CN1768133A - 使用islet1作为标志分离或产生干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了体外扩增和增殖未分化的祖细胞的方法，更具体地，提供了体外扩增和增殖含有Islet1的未分化祖细胞的方法，Islet1是增殖中的心脏干细胞显然特有的一个标志，本发明描述了用于分离干细胞群的方法，以及用于刺激未分化的祖细胞扩增和增殖而不发生分化的方法，例如，以提供心脏修复或改善心脏功能。
Description
发明领域
[0001]本发明一般性地涉及体外扩增和增殖未分化的祖细胞，更具体地，涉及含有Isletl的未分化祖细胞(undifferentiated progenitor cellscontaining Islet1)。
背景信息
[0002]先天性心脏病(Congenital heart disease)在所有出生缺陷中是最常见的(Hoffman and Kaplan，2002)。为了成功地预防先天性心脏病，或对先天性心脏病进行治疗干预，对其病原学的了解是极其重要的。为了达到这个目的，对具体的心脏细胞谱系的起源和它们之间的相互关系的理解是至关重要的。理解心脏祖先细胞(cardiac progenitors)的起源和性质，对于开发针对先天性心脏病和成人心脏病的心脏干细胞治疗来说也具有重要意义。
[0003]最近的研究工作已经定义了心脏祖先细胞的两个区(fields)，被称为初级区，和次级区，或前心区(Kelly and Buckingham，2002)。据认为，初级心区(primary heart field)形成心脏的心房和心室，而认为次级区或前区(secondary or anterior field)形成流出道(outflow tract)。认为次级区在早期线性心管阶段(early linear heart tube stage)位于心脏的前部和背部。有关心流出道不存在于线性心管中的最初的证据，来自在小鸡胚胎中所进行的一系列体内谱系研究，这些研究由de laCruz和同事从1977起向前推进(de la Cruz，2000)。这些研究表明，在线性心管阶段不存在流出道，但是没有指出：在后面的阶段中，流出道来自何处。
[0004]最近，由三个不同的实验室所作的研究指出了流出道的起源，其中，两个实验室在小鸡胚胎中进行研究，一个在小鼠胚胎中进行研究(Kelly et al.，2001；Mjaatvedt et al.，2001；Waldo et al.，2001)。这些研究结果表明，流出道中的一些细胞起源于靠近咽内胚层(pharyngealendoderm)的脏壁中胚层(splanchnic mesoderm)。这些实验结果不能最终评价“次级”或“前”心区的贡献大小和界线。
[0005]已经用许多不同的方式对干细胞进行了定义。然而，主要原则包括：(1)自我更新，或能产生具有与原始的母细胞类似的特征的子细胞(daughter cells)的能力；(2)单个细胞的多谱系分化(multi-lineagedifferentiation)；和(3)受损组织的体内功能重构。
[0006]胚胎干(ES)细胞——最初从小鼠获得(Evans andKaufmann，1981)，最近从非人灵长类和人类胚泡获得(Thomson，et al.，1998)——展示出所有三种特征。ES细胞是多能细胞，源自胚泡的内细胞团，它可以在未分化的状态下无限繁殖。小鼠和人ES细胞系都在培养中被连续保持，细胞倍增多于300次。在体外，当ES细胞被注射入胚泡时，ES细胞分化为所有的体细胞类型，并形成具有全部三胚层的成熟子代细胞(mature progeny cells)。最终，ES细胞的所有分化的子代细胞都是功能细胞，因为由四倍体胚胎互补作用(tetraploid embryocomplementation)产生的小鼠是活的。尽管ES细胞已经被从人类分离得到，但是它们在研究中的应用以及它们的治疗潜力受到伦理考虑因素的阻碍。
[0007]尽管成体干细胞的自我更新和分化的程度低于ES中所看到的自我更新和分化的程度，多数成体干细胞也能达到上面提到的干细胞标准。研究得最透彻的成体干细胞——造血干细胞(HSC)(Weissman，2000)——进行着体内自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化成所有成熟血成分，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓予以恢复。其他成体干细胞在更近时期才被定义，并因此，研究得不够透彻。然而，神经干细胞(NSC)(Gage，2000)，间充质干细胞(MSC)(Jiang，et al.，2002)和表皮干细胞(Toma，et al.，(2001)都达到这些基本标准。其他也被称为干细胞的细胞，如成血管细胞或内皮干细胞(Rafii，et al.，1994)，除了它们仅分化成一种单一类型的细胞外，展示出所有必要的特点。
[0008]过去几年中，发表了许多文献，它们指出：来自一个给定组织的细胞可以有能力分化成一个不同组织的细胞。“干细胞可塑性(Stemcell plasticity)”是一个新的术语，其已被用来描述最近观察资料，即在出生后的成体干细胞中，存在着比原先所期望的更大潜力。利用骨髓(BM)的大多数研究，或利用富集HSC的外周血的大多数研究，是基于性别错配细胞(sex-mismatched cells)或者遗传标记细胞的体内移植，供体细胞(donor cells)的检测是基于Y-染色体或标记基因的存在。已经有了关于使用任一标记系统进行的、在供体细胞检测中所涉及的陷阱的综述(Tisdale and Dunbar，2002)。已经描述了下述分化作用，不但分化成造血细胞，而且分化成具有骨骼肌细胞(Gussoni，et al.，1999)、心肌细胞(Orlic，et al.，2001)、内皮细胞(Jackson，et al.，2001)、神经外胚层细胞(Brazelton，et al.，2000)特征的细胞，和内胚层细胞(Krause，etal.，2001)，包括肝细胞。
[0009]在这些研究的80％中，新鲜的BM细胞未经预前体外培养而被移植，这样不能确定具有可塑性的细胞是否能够进行自我更新的可能性。在大多数的这些研究中，未纯化的细胞群或纯化得到的部分同质性的细胞被移植，因此，使得无法研究分化细胞的无性繁殖起源或具有次级组织(second tissue)特性的细胞的起源组织。最后，这些研究，依赖于表型性状，来确定分化为与起源组织不同的细胞的分化作用，但仍不得不证明次级组织的细胞具有那个谱系的功能性状。
[0010]因此，本领域需要新的且更好的方法，来体外扩增和增殖未分化的心脏祖细胞(undifferentiated cardiac progenitor cells)。该方法包括在足以使祖细胞生长的条件下，培养分离的未分化祖细胞，其中这些细胞表达Islet1。研究。
发明概述
[0011]对缺少Islet1——一种LIM同源转换域转录因子——的小鼠的分析已经显示出：心脏发育的一个新模式。Islet1敲除小鼠的心脏完全缺失流出道、右心室和大部分的心房。Islet1的表达和表达Islet1的祖先细胞的谱系追踪表明，Islet1是未分化的心脏祖细胞群特有的标志，其产生在isl 1突变体中发现为缺失的心脏节段。Islet1的功能是这些祖细胞形成心脏所必须的。在islet1突变体中，表达islet1的祖细胞在数量上逐渐减少，骨形态发生蛋白(BMPs)和纤维原细胞生长因子(FGFs)被下调。本文中描述的研究定义了两个生心区(cardiogenic fields)，在它们中，一个表达并需要Islet，另一个则不是如此。这些研究的结果对于特定心脏谱系发育、心脏成环(cardiac looping)、左右不对称性(leftright asymmetry)、心脏演变(cardiac evolution)和心脏干细胞具有启示意义。
[0012]因此，在一种实施方案中，本发明提供了用于检测干细胞的方法，包括测定细胞中Islet1核酸的表达和表达产物。
[0013]在另一种实施方案中，本发明提供了分离或富集干细胞的方法，包括将细胞与对Islet1有反应性的试剂相接触，并将反应阴性细胞和反应阳性细胞分离，从而分离或富集干细胞。
[0014]在又一种实施方案中，本发明提供了产生干细胞的方法，包括将表达Islet 1的未分化祖细胞与激活或增强该细胞中Islet1表达的试剂相接触，以便激活和增强Islet 1在该细胞中的表达。
[0015]在再一种实施方案中，本发明提供了扩增和增殖未分化的心脏祖细胞的体外方法。该方法包括在足以使祖细胞生长的条件下，培养分离得到的未分化的祖细胞，该祖细胞表达Islet1。在该方法中，祖细胞足以生长的条件包括：在物种特异性的心脏纤维原细胞的滋养层上培养细胞，或者在来自心脏的纤维原细胞的条件培养基中培养细胞。
[0016]在另一种实施方案中，本发明提供了组合物，其是Islet1阳性干细胞的富集群，相比起其他细胞类型，包括大于90％的Islet1阳性干细胞。
附图简述
[0017]图1是Islet 1的一个表达序列标签(EST)的mRNA序列(SEQID NO：1)。
[0018]图2是Islet 1(小鼠)的DNA序列，可以从GenBank获得，编号：NM_021459XM_354773(SEQ ID NO：2)。
发明详述
[0019]已经发现，Islet1(SEQ ID NO：2)是转录因子，是增殖着的心脏干细胞所特有的一个标志(FIG 2)。它是至今为止唯一已知的特异性表达在生心干细胞(cardiogenic stem cells)中，而不表达在分化的心脏细胞中的基因。Islet1是生心干细胞状态的主调节子(master regulator)。该发现使得能够使用islet1表达作为手段来分离内源性生心干细胞，或产生生心干细胞。Islet1也在其他祖细胞或“干细胞”群中被表达，包括胰腺、神经嵴、主动脉-生殖腺-中肾区域(造血祖细胞或内皮祖细胞)和其他细胞类型的祖细胞或“干细胞”群。该表达——与本文中描述的关于生心干细胞的数据相一致，显示了islet不但能标记生心干细胞，而且也能标记其他多能干细胞。
[0020]还不知道有其他基因，它们在最早阶段特异性地表达在未分化的生心性前体细胞(undifferentiated cardiogenic precursors)中。Islet1是这一细胞群的独特鉴定者。Islet1也是这些前体细胞(precursors)帮助心脏发育所必需的。在islet1突变体中，通常源自表达islet1的祖细胞的生心谱系是不存在的。因此，Islet的独特性在于，它在许多胚胎期不同的多能祖细胞中被表达。Islet是驱动干细胞状态的转录因子。
[0021]利用islet1作为标志，细胞可以从早期胚胎中被分离得到，与荧光标记的islet1抗体杂交，并通过FACS(荧光激活细胞分选术)对干细胞进行分选。可替代地，基因(例如lacZ、GFP、cre)可以被插入到内源性islet1位点，并用作细胞鉴定或分选的基础。生心干细胞系可以通过单独表达islet1而建立，或通过联合表达islet1与Nkx2.5而建立，Nkx2.5是另一种转录因子，其在心脏祖细胞中被表达，也在分化的心脏细胞中表达。为了使这些生心性前体进行分化，通过遗传学手段，或通过应用生长因子下调islet1的表达。其他干细胞系能以类似的方式被创作，或者单独表达islet1，或者islet1与对不同的谱系具有特异性的其他因子一起被表达，来创制多能细胞，其能分化成多个谱系，或特殊的谱系，这取决于遗传或物理环境。
[0022]大量的数据证实了这样的结论，即islet1是分化之前的生心干细胞的标志。该发现导致形成这样的想法，利用islet1作为工具，在胚胎、新生或成体阶段，从各种实验模式动物和从人中，分离生心干细胞。可以获得islet1抗体，以检测这些细胞群；和使用已知的技术，可以创作在islet1位置插入有GFP的小鼠系。也已经确定，islet在主动脉-生殖腺-中肾区域被表达，该区域对于产生多能造血前体和内皮前体是至关重要的。
[0023]由本文中描述的研究，若干利用这些干细胞的治疗用途由然而生。例如，本发明提供了方法，用于将不同的细胞类型转化为生心干细胞，用于治疗用途，例如：从心脏患者分离皮肤纤维原细胞或骨髓干细胞，将这些细胞转化为生心干细胞，然后将转化的细胞注射入患者。该方法可以被用于治疗心脏病，包括心梗后疾病(post-infarct)、心力衰竭、缺血性心脏病。其他的应用包括，刺激在分化心脏内的常住生心干细胞的增殖和/或分化，以修复心脏或改善心脏功能。分离的生心干细胞可以用于治疗药物筛选，用于毒理学研究，和用于组织工程。在所有这些程序中，来自islet阳性干细胞的其他不同的细胞谱系也可以被使用，具有对相关人类疾病的用途。
[0024]本发明基于这样的发现，两种生心区的界线与之前期望的不同。一种祖先群表达islet1并将产生流出道、右心室、左心室细胞亚群和大部分的心房细胞。另一祖先群则不表达islet1，且将产生左心室的大部分和一些心房细胞。Islet1在未分化的前体中的特异性表达，也第一次使得能够准确地观察到islet1表达祖先群，并给予我们一个重要的手段，用于分离和表征心脏干细胞群。Islet1不但定义该干细胞群，而且也是这些细胞帮助形成心脏所必须的，这为不同的心脏区域提供了第一个的遗传证据。
[0025]Islet1(Isl 1)敲除小鼠已被用来检测运动神经元和胰腺发育的缺陷(Ahlgren et al.，1997；Pfaff et al.，1996)。isl 1纯合无效的小鼠在大约ED9.5时，显示出生长延迟现象，并在大约ED10.5时死亡。而杂合突变体存活下来，且无明显的表型。尽管怀疑是血管畸形(Pfaff et al.，1996)，但纯合突变体死亡的原因在这之前还未被陈述过。因此，查明了isl1-/-小鼠死亡的原因。
[0026]当对ED9.0至ED9.5之间的纯合无效(homozygous null)胚胎进行检测时，发现严重异常的心脏。在总体形态学水平上，突变体心脏看上去由单个的、畸形的、未分裂的腔室组成。组织学分析确认了该印象。作为第一次尝试去表征突变体心脏内的细胞之腔室同一性，使用心腔室标记物来进行整体原位杂交分析(whole mount in situhybridization analysis)。心室肌球蛋白轻链2(MLC2v)mRNA特异性地标记心室细胞，和A/V连接细胞(Franco et al.，1999)。在这些阶段，心房肌球蛋白轻链2(MLC2a)mRNA标记所有心肌细胞(Kubalak et al.，1994)。与针对MLC2v和MLC2a mRNAs的探针进行的杂交表明，单个腔室的前面部分内的细胞具有心室同一性，而单个腔室的后面部分中的细胞则不具有心室同一性，并因此可能具有心房同一性。
[0027]许多转录因子区域性地表达于心脏中，一组这些转录因子被用于进一步研究isl 1突变心脏内的细胞同一性。在所研究的阶段中，tbx5特异性地表达于心脏的后极中，在心房和左心室中(Bruneau et al.，1999)。在islet1突变体中，心脏的心房和心室部分都表达tbx5，这表示突变心脏的心室部分具有左心室同一性。EHand在左心室中被表达，但不在右心室中表达(Cross et al.，1995；Cserjesi et al.，1995；Thomas etal.，1998)。在isl1-/-胚胎中，EHand在整个心室组织中都被表达，这表示它具有左心室同一性，不具有右心室同一性，这与用tbx5探针获得结果相一致。Tbx20在流出道和A/V通道中被高度表达(Carson et al.，2000；Kraus et al.，2001)。来自islet 1突变体的心脏在心室和心房的连接处表达tbx20，在它们的前端不表达tbx20，这表示无流出道。用msx2的探针获得了与该结果一致的结果，msx2标记在ED8.5的心脏流出道。Islet1突变心脏的前部无msx2染色。这些数据，同从先前与MLC2a和MLC2v的探针所进行杂交获得的结果一起，提示：尽管存在左心室、AN通道和心房同一性的细胞，islet1突变体缺少流出道和右心室。
[0028]从该分析推断出，islet1突变体缺失完整的心脏分隔。此外，突变的心脏不能成环。该结论得到扫描电子显微镜分析的支持。令人感兴趣的是，在ED 9.0(12体节对(somite pairs))时，isl 1突变体中的心脏原基类似于在ED 8.25(5体节对)时、在较早阶段野生型胚胎中所见的心脏原基(Kaufman，1999)，这表示出心脏发育的中断。在ED 9.5(22体节对)，野生型同胎仔(littermates)与它们的突变对等物的比较显示，在突变子中不存在流出道和右心室，这与标记物分析一致。
[0029]isl 1-/-小鼠严重的心脏表型使得人们去研究小鼠心脏发育的早期的isl 1表达。利用isl 1和MLC2a mRNAs的探针对ED7.25至ED8.75的胚胎进行单和双整体原位杂交。后者是分化的生心性前体最早的标志物之一。该整体原位杂交及随后的切片分析(section analysis)表明，islet1决不与MLC2a共表达，相反，在紧靠的细胞群处被表达。在早期生心新月阶段(cardiogenic crescent stages)，islet1表达细胞是在MLC2a表达细胞的中部和背部。随着心管形成时，内脏间质中的islet1阳性细胞在它们的整个延伸范围内，包括前面区域和后面区域，与MLC2a阳性细胞相邻，其中内脏间质包括心系膜并靠近前肠内胚层。Islet1不但在脏壁中胚层中被表达，也在腹前肠内胚层中被表达。
[0030]尽管islet1不在分化的MLC2a阳性心肌前体中被表达，但是它在最近鉴定的心脏次级或前心区(secondary or anterior heart field)区域中，也就是咽区域的脏壁中胚层细胞中表达。最近的证据指出，小鼠心前区帮助形成流出道(Kelly and Buckingham，2002)。该发现——与islet1突变体中的心脏表型相一致——显示出islet1表达细胞可能帮助形成心脏的流出道。
[0031]为了研究该问题，进行isl 1表达细胞的谱系分析，这通过将islet-1-cre小鼠(Srinivas et al.，2001)和Rosa26-lacZ指示小鼠(Soriano，1999)杂交来进行。在该杂交的子代中，Cre-介导的切除使得lacZ基因处于普遍表达的Rosa26基因座的控制之下，使得通过针对β-半乳糖苷酶活性的染色方法从而对表达isl 1的细胞的命运进行跟踪成为可能，既便是从内源性isl 1基因座而来的转录已被抑制。这一分析的结果是令人吃惊的，并且表明先前表达islet1的细胞对胚胎心脏具有实质性贡献，包括位于流出道、右心室和心房中的大部分细胞，也有助于形成左心室的特殊区域。β-半乳糖苷酶阳性细胞也在心内膜内被观察到，和在衬里于主动脉弓动脉的内皮细胞中被观察到，内皮细胞衬着主动脉弓动脉(aortic arch arteries)。多数的β-半乳糖苷酶阴性心肌细胞在左心室的腹侧面和左心房的前腹区域被观察到。
[0032]观察到，islet1-表达细胞贡献了发育成为心脏的大部分细胞，该观察结果与我们先前在isl 1纯合突变体小鼠中对心脏表型所作的分析相一致，在该突变体小鼠中，整个心脏分割都缺失。缺失的结构表明，Islet1可能对于表达islet1的生心前体的增殖、存活和/或迁移是所必需的。为了致力于解决该问题，人们尝试去检测isl 1突变体和同胎幼崽对照中的isl 1表达细胞。尽管isl 1基因的靶向结构被删除了第三外显子，——第三外显子包含第二LIM区域——isl 1 mRNA的5′端依然在突变体中被表达，这使得可以检测突变体细胞中的islet1信使。然而，Islet蛋白是不能被检测到的(Pfaff et al.，1996)。
[0033]为了追踪突变体和野生型胚胎中的isl 1表达细胞，用isl 1mRNA的探针，对ED8.5-ED10的胚胎进行整体原位杂交分析。这些分析的结果证明，尽管一些细胞仍然存在，但是在突变体中islet-表达细胞却日渐减少。结合isl 1突变体的心脏表型，这些结果表明，Islet是细胞增殖和/或细胞存活所必需的。
[0034]这些研究结果显示，Islet1是生心前体增殖和存活所必需的细胞，也显示，Islet1的下游靶物质(downstream targets)调控该效应。两个生长因子通道是骨形态发生蛋白(BMPs)和纤维原细胞生长因子(FGFs)，它们涉及脊椎动物和无脊椎动物心脏发育中的生心前体的生长和存活(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)。许多BMPs和FGFs已被描述为表达在胚胎区域，其与islet1-表达细胞相重叠，和/或临近islet1-表达细胞，包括BMPs 2、4、6和7，和FGFs 4、8和10(Crossley andMartin，1995；Dudley and Robertson，1997；Kelly et al.，2001；Lyons et al.，1995；Niswander and Martin，1992)。为了测定是否这些BMPs和FGFs中的任何一个是Islet1作用的靶(目标，targets)，用这些生长因子基因的探针进行整体原位杂交。该分析的结果表明，在isl无效小鼠中，这些基因中的每一个的表达水平下降。在与islet1表达重叠的区域，这些生长因子中一些表达急剧下调或未被检测到，包括BMP4、BMP7和FGF10的表达。这些基因可能是Islet的直接或间接目标。其他BMP和FGF基因的表达依然存在，但是在与islet1表达重叠的区域，表达区域减少，这与在islet1突变体中对islet1 mRNA的观察结果相类似。该减少能反映出表达这些生长因子的细胞数量的减少。
[0035]本文中描述的数据显示，产生流出道的祖先也产生右心室和心房中的大部分细胞，和左心室内的细胞亚群。因此，之前描述的二级(secondary)或前心区是这些祖先群(progenitor population)的亚群，其以islet1表达为特征。Islet1功能是这些细胞成为心脏所必需的。在缺乏Islet1时，其形成的心脏缺失正常情况下由islet1表达祖先所贡献的分割(segments)。区别是，将产生大部分的左心室细胞和心房细胞亚群的祖先不表达islet1，并且能够产生心脏细胞，其具有在缺失Islet1功能下的这些标识特征。
[0036]在islet1突变体中心脏的外观和表征，和islet1表达的分析和islet1祖先的原基分布作图，已经导致产生新的心脏发育工作模式。在该模型中，在正中线的生心性中胚层的第一突出分隔(protruding segments)首先分化，不表达islet1，并将产生左心室和一些相邻心房内的大部分的细胞。当Islet1表达祖先加入“初级”心脏分割时，它们迁入进来，同时日益增多地进行分化并下调islet1表达，以形成右心室、流出道和心房剩余部分的大部分细胞。应该注意到，islet1表达祖先的很大数量的子代在左心室内、在与右心室的连接区域、在小梁内，和沿着向内弯曲的壁处被发现，微微向下延伸至左心室的背壁。
[0037]在心脏发育的最早阶段，当相邻的间质与正分化的心肌相邻时，islet细胞细胞迁入贯穿心肌的整个前部-后部区域中。在后面的阶段中，islet祖先通过两个区域迁移入心脏，这两个区域保持与背体壁(dorsalbody wall)的内脏间质的连接。在前部，这是主动脉囊的区域；在后部，是心背系膜(dorsal mesocardium)。
[0038]前面利用分子标记对人心脏发育进行解剖学分析，表明心脏外间质——其通过心背系膜迁移进来，形成心房和心房-心室分隔(Lamers and Moorman，2002)。对于初级心房七分隔(primary atrialseptem)前沿上的间质帽(mesenchymal cap)是否起源于该心脏外中胚层，或是否从垫状内皮(cushion endothelium)衍生而来有争论。利用islet1谱系分析，该问题现在可以最终解决了。此外，研究islet-衍生心肌细胞在心脏分隔中的作用将引起人们的注意。
[0039]有趣的是，注意到islet-表达祖先的子代明显分布于与发育传导系统的标记相符的区域中，这表明该分布群在传导系统发育中发挥主要作用(Rentschler et al，2002；Kondo et al，2003)。
[0040]本文中描述的数据证明，Islet1不存在时，表达islet1的生心祖先未充分地帮助形成心脏，并且数量减少，这证明Islet1是这些祖先增殖和/或存活所必需的。Islet1祖先的大部分子代不存在于isl 1-/-突变体心脏中的观察现象表明，Islet1也是迁移所必需的。
[0041]当前体分化时，Islet1表达被下调，这表明在生心前体中，Islet的功能可能是维持未分化状态所必需的，和/或可能与分化的状态不相容。Islet1也是运动神经元中细胞存活中所必需的，但是在分化的细胞中表达并发挥作用(Pfaff et al.，1996)。在胰腺发育中，Islet1的功能在胰腺间质中和在分化的islet细胞中是所必需的(Ahlgren et al.，1997)。
[0042]肌细胞分化之后的心脏生长导致人们认为，分化的肌细胞广泛地增殖，导致心肌生长。表达islet1的前体迁移入心脏，表明该迁移也能导致心脏的某些生长。然而，在islet1突变体中，非-islet表达祖先发生分化，并进行扩张，这表明分化的前体的迁移和增殖在生心性生长中发挥作用。
[0043]islet1突变体的心脏似乎没有经历成环形态形成(Loopingmorphogenesis)，是因为心室节段保持在心房节段之前。该观察资料表明，islet1表达祖先迁移入心脏与成环形成发生过程密切相关。环形成发生过程(Looping morphogenesis)可能不但是心肌生长、而且是islet1-表达细胞迁入到心脏中的结果。
[0044]除了在生心中胚层被表达外，islet1也在咽内胚层中表达，咽内胚层是已经被证明在心脏发育中发挥重要作用的组织(Lough et al，)。这产生这样的可能性，在生心祖先中对islet的需求可能不是细胞自主的。进一步的实验将直指该问题。
[0045]本文中描述的研究证明，Islet1界定了生心区(cardiogenic fields)中的一个，并且是该一个生心区所必需的。也引起人们的兴趣去了解可能类似地为其他的非islet表达区所必需的其他基因。在本文上下文中，应该注意到Nkx2.5敲除小鼠具有突变的心脏，该突变心脏具有流出道、右心室细胞和心房细胞(Harvey et al，1999；Tanaka et al，1999)。许多左心室同一性标记不存在，这表明不具有左心室同一性。这些观察现象产生这样的可能性，即Nkx2.5是由非islet表达祖先形成心脏组织所必需的。倘若islet1和kx2.5无效小鼠的表型形成鲜明对比，尽管Nkx2.5在Islet方式中明显不是必需的，Nkx2.5也可能在islet-表达心脏区中发挥作用。产生islet1和Nkx2.5双重突变的小鼠，可以用于评价这些可能性。已经显示，在Nkx2.5敲除的小鼠中，islet1 mRNA表达被保留(未公布观察结果)。
[0046]如上所讨论，Islet1阳性祖先(Islet1 positive progenitors)可以影响心脏成环形态形成(cardiac looping morphogenesis)。心脏成环作用的发生以左-右方向为特征，流出道和右心室向右成环。左-右轴信息的微扰(Perturbation)导致心脏的内脏逆位，流出道和右心室向左成环。心房异构(Atrial isomerism)也可以产生。本文中描述的数据证明，流出道、右心室和大部分心房细胞衍生于islet-表达祖先细胞，这表明赋予这些前体的左-右信息将是左右心脏不对称的关键的决定因素。遗传标记的先前研究已经表明最初的左右轴信息保持于心房的排列中，但是在心室中被旋转。也就是，“左”和“右”心室不是严格地与左和右体轴(body axis)相对应(Campione et al.，2001；Franco et al.，2000)。我们的发现，即左和右心室源于不同的生心区，给予这一个观察资料更深层次的理解。有价值的是，依据islet祖先细胞群来重新检测心脏的左右结构模式，以便研究涉及在细胞进入心脏之前将左右信息赋予这些细胞的基因，以及它们相对于其原始左-右方向定位、在心脏内的随后定位。类似地，检测赋予非-islet表达祖源的左右同一性，和在发育的心脏内的左右分隔的最终定位是有价值的。
[0047]同源转换区转录因子(homeodomain transcription factor)，pitx2，在左-右通道的下游，在左外侧中胚层中被特异性表达，并在后期发育中保持区域划分状态(Capdevila et al，2000)。最近分析证明，pitx2在生心新月体(cardiogenic crescent)的区域中被不对称地表达，并且随后在左心房而不是在右心房中被表达，也表达在流出道、右和左心室的不同部分中(Campione et al，2001)。非常感兴趣的是，去研究pitx2在islet-表达祖先中的潜在的不对称表达，并可能使用pitx2表达作为标志去研究islet1-表达祖先所采用的迁移途径。在这点上，在ED9.5，pitx2c不对称性地表达在鳃弓和脏壁中胚层中，其与主动脉囊相邻(Liu et al，2002)。Pitx2被敲除的小鼠无法存活下来，并展示出许多心脏表型，尽管心脏依然明显向右成环(Capdevila et al，2000)。在islet1范例的上下文中，重新检测pitx2无效表型，和左右心脏不对称的其他组织是引人瞩目的。
[0048]缺少Islet导致表达islet的生心前体细胞数量减少，这表明可以扰乱生长因子信号(growth factor signaling)。因为FGF和BMP信号是心脏发生所必需的(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)，我们检测了许多BMP或FGF生长因子的表达，这些生长因子在表达islet1的生心祖先中或与表达islet1的生心祖先相邻的地方被表达。本文中描述的数据证明，每一检测的生长因子选择性地在与表达islet1的生心前体的相重叠的区域显著被下调或减少。
[0049]Islet1突变体显示出，在fgf8表达区域中的总体减少，但它们的表型比起具有fgf8亚效等位基因所看到的表型更严重。敲除fgf4或fgf8的小鼠是早期胚胎致死型的。但是fgf8是亚效等位基因的小鼠在出生时死亡，这是由于心血管缺陷的缘故，包括流出道畸形(Abu-Issa et al.，2002；Feldman et al.，1995；Frank et al.，2002；Sun et al.，1999)。在islet1突变体中，fgf8表达实质上在islet1-表达生心前体中是不存在的。敲除fgf8的小鼠在出生时死亡，这归因于它们的肺表型(Sekine et al.，1999)。然而，尽管明显不如islet心脏表型严重，可能有未被描述过的心脏表型。
[0050]BMP4和BMP7，以高度重叠的方式，被表达islet的生心前体共表达。BMP2和BMP6以与BMP4、BMP7不同方式表达，或以彼此不相同的方式被表达，但是它们的表达也与islet1的表达相重叠。在islet1突变体中，这些生长因子中的每一个的表达在与islet表达相一致的区域被大大减少或表现缺乏。对这些BMPs中的每个进行了敲除，对BMP6/7进行了双敲除(Kim et al.，2001；Winnier et al.，1995；Zhang andBradley，1996)。这些突变体中的任何突变体都没有重演islet突变体的心脏表型，这是由于在植入或原肠胚形成中的早期缺陷的缘故，或者，如果它们经受得住较早缺陷而存活下来，可能是功能性丰余(functionalredundancy)的缘故。
[0051]我们的结果表明，在islet突变体中的心脏表型可能全部或部分是或者FGF或者BMP或两者信号缺陷的缘故。要将这些可能性辨别开来，将需要进一步的实验，来将islet表达祖先中的这些信号通路去除。此外，islet突变体中的其他生长因子通路可能受到影响。
[0052]考虑到许多实验已经证明脊椎动物心脏从咽或肠中胚层演化而来(Haun et al.，1998；Park et al.，1998；Ranganayakulu et al.，1998)，islet1在咽和前肠区域的脏壁中胚层中的表达引人瞩目。先前的数据已经证明，islet在小鸡生心前体中被表达(Yuan and Schoenwolf，2000)。对于小鼠islet，存在islet的果蝇同系物，其在运动神经元发育中具有作用；并且吸引人的是，它在背脉管(dorsal vessel)中被表达(Thor and Thomas，1997)。非常令人感兴趣的是去检测islet在其他物种心脏发生中的作用，来获得对心脏进化的更深的认识。结果可以表明，islet-表达祖先，用进化术语来说，是“初级的”。如果是这样的话，它可能表明左心室是较晚的进化发育。令人感兴趣的是，在斑马鱼中——其具有单个心室——，Dhand是存在的，Dhand是高等脊椎动物中的右心室的标志物，然而未发现它的左心室中的对等物EHand的同源物ngelo，Lohr，Lee，Ticho，Breitbart，Yost，2000)。
[0053]也许，在我们对islet在心脏发生中的作用的发现中，最令人兴奋的方面之一是利用Islet1作为生心干细胞状态的标志来进行预测。干细胞可以定义为祖细胞，其增殖并产生许多不同的谱系。Islet1-表达细胞符合该定义，产生许多不同的心脏谱系。Islet1在分化之前的细胞中表达的独特特性，将使得能依据islet1表达进行细胞分选。此外，Islet1在指令这些细胞增殖和/或存活中的作用表明，Islet1，与其他因子一起，可以被用于驱动生心干细胞的状态。
[0054]基于上面描述的这些深思熟虑以及在证据A(Exhibit A)中所阐述的——其通过参考并入本文，我们成功地鉴定到了小鼠、鼠类和人类非-肌细胞培养物中的稀有细胞群(rare cell population)，其能够在体外被扩增和繁殖。这些细胞不但分化成中胚层谱系，而且分化成神经外胚层。我们能够显示，能够体外分化成至少两个胚层的细胞能够从啮齿类动物和人心脏选择出来。Islet-1(isl 1)，是一种LIM-同源转换区转录因子，标识了这些未分化的祖细胞，并使该生心前体群在成体心脏中是现显的。因此，这些细胞被命名为i-细胞(i-cells)。
[0055]未分化的i-细胞的培养，如在下面实施例1中阐述的，揭示了生心前体群只能在无分化作用下进行培养，并且在种属-特异性的心脏纤维原细胞的滋养层上衰老。类似的滋养细胞-依赖型(feeder-dependent)培养条件被用于分离小鼠和人ES细胞，且此类滋养层被证明对于将它们维持在未分化的状态下是至关重要的(Donovanand Gearhart，2001)。
[0056]对从心脏纤维原细胞获得的饲养细胞或条件培养基(conditioned medium)的需求表明：它们提供抑制多能祖细胞的分化或促进多能祖细胞自我更新的因子。具有这些特性的活性称为i-细胞的分化-抑制活性(differentiation-inihibiting activity of i-cells)(DIAI)。对于鼠类ES细胞，白血病抑制因子(LIF)，其为有关白细胞介素-6的细胞因子家族的成员，可以替代对饲养细胞的需求(Nichols，et al.，1990)。为了抑制LIF受体信号组分的鼠类ES细胞分化激活作用，糖蛋白130(gp 130)是必要和充分的。然而，人ES细胞和心脏i-细胞似乎不需要LIF，以便用于阻断分化作用和刺激自我更新(Thomson，et al.，1998)。
[0057]直到现在，还没有建立起这样的体外培养条件，其允许多能的成体干细胞扩增和繁殖。成体HSCs或NSCs(dult HSCs or NSCs)，在体内定义为长期再生细胞(long-term repopulating cells)，不能在培养物中被扩增，而不失去发育潜力(Weissman，2000)。但是最近的一个研究显示，从骨髓得到的间质干细胞，能够在特定的条件下，在培养基中无限生长(Jiang，et al.，2002)。
[0058]本发明也提供了细胞的组合物，包括富集的isl 1阳性干细胞群。相比起其他细胞类型，该组合物优选含有大部分的或至少约90％isl 1阳性干细胞。isl 1阳性干细胞由任何心脏组织衍生而来，诸如从大鼠、小鼠或人的心脏组织。
[0059]因为未分化状态的表型特征，已经发现i-细胞在细胞核中表达高水平的isl 1，和在胞质中表达高水平的巢蛋白(nestin)，巢蛋白是标志未分化NSCs的中间丝。此外，细胞显示出低水平地表达Nkx2.5和ES细胞转录因子oct-4，Nkx2.5是果蝇铁匠基因(tinman)的同源框脊椎动物同系物。因此，这些标志物可以被用于鉴定i-细胞。
[0060]Isl 1对于运动神经元和胰腺发育是至关重要的(Pfaff，et al.，1996)。敲除isl 1的纯合胚胎在大约ED 10.5死亡，这是由单心室的未分开的心脏-腔室以及流出道血管畸形所造成的(Cai，et al.，2003)。isl 1表达细胞的谱系分析揭示：这些细胞在实质上有助于形成(substantiallycontribute)胚胎心脏，包括在流出道中的大部分细胞、右心室和两心房(Cai，et al.，2003)。在新生儿和成体心脏中，isl 1表达的下调允许在心肌层看到生心前体。
[0061]免疫组织化学显示，在成体心脏中的isl 1表达细胞主要位于右心室、隔膜和心房中。在未分化的前体细胞中，isl 1在核中被高水平的表达，并在i-细胞分化期间被下调。Islet表达在体外和体内成为生心干细胞群的标志，并看上去是这些干细胞分化和存活所必需的。
[0062]在未分化状态下，Nkx2.5也在i-细胞中被表达。该转录因子是脊椎动物心脏发育最早的标记物之一，并且对于心脏-限制性基因活性的调节是重要的。POU-域转录因子oct-4是多能ES细胞的分子标记物。Oct-4在原肠形成前期胚胎、早期卵裂-期胚胎(early cleavage-stageembryo)、胚泡内细胞团(inner cell mass)的细胞、和胚胎癌细胞中被表达。在成体动物中，oct-4仅在生殖细胞和间充质干细胞中被发现(Rosner，et al.，1990)。
[0063]在本发明中，新型心脏祖细胞群(progenitor population)已被发现、分离和鉴定。Isl 1表达标记这些生心干细胞，并似乎是这些细胞分化状态和存活所必需的。这些细胞对研究和理解心脏干细胞分化和生长的信号通路，为先天性和成体心脏病的未来治疗应用铺平了道路。
[0064]神经细胞或肌细胞中具有进一步分化作用的i-细胞中的基因靶向(gene targeting)，使得进行细胞生物学研究，而避免了与耗费时间的动物模型的复杂性相关的斗争。细胞培养的目标是开发明确的、并容易操作的实验体系，其赋予克隆均匀性的优点和操纵外部环境的能力。而且，由于伦理上不能接受通过实验的方式改变人种系，ES细胞转基因路线对于涉及人基因操作的实验是不可行的。在人i-细胞中进行基因靶向，使得在啮齿类动物模型系统不能充分重演(recapitulate)人生物学或疾病过程的领域的重要应用成为可能。
[0065]此外，I-细胞可以作为心脏和神经元细胞治疗的供体组织的来源予以应用。早期的胚胎干细胞对于以细胞为基础的治疗具有不利之处：(i)转化的数量和(ii)获得特异性分化表型所需要的信号的复杂性。相反，发育中的i-细胞和来源于成体的心脏祖先细胞的表型分化避开了伦理上和免疫学上的约束。
[0066]i-细胞的交叉-谱系转化(Cross-lineage transformation)，为获得更为灵活的组织来源提供了一个新的途径，特别是从病人本身获得自体移植物。i-细胞相比起ES细胞还有一个先进之处，在于：这些前体细胞，在异种移植物中，比起初级胚胎肌细胞，具有较少的免疫原性，这就为克服来自非-人供体移植中的主要困难之一开辟了道路。
[0067]本发明方法利用分离的单克隆抗体，该抗体特征为特异性地结合Islet 1多肽并免疫沉淀Islet 1多肽。
[0068]本领域已知的和本文中描述的任何合适的免疫测定形式，都可以被用于检测Islet 1-表达细胞在不同的细胞群中的存在和/或对在不同的细胞群中的Islet 1-表达细胞进行定量。尽管可以使用任何类型的抗-Islet 1多肽抗体，如本文中描述的，其特异性结合Islet 1多肽，但是优选的是单克隆抗体。
[0069]本发明对Islet 1多肽的免疫学测试，可以通过使用本领域已知的任何技术、以高通量形式被使用，诸如FASC筛选，下面将对其进行更加详细地描述。
[0070]适合于结合到本发明方法所使用的抗体上的可检测标记物——包括高通量筛选形式方法，包括通过使用各种化学连接基团或双功能肽接头连接到抗体上的放射性标记物。末端羟基可以用无机酸进行酯化，例如32p磷酸或14C有机酸，或者以另外方式酯化，以便为标记物(label)提供连接基团(linking groups)。有意用作可检测标记物的酶将首先是水解酶，特别地是酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素和它的衍生物，若丹明和其衍生物、丹磺酰(dansyl)、伞形酮、和诸如此类物质。化学发光剂(Chemiluminescers)包括荧光素和2，3-二羟酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)(例如邻苯二甲基肼)和类似物。
[0071]抗体也可以被附着到固体支持物上，其特别用于Islet 1多肽的免疫测定或免疫沉淀反应。此种固体支持物包括，但是不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯，例如蛋白G覆盖的微量板或珠的孔。
[0072]针对特异性表位或表位组合的抗体，这样与Islet 1多肽特异性结合，将使得能筛选本文中描述的细胞群。通过使用此类单克隆抗体，可以利用各种筛选技术，并包括使用抗体-涂覆的磁珠的磁分离，用附着到固体基质(即板子)上的抗体“淘洗(panning)”和流式细胞分析术(参见例如美国专利5,985,660；和Morrison et al.，Cell，96：737-49(1999))。
[0073]在本发明方法中有用的抗体可以用任何本领域已知的方法测定其免疫特异性结合特性。可以使用的免疫测定包括，但不限于竞争性和非-竞争性测定系统，使用技术诸如蛋白质印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应(gel diffusion precipitin reactions)、免疫扩散测定、凝集测定(agglutination assays)、补体结合测定(complement-fixation assays)、免疫放射量测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定诸如此类。此类测定是常规的并且是本领域熟知的(参见例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，其通过参考整体并入本文)。示范性的免疫测定方法在下面被简要描述(但决不为了限制的目的)。
[0074]免疫沉淀反应的方案一般包括在裂解缓冲液中裂解细胞群，裂解缓冲液诸如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％Trasylol)，补充以蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)，将感兴趣的抗体加入到细胞裂解物中，在4℃下，温育一段时间(例如1-4小时)，将蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠加入到细胞裂解物中，在4℃下温育约1小时或更多时间，在裂解缓冲液中洗涤珠子，和将珠子重新悬浮于SDS/样品缓冲液。例如通过蛋白质印迹分析可以测定感兴趣的抗体免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员知道，关于这些参数可以被修改以增加抗体与抗原的结合作用和减少背景(例如，用琼脂糖珠预先洗涤细胞裂解物)。对于涉及免疫沉淀反应方案的进一步讨论，参见Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York at 10.16.1。
[0075]蛋白质印迹分析一般包括：制备蛋白质样品；蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳(例如，8％-20％ SDS-PAGE，这取决于抗原的分子量)；将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上，诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙；在封闭溶液(例如，含3％BSA或脱脂奶粉的PBS)中封闭膜；在洗涤缓冲液(PBS-Tween 20)中洗涤膜；用在封闭缓冲液中稀释的初级抗体(感兴趣的抗体)对膜进行封闭；在洗涤缓冲液中洗涤膜；用在封闭缓冲液中稀释的二级抗体(其识别初级抗体，例如抗-人抗体)对膜进行封闭，二级抗体偶联到酶解基质(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或偶联到放射活性分子(例如32P或125I)上；在洗涤缓冲液中洗涤膜；并检测抗原的存在。本领域技术人员将对这些参数是可以知晓的，它们被修改以增加被检测到的信号和减少背景噪音(backgroundnoise)。对于关于蛋白质印迹分析方案的进一步讨论，参见Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley &Sons，Inc.，New York at 10.8.1。
[0076]ELISAs包括：制备抗原，用抗原包被96孔微量板的孔，将偶联有可检测化合物诸如酶促基质(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣的抗体加入到孔中，并温育一段时间，并检测抗原的存在。在ELISAs中，感兴趣的抗体不必结合到可检测的化合物上；相反，结合到可检测化合物上的二级抗体(其识别感兴趣的抗体)可以被加入到孔中。还有，代替用抗原包被孔，抗体可以被用来包被孔。在该情况下，在将感兴趣的抗原加入到包被的孔中之后，结合到可检测化合物上的二级抗体可以被加入。本领域技术人员知道，参数可以被修改以增加被检测到的信号，以及也知道本领域已知的其他变化。对于关于ELISAs的进一步讨论，参见Ausubel et al，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York at 11.2.1。
[0077]通过竞争性结合测定方法，可以测定抗体对抗原的结合亲和力，以及抗体-抗原相互作用的解离率(off-rate)。竞争性结合测定的一个例子是放射性免疫测定，包括：用感兴趣的抗体，在增加数量的未标记抗原的存在下，温育标记的抗原(例如，3H或125I)；并检测结合到标记的抗原上的抗体。由用斯卡查德图分析获得的数据，能够测定感兴趣的抗体对特异抗原的亲和力，和结合解离率。与二级抗体的竞争也能使用放射性免疫测定来确定。在这种情况下，在增加数量的未标记的二级抗体的存在下，用结合到标记的化合物(例如3H或125I)上的感兴趣的抗体温育抗原。
[0078]用于本发明测定中的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或它们的功能活性片段。针对islet 1多肽的单-或多-克隆抗体在合适的宿主动物中产生，这是通过使用本领域已知的常规技术、用免疫源性偶联物对动物进行免疫而产生。
[0079]单克隆抗体的制备方法已被如Kohler and Milstein，Nature
256：495-7，1975；和Harlow et al.，in：
Antibodies：a Laboratory Manual，page726(Cold Spring Harbor Pub.，1988)所公开，这些公开资料通过参考并入本文。简言之，单克隆抗体可以通过下述方法获得：用包含本发明免疫原性偶联物——上面已公开了它的制备——的组合物注射小鼠或其他小型哺乳动物，诸如兔，通过取出血清样品确认抗体产物的存在，取出脾以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆该杂交瘤，筛选针对抗原产生抗体的阳性克隆，和从杂交瘤培养物中分离抗体。通过各种业已建立的技术，单克隆抗体可以从杂交瘤培养物中分离和纯化得到。此种分离技术包括：利用蛋白A-琼脂糖的亲合层析，大小排阻层析和离子交换层析。参见，例如Barnes etal.，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，in：Methods in Mol.Biol.，
10：79-104，1992)。本发明的抗体也可以来自亚人类灵长类动物(subhumanprimate)抗体。在狒狒中产生抗体的通用技术可以参见例如Goldenberget al.，国际专利公布WO91/11465(1991)和Losman et al.，Int.J.Cancer，46：310-314，1990。
[0080]也能使用抗-独特型技术(anti-idiotype technology)产生单克隆抗体，其模拟一个表位。例如，为第一单克隆抗体制备的抗-独特型单克隆抗体，将在高变区具有结合区域，这是被第一单克隆抗体结合的该表位的“像(image)”。
[0081]本发明中使用的术语“抗体(antibody)”包括完整的分子以及其功能片段，诸如Fab、F(ab′)2和Fv，它们能够结合islet 1多肽，这些功能性抗体片段定义如下：
(1)Fab，是包含抗体分子的单价抗原-结合片段的片段，能够通过用酶——木瓜蛋白酶消化整个抗体，产生一个完整的轻链和一个重链的一部分而制备得到；
(2)Fab′，是抗体分子的片段，其通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，产生完整轻链和部分重链而制备得到；每个抗体分子得到两个Fab′片段；
(3)(Fab′)2，是抗体片段，其通过用酶——胃蛋白酶处理整个抗体而制备得到，无需随后的还原作用；F(ab′)2是两个Fab′的二聚物，通过两个二硫键固定在一起；
(4)Fv，定义为遗传工程片段，包含表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区；和
(5)单链抗体(Single chain antibody，″SCA″)，是遗传工程分子，包含轻链的可变区和重链的可变区，通过合适的多肽接头连接，作为遗传融合单链分子。
[0082]制备这些片段的方法是本领域已知的。(参见如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1988，通过参考，并入本文)。如本发明中所使用的，术语“表位(epitope)”指抗原上的任何抗原决定簇，抗体的互补位与其结合。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面定群(grouping)诸如氨基酸或碳水化合物侧链组成，通常具有特异性的三维结构特征，以及特异性电荷特征。
[0083]本发明的抗体片段可以通过对抗体进行蛋白质水解作用制备，或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA而制备得到。抗体片段可以通过常规的方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体而获得。例如，抗体片段可以通过用木瓜蛋白酶酶切抗体，给出称为F(ab′)2的5S片段而生产得到。该片段可以进一步使用硫醇还原剂进行切割，和任选地，使用针对由二硫键切割产生的巯基基团的任意封闭剂，从而产生3.5S Fab′单价片段。可选择地，使用木瓜蛋白酶的酶切，直接产生两个单价Fab′片段和一个Fc片段。这些方法例如被Goldenberg，美国专利4,036,945和4,331,647，以及该专利包含的参考文献所描述，这些专利通过参考整体并入本文。也参见Porter，R.R.，Biochem.J.，73：119-126，1959。切割抗体的其他方法，诸如分离重链以形成单价轻-重链片段，对片段的进一步切割，或其他酶促的，化学的，或遗传技术也可以被使用，只要片段能够结合被完整抗体所识别的抗原就可以。
[0084]Fv片段包括VH和VL链的缔合体。该缔合可以是非共价的，如Inbar et al.，Proc.Nat′l ilcad.Sci.USA
69：2659-62，1972中所述。可选择地，该可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学试剂诸如戊二醛进行交联。优选地，这些Fv片段含有通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包括编码VH和VL区域的DNA序列的结构基因制备而得，其中VH和VL区域通过寡核苷酸连接起来。结构基因被插入到表达载体，其随后被导入宿主细胞，诸如大肠杆菌。该重组宿主细胞合成单个多肽链，以连接肽连接两个V结构域。产生sFvs的方法，由下述文献描述，例如：Whitlow and Filpula，Methods，
2：97-105，1991；Bird et al.，Science
242：423-426，1988；Pack etal.，Bio/Technology
11：1271-77，1993；和Ladner等美国专利4,946,778，其通过参考整体并入本文。
[0085]抗体片段的另一种形式是编码单个互补-决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位(minimal recognition units)”)可以通过构建编码感兴趣的CDR的基因而获得。此类基因，例如通过使用聚合酶链反应，从抗体-产生细胞的RNA合成可变区而制备得到。参见例如Larrickand Fry，Methods，
2：106-10，1991。
[0086]本发明方法使用单克隆抗体，该抗体以特异性结合islet 1多肽为特征，其中，Islet 1多肽保留功能活性。
[0087]产生单克隆抗体——其用于本发明方法来免疫捕捉Islet 1多肽——的杂交瘤细胞系可以从商业渠道获得。
[0088]下面的实施例旨在举例说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1
实验程序
小鼠突变体
[0089]产生islet无效突变体的方法已经在前面描述(Pfaff et al，1996)。敲除构建物剔除了编码Islet 1第二个LIM结构域的外显子。Islet1-cre小鼠通常由Thomas M.Jessell提供，且在之前已经被描述过(Srinivas etal，2001)。IRES-cre盒(cassette)被插入到编码Islet1第二个LIM结构域的外显子中，破坏islet基因的表达。
整体RNA原位杂交分析(Whole Mount in situ Hybridization)
[0090]整体RNA原位杂交分析按照之前描述的方法进行(Wilkinson，1999)。有关所被使用的特异性RNA探针的参考文献如下：MLC2a(Kubalak et al.，1994)；MLC2v(O′Brien et al.，1993)；tbx5(Bruneau et al.，1999)；tbx20(未公开的结果)；BMP2、BMP6、BMP7、BMP4、BMP5(Kim et al.，2001；Lyons et al.，1995)；FGF4、FGF8和FGF10(Feldman etal.，1995；Sun et al.，1999)；EHand(Cross et al.，1995)；islet1(EST，GenBank编号：AA198791)(SEQ ID NO：2)；msx2(Liu et al.，1994)。
[0091]利用异羟洋地黄毒苷配基和荧光素-标记探针进行双RNA原位杂交，这些探针偶联有碱性磷酸酶(Roche Cat.#1277073，1685619)。染色反应采用如下物质进行：采用CIP/铁氰化物/氰亚铁酸盐，依据万维网上的Janet Rossant’s实验室方案网址(mshri.on.ca/rossant/protocols/doubleINsitu)和MagentaPhos-tet Red，依据万维网上的Claudio Stem′s实验室方案网址(sternlab.anat.ucl.ac.uk/INSITU)；或者，采用Fast Red(Roche Cat.No.：1496549)和BCIP(碱性磷酸酶的生色底物)；单独地。温育和染色以检测第一抗体(抗-荧光素-AP，Roche Cat.No.：1426338)之后，胚胎在65℃温育1小时，以使得碱性磷酸酶活性发生失活，并在温育之前洗涤，与第二抗体温育和染色以检测第二抗体(抗-异羟洋地黄毒苷配基-AP，Roche Cat.No.：1093274)。对于用Fast Red染色的胚胎，其中FastRed可溶于乙醇，制备冷冻切片。对于用BCIP/铁氰化物/氰亚铁酸盐和MagentaPhos-tet Red染色的胚胎，制备石蜡切片，在乙醇中快速洗涤以最小化信号损失。
扫描电子显微术
[0092]可以利用心脏扫描电子显微术(SEM)的标准程序(Pexieder，1986)。简要地，将胚胎进行乙醇脱水作用，和由氟利昂113至氟利昂23的临界点干燥。干燥的标本置于SEM管上，用300nm金进行离子喷溅，并在扫描电子显微镜中检测。以标准取向(orientations)和放大倍数，拍摄SEM显微照片。
实施例2
未分化的I-细胞的培养
[0093]要从鼠类心脏分离心脏祖先，所使用的方法类似于那些用于从成年器官分离心肌细胞的方法。在胰蛋白酶-消化状态，i-细胞和心脏纤维原细胞具有类似的约35μm的细胞直径，和在Percoll梯度上以同样的组分(fractions)共纯化。通过测试多个条件，开发得到I-细胞培养物，包括在纤连蛋白、胶原蛋白-型-IV或层粘连蛋白上的培养物。测试的培养基条件包括几个浓度的胎牛血清(FCS)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF-BB)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)2+4、胰岛素样生长因子(IGF)1、sonic hedgehoc(Shh)和地塞米松，如下所阐述。
[0094]种植有10个isl 1阳性细胞的96孔板中的约5-10％产生持续的生长培养物，这就表明100个i-细胞中只有约5-10个能够引发i-细胞培养。几个i-细胞群现在已经培养超过12倍的群体倍增。已经发现：在心脏纤维原细胞的滋养层上或在由从心脏新鲜分离的纤维原细胞制成的条件培养基中，生心性前体群只能以无分化的或没有细胞死亡的状态培养。通过对心脏纤维原细胞去除条件培养基或从滋养层分离I-细胞，可以诱导I-细胞分化为肌细胞和神经细胞。经过5至10倍以上的群体倍增之后，形态和表型类似。I-细胞直径约35μm，具有巨大的细胞核，无细胞质，以三维球体形式生长，总是附着到纤维原细胞滋养层。当分离和培养人组织心房的i-细胞时，获得类似的结果。
实施例3
单个I-细胞的体外分化
[0095]接下来，通过加入细胞因子，测试从小鼠和大鼠心脏获得的i-细胞的体外分化能力，其中，细胞因子依据对ES细胞分化成神经外胚层和中胚层已经作出的报道而选择。分化作用要求，i-细胞必须被重新铺板，无滋养层，i-细胞以约1-2×104细胞/cm2的浓度，处于不含血清但含有谱系-特异性细胞因子的培养基中。神经祖先细胞(Neuroprogenitors)可以用PDGF-BB扩增，并通过加入bFGF进行诱导分化(Palmer，et al.，1999)。
[0096]在bFGF处理下，约45％的i-细胞获得星形胶质细胞的形态和表型特征，对胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元具有免疫组织化学阳性，其中神经元被染色成对神经丝200为阳性(NF-200)。肌细胞分化作用获得这样的细胞，该细胞在免疫组织化学实验中对α-肌节肌动蛋白(sarcomeric actin)和α-辅肌动蛋白显示出阳性信号。
实施例4
从小鼠心脏分离出生后心脏祖细胞的分离方案
[0097]将30至50个1天大的小鼠幼崽的心脏从胸部解剖出来，切成四片，在4℃下，不含Ca2+的HBSS(Hank′s balanced salt)溶液中洗涤3次。将心脏转移入0.5mg/ml胰蛋白酶-HBSS溶液中，并在4℃下，在定轨摇床上预先消化过夜(～17小时)。将一半的胰蛋白酶溶液从预先消化的组织去除，剩余部分用温DMEM/M199细胞培养基(4∶1比率)以1∶1稀释，所述培养基含有青霉素(100U/ml)/链霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)。
[0098]将组织在37℃下摇动3-4分钟之后，将稀释的胰蛋白酶从组织去除，将20ml的24U/mlII型胶原酶的HBSS溶液加入到组织溶液中。在37℃下，振荡水浴中温育2分钟之后，弃去最初的胶原酶II型消化液，因为它主要含有血红细胞和死亡的组织细胞。将该组织重新悬浮于12ml的新鲜II型胶原酶溶液中，并在37℃水浴中振荡10分钟。通过加入同样体积的冷的DMEM/M199培养基，使得上清液失活，该DMEM/M199培养基含有10％的马血清和5％的胎牛血清，将失活的上清液保存在冰上。组织重新悬浮和上清液失活作用再反复进行3次，直到组织切片完全被消化。将来自消化液的上清液收集在一起，并以800rpm的转速离心5分钟。上清液含有大部分的心脏间充质细胞，而沉淀含有大部分的心脏肌细胞。
[0099]第二次离心1500rpm，3分钟之后，继而将DMEM中的间充质细胞铺板在塑料上20分钟，DMEM含有青霉素(100U/ml)/链霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分钟之后，通过用PBS进行两步严格的洗涤步骤，将未-附着的细胞从平板去除。
[00100]将附着的心脏间充质细胞在37℃下，用5％CO2培养14-21天。在培养的第二天，当细胞汇合时，将培养基改换为DMEM/F12，DMEM/F12含有B27补体、2％胎牛血清、10ng/ml EGF。10天后，心脏祖群开始在心脏间充质细胞的滋养层顶部开始扩增。
实施例5
从大鼠心脏分离出生后心脏祖细胞的分离方案
[0100]将50个出生1-5天的大鼠幼崽心脏从胸部解剖出来，切成四片，在ADS缓冲液中洗涤2次，ADS缓冲液含有6.8g/l NaCl、4.7g/l HEPES、0.12g/lNaH2PO4、0.14g/lNaH2PO4H2O、1g/l葡萄糖、0.4g/lKCl、0.2g/lMgSO47H2O(pH调整为7.35)。将心脏切片在37℃下，搅拌瓶(stirflask)中，于ADS缓冲液中温育15分钟，ADS缓冲液含有胶原酶II型(115单位/ml)和胰酶(0.8mg/ml)。弃去第一消化物。将18ml的新鲜酶溶液加入到组织中，并37℃搅拌20分钟。
[0101]消化20分钟之后，去除酶溶液，用6ml的新生小牛血清使之失活，将新鲜酶溶液加入到搅拌瓶中的组织切片中，并在37℃下再温育20分钟。将由第一个20分钟消化得到消化物在1000rpm转速下离心6分钟，将沉淀重新悬浮于5ml的新生小牛血清，并在37℃下置于10％CO2。上面的步骤，从酶溶液的去除至沉淀重新悬浮，重复进行4次。
[0102]将每次离心所得到的细胞悬浮液收集起来，并将收集液在1000rpm离心6分钟。将沉淀重新悬浮于12ml的ADS缓冲液中。将细胞悬浮液层铺在Percoll梯度(每一梯度2ml细胞)的顶部。每一Percoll梯度由顶部的4ml Percoll(1.06g/ml)和底部的3ml Percoll(1.08g/ml)组成。
[0103]在缓慢加速和减速下，3000rpm离心30分钟之后，上部的带由心脏间充质细胞组成，界面处的中间带由心脏肌细胞组成。用巴氏吸管收集间充质细胞。
[0104]第二次离心(1500rpm，3分钟)之后，继而将DMEM中的间充质细胞涂布于塑料上20分钟，DMEM包含青霉素(100U/ml)/链霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分钟后，通过用PBS进行两步严格的洗涤步骤，将未-附着细胞从平板去除。
[0105]将心脏间充质细胞在37℃下，用5％CO2培养14-21天。在培养的第二天，当细胞汇合时，将培养基改换为DMEM/F12，DMEM/F12含有B27补体、2％胎牛血清、10ng/mlEGF。10天后，心脏祖群开始在心脏间充质细胞的滋养层顶部开始扩增。
实施例6
心脏祖细胞群表型细胞标记的FACS分析
[0106]在上述实施例4和实施例5中，从出生后的小鼠和大鼠心肌膜分离得到的细胞的表型细胞标记物，分别用FACS分析鉴定。FACS分析显示：90％的细胞表达LIM同源转换区转录因子islet1；～90％的细胞表达果蝇tinman同源物Nkx2.5；和30-40％的细胞共表达中间丝巢蛋白。
实施例7
分化方案
[0107]对于祖群的分化作用，细胞被重新铺板(replated)，无间充质细胞滋养层，密度大约为2×104细胞/cm2，位于含有2％的胎牛血清和谱系-特异性分化试剂的培养基中。
[0108]体外肌细胞分化用条件培养基实施，条件培养基富集逆转录病毒感染的NIH3T3细胞系的wntl 1，细胞系稳定表达和分泌wntl 1。在纤连蛋白包被的培养皿中，用wntl 1条件培养基，随后用2.5ng/ml浓度的BMP2，以连续分化实验方案处理细胞4.4天。然后，将分化的细胞在单细胞实验中进行分析，以分析电生理情形下的通道电流(channelcurrents)和细胞内Ca2+瞬变。
[0109]在层粘连蛋白和多溶素包被的培养皿中，用0.2uM全反式视黄酸(all-trans retinoic acid)和5μM毛喉素实施神经元细胞类型的体外分化，时间10-15天。
[0110]脂肪细胞的体外分化是在塑料培养皿中，用10％的新生小牛血清和5％的胎牛血清实施。
[0111]尽管本发明参考上述实施例而进行描述，应该理解的是，修饰和变化包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由下述权利要求的限定。
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Claims (23)
1.一种用于检测干细胞的方法，包括测定细胞中的Isletl核酸或表达产物的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述测定是免疫组织化学的。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述测定是包括测定IsletlmRNA的存在。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞是生心干细胞。
5.一种用于分离或富集干细胞的方法，包括：将一群细胞与对Isletl具有反应性的试剂相接触，和将所述反应阳性细胞和反应阴性细胞分离开来，从而分离或富集干细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述干细胞是生心干细胞。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述试剂是被可检测地标记的。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述标记物是荧光标志。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述试剂是抗-islet 1抗体。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述分离或富集是通过荧光激活细胞分选分析法进行的。
11.一种用于产生干细胞的方法，包括将表达Islet 1的未分化祖细胞与试剂接触，以便激活或增强Islet 1在所述细胞中的表达，其中，所述试剂激活或增强Isletl在细胞中的表达。
12.如权利要求11所述的方法，其中，Islet 1表达的所述激活或增强导致所述细胞分化为中胚层或神经外胚层谱系。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述谱系是中胚层谱系。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述谱系是神经外胚层谱系。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述未分化祖细胞是啮齿类动物的。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述啮齿类动物细胞是非-肌细胞的心脏细胞。
17.如权利要求11所述的方法，其中，所述未分化祖细胞是人的。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述人细胞是非-肌细胞的心脏细胞。
19.如权利要求11所述的方法，其中，所述干细胞是生心干细胞。
20.一种扩增未分化生心祖细胞的细胞群、而不发生分化的体外方法，包括：
培养分离得到的未分化祖细胞，所述祖细胞在祖细胞足以生长的条件下表达Isletl，其中所述祖细胞足以生长的条件包括：将该细胞培养在种-特异性心脏纤维原细胞的滋养层上或培养在来自心脏的纤维原细胞的条件培养基中。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述未分化祖细胞是非-肌细胞的细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述非-肌细胞是大鼠的、小鼠的或人的细胞。
23.一种组合物，包括Isletl阳性干细胞的富集群，其包括大于90％的Isletl阳性干细胞。
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