CN101426902B

CN101426902B - 将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法

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Publication number: CN101426902B
Application number: CN2007800146073A
Authority: CN
Inventors: 小清水右一; 田中智文; 河岛佳代子; 门仓庆知
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2027-04-27
Also published as: RU2433174C2; WO2007126077A1; US20090325288A1; IL194970A0; JPWO2007126077A1; US8293529B2; EP2014766A1; KR101346047B1; CA2650685C; BRPI0710949A2; AU2007244226A1; CA2650685A1; AU2007244226B2; RU2008146991A; CN101426902A; EP2457994A1; IL194970A; EP2014766A4; KR101234544B1; KR20120139856A

Abstract

本发明提供以高效率有选择地将干细胞分化诱导成心肌细胞对方法。具体提供了将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其包括(i)在从分化诱导开始直至经典(canonical)Wnt基因的表达上升期的24小时前的期间内，在不含促进经典Wnt信号途径的活化的物质的培养液中培养多能性干细胞；然后，(ii)在经典Wnt基因的表达上升期的24～0小时前至24～96小时的期间，在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养。

Description

将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法

技术领域

【0001】

本发明涉及一种有选择地且高效率地由ES细胞等多能性干细胞制备心肌细胞的方法。

背景技术

【0002】

(1)使用多能性干细胞制备心肌细胞

一般而言，心肌细胞在出生前一边自主跳动一边活跃地进行细胞分裂，出生后立刻丧失其分裂能力，而且未分化的干细胞或前体细胞只是极少数存在，其增殖能力和分化能力极低、心肌细胞若由于遭受心肌梗塞和心肌炎等各种应激而死亡，丧失的心肌细胞无法获得补充。其结果是，残存的心肌细胞由于代偿性肥大而保持心脏机能，若各种应激持续进行，超出其允许的范围，则引起进一步的心肌细胞的疲惫、死亡，呈现出心肌机能的降低(即心力衰竭)。

【0003】

以心力衰竭为代表的心脏病位居日本死亡原因的第2位，其预后极差，心脏疾病患者的5年存活率在50％左右。因此，可以认为治疗效果高的心力衰竭治疗法的开发与医疗福利的大幅前进以及医疗经济的改善相关联。作为心力衰竭治疗药，一直以来使用的是使心肌的收缩力增加的洋地黄制剂和黄嘌呤制剂等强心剂，已知由于长期给药这些药物过度消耗心肌能量，因此使病情恶化。而且，最近，用通过交感神经系统和高血压蛋白原酶-血管紧张素系的亢进而减轻过剩的心脏负荷的β阻断剂和ACE抑制药进行的治疗日益成为主流，然而这些只不过是对症的治疗方法，并不能使受到伤害的心脏组织回复到原样。与之相对，心脏移植是一种针对重症心力衰竭的根本的治疗方法，由于器官提供者的不足和医疗伦理、患者的肉体的、经济的负担重等问题，这种方法难以作为一般的治疗方法频繁使用。

【0004】

因此，可以认为补充性移植衰弱或丧失的心肌细胞的方法对于心力衰竭的治疗极为有用。事实上，已知在使用动物的实验中，若从胎儿中获得未成熟的心肌细胞，将其移植到成体心脏组织中，移植细胞作为心肌细胞有效地发挥功能(参照非专利文献1)。但是，该方法难以获得大量的心肌细胞，从伦理的观点考虑，也难以应用于临床医疗。

【0005】

因此，未分化的干细胞分化诱导成心肌细胞，将其作为移植用细胞使用的方法近年来尤为受到关注。现在，由于在成体心脏组织中没有发现可以清楚鉴定为可以产生心肌细胞的前体细胞或干细胞的细胞群，因此为了实施上述方法，可以考虑使用未分化的具有更丰富的分化能力的多能性干细胞。

【0006】

所谓多能性干细胞(pluripotent stem cells)，被定义为通过离体培养仍然保持未分化状态，基本可以持续或长期细胞增殖，呈现正常的核(染色体)型，具有在适当的条件下分化成所有三个胚层(外胚层、中胚层、和内胚层)系统的细胞的能力的细胞。作为多能性干细胞，最熟知的是分离自初期胚的胚胎干细胞(embryonic stem cells：ES细胞)和分离自胎儿期的原始生殖细胞的胚胎生殖细胞(embryonicgerm cells：EG细胞)、出生后立即从精巢中分离的生殖细胞系干细胞(germline stem cells：GS细胞)等。

【0007】

从以前就知道，尤其是ES细胞，通过离体培养，可以分化成心肌细胞。初期的研究基本都是使用小鼠来源的ES细胞进行。若ES细胞在单一细胞状态(通过实施酶处理等细胞之间不粘附，各个细胞分散的状态)下，不存在白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor：LIF)等分化抑制因子下进行悬浮培养，则ES细胞之间粘附、凝集，形成被称为胚状体(embryoid body：EB)的初期胚类似的结构体。已知，这之后，通过在悬浮状态或粘附状态下培养EB，出现具有自主跳动性的心肌细胞。

【0008】

按上述方式制备的ES细胞来源心肌细胞呈现出与胎儿心脏来源的未成熟的心肌细胞极为相似的性状(参照非专利文献2、3)。而且，实际上，在将ES细胞来源心肌细胞移植到成体心脏组织中的动物实验例中，与移植了胎儿心肌的例相比基本没有变化，因此确认也具有极高有效性(参照专利文献1、非专利文献4)。

【0009】

1995年，Thomson等人首次从灵长类中建立ES细胞，逐渐带来了使用来源于多能性干细胞的心肌细胞的心肌再生治疗法的实用化的现实意义(专利文献2、非专利文献5参照)。接着，他们从人初期胚中成功地分离并建立了人ES细胞株(参照非专利文献6)。而且，Gearhart等人由人原始生殖细胞建立了hEG细胞株(参照非专利文献7、专利文献3)。

【0010】

Kehat等人(参照非专利文献8)和Xu等人(参照专利文献4、非专利文献9)报道了，与小鼠ES细胞相同，也可以由人ES细胞分化诱导心肌细胞。若根据这些报道，由人ES细胞分化诱导的心肌细胞具有自主跳动能力，在表达产生肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I(Troponin I)、心房性利尿肽(atrial natriureticpeptide；ANP)等心肌特异的蛋白质、GATA-4和Nkx2.5、MEF-2c等心肌特异的转录因子的同时，根据细微解剖学观察和电生理学分析，可期待胎生期的未成熟的心肌细胞的性质得意维持，应用于再生医疗。

【0011】

另一方面，作为来源于多能性干细胞的心肌细胞在用于细胞移植治疗和其它目的使用时的重要问题，可以列举用以往的方法由ES细胞或EG细胞所形成的EB中在心肌细胞以外还混合了血细胞系统细胞和血管系统细胞、神经系统细胞、肠道系统细胞、骨、软骨细胞等其它细胞。而且，在这些分化的细胞中，心肌细胞所占的比例不怎么高，只不过为总体的5～20％左右。

【0012】

从混合有其它种类的细胞混合物中，有选择地选择心肌细胞的方法，可列举通过对ES细胞的基因人为地进行修饰，使之被赋予药物耐受性或异位性表达能力，回收具有作为心肌细胞或其前体细胞的性状的细胞的方法。例如、Field和共同研究者们通过在小鼠ES细胞中导入位于α型肌球蛋白重链启动子控制下的可以表达新霉素(G418)耐受性基因的基因盒，只有该ES细胞分化成心肌细胞，伴随其表达α型肌球蛋白重链基因时，构建出了在添加了G418的培养基中可以生存的系统(参照专利文献1、非专利文献4)。且发现通过该方法选择为G418耐受性细胞的细胞以99％以上的几率为心肌细胞。但是，虽然该方法中心肌细胞的纯度极高，但是最终获得的心肌细胞数仅仅为全部细胞数的几个百分比左右，所以难以获得移植治疗所必需的心肌细胞。

【0013】

而且，Xu等人报道了通过用5-氮杂胞嘧啶核苷处理人ES细胞，EB中的肌钙蛋白I阳性(心肌)细胞由15％增加到44％(参照非专利文献9)。但是，即使是该方法中，心肌细胞所占的比例也不超过EB中的50％。而且，去甲基化剂5-氮杂胞嘧啶核苷是通过使结合于DNA的甲基去除而使基因的表达状态变化的药物，由于药物直接作用于染色体，作为制备移植用细胞的药物并不合适。

【0014】

此外，作为使ES细胞高效生成心肌细胞的方法，例如，在小鼠ES细胞中，添加视黄酸(参照非专利文献10)和抗坏血酸(参照非专利文献11)、TGFβ、BMP-2(参照非专利文献12)、PDGF(参照非专利文献13)、强啡肽B(Dynorphin B)(参照非专利文献14)、或使细胞内的活性氧类(reactive oxygen specieS：ROS)(参照非专利文献15)和Ca²⁺(参照非专利文献16)增加的处理方式促进性作用于心肌细胞的分化诱导，可这些方法的任何一个方法都无法形成心肌细胞特异的或选择性的分化诱导。最近，包括发明人在内的研究组公开了，若通过用BMP拮抗剂瞬时处理ES细胞，就可以以比以往的方法更高效地有选择性地分化诱导心肌细胞(专利文献5、非专利文献17)。

【0015】

(2)心肌细胞的分化和/或发育过程中Wnt蛋白质功能的发挥

分泌性蛋白质Wnt蛋白质是被确认了其广泛存在于脊椎动物以及线虫或昆虫等无脊椎动物中的蛋白家族中的一群，已知该基因家族中有多种分子种类(非专利文献18、19)。例如、现已判明与人和小鼠相关的有19种(Wnt-1、2、2b/13、3、3a、4、5a、5b、6、7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a、10b、11、16)。这些由Wnt基因编码的Wnt蛋白质群其组织特异性各不相同，然而结构却相互类似。

【0016】

Wnt蛋白质作为配体有助于细胞内信号传递系统时，与存在于细胞膜上的7次跨膜Frizzled(Frizzled；以下、Fzd)家族受体结合。有多个在Fzd受体的下游作用的途径，但作为最主要的途径，可以列举由糖原合成酶激酶(Glycogen Synthase Kinase：GSK)-3β介导的β连环蛋白的磷酸化抑制。不存在Wnt信号时，β连环蛋白与GSK-3β在APC(Adenomatous polyposis coli)蛋白上通过洋虫胶(Axin)一起被补充，被GSK-3β迅速地磷酸化。被磷酸化的β连环蛋白受到泛素化而被蛋白酶体分解。

【0017】

另一方面，Wnt蛋白质一旦与Fzd受体结合，细胞内因子蓬乱蛋白(Dishevelled)就被活化，从而补充GSK-3β，β连环蛋白不被磷酸化，在细胞质内作为游离型残留并同时转移到核内。核内转移的β连环蛋白通过与存在于核内的淋巴细胞活化因子-1/T细胞因子(Lymphoid enhancer factor-1/T cell factor；以下、LEF-1/TCF)结合而形成转录活化复合体，诱导目的基因的转录。将伴随这样的β连环蛋白的蓄积和核内转移的信号传递途径称为“古典的”Wnt途径、或经典Wnt(canonical Wnt)信号途径，可活化该途径的Wnt-1或Wnt-3a、Wnt-8a等家族分子类被称为经典Wnt。公知的是即使在通过各种GSK-3β抑制剂进行的处理中也同样会引起经典Wnt信号途径的活化。

【0018】

已知Wnt配体也通过Fzd受体活化β连环蛋白途径以外的信号传递途径，可以列举活化MAP激酶的1种JNK(Jun N-末端激酶)的平面内细胞极性(Planar cell polarity：PCP)途径、通过三聚物型G蛋白质的活化和接连发生的磷脂酶(Phospholipase)C的活化使得细胞内Ca²⁺浓度上升以及蛋白质激酶C活化的Ca²⁺途径(非专利文献19、20)。这些途径相对于经典Wnt信号途径，被称为“非古典的”Wnt途径、或非(non)经典(non-canonical)Wnt信号途径。据报道Wnt-4和Wnt-11是可以活化该途径的Wnt家族分子，这些Wnt配体对经典Wnt信号途径有抑制作用。

【0019】

而且，在Wnt蛋白质的分子种类中，根据作用的细胞种类和其分化阶段，该细胞中表达的Fzd受体的差异，也存在可以活化经典途径和非经典途径这两者的种类。例如，已知Wnt-5a在非洲爪蛙胚的2次轴形成和乳腺上皮细胞的癌化等一般的测试系统中作为非经典Wnt作用，但另一方面，对于ES细胞，诱导β连环蛋白的稳定化和转录活性，也就是说使经典Wnt信号途径活化(非专利文献21)。

【0020】

已知Wnt蛋白质在各种细胞、组织或癌的发生、增殖、分化过程中，与各种各样的生物学功能相关。在发育初期过程中，心肌细胞从侧板中胚层的一部分出现，然后，一边重复细胞分裂一边增殖，渐渐形成心脏。在该过程中，Wnt信号的有无承担着重要的作用，这从几个事例就可以清楚。例如，在鸡和非洲爪蛙的发育初期过程中，使经典Wnt信号途径活化的Wnt-3a和Wnt-8a基因的异位的和/或强制性表达可显著抑制心脏的形成(非专利文献22、23)。

【0021】

另一方面，与Wnt-3a或Wnt-8a结合，具有抑制该信号传递作用的Frzb和Dkk-1等所有的Wnt拮抗剂促进心形成，由此提示经典Wnt信号对心肌发育有抑制性作用。

【0022】

与之相反，已知拮抗性作用于经典Wnt信号的非经典Wnt信号途径的活化可促进性诱导心肌细胞的发育、分化。Pandur等人(非专利文献24)已阐明不使经典途径活化，而使非经典途径活化的Wnt-11是非洲爪蛙的心脏发育所必需的因子。然后，在小鼠ES细胞(非专利文献25)和人的血管内皮前体细胞(非专利文献26)的心肌分化诱导系统中也同样确认了Wnt-11的促进效果。而且，已知与非经典Wnt信号途径的活化相关，可以由舌组织分化诱导心肌细胞(专利文献6)。

【0023】

另一方面，与上述事例不同，已知经典Wnt信号途径的活化促进性地作用于胚胎性癌细胞(Embryonic carcinoma cells：EC细胞)的心肌分化。作为EC细胞中的1种的P19细胞的亚株、P19CL6细胞具有在二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide：DMSO)刺激下向心肌细胞分化的性质，然而如果在培养基中添加Wnt-3a或Wnt-8，则促进了伴随β连环蛋白稳定化的向心肌细胞的分化(非专利文献27)。而且，显示出，在本系统中，添加Wnt蛋白质的时机，在紧随分化诱导后前4天内是很不错的(非专利文献28)。

【0024】

在P19细胞系可以分化诱导成心肌细胞和神经细胞这一方面，一部分呈现出类似于ES细胞的性状。但是，P19细胞系不具有ES细胞的多种分化能力和嵌合体形成能力，而且，发现细胞表面标志和表达基因等，也有很大差异。即，虽然存在P19细胞系在某种实验中作为ES细胞的模式系统使用的情况，然而很难说它一定是具有与ES细胞相同的性状的细胞，本实验系统中获得的发现是：尚且还无法有科学根据地进行预测是否可以推定那样的ES细胞等可以作为多能性干细胞的心肌分化诱导系统。

【0025】

最近，报道了在使用小鼠ES细胞的实验系统中，通过从分化诱导开始的前3天内添加经典Wnt即Wnt-3a蛋白，ES细胞的心肌分化受到促进(Naito A等人、第28次日本分子生物学会年会、2005.12.7～10、博多、日本；非专利文献30)。但是，在我们的相同的研究中，并没有发现显著的分化促进效果(实施例2)，而且，其它研究组通过对小鼠ES细胞进行Wnt-3a处理也没有引起特别显著的心肌分化诱导效果(非专利文献25)，或者也没有关于存在抑制效果效果(非专利文献29)的报告。即，经典Wnt信号途径的活化对以ES细胞为代表的多能性干细胞对心肌分化的效果并不明确，不能认为已建立了用于诱导心肌分化的最佳培养法。

专利文献1：美国专利第6,015,671号

专利文献2：美国专利第5,843,780号

专利文献3：美国专利第6,090,622号

专利文献4：WO03/06950号

专利文献5：WO2005/033298

专利文献6：特开2005-224155

非专利文献1：Soonpaa MH et al.，Science，264：98，1994

非专利文献2：Maltsev VA et al.，Mechanism of Developement，44：41，1993

非专利文献3：Maltsev VA et al.，Circulation Research，75：233，1994

非专利文献4：Klug MG et al.，Journal of Clinical Investigation，98：216，1996

非专利文献5：Thomson JA et al.，Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America，92：7844，1995

非专利文献6：Thomson JA et al.，Science，282：114，1998

非专利文献7：Shamblott MJ et al.，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，95：13726，1998

非专利文献8：Kehat I et al.，Journa l of Clinical Investigation，108：407，2001

非专利文献9：Xu C et al.，Circulation Research，91：501，2002

非专利文献10：Wobus AM et al.，Journal of Molecular and cellularCardiology，29：1525，1997

非专利文献11：Takahashi T et al.，Circulation，107：1912，2003

非专利文献12：Behfar A et al.，FASEB Journal，16：1558，2002

非专利文献13：Sachinidis et al.，Cardiovascular Research，58：278，2003

非专利文献14：Ventura Cet al.，Circulation Research，92：623，2003

非专利文献15：Sauer H et al.，FEBS Letters，476：218，2000

非专利文献16：Li J et al.，Journal of Cell Biology，158：103，2002

非专利文献17：Yuasa S et al.，Nature Biotechnology，23：607，2005

非专利文献18：Nusse R，Cell Research，15：28，2005

非专利文献19：Widelitz R，Growth Factors，23：111，2005

非专利文献20：Luhl M et al.，Trends in Genetics，16：279，2000

非专利文献21：Hao J et al.，Developemental Biology，290：81，2006

非专利文献22：Schneider VA & Mercola M、Genes and developement，15：304，2001

非专利文献23：Marvin MJ et al.，Genes and Developement，15：316，2001

非专利文献24：Pandur P et al.，Nature，418：636，2002

非专利文献25：Terami H et al.，Biochemical and BiophysicalResearch Communication，325：968，2004

非专利文献26：Koyanagi M et al.，Journal of Biologycal Chemistry，260：16838，2005

非专利文献27：Nakamura T et al.，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，100：5834，2003

非专利文献28：Nai to AT et al.，Circulation Research，97：144，2005

非专利文献29：Yamashita JK et al.，FASEB Journal，19：1534，2002

非专利文献30：Naito AT et al.，Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America，103：19812，2006

发明内容

发明要解决的问题

【0026】

本发明的问题在于提供通过通过活化经典Wnt信号途径，高效率且选择性地将未分化的多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法；通过该方法获得的心肌细胞；以及在以心脏病作为目标的细胞移植、注入、其它治疗中使用该细胞的方法等。

用于解决问题的方法

【0027】

本发明人等使用多能性干细胞、尤其是使用最频繁的细胞-ES细胞作为制备心肌细胞制的干细胞源，对向心肌细胞或其前体细胞分化诱导的条件反复进行了各种研究，结果发现，培养时的某个时期，通过在培养基中添加促进经典Wnt信号途径的活化的物质(以下、Wnt信号活化物质)，相对于通常的方法选择性地以极为高效率产生被认为是具有跳动能力的心肌细胞的细胞，从而完成了本发明。

【0028】

作为可以在本发明中使用的多能性干细胞，可以列举小鼠、猴、人等哺乳动物来源的ES细胞、EG细胞、GS细胞、以及所有与ES细胞具有类似性状的多能性干细胞。此时，所谓与ES细胞类似的性状是指可以定义为在ES细胞中存在特异的表面(抗原)标记，或ES细胞特异的基因表达、或畸胎瘤(teratoma)形成能力或嵌合小鼠形成能力、这样的在ES细胞中存在的特异性的细胞生物学的性质。

【0029】

本发明中，作为促进经典Wnt信号途径活化的物质的具体例子，可以列举各种经典Wnt蛋白质、GSK-3β抑制剂、其它可以活化经典Wnt信号途径的低分子化合物等。而且，还可以使用可以活化经典Wnt信号途径的基因、例如各种经典Wnt基因、β连环蛋白基因、或失去其N末端而被GSK-3β将磷酸化部位取代为非磷酸化氨基酸的β连环蛋白基因活性型变异体等。

【0030】

在本发明中，所谓经典Wnt蛋白质被定义为Wnt家族蛋白质群中与Fzd家族受体结合，通过GSK-3β抑制β连环蛋白的磷酸化，促进β连环蛋白的稳定化以及转录活性能的物质。作为本发明所涉及的合适的经典Wnt蛋白质，可以列举例如、Wnt-1和Wnt-3a、Wnt-5a、Wnt-8a等，进而还可以列举在氨基酸序列中与该蛋白质具有80％以上、更优选90％以上的同源性且具有β连环蛋白活化能力的蛋白质。

【0031】

本发明的一个特征在于用Wnt信号活化物质瞬间刺激ES细胞等多能性干细胞，作为这种刺激方法，没有特别的限定，优选可以列举在含有经典Wnt蛋白质、例如、通过使纯化的经典Wnt基因表达而获得的重组蛋白质(以下、重组Wnt蛋白质)的培养基中进行培养的方法。使用的经典Wnt蛋白质和编码其的基因优选为与多能性干细胞来源的物种同种的动物来源，也可以使用其它种动物来源的。在使用重组Wnt蛋白质时，无菌地去除不新鲜的培养基，在含有浓度为0.1ng/mL～500ng/mL、优选1ng/mL～200ng/mL、更优选10ng/mL～100ng/mL的重组Wnt蛋白质的培养基中进行培养。

【0032】

本发明中涉及的所谓GSK-3β抑制剂被定义为抑制GSK-3β蛋白质的激酶活性(例如对β连环蛋白的磷酸化能力)的物质，已知的有数十种以上，作为其具体例子，可以列举靛玉红衍生物即BIO(别称：GSK-3β抑制因子IX；6-溴靛玉红3′-肟)、马来酰亚胺衍生物即SB216763(3-(2，4-二氯苯)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)、苯基α溴甲基酮化合物-GSK-3β抑制因子VII(4-溴代苯乙酮)、细胞膜透过型磷酸化肽-L803-mts(别称：GSK-3β肽抑制因子；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂)等。这些化合物从Calbiochem公司和Biomol公司等处购买，可以容易地使用，没有特别的限制。

【0033】

在使用这些GSK-3β抑制剂时，根据其物质特性的差异，其最适浓度差异很大。因此，需要根据所使用的化合物种类改变最适浓度。例如、BIO和SB216763，优选用含有浓度为10nmol/L～1μmol/L、更优选50nmol/L～200nmol/L的GSK-3β抑制剂的培养基替代，再继续培养。GSK-3β抑制因子VII的添加浓度优选为2μmol/L～100μmol/L，更优选5μmol/L～20μmol/L。L803-mts的添加浓度优选为5μmol/L～500μmol/L、更优选20μmol/L～200μmol/L、更优选25μmol/L～200μmol/L。

【0034】

而且，作为在本发明的实施中使用的药物，除了GSK-3β抑制剂以外，还可以是促进经典Wnt信号途径活化的低分子物质(以下、Wnt激动剂)，作为合适的例子，可以列举氨基嘧啶衍生物(2-氨基-4-[3，4-(亚甲二氧)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)-嘧啶；Calbiochem社)(Liu et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.44：1987，2005)。在使用该Wnt激动剂时，使用含有浓度为1nmol/L～1000nmol/L、优选10nmol/L～500nmol/L、更优选50nmol/L～200nmol/L的Wnt激动剂的培养基替换，继续培养。

【0035】

使Wnt信号活化物质作用时，可以以在本发明的实施中使用的多能性干细胞的分化诱导过程中各种经典Wnt基因的表达模式作为指标来确定。具体而言，基于常规方法，分化诱导多能性干细胞，从经时回收的试样中提取mRNA，用RT-PCR法等一般的方法研究各种经典Wnt基因的表达量，分化诱导后经典Wnt基因的表达量比分化诱导前未分化的多能性干细胞有显著上升时为“Wnt基因的表达上升期”。作为分析对象的经典Wnt基因可以是1种，但理想的是优选2种以上，更优选3种以上。

【0036】

本发明的实施中，多能性干细胞在用于心肌分化诱导的培养开始后即刻起，到用上述方法确定出Wnt基因的表达上升期的24小时前这段期间，在不含Wnt信号活化物质的培养基中进行培养。而且，在用上述方法确定的Wnt基因的表达上升期的24小时前～0小时前、优选从24小时前的时间点开始、优选24小时～96小时、更优选48小时～72小时、在含有Wnt信号活化物质的培养基中培养多能性干细胞。而且，使Wnt信号活化物质作用期间，可以根据所使用的细胞来源的动物种类、所使用的细胞株、使用的Wnt信号活化物质种类等条件的差异，改变最适时间再使用。

【0037】

根据上述方法，从以ES细胞为代表的多能性干细胞中分化诱导的心肌细胞、接着用公知方法进行细胞回收、分离，通过使用纯化方法可以有效且大量地获得高纯度的心肌细胞。以下，将这样获得的心肌细胞称为根据本发明制备的心肌细胞。

【0038】

根据本发明制备的心肌细胞是呈现心肌细胞的形态学的、生理学的和/或免疫学的特征的细胞。生理学的和/或免疫学的特征没有特别的限定，根据本发明制备的心肌细胞被识别为心肌细胞，只要发现在心肌细胞中特异性表达1个或其以上的标记即可。

【0039】

而且，根据本发明制备的心肌细胞可以在用于鉴定促进心肌细胞的发育或分化诱导、再生、生存等的新型因子或具有可能性的化疗药物的筛选方法中使用。

【0040】

进而，根据本发明制备的心肌细胞可以在治疗处于心脏疾病状态的心脏的方法中使用。

【0041】

也就是说，不限于这些，本发明涉及以下事项。

(1)将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其包括(i)在从分化诱导开始到经典Wnt基因的表达上升期的24小时前的时期内，在不含促进经典Wnt信号途径的活化的物质的培养液中培养多能性干细胞；然后，

(ii)在经典Wnt基因的表达上升期的24～0小时前至24～96小时的期间内，在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养。

(2)根据(1)所述的方法，从到达经典Wnt基因的表达上升期的24小时前开始在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞的时间为48～72小时。

(4)根据(1)～(3)任一项所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质是选自于经典Wnt蛋白质、GSK3β抑制剂和Wnt激动剂的物质。

(5)根据(4)所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质是经典Wnt蛋白质。

(6)根据(5)所述的方法，经典Wnt蛋白质是选自于Wnt-1、Wnt-3a和Wnt-5a中的至少一种Wnt蛋白质。

(7)根据(5)或(6)所述的方法，经典Wnt蛋白质在培养液中的浓度为0.1ng/mL～500ng/mL。

(8)根据(4)所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质是GSK3β抑制剂。

(9)根据(8)所述的方法，GSK3β抑制剂是选自于GSK3β抑制因子VII、L803-mts、SB216763、和GSK3β抑制因子IX(BIO)中的至少一个抑制剂。

(10)根据(8)或(9)所述的方法，GSK3β抑制剂在培养液中的浓度，当是GSK3β抑制因子VII的情况下为2μmol/L～100μmol/L、当是L803-mts的情况下为5μmol/L～500μmol/L、当是SB216763的情况下为10nmol/L～1μmol/L、或、在为GSK3β抑制因子IX(BIO)时为10nmol/L～1μmol/L。

(11)根据(4)所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质为Wnt激动剂。

(12)根据(11)所述的方法，Wnt激动剂为氨基嘧啶衍生物。

(13)根据(11)或(12)所述的方法，Wnt激动剂在培养液中的浓度为1nmol/L～1000nmol/L。

(14)根据(1)～(13)所述的方法，多能性干细胞为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、或生殖细胞系干细胞。

(15)根据(14)所述的方法，多能性干细胞为胚胎干细胞(14)。

(16)(14)或(15)所述的方法，多能性干细胞来源于人。

发明的效果

【0042】

通过使用本发明中涉及的方法，可以由ES细胞等多能性干细胞极为有效且选择性地生产心肌前体细胞和心肌细胞。通过本发明所涉及的方法制备的心肌(前体)细胞可以用于探询和开发对心脏疾病治疗有效的药物中，与此同时也存在着可以应用于针对严重的心脏疾病的心肌移植治疗中的可能性。

附图的简要说明】

【0043】

图1A表示在BS细胞分化诱导的过程中Wnt基因等的表达变化。图中的符号的含义如下所示。○：未处理组、■：腱蛋白(Chordin)处理组、▲：Dan处理组。纵轴表示Wnt基因表达量相对于作为内部标准使用的GAPDH基因的表达量的相对比例。而且，※表示该Wnt基因的表达量与分化诱导前未分化的ES细胞相比显著上升的时间点。

图1B表示ES细胞分化诱导时的过程中Wnt基因等的表达变化。图中的符号的含义如下所示。○：未处理组、■：腱蛋白处理组、▲：Dan处理组。纵轴表示Wnt基因表达量相对于作为内部标准使用的GAPDH基因的表达量的相对比例。而且，※表示该Wnt基因的表达量与分化诱导前未分化的ES细胞相比显著上升的时间点。

图1C表示ES细胞分化诱导时的过程中Wnt基因等的表达变化。图中的符号的含义如下所示。○：未处理组、■：腱蛋白处理组、▲：Dan处理组。纵轴表示Wnt基因表达量相对于作为内部标准使用的GAPDH基因的表达量的相对比例。而且，※表示该Wnt基因的表达量与分化诱导前未分化的ES细胞相比显著上升的时间点。

图2A表示根据向培养液中添加重组Wnt蛋白质时间的不同对跳动性EB出现的影响。

图2B表示根据向培养液中添加重组Wnt蛋白质时间的不同对跳动性EB出现的影响。

图3A表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为1时的相对比例。

图3B表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为1时的相对比例。

图3C表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为1时的相对比例。

图3D表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为1时的相对比例。

图4表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标志蛋白质的免疫组织化学染色。

图5A表示由GSK3β抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。

图5B表示由GSK3β抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。

图5C表示由GSK3β抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。

图5D表示由GSK3β抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。

图5E表示由GSK3β抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。

图6表示在普通绒猴(猴)ES细胞的分化诱导过程中Wnt-3基因的表达变动。

图7表示在由于cmES细胞的分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标记基因的表达。

图8表示在由于cmES细胞的分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细胞特异的标志蛋白质的免疫组织化学的染色。

用于实施发明的方式

【0044】

以下，就用于实施包括本发明的上述效果和其它优点和特征的发明的方式进行描述。

【0045】

本发明的实施中，分子生物学和重组DNA技术等基因工程方法和一般的细胞生物学方法和现有技术，若没有特别表示，实施者可以参照本领域标准的书籍。作为这种书籍，可以列举例如、「分子克隆：实验室手册第3版」(Sambrook&Russell、冷泉港实验室出版、2001)；「Current Protocols in Molecular biology」(Ausubel et al.编、John Wiley&Sons、1987)；「Methods in Enzymology系列」(AcademicPress)；「PCR Protocols：Methods in Molecular Biology」(Bartlett&Striling编、Humana Press、2003)；「Animal Cell Culture：APractical Approach第3版(Masters编、Oxford University Press、2000)；「Antibodies：A Laboratory Manual」(Harlow et al.&Lane编、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1987)等。而且，本说明书中所参照的用于细胞培养、细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从Sigma公司或Aldrich公司、Invit rogen/GIBCO公司、Clontech公司、Stratagene公司等商家获得。

【0046】

而且，使用多能性干细胞的细胞培养、和发育·细胞生物学实验的一般方法，实施者可以参照本领域的标准书籍。这其中包括「Guide toTechniques in Mouse Development」(Wasserman et al.编、AcademicPress，1993)；「Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro」(M.V.Wiles、Meth.Enzymol.225：900，1993)；「Manipulatingthe Mouse Embryo：A laboratory manual」(Hogan et al.编、ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994)；「Embryonic Stem Cells」(Turksen编、Humana Press，2002)。本说明书中参照的用于细胞培养、发育、细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从Invitrogen/GIBCO公司或Sigma公司等商家获得。

【0047】

小鼠和人的多能性干细胞的制备、传代、保存法，已经建立了标准的规程，实施者除了参照前面列举的参考书籍之外，还可以通过参照多种参考文献等来使用这些多能性干细胞。作为这种文献，可以列举以下文献：Matsui et al.，Cell70：841，1992；Thomson et al.，美国专利第5,843,780号；Thomson et al.，Science282：114，1998；Shamblott et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13726，1998；Shamblott et al.，美国专利第6,090,622号；Reubinoff et al.，Nat.Biotech.18：399，2000；国际公开号第00/27995号。此外，至于其它动物种，就例如猴(Thomson et al.，美国专利第5,843,780号；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7844，1996)，大鼠(Iannacconeet al.，Dev.Biol.163：288，1994；Loring et al.，国际公开号第99/27076号)、鸡(Pain et al.，Development122：2339，1996；美国专利第5,340,740号；美国专利第5,656,479号)、猪(Wheeleret al.，Reprod.Fertil.Dev.6：563，1994；Shim et al.，Biol.Reprod.57：1089，1997)等而言，已知有ES细胞或ES细胞样细胞的建立方法，按照各记载的方法，可以制备使用可以在本发明中使用的ES细胞。

【0048】

本公开中，所谓“心肌细胞”，被定义为包括具有将来可形成功能性心肌细胞的能力的心肌前体细胞、胎儿型心肌细胞、成体型心肌细胞这所有分化阶段的细胞，通过以下记载的至少一个、优选多种方法，可以可确认具有至少一个、优选多个标记或基准的细胞。

【0049】

通过以往生物化学的或免疫化学的方法检测心肌细胞中特异的各种标记的表达。该方法没有特别的限定，优选使用免疫组织化学染色法和免疫电泳等免疫化学方法。这些方法中，可以使用与心肌前体细胞或心肌细胞结合的标记特异的多克隆抗体或单克隆抗体。以各个特异标记作为目的的抗体是商购的，可以容易地使用。作为在心肌前体细胞或心肌细胞中特异的标记，可以列举例如、肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、TroponinI、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。

【0050】

或者，对心肌前体细胞或心肌细胞特异的标记的表达并没有特别的方法，但可以通过逆转录酶介入性聚合酶链式反应(RT-PCR)和杂交分析等用于扩增、检测、分析编码任意标志蛋白质的mRNA的一直以来经常使用的分子生物学的方法进行确认。编码在心肌前体细胞或心肌细胞中特异性标记(例如、肌球蛋白重链/轻链和α-辅肌动蛋白、TroponinI、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白质的核酸序列是已知的，在国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的GenBank等各种公共数据库中可以使用，可以容易地确定用于作为引物或探针使用的所需要的标记特异的序列。

【0051】

进而，为了确认多能性细胞向心肌细胞的分化，还可以追加性使用生理学的基准。也就是说，以多能性细胞来源的细胞具有自律的跳动性，各种离子通道表达，可以在电生理刺激中反应等作为有用的指标。

【0052】

本发明的方法还可以对于任意哺乳动物来源的多能性干细胞进行使用。例如、可以对于小鼠、牛、山羊、狗、猫、绒猴、罗猴、人来源的多能性干细胞使用，但并非仅限于这些动物种类来源的多能性干细胞。例如、作为可以在本发明中使用的多能性干细胞，可以列举已作为培养细胞被广泛使用的小鼠、猴、人等哺乳动物来源的ES细胞。

【0053】

作为小鼠来源的ES细胞的具体例子，可以列举EB3细胞、E14细胞、D3细胞、CCE细胞、R1细胞、129SV细胞、J1细胞等。本申请发明中涉及的小鼠来源的ES细胞可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和Chemicon公司、Cell&Molecular Technologies公司等获得。

【0054】

作为猴来源的ES细胞，已报道了从罗猴(rhesus monkey：Macacamulatta)(Thomson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7844，1995)和食蟹猴(cynomolgus monkey：Macaca fascicularis)(Suemoriet al.，Dev.Dyn.222：273，2001)、普通绒猴(common marmoset：Callithrix jacchus)(Sasaki et al.，Stem Cells.23：1304，2005)中建立，可以使用。例如、绒猴BS细胞还可以从财团法人·实验动物中央研究所获得。

【0055】

人来源ES细胞现在在全世界已建立了数10种以上，例如、美国·国立卫生研究所的表(http://stemcells.nih.gov/registry/index.asp)中登录了多种细胞株，这些都可以使用，而且还可以从Cellartis公司和ES Cell International公司、Wisconsin AlumniResearch Foundation等购入。而且，在日本，还可以从国立大学法人、京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心获得(Suemori et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，345：926，2006)。

【0056】

而且，就牛(Mitalipova et al.，Cloning3：59，2001)、鸟(Petitte et al.，Mech.Dev.121：1159，2004)、斑马鱼(Fishman，Science294：1290，2001)而言，据报道已经建立了ES细胞。

【0057】

一般而言ES细胞是通过培养初期胚而建立的，但也可以从核移植了体细胞的核的初期胚中制备ES细胞(Munsie et al.，Curr.Biol.10：989，2000；Wakayamaetal.，Science292：740，2001；Hwanget al.，Science303：1669，2004)。而且，据报道还尝试使单性发育胚发育至与胚泡期同等阶段，从其中制备ES细胞(美国专利公开第02/168763号；Vrana K et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：11911-6)、以及通过使体细胞与ES细胞融合，从而制备具有体细胞核的遗传信息的ES细胞的方法(国际公开号第00/49137号；Tadaet al.，Curr.Biol.11：1553，2001)。本发明中使用的ES细胞还包括用基因工程学方法改变按这种方法制备的ES细胞或ES细胞的染色体上的基因而获得的细胞。

【0058】

而且，可以在本发明中涉及的方法中使用的多能性干细胞不仅限于ES细胞，包括所有哺乳动物的成体器官和组织的细胞、骨髓细胞、血液细胞、以及所有来源于胚或胎儿的细胞等且具有与ES细胞类似的性状的多能性干细胞。此时，所谓与ES细胞类似的性状可以定义为，具有在ES细胞中存在特异性表面(抗原)标记，ES细胞特异的基因表达、或畸胎瘤(teratoma)形成能力和嵌合小鼠形成能力等ES细胞中所具有的特异性的细胞生物学性质。作为这种具体例子，可以列举由原始生殖细胞制备的EG细胞、由精巢的生殖细胞制备的GS细胞、和从成纤维细胞等体细胞中通过特殊的基因操作制备的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells：iPS细胞)等。

【0059】

本发明中，作为从ES细胞等多能性干细胞中制备心肌细胞的培养方法，如果是适于心肌细胞的分化诱导的方法，则可以使用任意一种，例如、可以列举悬浮培养法、悬滴(hanging drop)培养法、与支持细胞一起的共同培养法、旋转培养法、软琼脂培养法、微载体培养法等。作为具体的方法的例子，可以列举将形成单一细胞状态(通过实施酶消化等，细胞之间不粘附，各个细胞在液相中分散的状态)的ES细胞，优选以1×10³～1×10⁵细胞/mL的细胞密度悬浮于培养基中、使其液滴10～100μL附着于培养板的上皿进行的悬滴培养的方法。而且，还可以将上述细胞悬浮液接种于市售的细胞块(椭圆体)形成用96孔培养板(例如、スミロンセルタイト·椭圆体；住友べ—クライト社)、或细胞非粘附性培养板(例如、coaster超低粘附板；Corning社)、无处理聚苯乙烯制板上。然后，通过在37℃下通气5％的二氧化碳的CO₂条件下培养含有ES细胞的悬浮液，形成EB，这其中发生心肌细胞等分化诱导。

【0060】

本发明中，所谓经典Wnt信号途径的活化是指，β连环蛋白不受GSK-3β的磷酸化，在细胞质内和/或核内以稳定状态存在，和/或在核内通过与LEF-1/TCF结合而形成转录活化复合体，具有目的基因的转录诱导活性能力的状态。作为研究经典Wnt信号途径是否被活化的方法，并没有特别的限定，但可以使用通过采用β连环蛋白特异抗体的免疫组织染色和Western印迹分析等，测定细胞质内和/或核内中的β连环蛋白量的方法。而且，特异性识别非磷酸化型β连环蛋白、即活性型β连环蛋白的单克隆抗体也可以商购，特别有用。而且，在LEF-1/TCF结合序列的下游连接报告基因，以该报告基因产物的产生能力作为指标的报告、测试也有效。该方法中使用的含有LEF-1/TCF结合序列和报告基因的质粒可以从Upstate公司以TOPflash的商品名购买。

【0061】

作为Wnt信号活化物质的具体例子，可以列举各种经典Wnt蛋白质、GSK-3β抑制剂和Wnt激动剂等。而且，还可以使用可以活化经典Wnt信号途径的基因、例如各种经典Wnt基因、β连环蛋白基因、或缺失其N末端，而被GSK-3β将磷酸化部位取代为非磷酸化氨基酸的β连环蛋白基因活性型变异体等。作为另外的方法，还可以使用抑制性控制经典通过特异的反义DNA或核酶、RNA干涉用反义RNA、低分子化合物等抑制或停止Wnt信号途径的AXIN或APC等基因的表达的方法。而且，编码这些分子的基因的碱基序列在NCBI等公知的DNA数据库中可以使用，如果是本领域技术人员，则可以获得，制作，使用该基因的cDNA和siRNA，反义DNA。

【0062】

所谓可以在本发明中使用的经典Wnt蛋白质，被定义为Wnt家族蛋白质群中，与Fzd家族受体结合，通过GSK-3β抑制β连环蛋白的磷酸化，促进β连环蛋白的稳定化以及转录活性能力的物质。作为本发明中涉及的合适的经典Wnt蛋白质，可以列举例如、Wnt-1(序列号1)或Wnt-3a(序列号2)、Wnt-5a(序列号3)、Wnt-8a(序列号4)等，进而还可以列举与该蛋白质在氨基酸序列上具有80％以上、更优选90％以上的同源性，且具有β连环蛋白活化能力的蛋白质。

【0063】

本发明的一个特征在于用Wnt信号活化物质瞬间性刺激ES细胞等多能性干细胞，作为该刺激方法，并没有特别的限定，但优选，在培养基中添加经典Wnt蛋白质、例如重组Wnt蛋白质，在其中培养的方法。此外，如果是呈现同样效果的方法，可以使用任意一种，例如、可以列举添加从生物体组织中提取、纯化的经典Wnt蛋白质，在其中进行培养的方法，在多能性干细胞自身中导入编码经典Wnt蛋白质的基因的表达载体的方法，在支持细胞中导入该表达载体，该导入细胞作为共培养细胞使用的方法、或采用该导入细胞的培养上清等细胞产生物的方法等，本发明中涉及的方法中，包括任意作为在培养基中添加经典Wnt蛋白质的实施方式。

【0064】

本发明的实施中，使用的经典Wnt蛋白质和编码其的基因优选与多能性干细胞来源的物种同种的动物来源，但也可以是其它物种动物来源的。例如、在本发明种，在使用小鼠ES细胞或猴ES细胞时，可以使用人WNT-1蛋白。作为重组Wnt蛋白质，小鼠来源的Wnt-3a和Wnt-5a、人来源的WNT-7A从R&D Systems公司购买，人来源的WNT-1从Peprotech公司购买，可容易地使用。在使用这些重组蛋白质时，无菌除去不新鲜的培养基后，在含有浓度为0.1ng/mL～500ng/mL，优选1ng/mL～200ng/mL、更优选10ng/mL～100ng/mL的Wnt蛋白质的培养基中继续培养。

【0065】

自己制备目的Wnt蛋白质时，由于已知Wnt蛋白质不受棕榈酸修饰且不呈现生物学活性，因此需要在L细胞等动物来源的细胞中导入该基因的表达载体，使之表达，纯化分泌在该培养上清中的重组蛋白，其具体方法是已经公知的(Willert et al.，Nature423：448，2003；Kishida et al.，Mol.Cell.Biol.24：4487；http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html)。

【0066】

而且，编码这些因子的基因的碱基序列可以使用NCBI等公共的DNA数据库，如果是本领域技术人员，就可以获得和使用该基因的cDNA。例如、Wnt-3a和Wnt-8a基因在人和小鼠中已经获得了鉴定，人WNT-3A(序列号5)、小鼠Wnt-3a(序列号2)、人WNT-8A(序列号6)、小鼠Wnt-8a(序列号4)的碱基序列分别以登录号：NM_033131、NM_009522、NM_031933、NM_009290登录。

【0067】

所谓本发明中涉及的GSK-3β抑制剂，被定义为抑制GSK-3β蛋白质的激酶活性、例如对β连环蛋白的磷酸化能力的物质，已知的有数十种以上(Martinez et al.，Med.Res.Rev.22：373，2002；MeijerL et al.，Trends Pharmacol.Sci.25：471，2004)。作为具体例子，可以列举锂、丙戊酸、苯二氮卓(benzazepinone)家族的Kenpaullone(9-溴-7，12-二氢吲哚[3，2-d][1]苯并氮杂卓-6(5H)-one)和Alsterpaullone(9-硝基-7，12-二氢吲哚[3，2-d][1]苯并氮杂卓-6(5H)-基)、靛玉红衍生物5-氯-靛玉红、靛玉红-3’-单肟或BIO(别名、GSK-3β抑制因子IX；6-溴靛玉红-3′-肟)、马来酰亚胺衍生物SB216763(3-(2，4-二氯苯)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)或SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝化苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮)、Thiadiazolidinone(TDZD)类似物TDZD-8(别名：GSK-3β抑制因子I；4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)或OTDZT(别名、GSK-3β抑制因子III；2，4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮)、苯基α溴甲基酮化合物GSK-3β抑制因子VII(4-溴代苯乙酮)、细胞膜透过型的磷酸化肽L803-mts(别名、GSK-3β肽抑制因子；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂)等。这些化合物从Calbiochem公司和Biomol公司等购买，可以容易地使用，并没有特别的限定。

【0068】

而且，在使用这些GSK-3β抑制剂时，根据其物质特性的差异，其最适浓度也不同。因此，需要根据所使用的化合物的种类，改变最适浓度，在含有该浓度的GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养。

【0069】

例如、使用BIO或SB216763时，在含有浓度优选在10nmol/L～1μmol/L、更优选50nmol/L～200nmol/L的培养基中培养。使用GSK-3β抑制因子VII的情况下，浓度优选在2μmol/L～100μmol/L、更优选5μmol/L～20μmol/L。而且，使用L803-mts的情况下，浓度优选在5μmol/L～500μmol/L、更优选20μmol/L～200μmol/L、更优选25μmol/L～200μmol/L。

【0070】

而且，作为在本发明的实施中使用的药物，除了GSK-3β抑制剂以外，还可以是促进经典Wnt信号途径的活化的低分子物质(Wnt激动剂)、例如、有机或无机化合物或肽片段等。作为其合适的例子，可以列举氨基嘧啶衍生物(2-氨基-4-[3，4-(亚甲基代二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶；Calbiochem公司)(Liu et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.44：1987，2005)。在使用该Wnt激动剂时，在含有浓度为1nmol/L～1000nmol/L、优选10nmol/L～500nmol/L、更优选50nmol/L～200nmol/L的Wnt激动剂的培养基中培养。

【0071】

使Wnt信号活化物质作用于多能性干细胞的时间的确定，在本发明的实施中是十分重要的要件。即，在不合适的时间，使Wnt信号活化物质作用时，不但不呈现多能性干细胞的对心肌分化能力的促进效果，而且反倒呈现抑制效果。例如，分化诱导多能性干细胞后立即开始，以在培养液中添加Wnt信号活化物质的状态进行1周左右的培养，与培养液中没有添加任何物质的组(未处理组)相比，心肌分化能力降低。

【0072】

确定使Wnt信号活化物质作用的时间时，在本发明的实施中使用的多能性干细胞的分化诱导过程中，可以以各种经典Wnt基因的表达模式作为指标。具体而言，可以基于常规方法分化诱导多能性干细胞，从经时回收的样品中提取mRNA，用RT-PCR法等一般的方法研究各种经典Wnt基因的表达量。试样的回收，从用于分化诱导的培养开始起到发现(跳动性)心肌细胞的出现期间，例如、小鼠ES细胞、猴ES细胞和人ES细胞的情况下，6～14天左右，优选每24小时，更优选每12小时进行。作为分析对象的经典Wnt基因可以是1种，理想的是优选2种以上，更优选3种以上。

【0073】

ES细胞等多能性干细胞中，各种经典Wnt基因的表达在未分化状态或分化诱导后一般较低，分化诱导数日后急剧升高(实施例1)。这样一来，分化诱导后经典Wnt基因的表达量与分化诱导前的未分化的多能性干细胞相比显著上升的时间为“Wnt基因的表达上升期”。显著表达上升可以通过一般使用Student′st检验等统计学检测(置信区间：5％)进行判断。此时，作为判断基准的置信区间优选5％、更优选1％。而且，可以在测量的经典Wnt基因的表达在分化诱导后的数日间急剧上升，然后，在数日内其表达消失时，即出现在经典Wnt基因只在短时间内表现表达上升时，以出现最大表达量的时间作为Wnt基因的表达上升期。

【0074】

已知若从在进行分化诱导2，3天前开始，和/或分化诱导后立即在含有BMP拮抗剂的培养基中培养多能性干细胞，其心肌分化能力显著升高(WO2005/033298；Yuasa et al.，Nat.Biotechnol.23：607，2005)，该培养时，发现可以确认上述各种经典Wnt基因的表达上升。这一发现在确定本申请发明中经典Wnt基因的表达上升期时有用，在对所述的表达上升期进行确定时，理想的是在含有BMP拮抗剂的培养基中进行培养。作为BMP拮抗剂，是指与BMP分子(例如、BMP-2、BMP-4、BMP-7等)结合，抑制BMP信号传递的物质，可以列举Noggin，腱蛋白，DAN等，可以在培养基中添加时使用的这些物质可以从例如R&Dsystems公司购买。

【0075】

在本发明中，从用于心肌分化诱导的培养开始后即刻起，到通过上述方法确定的Wnt基因的表达上升期的24小时前这段时间内，在不含Wnt信号活化物质的培养基中培养多能性干细胞。然后，通过上述方法确定的Wnt基因的表达上升期的24～0小时前，优选从24小时前的时间开始的24～96小时，优选48～72小时，在含有Wnt信号活化物质的培养基中培养。例如，小鼠ES细胞的1个事例中，若进行用于该细胞的心肌分化诱导的培养，代表性的经典Wnt基因Wnt-3和Wnt-3a、Wnt-8a的表达，在未分化时或分化诱导之后立即很低，分化诱导后第72小时起直到第96小时呈现强表达(实施例1)。因此，在本发明的方法中使用该细胞时，经典Wnt基因的表达上升期为分化诱导的72小时后，在从分化诱导开始到第48小时，在不含Wnt信号活化物质的培养基中进行培养。然后，该细胞在分化诱导开始后第48小时开始在含Wnt信号活化物质的培养基中培养24小时～96小时，优选进行48小时～72小时的培养。而且，使Wnt信号活化物质的作用时期(时间)可以根据所使用的细胞所来源的动物种类，所使用的细胞株、使用的Wnt信号活化物质的种类等条件的不同，适当设定最适时期(时间)，该时期(时间)可以基于通过确定使上述Wnt信号活化物质作用的时期的方法而获得的经典Wnt基因的表达上升期来设定。例如、猴(普通绒猴)ES细胞时，发现Wnt-3基因的表达在直到分化诱导后72～120小时有强表达(实施例5)、人ES细胞的情况是Wnt-3a基因在分化诱导后72时间前后呈现形成峰的表达(Beqqali etal.，Stem Cells24：1956，2006)。

【0076】

通过上述方法，由以ES细胞为代表的多能性干细胞分化诱导的心肌细胞然后通过使用通过公知方法进行细胞回收、分离、纯化法，可以有效且大量地获得高纯度的心肌细胞(根据本发明制备的心肌细胞)。

【0077】

心肌细胞的纯化方法可以使用公知的细胞分离纯化的方法中的任意一种，作为具体的例子，可以列举流式细胞仪或磁珠、淘选法等以抗原-抗体反应为基准的方法(「Monoclonal Antibodies：principles and practice，Third Edition」(Acad.Press，1993)；「Antibody Engineering：A Practical Approach」(IRL PressatOxford University Press，1996)或、通过采用蔗糖、Percoll等载体的密度梯度离心进行的细胞分级法。而且，作为其它的心肌细胞选择法，可以列举作为基础的ES细胞等多能性干细胞的基因中预先进行人为修饰，给予药物耐受性或异位性蛋白质的表达能力，回收具有作为心肌细胞的性状的细胞的方法。例如、Field和共同研究者，通过在小鼠ES细胞导入位于α型肌球蛋白重链启动子的控制下的可以表达新霉素(G418)耐受性基因的基因盒，只有在该ES细胞分化成心肌细胞，伴随其表达α型肌球蛋白重链基因时，构建出在添加了G418的培养基中可以生存的系统，确认通过该方法选择为G418耐受性细胞的细胞以99％以上的几率为心肌细胞(美国专利第6,015,671号；Kluget al.，J.Clin.Invest.98：216，1996)。作为其它的例子，利用心肌细胞与其它细胞相比，其线粒体含量高这一点，用线粒体选择性的萤光色素或线粒体膜电位感受性试剂，特异性回收含较多线粒体的细胞群，即心肌细胞的方法(WO2006/022377)也有效。作为其它的例子，利用心肌细胞特异性的代谢特性，通过在低糖条件下添加乳酸或天冬氨酸等氨基酸，特异性纯化心肌细胞的方法也是合适的(特愿2006-23770)。

【0078】

根据本发明制备的心肌细胞在各种生理活性物质(例如、药物)和功能未知的新基因产物等药理评价和活性评价中有用。例如，可以应用于筛选ES细胞等多能性干细胞向心肌细胞的分化控制中涉及的物质或药物，或心肌细胞的功能调解中涉及的物质或药物，以及对心肌细胞有毒性或抑制性的物质或药物中。尤其是，在现状中，采用人心肌细胞的筛选法几乎不存在，根据本发明制备的心肌细胞成为用于实施该筛选法的有用的细胞来源。在进一步的方式中，包括根据本发明制备的心肌细胞的评价试剂盒对于上述筛选有用。

【0079】

作为提供给筛选的待测物质，如果是可以在培养系统中添加的物质，则无论其种类都可以，可以列举，例如低分子化合物、高分子化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽、基因、病毒、细胞、细胞培养液、微生物培养液等。作为在培养系统中有效导入基因的方法，可以列举采用逆转录病毒、腺病毒等病毒载体在培养系统中添加的方法、或通过封入于脂质体等人工构造物中在培养系统中添加的方法等。

【0080】

待测物质的评价可以通过测定ES细胞等多能性干细胞向心肌细胞的分化诱导效率，以及心肌细胞功能的质的或量的变化来进行。例如、待测物质的心肌分化诱导效率，可以通过以下方式测定：用本发明记载的方法培养的多能性干细胞，在培养开始后第5～15天、优选第7～12天时，通过生物化学的或免疫化学方法检测心肌细胞中特异性的各种标记的表达。作为生物化学的或免疫化学方法，没有特别的限定，但优选可以使用免疫组织化学染色法和免疫电泳法等免疫化学方法。这些方法中，可以使用与心肌细胞的标记特异的多克隆抗体或单克隆抗体。各个以特异的标记作为目的的抗体有市售，可以容易地使用。在心肌细胞中特异的标记，可以列举例如、肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。

【0081】

而且，作为评价待测物质的指标的心肌细胞功能，可以列举心肌细胞的存活性作为其中一例。具体而言，可以将通过本发明记载的方法制备的心肌细胞以适当的细胞密度接种在培养板上，在不含血清的培养基中培养并诱导细胞死亡(凋亡)，此时，可以在培养基中添加适量的待测物质，测定心肌细胞的存活率或死亡率。作为心肌细胞的存活率或死亡率的测定方法，可以通过以台盼蓝等色素的吸收作为指标的肉眼观察，以脱氢酶的活性(还原活性)作为指标的方法，进而还可以使用以凋亡细胞中特异的Caspase活性和AnnexinV的表达作为指标的方法。利用该机制的试剂盒，从Sigma公司和Clontech公司，Promega公司等许多制造商中购买，且可以容易地使用。

【0082】

通过这种筛选方法获得的物质或药物由于具有心肌细胞的分化诱导作用和功能调解作用，因此可以作为例如心肌梗塞、虚血性心脏疾病、充血性心力衰竭、肥大型心肌症、扩张型心肌症、心肌炎、慢性心力衰竭等心脏疾病预防药或治疗药来使用。这些化合物可以是新化合物，也可以是公知的化合物。

【0083】

而且，根据本发明制备的心肌细胞可以作为心肌再生药或心脏疾病的治疗药使用。作为心脏疾病，可以列举心肌梗塞、虚血性心脏疾病、充血性心力衰竭、肥大型心肌症、扩张型心肌症、心肌炎、慢性心力衰竭等。作为心肌再生药或心脏疾病治疗药，如果以高纯度含有根据本发明制备的心肌细胞，则可以采用使细胞悬浮于培养基等水性载体上的，将细胞包埋于生物体分解性基质等支持体中的，或加工成单层或多层心肌细胞层(Shimizu et al，Circ.Res.90：e40，2002)的药物等各种形状的药物。

【0084】

作为向障碍部位输送上述治疗药的方法，可以列举开胸，用注射器直接注入到心脏中的方法，外科切开心脏的一部分再移植的方法，以及通过使用导管的经血管的方法进行移植的方法等(Murry et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.67：519，2002；Menasche、Ann.Thorac.Surg.75：S20，2003；Dowell et al.，Cardiovasc.Res.58：336，2003)，但并没有特别的限定。据报道若通过这样的方法，将从胎儿心脏回收的心肌细胞移植到心脏受损的动物的心脏中，则呈现极好的治疗效果(Menasche、Ann.Thorac.Surg.75：S20，2003；Reffelmann et al.，Heart Fail.Rev.8：201，2003)。ES细胞来源的心肌细胞呈现出与胎儿心脏来源的心肌细胞极为相似的性状(Maltsev et al.，Mech.Dev.44：41，1993；Circ.Res.75：233，1994；Doevendans et al.，J.Mol.Cell.Cardiol.32：839，2000)。而且，实际上在将ES细胞来源的心肌细胞移植到成体心脏中的动物实验例中，也确认了与移植了胎儿心肌的例子相比几乎没有变化，显示出极高的生长附着性(Klug et al.，J.Clin.Invest.98：216，1996；Laflamme et al.，Am.J.Pathol.167：663)。因此，在由心肌细胞的疲惫和脱落引起的上述心脏疾病中，通过在不健康的心脏组织中补充性移植用本发明记载的方法制备的心肌细胞，可以期待促进心脏功能的改善。

【实施例】

【0085】

下面，列举实施例对本发明进行更具体的说明。

【0086】

实施例1：ES细胞的分化诱导过程中各种Wnt基因表达状态的研究(1)

研究了小鼠ES细胞的分化诱导过程中各种Wnt基因的表达。小鼠ES细胞，采用在含有20％小牛胎儿血清、2mmol/L L-谷酰胺、和0.1mmol/L2-巯基乙醇的Knockout-DMEM(Invitrogen公司)培养基(以下、称为ESM)中添加1000U/mL的LIF(ESGRO；Chemicon社)所形成的培养基，按照「Manipulating the Mouse Embryo：A LaboratoryManual」(Hogan et al.编、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994)、「Embryonic Stem Cells：Methods and Protocols」(Turksen编、Humana Press，2002)等中记载的方法，将保持未分化的性状且获得传代培养的ES细胞提供给实验。以下，将在该条件下传代培养的ES细胞称为在通常的培养条件下传代培养的ES细胞。而且，在以下的实验中，作为小鼠ES细胞，采用D3细胞、R1细胞、和129SV细胞(从大日本制药株式会社购买)，总的来说，没有发现由于ES细胞株的差异而导致实验结果不同。以下，没有事先声明的情况下，表示的是使用D3细胞株的实施例数据。而且，直到实施例4的实施例中都是采用小鼠ES细胞进行实验。

【0087】

用磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline；以下、PBS)清洗在通常的培养条件下传代培养的ES细胞2次后，用含有1mmol/L EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液处理后形成单一细胞状态，悬浮于ESM中。以下，只要没有特别说明，在从板上剥离ES细胞，在分化诱导和其它实验中使用时，都使用该条件。

【0088】

用于诱导ES细胞向心肌细胞或神经细胞等分化的培养基于常规方法，按以下方式进行。将ES细胞悬浮于不含LIF的培养基中，将该悬浮液以平均500细胞/50μL接种于市售的细胞团块(椭圆体)形成用96孔培养板(スミロンセルタイト·椭圆体；住友べ—クライト社)的每1孔中。在本实验条件下，发现ES细胞从悬浮培养后立即凝集，形成EB，从悬浮凝集培养(分化诱导)后第7～8天前后开始可以观察到一部分EB中有自主跳动性，从而清楚了EB中的至少一部分细胞正分化诱导成心肌细胞。

【0089】

此时，在一部分的实验组中，在分化诱导的3天前和分化诱导后立即在培养基中添加市售的重组

腱蛋白蛋白或Dan蛋白(15ng/mL；均为R&D systems公司)。公知的是，这样，通过用BMP拮抗剂瞬时处理ES细胞，其心肌分化能力显著提高(WO2005-033298；Yuasa et al.，Nat.Biotechnol.23：607，2005)。以下，将在培养基中添加腱蛋白蛋白或Dan蛋白等BMP拮抗剂，使之作用于ES细胞称为「BMP拮抗剂处理」。

【0090】

经时回收这样制备的EB，用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen社制)制备总RNA，进行DNase处理。用SuperScript^TM用于RT-PCR的第一链合成系统(Invitrogen公司)，从经DNase处理的总RNA(1μg)中，合成cDNA。基因的表达分析用ABI PRISM7700(PE AppliedBiosystems社)，通过采用Lux引物的实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)定量系统，研究各种基因的表达量。实时PCR定量反应，以上述cDNA作为模板，用PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司)，按照附带的说明书中记载的方法进行。

【0091】

用于检测各种Wnt基因等的Lux引物，采用引物设计用软件(D-LUX^TMDesigner；Invitrogen公司)，基于各种基因的碱基序列信息进行设计。在各种Wnt基因的各转录产物的检测中使用的Lux引物的碱基序列如下所示。

Wnt-3

(正向)5’-CAACAGTAGCAAGGAGCATGGACTGTTG-3’(序列号7)

(反向)5’-GGCTGGGTCCAGGTCGTTTA-3’(序列号8)

Wnt-3a

(正向)5’-GACAAACCGGGAGTCAGCCTTTGTC-3’(序列号9)

(反向)5’-TGCTGCACCCACAGATAGCA-3’(序列号10)

Wnt-8a

(反向)5’-GTACATGCGCTCTGCTGCCATCATGTAC-3’(序列号11)

(正向)5’-GACTCGTCACAGCCGCAGTT-3’(序列号12)

基于上述方法进行的1个实验例示于图1。对从ES细胞的分化诱导第24小时(第1天)开始至第168小时时(第7天)时的Wnt基因的表达进行研究，结果发现Wnt-3和Wnt-3a、Wnt-8a基因具有显著的表达上升。这些Wnt基因在分化诱导后第72小时至第96小时时呈现强表达峰，然后，第120小时以后显著降低。因此，该ES细胞的情况下，可以判断Wnt基因的表达上升期为分化诱导后第72小时。

【0092】

在用腱蛋白蛋白或Dan蛋白等BMP拮抗剂处理的组中，与未处理组相同，在分化诱导第72小时时发现Wnt基因的强表达上升，清楚了其表达量与未处理组相比显著提高。这样，BMP拮抗剂处理是一种可以更为明确地判断ES细胞的分化过程中Wnt基因的表达上升时期的方法。

【0093】

实施例2：由重组Wnt蛋白质处理导致ES细胞来源心肌细胞出现增强效果(1)

由于在ES细胞的分化诱导初期过程中，在心肌细胞的出现前，发现各种Wnt基因瞬间表达上升，因此对这一时期的ES细胞进行重组Wnt蛋白质处理，研究其心肌分化诱导效果。ES细胞的分化诱导用与实施例1同样方法进行，在一部分实验组中，在含有市售的重组WNT-1蛋白(Peprotech公司)、Wnt-3a蛋白(R&D systems公司)、或Wnt-5a蛋白(R&D systems公司)的培养基中培养。以下，将在培养基中添加WNT-1等经典Wnt的重组蛋白质，使之作用于ES细胞称为“Wnt处理”。

【0094】

作为由ES细胞分化、发育至心肌细胞的1个指标，经时研究呈现自主跳动性的EB的出现率。在未处理组中，发现悬浮培养后第13天时跳动的EB的出现率为20％左右，但在分化诱导后第48小时～96小时的仅仅48小时(2天)进行Wnt处理的组(Wnt48～96h)和第48小时～120小时的72小时(3天)进行Wnt处理的组(Wnt48～120h)中，可以确认显著高比例的EB中有跳动性(图2A、B)。该效果的强度与BMP用拮抗剂处理(图中、腱蛋白组)的相当。

【0095】

另一方面，在分化诱导后的最初的48、72、96、或120小时(2，3，4或5天)进行Wnt处理的组(分别为Wnt^～48h、Wnt^～72h、Wnt^～96h、Wnt～120h)和在分化诱导第120小时或第144小时(第5天或第6天)以后进行Wnt处理的组(Wnt^120h～、Wnt^144h～)等中，具有跳动能力的EB只以与未处理组同种程度出现。而且，未处理组等的跳动性EB的比例低的组的EB中，跳动的区域限于EB的一部分，但是Wnt^48～96h组和Wnt^48～120h组的EB中，与腱蛋白处理的EB同样，可以观察到EB表层的几乎所有区域跳动。即，从分化诱导后立即开始到观察到Wnt基因的表达上升的时期(分化诱导开始后第72小时)的24小时之前这段时间，若在含有Wnt蛋白质的培养基中培养ES细胞，则无法获得显著的心肌分化诱导效果。

【0096】

另一方面，若从发现Wnt基因的表达上升的时期(分化诱导开始后第72小时)的24小时前到48小时(2天)或72小时(3天)，在含有重组Wnt蛋白质的培养基中培养该ES细胞，则获得了显著的心肌分化能力促进效果。

【0097】

根据以上结果，表明Wnt处理显著诱导ES细胞的心肌分化，该效果只在分化诱导过程的极度有限的时期内获得。在以下的实验中，只要没有特别的说明，所谓「Wnt处理」表示在分化诱导开始后第48小时～第96小时的48小时(2天)、或在分化诱导开始后第48小时～第120小时的72小时(3天)进行Wnt处理。

【0098】

「Wnt处理」中，就重组Wnt蛋白质的添加浓度的不同，对心肌分化诱导的影响进行了研究，结果在使用例如Wnt-3a或Wnt-5a、WNT-1时，均显示出同样的浓度依赖性，通过添加1ng/mL～100ng/mL浓度的重组蛋白质，获得了比未处理组更显著高的跳动性EB的出现率。尤其是，通过添加10ng/mL～50ng/mL浓度的Wnt蛋白质，发现了极良好的跳动性EB的出现。

【0099】

实施例3：通过Wnt处理已分化诱导的ES细胞来源心肌细胞的性状

如实施例2中所示的那样，通过进行Wnt处理，由ES细胞制备的EB的跳动性显著提高，在该跳动性EB中，确认该跳动性细胞是心肌细胞，因此研究了各种心肌特异的标记分子的基因表达和蛋白质产生。用与实施例2同样的方法进行ES细胞的分化诱导，在分化诱导后第10天回收EB，制备cDNA。实时PCR定量反应用TaqMan探针法进行。即，以上述cDNA(1μL)作为模板，用TaqMan Universal PCR MasterMix(PE Applied Biosystems社)，按照附带的说明书中记载的方法进行。用于检测各种基因的TaqMan探针，采用引物设计用软件(ABIPRISM Primer Express)，基于各种基因的碱基序列信息设计。在GATA-4、Nkx-2.5、MLC-2a、MLC-2v、和GAPDH的各转录产物的检测中使用的引物和TaqMan探针的碱基序列如下所示。

GATA-4

(正向)5’-ACGGAAGCCCAAGAACCTGA-3’(序列号13)、

(反向)5’-CATTGCTGGAGTTACCGCTG-3’(序列号14)、

(TaqMan探针)5’-TAAATCTAA GACGCCAGCAGGTCCTGCTG-3’(序列号15)；

Nkx-2.5

(正向)5’-TGACCCAGCCAAAGACCCT-3’(序列号16)、

(反向)5’-CCATCCGTCTCGGCTTTGT-3’(序列号17)、

(TaqMan探针)5’-CGGATAAAAAAGA GCTGTGCGCGC-3’(序列号18)；

MLC-2a

(正向)5’-CCAGGCAGACAAGTTCTCTCCT-3’(序列号19)、

(反向)5’-CTTGTAGTCAATGTTGCCGGC-3’(序列号20)、

(TaqMan探针)5’-CAACTGTTTGCGCTGACACCCATGGA-3’(序列号21)；

MLC-2v

(正向)5’-GCAGAGAGGTTCTCCAAAGAGG-3’(序列号22)、

(反向)5’-AAGATTGCCGGTAACGTCAGG-3’(序列号23)、

(TaqMan探针)5’-ATCGACCAGATGTTCGCAGCCTTTCC-3’(序列号24)

GAPDH

(正向)5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’(序列号25)、

(反向)5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’(序列号26)、

(TaqMan探针)5’-CAGAAGACTGTG GATGGCCCCTC-3’(序列号27)

分化诱导第10天的Wnt处理组(Wnt^48～120h组)EB组中，就已知为代表性的心肌细胞标记的GATA-4或Nkx-2.5、MLC-2a、MLC-2v(图3)、αMHC、βMHC等基因而言，比未处理组相比，发现表达显著加强。

【0100】

另一方面，跳动性EB的出现率降低了的Wnt^～48h、Wnt^～120h、Wnt^144h～组中，与未处理组程度相同的表达量，跳动性EB的出现率与各种心肌标记基因的表达量显示出几乎相同的倾向。

【0101】

接着，用免疫组织化学的染色法确认了在Wnt处理组EB中发育的跳动性细胞所产生的心肌细胞特异性标志蛋白质。用冷冻切片制作用包埋剂(OCT Compound、Sakura Finetek USA社)新鲜包埋分化诱导第10天的Wnt处理组(Wnt48～120h组)EB，将用液氮冷冻制备的冷冻标本切薄(6μm)后，添加到载物片上。对该冷冻切片，使之与作为1次抗体的抗肌节/肌球蛋白抗体(MF20；American Type CultureCollection)、抗GATA-4抗体(C-20；Santa Cruz社)、或抗Nkx-2.5抗体(N-19；Santa Cruz社)反应后，然后使之与辣根过氧化物酶标识2次抗体(Bio-RAD社)反应，最后用ACE(3-氨基-9-乙基咔唑)底物液(ニチレイ社)的显色反应后，在光学显微镜下进行观察。

【0102】

结果示于图4。在未处理组中，在心肌细胞的特异性标志蛋白质肌节/肌球蛋白(图中MHC)或Nkx-2.5、GATA-4的阳性细胞，与只在EB中的极少一部分中观察到相对，在Wnt处理组中，与BMP拮抗剂(Dan)处理组同样，EB构成的细胞的大多数呈现阳性像，可以确认形成心肌细胞团块(cardiospheres)。根据以上的结果，证实了由Wnt处理分化诱导的ES细胞来源的跳动性细胞为心肌细胞，清楚了本方法是一种强力促进EB内的心肌细胞的分化和发育的方法。

【0103】

实施例4：由β连环蛋白的活化剂导致ES细胞来源心肌细胞的增强效果出现

上述经典Wnt蛋白质处理，通过抑制细胞内GSK3β的作用，促进β连环蛋白的稳定化以及转录活性能是公知的。因此，确认了促进β连环蛋白的稳定化以及转录活性能力的各种药物处理，与Wnt处理同样，显示出ES细胞的心肌分化诱导效果。作为促进β连环蛋白的稳定化以及转录活性能力的药物，使用市售的GSK3β抑制剂BIO(Calbiochem公司)、GSK3β抑制因子VII(Calbiochem公司)、细胞膜透过型GSK3β肽抑制因子(L803-mts；Calbiochem公司)、SB216763(Biomol公司)、和不通过GSK3β抑制而促进β连环蛋白的转录活性能力的Wnt激动剂(Calbiochem社)这5种。ES细胞的分化诱导按与上述实施例同样方式进行，上述化合物与重组Wnt蛋白质同样，从分化诱导后第48小时到第120小时(第3～5天)期间，在含有上述化合物的培养基中培养。

【0104】

其结果是，如图5所示，上述化合物的添加组中，其最适浓度中，可以确认呈现与重组Wnt蛋白质处理组等同或者更好的强的心肌分化诱导活性。用与实施例3同样的方法，研究经这些化合物处理的EB中的心肌标记基因以及心肌标记蛋白的表达，结果发现与重组Wnt蛋白质处理组同样，且与未处理组相比表现出显著高的基因和蛋白的表达提高效果。

【0105】

实施例5：ES细胞的分化诱导过程中Wnt基因表达状态的研究(2)

使用猴的1种，普通绒猴来源的ES细胞(以下，称为cmES细胞)，对该分化过程中Wnt基因的表达进行研究。使用cmES细胞的培养时，采用在含有20％Knockout Serum Replacement(Invitrogen公司)、0.1mmol/L MEM非必需氨基酸液、1mmol/L L-谷酰胺、0.1mmol/L2-巯基乙醇的Knockout-DMEM培养基(Invitrogen公司)(以下，称为cmES培养基)中添加了10ng/mL重组LIF(alomone labs公司)和10ng/mL重组碱基性成纤维细胞增殖因子(Invitrogen公司)的培养基，将在作为饲养细胞预先接种的经过丝裂霉素处理过的初代小鼠胚成纤维细胞上，保持未分化的性状又获得传代培养的细胞提供给实验。

【0106】

用于分化诱导cmES细胞的培养，基于常规方法，按以下方式进行。用PBS清洗cmES细胞后，用市售的灵长类ES细胞用细胞剥离液(ReproCELL社)于37℃处理5分钟，回收含有cmES细胞的细胞块的细胞悬浮液。然后，用于将饲养细胞与cmES细胞分离，用孔径100μm的筛过滤细胞悬浮液后，用孔径为40μm的筛过滤其通过的细胞级分，再回收非通过级分。进而，含有这种cmES细胞块的非通过分级接种在呈现高细胞粘附能力的市售的培养板(プライマリア；べクトン·デイツキンソン社)上，培养30分钟后，回收不粘附于板上的培养基中而悬浮的细胞块。将按这种方式获得的cmES细胞块，在用cmES培养基充满的市售的细胞非粘附性培养板(ハイドロセル；CellSeed社制)上，以细胞块之间相互不接触、粘附的状态培养，使之形成EB，进行分化诱导。

【0107】

经时回收按这种方式制备的EB，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen社)制备总RNA。接着，用逆转录酶合成cDNA后，通过PCR，检测普通绒猴Wnt-3基因(cmWnt-3)和作为内因性对照的βActin(cmβActin)的表达。检测中使用的引物如下所示。

cmWnt-3

(正向)5′-GAGGTGAAGACCTGCTGGTGGGC-3′(序列号28)

(反向)5′-GTTGGGCTCACAAAAGTTGG-3′(序列号29)

cmβActin

(正向)5′-TCCTGACCCTGAAGTACCCC-3′(序列号30)

(反向)5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3′(序列号31)

基于上述方法进行的1个实验例示于图6。对cmES细胞的分化诱导第24小时(第1天)到第168小时(第7天)时的表达进行研究，Wnt-3基因在分化诱导后第72小时至第120小时时呈现强表达的峰，然后，该表达消失(图6)。因此，该ES细胞的情况，可以判断Wnt-3基因的表达上升期为分化诱导后第72小时，获得了与小鼠ES细胞几乎一样的结果。

【0108】

实施例6：通过重组Wnt蛋白质处理产生的ES细胞来源心肌细胞的表达增强效果(2)

使用cmES细胞，进行重组Wnt蛋白处理效果的研究。以与实施例5的方法同样的方式进行cmES细胞的培养和分化诱导。此时，一部分实验组中，在分化诱导后第48小时～第120小时的72时间(3天)，在含有市售的重组WNT-1蛋白(PeproTech社)、Wnt-3a蛋白(R&Dsystems社)或WNT-7A蛋白(R&D systems社)的培养基中进行了培养。

【0109】

为了确认cmES细胞分化、发育成心肌细胞，研究了EB的自主跳动能力的观察、和各种心肌特异的标记分子的基因以及蛋白的表达。在未处理组中，在10％以下的EB中，从分化诱导后2周前后开始，在EB的一部分区域发现了跳动，与之相对，在Wnt处理组中，自主跳动从分化诱导后第10天前后开始，在分化诱导后第16天时几乎半数的EB出现了跳动性。

【0110】

而且，为了分析表达基因，在分化诱导后第10天回收EB，按与实施例5的方法同样的方式检测各种标记基因的表达。普通绒猴的Nestin、ANP、MLC-2a、MLC-2v的各转录产物(以下、cmNestin、cmANP、cmMLC-2a、cmMLC-2v)的检测中使用的引物以下所示。

cmNestin

(正向)5′-GCCCTGACCACTCCAGTTTA-3′(序列号32)、

(反向)5′-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC-3′(序列号33)

cmANP

(正向)5′-GAACCAGAGGGGAGAGACAGA-3′(序列号34)、

(反向)5′-CCCTCAGCTTGCTTTTTAGGAG-3′(序列号35)

cmMLC-2a

(正向)5′-GAGGAGAATGGCCAGCAGGAA-3′(序列号36)、

(反向)5′-GCGAACATCTGCTCCACCTCA-3′(序列号37)

cmMLC-2v

(正向)5′-AGGAGGCCTTCACTATCATGG-3′(序列号38)、

(反向)5′-GTGATGATGTGCACCAGGTTC-3′(序列号39)

分化诱导后第10天的Wnt-3a处理组EB中，就代表性心肌细胞标记cmANP、cmMLC-2a、cmMLC-2v基因而言，与未处理组相比，发现有显著强的表达(图7)。Wnt-1处理组EB中也获得了同样的结果。

【0111】

另一方面，还发现已知为神经标记的cmNestin的表达在Wnt处理组中表达显著减少。

【0112】

然后，与实施例2同样，用免疫组织化学的染色法确认了Wnt处理组EB中发育的跳动性细胞是产生特异的标志蛋白质的心肌细胞。使作为1次抗体的抗肌节/肌球蛋白抗体、抗GATA-4抗体、或抗Nkx-2.5抗体与由分化诱导第16天的Wnt处理组(Wnt-3a、WNT-1)EB制备的冷冻切片反应，进行显色反应后，在光学显微镜下进行观察。

【0113】

其结果是，在未处理组中，在心肌细胞中特异的标志蛋白质肌节·肌球蛋白或GATA-4的阳性细胞，只在EB中的极少一部分观察到，而且基本没有观察到Nkx-2.5阳性细胞，与之相对，用Wnt-3a或WNT-1处理的组中，可以确认EB构成的细胞的大多数呈现阳性图像(图8)。在WNT-7A处理组EB中也获得了同样的结果。

【0114】

根据以上结果，清楚了Wnt处理对于啮齿类的ES细胞和灵长类的ES细胞可以显著地促进诱导心肌分化。

Claims

1.将哺乳动物来源的多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其中脯乳动物来源的多能性干细胞不包括破坏人胚胎得到的胚胎干细胞或者胚胎生殖细胞，前述方法的特征在于包括

(i)在从分化诱导开始直至经典Wnt基因的表达上升期的24小时前的期间内，在不含促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞；然后，

(ii)在经典Wnt基因的表达上升期的24～0小时前至24～96小时的期间内，在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中哺乳动物来源的多能性干细胞来源于啮齿类或灵长类。

3.根据权利要求1所述的方法，从经典Wnt基因的表达上升期的24小时前开始在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞。

4.根据权利要求1或3所述的方法，在促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞的时间为48～72小时。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质是选自于经典Wnt蛋白质、GSK3β抑制剂和Wnt激动剂的物质。

6.根据权利要求5所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质是经典Wnt蛋白质。

7.根据权利要求6所述的方法，经典Wnt蛋白质是选自于Wnt-1、Wnt-3a和Wnt-5a中至少一个的Wnt蛋白质。

8.根据权利要求6或7所述的方法，经典Wnt蛋白质在培养液中的浓度为0.1ng/mL～500ng/mL。

9.根据权利要求5所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质是GSK 3β抑制剂。

10.根据权利要求9所述的方法，GSK3β抑制剂是选自于GSK3β抑制因子VI I、Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂、(3-(2，4-二氯苯)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)、和GSK3β抑制因子IX(BIO)中至少一个的抑制剂。

11.根据权利要求9或10所述的方法，GSK3β抑制剂在培养液中的浓度，在GSK3β抑制因子VII的情况下为2μmo1/L～100μmol/L、在Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂的情况下为5μmol/L～500μmol/L、在(3-(2，4-二氯苯)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)的情况下为10nmol/L～1μmol/L、或、在GSK3β抑制因子IX(BIO)的情况下为10nmol/L～1μmol/L。

12.根据权利要求5所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质为Wnt激动剂。

13.根据权利要求12所述的方法，Wnt激动剂为氨基嘧啶衍生物。

14.根据权利要求12或13所述的方法，Wnt激动剂在培养液中的浓度为1nmol/L～1000nmol/L。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，多能性干细胞为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、或生殖细胞系干细胞。

16.根据权利要求15所述的方法，多能性干细胞为胚胎干细胞。

17.根据权利要求15或16所述的方法，多能性干细胞来源于人，但不是破坏人胚胎得到的多能干细胞。