KR102010922B1

KR102010922B1 - 켄파울론 유도체의 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 용도

Info

Publication number: KR102010922B1
Application number: KR1020170144854A
Authority: KR
Inventors: 황기철; 임소연; 김상우; 이윤미; 최정원
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-08-14
Also published as: KR20190049234A; WO2019088546A3; WO2019088546A2

Abstract

본 발명은 켄파울론 유도체의 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명의 켄파울론 유도체는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도능이 우수하고, 켄파울론 유도체에 의해 분화 유도된 심근세포는 심근경색 등 심장질환의 치료적 효과가 우수하다.

Description

켄파울론 유도체의 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 용도{Use of a Kenpaullone derivative for inducing differentiation of stem cells into cardiomyocytes}

본 발명은 켄파울론 유도체의 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 용도에 관한 것이다.

심장세포대체요법(Cardiac-cell based replacement therapy)은 심장 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 치료법으로 인식되고 있으며, 현재까지 배아줄기세포를 포함한 골격근 근모세포(skeletal myoblasts), 골수단핵세포(bone marrow mononuclear cells, BMC) 및 순환성 전구세포(circulating progenitor cells)인 내피전구세포(endothelial progenitorcells), 중간엽 세포(mesenchymal cells), 심장줄기세포(cardiac stem cells) 등이 중요한 세포 공급원이 되고 있다.

배아 줄기세포는 다양한 세포로의 분화 잠재력에도 불구하고 심근에 이식된 배아줄기 세포의 성체 성숙까지의 비 조절, 기형암(teratocarcinoma) 형성, 면역 거부반응 등의 문제점으로 인해 임상 적용 가능성에 어려움을 겪고 있다.

심장질환 치료분야에서 줄기세포 치료제는 손상된 심근을 재생할 수 있다는 점에서 관심의 대상이다. 괴사된 심근을 줄기세포 치료제로 치료하면 심근이 재생될 수 있어, 결국 줄기세포 치료제가 심근 손상을 치료하는 근본적인 치료법이 될 것으로 기대를 모은다. 심장질환 중 줄기세포 치료제 관련 연구가 가장 활발히 이뤄지고 있는 질환은 허혈성 심질환이다. 허혈성 심질환은 산소와 영양분을 공급하는 관상동맥이 심근에 필요한 산소를 충분히 공급하지 못하면서 심근에 국소 빈혈을 일으켜 심근경색, 협심증 등이 발병하는 질환이다. 현재 진행되고 있는 허혈성 심질환 치료법은 심장 리모델링을 억제하거나 수술로 막힌 혈관을 개통하는 정도여서, 한 번 손상된 심근을 되살리는 방법이 아니라는 점에서 한계가 있다.

심혈관 질환 치료를 위해 가장 많이 사용하는 성체 줄기세포 형태는 중간엽 줄기세포이며 1960년에 McCulloch와 Till에 의해 마우스에서 조혈기능을 회복시킬 수 있는 골수 줄기세포를 획득한 것이 시초가 되었고, 1961년 모스크바 Gamaleya 연구소의 Friedenstein 이 첫 명명을 하였다. 이후 Case Western Reserve University의 Arnold Caplan 에 의해 적은 골수 샘플로부터 인간 중간엽 줄기세포를 처음으로 분리하고, 생체 외에서 세포를 획득 및 증식시키는 임상적 가능성을 제시했다. Orlic 외의 연구진이 보고한 바에 따르면 자가 조직 유래의 중간엽 줄기세포를 허혈성 심근 조직에 이식하였을 때 9일 이후에 좌심실에 68%의 새로운 심근이 형성되었고 낮아졌던 심근 기능도 상승한다고 한다. 이후 이식 세포의 낮은 생존율과 부착율을 개선하고자 생존 및 부착 관련 유전자의 과발현을 통해 중간엽 줄기세포를 심근에 이식하였고, 줄기세포에 의한 재생 및 기능 향상에 크게 기여함을 보고하였다. 이러한 결과를 바탕으로 많은 임상시험이 진행 중이거나 완료되었다.

Segers, V.F. & Lee, R.T. Nature 451, 937-942 (2008) Chang, M.G., et al. Circulation 113, 1832-1841 (2006) Song, S.W., et al. Stem Cells 27, 1358-1365 (2009) Chang, W., et al. Stem Cells 27, 2283-2292 (2009) Song, H., et al. Stem Cells 25, 1431-1438 (2007) Orlic D et al. Nature 410(6829):701-5 (2001. 04. 05) Mangi AA et al. Nat Med. 9(9):1195-201 (2003. 08. 10)

본 발명의 목적은 줄기세포의 심근세포로의 분화능이 우수한 켄파울론 유도체의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법에 의해 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심장질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 켄파울론 유도체는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도능이 우수하고, 켄파울론 유도체에 의해 분화 유도된 심근세포는 심근경색 등 심장질환의 치료적 효과가 우수하다.

도 1은 켄파울론 유도체 #1 내지 #23의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 켄파울론 및 이의 유도체들 처리 시 줄기세포의 세포 생존 분석 결과를 도시한 것이다.
도 3 내지 도 11은 켄파울론 및 이의 유도체들(#1, 2, 13, 16, 18, 20, 21, 23) 처리 시 줄기세포의 세포 모양 변화를 보여주는 현미경 사진도이다.
도 12는 켄파울론 및 이의 유도체들(#1, 2, 13, 16, 18, 20, 21, 23)을 처리한 줄기세포에서 심근세포 특이적 마커(GATA4, TBX5, NKX2-5, TNNT2, MEF2C)의 발현을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 MI(myocardial infarction) 손상을 입은 심혈관질환 동물모델에서 줄기세포(ASCs: MI3D+ASC) 처리군 및 켄파울론 유도체 #18이 처리된 줄기세포의 처리군(MI3D+#18(1D))의 치료 효과를 보여주는 결과이다.

본 발명자들은 켄파울론이 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도능을 기반으로 하여 켄파울론이 miRNA-182의 발현을 유도하고 허혈성 손상으로부터 심장 기능을 개선함을 확인하였다. 이에, 켄파울론 유도체 개발을 통해 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도능이 우수한 화합물을 제조하고, 이로부터 분화 유도된 심근세포의 심장질환 치료 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

상기 화학식 1의 화합물은 켄파울론 유도체로, C₁₆H₁₀FN₃O₃ (MW=311.27)로 표시되고, 2-플루오로-9-나이트로-7,12-다이하이드로벤조[2,3]아제피노[4,5,-b]인돌-6(5H)-온(2-fluoro-9-nitro-7,12-dihydrobenzo[2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one)로 명명된다.

상기 켄파울론 유도체는 하기 반응식 1에 따라 제조될 수 있다:

[반응식 1]

상기 켄파울론 유도체는,

아닐린 화합물 A와 메틸 숙시닐 클로라이드의 축합반응을 통해서 아마이드 화합물 B를 제조하는 제1단계;

아마이드 화합물 B에 염기를 사용하여 고리화 반응을 진행시켜 다이 카보닐 락탐 화합물 C를 제조하는 제2단계;

다이 카보닐 락탐 화합물 C의 에스터기를 제거하여 아제핀 다이온 화합물 D를 제조하는 제3단계; 및

아제핀 다이온 화합물 D를 나이트로기가 치환된 하이드라진을 사용하여 산 촉매 하에 인돌화 반응을 진행하여 켄파울론 유도체 #18의 화합물(2-플루오로-9-나이트로-7,12-다이하이드로벤조[2,3]아제피노[4,5,-b]인돌-6(5H)-온)을 제조하는 제4단계를 거쳐 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 화학식 1의 켄파울론 유도체는 줄기세포로부터 심근세포를 분화 유도하며, 화학식 1의 화합물이 처리된 줄기세포에서 심근세포 특이적 마커인 GATA4, TBX5, NKX2-5, TNNT2 또는 MEF2C의 발현이 대조군(DMSO 처리 군)에 비해 현저히 증가함을 확인하였다. 따라서, 화학식 1의 켄파울론 유도체는 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도제로 사용할 수 있다.

본 발명의 심근세포로의 분화 유도에 사용되는 줄기세포는 포유동물에서 유래한 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로는, 지방 유래 줄기세포일 수 있다.

공지의 줄기세포 공급원으로부터 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

줄기세포의 심근세포로의 분화 유도는 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 수행될 수 있다.

상기 배지는 줄기세포의 배양 시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이러한 배지로, MEM-alpha(Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 시 상기 배지에는 심근세포 분화 유도 성분으로, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 덱사메타손, L-아스코르베이트-2-포스페이트, L-프롤린 및 소듐 피루베이트 등을 첨가할 수 있다.

배양 기간은 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도에 일반적으로 유도하는 시간으로, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서의 배양은 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있으나, 화학식 1의 화합물의 종류 또는 농도, 줄기세포의 공급원에 따라 달라질 수 있어 이에 제한되는 것은 아니다.

줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법은, 당업계에 알려진 3차원 배양 방법을 적용할 수 있다. 3차원 배양이란 세포 성장에 의해 세포단층(mono-layer)이 형성되도록 배양하는 통상적인 단층배양이 아닌 세포들이 뭉쳐서 성장하여 3차원적인 입체형태(예를 들면, 구체 또는 타원체)를 형성하도록 배양하는 것을 말한다.

본 발명에 있어서, 용어 "심근세포"는 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포 또는 심근세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 처리에 의해 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포는 심근세포 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 심근세포는 심근세포 특이적 마커의 발현이 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 심근세포 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, GATA4, TBX5, NKX2-5, TNNT2 또는 MEF2C 등일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 줄기세포만을 처리한 대조군에 비해 화학식 1의 화합물을 처리한 줄기세포(또는 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포)를 동물 모델에 투여한 경우, 심근경색에 의한 손상이 현저히 줄어든다.

따라서, 본 발명은 상기 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법에 의해 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심장질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 심장질환 치료용 의약 조성물에 사용하는 심근세포는 "켄파울론 유도체가 처리된 줄기세포" 또는 "켄파울론 유도체에 의해 분화 유도된 심근세포"를 의미한다.

본 발명의 심장질환 치료용 의약 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나 심근경색, 심부전, 부정맥 등의 심장질환의 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

상기 개체는 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 생쥐, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 포유동물일 수 있다.

본 발명의 심장질환 치료용 의약 조성물에 사용되는 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포는 치료 대상이 인간인 경우, 환자 자신의 생물학적 샘플에서 유래된 줄기세포나 타인의 샘플에서 유래된 줄기세포로부터 분화 유도된 것일 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 예컨대, 심근세포를 식염수 또는 완충액에 포함시켜 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 심근세포를 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 상기 심근세포의 유효량은 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여 시 1×10⁴ 내지 1×10⁸ 세포/㎏일 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 켄파울론 유도체의 제조

켄파울론 유도체 #18은 하기 반응식 1과 같이 제조되었다.

[반응식 1]

켄파울론 유도체 #18을 제조하기 위한 제1단계는 아닐린 화합물 A(methyl 2-amino-5-fluorobenzoate)에 메틸 숙시닐 클로라이드(methyl succinyl chloride)와 축합반응을 통해서 아마이드 화합물 B인 메틸 5-플루오로-2-(4-메톡시-4-옥소부탄아미도)벤조에이트(methyl 5-fluoro-2-(4-methoxy-4-oxobutanamido)benzoate)를 제조하는 것이다.

25 mL 둥근 바닥 플라스크에 아닐린 화합물 A(500 mg, 2.96 mmol), DMAP(1.83 mg, 0.0150 mmol), 다이아이소프로필에틸아민(0.54 mL, 3.10 mmol)과 다이클로로메테인(9 mL)을 넣은 후, 마지막으로 메틸 숙시닐 클로라이드(400 ㎕, 3.25 mmol) 천천히 넣었다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 용액에 물(10 mL)을 넣고 30분간 더 교반한 후 다이클로로메테인(10 mL)으로 세 번 추출하였다. 유기 층을 모아 무수 황산마그네슘으로 물을 제거하고, 여과 및 농축하여 얻은 반응 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥세인:에틸 아세테이트=1:3)로 분리하여 연한 노란색 고체로 아마이드 화합물 B인 메틸 5-플루오로-2-(4-메톡시-4-옥소부탄아미도)벤조에이트(776 mg, 2.74 mmol, 93%)를 제조하였다.

¹H NMR (CDCl₃,400 MHz): δ 11.0 (s, 1H), 8.70 (dd, J = 9.3, 9.3 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 9.2, 3.2 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 9.2, 3.2 Hz, 1H), 3.05 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 2.79-2.74 (m, 4H).

제2단계는 아마이드 화합물 B에 염기를 사용하여 고리화 반응을 진행시켜 다이 카보닐 락탐 화합물 C인 메틸 7-플루오로-2,5-다이옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤조[b]아제핀-4-카복실레이트(methyl 7-fluoro-2,5-dioxo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-benzo[b]azepine-4-carboxylate)를 제조하는 것이다.

아마이드 화합물 B(776 mg, 2.74 mmol)와 테트라하이드로퓨란(10 mL)을 25 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 반응 온도를 0℃로 낮춘 후, tert-BuOK 용액(7.9 mL, 7.95 mmol, 1 M in THF)을 넣고 2.5시간 동안 교반시켰다. 반응 용액에 물 3 mL를 넣고 1 N HCl 수용액을 pH4가 될 때까지 넣은 후 30분 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 다이클로로메테인(10 mL)으로 세 번 추출한 후 유기 층을 모아 무수 황산마그네슘으로 물을 제거하고, 여과 및 농축하여 얻은 크루드 화합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥세인:에틸 아세테이트=1:1)로 분리하여 연한 노란색 고체로 락탐 화합물 C인 메틸 7-플루오로-2,5-다이옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤조[b]아제핀-4-카복실레이트(509 mg, 1.80 mmol, 66%)를 제조하였다.

¹H NMR (CDCl₃,400 MHz): δ 12.6 (s, 1H), 7.63-7.16 (m, 2H), 7.23-7.19 (m, 1H), 7.01 (dd, J = 9.3, 9.3 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.12 (s, 2H).

제3단계는 다이 카보닐 락탐 화합물 C의 에스터기를 제거하여 아제핀 다이온 화합물 D인 7-플루오로-3,4-다이하이드로-1H-벤조[b]아제핀-2,5-다이온(7-fluoro-3,4-dihydro-1H-benzo[b]azepine-2,5-dione)을 제조하는 단계이다.

다이 카보닐 화합물 C(332 mg, 1.43 mmol), 다이메틸설폭사이드(DMSO, 4.1 mL)와 물(0.6 mL)을 마이크로웨이브 튜브에 넣고 마이크로웨이브 반응기(100 watt)를 사용하여 140℃에서 15분간 교반하였다. 반응 용액을 상온으로 식힌 후, 물을 넣고 다이클로로메테인(10 mL)으로 세 번 추출하였다. 유기 층을 모아서 무수 황산마그네슘으로 물을 제거하고, 여과 및 농축하여 얻은 용액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥세인:에틸 아세테이트=1:2)로 분리하여 연한 노란색 고체로 아제핀 다이온 화합물 D인 7-플루오로-3,4-다이하이드로-1H-벤조[b]아제핀-2,5-다이온 (145 mg, 0.75 mmol, 52%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃,400 MHz): δ 7.71 (dd, J = 6.3, 2.7 Hz, 1H), 7.54-7.46 (m, 1H), 6.93 (dd, J = 8.6, 8.6 Hz, 1H), 3.07-3.03 (m, 2H), 2.84-2.81 (m, 2H).

제4단계는 아제핀 다이온 화합물 D를 나이트로기가 치환된 하이드라진을 사용하여 산 촉매 하에 인돌화 반응을 진행하여 켄파울론 #18 화합물인 2-플루오로-9-나이트로-7,12-다이하이드로벤조[2,3]아제피노[4,5,-b]인돌-6(5H)-온(2-fluoro-9-nitro-7,12-dihydrobenzo[2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one)을 제조하는 것이다.

아제핀 다이온 화합물 D(30 mg, 0.155 mmol), 소듐 아세테이트(19 mg, 0.233 mmol), 4-나이트로페닐하이드라진 하이드로클로라이드(44 mg, 0.233 mmol), 아세트산(1 mL)을 10 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 70℃로 가열하여 1시간 동안 교반한 후, 황산(10 ㎕)을 넣었다. 1시간 동안 교반한 후에 황산(10 ㎕)을 추가로 더 넣고 70℃에서 1시간을 더 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 식힌 후 5% 소듐 아세테이트 수용액을 넣으면 고체 침전물이 생기는데 생성된 고체 침전물을 여과하여 얻은 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥세인:에틸 아세테이트=1:2)로 분리하였다. 분리 후 노란색 고체의 켄파울론 #18 화합물인 2-플루오로-9-나이트로-7,12-다이하이드로벤조[2,3]아제피노[4,5,-b]인돌-6(5H)-온(4.0 mg, 0.013 mmol)을 8% 수율로 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz): δ 12.4 (s, 1H), 10.2 (s, 1H), 8.77 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 9.1, 2.0 Hz, 1H), 7.62-7.58 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 2H), 3.67 (s, 2H).

<실시예 2> 켄파울론 유도체의 세포 생존 실험

Ez-Cytox(Daeillab, Korea)를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cells: ASCs)을 5×10⁴ cells/cm² 농도로 분주한 후 켄파울론과 켄파울론 유도체를 농도별로 처리하고, 48시간 후 웰당 10 ㎕의 Ez-Cytox를 넣고 1~4 시간 동안 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.

RNA 분리, 역전사 PCR, 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 위해, RNA는 TRIzol Reagent Solution(Life Technologies, Frederick, Maryland, USA)으로 분리하였고, Oligo dT-primed cDNA는 Maxime RT PreMix kit(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 합성하였다. 각 유전자의 발현은 SYBR Green Dye system(SYBR Premix Ex Taq(Tli RNase Plus) and ROX reference dye(Takara Bio Inc. Foster City, CA, USA))의 Applied Biosystems StepOnePlus real-time PCR System(Foster City, CA, USA)으로 조사하였다. 각 전사체량은 GAPDH 전사체 수준으로 보정하였고 PCR에 사용된 프라이머는 아래 표 1과 같다.

PCR 조건은 다음과 같다. Holding stage(65 ℃, 30초), Cycling stage(95℃, 5초 → 60℃, 30초, 40 cycles)

유전자		프라이머 서열(5'→ 3')
GATA4	F ^a)	GCCTCTCGGTGTGACGAGT
GATA4	R ^b)	TGGTTCCGGAAGCTGATGTAG
TBX5	F	AAGAGTTCCCTCCTCTCCCC
TBX5	R	GTCTTGGCCCCGGGAATAAA
NKX2-5	F	CAACATGACCCTGAGTCCCC
NKX2-5	R	TAATCGCCGCCACAAACTCT
TNNT2	F	GACAGAGCGGAAAAGTGGGA
TNNT2	R	CACAGCTCCTTGGCCTTCTC
MEF2C	F	GCCAGCTGGTCTGGCTTTAT
MEF2C	R	CTTTGGCACCAGTGCCTTTC
Internal control
GAPDH	F	GAAAGCCTGCCGGTGACTAA
GAPDH	R	AGGAAAAGCATCACCCGGAG
^a) F, 센스 가닥의 서열 ^b) R, 안티센스 가닥의 서열

켄파울론과 켄파울론 유도체 23개(도 1)를 ASCs에 3개의 다른 농도(1, 5, 10 μM)로 각각 처리하고 48시간 후 세포 생존 여부를 cell viability assay을 통해 확인하였다(도 2).

또한, 켄파울론과 켄파울론 유도체 처리 24시간 및 48시간 후의 세포 모양 변화를 현미경으로 관찰하여 사진을 찍었다(도 3 내지 도 11).

그 중 세포 모양 변화가 관찰되었던 켄파울론 유도체 8개(#1, 2, 13, 16, 18, 20, 21, 23)와 켄파울론을 다시 ASCs에 세포의 생존에 큰 영향을 주지 않는 농도(1, 5, 10 μM)로 처리한 후 qRT-PCR을 이용하여 심근세포(cardiomyocyte) 특이적 마커(GATA4, TBX5, NKX2-5, TNNT2, MEF2C) 발현 정도를 조사하였다.

그 결과 켄파울론 유도체 #18(K-F-NO2)를 처리한 ASCs에서 심근세포 특이적 마커의 발현이 급증하는 것을 관찰하였다(도 12).

다음으로, 심혈관질환 동물 모델에서 줄기세포(ASCs) 처리군 및 켄파울론 유도체 #18이 처리된 줄기세포 처리군을 비교하였다. 이를 위해, 심장 적출 후 1% TTC(Triphenyl tetrazolium chloride) 용액으로 관류하여 37℃에서 1시간 동안 염색한 후 포름알데히드에서 고정하였다. TTC는 미토콘드리아의 탈수소효소를 염색하기 때문에 세포 사멸이 진행되었을 경우 미토콘드리아에서 탈수소효소를 분비할 수 없으므로 염색이 되지 않아 하얗게 나타나는 것을 통해 심근경색에 의한 손상 부위 및 크기를 확인할 수 있다.

도 13에 나타난 바와 같이, 손상을 입은 MI(myocardial infarction) 군과 비교하였을 때 ASCs를 처리한 군에서 별다른 차이를 보이지 않았지만 켄파울론 유도체 #18를 처리한 ASC를 처리한 군에서 보다 염색이 많이 된 것을 보아 심근경색에 의한 손상이 줄어든 것을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물:
[화학식 1]
삭제
제1항에 있어서,
심근세포는 심근세포 특이적 마커의 발현이 지방 유래 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것인, 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물.
제3항에 있어서,
심근세포 특이적 마커는 GATA4, TBX5, NKX2-5, TNNT2 및 MEF2C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물.
하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 지방 유래 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법:
[화학식 1]
삭제
제5항에 있어서,
배양은 5일 내지 15일 동안 수행되는 것인, 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법.
제5항에 있어서,
심근세포는 심근세포 특이적 마커의 발현이 지방 유래 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것인, 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법.
제8항에 있어서,
심근세포 특이적 마커는 GATA4, TBX5, NKX2-5, TNNT2 및 MEF2C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 지방 유래 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도 방법.
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