CN101519385B

CN101519385B - 具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物及其用途

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Publication number: CN101519385B
Application number: CN2008101012284A
Authority: CN
Inventors: 韩梅; 冯彦; 孙媛媛
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2028-02-29
Also published as: CN101519385A

Abstract

本发明提供了具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物及其用途。本发明化合物对干细胞增殖机理的研究具有重要意义。本发明还涉及该化合物及其相关化合物在制备干细胞增殖促进剂以及用于制备促进干细胞增殖的药物中的用途。本发明还涉及该化合物在用于制备治疗由于细胞损伤引起的各种疾病的药物中的用途。所述细胞损伤引起的各种疾病包括与神经系统细胞退行性或损伤性有关的疾病、血液系统疾病、心血管系统细胞丢失性或损伤性疾病以及皮肤烧伤等。

Description

具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物及其用途

技术领域

本发明涉及具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物，还涉及该小分子化合物在制备干细胞增殖促进剂及用于制备促进干细胞增殖的药物中的用途。本发明还涉及该小分子化合物在制备治疗细胞丢失或损伤性疾病的药物中的用途。属于医药领域。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞，在特定条件下，还可以增殖并定向分化成不同的功能细胞。因此干细胞的研究对生命体各个组织器官的更新及损伤修复，起着非常重要的作用，成为许多无法治愈的疾病，特别是细胞及组织缺失或损伤性疾病的唯一希望。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于伦理问题，使其应用受到极大的限制；而成体干细胞由于可以分化为功能细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础；为研究哺乳动物早期发育提供了很好的体外模型；为许多疾病的细胞替代疗法提供了新的细胞来源；也标志着现代生物学的发展和新药物的研发进入了新的时代。因此，成体干细胞成为研究的重点。但正常成年哺乳动物的干细胞数量极少且处于静息状态，且分化发育受多种内在机制和微环境因素的影响，使其自行分化难以形成单一独特的细胞类型；在体外则很难长期、大量培养，特别是无血清扩增培养，无法应用于实际治疗。目前为止，只有少量的成体组织干细胞，可在体外实现无血清扩增培养，但需要加入不同的生长因子、信号分子等进行遗传调控。显然，自体及体外定向诱导干细胞的增殖和分化，以产生特定类型的同源细胞群体需要更有效、选择性更强的细胞培养和诱导技术。

许多疾病的根源都可追溯为功能性细胞的丢失或损伤所致，而细胞替代疗法是治疗这些疾病的有效方法，有时甚至是唯一的方法。细胞替代疗法分为：细胞移植和通过药物调节自体干细胞增殖与定向分化。干细胞药物就是指可以通过调节生物体内干细胞的增殖与分化，来防治由于细胞缺失或损伤而引起的疾病的一类治疗和预防药物。近年来发现：生长因子和小分子化合物均可调节生物体内干细胞的增殖与分化；运用干细胞药物来调节自身干细胞的增殖与定向分化潜能，以重建受损的功能细胞，恢复其生物学功能，既解决了成体干细胞的来源困难和胚胎干细胞的伦理困惑问题；也避免了细胞移植的免疫排斥和手术后遗症问题。为细胞丢失或损伤性疾病的防治提供崭新的视点和思路。

例如，中枢神经系统疾病——神经系统退行性或损伤性疾病：包括帕金森氏病(PD)、阿尔采末病(AD)、亨廷顿病(HD)、药物滥用、抑郁症以及脑卒中等，均是由于神经细胞的缺失和损坏而引发的疾病。设法挽救已受损的神经细胞，并同时刺激该神经细胞的再生是理想的治疗策略。目前已有人通过使用神经干细胞移植来尝试修补受损的细胞，但是临床上存在移植用神经干细胞、功能性细胞无法获得的限制，以及细胞移植的免疫排斥和手术后遗症等问题，使人们不得不关注于通过刺激自体神经干细胞增殖与分化，以提供神经细胞进行“自我更新”的可能，进而推动神经干细胞药物的发明。

虽然生长因子或生物活性蛋白可以最为干细胞药物应用，但由于生长因子或生物活性蛋白作为体内的大分子活性物质，不仅介入纵横交错的生理过程，在体内呈现极其复杂的多重调控功能，而且是异源性多肽或蛋白，可以引发免疫反应，价格也很昂贵，很难具有临床治疗和药用价值。小分子化合物则一直是临床疾病治疗药物的主体，而小分子化合物作为干细胞调节药物的潜力也越来越受到人们的重视。

小分子化合物包括合成小分子化合物和天然小分子化合物(主要是指植物提取化合物以及中药的有效成分单体)，相比之下用小分子化合物药物具有以下特点及优势：

a.小分子化合物调节不仅易于给药又易于在生理功能恢复后撤出，对病理和生理过程的调节主动方便。

b.外源性的小分子化合物通常调节作用单一，不像内源性的大分子活性物质一样，介入体内复杂的多重调控系统，而且易引发免疫反应。因而有助于维持正常的机体生理功能。

c.小分子化合物易于人工合成及工业化生产，比内源性的生物活性大分子有更好的药用价值及临床药物治疗价值。

d.特别是天然小分子化合物由于经过了生物(植物体)代谢过程，其生物适应性特别是毒性更优于合成的小分子化合物。

e.小分子化合物由于分子量小，易于通过血脑屏障。

因此寻找特异性调节成体干细胞增殖与分化的小分子化合物不仅是成体干细胞体外增殖与分化的生物学研究热点，还是创新药物——干细胞药物的研究热点。

本发明的目的是提供具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物。该小分子化合物可以作为干细胞增殖促进剂以及用于制备促进干细胞增殖的药物，为科研、临床及药用提供更多的选择。运用干细胞药物来调节自身干细胞的增殖与定向分化潜能，以重建受损的功能细胞，恢复其生物学功能，既解决了成体干细胞的来源困难和胚胎干细胞的伦理困惑问题，也避免了细胞移植的免疫排斥和手术后遗症问题，为细胞丢失或损伤性疾病的防治提供崭新的视点和思路。

发明内容

本发明的目的是提供具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物。本发明提供的小分子化合物可以作为干细胞增殖促进剂以及用于制备促进干细胞增殖的药物，可以应用于临床，为移植提供大量干细胞。本发明提供的小分子化合物能够促进干细胞增殖以及功能细胞的修复，而且能够用于干细胞增殖机理的研究。

化合物及其制备方法

本发明提供通式[I]所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、水合物：

式中，R₁是氢原子、低级烷基、或芳基；R₂是氢原子、氨基、低级烷基或芳基；X是杂原子，如氧原子、或硫原子；Y是杂原子，如氧原子、或硫原子。

在本发明中，低级烷基是指C1-C6烷基(具有1-6个碳原子的烷基)，包括C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、或丁基。芳基包括但不限于苯基或萘基。杂原子一般是指O、S、或N原子，优选氧原子或硫原子。

以下作为上述通式的优选例子：

在一个优选实施方案中，通式[I]所示小分子化合物为Ia(R₁是氢原子，R₂是氨基，X是硫原子，Y是硫原子)，结构式如下：

在一个优选实施方案中，通式[I]所示小分子化合物为Ib(R₁是甲基，R₂是氨基，X是硫原子，Y是硫原子)，结构式如下：

在一个优选实施方案中，通式[I]所示小分子化合物为Ic(R₁是甲基，R₂是甲基，X是硫原子，Y是硫原子)，结构式如下：

在一个优选实施方案中，通式[I]所示小分子化合物为Id(R₁是氢原子，R₂是氨基，X是氧原子，Y是硫原子)，结构式如下：

在一个优选实施方案中，通式[I]所示小分子化合物为Ie(R₁是氢原子，R₂是甲基，X是硫原子，Y是氧原子)，结构式如下：

本发明还涉及通式[I]所示小分子化合物的制备方法：

制法1：

制法1是通过由化合物II为起始原料，环化生成中间产物III，然后进行氨基缩硫脲反应制备Ia的方法。

制法2：

(式中：R₁是低级烷基、芳基；)

制法2是以制法1中的化合物III为起始原料，首先进行烷基化反应，然后通过氨基缩硫脲反应制备通式为I_R1(R₁是低级烷基、芳基)的化合物的方法。

制法3：

(式中，R₁是低级烷基、芳基；R₂是低级烷基、芳基；)

制法3是以制法2中的化合物IV为起始原料，与化合物R₂NCS反应制备通式为I_R1R2(R₁是低级烷基、芳基；R₂是低级烷基、芳基)的化合物的方法。

制法4：

(式中，R₁是氢原子、低级烷基、芳基；)

制法4是以制法1中的化合物III或制法2中的化合物IV为起始原料，通过与化合物VI反应制备通式为Ix(R₁是氢原子、低级烷基、芳基)的化合物的方法。

制法5：

制法5是以化合物VII与化合物VIII为起始原料，合成中间产物IX后再与X反应，生成XI，在进行与制法3相似的反应，制备通式为I_Y(R₂是低级烷基、芳基)的化合物的方法。

用上述制法1-5得到的化合物[I]可用常规方法分离，根据需要，可使用常规方法，例如，重结晶法、分离用薄层色谱、柱形色层分离法等纯化。另外，根据需要，可以盐的形式纯化。

化合物[I]可用本身公知的方法，转化为药学上可接受的盐。

增殖剂

本发明还涉及本发明提供的通式[I]所示小分子化合物在制备干细胞促增殖剂中的用途。所述干细胞促增殖剂是指那些在体内或在体外与干细胞接触时能够促进干细胞增殖的化合物及其组分。

本发明还涉及作为干细胞促增殖剂的通式[I]所示化合物。

本发明还涉及通式[I]所示化合物作为干细胞促增殖剂的用途。

由于本发明化合物具有前述的功能及特点，因此本发明化合物可作为体外培养干细胞的添加剂，与前述已知技术所使用的大分子蛋白质不同，本发明的化合物为分子量较小的小分子物质，其可以在培养液内较久地维持其特性(大约7-9天换一次培养基即可)。另外，本领域的技术人员，通过阅读本发明说明书后也可得知，本发明化合物可进一步包含生长因子，用于培养干细胞，以促进其增生。这对于干细胞的研究是一个更好的且新兴的试验用无血清的细胞培养添加剂。

在上述用途中，所述干细胞促增殖剂以本发明提供的通式[I]所示小分子化合物作为活性成分。本发明提供的干细胞促增殖剂可以单独含有本发明提供的小分子化合物，或者是本发明提供的小分子化合物与其他任意具有促进干细胞增殖作用的有效成份的混合物。

本发明的干细胞促增殖剂可以用于干细胞的增殖方法中，该方法的特征在于，通过该小分子化合物与干细胞接触，促进干细胞的增殖。当在体外使用本发明提供的干细胞增殖剂的场合，优选将本发明提供的小分子化合物溶解于能够溶解该物质的溶液中之后，提供使用。作为该溶液，可列举出水、DMSO等。

对干细胞无特殊限定，只要是干细胞即可，包括成体干细胞和胚胎干细胞。其中胚胎干细胞作为全能性细胞，可以分化为任何细胞类型。成体干细胞包括神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等。

由本发明提供的通式[I]所示小分子化合物制备的干细胞促增殖剂可以直接给药，不过希望将其作为常规的各种药剂提供使用，而且这些药剂可以用于动物或人。

对干细胞无特殊限定，只要是干细胞即可，包括成体干细胞和胚胎干细胞。其中成体干细胞包括神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等。胚胎干细胞作为全能性细胞，可以分化为任何细胞类型。

在上述用途中，所述干细胞促增殖剂以本发明提供的通式[I]所示小分子化合物作为活性成分。本发明提供的干细胞促增殖剂可以单独含有本发明提供的小分子化合物，或者是本发明提供的小分子化合物与其他任意具有促进干细胞增殖作用的有效成份的混合物。这些药剂可以按照与上述的促进干细胞增殖药的制剂同样的方法来制备，也可以按照同样的给药方法来给药。

方法

本发明还涉及一种干细胞的促进增殖方法，其特征在于，用本发明提供的通式[I]所示小分子化合物促进干细胞的增殖。

本发明还涉及一种干细胞的促进增殖方法，其特征在于，将本发明提供的通式[I]所示小分子化合物与干细胞接触。

本发明的上述方法可以在体内或者体外进行。

本发明还提供一种培养干细胞的方法，包括在本发明化合物存在的情况下，培养干细胞。

在一个实施方案中，在本发明所述的干细胞促增殖剂存在的情况下，培养获得的干细胞。

可以在存在本发明所述的干细胞促增殖剂的情况下，通过培养动物的干细胞有效的促进干细胞的增殖。动物的干细胞可以是任一种动物的干细胞，优选是哺乳动物，更优选是由大鼠、小鼠、猴子、人得来的干细胞。作为干细胞，可列举出由大脑得来的神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等，优选是神经干细胞。神经干细胞可以是由任何周龄或任何年龄的动物得来的细胞，但优选是成体干细胞。本发明的干细胞可以包括人胚胎干细胞，或者在另一个实施方式中，本发明的干细胞包括人胚胎干细胞。

作为由动物取得成年神经干细胞的方法，可列举出下述方法，即，取大鼠SVZ区组织细胞，分离培养大鼠神经干细胞。

本发明的干细胞促增殖剂存在下培养神经干细胞时，相对于2×10⁴个/ml左右的神经干细胞，优选该神经干细胞促增殖剂浓度作用范围在1nmol/ml～100umol/ml。通过使神经干细胞与本发明的神经干细胞促增殖剂接触，在37℃下和5％CO₂气体中，于2～7天内每3天一次更换全部或部分培养基进行培养，这样可以促进神经干细胞的增殖。

作为用于培养成年神经干细胞的培养基，只要是不妨碍促进神经干细胞增殖的培养基，任一种培养基都可以使用，但优先选用DMEM/F12培养基等。

按上述培养方法获得的神经干细胞可以从培养基中回收，通过外科手术将其移植到神经疾病患者的障碍部位，即可用于治疗该神经疾病。作为该神经疾病，可列举出：帕金森氏病、阿尔采末病、唐氏症、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤、亨廷顿氏病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、焦虑性障碍、综合失调症、抑郁症和躁郁症等。

组合物及其医药用途

已知小分子化合物较易通过血脑屏障而到达脑细胞，目前美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)正积极进行关于人体干细胞移植治疗方式的认可，而本发明化合物中所包含的小分子化合物，且其可在无血清、低细胞密度的情况下促进干细胞生存，由于本发明化合物具有这些特性，本发明的技术人员，也可通过阅读前述的说明而了解到，本发明化合物可进一步通过已知的技术开发成为一医药化合物。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，含有通式[I]所示小分子化合物或其药学上可接受的盐、异构体或水合物。

本发明提供的药物组合物可以只含有治疗有效量的通式[I]所示小分子化合物或其药学上可接受的盐、异构体或水合物。或者，本发明提供的药物组合物也可以含有治疗有效量的通式[I]所示小分子化合物或其药学上可接受的盐、异构体或水合物及药学上可以接受的载体或赋形剂。或者本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的通式[I]所示小分子化合物或其药学上可接受的盐、异构体或水合物，用于治疗的其他的有效成分及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的通式[I]所示小分子化合物及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的小分子化合物Ia及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的小分子化合物Ib及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的小分子化合物Ic及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的小分子化合物Id及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的小分子化合物Ie及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物可以含有治疗有效量的小分子化合物Ia、Ib、Ic、Id、Ie中一种或者多种的组合，以及药学上可以接受的载体或赋形剂。

本发明提供的药物组合物制剂剂型包括药学上可以接受的任何剂型。可以通过将活性成分与可药用的一种或更多的载体一起混合，按照制剂学技术领域公知的任意方法来制备。

作为给药途径，希望使用在治疗时最有效的途径，例如可列举出口服或静脉内给药等非口服途径。

作为给药剂型的例子，可列举出片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂等。

作为适合于口服给药的例如糖浆剂之类的液体制剂，可以通过使用下述物质来制备，所说物质包括：水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等的糖类；聚乙二醇、丙二醇等醇类；芝麻油、橄榄油、大豆油等的油类；对羟基苯甲酸酯类等防腐剂；草莓香精、薄荷等香料类等。另外，片剂、散剂和颗粒剂等可以通过使用下述物质来制备，所说物质包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等赋形剂；淀粉、海藻酸钠等崩解剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。

适合于非口服给药的制剂优选使用含有与接受者的血液等渗的活性化合物的灭菌水性剂来制备。例如，在注射剂的场合，可以使用由盐溶液、葡萄糖溶液或者盐水与葡萄糖溶液的混合物组成的载体等来配制注射用的溶液。

另外，即使在非口服剂的场合，也可以添加选自在描述口服剂时例示的稀释剂、防腐剂、香料剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、表面活性剂、增塑剂等之中的一种或多种辅助成分。

本发明提供的通式[I]所示小分子化合物的给药量和给药次数可根据给药的剂型、患者的年龄、体重、应予治疗的症状的性质和严重程度的不同而异，但是在通常口服的场合，按照成人每人0.01mg～1g，优选0.05～50mg的给药量，每天一次至数次给药。在静脉内给药等的非口服给药的场合，按照成人每人0.001～100mg，优选0.01～10mg的给药量，每天一次至数次给药。

本发明还涉及本发明提供的药物组合物在制备干细胞药物中的用途。所述干细胞药物是指可以通过调节生物体内干细胞的增殖与分化，来防治由于细胞缺失或损伤而引起的疾病的一类治疗和/或预防药物。近年来发现：运用中药、生长因子和小分子化合物均可调节生物体内干细胞的增殖与分化。

本发明还涉及本发明提供的药物组合物在制备治疗细胞丢失或损伤性疾病的药物中的用途。

在本发明所述用途中，所述细胞丢失或损伤性疾病包括与神经系统细胞退行性或损伤性有关的疾病、血液系统疾病、心血管系统细胞丢失性或损伤性疾病、皮肤疾病。

在本发明所述用途中，所述与细胞退行性或损伤性有关的疾病包括：(1)神经系统疾病：帕金森氏病(Parkinson s disease，PD)、阿尔采末病(Alzheimer s disease，AD)、亨廷顿病(Huntington s disease，HD)、唐氏症、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、焦虑性障碍、抑郁症、躁郁症等；(2)血液系统疾病：急性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性组织细胞病、再生障碍性贫血、海洋性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维症等；(3)心血管疾病：心肌病、冠心病、心力衰竭、亚急性心内膜炎、急性心肌梗死、心绞痛、缺血性心脏病等；(4)外科疾病：多器官功能不全综合症、骨折不愈合、烧伤、骨缺损、颅脑手术后遗症、眼角膜损伤等；(5)自身免疫系统疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合症、皮肌炎、重症肌无力、多发性硬化、获得性免疫缺陷综合症等；及其他系统与细胞丢失或损伤有关的疾病，这里不一一列举。

本发明的任何方法均可以是在体内进行或者可以在体外进行。

附图说明

图1：Ia对胚胎干细胞增殖的促进作用

图2：Ia对人的神经干细胞增殖的促进作用

图3：Ia对人间充质干细胞增殖的促进作用

图4：Ia对大鼠间充质干细胞增殖的促进作用

图5：药效学评价(水迷宫结果)

图6：Ia对AD大鼠体内神经细胞的作用

具体实施方式

下面，列举实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：4-(4-(5-mercapto-1，3，4-oxadiazol-2-yl)phenyl)thiosemicarbazide的制备(Ia)

将0.76g(0.005M)对氨基苯甲酰肼(II)溶于30ml甲醇中，加入KOH水溶液(0.005M)，CS20.3ml(0.005M)，加热回流，24h后旋干甲醇，加入约30ml水，用6N盐酸酸化，抽滤，乙醚洗涤，干燥，得产物2-巯基-5-对氨基苯基-1，3，4-噁二唑(III)；将III579mg，溶于20ml甲醇，加入KOH 168mg，CS2 0.2ml，室温反应4h，过滤，真空旋干甲醇，加入四氢呋喃10ml，对入甲苯磺酰氯266mg，室温反应1h后，加入水合肼(0.19ml)，室温过夜，抽滤，乙醇重结晶，干燥，得产物160mg，产率20％。

IR v(液体石蜡)cm^-1：3320，3212，1810，1596，1292。

1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：

2.0(3H，s)，3.0(1H，s)，4.0(1H，s)，6.52(2H，d)，7.23(2H，d)。

实施例2：4-(4-(5-(methylthio)-1，3，4-oxadiazol-2-yl)phenyl)thiosemicarbazide的制备(Ib)

将实施例1中的III 1.5mmol和1.5mmolKOH溶解于11mL无水甲醇中。室温下搅拌10min，加入CH₃I，继续室温搅拌4h。过滤，得白色固体，5％Na₂CO₃洗涤，真空干燥，乙醇重结晶，干燥，得产物2-巯甲基-5-对氨基苯基-1，3，4-噁二唑(IV)；将IV 579mg，溶于20ml甲醇，加入KOH 168mg，CS₂ 0.2ml，室温反应4h，过滤，真空旋干甲醇，加入四氢呋喃10ml，对入甲苯磺酰氯266mg，室温反应1h后，加入水合肼(0.19ml)，室温过夜，抽滤，乙醇重结晶，干燥，得产物350mg，产率45％。

IR v(液体石蜡)cm^-1：3323，3212，1652，1123。

1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：

2.0(3H，s)，2.47(3H，s)，4.0(1H，s)，6.52(2H，d)，7.23(2H，d)

实施例3：1-methyl-3-(4-(5-(methylthio)-1，3，4-oxadiazol-2-yl)phenyl)thiourea的制备(Ic)：

将实施例2中的IV 1.5mmol溶解于20mL无水甲醇中，加入CH₃NCS1.5mmol，室温下搅拌5小时，旋干溶剂，乙醇重结晶，干燥，得产物Ic350mg，产率83％。

IR v(液体石蜡)cm^-1：3313，3259，1762，1232。

1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：

2.0(1H，s)，2.47(6H，s)，4.0(1H，s)，6.52(2H，d)，7.23(2H，d)

实施例4：4-(4-(5-mercapto-1，3，4-oxadiazol-2-yl)phenyl)semicarbazide的制备(Id)：

将实施例1中的III965mg，溶于20ml甲醇，加入KOH 168mg，CS₂0.2ml，室温反应4h，过滤，真空旋干甲醇，加入四氢呋喃10ml，对入氯甲酸乙酯1.08g，室温反应1h后，加入水合肼(0.19ml)，室温过夜，抽滤，乙醇重结晶，干燥，得产物452mg，产率36％。

IR v(液体石蜡)cm^-1：3320，3212，1632，1292。

1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：

2.0(2H，s)，3.0(1H，s)，6.0(2H，s)，7.46(2H，d)，7.70(2H，d)

实施例5：1-methyl-3-(4-(5-oxo-4，5-dihydro-1，3，4-oxadiazol-2-yl)phenyl)thiourea的制备(Ie)：

将咪唑10mmol溶于二氯甲烷溶液中，加入VIII 10mmol，冰浴反应1小时后室温2小时，旋干溶剂后加入DMF30ml，X 10mmol，室温反应24小时后加入CH₃NCS10mmol，室温下搅拌5小时，旋干溶剂，乙醇重结晶，干燥，得产物Ie1.4g，产率57％。

IR v(液体石蜡)cm^-1：3115，1821，1662，1189。

1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：

2.0(1H，s)，2.47(3H，s)，4.0(1H，s)，6.5(2H，d)，7.0(1H，s)，7.4(2H，d)

实验例6：小分子化合物Ia对胚胎干细胞增殖作用的研究

胚胎干细胞(按常规方法从受精卵获得)培养于无血清培养基(常规培养基，如DMEM/F12，αMEM，1640等)中，实验分为空白、FGF、神经干细胞促增殖剂Ia、FGF+神经干细胞促增殖剂Ia组。培养1-4天后采用试剂盒CellTiter-

Luminescent Cell Viability Assay(Promega)用ATP法检测细胞增殖。ATP法按照该试剂盒操作步骤操作。

如图1所示，柱状图的高度表示化学发光强度，与细胞数成正比，由此可以看出，在神经干细胞促增殖剂Ia存在下，胚胎干细胞增殖显著增加，因此Ia对胚胎干细胞具有促进增殖的作用。

实验例7：小分子化合物Ia促进大鼠神经干细胞增殖的研究

将大鼠神经干细胞培养于无血清培养基中，实验分为空白组、FGF组、小分子化合物Ia组、FGF+小分子化合物Ia组，用ATP法(同实施例6的方法)进行检测。小分子化合物Ib、Ic、Id、Ie均做了上述实验，

实验结果如下表所示，发现小分子化合物Ia、Ib、Ic、Id、Ie对大鼠神经干细胞具有促进增殖的作用。

表：小分子化合物(Ia-e)对大鼠成体神经干细胞增殖的促进作用

小分子化合物	大鼠神经干细胞增值率
		Ia	4.2
Ib	2
		Ic	1.5
Id	1.6
		Ie	2.4

实验例8：促进体外培养细胞系：人的神经干细胞增殖的研究

将人的神经干细胞(北京大学干细胞研究中心按常规方法提供)用培养基(DMRM/F₁₂+10％胎牛血清+20ng/ml EGF、bFGF)配成单细胞悬液，以2×10⁴接种于96孔板，实验分组为：培养基组对照组(不加药组)；培养基+小分子化合物Ia组(加药组)。培养4天后加入MTT(5mg/ml)10ul，孵育4h后加入裂解液(10％SDS，0.1％NH₄Cl)100ul，孵育过夜。在490nm测光吸收值。

实验结果如图2所示，柱状图高度表示吸光度的大小，与细胞个数成正比(以下MTT法的图纵坐标表示一样，不一一解释)。小分子化合物Ia吸光度大，证明加入小分子化合物Ia组细胞数量多，因此证明小分子化合物Ia对人的神经干细胞具有促进增殖的作用。

实施例9：Ia对人、大鼠间充质干细胞增殖的促进作用

将人(大鼠)间充质干细胞(按照常规方法获得的细胞系)用培养基(α-MEM+10％胎牛血清)配成单细胞悬液，以1×10⁴接种于96孔板，实验分组为：培养基对照组；培养基+小分子化合物Ia组。培养2天后加入MTT(5mg/ml)10ul，孵育4h后加入裂解液(10％SDS，0.1％NH₄Cl)100ul，孵育过夜。在490nm测光吸收值。

实验结果：如图3所示，小分子化合物Ia对人间充质干细胞具有促进增殖的作用。如图4所示：小分子化合物Ia对大鼠间充质干细胞具有促进增殖的作用。

实验例10：制剂

实施例(1)：Ia注射剂

称取小分子化合物Ia 9mg，溶解于1.8mlDMSO溶液中，溶解后，用注射用生理盐水500ml，搅拌混匀，用5号砂芯漏斗过滤，分装，100℃热压灭菌30分钟，检漏，质检，包装，即得90ug/5ml/支安培，共100支。

实施例(2)：Ia片剂

通过将以下组分按下述重量配比来制备小分子化合物Ia片剂：

化合物Ia 5 乳糖 62

马铃薯淀粉 30 聚乙烯醇 2

硬脂酸镁 1

将化合物Ia细粉、乳糖、马铃薯淀粉混合均匀，另取聚乙烯醇配成50％水溶液，按上述质量配比加入混合粉末中，混合均匀，通过20目筛制成湿粒，60℃沸腾干燥。用整粒机对经以上工序获得的Ia颗粒进行整粒，以得到80-12目的Ia颗粒。按重量配比称取过60目以上筛的硬脂酸镁，与以上工序获得的Ia颗粒混合5分钟，以保证其均匀性。在压片机上用Ia总混粉进行压片，硬度要达到1kg以上，偏重差异控制在±5％以内，规格为10mg/片；根据质量和市场要求对所得的Ia进行分装。

实验例11：小分子化合物Ia在AD大鼠体内的药效学评价

建AD大鼠模型：本实验利用脑立体定位仪和微量注射泵向大鼠海马齿状回背侧细胞带(前囟后3.0mm，右侧旁开2.0mm，硬脑膜下3.2mm，门齿钩平面低于耳间线平面2.4mm)定位注射聚合态的Aβ1-40(5ug/ul)20ul(0.4ul/min，5min)，2周后建模完成。

实验分组：生理盐水组(脑内注射生理盐水，尾静脉注射DMSO生理盐水，2只)；模型组(脑内注射Aβ1-40，尾静脉注射DMSO生理盐水，2只)；给药组(脑内注射Aβ1-40，尾静脉注射Ia的DMSO生理盐水溶液，3只)。连续给药12天。

药效学实验：Morris水迷宫：实验装置为一高度60cm、直径120cm的不锈钢圆形水池(水池底和水池壁都用黑色贴纸覆盖以便摄像机分辨出水池中的白色实验鼠)通过摄像机与电脑连接；水池分四个象限，在第一象限正中处放一个平台，实验时水深约40cm，平台低于水面约3cm，实验时使水温保持在22±1℃。每次实验鼠分别从4个不同的入水点入水，摄像机记录数验鼠游泳的轨迹，通过图像处理软件分析实验结果。实验共进行5天，在正式实验前一天每只实验鼠在水池中自由游泳2分钟以适应环境。前4天为定位航行实验阶段，实验时记录实验鼠从入水至爬上平台的时间，为逃避潜伏期，并使其在平台站立10秒，每次实验持续大鼠90秒，若90秒后未找到平台，便引导实验鼠至平台并在平台上站立10秒。每只大鼠每天检测两次，第2次在第一次结束10分钟后从与第一次不同入水点入水。第五天撤去平台，进行空间探索实验，记录实验动物的逃避潜伏期、垮台次数及在象限偏好性等，进行比较。

实验结果图5表明：阴影象限代表原站台区，停留时间越长证明学习效果越好。由图可以看出，给药组比对照组在逃避象限停留时间长，且具有明显的象限倾向性，证明学习效果越好，证明干细胞药物对AD的症状有所改善。

实验例12：小分子化合物Ia对AD大鼠体内神经细胞的作用

将实施例11中的大鼠，灌流取脑：大鼠麻醉，10％水合氯醛，0.3ml/100g；左心室注射肝素200ug/kg，剪开右心耳，左心室先灌40ml生理盐水，后灌300ml 4％多聚甲醛，至心脏变硬。取脑：断颈后，剥开头骨，至嗅球露出，用小弯剪从嗅球剥落，剪断视神经后，慢慢剥至自然脱落，粘连部位剪开，放入4％多聚甲醛溶液中过夜。然后用酒精梯度脱水后进行石蜡包埋，然后进行切片、捞片。

HE染色：脱蜡：二甲苯，2次，每次3min。水化：降浓度梯度酒精水化：100％→95％→90％→80％→70％。每级脱水2～3分钟以除二甲苯。水洗：去除乙醇。浸入苏木精染液，染色5-10min。自来水浸洗。浸入稀盐酸乙醇溶液进行分色，数秒钟即可。自来水浸洗。浸入淡氨水中，使细胞核蓝化，3-5min。自来水浸洗。浸入伊红染液，染色5-10min，自来水浸洗。经酒精逐级脱水后二甲苯透明3次，每次1min。用中性树脂封片，在荧光显微镜下观察。

光镜下观察，正常细胞细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。

实验结果如图6所示：AD模型组海马区细胞变性比较厉害，而Ia治疗组海马区细胞变性要轻一些，二者具有显著差异，因此，实验初步证明Ia对神经细胞有保护作用，保护了神经细胞在外源性刺激下的变性。

Claims

1.通式[I]所示化合物或其药学上可接受的盐：

式中，R₁是氢原子、C1-C4烷基、或苯基；R₂是氢原子、C1-C4烷基或苯基或氨基；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子，

条件是不包括Y是硫原子、R₁是氢原子、X是硫原子且R₂是甲基、乙基或者苯基的化合物。

2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R₁是甲基或乙基。

3.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R₂是甲基或乙基。

4.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中通式[I]的化合物是下述化合物(1)-(5)中的任一个：

5.权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备具有促进干细胞增殖作用的药物中的用途。

6.权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备干细胞增殖促进剂中的用途。

7.权利要求5或6所述的用途，其中，所述干细胞选自成体干细胞和胚胎干细胞。

8.权利要求7所述的用途，其中所述成体干细胞是神经干细胞、间充质干细胞或造血干细胞。

9.一种药物组合物，含有权利要求1-4中任一项的化合物或其药学上可接受的盐。

10.权利要求1-4中任一项的化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求9所述的组合物在制备治疗细胞丢失或损伤性疾病的药物中的用途。

11.权利要求10所述的用途，其特征在于：细胞丢失或损伤性疾病选自与神经系统细胞退行性或损伤性有关的疾病、血液系统疾病、心血管系统细胞丢失性或损伤性疾病、皮肤疾病。

12.权利要求11所述的用途，其特征在于：所述与神经系统细胞退行性或损伤性有关的疾病选自帕金森氏病、阿尔采末病、亨廷顿病、唐氏症、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、焦虑性障碍、抑郁症、躁郁症；所述血液系统疾病选自再生障碍性贫血、地中海贫血症、白血病、恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统及免疫系统功能障碍；所述心血管系统细胞丢失性或损伤性疾病选自心肌病、冠心病、心力衰竭、亚急性心内膜炎、急性心肌梗死、心绞痛、缺血性心脏病；所述皮肤疾病是皮肤烧伤。