CN101495120A - 用于诱导或抑制干细胞分化的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诱导或抑制干细胞分化的组合物和方法。本发明也涉及在治疗医学疾病例如骨质疏松、骨折、骨损伤、心肌梗塞、心肌病、肌肉变性疾病、肌病和尿失禁中的应用。

Description

用于诱导或抑制干细胞分化的组合物
技术领域
本发明涉及用于诱导或抑制干细胞分化的组合物和方法。本发明也涉及在治疗医学疾病例如骨质疏松、骨折、骨损伤、心肌梗塞(myocardiacinfarction)、心肌病、肌肉变性疾病(degenerative muscle disease)、肌病和尿失禁中的应用。
背景技术
干细胞是这样的细胞，它们具有无限期地自我复制的能力，并且具有发展成具有特化功能的成熟细胞的潜力，所述成熟细胞例如心脏细胞、神经细胞、骨细胞、肌细胞、血细胞和胰β细胞。存在几种类型的干细胞或干细胞源。胚胎干(ES)细胞是源自胚泡的内细胞团的干细胞并且是多能的，即它们能够分化成源自所有三种原胚层(外胚层，内胚层或干细胞中胚层)的细胞(Keller，Genes Develop，2005，19，1129-55)。成体干细胞是未分化的细胞，它们日日繁殖从而提供某些特化的细胞。已经在全身各处(包括在骨髓、外周血、脑、脊髓、肝脏和胰腺中)找到了成体干细胞，并且它们的潜力比ES胞的潜力具有更多的限制。通常，成体干细胞是多能细胞，它们负责分化成发挥它们所来源的组织的功能的细胞。但是，已经发现成体干细胞在某些条件下具有分化成不相关组织的特化细胞(包括源自不同胚胎胚层的细胞)的潜力(Bhatia R and Hare JM，Congest Heart Fail.2005，11，87-91和Weissberg PL and Qasim A，Heart，2005，91，696-702)。
Wnt基因家族编码20种以上的富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，它们通过结合到靶细胞上的Frizzled(Fzd)受体而发挥作用。Wnt结合到Fzd上激活了Disheveled(Dvl)，导致糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)(一种细胞质丝氨酸-苏氨酸激酶)的失活。GSK-3β靶标的β-连环蛋白(beta-catenin)被稳定化，转移到细胞核，并激活具体启动子上的TCF(T细胞因子)依赖性转录(Dierick和Bejsovec在1999年做出综述并且Wodarz和Nusse在1998年做出综述)。Wnt信号传导在各种组织中指导细胞命运的确定，所述各种组织包括肾(Labus et al.，Wound Repair Regen，1998，6，58-64和Vainio and Uusitalo，Pediatr Nephrol，2000，15，151-6)、CNS(Patapoutian and Reichardt，Curr OpinNeurobiol，2000，10，392-9)、造血组织(hematopoietic)(Van Den Berg et al.，Bloo-d，1998，92，3189-202)和骨骼肌(Cossu and Borello，EMBO J，1999，18，6867-72)。此外，Wnt信号传导在斑马鱼(zebrafish)和水螅(hydra)中参与出生后的伤口愈合和组织再生(Hobmayer et al.，Nature，2000，407，186-9、Labus etal.，Wound Repari Regen，1998，6，58-64和Poss et al.，Dev Dyn，2000，219，282-6)。已经提出Wnt信号传导参与骨量(bone mass)和骨生成的调节。发现LRP5中功能缺失的突变与骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(一种常染色体隐性遗传病)相关(Gong Y et al.Cell，2001，107，513-23和Kato M et al.J CellBiol，2002，157，303-14)。此外，LRP5中Gly171与Val的置换突变导致高骨量表现型(high bone mass phenotype)(Boyden LM et al.，N Engl J Med，2002，346，1513-21)。这些与LRP5中功能缺失或置换突变相关的表现型表明，Wnt信号传导可能与调整骨量和骨生成的调节相关(WestendorfJJ et al.Gene，2004，341，19-39)。在骨生成过程中，多能间充质干细胞分化成前成骨细胞(preosteoblast)，所述前成骨细胞然后分化成成熟的成骨细胞，所述成熟的骨细胞使形成骨基质并随后矿化的必要组分发生沉积。分化成成骨细胞后，所述细胞表达分化相关的表现型例如高水平的碱性磷酸酶(ALP)、甲状旁腺激素受体、I型胶原、骨钙蛋白、基质细胞外磷酸糖蛋白(MEPE)和骨唾液蛋白。在培养的细胞中，Bain等人(Biochem Biophys Res Commun，203，301，84-91)做出以下描述，使用组成性活性形式的β-连环蛋白来刺激常规的Wnt信号传导，这可诱导ALP的活性。人间充质干细胞(hMSCs)是来自骨髓的多能细胞，其可在体外增殖(expand)并分化成生成骨的、生成软骨的(chondrogenic)和生成脂肪的谱系(Pittenger MF et al，Science，1999，284，143-7)。MSCs最初确定为骨髓抽出物的成纤维细胞依附部分(fibroblasticadherent fraction)(Castro-Malaspina H.et al，Blood，1980，56，289-301)，其也称为集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)、骨髓基质细胞、骨髓间充质细胞或间充质祖细胞。hMSCs的体外生骨分化重演了正常体内骨生成过程中的多个发育步骤。例如，在地塞米松和β-磷酸甘油的存在下，hMSCs表达生骨标记物例如对骨有特异性的碱性磷酸酶(ALP)，并且它们沉积细胞外基质，所述基质在合适的培养条件下矿化(Caplan AI and Bruder SP.，Trends Mol Med，2001，7，259-64)。因为它们易于得到并且建立了良好的体外培养方案，所以hMSCs已经成为自体骨组织工程和软骨组织工程中的细胞源(Bianco P andRobey PG.，Nature，2001，414，118-21)。
Wnt蛋白通过激活Myf5和MyoD的表达而在小鼠旁轴中胚层的外植体中引发肌生成(Tajbakhsh et al.，Development，1998，121，4077-83)。体节前期(presomitic)中胚层和体节早期的肌生成受到Wnt拮抗剂即可溶性Frizzled相关蛋白3(sFRP3/Frzb1)的抑制(Borello et al.，Development，1999，126，4247-55)。因此，对于在胚胎前体细胞中诱导并保持生肌程序，Wnt信号传导似乎是必要条件，并且在某些情况下似乎是充分条件。
Wnt/β-连环蛋白途径通常调节一系列涉及促进增殖和分化的基因的表达。这些基因中的许多种，包括细胞周期蛋白D1(cyclin D1)(Shtutman et al.，“The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：5522-27(1999)和Tetsu et al.，“Beta-catenin regulatesexpression of cyclin D1 in colon carcinoma cells，”Nature 398：422-26(1999))和原癌基因(c-myc)(He et al.，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway，”Science 281：1509-12(1998))，在细胞生长、增殖和分化中起关键作用。本发明提供调节成体干细胞和胚胎干细胞分化的物质，并提供如下详细描述的其它相关优点。
发明内容
技术问题
简而言之，本发明提供诱导或抑制干细胞分化的物质和使用这些物质的方法。
技术方案
一方面，本发明提供用于诱导和促进骨髓干细胞的骨生成的方法，同时在相关方面，本发明提供在所述方法中有用的化合物。本发明涉及解决与骨再建(bone remodeling)相关的几个问题(例如骨质疏松和其它骨疾病)的方法和组合物。本发明也提供组合物在辅助治愈骨折或其它骨损伤或骨异常中的用途。本发明提供刺激或增强哺乳动物受试对象中的成骨细胞矿化的方法，其包括对所述受试对象给予有效量的所述组合物。
另一方面，本发明提供用于抑制骨髓干细胞的骨生成分化的组合物和方法。
另一方面，本发明提供用于诱导和引导干细胞分化成心肌谱系(myocardiac lineage)细胞的组合物和方法。本发明提供诱导心肌生成(cardiomyogenesis)的方法。将哺乳动物细胞与化合物接触，由此所述哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。所述接触可在体内或体外进行。从所述化合物诱导心肌生成的能力来看，所述化合物可用于治疗心肌疾病例如心肌病和心律不齐，并且可用于修复心脏肌肉组织损伤例如由心脏病发作引起的心肌梗塞。
另一方面，本发明提供用于抑制干细胞分化成心肌谱系的组合物和方法。
另一方面，本发明提供用于诱导和引导干细胞分化成骨骼肌细胞或平滑肌细胞的组合物和方法。将哺乳动物细胞与化合物接触，由此所述哺乳动物细胞分化成肌细胞谱系(myocytic lineage)细胞。所述接触步骤可在体内或体外进行。从所述化合物诱导肌生成的能力来看，所述化合物可用于治疗肌肉变性疾病例如肌肉营养不良或肌病或尿失禁。
另一方面，本发明提供用于抑制干细胞的肌生成分化的组合物和方法。
本发明的方法可用于治疗各种医学疾病。例如，在本发明的各个方面，所述组合物在细胞内，并且所述物质增加所述细胞分化的可能性；所述组合物在细胞内，并且所述物质增加所述细胞增殖的可能性。
☆所述组合物可以在体内或体外。一方面，所述组合物在体外，并且所述组合物还包括干细胞。另一方面，所述组合物在体内，并且所述组合物在哺乳动物例如小鼠体内。
另一方面，本发明提供用于调节细胞增殖的方法，其包括(a)提供在以下条件下的细胞群体：一定比例的所述群体会增殖并且一定比例的所述群体会分化；和(b)向所述群体中添加化学物质，其中所述物质导致增殖细胞的比例相对于分化的细胞比例增加。在所述方法的各种任选实施方案中，还包括将物质添加到激活Wnt途径的群体中；所述细胞群体是干细胞的群体；所述方法在体外进行；所述方法还包括添加导致所述细胞群体分化的物质，其中例如所述群体中的细胞分化形成成骨细胞、骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞或血细胞，或所述群体中的细胞分化形成神经元细胞。
另一方面，本发明提供保持干细胞处于未分化状态的方法，其包括使所述干细胞与能够抑制细胞分化或促进细胞增殖的物质接触，所述物质的量可有效地保持所述干细胞处于未分化的状态。
在本发明的方法和组合物中，所述化学物质可选自式(I)的化合物：
Figure A20078002800400131
其中
E为-(ZR4)-或-(C＝O)-；
G不存在，或为-(XR5)-或-(C＝O)-；
W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-或-(SO2)-，或不存在；
Y为氧或硫；
X或Z独立地为氮或CH；
R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，并独立地选自：
氨基酸侧链部分；
C1-12烷基或具有一个或多个取代基的取代的C1-12烷基，所述取代基独立地选自氨基、胍基、C1-4烷基胍基、二C1-4烷基胍基、脒基、C1-4烷基脒基、二C1-4烷基脒基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、硫化物基团(sulfide)、羧基和羟基；
C1-6烷氧基；
C6-12芳基或具有一个或多个取代基的取代的C6-12芳基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基(C1-4dialkylamino)、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
具有5-7个环成员的单环芳基-烷基，其可具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的单环芳基-烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
具有8-10个环成员的二环芳基-烷基，其可具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的二环芳基-烷基，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基和羟基；
具有5-14个环成员的三环芳基-烷基，其可具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的三环芳基-烷基，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基和羟基；
芳基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的芳基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、C3-6环烷基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基、羟基、酰胺基团(amide)、C1-6烷氧基C1-6酰基(C1-6acyl)和吗啉基C1-6烷基；
环烷基烷基或具有一个或多个取代基的取代的环烷基烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；和
环烷基或具有一个或多个取代基的取代的环烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基。
在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，并独立地选自：
C1-12烷基或具有一个或多个取代基的取代的C1-12烷基，所述取代基独立地选自氨基、胍基、C1-4烷基胍基、二C1-4烷基胍基、脒基、C1-4烷基脒基、二C1-4烷基脒基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、硫化物基团、羧基和羟基；
C1-6烷氧基；
环烷基C1-3烷基；
环烷基；
苯基或具有一个或多个取代基的取代的苯基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苯基C2-4烷基或具有一个或多个取代基的苯基C2-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基、硫化物基团和羟基；
萘基或具有一个或多个取代基的取代的萘基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
萘基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的萘基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苄基或具有一个或多个取代基的取代的苄基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、三氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
二苯基甲基或具有一个或多个取代基的取代的二苯基甲基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苄基苯基酰胺基团(benzylphenyl amide)或具有一个或多个取代基的取代的苄基苯基酰胺基团，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吡啶基或具有一个或多个取代基的取代的吡啶基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吡啶基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的吡啶基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
嘧啶基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的嘧啶基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
三嗪-2-基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的三嗪-2-基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
咪唑基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的咪唑基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苯并噻唑啉基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的苯并噻唑啉基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吩噁嗪基C1-4烷基；
苄基对甲苯基醚基团(benzyl p-tolyl ether)；
苯氧基苄基；
N-脒基哌嗪基-N-C1-4烷基；
喹啉基C1-4烷基；
N-脒基哌嗪基；
N-脒基哌啶基C1-4烷基；
4-氨基环己基C1-2烷基；和
4-氨基环己基。
在某些实施方案中，E为-(ZR4)-且G为-(XR5)-，其中Z为CH且X为氮，并且所述化合物具有以下通式(II)：
Figure A20078002800400171
其中R2、R3和R5如式(I)中所定义。
在某些实施方案中，所述化合物具有以下通式(III)：
在某些实施方案中，E为-(ZR4)-且G不存在，其中Z为氮，并且所述化合物具有以下通式(IV)：
Figure A20078002800400173
其中R1、R2、R3、R4和W如式(I)中所定义。
在某些实施方案中，E为-(ZR4)-且G为-(XR5)-，其中Z和X独立地为CH，并且所述化合物具有式(V)的结构：
Figure A20078002800400181
其中R1、R2、R3、R4、R5和W如式(I)中所定义。
在某些实施方案中，所述化合物具有以下通式(VI)：
Figure A20078002800400182
下文进一步详细描述了本发明的这些方面和相关方面。
附图说明
图1.制备本发明的回折拟态物的一般合成方案。
图2.化合物A(表2中的序号111)抑制β-连环蛋白/TCF转录。化合物A选择性地抑制β-连环蛋白/TCF报告基因构建体(construct)，其IC50为1.455μM。SW480细胞(105)用β-连环蛋白/TCF萤光素酶构建体转染。用化合物A(1-50μM)处理细胞。处理后24小时，制备溶胞产物，并对其进行双重萤光素酶测定。
图3.化合物B(表2中的序号10)抑制β-连环蛋白/TCF转录。化合物B选择性地抑制β-连环蛋白/TCF报告基因构建体，其IC50为6.978μM。SW480细胞(105)用β-连环蛋白/TCF萤光素酶构建体转染。用化合物B(1-50μM)处理细胞。处理后24小时，制备溶胞产物，并对其进行双重萤光素酶测定。
图4-7.通过化合物对干细胞的骨生成进行调节。
图4.化合物B抑制由人骨髓衍生的间充质干细胞(hBMMSC)分化成骨细胞谱系。将化合物B添加到hBMMSC细胞培养物中，并测量细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。20μM的化合物B强效地抑制了细胞的碱性磷酸酶活性。当以20μM处理hBMMSC时，化合物C(表2中的序号82)和D(表2中的序号66)显著地提高了ALP的水平(分别为200％和202％)。
图5.当与骨生成诱导混合物(osteogenic induction cocktail，OIC)联合处理时，化合物C和D也强效地诱导了hBMMSC的矿化。
图6.当用各种浓度的化合物C和D处理时，甚至是在0.5μM时，两种化合物都显示出诱导骨生成的活性(刺激矿化)。
图7.通过用化合物C和D处理，增加了hBMMSC中ALP mRNA的表达。
图8-14.通过化合物对干细胞的心肌生成进行调节。
图8.含有处于pEGFP-1的EcoRI位点和SalI位点之间的小鼠α-MHC基因的1.8kb启动子序列的载体构建体。
图9.处理后当在荧光显微镜下观察时，发现用化合物E(表2中的序号71)进行的处理(10μM)提高了荧光的表现，并且与DMSO对照相比，其水平在第5天得到了显著的提高。
图10.对用DMSO处理的胚状体(embryoid body，EB)进行FACS分析。表现荧光(α-MHC阳性)的细胞群体为0.54％。
图11.对用化合物E(10μM)处理的胚状体(EB)进行FACS分析。表现荧光(α-MHC阳性)的细胞群体为2.50％，其量与用DMSO处理的EB相比增加到4.6倍。
图12.与用DMSO处理的对照组相比，EGFP(增强的绿色荧光蛋白)(Enhanced Green Fluorescence Protein)的表达水平在用化合物E处理的组中增加的倍数。化合物E对心肌生成分化的促进活性是浓度依赖性的，并且它的效果即使是在0.3μM时也是显著的。
图13.与DMSO对照相比，当ES细胞被处理7和10天时，化合物E强效地增加了ANP和Nkx2.5mRNA在ES细胞中的表达水平。
图14.当小鼠胚胎干细胞暴露于10μM的化合物B历经5天时，用化合物B进行的处理降低了荧光的表现(0.26∶1＝化合物B∶DMSO对照)。
图15.通过化合物F(表2中的序号112)对肌生成进行调节。
A.当C2C12成肌细胞在含有2％马血清的分化培养基(DM)中孵育3天时，这些细胞分化形成大批肌管。
B.在用化合物F处理的生长培养基(GM)中生长的C2C12细胞显示有大批肌管形成。
C.在没有化合物F的生长培养基(GM)中生长的C2C12细胞没有显示出肌管形成。
D.用化合物F进行的处理也显著增加了MyoD和Myf5蛋白的表达。
图16.通过化合物与Wnt或CBP或p300一起或不与Wnt或CBP或p300一起对肌生成进行调节。
A.用或不用试验化合物B和F处理Wnt1条件培养基。通过在C2C12细胞中用Wnt1处理而增加了Myf-5的表达，并且其表达水平通过用化合物F联合处理而得到了进一步的提高。用化合物B进行的处理减少了C2C12细胞中Myf-5的表达，并且当用Wnt1联合处理时，化合物B也废止了Wnt1提高Myf-5的活性。
B.使CBP或p300连同或不连同试验化合物暴露于C2C12细胞，并且确定Myf5蛋白的细胞表达水平。与DMSO对照相比，5μM和10μM的化合物F剂量依赖性地增加了Myf5的表达。与DMSO对照相比，5μM和10μM的化合物B剂量依赖性地减少了Myf5的表达。用p300与化合物B进行的联合处理恢复了化合物B所导致的Myf5表达减少，但是这种减少没有通过用CBP进行的联合处理得到恢复。
具体实施方式
本发明提供诱导或抑制干细胞分化的物质及与其相关的方法。
下文提供了这些方法和物质的更具体细节。但是，在提供这些细节前，先提供以下定义来帮助读者理解本公开内容。
定义
本申请所用的“干细胞”是指任何能自我更新的多能细胞或多能细胞或祖细胞或前体细胞，其能够分化成多种细胞类型。适合用于本发明方法的干细胞包括能够分化成以下细胞的干细胞：生骨谱系细胞例如成骨细胞和骨细胞、心肌谱系细胞例如心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、血细胞或神经元等。
本申请所用的术语“分化”是指细胞针对特定功能发生特化的发展过程，例如在所述过程中，细胞得到不同于初始细胞类型的一种或多种形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定型和最终分化过程。分化可例如通过以下方法来评价：使用FACS分析、免疫组织化学或本领域技术人员已知的其它方法来监测谱系标记物的存在或消失。源自祖细胞的经分化的后代细胞可以但是不必须相关于与干细胞源组织相同的组织胚层。例如，神经祖细胞和肌肉祖细胞能够分化成造血细胞谱系(homatopoietic cell lineage)。
本申请所用的“骨生成”是指骨细胞的增殖和骨组织的生长(即新骨基质的合成和沉积)。骨生成也指祖细胞或前体细胞分化或转分化成骨细胞(即骨细胞(osteoblast))。祖细胞或前体细胞可以是多能干细胞例如间充质干细胞。祖细胞或前体细胞可以是预定型为骨细胞谱系的细胞(例如前骨细胞)或没有预定型为骨细胞谱系的细胞(例如前脂肪细胞或前成肌细胞)。
本申请所用的术语“心肌生成”是指祖细胞或前体细胞向心肌细胞(即心肌细胞(cardiomyocyte))的分化和心肌组织的生长。祖细胞或前体细胞可以是多能干细胞例如胚胎干细胞。祖细胞或前体细胞可以是预定型为心肌谱系的细胞(例如前心肌细胞)或没有预定型的细胞(例如多能成体干细胞)。
术语“癌干细胞”表示肿瘤中的细胞亚群，其能够引发新的肿瘤，然后出现长时间的缓和。这种情况的发生大概是因为癌干细胞具有独特的性质，例如具有独特的寿命、静止期(quiescence)和自我更新，其类似于正常的组织干细胞。自我更新是干细胞通过对称分裂(symmetric division)产生类似子细胞的过程。
β-连环蛋白是指本领域已知的一种蛋白质，参见例如Morin，P.J.，Bioessays 21：1021-30(1999)、Gottardi et al.，Curr.Biol.11：R792-4(2001)和Huber et al.，Cell 105：391-402(2001)。β-连环蛋白已经确认为在质膜上发生细胞粘着的介质和转录的激活剂。
术语“CBP蛋白”是指也称之为CREB结合蛋白的蛋白质，其中CREB是“cAMP应答元件结合(cAMP-response element binding)”的缩写。这种蛋白质是本领域已知的，参见例如Takemaru et al.，J.Cell Biol.149：249-54(2000)和美国专利6,063,583。
术语“p300蛋白”是指本领域已知的一种蛋白质。参见例如Gusterson，R.J.et al.，J Biol Chem.2003 Feb 28；278(9)：6838-47、An and Roeder，J BiolChem.2003 Jan 17；278(3)：1504-10、Rebel，V.I.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Nov 12；99(23)：14789-94和美国专利5,658,784以及其中引用的参考文献。
术语“细胞进行分化而不是进行增殖的可能性”是指细胞进行分化而不是进行增殖的概率。这种概率可以通过以下比值来表达和/或测量：在给定的条件下进行分化的细胞数目与进行增殖的细胞数目的比值。“增加细胞进行分化而不是进行增殖的可能性”的物质是指这样的化合物，与在没有所述化合物的情况下进行分化的细胞数目与进行增殖的细胞数目的比值相比，当所述化合物存在时，所述化合物使进行分化的细胞数目与进行增殖的细胞数目的比值增加。类似地，“增加细胞进行增殖而不是进行分化的可能性”的物质是指这样的化合物，与在没有所述化合物的情况下进行增殖的细胞数目与进行分化的细胞数目的比值相比，当所述化合物存在时，所述化合物使进行增殖的细胞数目与进行分化的细胞数目的比值增加。
术语“Wnt途径”是指可通过Wnt蛋白(分泌的糖蛋白)结合到卷曲的(frizzled)七跨膜区受体而引发的信号级联放大。这种途径是本领域已知的并且得以表征，是多篇文章和综述的主题(参见例如Huelsken and Behrens，J.Cell Sci.115：3977-8，2002、Wodarz et al.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14：59-88(1998)、Morin，P.J.，Bioessays 21：1021-30(1999)、Moon et al.，Science296：1644-46(2002)、Oving et al.，Eur.J.Clin.Invest.32：448-57(2002)和Sakanaka et al.，Recent Prog.Horm.Res.55：225-36，2000)。
物质
一方面，本发明提供可用于上述方法的物质。可用于本发明方法的物质可通过对式(I)的化合物进行筛选来确定：
Figure A20078002800400221
其中
E为-(ZR4)-或-(C＝O)-；
G不存在，或为-(XR5)-或-(C＝O)-；
W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-或-(SO2)-，或不存在；
Y为氧或硫；
X或Z独立地为氮或CH；
R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，并独立地选自：
氨基酸侧链部分；
C1-12烷基或具有一个或多个取代基的取代的C1-12烷基，所述取代基独立地选自氨基、胍基、C1-4烷基胍基、二C1-4烷基胍基、脒基、C1-4烷基脒基、二C1-4烷基脒基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、硫化物基团、羧基和羟基；
C1-6烷氧基；
C6-12芳基或具有一个或多个取代基的取代的C6-12芳基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
具有5-7个环成员的单环芳基-烷基，其可具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的单环芳基-烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
具有8-10个环成员的二环芳基-烷基，其可具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的二环芳基-烷基，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基和羟基；
具有5-14个环成员的三环芳基-烷基，其可具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的三环芳基-烷基，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基和羟基；
芳基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的芳基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、C3-6环烷基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基、羟基、酰胺基团、C1-6烷氧基C1-6酰基和吗啉基C1-6烷基；
环烷基烷基或具有一个或多个取代基的取代的环烷基烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；和
环烷基或具有一个或多个取代基的取代的环烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基。
在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，并独立地选自：
C1-12烷基或具有一个或多个取代基的取代的C1-12烷基，所述取代基独立地选自氨基、胍基、C1-4烷基胍基、二C1-4烷基胍基、脒基、C1-4烷基脒基、二C1-4烷基脒基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、硫化物基团、羧基和羟基；
C1-6烷氧基；
环烷基C1-3烷基；
环烷基；
苯基或具有一个或多个取代基的取代的苯基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苯基C2-4烷基或具有一个或多个取代基的苯基C2-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基、硫化物基团和羟基；
萘基或具有一个或多个取代基的取代的萘基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
萘基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的萘基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苄基或具有一个或多个取代基的取代的苄基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、三氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
二苯基甲基或具有一个或多个取代基的取代的二苯基甲基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苄基苯基酰胺基团或具有一个或多个取代基的取代的苄基苯基酰胺基团，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吡啶基或具有一个或多个取代基的取代的吡啶基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吡啶基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的吡啶基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
嘧啶基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的嘧啶基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
三嗪-2-基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的三嗪-2-基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
咪唑基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的咪唑基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苯并噻唑啉基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的苯并噻唑啉基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吩噁嗪基C1-4烷基；
苄基对甲苯基醚基团；
苯氧基苄基；
N-脒基哌嗪基-N-C1-4烷基；
喹啉基C1-4烷基；
N-脒基哌嗪基；
N-脒基哌啶基C1-4烷基；
4-氨基环己基C1-2烷基；和
4-氨基环己基。
本申请所用的术语“氨基酸侧链部分”表示存在于天然蛋白质中的任何氨基酸侧链部分，其包括(但不限于)表1中所确定的天然氨基酸侧链部分。本发明的其它天然氨基酸侧链部分包括(但不限于)以下氨基酸的侧链部分：3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羟基赖氨酸、γ-羧基谷氨酸、磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸。此外，也可将糖基化的氨基酸侧链用于本发明的实践，所述糖基化的氨基酸包括(但不限于)糖基化的苏氨酸、糖基化的丝氨酸和糖基化的天冬酰胺。
表1
氨基酸侧链部分         氨基酸
-H                     甘氨酸
-CH3                   丙氨酸
-CH(CH3)2              缬氨酸
-CH2CH(CH3)2           亮氨酸
-CH(CH3)CH2CH3         异亮氨酸
-(CH2)4NH3 +            赖氨酸
-(CH2)3NHC(NH2)NH2 +    精氨酸
Figure A20078002800400261
                                       组氨酸
-CH2COO-               天冬氨酸
-CH2CH2COO-                   谷氨酸
-CH2CONH2          天冬酰胺
-CH2CH2CONH2       谷氨酰胺
Figure A20078002800400271
                           苯丙氨酸
Figure A20078002800400272
                          酪氨酸
Figure A20078002800400273
                 色氨酸
-CH2SH             半胱氨酸
-CH2CH2SCH3        蛋氨酸
-CH2OH             丝氨酸
-CH(OH)CH3         苏氨酸
Figure A20078002800400274
                     脯氨酸
Figure A20078002800400275
             羟脯氨酸
在某些实施方案中，E为-(ZR4)-且G为-(XR5)-，其中Z为CH且X为氮，并且所述化合物具有以下通式(II)：
其中R2、R3和R5如式(I)中所定义。
在某些实施方案中，所述化合物具有以下通式(III)：
Figure A20078002800400281
在某些实施方案中，E为-(ZR4)-且G不存在，其中Z为氮，并且所述化合物具有以下通式(IV)：
Figure A20078002800400282
其中R1、R2、R3、R4和W如式(I)中所定义。
在某些实施方案中，E为-(ZR4)-且G为-(XR5)-，其中Z和X独立地为CH，并且所述化合物具有式(V)的结构：
其中R1、R2、R3、R4、R5和W如式(I)中所定义。
在某些实施方案中，所述化合物具有以下通式(VI)：
Figure A20078002800400291
这些化合物可通过合适的初始组件分子(下文中称为“组件片段”)来制备。简而言之，在合成具有式(I)的回折拟态结构中，偶联第一和第二组件片段，形成结合的第一-第二中间体，如果需要的话，偶联第三和/或第四组件片段，形成结合的第三-第四中间体(或者如果可商购，则可使用单一的第三中间体)，然后将结合的第一-第二中间体和第三-第四中间体(或者第三中间体)偶联，得到第一-第二-第三-第四中间体(或者第一-第二-第三中间体)，将其环化，得到本发明的回折拟态结构。或者，式(I)的回折拟态结构可通过连续偶联单个的组件片段来制备，所述制备或者在溶液中逐步进行，或者根据固相肽合成中的一般实践通过固相合成来进行。
在图1中说明了制备本发明化合物的具体组件片段及其组装。例如，“第一组件片段”可具有以下式S1：
Figure A20078002800400292
其中R2如上所定义，并且R是适合用于肽合成的保护基团，其中可将此保护基团结合到聚合物载体上，使固相合成能够进行。合适的R基团包括烷基，并且在优选的实施方案中，R是甲基。在图1中，R基团之一为聚合物载体(固体)，在所述图中用“Pol”表示。上述第一组件片段可容易地通过以下方法来合成：用CH(OR)2-CHO对H2N-R2进行还原胺化(reductiveamination)，或在H2N-R2和CH(OR)2-CH2-LG(其中LG是指离去基团例如卤素(Hal)基团)之间进行置换反应。
“第二组件片段”可具有以下式S2：
Figure A20078002800400293
其中P是适合用于肽合成的氨基保护基团，L1是羟基或羧基活化基团，并且R3如上所定义。优选的保护基团包括叔丁基二甲基硅基(TBDMS)、叔丁氧羰基(BOC)、甲氧羰基(MOC)、9H-芴基甲氧羰基(FMOC)和烯丙氧羰基(Alloc)。N受保护的氨基酸是商购的，例如FMOC氨基酸可得自各种来源。为了使第二组件片段可与第一组件片段反应，L1是羧基活化基团，并且羧基向活化羧基的转化可通过本领域已知的羧基活化方法来容易地实现。合适的活化羧酸基团包括酰卤(其中L1是卤素例如氯或溴)、酸酐(其中L1是酰基例如乙酰基)、具有反应性的酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和五氟苯酯)以及其它活化的中间体(例如在使用碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺(DCC)的偶联反应中形成的活性中间体)。因此，可通过本领域技术人员已知的方法，将商购的N受保护的氨基酸转化成羧基经活化的形式。
在氨基酸的叠氮衍生物作为第二组件片段的情况下，上述化合物可通过Zaloom等人(J.Org.Chem.46：5173-76，1981)所披露的反应由相应的氨基酸制备。
或者，本发明的第一组件片段可具有以下式S1’：
Figure A20078002800400301
其中R如上所定义，并且L2是离去基团例如卤素原子或甲苯磺酰基，并且本发明的第二组件片段可具有以下式S2’：
Figure A20078002800400302
其中R2、R3和P如上所定义。
本发明的“第三组件片段”可具有以下式S3：
Figure A20078002800400303
其中G、E、L1和L2如上所定义。合适的第三组件片段是可从各种来源商购的，或者可通过有机化学领域已知的方法来制备。
因此，如上所述，式(I)的回折拟态化合物可通过以下方法来合成：使第一组件片段与第二组件片段反应，得到结合的第一-第二中间体，接着使所述结合的第一-第二中间体与第三-第四中间体(或第三组件片段)反应，得到结合的第一-第二-第三-第四中间体(或结合的第一-第二-第三中间体)，然后使此中间体环化，得到回折拟态结构。
使用方法
本发明提供抑制β-连环蛋白/TCF亚群诱导的转录的式(I)化合物。
另一方面，本发明提供用于选择性地抑制WNT/β-连环蛋白途径所靶向的基因的表达的方法，所述方法包括将化合物投予组合物中，所述组合物包含WNT/β-连环蛋白途径所靶向的基因，并且所述化合物导致WNT/β-连环蛋白途径所靶向的基因的表达发生变化。
另一方面，本发明提供用于诱导干细胞分化的方法，所述方法包括使所述干细胞与诱导细胞分化成具体谱系的物质接触，所述具体谱系例如为成骨细胞、骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、血细胞、神经元和胰β细胞。
可以用本领域已知的任何合适方法来表征细胞增殖和细胞分化。上述方法包括如实施例中所述的流式细胞计量分析(flow cytometric analysis)、实时RT-PCR和细胞增殖测定。
另一方面，本发明提供保持干细胞处于未分化状态的方法，其包括使所述干细胞与抑制细胞分化或促进细胞增殖的物质接触，所述物质的量可有效地保持所述干细胞处于未分化的状态。
干细胞疗法为治疗多种变性疾病(degenerative disease)提供了机会，所述变性疾病是由于功能失常的特定细胞类型过早地死亡和身体不能更换或恢复它们而导致的。干细胞的可能治疗用途包括对器官移植的患者进行免疫调节，治疗自身免疫性疾病例如肌肉营养不良、多发性硬化和类风湿性关节炎，修复损伤的组织例如中风(stroke)、脊髓损伤和烧伤，治疗神经变性疾病如Lou Gehrig病(Lou Gehrig’s disease)和神经病症(neurologicalcondition)例如帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，以及治疗白血病、镰状细胞贫血(sickle cell anaemia)、心脏病和糖尿病。对于大部分干细胞疗法，可在体外培养胚胎干细胞或成体干细胞，诱导其分化成期望的细胞类型，并将其移植给患者。为了成功地培养干细胞，需要将干细胞保持在未分化的状态。
为了使干细胞保持在未分化的状态，可在干细胞培养的各个阶段使用本发明的化合物，例如促进细胞增殖或抑制细胞分化的本发明化合物。例如，可在将干细胞从其来源组织中分离出来时使用上述化合物。或者，可在某个培养阶段后将本发明的化合物添加到培养基中。本发明的化合物也可持续存在于培养基中，从而使干细胞保持在未分化的状态。所述化合物的浓度可通过将所述化合物的量调整至以下水平来优化，在所述水平，干细胞保持在未分化的状态，或者与在没有所述化合物的情况下所培养的干细胞相比，干细胞的分化得以减少，并且细胞培养的其它方面(例如细胞成活率(cell viability rate)和细胞增殖速率)没有受到有害的影响。
本发明的这些和其它方法可用化学物质例如在本申请中确定为化合物A-F的化学物质及其类似物来实施。
药物组合物和给药方法
可将本发明的化合物添加到适合于给药的药物组合物中。上述组合物通常包含所述化合物和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指与给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张物质和吸收延迟剂(absorption delaying agent)等。用于药物活性物质的上述介质和物质的使用是本领域已知的。也可将增补的活性化合物添加到所述组合物中。
可通过肠胃外、局部、口服或局部方式来给药本发明的药物组合物，用于治疗性处置。可使用各种水性载体，例如水、缓冲水(buffered water)、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并且可包括用于提高稳定性的其它蛋白质，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。可通过常规的已知灭菌技术对得到的组合物进行灭菌。可将溶液包装备用或在无菌条件下对其进行过滤并冻干，将冻干的制品与无菌的溶液合并，然后给药。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们封装在胶囊中或压缩成片剂。为了进行口服治疗性给药，可向活性化合物中添加赋形剂，并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。可将药物相容的粘合剂和/或辅助物质作为组合物的部分而包含在所述组合物中。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或性质类似的化合物：粘合剂(例如微晶纤维、黄蓍树胶或明胶)；赋形剂(例如淀粉或乳糖)，崩解剂(例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉)；润滑剂(例如硬脂酸镁或Sterotes)；助流剂(例如胶体二氧化硅)；甜味剂(例如蔗糖或糖精)；调味剂(例如薄荷、水杨酸甲酯或橘子香精)。
对于吸入给药，所述化合物从含有合适推进剂(例如气体如二氧化碳)的加压容器、分配器或喷雾器以气雾喷雾的形式递送。
全身给药也可通过经粘膜或经皮的方式来进行。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适合于待穿过屏障的渗透剂。上述渗透剂通常是本领域已知的，并且对于经粘膜给药包括例如去污剂、胆汁盐(bile salt)和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾(nasal spray)或栓剂来进行。对于经皮给药，将活性化合物配制成本领域通常已知的软膏剂(ointment)、油膏剂(salve)、凝胶剂或乳膏剂(cream)。
在一个实施方案中，制备活性化合物，使所述化合物带有可保护其不被快速从身体消除的载体，例如控制释放制剂(controlled releaseformulation)，包括植入物(implant)和微胶囊化的递送系统。可使用生物可降解或生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。这些物质也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.购买得到。
尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，从而易于给药和使剂量一致。本申请所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为单位剂量用于待治疗的受试对象；每个单位含有估计会产生期望治疗效果的预定量活性化合物以及所需的药物载体。用于本发明剂量单位形式的规格由以下因素决定并直接取决于这些因素：活性化合物的独特性质、希望取得的特定治疗效果以及本领域中混配上述活性化合物用于个体治疗的固有限制。
这些化合物的毒性和治疗效果可通过标准的药学方法在细胞培养或实验动物中确定，所述细胞培养或实验动物例如用于确定LD50(使群体中的50％致死的剂量)和ED50(对群体中的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比值是治疗指数(therapeutic index)，并且它可表示为LD50/ED50的比值。显示出大治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用显示出毒副作用的化合物，但是需要仔细地设计给药系统，使这些化合物靶向于受疾病影响的组织位点，从而使对未感染细胞的潜在伤害最小化，由此减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究中得到的数据可用于配制一系列用于人的剂量。上述化合物的剂量优选取决于毒性很小或没有毒性的包括ED50在内的一系列循环浓度(circulating concentration)。剂量可根据所使用的剂型和所使用的给药途径而在上述范围内变化。对于在本发明的方法中所使用的任何化合物，治疗有效的剂量最初可通过细胞培养物定来估计。可以通过动物模型来配制剂量，从而得到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中确定的IC50(即实现对症状最大抑制作用的一半时试验化合物的浓度)。可将上述信息用于更精确地确定人体内的有用剂量。例如可通过高效液相色谱来测量血浆中的水平。
表2.对选自本发明化合物的化合物进行的生物活性试验及其变化百分比(其通过实施例2和3中所述的骨生成测定和心肌生成测定来测量)
Figure A20078002800400351
Figure A20078002800400361
Figure A20078002800400371
Figure A20078002800400381
Figure A20078002800400391
Figure A20078002800400401
Figure A20078002800400411
Figure A20078002800400441
Figure A20078002800400451
Figure A20078002800400461
Figure A20078002800400471
Figure A20078002800400481
Figure A20078002800400491
提供以下实施例来说明本发明，但这些实施例不应该被理解为是对本发明的限制。
制备实施例
制备实施例1
制备N-苄基氨甲酰基-N’-甲基-肼基乙酸
(1)制备N-Boc-N-甲基肼
向处于外部冰水浴中的搅拌的甲基肼硫酸盐(100g，0.693mol)在水(2.0L)中的悬浮液中小心地加入NaHCO3至pH 11-12。将反应混合物剧烈搅拌，并向溶液中加入DiBoc(1.1当量)在THF(2.0L)中的溶液。在室温搅拌过夜后，除去有机层，并用乙酸乙酯(1.0L×3)萃取。合并的溶液经硫酸钠干燥，并真空蒸发，得到标题化合物(80g，79％，为浅黄色油状化合物)，其不经过进一步纯化而直接用于下一步。
(2)制备N-Boc-N-甲基-N’-苄基氨甲酰基-肼
5.0L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和氯化钙管。通过滴液漏斗向在外部冰水浴中的在烧瓶中的搅拌的N’-Boc-N’-甲基肼(80g，0.547mol)在THF(500ml)中的溶液中小心地加入异氰酸苄酯(39mL，300mmol)在THF(30ml)中的溶液。2小时后，将溶液蒸发。用己烷(使用少量的乙酸乙酯)将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤并用最少量的己烷洗涤，并将其真空干燥过夜，得到标题化合物(124g，81％，为白色固体)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ1.41(9H，s)，δ3.10(3H，s)，δ4.45(2H，d，J＝6Hz)，δ5.71(1H，t，J＝6Hz)，δ7.04(1H，br)，δ7.28(5H，m)。
(3)制备N-甲基-N’-苄基氨甲酰基-肼
Figure A20078002800400504
5L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和连接至氯化钙管的回流冷凝器。向烧瓶中添加N-苄基氨甲酰基-N’-Boc-N’-甲基肼(124g，0.443mol)在4M HCl(在二噁烷中，500ml)中的溶液，然后一边搅拌一边添加1，4-二噁烷(3L)。将反应混合物在室温搅拌过夜，并真空蒸发，然后在外部冰水浴中缓慢添加NaHCO3水溶液(pH 11-12)。将水层用乙酸乙酯萃取(3次)，并经Na2SO4干燥。将残余物真空蒸发，并用己烷和EtOAc将其浆化，得到白色固体。将固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并将其真空干燥过夜，得到标题化合物(72g，91％，为白色固体)。
(4)制备N-苄基氨甲酰基-N’-甲基-肼基乙酸叔丁酯
3L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和连接至氯化钙管的回流冷凝器。N-苄基氨甲酰基-N’-甲基肼(72g，0.402mol)在900mL甲苯∶DMF(800mL∶100mL＝v/v∶8/1)共溶剂中的悬浮液添加到烧瓶中，然后添加K2CO3(281g)。在70-80℃加热1hr后，缓慢添加溴乙酸叔丁酯(1.1当量)在甲苯(100ml)中的溶液，并在70-80℃搅拌5hr。将混合物过滤并用EtOAc(1.0L×3)萃取。用盐水(1.0L×3)洗涤有机溶液，对其进行蒸发，残余物用己烷和EtOAc进行浆化，得到白色固体。将固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(105g，90％，为白色固体)。1HNMR(CDCl3，300MHz)：δ1.46(9H，s)，δ2.70(3H，s)，δ3.42(2H，br)，δ4.45(2H，d，J＝6Hz)，δ6.22(1H，br)δ6.41(1H，t，J＝6Hz)，δ7.31(5H，m)。
(5)制备N-苄基氨甲酰基-N’-甲基-肼基乙酸
Figure A20078002800400512
3L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和氯化钙管。添加N-苄基氨甲酰基-N’-甲基-肼基乙酸叔丁酯(105g，0.358mol)在HCl(200mL，4M在二噁烷中的溶液)中的溶液，并在外部冰水浴中剧烈搅拌，然后温热至室温。向反应溶液中添加1，4-二噁烷(2.0L)。在室温搅拌过夜后，通过在40℃和抽真空下进行旋转蒸发来将溶液完全浓缩。添加饱和的NaHCO3水溶液，并用EtOAc(1.0L×2)洗涤水层。在0℃缓慢逐滴添加浓HCl(pH 2-3)。用EtOAc(1.0L×2)萃取混合物，有机层经硫酸钠干燥，然后蒸发。通过将残余物在正己烷和EtOAc中结晶而将其纯化，并真空蒸发，得到标题化合物(75g，89％，为白色固体)。1H NMR(CDCl3)：δ2.79(3H，s)δ3.46-3.58(2H，br)，δ4.43(2H，d，J＝6Hz)，δ6.53(1H，t，J＝6Hz)，δ7.29(5H，m)，δ7.80(1H，s)，δ12.38(1H，br)。
制备实施例2
制备N-苄基氨甲酰基-N’-4-氟苄基-肼基乙酸
(1)制备N-苄基氨甲酰基-N’-Boc-肼
Figure A20078002800400521
添加Boc-Carbazate(叔丁氧羰基肼基甲酸酯)(200g，1.51mol)在THF(2.0L)中的溶液，并添加异氰酸苄酯(1.1当量)在THF中的溶液。6小时后，对溶液进行真空蒸发。用己烷/EA(乙酸乙酯)将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(白色固体，380g，95％)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.89-3.08(2H，m)，4.19(4H，m)，7.27-7.40(8H，m)，7.64-7.73(2H，m)，7.87(2H，d，J＝6Hz)。
(2)制备N-苄基氨甲酰基-肼
Figure A20078002800400522
添加上述化合物(380g，1.43mol)。在冰水浴中一边剧烈搅拌一边缓慢添加HCl溶液(1L，4M在二噁烷中的溶液)和1，4-二噁烷(3L)。将反应混合物在室温搅拌6小时。通过在40℃和抽真空下的旋转蒸发来将溶液完全浓缩。用己烷/EA将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(白色固体，270g，94％)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.89-3.08(2H，m)，4.19(4H，m)，7.27-7.40(8H，m)，7.64-7.73(2H，m)，7.87(2H，d，J＝6Hz)。
(3)制备N-苄基氨甲酰基-肼基乙酸叔丁酯
Figure A20078002800400523
10L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和连接至氯化钙管的回流冷凝器。添加N-苄基氨甲酰基-肼(270g，1.34mol)在4L甲苯∶DMF(3L∶1L)共溶剂中的溶液。在0℃历时30分钟缓慢添加二异丙基乙胺(1.1当量)。将反应混合物温热至室温，并缓慢添加K2CO3(3.0当量)。通过滴液漏斗添加溴乙酸叔丁酯(1.1当量)在甲苯中的溶液。将反应混合物在70℃-80℃搅拌6小时。将混合物过滤并用EtOAc(4.0L)萃取。用盐水(2次)洗涤有机层，真空蒸发并用己烷和EtOAc将残余物浆化，得到白色固体。将固体过滤并用最小量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(260g，70％，为白色固体)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ1.47(9H，s)，3.41(2H，d)，4.13(1H，br，t)，4.41(2H，d)，6.31(1H，br)，6.39(1H，br)，7.31(5H，m)。
(4)制备N-苄基氨甲酰基-N’-4-氟苄基-肼基乙酸叔丁酯
Figure A20078002800400531
将Secondary Hydrazine(仲肼)(74g，265mmol)溶于2L DMF/甲苯(v/v＝1/3)中。5L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和连接至氯化钙管的回流冷凝器，然后向反应混合物中添加K2CO3(3.0当量)。将溶液加热至70℃-80℃并保持30min，并通过滴液漏斗添加4-氟苄基溴(1.1当量)在甲苯中的溶液。将反应混合物在70℃-80℃搅拌6小时。将混合物过滤并用EtOAc(2.0L)萃取。用盐水(2次)洗涤有机层，并真空蒸发，用己烷和EtOAc将残余物浆化，得到白色固体。将固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(白色固体，81g，79％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.47(9H，s)，3.44(2H，br)，3.97(2H，br)，4.30(2H，br)，6.16(1H，br)，6.32(1H，br)，6.96(2H，m)，7.11(2H，d)，7.27(5H，m)。
(5)制备N-苄基氨甲酰基-N’-4-氟苄基-肼基乙酸
Figure A20078002800400532
3L圆底烧瓶安装有玻璃塞和氯化钙管。添加N-苄基氨甲酰基-N’-4-氟苄基-肼基乙酸叔丁酯(81g，0.209mol)。在冰水浴中一边剧烈搅拌一边缓慢添加HCl溶液(500mL，4M在二噁烷中的溶液)和1，4-二噁烷(1L)。将反应混合物在室温搅拌6小时。通过在40℃和抽真空下的旋转蒸发来将溶液完全浓缩。用己烷/EA将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，真空干燥过夜，得到标题化合物(56g，81％，为白色固体)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ3.53(2H，s)，3.87(2H，s)，4.11(2H，d)，6.81(1H，t)，7.01(4H，m)，7.19(4H，m)，7.40(2H，m)。
制备实施例3
制备N-苄基氨甲酰基-N’-苄基-肼基乙酸
(1)制备N-苄基氨甲酰基-N’-Boc-肼
Figure A20078002800400541
添加叔丁氧羰基肼基甲酸酯(200g，1.51mol)在THF(2.0L)中的溶液，并添加异氰酸苄酯(1.1当量)在THF中的溶液。6小时后，对溶液进行真空蒸发。用己烷/EA将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(白色固体，380g，95％)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.89-3.08(2H，m)，4.19(4H，m)，7.27-7.40(8H，m)，7.64-7.73(2H，m)，7.87(2H，d，J＝6Hz)。
(2)制备N-苄基氨甲酰基-肼
Figure A20078002800400542
添加上述化合物(380g，1.43mol)。在冰水浴中一边剧烈搅拌一边缓慢添加HCl溶液(1L，4M在二噁烷中的溶液)和1，4-二噁烷(3L)。将反应混合物在室温搅拌6小时。通过在40℃和抽真空下的旋转蒸发来将溶液完全浓缩。用己烷/EA将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(白色固体，270g，94％)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.89-3.08(2H，m)，4.19(4H，m)，7.27-7.40(8H，m)，7.64-7.73(2H，m)，7.87(2H，d，J＝6Hz)。
(3)制备N-苄基氨甲酰基-肼基乙酸叔丁酯
10L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和连接至氯化钙管的回流冷凝器。添加N-苄基氨甲酰基-肼(270g，1.34mol)在4L甲苯∶DMF(3L∶1L)共溶剂中的溶液。在0℃历时30分钟缓慢添加二异丙基乙胺(1.1当量)。将反应混合物温热至室温，并缓慢添加K2CO3(3.0当量)。通过滴液漏斗添加溴乙酸叔丁酯(1.1当量)在甲苯中的溶液。将反应混合物在70℃-80℃搅拌6小时。将混合物过滤并用EtOAc(4.0L)萃取。用盐水(2次)洗涤有机层，真空蒸发并用己烷和EtOAc将残余物浆化，得到白色固体。将固体过滤并用最小量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(260g，70％，为白色固体)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ1.47(9H，s)，3.41(2H，d)，4.13(1H，br，t)，4.41(2H，d)，6.31(1H，br)，6.39(1H，br)，7.31(5H，m)。
(4)制备N-苄基氨甲酰基-N’-苄基-肼基乙酸叔丁酯
Figure A20078002800400551
将仲肼(74g，265mmol)溶于2L DMF∶甲苯(1.5L∶0.5L)中。5L双颈圆底烧瓶安装有玻璃塞和连接至氯化钙管的回流冷凝器，然后向反应混合物中添加K2CO3(3.0当量)。将溶液加热至70℃-80℃并保持30min，并通过滴液漏斗添加苄基溴(1.1当量)在甲苯中的溶液。将反应混合物在70℃-80℃搅拌6小时。将混合物过滤并用EtOAc(2.0L)萃取。用盐水(2次)洗涤有机层，并真空蒸发，用己烷和EtOAc将残余物浆化，得到白色固体。将固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(白色固体，81g，79％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.47(9H，s)，3.44(2H，br)，3.97(2H，br)，4.30(2H，br)，6.16(1H，br)，6.32(1H，br)，7.27(10H，m)。
(5)制备N-苄基氨甲酰基-N’-苄基-肼基乙酸
Figure A20078002800400552
3L圆底烧瓶安装有玻璃塞和氯化钙管。添加N-苄基氨甲酰基-N’-苄基-肼基乙酸叔丁酯(81g，0.209mol)。在冰水浴中一边剧烈搅拌一边缓慢添加HCl溶液(500mL，4M在二噁烷中的溶液)和1，4-二噁烷(1L)。将反应混合物在室温搅拌6小时。通过在40℃和抽真空下的旋转蒸发来将溶液完全浓缩。用己烷/EA将残余物浆化，得到白色固体。将分离的无色固体过滤，并用最少量的己烷洗涤，并真空干燥过夜，得到标题化合物(56g，81％，为白色固体)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ3.53(2H，s)，3.87(2H，s)，4.11(2H，d)，6.81(1H，t)，7.27(10H，m)。
制备实施例4
Figure A20078002800400561
(1)制备8-(3-氯-2-二甲氨基-苄基)-6-(4-羟基-苄基)-2-甲基-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
将(2-二甲氨基-3-氯-苯基)-甲胺在DMSO中的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(bromoacetal resin)(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，得到第一组件片段。
将Fmoc-酪氨酸(OtBu)-OH(4当量，可商购，第二组件片段)、HATU(PerSeptive Biosystems，4当量)和DIEA(4当量)在NMP(AdvancedChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将N-苄基氨甲酰基-N’-甲基-肼基乙酸(4当量，第三组件片段)、HOBT[Advanced ChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥。
将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δppm2.45(s，3H)，2.65(s，6H)，3.12(m，2H)，3.52(m，4H)，4.12(dd，1H)，4.24(dd，1H)，4.45(d，1H)，4.75(d，1H)，5.20(t，1H)，5.56(dd，1H)，6.40(m，3H)，6.66(d，2H)，7.11(d，2H)，7.39(m，5H)。
制备实施例5
(1)制备8-异丁基-2-甲基-4，7-二氧代-6-苄基-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
将异丁基胺在DMSO中的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，得到第一组件片段。
将Fmoc-苯丙氨酸(4当量，可商购，第二组件片段)、HATU(PerSeptiveBiosystems，4当量)和DIEA(4当量)在NMP(Advanced ChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将N-苄基氨甲酰基-N’-甲基-肼基乙酸(4当量，第三组件片段)、HOBT[Advanced ChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥。
将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δppm1.12(s，6H)，2.45(s，3H)，2.47(m，1H)，3.15(m，4H)，3.47(m，4H)，4.10(d，1H)，4.23(d，1H)，5.15(t，1H)，6.03(dd，1H)，7.15(m，5H)，7.23(m，5H)。
制备实施例6
(1)制备6-异丁基-8-(4-甲氧基-苄基)-2-甲基-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
进行与制备实施例5中所述相同的方法，所不同的是使用Fmoc-亮氨酸-OH代替Fmoc-苯丙氨酸-OH，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δppm 1.10(s，6H)，1.80(m，3H)，2.45(s，3H)，3.40(m，2H)，3.58(m，2H)，3.70(s，3H)，4.45(dd，1H)，4.48(dd，1H)，4.50(s，2H)，4.57(t，1H)，6.28(dd，1H)，6.70(d，2H)，6.98(d，2H)，7.18(m，5H)。
制备实施例7
Figure A20078002800400582
(1)制备(6S，9aS)-N-苄基-6-异丁基-8-(4-甲氧基苄基)-2-甲基-4，7-二氧代-六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-羧酰胺
将4-甲氧基-苄胺在DMSO中的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，得到第一组件片段。
将Fmoc-Val-OH(4当量)、HATU(PerSeptive Biosystems，4当量)和DIEA(4当量)在NMP(Advanced ChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将2-(2-(苄基氨甲酰基)-1-甲基肼基)乙酸(4当量)、HOBT[AdvancedChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥。
将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm1.51(d，6H)，1.91(m，1H)，2.49(s，3H)，3.45(d，2H)，3.69(m，2H)，3.72(s，3H)，3.82(m，2H)，4.40(s，2H)，4.48(s，2H)，4.53(t，1H)，5.55(t，1H)，6.61(d，2H)，6.95(d，2H)，7.24-7.38(m，5H)。
制备实施例8
(1)制备(6R，9aR)-N，6-二苄基-2-甲基-4，7-二氧代-8-苯乙基-六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-羧酰胺
将2-苯基乙胺在DMSO中的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，得到第一组件片段。
将Fmoc-D-Phe-OH(4当量，可商购，第二组件片段)、HATU(PerSeptiveBiosystems，4当量)和DIEA(4当量)在NMP(Advanced ChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将2-(2-(苄基氨甲酰基)-1-甲基肼基)乙酸(4当量)、HOBT[AdvancedChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥。
将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm2.47(s，3H)，2.81(t，2H)，2.90(dd，1H)，3.15(dd，1H)，3.47-3.58(m，5H)，3.81(m，1H)，4.47(s，2H)，4.97(t，1H)，5.80(t，1H)，7.15(m，2H)，7.21-7.38(m，13H)。
制备实施例9
(1)制备(6S，9aS)-N-苄基-2-甲基-6-(4-甲基苄基)-4，7-二氧代-8-苯乙基-六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-羧酰胺
进行与制备实施例7中所述相同的方法，所不同的是使用Fmoc-Phe(4-Me)-OH代替Fmoc-D-Phe-OH，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 2.19(s，3H)，2.51(s，3H)，2.92(t，2H)，2.93(dd，1H)，3.20(dd，1H)，3.42-3.60(m，5H)，3.85(m，1H)，4.45(s，2H)，4.92(t，1H)，5.80(t，1H)，7.00(d，4H)，7.25-7.35(m，10H)。
制备实施例10
制备2-(4-氟-苄基)-4，7-二氧代-6-苯乙基-8-(3-三氟甲基苄基)-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
将3-三氟甲基苄胺在DMSO中的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。
将Fmoc-高苯丙氨酸(Fmoc-homophenylalanine)(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)和DIEA(4当量)在NMP(AdvancedChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将Nβ-Fmoc-Nα-4-氟苄基-肼基甘氨酸(4当量)、HOBT[AdvancedChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液(对于1g树脂，添加10ml)。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
用异氰酸苄酯(4当量)和DIEA(4当量)在DCM中的混合物在室温处理树脂4小时。然后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥后，将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 3.15-3.53(m，6H)，4.31-4.42(m，4H)，4.47-4.85(m，2H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.81(d，2H)，6.85(d，2H)，6.91(m，4H)，7.15-8.24(m，14H)。
Figure A20078002800400621
制备实施例11
制备2-(4-氟-苄基)-6-(4-甲氧基-苄基)-4，7-二氧代-8-(3-三氟甲基-苄基)-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
将3-三氟甲基苄胺在DMSO中的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。
将Fmoc-Tyr(O-Me)(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)和DIEA(4当量)在NMP(Advanced ChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将Nβ-Fmoc-Nα-4-氟苄基-肼基甘氨酸(4当量)、HOBT[AdvancedChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液(对于1g树脂，添加10ml)。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
用异氰酸苄酯(4当量)和DIEA(4当量)在DCM中的混合物在室温处理树脂4小时。然后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥后，将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 3.24-3.52(m，4H)，3.98(s，3H)，4.19-4.25(m，4H)，4.47-4.85(m，2H)，5.33(t，1H)，5.35(m，2H)，6.78(d，2H)，6.88(d，2H)，6.91(m，4H)，7.05-8.11(m，9H)。
制备实施例12
制备6-(4-苄氧基-苄基)-2-(4-氟-苄基)-4，7-二氧代-8-(3-三氟甲基-苄基)-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
进行与制备实施例11中所述相同的方法，所不同的是使用Fmoc-Tyr(O-Bn)(Fmoc-Tyr(O-苄基))代替Fmoc-Tyr(O-Me)，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 3.10-3.55(m，4H)，4.31-4.45(m，6H)，4.47-4.85(m，2H)，5.20(t，1H)，5.44(m，2H)，6.66(d，2H)，6.67(d，2H)，7.25-8.03(m，18H)。
制备实施例13
制备6-(3，4-二氟-苄基)-2-(4-氟-苄基)-4，7-二氧代-8-(3-三氟甲基-苄基)-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
进行与制备实施例11中所述相同的方法，所不同的是使用Fmoc-3，4-二氟-Phe代替Fmoc-Tyr(O-Me)，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 3.15-3.53(m，4H)，4.31-4.42(m，6H)，4.47-4.85(m，2H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.68(d，2H)，6.99(d，2H)，7.21-8.21(m，12H)。
制备实施例14
Figure A20078002800400641
制备2-苄基-8-[2-(4-氯-苯基)-乙基]-6-(4-甲氧基-苄基)-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
将2-(4-氯-苯基)-乙胺的溶液(2.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，得到第一组件片段。
将2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酸(4当量，可商购，第二组件片段)、HATU(PerSeptive Biosystems，4当量)和DIEA(4当量)在NMP(Advanced ChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将(2-苄氨甲酰基-1-苄基肼基)乙酸(4当量)、HOBT[AdvancedChemTech](4当量)和DIC(4当量)在DMF中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇3小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥。
将树脂用甲酸(2.5ml)在室温处理18小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm3.22-3.57(m，10H)，3.82(s，3H)，4.36(d，2H)，4.50(d，1H)，4.90(d，1H)，5.36-5.45(m，2H)，6.62-6.73(m，4H)，6.98-7.05(m，4H)，7.10-7.48(m，10H)。
制备实施例15
制备2-苄基-8-[2-(4-氯-苯基)-乙基]-6-(3，4-二氟-苄基)-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
进行与制备实施例14中所述相同的方法，所不同的是使用3-(3，4-二氟-苯基)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-丙酸代替2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酸，得到标题化合物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 3.25-3.68(m，9H)，4.36(d，2H)，4.52(d，1H)，4.96(d，1H)，5.36-5.45(m，2H)，6.50-6.76(m，2H)，6.92-7.08(m，5H)，7.10-7.48(m，10H)。
制备实施例16
制备2-苄基-6-(4-氯-苄基)-8-[2-(4-氯-苯基)-乙基]-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄基酰胺
进行与制备实施例14中所述相同的方法，所不同的是使用3-(4-氯-苯基)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-丙酸代替2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酸，得到产物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 3.18-3.50(m，9H)，4.41(d，2H)，4.50(d，1H)，4.90(d，1H)，5.36-5.45(m，2H)，6.60-6.78(m，4H)，6.98-7.05(m，4H)，7.15-7.58(m，10H)。
制备实施例17
制备2-甲基-5-(对羟基苯基甲基)-7-萘基甲基-3，6-二氧代-六氢-[1，2，4]三唑并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸苄基酰胺
将萘基甲胺在DMSO中的溶液(1.5ml，2M)和溴乙缩醛树脂(30mg，0.98mmol/g)置于带有螺帽的小瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃振摇12小时。通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，得到第一组件片段。
将Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3当量)、HATU(PerSeptive Biosystems，3当量)和DIEA(3当量)在NMP(Advanced ChemTech)中的溶液添加到树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤，由此将第二组件片段添加到第一组件片段中。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯(5当量)和DIEA(5当量)在DCM中的溶液添加到以上制备的树脂中。将反应混合物在室温振摇4小时后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
向树脂中添加20％哌啶在DMF中的溶液(对于1g树脂，添加10ml)。将反应混合物在室温振摇8min后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将树脂用异氰酸苄酯(4当量)和DIEA(4当量)在DCM中的混合物在室温处理4小时。然后，通过过滤来收集树脂，并用DMF洗涤，用DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。将树脂在室温真空干燥。
将树脂用甲酸在室温处理14小时。通过过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，得到产物，为油状物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm 2.80-2.98(m，5H)，3.21-3.37(m，2H)，4.22-4.52(m，2H)，4.59(t，1H)，4.71(d，1H)，5.02(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.51(d，1H)，6.66(t，2H)，6.94(dd，2H)，7.21-8.21(m，12H)。
实施例
实施例1
在SW480细胞中进行的TopFlash报告基因测定
在此实施例中使用以下试验化合物(化合物A和B)：
Figure A20078002800400671
化合物A(表2中的序号111)
Figure A20078002800400672
化合物B(表2中的序号10)
a.报告基因测定
使用SuperfectTM转染试剂(Qiagen，301307)对SW480细胞进行转染。转染前，对细胞短暂地进行胰蛋白酶处理1天，然后铺于6孔板中(5×105个细胞/孔)，从而使它们在转染当天为50-80％融合。
将4微克(TOPFlash)DNA和1微克(pRL-null)DNA稀释在150ml不含血清的培养基中，并加入30μl SuperfectTM转染试剂。将DNA-Superfect混合物在室温孵育15min，然后将1ml 10％FBS DMEM添加至上述混合物中，又进行3小时孵育。当形成复合物时，用不含抗生素的PBS将细胞洗涤两次。
将DNA-SuperfectTM转染试剂复合物施用于细胞，然后在37℃和5％CO2下孵育3小时。孵育后，添加具有10％FBS的恢复培养基，从而使最终体积为1.18ml。孵育3小时后，收获细胞，并重新接种于96孔板(3×104个细胞/孔)。在37℃和5％CO2下孵育过夜后，将细胞用化合物A或化合物B处理24小时。最后，通过萤光素酶测定(Promega，E1960)来检查活性。
图2和3显示了化合物A(图2)和化合物B(图3)对SW480细胞的IC50的测量结果。
实施例2
在人间充质干细胞中调节骨生成的活性
在本实施例中使用以下化合物(化合物B、化合物C和化合物D)：
化合物B(表2中的序号10)
Figure A20078002800400682
化合物C(表2中的序号82)
化合物D(表2中的序号66)
方法
细胞培养：从正常受试者分离源自人骨髓的间充质干细胞(hBMMSC)。
通过单独的试验化合物进行骨生成调节活性测定：将hBMMSC培养在培养基中，并将细胞接种到96孔培养板中，将试验化合物溶于DMSO中并用培养基稀释(最终0.01％DMSO)，然后将其添加到所述培养基中(试验化合物的最终浓度为20μM)并在CO2培养箱中培养(37℃和5％CO2)。使用新鲜的培养基将培养基每2天更换一次，只要更换培养基就用化合物再次处理。孵育6至7天后，细胞溶胞产物的碱性磷酸酶活性通过比色法来测定。每种化合物与DMSO对照相比所致的ALP活性改变倍数总结于表2(骨生成)中。为了确定细胞内的矿化，孵育10-14天后进行Von Kossa染色或AlizarinRed S测定。
使用诱导培养基(induction media)时试验化合物的骨生成调节活性：将hBMMSC用含有骨生成诱导混合物(OIC)(0.1μM地塞米松、50μM抗坏血酸-2-磷酸(ascorbate-2-phosphate)和10mM β-磷酸甘油(β-glycerophosphate))的培养基培养。孵育4至5天后，通过比色法测量细胞溶胞产物的碱性磷酸酶(ALP)活性。为了确定细胞内的矿化，孵育10-14天后进行Von Kossa染色或Alizarin Red S测定。
细胞增殖测定：为了研究试验化合物对hBMMSC的细胞毒性，使hBMMSC在与以上(方法b和c)相同的条件下暴露于试验化合物6-7天。使用CellTiter 96 Aqueous One Solution(Promega，#G3581)来评价细胞增殖。使用读板器(microplate reader)(Molecular Device)来确定每个孔在490nm的吸光度，并与对照相比计算生长抑制百分比(％生长抑制)。
RT-PCR：为了分析碱性磷酸酶(ALP)的mRNA水平，使用Trizol(Invitrogen-GIBCO-BRL，Baltimore，MD)从使用化合物处理4天或没有使用化合物处理4天的hBMMSC中分离总的RNA。使用随机六聚体(50ng)，并根据制造商的指导使用Superscript II逆转录体系(Invitrogen-GIBCO-BRL)，在20μl的总体积中对2μg RNA进行逆转录。在含有5μl cDNA、100pmol引物、100μM dNTPs、1×Taq缓冲液和1.5mM MgCl2的50μl体积中进行PCR。将反应混合物加热至80℃并保持10min，然后加入Taq。将cDNA扩增25个循环(EphB2受体)或15个循环(GAPDH)。一轮扩增包括在94℃保持1min、在60℃保持2min和在72℃保持2min，并且最终延伸时间为10min(在72℃)。通过在2％凝胶中进行的电泳对PCR产物进行解析和显现，并用溴化乙锭对其染色。所用的ALP PCR引物是5’-ATCGGGACTGGTACTCGGATAA-3’和5’-ATCAGTTCTGTTCTTCGGGTAC-3’。用于GAPDH的引物对是5’-GGTGCTGAGTATGTCGTGGA-3’和5’-ACAGTGTTCTGGGTGGCAGT-3’。持家基因即GADPH用作对照。
结果
当用化合物B单独处理hBMMSC(图4)时，20μM的化合物B降低了ALP水平(77％)，并且细胞增殖也得到了抑制(51％)。与媒介对照(vehiclecontrol)组相比，当用骨生成诱导混合物联合处理时，20μM的化合物B降低了ALP水平(80％)。相反地，当单独处理时，20μM的化合物C或D显著地提高了ALP水平(分别为200％和202％)(图4)，并且不显著地影响细胞增殖(分别为127％和83％)。当用骨生成诱导混合物(OIC)联合处理时，化合物C和D强效地诱导了hBMMSC的矿化(图5)。当用各种浓度的化合物C和D进行处理时，两种化合物即使是在0.5μM时也显示出骨生成诱导活性(刺激矿化)(图6)。通过在hBMMSC中用化合物C和D处理，增加了ALP mRNA的表达(图7)。
实施例3
在小鼠胚胎干细胞中调节心肌生成的活性
在本实施例中使用以下化合物(化合物B和E)：
Figure A20078002800400701
化合物B
Figure A20078002800400702
化合物E(表2中的序号71)
方法
a.细胞培养：将小鼠胚胎干(ES)细胞即源自129/S6珠的TC1在培养基中在辐射饲养器层(irradiated feeder layer)上培养，所述培养基是补充有15％FBS(Hyclone)、0.1mM β-巯基乙醇、1M丙酮酸钠、1mM L-谷氨酰胺和1×非必需氨基酸的高葡萄糖DMEM(GibcoBRL，Germany)。
b.建立稳定转化有α-MHC的ES细胞系：将含有处于pEGFP-1(Clontech Laboratories，Inc.，CA，USA)的EcoRI位点和SalI位点之间的小鼠α-MHC基因的1.8kb启动子序列的构建体(图8)线性化于XhoI位点，并使用Gene Pulser II(BioRad，MA)将其引入到小鼠ES细胞即TC1中。电穿孔24小时后，将含有G418的选择培养基(selection medium)施用2周。收获所选择的ES细胞克隆(clone)，并将其扩增在饲养器细胞层上。本实验使用在分化成心肌细胞时表现绿色荧光的克隆。
c.心肌生成调节活性测定：通过悬滴培养(hanging drop culture)，使用数目为约600的ES细胞，历时2天形成胚状体(EB)，通过在培养皿上在悬浮条件下再培养2天而将其进一步扩增。然后，将每个EB铺于96孔培养板的孔中。将试验化合物溶于DMSO中，并将其用培养基稀释(最终0.05％DMSO)，并且EB用试验化合物处理5天。铺板后每三天更换一次培养基。使用FACS(Beckman)来测量EGFP的表达水平。每种化合物与DMSO对照相比所致的EGFP表达水平变化倍数总结于表2(心肌生成)中。对于FACS分析，用胰蛋白酶使正在分化的细胞解离(dissociated)。为了确定分化程度，使用倒置荧光显微镜(Zeiss，Germany)来观察EB并照像。出现搏动的EB(beating EB)的数目在显微镜下计数，并每天对其进行记录。
d.实时RT-PCR：为了分析心肌生成标记基因即心房钠尿肽(AtrialNatriuretic Peptide，ANP)和Nkx2.5的mRNA水平，使用Trizol(Invitrogen-GIBCO-BRL，Baltimore，MD，USA)从使用或没有使用化合物E处理7天和10天的干细胞分离总RNA。测量每种mRNA的相对表达水平。
结果
用DMSO处理的对照EB显示出随着时间推移荧光表达逐渐增强，但是它的表达水平即使在孵育5天后也是最小的。当在荧光显微镜下观察时，用化合物E(10μM)进行的处理提高了处理后的荧光表达。并且与DMSO对照相比，它的水平在第5天得到了显著的提高(图9)。对荧光表达细胞的细胞群体进行的FACS分析显示，与DMSO对照(图10)相比，用10μM化合物E进行的处理(图11)使荧光阳性(α-MHC阳性)细胞的百分比增加到4.6倍。并且其促进心肌生成分化的活性是剂量依赖性的(图12)。与DMSO对照相比，当处理7和10天时，化合物E强效地增加了ES细胞中ANP和Nkx2.5mRNA的表达水平(图13)。当以10μM的浓度暴露于小鼠胚胎干细胞5天时，用化合物B进行的处理减少了荧光的表达(0.26∶1＝化合物B∶DMSO对照)(图14)。
实施例4
在C2C12成肌细胞中调节肌生成
在本实施例中使用以下化合物(化合物B和F)：
Figure A20078002800400721
化合物B
Figure A20078002800400722
化合物F(表2中的序号112)
材料和方法
a.细胞培养：在37℃和补充有5％CO2的受控加湿的空气气氛中，在多孔或组织培养皿(Corning-Costar Inc.U.S.A.)中，使用补充有抗生素溶液(青霉素和链霉素)的具有Glutamax的10％FBS/DMEM(称为GM(生长培养基))，使购自American Tissue Type Collection(ATCC)的鼠科C2C 12成肌细胞系(来自股肌肉(thigh muscle)的卫星细胞)保持在指数生长期。
b.分化诱导和试验化合物处理：每隔一天，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤2次，并且直到它们达到100％融合才更换培养基。然后将融合的细胞(相同细胞密度的成肌细胞完全覆盖表面皿(surface dish))引导到有丝分裂后的状态，并且通过用2％(v/v)马血清HS/DMEM(称为DM(分化培养基(differentiating medium)))代替GM而启动分化和融合。在上述条件下，C2C12成肌细胞容易并且完全地分化成肌管，因此发明人能够监视接下来的5天中分化过程的变化。在研究过程中，不含有或含有所述实验因子的新制备的培养基每24小时更换一次。将试验化合物溶于DMSO中，并用培养基将其稀释。将试验化合物(如果没有特别指出，则使用的是10μM以及最终DMSO 0.1％v/v)或DMSO(0.1％v/v)添加到培养基中。
c.MyoD和Myf5的表达：如文献中所述(Verma et al.，British J Pharmacol，2004，143，106-13)，使细胞溶胞，并通过Western免疫印迹分析来分析蛋白质表达水平。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来解析等量的蛋白质样品，并将其转移到硝化纤维素膜上。将膜用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭，并与指明的主要抗体(primary antibody)一起孵育12-16h：稀释为1/400的多克隆C20抗MyoD(得自Santa-Cruz，Biotechnology，Santa Cruz，CA)和针对Myf-5的COOH末端部分的多克隆抗Myf-5。在PBS中洗涤几次后，将所述膜与化学荧光试剂一起孵育。
结果
C2C12是用于研究骨骼肌分化的良好表征的细胞培养模型。在容许分化的条件下，例如在低血清浓度的条件下，C2C12成肌细胞进行分化，形成肌管。当将这些细胞在含有2％马血清的分化培养基(DM)中孵育3天时，观察到在C2C12细胞中形成大量肌管。形成肌管的这些C2C12细胞显示出纺锤状形态和膜融合(membrane fusion)，从而形成多核肌管(multinucleatedmyotube)(图15A)，这与在生长培养基(GM)中生长的细胞(图15C)不同。当将化合物F添加到在GM中生长的细胞中时，它导致大量肌管的形成(图15B)。另外，通过用化合物F进行处理，MyoD和Myf5的蛋白质表达水平得到了显著的提高，如图15D中所示。
Wnt/β-连环蛋白信号传导在生肌命运确定(myogenic fate determination)和分化中起重要作用(Pan et al.，PNAS 2005，102，17378-83)。为了研究调节Wnt途径的化合物和Wnt配体在肌生成中的关系，Wnt1条件培养基用或不用试验化合物B和F进行处理。通过用Wnt1进行处理，增加了Myf-5的表达，并且其表达水平通过用化合物F联合处理而得到了进一步的提高。用化合物B进行的处理减少了Myf-5在C2C12细胞中的表达，并且当用Wnt1联合处理时，化合物B也废除了Wnt1提高Myf-5的活性(图16A)。
认为CREB结合蛋白(CBP)和/或与其密切相关的同系物即p300参与多种不同转录因子(包括TCF4/β-连环蛋白信号传导)的活性。为了评价CBP或p300与调节Wnt途径的试验化合物之间可能的相互作用，使CBP或p300连同或不连同试验化合物暴露于C2C12细胞，并确定Myf5蛋白的细胞表达水平。与DMSO对照相比，5μM和10μM的化合物F剂量依赖性地增加了Myf5的表达。与DMSO对照相比，5μM和10μM的化合物B剂量依赖性地降低了Myf5的表达。并且用p300与化合物B p300进行的联合处理解除了由化合物B引起的Myf5表达减少，但是用CBP进行的联合处理没有使其发生变化(图16B)。这表明化合物B在相同的信号传导途径中阻断p300或与p300竞争，但是不阻断密切相关的类似物即CBP，也不与CBP竞争。

Claims (16)

1.一种组合物，其包含具有以下通式(I)的化合物，用于诱导或抑制干细胞的分化：
Figure A2007800280040002C1
其中
E为-(ZR4)-或-(C＝O)-；
G不存在，或为-(XR5)-或-(C＝O)-；
W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-或-(SO2)-，或不存在；
Y为氧或硫；
X或Z独立地为氮或CH；和
R1、R2、R3、R4、R5相同或不同，并且独立地选自：
氨基酸侧链部分；
C1-12烷基或具有一个或多个取代基的取代的C1-12烷基，所述取代基独立地选自氨基、胍基、C1-4烷基胍基、二C1-4烷基胍基、脒基、C1-4烷基脒基、二C1-4烷基脒基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、硫化物基团、羧基和羟基；
C1-6烷氧基；
C6-12芳基或具有一个或多个取代基的取代的C6-12芳基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
具有5-7个环成员的单环芳基-烷基，其任选地具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的单环芳基-烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
具有8-10个环成员的二环芳基-烷基，其任选地具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的二环芳基-烷基，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基和羟基；
具有5-14个环成员的三环芳基-烷基，其任选地具有1-2个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫；或具有一个或多个取代基的取代的三环芳基-烷基，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基和羟基；
芳基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的芳基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、C3-6环烷基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基、羟基、酰胺基团、C1-6烷氧基C1-6酰基和吗啉基C1-6烷基；
环烷基烷基或具有一个或多个取代基的取代的环烷基烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；和
环烷基或具有一个或多个取代基的取代的环烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基。
2.权利要求1的包含所述化合物的组合物，其中R1、R2、R3、R4和R5相同或不同，并独立地选自：
C1-12烷基或具有一个或多个取代基的取代的C1-12烷基，所述取代基独立地选自氨基、胍基、C1-4烷基胍基、二C1-4烷基胍基、脒基、C1-4烷基脒基、二C1-4烷基脒基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、硫化物基团、羧基和羟基；
C1-6烷氧基；
环烷基C1-3烷基；
环烷基；
苯基或具有一个或多个取代基的取代的苯基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苯基C2-4烷基或具有一个或多个取代基的苯基C2-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基、硫化物基团和羟基；
萘基或具有一个或多个取代基的取代的萘基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
萘基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的萘基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苄基或具有一个或多个取代基的取代的苄基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、三氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
二苯基甲基或具有一个或多个取代基的取代的二苯基甲基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苄基苯基酰胺基团或具有一个或多个取代基的取代的苄基苯基酰胺基团，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吡啶基或具有一个或多个取代基的取代的吡啶基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吡啶基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的吡啶基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
嘧啶基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的嘧啶基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
三嗪-2-基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的三嗪-2-基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
咪唑基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的咪唑基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
苯并噻唑啉基C1-4烷基或具有一个或多个取代基的取代的苯并噻唑啉基C1-4烷基，所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-6烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羟基；
吩噁嗪基C1-4烷基；
苄基对甲苯基醚基团；
苯氧基苄基；
N-脒基哌嗪基-N-C1-4烷基；
喹啉基C1-4烷基；
N-脒基哌嗪基；
N-脒基哌啶基C1-4烷基；
4-氨基环己基C1-2烷基；和
4-氨基环己基。
3.权利要求1的包含所述化合物的组合物，其中E为-(ZR4)-且G为-(XR5)-，其中Z为CH且X为氮，并且所述化合物具有式(II)的结构：
4.权利要求3的包含所述化合物的组合物，其中所述化合物具有式(III)的结构：
Figure A2007800280040006C2
5.权利要求1的包含所述化合物的组合物，其中E为-(ZR4)-且G不存在，其中Z为氮，并且所述化合物具有式(IV)的结构：
Figure A2007800280040006C3
6.权利要求1的包含所述化合物的组合物，其中E为-(ZR4)-且G为-(XR5)-，其中Z和X独立地为CH，并且所述化合物具有式(V)的结构：
Figure A2007800280040007C1
7.权利要求6的包含所述化合物的组合物，其中所述化合物具有式(VI)的结构：
8.用于诱导或抑制干细胞分化的方法，其包括使所述干细胞与一定量的权利要求1-7中任一项的组合物接触，其中所述量是对调节所述干细胞的分化有效的。
9.权利要求8的方法，其用于诱导或抑制选自以下的一种情况：骨生成、心肌生成和肌生成。
10.权利要求8的方法，其用于诱导或抑制选自以下的一种情况：神经生成和血细胞生成。
11.用于抑制癌干细胞或癌引发细胞增殖或自我更新的方法，其包括使所述干细胞与一定量的权利要求1-7中任一项的化合物接触，其中所述量是对抑制癌干细胞或癌引发细胞的增殖或自我更新有效的。
12.权利要求8的方法，其中将所述干细胞在培养基中与1nM-50μM的所述化合物一起培养。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的化合物和药学上可接受的载体。
14.权利要求13的药物组合物，其用于治疗选自以下的医学疾病：骨质疏松、骨折、骨损伤、心肌梗塞、心肌病、肌肉变性疾病和尿失禁。
15.权利要求13的药物组合物，其用于通过对受试对象给予所述药物组合物来选择性地杀死、抑制或调节存在于癌性肿瘤中的癌干细胞的生长。
16.权利要求6的组合物，其用于诱导肌生成。
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