TW202043199A - 醯肼化合物及激酶抑制劑 - Google Patents

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西野泰斗
相原彩子
大敬一朗
岩脇卓巳
三島巧
竃浦政宏
深澤菜月
中嶋宏之
繁田幸宏
岩元寿公
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日商日產化學股份有限公司
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Abstract

本發明以提供於細胞培養(尤其是3次元細胞培養)時可促進細胞增殖之新穎化合物為目的。式(I)；
Figure 109102822-A0202-11-0001-48
[式中，各符號如說明書中之定義]表示之醯肼化合物或其鹽及含有其等之組成物可顯著的促進細胞增殖、球狀體形成、囊胞形成及/或類器官形成，除此之外，可顯著的抑制LATS1或LATS2等激酶之活性。

Description

醯肼化合物及激酶抑制劑
本發明係有關以新穎之醯肼化合物、含有該醯肼化合物之培養基添加用組成物、使用該培養基添加用組成物為特徵之細胞或組織之培養方法及含有該醯肼化合物之激酶抑制劑等。
近年來，使用細胞之實驗係以解釋清楚生命現象之作用機序或確立疾病之治療法等為目的，於以生命科學領域為代表之多數領域非常頻繁的進行。例如，就藥物研發領域中之一例而言，有一種方法，其係使候補化合物作用於成為治療標的之癌細胞，並篩選可阻礙癌細胞增殖之化合物。於相關之篩選中，有時要篩選數萬種候補化合物之情況，於該等態樣需準備大量的均質細胞。惟，人類等高等生物之細胞即使為比較上為快速分裂之細胞也需要約1日之時間，此外，於癌細胞或幹細胞亦存在1次細胞分裂所需的時間達數個月以上者，成為阻礙細胞快速供給之要因。吾人正從相關之背景試著構築出可促進分裂慢之細胞增殖之手段，例如，已有人報告具有特定構造之硫醇化合物可促進造血前驅細胞增殖，及聚異戊二烯系化合物可促進肝細胞增殖等(專利文獻1、2)。
另一方面，於藥物研發篩選領域，近年來細胞之3次元培養受到注目。3次元培養為擔任體內及體外之中間者之細胞培養技術。於3次元培養， 細胞可形成球狀體(亦稱為橢球體)等立體構造，因此，與一般之2次元培養比較，能夠進行更接近活體之分析。因此，3次元培養有著可具體辨識出於使用2次元培養之藥物研發篩選時不能具體辨識之疾病治療用化合物之可能性(非專利文獻1)。
激酶(蛋白質磷酸化酵素、蛋白質激酶)為將蛋白質之絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸之羥基磷酸化之酵素，為擔任細胞增殖或分化等信號傳達之酵素群。作為編碼激酶之基因至今己有500種以上被選殖。因此，蛋白質激酶到處存在於細胞內，深入參予細胞增殖或分化或機能表現等之調節或調控(非專利文獻2)。
大腫瘤抑制因子(Large tumor suppressor)(以下簡稱為LATS)1及LATS2為構成Hippo信號傳達路徑主要因子之蛋白質激酶(專利文獻3、非專利文獻3、4)。已知於細胞密度上昇而受到接觸抑制時、或因為活性氧、DNA損傷等使細胞受到傷害時，本傳達路徑會活化(非專利文獻5、6、7)。本傳達路徑被活化時，LATS會將屬於轉錄共軛因子之Yes-associated protein(以下簡稱為YAP)或transcriptional co-activator with PDZ-binding motif(以下簡稱為TAZ)磷酸化。經磷酸化之YAP或TAZ從細胞核向細胞質移行，而受到蛋白質分解，因此YAP或TAZ之標的基因之表現受到抑制。會受到由YAP所致之表現調節之基因之例已知有CCND1、CTGF、BIRC2、CYR61、AMOTL2、TGFB2等(非專利文獻8、9、10、11)。Hippo信號傳達路徑之活化與該等基因之表現阻礙有關，引起細胞增殖、細胞死亡誘導。近年來已有人報告藉由使LATS1及LATS2受到基因缺損，而於體外之3次元培養中促進細胞增殖(非專利文獻12)。
已知Hippo信號傳達路徑會調控幹細胞之自我複製/分化(非專利 文獻13)。又，Hippo信號傳達路徑於皮膚、腸管或神經的維持為必要者，YAP若不能正常作用，則組織損傷時之修復受到抑制(非專利文獻14)。再者，已有人報告Hippo信號傳達路徑的缺失會使心肌梗塞後之收縮期心衰竭回復(非專利文獻15)。因此，由於Hippo信號傳達路徑調控細胞、組織、臟器之增殖、維持或回復，Hippo信號傳達路徑之抑制劑或YAP及TAZ之活化劑可期待作為藉由細胞增殖不全引起之疾病之治療藥。該等疾病之例可列舉燙傷、外傷、肌肉萎縮、虛血性疾病、神經變性疾病(例如阿滋海默症、巴金森症或亨丁頓舞蹈症等。就Hippo信號傳達路徑之抑制劑之例而言，已有人報告將XMU-MP-1作為MST1之抑制劑(非專利文獻16)。XMU-MP-1顯示藉由抑制Hippo信號傳達路徑而促進從肝障礙之回復。又，已有人報告將IBS008738作為TAZ之活化劑，顯示藉由本活化劑所致之肌內損傷回復之促進效果(非專利文獻17)。再者，已有人報告由抑制LATS1及LATS2之化合物所致之眼球、皮膚或肝臟之修復促進效果(專利文獻4)。如上所述，Hippo信號傳達路徑之調控劑可期待作為各種疾病之治療藥。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特表平11-504000號公報
[專利文獻2]國際公開第2008/155920號
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[非專利文獻]
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[非專利文獻8]Imajo M et al., The EMBO Journal 2012, 31:1109-1122
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[非專利文獻16]Fan F et al., Science Translational Medicine 2016, 8(352): 352ra108
[非專利文獻17]Yang Z et al., Molecular and Cellular Biology 2014, 34(9):1607-1621
本發明以於細胞培養(尤其是3次元細胞培養)中，可促進細胞增殖之新穎化合物的提供為目的。
本發明人等對於上述課題進行深入研究之結果發現，此次新合成之醯肼化合物可非常良好地促進在培養(尤其是3次元培養)下之各種細胞之增殖。再者，本發明人等亦發現該化合物抑制LATS1及LATS2。以相關之見解為基礎進一步進行研究因而完成本發明。亦即，本發明為如下所述者。
[1]式(I)表示之醯肼化合物或其鹽；
Figure 109102822-A0202-12-0005-4
[式中，X為-N(R5)C(R2)(R3)-、-C(R2)(R3)N(R5)-或-C(R2)(R3)O-、
W表示下列D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11或D-12之任一者所示之環，
Figure 109102822-A0202-12-0006-56
Figure 109102822-A0202-12-0006-53
R1為C1至C6烷基或鹵(C1至C6)烷基，
R2及R3各自獨立地為氫原子或C1至C6烷基，
R4及R5各自獨立地為氫原子或C1至C6烷基，
Ra為羥基、硝基、鹵素原子、C1至C6烷基、鹵(C1至C6)烷基、C2至C6烯基、C2至C6炔基、C1至C6烷氧基、鹵(C1至C6)烷氧基、C1至C6烷硫基、鹵(C1至C6)烷硫基、C1至C6烷基亞磺醯基或C1至C6烷基磺醯基，
m為0、1、2、3或4，
p為0、1、2或3，
r為0或1]。
[2]如[1]所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
W為D-1、D-2或D-3之任一者所示之環，
R4及R5為氫原子，
Ra為C1至C6烷基或鹵素原子，
m為0或1，
r為0。
[3]如[1]所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
X為-N(R5)C(R2)(R3)-，
W為D-2、D-4、D-5、D-6或D-7之任一者所示之環，
R2、R3、R4及R5為氫原子，
p、m及r為0。
[4]如[1]所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
X為-C(R2)(R3)O-，
W為D-2所示之環，
m及r為0。
[5]如[1]所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
W為D-8、D-9、D-10、D-11或D-12之任一者所示之環，
R4及R5為氫原子，
p為0。
[6]一種培養基添加用組成物，為含有[1]至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[7]如[6]所述之培養基添加用組成物，其為細胞增殖促進用者。
[8]如[7]所述之培養基添加用組成物，其中，細胞為選自由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所構成之群組。
[9]如[6]所述之培養基添加用組成物，其係用於球狀體形成、囊胞形成或類器官形成的促進。
[10]如[6]所述之培養基添加用組成物，其係用於移植用細胞或移植用類器官的製造。
[11]如[6]所述之培養基添加用組成物，其為細胞貼附促進用者。
[12]一種細胞培養之培養基，係含有[1]至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[13]一種促進細胞增殖的方法，包含於細胞培養之培養基中添加[1]乃至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[14]如[13]所述之方法，其中，細胞為選自由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所構成之群組。
[15]一種促進細胞貼附的方法，包含於細胞培養之培養基中添加[1]乃至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[16]一種激酶抑制劑，包含[1]乃至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[17]如[16]所述之激酶抑制劑，其中，激酶為LATS。
[18]一種Hippo信號傳達路徑抑制劑，包含[1]乃至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[19]一種醫藥組成物，包含[1]乃至[5]中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
[20]如[19]所述之醫藥組成物，其中，醫藥組成物為用於治療眼、肝臟、皮膚或腸之疾病的治療。
根據本發明可顯著地促進細胞增殖、球狀體形成、囊胞形成及/或類器官形成。除此之外，根據本發明可顯著地抑制LATS1或LATS2等激酶之活 性。再者，根據本發明可治療伴隨細胞增殖不全之疾病，同時可促進損傷組織再生。
第1圖為試驗例4之共焦螢光顯微鏡照片。
第2圖為顯示對於試驗例18中切除之肝臟回復之本發明化合物的效果圖。
第3圖為顯示對於試驗例19中大腸炎回復之本發明化合物的效果圖。
本發明中使用之新穎化合物為以下式(I)表示之化合物(以下，亦稱為「本發明化合物」)。
Figure 109102822-A0202-12-0009-8
[式中，X為-N(R5)C(R2)(R3)-、-C(R2)(R3)N(R5)-或-C(R2)(R3)O-，
W表示下列D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11或D-12之任一者所示之環，
Figure 109102822-A0202-12-0010-58
Figure 109102822-A0202-12-0010-59
R1為C1至C6烷基或鹵(C1至C6)烷基，
R2及R3各自獨立地為氫原子或C1至C6烷基，
R4及R5各自獨立地為氫原子或C1至C6烷基，
Ra為羥基、硝基、鹵素原子、C1至C6烷基、鹵(C1至C6)烷基、C2至C6烯基、C2至C6炔基、C1至C6烷氧基、鹵(C1至C6)烷氧基、C1至C6烷硫基、鹵(C1至C6)烷硫基、C1至C6烷基亞磺醯基或C1至C6烷基磺醯基，
m為0、1、2、3或4，
p為0、1、2或3，
r為0或1]。
於一態樣，式(I)表示之化合物中，
X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
W為D-1、D-2或D-3之任一者所示之環，
R4及R5為氫原子，Ra為C1至C6烷基或鹵素原子，
m為0或1，
r為0。
於一態樣，式(I)表示之化合物中，
X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
W為D-2所示之環，
R2為C1至C6烷基，
R3、R4及R5為氫原子，
Ra為C1至C6烷基，
m為0，
r為0。
於一態樣，式(I)表示之化合物中，
X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
W為D-2所示之環，
R2為C1至C6烷基，
R3、R4及R5為氫原子，
Ra為鹵素原子，
m為1，
r為0。
又，於其他之一態樣，式(I)表示之化合物中，
X為-N(R5)C(R2)(R3)-，
W為D-2、D-4、D-5、D-6或D-7之任一者所示之環，
R2、R3、R4及R5為氫原子，
p、m及r為0。
再於其他之一態樣，式(I)表示之化合物中，
X為-C(R2)(R3)O-，
W為D-2所示之環，
m及r為0。
再於其他之一態樣，式(I)表示之化合物中，
W為D-8、D-9、D-10、D-11或D-12之任一者所示之環，
R4及R5為氫原子，
P為0。
關於式(I)表示之化合物，對應取代基之種類或條件，根據情況，認為有作為例如下述式表示之酮-烯醇構造互變異構體等存在，惟，本發明化合物亦包含可存在之所有異構體。
Figure 109102822-A0202-12-0012-10
本發明化合物所包含之化合物，根據取代基之種類，有具有E立體配置之E體及具有Z立體配置之Z體之幾何異構體存在之情況。本發明化合物包含該等E體、Z體或將E體及Z體以任意比例含有之混合物，於本說明書，有將該等例如如上所述，作為波線之結合表示之情況。
本發明化合物所包含之化合物，有起因於1個或2個以上不對稱碳原子的存在之光學活性體存在，惟，本發明化合物包含所有之光學活性體或消旋體。
本發明化合物所包含之化合物中，可依照常法作成酸加成鹽者，包含例如氫氟酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸等鹵化氫酸的鹽，硝酸、硫酸、磷酸、氯酸、過氯酸等無機酸的鹽，甲磺酸、乙磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸等磺酸的鹽，甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、富馬酸、酒石酸、草酸、馬來酸、蘋果酸、琥珀酸、苯甲酸、苦杏仁酸、抗壞血酸、乳酸、葡萄糖酸、檸檬酸等羧酸的鹽或麩胺酸、天冬胺酸等胺基酸的鹽，惟不限定於此。
又，本發明化合物所包含之化合物中，可依照常法作成金屬鹽者，包含例如鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽，鈣、鋇、鎂等鹼土金屬的鹽或鋁的鹽，惟不限定於此。
接著，將本說明書中所示之各取代基之具體例揭示於下。此處，n-係指正、i-係指異、s-係指第二及t-係指第三、Ph係指苯基。
本說明書中之鹵素原子可列舉氟原子、氯原子、溴原子及碘原子。又，本說明書中「鹵」亦表示該等鹵素原子。
本說明書中之Ca至Cb烷基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之直鏈狀或支鏈狀飽和烴基，具體例可列舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、正己基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之鹵(Ca至Cb)烷基的標記係表示結合於碳原子之氫原子藉由鹵素原子任意取代，碳原子數為a至b個所構成之直鏈狀或支鏈狀飽和 烴，此時，藉由2個以上鹵素原子取代時，該等鹵素原子互相可相同亦可不同。 具體例可列舉例如氟甲基、氯甲基、溴甲基、碘甲基、二氟甲基、二氯甲基、三氟甲基、氯二氟甲基、三氯甲基、溴二氟甲基、1-氟乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-溴-2,2-二氟乙基、1,1,2,2-四氟乙基、2-氯-1,1,2-三氟乙基、2-氯-1,1,2,2-四氟乙基、五氟乙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、3-溴-3,3-二氟丙基、2,2,3,3-四氟丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、1,1,2,3,3,3-六氟丙基、七氟丙基、2,2,2-三氟-1-(甲基)乙基、2,2,2-三氟-1-(三氟甲基)乙基、1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基、2,2,3,4,4,4-六氟丁基、2,2,3,3,4,4,4-七氟丁基、九氟丁基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之Ca至Cb烯基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之直鏈狀或支鏈狀且分子內具有1個或2個以上雙鍵之不飽和烴，具體例可列舉例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、2-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之Ca至Cb炔基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之直鏈狀或支鏈狀且分子內具有1個或2個以上參鍵之不飽和烴，具體例可列舉例如乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、4,4,4-三氟-2-丁炔基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之Ca至Cb烷氧基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之前述意義之烷基-O-基，具體例可列舉例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基等，於各個指定之碳 原子數範圍選擇。
本說明書中之鹵(Ca至Cb)烷氧基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之前述意義之鹵烷基-O-，具體例可列舉例如二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯二氟甲氧基、溴二氟甲氧基、2-氟乙氧基、2-氯乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、1,1,2,2,-四氟乙氧基、2-氯-1,1,2-三氟乙氧基、1,1,2,3,3,3-六氟丙氧基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之Ca至Cb烷硫基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之前述意義之烷基-S-，具體例可列舉例如甲硫基、乙硫基、正丙硫基、異丙硫基、正丁硫基、異丁硫基、第二丁硫基、第三丁硫基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之鹵(Ca至Cb)烷硫基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之前述意義之鹵烷基-S-，具體例可列舉例如二氟甲硫基、三氟甲硫基、氯二氟甲硫基、溴二氟甲硫基、2,2,2-三氟乙硫基、1,1,2,2-四氟乙硫基、2-氯-1,1,2-三氟乙硫基、五氟乙硫基、1,1,2,3,3,3-六氟丙硫基、七氟丙硫基、1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙硫基、九氟丁硫基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之Ca至Cb烷基亞磺醯基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之前述意義之烷基-S(O)-，具體例可列舉例如甲基亞磺醯基、乙基亞磺醯基、正丙基亞磺醯基、異丙基亞磺醯基、正丁基亞磺醯基、異丁基亞磺醯基、第二丁基亞磺醯基、第三丁基亞磺醯基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
本說明書中之Ca至Cb烷基磺醯基的標記係表示由碳原子數a至b個所構成之前述意義之烷基-SO2-，具體例可列舉例如甲基磺醯基、乙基磺醯基、正丙基磺醯基、異丙基磺醯基、正丁基磺醯基、異丁基磺醯基、第二丁基磺 醯基、第三丁基磺醯基等，於各個指定之碳原子數範圍選擇。
接著，於以下說明本發明化合物之製造法。
[製造法A]
式(I)表示之化合物為如下述式表示之方式，可經由將式(2-1)表示之化合物(式中，R1表示與前述者同意義)與式(3-1)(式中，W及X表示與前述者同意義)進行脫水反應而合成。作為一例，表示於下述式，式(I)中R4為氫原子之情況。
[反應式1]
Figure 109102822-A0202-12-0016-11
於本反應，對於式(2-1)表示之化合物1當量，式(3-1)表示之化合物可於0.5至20當量範圍使用，較佳為於1至2當量範圍使用。
本反應可以無溶劑實施，亦可使用水或有機溶劑，例如有機溶劑可列舉甲苯、o-二甲苯等芳族烴類，1,4-二噁烷、四氫呋喃等醚類，N,N-二甲基甲醯胺、二甲亞碸等極性溶劑。該等溶劑可單獨使用，亦可將該等中2種以上混合使用。
反應溫度可於從0℃至反應混合物之回流溫度之範圍，較佳為於從100℃至反應混合物之回流溫度之範圍設定任意之溫度。
反應時間依反應基質之濃度、反應溫度而變化，通常可於5分鐘至100小時之範圍，較佳於1小時至72小時之範圍任意設定。
此處使用之式(2-1)表示之化合物為公知化合物，一部分可由市售 品取得。又，可以文獻[例如Synthesis,(13),p.1857(2002)等]記載之方法為基準製造。
式(3-1)表示之化合物為公知化合物，一部分可由市售品取得。又，可以文獻[例如Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry,298(1),p.9(2013)等]記載之方法為基準製造。
反應完成後之反應混合物直接濃縮或溶解於有機溶劑，水洗後濃縮或投入冰水中，進行有機溶劑萃取後濃縮之通常之後處理，可獲得目的之本發明化合物。又，需要精製時可藉由再結晶、管柱層析、薄層層析、液體層析分取等任意精製方法分離、精製。
又，本發明所包含之化合物中，起因於1個或2個以上不對稱碳原子的存在之光學活性體存在之情況，例如可藉由使用為光學活性體之原料，以前述製造法為基準之方法進行製造，或是可由該化合物之消旋體，藉由使用對掌性管柱之液體層析、超臨界流體層析等進行光學分割，而獲得光學活性體。
本說明書中之3次元細胞培養(3D細胞培養)係指例如使用包埋培養法、微載體培養法、球狀體培養法等，將細胞於3次元環境進行培養。包埋培養為將細胞埋入基膠質(Matrigel)(註冊商標)、Geltrex(註冊商標)、瓊脂、甲基纖維素、膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、瓊脂糖、海藻酸鹽等固形或半固體凝膠基材中使其固定之培養方法。微載體培養法為將細胞於只比水稍重之微粒子(以下亦稱為微載體)表面上使其單層增殖，將該微粒子於燒瓶等培養容器內攪拌，進行以浮遊狀態之培養者。球狀體培養為使目的細胞形成由數十至數百個所構成之凝集塊(以下亦稱為球狀體或橢球體)後，將該凝集塊於培養基中靜置或振盪進行培養之方法。又，就本發明之3次元細胞培養(3D細胞培養)而言，亦可使用下述 手法：藉由將透明質酸、脫醯化結蘭膠、黃原膠等多糖類或此等之衍生物於培養基中分散，而使其形成不定型之3次元網絡，將此作為框架而將貼附細胞於培養基中維持浮遊狀態，藉此將細胞於更接近活體內之3次元狀態進行培養之手法。此時，3次元細胞培養中之細胞，由於受困在該3次元網絡而不沉澱，不需振盪、旋轉操作等即可進行培養。3次元細胞培養可藉由本身公知之方法實施(參照例如WO2014/017513)。
[培養基添加用組成物]
本發明提供含有本發明化合物之培養基添加用組成物(以下亦稱為本發明組成物)。本發明組成物藉由添加於細胞培養基，尤其是3次元細胞培養培養基，可達成細胞增殖的促進、球狀體形成的促進、囊胞(以下亦以Cyst標記)形成的促進及類器官形成的促進中任一項或該等之任意組合。
亦即，本發明組成物之用途具體例例示於下：(1)促進細胞增殖；(2)促進球狀體形成；(3)促進類器官形成；(4)促進囊胞形成；(5)促進細胞增殖及促進球狀體形成；(6)細促進胞增殖及促進類器官形成；(7)促進細胞增殖及促進囊胞形成；(8)促進球狀體形成及促進類器官形成；(9)促進球狀體形成及促進囊胞形成；(10)促進類器官形成及促進Cyst形成； (11)促進細胞增殖、促進球狀體形成及促進類器官形成；(12)促進細胞增殖、促進球狀體形成及促進囊胞形成；(13)促進細胞增殖、促進類器官形成及促進Cyst形成；(14)促進球狀體形成、促進類器官形成及促進Cyst形成；或、(15)促進細胞增殖、促進球狀體形成、促進類器官形成及促進Cyst形成。
於本說明書，「促進細胞增殖」係指例如與成為對照之規定細胞數比較，細胞數增加至少5%以上、至少10%以上、至少20%以上、至少30%以上、至少40%以上、至少50%以上、至少60%以上、至少70%以上、至少80%以上、至少90%以上、至少100%以上、至少150%以上或至少200%以上。
本發明組成物亦可含有1種或組合2種以上之本發明化合物作為有效成分。
又，本發明組成物亦可含有本發明化合物以外之其他成分。只要能獲得本發明所期望之效果即可，並無特別限制，相關之成分可包含例如水、生理食鹽水、二甲亞碸(DMSO)、甘油、丙二醇、丁二醇及甲醇、乙醇、丁醇、丙醇等各種醇等。本發明組成物必要時可實施滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，可列舉例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下亦稱為過濾滅菌)時，過濾器部分之材質並無特別限制，可列舉例如玻璃纖維、尼龍、聚醚碸(PES)、親水性聚二氟亞乙烯(PVDF)、纖維素混合酯、纖維素乙酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器細孔之大小並無特別限制，較佳為0.1μm至10μm，更佳為0.1μm至1μm，最佳為0.1μm至0.5μm。該等滅菌處理，該組成物可為固體狀態，亦可為溶液狀態。
作為本發明組成物中有效成分之本發明化合物之調配量，只要於 將本發明組成物添加於培養基(尤其是3次元細胞培養培養基)時，該培養基可發揮本發明所期望之效果之濃度者即可，並無特別限制。作為可發揮本發明所期望之效果之濃度，例如本發明化合物之培養基(尤其是3次元細胞培養培養基)中濃度之下限值通常為0.001μM以上，較佳為0.01μM以上，更佳為0.1μM以上，再更佳為1μM以上，最佳為10μM以上。又，其濃度之上限值通常為100μM以下，較佳為50μM以下，最佳為10μM以下。
本發明組成物於提供時或保存時可為任意形狀。該組成物可為如錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑之經製劑化之固體，如以適當之溶劑及溶解劑溶解之溶液或懸濁液之液體或結合於基板或擔體之狀態。作為製劑化時之添加物可列舉對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等黏合劑；脂肪酸酯等界面活性劑；甘油等可塑劑等。該等添加物不只限於上述者，只要業者可利用，可自由選擇。
就藉由本發明組成物對培養基(尤其是3次元細胞培養培養基)的添加而可達成細胞增殖之促進等之細胞種而言，只要可獲得所期望之效果即可，並無特別限制，可列舉精子或卵子等生殖細胞、構成活體之體細胞、正常細胞株、癌細胞株、前驅細胞、幹細胞、從活體分離之人為基因改變(例如，使用病毒之基因導入或藉由基因組編集之基因改變)所構成之細胞、從活體分離之人為之核交換之細胞等細胞種。又，該等細胞之由來並無特別限制，較佳為源自大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、松鼠、倉鼠、烟鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、普通狨、松鼠猴、普通獼猴、黑猩猩、人類等哺乳動物之細胞。又，細胞來源之組織或臟器只要能獲得本發明所期望之效果者即可，並無 特別限制，前述組織可列舉皮膚、腎臟、脾臟、副腎、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臟、膀胱、前列腺、睪丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等組織，惟，不只限於此，又，前述臟器可列舉肝臟、肺、腎臟、心臟、胰臟、胃、脾臟、小腸、大腸、生殖器、眼等臟器，惟，不只限於此。又，以類器官形成促進為目的時，有類器官較佳為源自小腸或大腸(結腸)之細胞之情況。又，以Cyst形成促進為目的時，有Cyst較佳為源自腎臟細胞之情況。
又，正常細胞株可列舉C3H10T1/2(小鼠胚胎纖維母細胞)、HEK293(人類胎兒腎細胞)、MDBK(源自牛腎臟之細胞)、MDCK(狗腎臟尿小管上皮細胞)、CHO-K1(源自中國倉鼠卵巢之細胞)、Vero(源自非洲綠猴腎臟上皮之細胞)、NIH3T3(小鼠胎兒纖維母細胞)、HepaRG(肝細胞、註冊商標)、HUVEC(人類臍帶靜脈內皮細胞)、人類初代培養肝細胞、表皮角化細胞、角膜上皮細胞、角膜內皮細胞等。該等中較佳為MDCK、C3H10T1/2、CHO-K1、Vero、HUVEC、表皮角化細胞、角膜上皮細胞、角膜內皮細胞或NIH3T3。又，癌細胞株之例不限定於以下之例，人類乳癌細胞株可列舉HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D，人類子宮頸癌細胞株可列舉HeLa，人類肺癌細胞株可列舉A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114，人類大腸癌細胞株可列舉Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr，人類前列腺癌細胞株可列舉DU-145、PC-3、LNCaP，人類中樞神經系癌細胞株可列舉U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19，人類卵巢癌細胞株可列舉OVCAR-3、OVCAR-4、 OVCAR-5、OVCAR-8、SKOV3、IGROV-1，人類腎癌細胞株可列舉RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10，人類胃癌細胞株可列舉MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74，皮膚癌細胞株可列舉LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14、A431，人類肝臟細胞株可列舉HuH-7、HepG2、PLC-PRF-5、SK-HEP-1，白血病細胞株可列舉CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat等。該等中較佳為人類卵巢癌細胞株SKOV3、人類肝臟細胞株HuH-7、源自人類上皮樣細胞癌之細胞株A431。再者，幹細胞為兼備將自己自身複製之能力及分化為其他複數系統細胞之能力之細胞，其例不只限於以下之例，可列舉胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞(MSC)、肝幹細胞、胰幹細胞、肌肉幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。多能性幹細胞可列舉前述幹細胞中之ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞。前驅細胞為從前述幹細胞分化為特定體細胞或生殖細胞之中途階段之細胞。此等中較佳為MSC及iPS細胞。
於一態樣，使用經添加本發明組成物之3次元細胞培養之培養基進行MSC等幹細胞的培養時，可在維持該細胞形質(例如未分化性)下促進其細胞增殖。MSC之未分化性的維持可藉由以流式細胞術(FCM)分析細胞表面標識之表現而確認(例如，參照WO2016/136986)，作為MSC之細胞表面標識可列舉CD29、CD73、CD90及CD105等為陽性者。
本說明書中「本發明組成物」之用語可以「本發明之培養基添加劑」之用語替代。
[培養基]
本發明提供含有本發明化合物或本發明組成物之培養基(以下，亦稱為「本發明之培養基」)。藉由使用本發明之培養基，可達成細胞增殖之促進、球狀體形成之促進、囊胞形成之促進及類器官形成之促進中之任一項或此等之任意組合。又，本發明之培養基較佳為3次元細胞培養之培養基。
本發明培養基中含有作為有效成分之本發明化合物的濃度，只要可得到本發明所期望之效果者即可，並無特別限定，例如其濃度之下限值通常為0.001μM以上，較佳為0.01μM以上，更佳為0.1μM以上，再佳為1μM以上，最佳為10μM以上。又，其濃度之上限值通常為100μM以下，較佳為50μM以下，最佳為10μM以下。
本發明之培養基除了調配本發明化合物或本發明組成物之外，亦可作成與公知培養基相同之組成。
於一態樣，本發明之培養基可藉由於市售之培養基(尤其是3次元細胞培養之培養基)中添加本發明化合物或組成物調製。藉由添加本發明化合物或本發明組成物作成本發明之培養基之市售培養基，只要可獲得所期望之效果者即可，並無特別限定，可列舉例如杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、漢姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、麥考伊5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾氏MEM(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊思考夫改良杜爾貝科氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E、IPL41培養基、 Fischer’s培養基、StemPro34(英杰(Invitrogen)公司製造)、X-VIVO 10(康培司(Cambrex)公司製造)、X-VIVO 15(康培司公司製造)、HPGM(康培司公司製造)、StemSpan H3000(幹細胞科技公司(STEMCELL Technologies)製造)、StemSpanSFEM(幹細胞科技公司製造)、StemlineII(西格瑪奧瑞奇(Sigma-Aldrich)公司製造)、QBSF-60(品質生物科技公司(Quality Biological Inc.)製造)、StemProhESCSFM(英杰公司製造)、Essential8(註冊商標)培養基(吉布可(Gibco)公司製造)、mTeSR1培養基(幹細胞科技公司製造)、mTeSR2培養基(幹細胞科技公司製造)、利普FF(Repro FF)(利普協(Reprocell)公司製造)、利普FF2(利普協公司製造)、StemFit(註冊商標)AK02N(味之素公司製造)、StemFit(註冊商標)AK03N(味之素公司製造)、PSGro hESC/iPSC培養基(系統生物科學(System Biosciences)公司製造)、NutriStem(註冊商標)培養基(生物工業(Biological Industries)公司製造)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製造)、MesenPRO RS培養基(吉布可公司製造)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡(股)公司製造)、間葉系幹細胞用培養基(普莫協(PromoCell)公司製造)、Sf-900II(英杰公司製造)、Opti-Pro(英杰公司製造)角膜上皮細胞基礎培養基(ATCC(註冊商標)、PCS-700-030(註冊商標))、Prigrow medium(Applied Biological Materials公司製造)、伊格爾基礎培養基(Basal Medium Eagle)、BGJb培養基、CMRL1066培養基、角質細胞基礎培養基2(PromoCell公司製造)、角質細胞增殖培養基2(PromoCell公司製造)、正常人類表皮角化細胞增殖用培養基(倉敷(Kurabo)公司製造)、正常人類表皮角化細胞基礎培養基(倉敷公司製造)、人類EpiVita增殖培養基(東洋紡(股)公司製造)、EpiLife(註冊商標)培養基(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司製造)、角膜上皮細胞系基礎培養基(ATCC公司製造、#PCS-700-030)、IntestiCult Organoid Growth Medium(幹細胞科技公司製造)、STEMdiff Cerebral Organoid Kit(幹細胞科技公司製造)、STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit(幹細胞科技公司製造)、HepatiCult Organoid Growth Medium(幹細胞科技公司製造)、PancreaCult Organoid Growth Medium(幹細胞科技公司製造)、PneumaCult-ALI(幹細胞科技公司製造)、STEMdiff APEL2(幹細胞科技公司製造)等培養基。又，該等培養基可使用添加脫醯化結蘭膠等多糖類，進行3次元細胞培養之培養基化之培養基。該等3次元細胞培養之培養基可列舉例如FCeM(註冊商標)(富士軟片和光純藥公司製造)，惟不限定於此等。
又，對應目的，可於上述之培養基中添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞增殖因子、分化誘導因子、細胞貼附因子、抗體、酵素、細胞激素、荷爾蒙、凝集素、細胞外基質、生理活性物質等。具體例可列舉鹼性纖維母細胞增殖因子、轉化增殖因子-α、轉化增殖因子-β、表皮生長因子、類胰島素成長因子、Wnt蛋白質、雙調蛋白(Amphiregulin)、干擾素類、介白素類、血管內皮細胞增殖因子、血小板衍生生長因子、肝細胞增殖因子、白蛋白、胰島素、β-巰基乙醇、剔除血清替代物(Knockout Serum Replacement)(KSR、賽默飛世爾科技公司製造)、Glutamax(賽默飛世爾科技公司製造)、氫化可的松(hydrocortisone)、腎上腺素、L-麩醯胺酸、丙酮酸、亞硒酸、Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinase)(ROCK)抑制劑等，惟，不限定於此等。
於本發明培養基中細胞之培養(尤其是3次元細胞培養)可使用於細胞培養通常使用之玻璃器皿、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(Teflon)(註冊商標)袋、皿、培養皿、組織培養用皿、多孔皿、微盤、微孔盤、多盤、多孔盤、細胞培養玻片 (chamber sliders)、管、盤、培養袋、轉瓶等培養容器實施。該等培養容器可塗覆膠原蛋白、明膠、層黏連蛋白、iMatrix-511、iMatrix-411、iMatrix-221、纖連蛋白、玻連蛋白、基膠質(Matrigel)(註冊商標)、聚L-鳥胺酸/層黏連蛋白或聚D-賴胺酸等細胞外基質。於形成細胞凝集塊(球狀體)時，培養(貼附性)之細胞以該等培養容器為細胞低貼附性，不會貼附於培養容器者較佳。細胞非貼附性之培養容器可使用培養容器表面未經以提昇與細胞之貼附性為目的之人工處理(例如藉由細胞外基質等塗覆處理)者或是培養容器表面經以降低與細胞之貼附性為目的之人工處理者。該等容器之例可列舉Sumiron Celltight Plate(住友Bakelite(股)公司製造)、PrimeSurface(註冊商標)盤(住友Bakelite(股)公司製造)、超低貼附表面盤(康寧(Corning)公司製造)、Nunclon Sphera plate(賽默飛世爾科技公司製造)等，惟，不限定於此等。
[促進細胞增殖之方法、促進球狀體形成之方法、促進囊胞形成之方法及促進類器官形成之方法]
本發明提供包含將本發明化合物或本發明組成物添加於培養基，促進細胞增殖之方法、促進球狀體形成之方法、促進囊胞形成之方法或促進類器官形成之方法(以下，亦將此等統稱為本發明方法)。
於本發明方法使用之培養基只要能得到所期望之效果者即可，並無特別限定。較佳為3次元細胞培養之培養基。又，於本發明方法之細胞培養條件(例如溫度、二氧化碳濃度、培養期間等)只要使用本體公知之方法即可，或是對應目的可適當改變。例如培養細胞時之溫度，只要是動物細胞，通常為25℃至39℃，較佳為33℃至39℃(例如37℃)。二氧化碳濃度通常於培養大氣中為4體積%至10體積%，較佳為4體積%至6體積%。培養期間通常為1至35日， 可合併培養之目的適當設定。
使細胞凝集塊(球狀體)形成之方法並無特別限制，業者可適當選擇。該例可列舉使用具有細胞非貼附表面之容器之方法、懸滴法(hanging drop method)、迴轉培養法、3次元支架法、離心法、藉由電場或磁場凝集之方法等。例如關於使用具有細胞非貼附表面之容器之方法，係將目的之細胞在實施抑制細胞貼附之表面處理之培養容器中進行培養，可形成球狀體。使用該細胞非貼附性培養容器時，首先採取目的細胞後調製其細胞懸浮液。播種於該培養容器中進行培養。連續培養約一週，細胞自發性的形成球狀體。作為此時使用之細胞非貼附性表面，可於通常使用之玻璃器皿等培養容器表面塗覆抑制細胞貼附之物質等。該等物質可列舉瓊脂糖、瓊脂、聚-HEMA(聚-(甲基丙烯酸2-羥基-乙酯)2-甲基丙烯醯氧基乙基磷醯膽鹼與其他單體(例如甲基丙烯酸丁酯等)之共聚物、聚(丙烯酸2-甲氧基乙酯)、聚-N-異丙基丙烯醯胺、Mebiolgel(註冊商標)等，惟只要為無細胞毒性者即可，不限定於此等。
又，作為形成細胞凝集塊(球狀體)之方法，可使用Nature Biotechnology,2010,Vol.28,No.4,p.361-366、Nature Protocols,2011,Vol.6,No.5,p.689-700、Nature Protocols,2011,Vol.6,No.5,p.572-579、Stem Cell Research,2011,Vol.7,p.97-111、Stem Cell Reviews and Reports,2010,Vol.6,p.248-259等中記載之方法。
又，於形成球狀體培養時使用之培養基中，可含有加速球狀體形成或促進其維持之成分。作為具有該等效果之成分之例可列舉二甲亞碸、超氧化物歧化酶、血漿銅藍蛋白、催化酶、過氧化酶、L-抗壞血酸、L-抗壞血酸磷酸酯、生育酚、類黃酮、尿酸、膽紅素、含硒化合物、運鐵蛋白、不飽和脂肪酸、白蛋 白、茶鹼、毛喉素(Forskolin)、升糖素、二丁醯基cAMP等。含硒化合物可列舉亞硒酸鈉、硒酸鈉、二甲基硒、硒化氫、硒甲硫胺酸、Se-甲基硒代半胱胺酸、硒代胱硫醚、硒半胱胺酸、硒高半胱胺酸、腺苷-5’-磷硒酸、Se-腺苷基硒甲硫胺酸。又，具有上述效果之成分之例可列舉Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152、Wf-536等Rho-相關的蛋白激酶(Rho-associated protein kinase)(ROCK)抑制劑。又，為了獲得作為目的之尺寸均一之細胞凝集塊，可於使用之細胞非貼附性培養容器上導入與作為目的之細胞凝集塊相同直徑之複數凹洞。該等凹洞只要相互連接或在作為目的之細胞凝集塊直徑範圍內，於將細胞播種時，播種之細胞在凹洞與凹洞之間不會形成細胞凝集塊，確實的在凹洞之中形成對應其容積大小之細胞凝集塊，可獲得均一尺寸之細胞凝集塊集團。此時凹洞之形狀較佳為半球或圓錐。
具有細胞貼附性之支持體基本上可形成球狀體。該樣支持體之例可列舉膠原蛋白、聚輪烷、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、水凝膠等。
藉由與餵養細胞進行共培養，亦可形成球狀體。作為用於促進球狀體形成之餵養細胞可使用任何之貼附性細胞，惟以對應各種細胞之餵養細胞較佳。惟不限定於此，於例如形成源自肝臟或軟骨的細胞之球狀體時，該餵養細胞之例，較適合之細胞種可列舉COS-1細胞或血管內皮細胞。
又，形成球狀體之方法可選擇懸滴法。懸滴法為例如將細胞懸濁液之液滴(容量為約10至50μL)於培養容器蓋等之頂棚側點附，承載之液滴以如垂下地倒掛狀態培養之方法。於該等培養，細胞與平面接觸所受到的影響最小，於液滴下部形成球狀體。該等液滴可使用如GravityPLUS Plate(珀金埃爾默 (PerkinElmer)公司製造)之特殊培養容器加以調整。具體而言，可使用含有100至100000個，較佳為200至10000個，更佳為500至10000個細胞之液滴調製球狀體。為了形成球狀體，較佳培養6至48小時。
球狀體之大小根據細胞種及培養期間而異，並無特別限定，於作成球形狀或橢圓球形狀時為具有20μm至1000μm，較佳為具有40μm至500μm，更佳為具有50μm至300μm，最佳為具有80μm至200μm之直徑。
該等球狀體即使以原狀繼續靜置培養，於10日以上，較佳為13日以上，更佳為30日以上之期間亦能保持增殖能力，再者於靜置培養中定期性進行機械性分割或再進行單細胞化處理及凝集，實質上可無期限保持增殖能力。
培養球狀體使用之培養容器只要是一般可培養動物細胞者即可，並無特別限定，可列舉例如燒瓶、皿、培養皿、組織培養用皿、多孔皿、微盤、微孔盤、多盤、多孔盤、細胞培養玻片、細胞培養燒瓶、螺蓋旋轉瓶、玻璃器皿、管、盤、培養袋、滾瓶、EZSPHERE(AGC Techno Glass公司製造)、Sumiron Celltight Plate(住友Bakelite(股)公司製造)等。
該等培養容器中，於實施多數醫藥品候補化合物或醫藥品評估時，較佳使用微盤、微孔盤、多盤、多孔盤。該等盤之洞底形狀並無特別限制，可使用平底、U字型、V字型者，較佳為使用U字型者。該等培養器材之材質並無特別限制，可列舉例如玻璃、聚氯乙烯、纖維素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚碸、聚胺基甲酸酯、聚酯、聚醯胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑膠等。
進行包埋培養時使用之培養基可含有細胞貼附因子，其例可列舉基膠質(Matrigel)(註冊商標)、Geltrex(註冊商標)、膠原蛋白、明膠、聚-L-賴胺酸、 聚D-賴胺酸、層黏連蛋白、iMatrix-511、iMatrix-411、iMatrix-221、纖連蛋白、玻連蛋白、肌糖蛋白、選擇素、透明質酸、纖維蛋白等。該等細胞貼附因子可將2種以上組合添加。再者，對於包埋培養中使用之培養基，可再將瓊脂、關華豆膠、羅望子膠、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯膠樹、塔拉膠、羅望子膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、瓊脂糖、羅望子種子膠、普魯蘭等增黏劑混合。該等增黏劑可將2種以上組合添加。
類器官(將幹細胞或前驅細胞於3次元環境下，於活體外進行培養形成迷你臟器)或Cyst(藉由上皮細胞形成之管腔構造)之方法並無特別限制，業者可適當選擇。其例可列舉使用上述之包埋培養之方法。具體而言，可將目的之細胞或組織於含有上述細胞貼附因子之包埋培養用培養基中進行培養，形成類器官或囊胞(Cyst)。此處，成為類器官來源之細胞以從組織採取之幹細胞或前驅細胞、多能性幹細胞等較佳。例如採取目的之細胞或組織後調製其懸浮液，播種於包埋培養用之培養基中進行培養。若連續培養3至45日，細胞會自發性的形成類器官或囊胞(Cyst)。
本發明方法中使用之培養基(尤其是3次元細胞培養培養基)只要使用本發明之培養基即可。
本發明方法中，培養基中之本發明化合物或本發明組成物之濃度及細胞種等與前述[培養基添加用組成物]中之說明者相同。
[促進細胞貼附之方法]
本發明提供包含於培養基添加本發明之組成物，用於促進細胞貼附之方法(以下，亦稱為「本發明之促進細胞貼附之方法」)。本發明之促進細胞貼附之方法可促進細胞(尤其是貼附細胞)於培養容器之細胞貼附。
本發明之促進細胞貼附之方法中使用之培養基，只要可獲得所期望之效果者即可，並無特別限定。又，於本發明之促進細胞貼附之方法中細胞培養條件(例如溫度、二氧化碳濃度、培養期間等)使用本體公知之方法即可，亦可對應目的加以適當改變。例如，培養細胞時之溫度只要是動物細胞，通常為25℃至39℃，較佳為33℃至39℃(例如37℃)。二氧化碳濃度於培養之大氣中通常為4體積%至10體積%，較佳為4體積%至6體積%。培養期間通常為1至45日，惟，可合併培養目的適當設定。
於本發明之促進細胞貼附之方法中使用之培養基，只要使用本發明之培養基即可。
於本發明之促進細胞貼附之方法，成為上述有效成分之化合物之濃度及較佳之細胞種等，與前述[培養基添加用組成物]及[培養基]中說明者相同。
[移植用細胞或移植用類器官之製造方法]
本發明提供以使用含有有效量之前述式(I)所示之化合物或其鹽之培養基為特徵之移植用細胞或移植用類器官之製造方法(以下，亦稱為「本發明之製造方法」)。移植用細胞之例可列舉例如肝臟細胞、皮膚細胞、成骨細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞、胰臟β細胞、神經細胞、網膜細胞、角膜上皮細胞及角膜內皮細胞，惟，不限定於此。例如，藉由本發明之製造方法獲得之角膜上皮細胞及角膜內皮細胞適合作為於治療角膜疾病時之移植用細胞使用。移植用類器官之例可列舉大腦、小腦、內耳、甲狀腺、胸腺、睪丸、肝臟、胰臟、小腸、大腸、結腸、上皮、肺、腎臟等類器官。例如，藉由本發明之製造方法獲得之大腸或結腸的類器官，適合作為於治療腸疾病時之移植用類器官使用。
本發明製造方法中之式(I)所示之化合物、其添加量、培養基、培 養容器、培養之細胞或類器官、細胞或類器官之培養方法等與前述[培養基添加用組成物]、[培養基]及[促進細胞增殖之方法、球狀體形成之方法、促進囊胞形成之方法及促進類器官形成之方法]中記載者相同。
本發明製造方法中之細胞培養條件(例如溫度、二氧化碳濃度、培養期間等)使用本體公知之方法即可或可對應目的適當改變。例如於培養細胞或類器官時之溫度，只要是動物細胞或類器官，通常為25℃至39℃，較佳為33℃至39℃(例如37℃)。二氧化碳濃度通常於培養之大氣中為4體積%至10體積%，較佳為4體積%至6體積%。培養期間通常為1至45日，惟，可合併培養目的適當設定。
[激酶抑制劑]
本發明提供含有本發明化合物之激酶抑制劑(以下，亦稱為「本發明之激酶抑制劑」)。
於本發明激酶抑制劑中調配之本發明化合物之量只要可獲得所期望之效果即可，並無特別限定，通常為0.01至100重量%，較佳為0.1至100重量%，更佳為1至100重量%，再佳為5至100重量%，最佳為10至100重量%。
本發明之激酶抑制劑於提供時或保存時可為任意形狀。該組成物可為如錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑之經製劑化之固體，以如適當溶劑及溶解劑溶解之溶液或懸濁液之液體，或結合於基板或單體之狀態。製劑化時之溶劑可列舉水、生理食鹽水、二甲亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等各種醇等水性溶劑。製劑化時之添加物可列舉對-羥基苯甲酸酯類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑； 聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等黏合劑；脂肪酸酯等界面活性劑；甘油等可塑劑等。該等添加物不限定於上述者，只要業者可利用者即可，可自由選擇。
又，本發明之激酶抑制劑必要時可實施滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，可列舉例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下，亦稱為過濾滅菌)時過濾器部分之材質並無特別限制，可列舉例如玻璃纖維、尼龍、聚醚碸(以下，簡稱為PES)、親水性聚二氟亞乙烯(以下，簡稱為PVDF)、纖維素混合酯、纖維素乙酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器細孔之大小並無特別限制，較佳為0.1μm至10μm，更佳為0.1μm至1μm，最佳為0.1μm至0.5μm。於該等滅菌處理，特定化合物可為固體，亦可為溶液狀態。
於本發明之激酶抑制劑，「抑制激酶」係指抑制激酶磷酸化之機能，將其活性消失或減弱。藉由本發明激酶抑制劑抑制之激酶之種類可列舉LATS1及LATS2，惟不限定於此。又，本說明書中之「減弱激酶活性」係指例如與作為對照之規定之激酶磷酸化活性水平比較，減弱激酶活性至少5%以上、至少10%以上、至少15%以上、至少20%以上、至少25%以上、至少30%以上、至少35%以上、至少40%以上、至少50%以上、至少55%以上、至少60%以上、至少65%以上、至少70%以上、至少75%以上、至少80%以上、至少85%以上、至少90%以上、至少95%以上或至少99%以上。激酶活性之測定如以下實施例中之說明，可使用二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate)(以下，簡稱為ADP)定量法、遷移率分析(Mobility Shift Assay)(以下，稱為MSA)法等本體公知之方法。激酶為位於Hippo信號傳達路徑上游之LATS2等時，為其下游效應物之將成為磷酸化標的之YAP及/或TAZ之細胞內局部存在藉由使用本體公知之分子生物學 手法確認，可間接評估激酶活性減弱之程度。
於本發明之一態樣，激酶為LATS2時，「抑制LATS2」係指抑制LATS2作為激酶之機能，將其活性消失或減弱。LATS2以從酵母至人類為止之廣範圍種進化性保存。因此，藉由本發明之激酶抑制劑抑制其活性之LATS2可為於所有生物中之LATS2，可為大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、松鼠、倉鼠、烟鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、普通狨、松鼠猴、普通獼猴、黑猩猩、人類等哺乳動物之LATS。藉由本發明激酶抑制劑抑制之LATS2較佳為人類LATS。又，於本說明書中只以「LATS」記載時，其概念為包含「LATS1」及「LATS2」雙方及LATS1與LATS2之複合體。
本發明激酶抑制劑之使用態樣之例包含以分子生物學性之試驗或研究目的之使用等，惟不限定於此。作為以分子生物學性試驗或研究目的使用之一態樣，於表現LATS2等特定激酶之細胞投予本發明之激酶抑制劑，可容易的調製特定激酶活性受到抑制之細胞。由此獲得之細胞於有用於特定激酶之機能解析或可調節該特定激酶機能之候補物質的篩選等。
於一態樣，表現特定激酶之細胞可為源自哺乳動物之細胞。相關之細胞例可列舉構成活體之體細胞、正常細胞株、癌細胞株、前驅細胞、幹細胞、從活體分離之人為基因改變(例如使用病毒之基因導入或藉由基因組編集之基因改變)所構成之細胞、從活體分離之人為核交換之細胞等細胞，惟不限定於此。該等細胞之來源並無特別限制，可列舉源自大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、松鼠、倉鼠、烟鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、普通狨、松鼠猴、普通獼猴、黑猩猩、人類等哺乳動物之細胞。又，源自相關細胞之組織或臟器並無特別限定，作為組織之例可列舉皮膚、腎臟、脾臟、副腎、肝臟、 肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、睪丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等組織，作為臟器之例可列舉肝臟、肺、腎臟、心臟、胰臟、胃、脾臟、小腸、大腸、生殖器、眼等臟器。本說明書中之「幹細胞」係指兼備將本身自身複製之能力及分化為其他複數系統之細胞之能力之細胞，其例不只限於以下所述者，可列舉胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌肉幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。作為多能性幹細胞可列舉前述幹細胞中之ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞。前驅細胞為從前述幹細胞分化為特定體細胞或生殖細胞之途中階段之細胞。
本發明激酶抑制劑之對表現特定激酶之細胞之投予，可藉由於培養該細胞之培養基中添加本發明之激酶抑制劑達成。本發明激酶抑制劑之添加量只要可獲得本發明所期望之效果之量即可，並無特別限制，例如，本發明化合物之培養基中之濃度通常可作成0.001至100μM，較佳為0.01M至50μM，更佳為0.1至30μM，再更佳為1至20μM，最佳為5至10μM。
於使用本發明之激酶抑制劑時，用於培養細胞之培養基並無特別限定，可使用市售之培養基。較佳之市售培養基可列舉於前述[培養基]中記載之培養基，惟不限定於此。
又，對應試驗/研究之目的，可於上述培養基中適當添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞增殖因子、分化誘導因子、細胞貼附因子、抗體、酵素、細胞激素、荷爾蒙、凝集素、細胞外基質、生理活性物質等物質。
細胞培養條件(例如溫度、二氧化碳濃度、培養期間等)只要使用本體公知之條件即可，對應目的亦可適當改變。例如培養細胞時之溫度通常為25至39℃，較佳為33至39℃(例如37℃)。二氧化碳濃度通常於培養之大氣中為4至10體積%，較佳為4至6體積%，培養期間通常為1至35日，惟，可合併培養目的適當設定。
[Hippo信號傳達路徑抑制劑]
本發明亦提供含有本發明化合物之Hippo信號傳達路徑抑制劑(以下，亦稱為「本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑」)。
Hippo信號傳達路徑為參予細胞增殖、細胞壞死、器官大小、自我複製、幹細胞及前驅細胞之分化、創傷治癒、組織再生之信號傳達路徑。該路徑於多種生物以進化性保存，尤其於哺乳動物被高度保存。哺乳動物中之Hippo信號傳達路徑之主要因子可列舉LATS1及LATS2。LATS經由與支架蛋白質Mob1A/B之會合而活化。LATS亦藉由STE20家族蛋白質激酶Mst1及Mst2之磷酸化而活化。LATS將為轉錄輔因子之下游效應物之YAP及TAZ磷酸化。藉由LATS之YAP及TAZ之磷酸化於Hippo信號傳達路徑中為非常重要之事項。經磷酸化之YAP及TAZ從細胞核向細胞質移行，藉由泛素-蛋白酶體系統分解。因此，Hippo信號傳達路徑為經活化之狀態時，YAP及/或TAZ藉由LATS磷酸化，向細胞質中移行、分解。另一方面，Hippo信號傳達路徑為不活性狀態時，YAP及/或TAZ不被磷酸化，局部存在於細胞核中。
如上所述，已知YAP及/或TAZ為轉錄輔因子，局部存在於細胞核中時，誘導種種基因之表現。已知藉由YAP及/或TAZ誘導表現之基因大多媒介細胞之生存或增殖。相關基因之例可列舉例如CCND1、CTGF、BIRC2、CYR61、 AMOTL2、TGFB2、ANKRD1等，惟不限定於此。又，CCND1基因(亦稱為CYCLIN D1、「PRAD1」等)於人類存在於第11號染色體。由該基因所編碼之蛋白質(295胺基酸、分子量：約36kDa)參予細胞周期促進。CTGF基因(結締組織生長因子(connective tissue growth factor)，亦稱為「CCN2」等)於人類存在於第6號染色體，編碼誘導細胞增殖之促進等之多肽(349胺基酸，分子量：約35kDa)。BIRC2基因(baculoviral IAP repeat containing2，亦稱為「API1」等)於人類存在於第11號染色體，為編碼藉由凋亡蛋白酶分解活性抑制細胞凋亡之蛋白質(618胺基酸、分子量：約70kDa)之基因。CYR61基因(富含半胱胺酸的血管生成誘導因子61(cysteine rich angiogenic inducer 61)，亦稱為「CCN1」等)於人類存在於第1號染色體。由該基因所編碼之蛋白質(381胺基酸，分子量：約39kDa)於血管形成、VEGF亢進、骨形成中擔任重要之角色。AMOTL2基因(angiomotin like 2，稱為「LCCP」)於人類存在於第3號染色體(3q22.2)。由該基因所編碼之蛋白質(837胺基酸，分子量：約92kDa)與抑制血管新生之血管抑素結合蛋白(angiomotin)有關，屬於結合蛋白質(motin protein)家族。ANKRD1基因(錨蛋白重複結構域蛋白1(Ankyrin repeat domain-containing protein 1)、心臟阿黴素反應蛋白(Cardiac adriamycin-responsive protein)，亦稱為「CARP」)於人類存在於第10號染色體。由該基因所編碼之蛋白質(319胺基酸，分子量：約36kDa)高表現於心肌或骨格肌，作為轉錄因子機能。
本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑，抑制LATS之激酶活性，抑制藉由LATS之YAP及/或TAZ的磷酸化。由於YAP及/或TAZ未磷酸化，促進YAP及/或TAZ之核內移行。結果藉由YAP及/或TAZ表現所誘導之基因之基因表現亢進。因此，本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑，亦可說是「YAP及 /或TAZ之核內移行促進劑」或是「由YAP及/或TAZ所誘導之基因之表現促進劑」。
此外，於本說明書，「促進YAP及/或TAZ之核內移行」係指藉由抑制YAP及/或TAZ的磷酸化及蛋白質分解，於核的YAP及/或TAZ之存在量比細胞質提高。又，提高YAP及/或TAZ之存在量係指例如與作為對照之YAP及/或TAZ的細胞核內之存在量比較，YAP及/或TAZ的細胞核內之存在量上昇至少1.3倍以上、至少1.5倍以上、至少2倍以上、至少3倍以上、至少4倍以上、至少5倍以上、至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上、至少9倍以上、至少10倍以上。又，YAP及/或TAZ的細胞核存在量之測定可如後述之實施例中使用之藉由使用將螢光標記結合之抗YAP(或TAZ)抗體之影像分析等本體公知之方法實施。此外，YAP及/或TAZ的細胞核存在量，可藉由使用西方點墨法等，觀察YAP及/或TAZ之磷酸化狀態而間接地測定。
此外，本說明書中「由YAP及/或TAZ所誘導之基因之表現促進」，係指YAP及/或TAZ向細胞核移行受到促進之結果，由YAP及/或TAZ所誘導之基因(例如CCND1、CTGF、BIRC2、CYR61、AMOTL2、TGFB2、ANKRD1中至少1個以上)之表現量亢進。又，基因表現亢進係指例如與規定之對照水平之表現量(例如無添加本發明Hippo信號傳達路徑抑制劑之細胞群)比較，上述之基因中至少1個以上基因之表現量上昇至少1.3倍以上、至少1.5倍以上、至少2倍以上、至少3倍以上、至少4倍以上、至少5倍以上、至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上、至少9倍以上、至少10倍以上。又，基因表現亢進之評估，可使用微陣列法、實時PCR(聚合酶連鎖反應)法等，以轉錄層級進行評估，或使用西方點墨法等，以蛋白質轉譯層級進行評估。
關於本發明Hippo信號傳達路徑抑制劑中，本發明化合物之量、劑型、滅菌處理等，與1.本發明之激酶抑制劑中說明者相同。
作為本發明Hippo信號傳達路徑抑制劑之使用態樣之例，包含以分子生物學試驗或研究目的之使用等，惟不限定於此。以分子生物學試驗或研究目的使用之具體例為例如於具有Hippo信號傳達路徑之細胞投予本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑，可容易的調製Hippo信號傳達路徑為經抑制狀態之細胞。如上所述，本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑，由於促進YAP及/或TAZ向細胞核移行，於該細胞，可更明確顯示YAP及/或TAZ參予之疾病之表現型。因此，藉由使用具有相關特性之細胞，可更有效率的進行可調節YAP及/或TAZ機能之物質的探索。
於一態樣，具有Hippo信號傳達路徑之細胞為源自哺乳動物之細胞。相關細胞之例可列舉構成活體之體細胞、正常細胞株、癌細胞株、前驅細胞、幹細胞、從活體分離之人為基因改變所構成之細胞、從活體分離之人為核交換之細胞等細胞，惟不限定於此。又，該等細胞之來源並無特別限定，可列舉源自大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、松鼠、倉鼠、烟鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、普通狨、松鼠猴、普通獼猴、黑猩猩、人類等哺乳動物之細胞。又，源自相關細胞之組織或臟器亦無特別限定，作為組織之例可列舉皮膚、腎臟、脾臟、副腎、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、睪丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等組織，又，作為臟器之例可列舉肝臟、肺、腎臟、心臟、胰臟、胃、脾臟、小腸、大腸、生殖器、眼等臟器。
於具有Hippo信號傳達路徑之細胞投予本發明Hippo信號傳達路 徑抑制劑，可藉由於培養該細胞之培養基中添加本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑達成。本發明Hippo信號傳達路徑抑制劑之添加量只要可獲得本發明所期望之效果之量即可，並無特別限定，例如，本發明化合物培養基中之濃度通常為0.001至100μM，較佳為0.01至50μM，更佳為0.1至30μM，再更佳為1至20μM，最佳為5至10μM。
於使用本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑時，用於培養細胞之培養基並無特別限定，可使用市售之培養基。於使用本發明之Hippo信號傳達路徑抑制劑時可使用之市售培養基，可與於使用本發明激酶抑制劑時使用之市售培養基相同。又，細胞培養條件等亦與於本發明之激酶抑制劑說明者相同。
[醫藥組成物]
本發明提供含有本發明化合物之醫藥組成物(以下，亦稱為「本發明之醫藥組成物」)。
Hippo信號傳達路徑為參予細胞增殖、細胞壞死、器官大小、自我複製、幹細胞及前驅細胞分化、創傷治癒、組織再生之信號傳達路徑、尤其是藉由以抑制LATS等激酶，抑制Hippo信號傳達路徑，使細胞增殖、創傷治癒及組織再生亢進。因此，包含有激酶抑制活性之本發明化合物之本發明之醫藥組成物，可用於伴隨細胞增殖不全之疾病或損傷組織之再生。
於本發明之醫藥組成物，本發明化合物之量、滅菌處理等與前述[激酶抑制劑]中之說明者相同。
本發明之醫藥組成物可單獨使用，亦可與其他至少1種治療藥組合使用。此時，本發明之醫藥組成物可與該治療藥同時投予，亦可先投予該治療藥，亦可以於之後投予。本發明之醫藥組成物可與該治療藥以相同或不同之投予 路徑投予。該治療藥可列舉化學療法藥、支持治療藥或其組合。
本說明書中之「治療」包含部分或實質上達成1種以上之部分或完全減輕疾病之程度，改善或提昇疾病相關之臨床症狀或指標，延遲、抑制或預防疾病之進行，部分或完全延遲、抑制或預防疾病發症或疾病之進行。
本發明醫藥組成物適用對象之動物通常為哺乳動物，較佳為人類，惟，亦可為寵物(例如狗、貓、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、松鼠等)或家畜(牛、羊、豬、馬等)。較佳之本發明醫藥組成物之適用對象為人類。
又，本發明之醫藥組成物於提供時或保存時可為任意之形狀。本發明之醫藥組成物通常可作成錠劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、糖漿劑等經口投予劑，點眼劑、眼軟膏劑、經皮吸收劑、眼科用注射劑、直腸投予劑、經皮吸收劑、肌肉注射劑、靜脈注射劑或皮下注射劑投予。本劑可作為1個治療藥或與其他治療藥作成混合物投予。此等可以單體投予，亦可以通常醫藥組成物之形態投予。該等製劑可加入製劑學上容許之添加物藉由常法製造之。亦即，經口劑可使用通常之賦形劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑、濕潤劑、可塑劑、塗覆劑等添加物。經口用液劑可為水性或油性懸濁液、溶液、乳濁液、糖漿、酏劑等形態，亦可作成於使用前以水或其他適當之溶劑調製之乾糖漿供給。前述之液劑可含有如懸濁化劑、香料、稀釋劑或乳化劑等通常之添加劑。於直腸內投予時可作成栓劑投予。栓劑可將可可脂、月桂酸脂、聚乙二醇、甘油明膠、維太素(Witepsol)、硬脂酸鈉或此等之混合物等適當之物質作為基劑使用，必要時可加入乳化劑、懸濁化劑、保存劑等。靜脈或皮下注射劑為了形成水性劑型或使用時溶解型劑型，可使用注射用蒸餾水、生理食鹽水、5%葡萄糖溶液、丙二醇等溶解劑或溶解輔助劑、pH調節劑、等張化劑、安定化劑等製劑成分。眼科用注射劑為了形成水 性劑型或使用時溶解型劑型，可使用注射用蒸餾水、生理食鹽水、5%葡萄糖溶液、丙二醇等溶解劑或溶解輔助劑、pH調節劑、等張化劑、安定化劑等製劑成分。眼軟膏劑可使用白色凡士林、液體石蠟等廣用之基材調製。點眼劑必要時可使用氯化鈉、氯化鉀、甘油、丙二醇等等張化劑，磷酸鈉、乙酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉等緩衝劑，聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油等界面活性劑，乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉等安定化劑，氯化烷基二甲基苯甲基銨、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯等防腐劑，甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等黏稠化劑，抗壞血酸、生育醇等抗氧化劑等調製之。pH只要在眼科製劑所容許之範圍內即可，較佳為4至8之範圍。調整pH時可使用鹽酸、磷酸、檸檬酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉等。以下例示本發明醫藥組成物之製劑例及其調製方法，惟不限定於此等。
[製劑例1]
製造含有以下成分之顆粒劑。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0042-12
將式(I)表示之化合物及乳糖通過60網孔之篩子。將玉米澱粉通過120網孔之篩子。將此等以V型混合機混合。於混合粉末中添加2%(w/v)低黏 度羥丙基纖維素(以下，簡稱為HPC-L)水溶液，進行練合、造粒(擠壓造粒孔徑0.5至1mm)後乾燥之。將獲得之乾燥顆粒以振動篩子(12/60網孔)過篩，獲得顆粒劑。
[製劑例2]
製造含有以下成分之膠囊填充用散劑。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0043-13
將式(I)表示之化合物及乳糖通過60網孔之篩子。將玉米澱粉通過120網孔之篩子。將此等與硬脂酸鎂以V型混合機混合。將10倍散100mg填充於5號硬明膠膠囊。
[製劑例3]
製造含有以下成分之膠囊填充用顆粒劑。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0043-14
將式(I)表示之化合物及乳糖通過60網孔之篩子。將玉米澱粉通過120網孔之篩子。將此等以V型混合機混合。於混合粉末中添加2%(w/v)HPC-L水溶液，進行練合、造粒後乾燥之。將獲得之乾燥顆粒以振動篩子(12/60網孔)過篩、整粒，將其150mg填充於4號硬明膠膠囊。
[製劑例4]
製造含有以下成分之錠劑。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0044-15
將式(I)表示之化合物、乳糖、微結晶纖維素、羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)通過60網孔之篩子，混合之。於混合粉末中添加硬脂酸鎂，獲得製劑用混合粉末。將該混合粉末直接打錠，獲得錠劑。
[製劑例5]
成分
Figure 109102822-A0202-12-0044-16
靜脈用製劑藉由於飽和脂肪酸甘油酯中添加式(I)表示之化合物製造之。該溶液通常以1分鐘1mL之速度於病患靜脈內投予。
[製劑例6]
製造含有以下成分之眼軟膏劑(100g中)。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0045-17
[製劑例7]
製造含有以下成分之點眼劑(100mL中)。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0045-18
[製劑例8]
製造含有以下成分之點眼劑(100mL中)。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0045-19
[製劑例9]
製造含有以下成分之錠劑。
成分
Figure 109102822-A0202-12-0046-20
於人類投予本發明之醫藥組成物時，其投予量根據患者之年齡、性別、成為治療對象之疾病、組織損傷狀態或程度適當決定，惟通常於成人的情況，於經口劑或直腸內投予，本發明化合物之投予量為約0.1至1000mg/人類/日，於注射劑為約0.05mg至500mg/人類/日。於眼局部投予時，投予量為每1日0.00001至100mg，較佳為0.001至10mg，更佳為0.01至1mg，最佳為0.1至0.5mg。投予可為單次投予或複數次投予。例如，本發明之治療劑為點眼劑的情況，可以1次量1至5滴，更佳1至2滴，最佳1滴，1日1至3次，更佳為1日1至2次，最佳為1日1次投予。此處，1滴通常為0.01至0.1mL。該等數值只是為例示，投予量配合患者之症狀決定。
可作為前驅藥利用之本發明化合物，可藉由加溶劑分解或於生理條件下之體內生成本發明於藥理學上為活性之化合物、具有於化學或代謝可分解之基之本發明之衍生物。選擇適當之前驅藥物之方法及製造法為例如Design of Prodrugs(Elsevier,Amsterdam 1985)中記載者。於本發明中，為具有羥基之化合物時，例示藉由該化合物與適當之醛或適當之酸酐進行反應獲得之醯氧基衍生物作為前驅藥物。作為前驅藥物，較佳之醯氧基可列舉-OCOC2H5、-OCO(t-Bu)、 -OCOC15H31、-OCO(m-CO2Na-Ph)、-OCOCH2CH2CO2Na、-OCOCH(NH2)CH3、-OCOCH2N(CH3)2等。本發明化合物具有胺基時，例示將具有胺基之化合物與適當之酸鹵化物或適當之混合酸酐進行反應製造之醯胺衍生物作為前驅藥物。作為前驅藥物，較佳之醯胺可列舉-NHCO(CH2)20OCH3、-NHCOCH(NH2)CH3等。
本發明之醫藥組成物可適用之疾病，只要是治療藉由抑制Hippo信號傳達路徑治療可獲得細胞增殖之促進、治癒創傷、組織再生結果之疾病或組織損傷即可，並無特別限定。於一態樣，伴隨細胞增殖不全之疾病包含伴隨Hippo信號傳達路徑異常活化之疾病。又，於另一態樣，伴隨細胞增殖不全之疾病包含伴隨YAP及/或TAZ異常活化之疾病。作為伴隨相關細胞增殖不全之疾病或組織損傷之例，可列舉例如炎症性疾病(例如炎症、皮膚炎、異位性皮膚炎、肝炎、腎炎、腎小球腎炎、胰臟炎、乾癬、痛風、愛迪生氏症(Addison’s disease)、炎症性腸疾病、克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性大腸炎等)、神經變性疾病(例如阿滋海默症、巴金森症、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob disease)、亨丁頓舞蹈症、脊髓小腦變性症(SCD)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓性肌萎縮症(SMA)、球脊髓性肌萎縮症等)、免疫性神經疾病(例如多發性硬化症、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、重症肌無力症、多發性肌炎等)、肌肉營養不良症、肌肉病變、外傷、燒傷、藥傷、皮膚損傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青引起之障礙、尋常性白斑、白皮症、脊髓損傷、肌肉損傷、肝不全、藥劑性肝障礙、酒精性肝障礙、虛血性肝障礙、病毒性肝障礙、自體免疫性肝障礙、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬變、心肌梗塞、腦浮腫、腦出血、腦梗塞、角膜內皮變性症、水疱性角膜症、角膜移植伴隨之眼障礙、隱形眼鏡眼障礙、無虹膜、史蒂芬斯-強森症候群(Stevens- Johnson syndrome)、角膜炎、角膜上皮障礙、點狀表層角膜症、角膜糜爛、角膜潰瘍、乾眼、角膜上皮剝離、翼狀贅片、強膜化角膜、角膜營養不良、角膜炎、角膜上皮幹細胞疲弊症、藥傷、熱傷、眼天疱瘡、糖尿病角膜症、角膜內皮炎、傅氏內皮細胞角膜失養症(Fuchs endothelial corneal dystrophy)、滴狀角膜、虹彩角膜內皮症候群及角膜移植後之移植不全等，惟不限定於此。於本態樣，本發明之醫藥組成物亦可稱為「本發明之伴隨細胞增殖不全之疾病或組織損傷之治療劑」。
於一態樣，本發明之醫藥組成物於將細胞、組織、臟器等移植於哺乳動物時促進存活及回復時有效。作為被移植之細胞之例可列舉幹細胞(造血幹細胞、間葉系幹細胞、神經幹細胞等)、β細胞等，惟不限定於此。作為被移植之組織之例可列舉血液、紅血球、血小板、淋巴球、骨髓、臍帶血、血管、角膜、網膜、眼球、皮膚等，惟不限定於此。作為被移植之臟器之例可列舉胰臟、肺、腎臟、肝臟、心臟、小腸、眼等，惟不限定於此。又，該等細胞、組織、臟器可於移植前實施藉由使用病毒之基因導入或基因組編集之基因改變。於本態樣，本發明之醫藥組成物亦稱為「細胞、組織及/或臟器移植之存活促進劑」。
[實施例]
以下，將於本發明之組成物等中使用之式(I)表示之醯肼化合物之合成例及試驗例作為實施例加以具體敘述，對本發明作更詳細之說明。
[化合物之合成例]
[合成例1](E)-N’-(1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)亞丙基)-2-(吡啶-2-基胺基)乙醯肼(化合物No.A-001)之合成法
將2-(吡啶-2-基胺基)乙醯肼120mg及2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮100mg懸 濁於1.1mL之二甲亞碸，於100℃攪拌21小時。反應完成後將該反應溶液藉由放冷冷卻至室溫，以原狀以中壓矽膠管柱層析[矽膠10g、甲醇/二氯甲烷=1/99至8/92(體積比。以下亦相同)之梯度]精製。於獲得之精製物中加入水(5mL)，濾取析出之固體。再將固體以二氯甲烷懸濁洗淨，獲得白色固體之目的物47.9mg。
[合成例2]合成(E)-N’-(1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)亞丙基)-2-(吡啶-3-基胺基)丙醯肼(化合物No.A-004)之光學活性化合物(化合物No.A-004A及A-004B)之合成法
藉由合成例1之基準方法，由2-(吡啶-3-胺基)丙醯肼135mg及2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮135mg合成81.6mg之A-004。使用Waters公司製造之超臨界流體層析儀(SFC)將A-004光學分割，獲得6.6mg之A-004A及4.2mg之A-004B。
[光學分割條件]
管柱；CHIRALPAK IA-3(20×250mm、5μm；大賽璐公司製造)
移動相；CO2：MeOH=60：40(體積比)
管柱溫度；40℃
流速；15mL/分鐘
於上述條件，A-004顯示2個峰，各個保持時間為8.14分鐘及保持時間為13.40分鐘。光學分割後保持時間為8.14分鐘之化合物為A-004A(光學純度99.9%ee)、保持時間為13.40分鐘之化合物為A-004B(光學純度99.9%ee)。
[合成例3](E)-2-(1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)亞丙基)-N-(吡啶-3-基甲基)肼-1-羧醯胺(化合物編號B-001)之合成法
步驟1；
將3-胺基甲基吡啶1.0g懸濁於二氯甲烷11mL及水11mL之混合溶劑。於 該懸濁液中加入碳酸氫鈉2.3g後於0℃冷卻之。於該溶液中慢慢滴入氯甲酸苯酯1.3mL後慢慢昇溫至室溫。攪拌22小時，加入水10mL使反應停止後分液之。有機層以飽和食鹽水10mL洗淨，以無水硫酸鎂乾燥、過濾。將濾液於減壓下進行濃縮，獲得之殘渣以中壓矽膠管柱層析(矽膠30g、乙酸乙酯/己烷=5/95至50/50之梯度)精製，獲得白色固體之(吡啶-3-基甲基)胺基甲酸苯基酯0.54g。
步驟2；
將步驟1之目的物0.54g懸濁於乙醇4.7mL，加入肼一水和物0.57mL。將該反應液於60℃攪拌17小時。反應完成後將反應液於減壓下濃縮後以甲苯共沸進行脫水。獲得之殘渣以甲苯洗淨後過濾，獲得白色固體之N-(吡啶-3-基甲基)肼羧醯胺0.28g。
步驟3；
藉由合成例1之基準方法，藉由步驟2之目的物120mg及2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮100mg，獲得白色固體之目的物95.0mg。
[合成例4](E)-N’-(1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)亞丙基)-2-(吡啶-3-基氧基)丙醯肼(化合物編號C-001)之合成法
步驟1；
於甲苯30mL中加入3-羥基吡啶1.26g、乳酸甲酯1.0mL及三苯基膦3.5g後於冰冷下加入偶氮二羧酸二異丙酯之約1.9mol/L甲苯溶液(東京化成工業公司製造。以下亦相同)7.0mL。將該反應液昇溫至室溫，攪拌19小時。於該反應液中追加三苯基膦1.17g及偶氮二羧酸二異丙酯之約1.9mol/L甲苯溶液2.32mL，再於室溫攪拌28小時。將藉由將該反應溶液於減壓下濃縮獲得之殘渣以中壓矽膠管柱層析(矽膠100g、乙酸乙酯/己烷=10/90至40/60)精製，獲得黃色液體之2- (吡啶-3-基氧基)丙酸甲酯735mg。
步驟2；
將步驟1之目的物370mg溶解於乙腈5.1mL，加入肼一水和物0.50mL後於60℃攪拌6小時。將藉由將該反應溶液於減壓下濃縮獲得之殘渣以甲苯洗淨後過濾，獲得白色固體之2-(吡啶-3-基氧基)丙醯肼285mg。
步驟3；
藉由合成例1之基準方法，藉由步驟2之目的物130mg及2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮100mg，獲得白色固體之目的物93.6mg。
[合成例5](R,E)-2-[(1H-吲唑-6-基)胺基]-N’-[1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)丙醯肼(化合物編號A-016)之合成法
步驟1；
於氮氣氣流下，於20℃，於1H-吲唑-6-胺500mg及2,6-二甲基吡啶553mg之1,2-二氯乙烷溶液(10mL)中加入(S)-2-{[(三氟甲基)磺醯基]氧基}丙酸乙酯1.03g，於70℃攪拌16小時。於反應液中加入水，以乙酸乙酯萃取3次。將合併之有機層以無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮。殘渣以矽膠管柱層析(石油醚/乙酸乙酯=4/1)精製，獲得黃色油狀物之(1H-吲唑-6-基)-D-胺基丙酸乙酯247mg。
步驟2；
藉由合成例3之步驟2及3之基準方法，使用步驟1之目的物247mg。獲得白色固體之目的物17mg。
[合成例6](R,E)-N’-[1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)亞丙基]-2-(嘧啶-5-基胺基)丙醯肼(化合物編號A-017)之合成法
步驟1；
於0至5℃，於六甲基磷醯三胺5.1g之四氫呋喃溶液(5mL)中加入氫化鈉338mg。接著加入嘧啶-5-基胺基甲酸第三丁基酯550mg，於20℃攪拌0.5小時，加入(S)-2{[(三氟甲基)磺醯基]氧基}丙酸乙酯2.11g之四氫呋喃溶液(2mL)。反應液於50℃攪拌16小時後於反應混合物中加入水，以乙酸乙酯萃取5次。合併之有機層以無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮乾固。殘渣以矽膠管柱層析(石油醚/乙酸乙酯0→10%)精製，獲得黃色油狀物之N-(第三丁氧基羰基)-N-(嘧啶-5-基)-D-胺基丙酸乙酯325mg。
步驟2；
於0至5℃，於N-(第三丁氧基羰基)-N-(嘧啶-5-基)-D-丙胺酸酯325mg之乙酸乙酯溶液(3mL)中加入4M氯化氫-乙酸乙酯5.5mL，於20℃攪拌19小時。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水，以乙酸乙酯萃取3次。將合併之有機層以無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮乾固，獲得黃色油狀物之嘧啶-5-基-D-丙胺酸乙酯160mg。
步驟3；
藉由合成例3之步驟2之基準方法，使用步驟2之目的物及肼1水和物，獲得黃色油狀物之(R)-2-(嘧啶-5-基胺基)丙醯肼147mg。
步驟4；
於步驟3之目的物100mg與2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮101mg之乙醇溶液中加入乙酸63μL，於65℃攪拌5日。將反應液濃縮，以矽膠管柱層析(二氯甲烷/甲醇=10/1)及逆相層析精製，獲得黃色固體之目的物11mg。
[合成例7](E)-2-[(1H-苯并[d]咪唑-6-基)胺基]-N’-[1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)丙醯肼(化合物編號A-018)之合成法
步驟1；
於1H-苯并[d]咪唑-6-胺2g之1,2-二氯乙烷溶液(35mL)中加入2-側氧基丙酸乙酯2.09g及乙酸859μL，於50℃攪拌30分鐘。接著，於反應混合物中加入三乙醯氧基硼氫化鈉4.14g，於50℃攪拌15小時。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水，以二氯甲烷萃取4次。將合併之有機層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，獲得黃色固體之(1H-苯并[d]咪唑-6-基)胺基丙酸乙酯1.2g。
步驟2；
藉由合成例3之步驟2及合成例6之步驟4之基準方法，使用步驟1之目的物300mg，獲得黃色固體之目的物32mg。
[合成例8](R,E)-N’-[1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)亞丙基]-2-(喹啉-7-基胺基)丙醯肼(化合物編號A-019)之合成法
步驟1；
將D-丙胺酸乙酯0.5g、7-溴喹啉554mg、三(二亞苯甲基丙酮)二鈀(0)220mg、Xantphos 139mg及碳酸銫2.35g之1,4-二噁烷溶液(10mL)以氮氣進行3次減壓脫氣，於90℃攪拌16小時。於反應液中加入乙酸乙酯，以矽藻土過濾。濾液以水洗淨3次，以無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮。殘渣以矽膠管柱層析(石油醚/乙酸乙酯：0→50%)精製，獲得黃色油狀物之喹啉-7-基-D-丙胺酸乙酯235mg。
步驟2；
藉由合成例3之步驟2及合成例6之步驟4之基準方法，使用步驟1之目的物100mg，獲得黃色固體之目的物9.1mg。
式(I)表示之化合物可藉由前述合成例1至合成例8之基準方法合成。藉由前述合成例合成之式(I)表示之化合物之例表示於第1表至第6表，惟，本發明化合物不限定於此等。
表中，Me表示甲基，Et表示乙基，R2中之(R)係指R配置，(rac)係指消旋體。又，Ra中之「-」表示無取代。
表中，D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11及D-12表示下述之構造，構造式中記載之編號表示Ra之取代位置。式中之「m」為0、1、2、3或4，「p」為0、1、2或3。
Figure 109102822-A0202-12-0054-62
Figure 109102822-A0202-12-0054-63
[表1]
Figure 109102822-A0202-12-0055-23
Figure 109102822-A0202-12-0055-24
[表2]
Figure 109102822-A0202-12-0056-25
Figure 109102822-A0202-12-0056-26
[表3]
Figure 109102822-A0202-12-0057-27
Figure 109102822-A0202-12-0057-29
[表4]
Figure 109102822-A0202-12-0057-30
Figure 109102822-A0202-12-0057-31
[表5]
Figure 109102822-A0202-12-0058-32
Figure 109102822-A0202-12-0058-33
[表6]
Figure 109102822-A0202-12-0058-34
Figure 109102822-A0202-12-0058-36
式(I)表示之化合物中，表1至表6記載之化合物之1H-NMR值表示於下。
質子核磁共振化學位移值為將重二甲亞碸之值作為2.49ppm，於重二甲亞碸中，於270MHz或400MHz測定之。又，1H-NMR值中之符號係表示以下之意思。s：單峰、brs：寬單峰、d：雙峰、dd：雙雙峰、t：三峰、q：四峰、 m：多峰。
A-001(270MHz)；δ 13.68(s,1H),10.95(s,1H),9.68(s,1H),7.98(d,J=2.7Hz,1H),7.41(t,J=8.1Hz,1H),7.25(d,J=8.1Hz,1H),6.93(t,J=8.1Hz,1H),6.63(d,J=8.1Hz,1H),6.53(t,J=8.1Hz,1H),6.39(d,J=8.1Hz,1H),4.11(d,J=8.1Hz,2H),2.78(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).
A-002(270MHz)；δ 13.66(s,1H),10.92(brs,1H),9.70(brs,1H),8.02(brs,1H),7.80(brs,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),7.09(t,J=8.1Hz,1H),6.95(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.26(t,J=8.1Hz,1H),4.00(d,J=5.4Hz,2H),2.81(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).
A-003(270MHz)；δ 13.63(s,1H),11.03(brs,1H),9.72(brs,1H),8.08(d,J=5.4Hz,2H),7.36(t,J=8.1Hz,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),6.64(d,J=5.4Hz,2H),6.41(d,J=8.1Hz,1H),4.10(d,J=5.4Hz,2H),2.83(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.10(t,J=8.1Hz,3H).
A-004(270MHz)；δ 13.63(s,1H),10.91(s,1H),9.71(s,1H),8.02(d,J=2.7Hz,1H),7.79(d,J=5.4Hz,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),7.08(t,J=8.1Hz,1H),6.94(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.23(d,J=8.1Hz,1H),4.33(m,J=8.1Hz,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.42(d,J=8.1Hz,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).
A-005(270MHz)；δ 13.67(s,1H),10.95(s,1H),9.75(brs,1H),8.05(brs,1H),7.77(brs,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),7.08(d,J=8.1Hz,1H),7.00(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H), 6.21(d,J=8.1Hz,1H),5.77(s,1H),4.21(m,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.78(m,2H),1.06(t,J=8.1Hz,3H),0.99(t,J=8.1Hz,3H).
A-006(270MHz)；δ 13.66(s,1H),10.92(brs,1H),9.74(brs,1H),7.90(brs,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),6.96(d,J=8.1Hz,1H),6.93(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.01(d,J=8.1Hz,1H),4.30(m,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),2.27(s,3H),1.95(s,3H),1.40(d,J=8.1Hz,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).
A-007(270MHz)；δ 13.61(s,1H),10.97(s,1H),9.73(s,1H),7.89(brs,1H),7.71(brs,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),6.79(d,J=13.5Hz,1H),6.69(d,J=10.8Hz,1H),6.38(d,J=8.1Hz,1H),4.34(m,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.93(s,3H),1.40(d,J=8.1Hz,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).
A-007R(270MHz)；δ 13.63(s,1H),10.97(s,1H),9.73(s,1H),7.91(brs,1H),7.73(brs,1H),7.28(d,J=8.1Hz,1H),6.81(d,J=13.5Hz,1H),6.69(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),4.35(m,1H),2.84(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.42(d,J=5.4Hz,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
A-008(270MHz)；δ 13.64(s,1H),10.91(s,1H),9.72(s,1H),7.84(brs,1H),7.64(brs,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),6.79(brs,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.15(d,J=8.1Hz,1H),4.33(m,1H),2.82(q,J=Hz,2H),2.16(s,3H),1.95(s,3H),1.41(d,J=8.1Hz,3H),1.06(t,J=8.1Hz,3H).
A-009(270MHz)；δ 13.65(s,1H),10.89(s,1H),9.72(s,1H),9.45(s,1H),7.52(brs,1H),7.39(brs,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.36(d,J=2.7Hz,1H),6.14(d,J=8.1Hz, 1H),4.25(m,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.39(d,J=5.4Hz,3H),1.06(t,J=8.1Hz,3H).
A-010(270MHz)；δ 13.64(s,1H),10.93(s,1H),9.72(s,1H),7.53(brs,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),7.19(m,1H),6.92(m,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.23(d,J=8.1Hz,1H),4.31(m,1H),2.81(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.41(d,J=8.1Hz,3H),1.06(m,3H).
A-011(270MHz)；δ 13.62(s,1H),10.98(s,1H),9.73(s,1H),7.99(d,J=2.7Hz,1H),7.78(d,J=2.7Hz,1H),7.28(d,J=8.1Hz,1H),7.03(s,1H),6.67(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=10.8Hz,1H),4.37(m,1H),2.84(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.42(d,J=8.1Hz,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).
A-012(270MHz)；δ 13.63(s,1H),10.95(s,1H),9.72(s,1H),7.79(d,J=2.7Hz,1H),7.27(d,J=8.1Hz,1H),7.20(d,J=8.1Hz,1H),7.06(m,1H),6.48(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),4.33(m,1H),2.82(q,J=5.4Hz,2H),1.95(s,3H),1.41(d,J=5.4Hz,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
A-013(270MHz)；δ 13.60(s,1H),11.02(s,1H),9.72(s,1H),8.29(brs,1H),8.10(brs,1H),7.25(m,2H),6.84(d,J=8.1Hz,1H),6.39(d,J=8.1Hz,1H),4.44(m,1H),3.16(d,J=5.4Hz,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.94(s,3H),1.43(d,J=8.1Hz,3H),1.06(t,J=8.1Hz,3H).
A-014(270MHz)；δ 13.62(s,1H),11.02(s,1H),9.72(s,1H),8.13(d,J=2.7Hz,1H),7.58(d,J=8.1Hz,1H),7.28(d,J=8.1Hz,1H),7.05(s,1H),7.01(s,1H),6.40(d,J=10.8Hz,1H),4.43(m,1H), 2.84(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.45(d,J=5.4Hz,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).
A-015(270MHz)；δ 13.61(s,1H),11.07(s,1H),9.73(s,1H),8.29(s,1H),7.30(t,J=8.1Hz,2H),6.41(d,J=8.1Hz,1H),4.50(m,1H),2.84(m,2H),1.97(s,3H),1.47(d,J=8.1Hz,3H),1.10(t,J=8.1Hz,3H).
A-016(400MHz)；δ 13.6(s,1H),12.4(s,1H),10.9(s,1H),9.71(s,1H),7.74(s,1H),7.42(d,J=8.8Hz,1H),7.25(d,J=8.8Hz,1H),6.64(d,J=10Hz,1H),6.40-6.30(m,2H),6.20(d,J=8.0Hz,1H),4.33-4.30(m,1H),2.83-2.78(m,2H),1.94(s,3H),1.44(d,J=6.8Hz,3H),1.02(t,J=7.6Hz,3H).
A-017(400MHz)；δ 13.6(s,1H),11.1-10.9(m,1H),9.75-9.65(m,1H),8.42(s,1H),8.17(s,2H),8.10-8.00(m,1H),7,27(d,J=8.8Hz,1H),6.53(d,J=8.8Hz,1H),6.40(d,J=8.8Hz,1H),4.40-4.30(m,1H),2.75-2.65(m,1H),2.00-1.90(m,3H),1.43(d,J=6.8Hz,3H),1.07(t,J=7.4Hz,3H).
A-018(400MHz)；δ 13.6(s,1H),12.1-11.8(m 1H),10.8(s,1H),9.70(s,1H),8.00-7.80(m,1H),7.40-7.20(m,2H),6.80-6.60(m,2H),6.38(d,J=8.8Hz,1H),5.90-5.60(m,1H),4.35-4.25(m,1H),2.78(d,J=7.2Hz,2H),1.96(s,3H),1.43(d,J=6.4Hz,3H),1.05-0.96(m,3H).
A-019(400MHz)；δ 13.6(s,1H),11.1(s,1H),9.70(s,1H),8.60(d,J=3.2Hz,1H),8.03(d,J=7.6Hz,1H),7.65(d,J=8.8Hz,1H),7.26(d,J=8.8Hz,1H),7.16-7.09(m,2H),6.86(s,1H),6.66(d,J=8.0Hz,1H),6.39(d,J=8.8Hz,1H),4.48(t,J=7.0Hz,1H),2.85(q,J=7.3Hz,1H), 1.94(s,3H),1.47(d,J=7.0Hz,3H),1.08(t,J=7.3Hz,3H).
A-020(400MHz)；δ 13.6(s,1H),11.1(s,1H),9.71(s,1H),8.62(d,J=1.6Hz,1H),8.48(d,J=1.6Hz,1H),7.77(d,J=9.2Hz,1H),7.40(dd,J=9.2 and 2.4Hz,1H),7.27(d,J=8.8Hz,1H),7.01(d,J=8.0Hz,1H),6.83(d,J=2.0Hz,1H),6.39(d,J=8.0Hz,1H),4.55-4.45(m,1H),2.86(q,J=7.4Hz,1H),1.94(s,3H),1.49(d,J=6.8Hz,3H),1.08(t,J=7.4Hz,3H).
B-001(270MHz)；δ 13.37(s,1H),9.62(s,1H),9.54(s,1H),8.54(s,1H),8.47(d,J=2.7Hz,1H),7.73(d,J=8.1Hz,1H),7.37(d,J=8.1Hz,1H),7.17(d,J=8.1Hz,1H),6.94(t,J=8.1Hz,1H),6.37(d,J=8.1Hz,1H),4.37(d,J=8.1Hz,2H),2.66(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
B-002(270MHz)；δ 13.41(s,1H),9.55(s,1H),9.53(s,1H),7.61(s,1H),7.17(d,J=8.1Hz,1H),6.76(t,J=8.1Hz,1H),6.41(t,J=8.1Hz,1H),6.37(d,J=8.1Hz,1H),6.29(d,J=2.7Hz,1H),4.33(d,J=5.4Hz,2H),2.64(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
B-003(270MHz)；δ 13.44(s,1H),9.53(s,1H),9.52(s,1H),7.62(s,1H),7.60(d,J=8.1Hz,1H),7.16(d,J=8.1Hz,1H),6.63(t,J=8.1Hz,1H),6.48(s,1H),6.37(d,J=8.1Hz,1H),4.17(d,J=2.7Hz,2H),2.64(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
B-004(270MHz)；δ 13.39(s,1H),9.58(s,1H),9.54(s,1H),7.41(d,J=2.7Hz,1H),7.17(d,J=8.1Hz,1H),7.00(d,J=5.4Hz,1H),6.97(t,J=5.4Hz,1H),6.88(t,J=8.1Hz,1H),6.37(d,J=8.1Hz,1H),4.51(d,J=8.1Hz,2H),2.65(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
B-005(270MHz)；δ 13.44(s,1H),9.54(s,1H),9.53(s,1H),7.51(d,J=5.4Hz,1H),7.34(s,1H),7.16(d,J=8.1Hz,1H),7.09(d,J=5.4Hz,1H),6.76(t,J=8.1Hz,1H),6.37(d,J=8.1Hz,1H),4.32(d,J=5.4Hz,2H),2.64(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.1Hz,3H).
B-006(270MHz)；δ 13.33(s,1H),9.67(s,1H),9.56(s,1H),8.45(s,1H),8.42(s,1H),7.63(d,J=8.1Hz,1H),7.16(d,J=8.1Hz,1H),7.00(m,1H),6.36(d,J=8.1Hz,1H),4.40(d,J=5.4Hz,2H),2.66(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.06(t,J=8.1Hz,3H).
B-007(270MHz)；δ 13.40(s,1H),9.56(s,1H),9.54(s,1H),8.48(s,1H),8.46(s,1H),7.71(m,1H),7.17(d,J=8.1Hz,1H),7.00(d,J=8.1Hz,1H),6.36(d,J=10.8Hz,1H),4.93(m,1H),2.63(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.46(d,J=8.1Hz,3H),1.09(t,J=8.1Hz,3H).
C-001(270MHz)；δ 13.58(s,1H),11.11(s,1H),9.77(s,1H),8.30(s,1H),8.19(t,J=2.7Hz,1H),7.35(d,J=2.7Hz,1H),7.33(d,J=2.7Hz,1H),7.29(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),5.20(q,J=8.1Hz,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.58(d,J=8.1Hz,3H),1.06(t,J=8.1Hz,3H).
[試驗例1]本發明化合物對於SKOV3細胞增殖作用之評估1
將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司製造)於含有15%胎牛血清(以下，簡稱為FBS。康寧公司製造)之McCoy’s5a培養基(西格瑪奧瑞奇公司製造)進行前培養(單層培養)。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨。對於貼附細胞，係添加0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士軟片和光純藥公司製造)，於37℃保溫3分鐘後剝離。添加上述培養基、離 心，再以相同之培養基再懸濁。
依照專利文獻1(WO2014/017513)之方法，將含有0.015%(w/v)脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌(股)公司製造)及15%(v/v)FBS、30ng/mL人類EGF(PEPROTECH公司製造)之McCoy’s5a培養基(西格瑪奧瑞奇公司製造)之組成物於FCeM-series Preparation Kit(富士軟片和光純藥公司製造)進行調製。接著，使於上述調製之SKOV3細胞懸濁於添加上述脫醯化結蘭膠之培養基組成物後，分注於96孔平底超低貼附表面微盤(康寧公司製造、#3474)之洞，使每1孔成為2000cells/90μL/孔。將溶解於二甲亞碸之本發明化合物於上述培養基稀釋，將該稀釋液分別逐次添加10μL，以使本發明化合物之最終濃度成為5μM、20μM、40μM。於一部分之孔只添加二甲亞碸(DMSO)作為對照組。各盤於CO2保溫器(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養4日。對於第4日之培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製造]，於室溫以盤振盪器(Micro plate mixer NS-P、AS ONE公司製造)攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值顯示125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
本發明化合物編號(5μM)；A-002、A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012。
本發明化合物編號(20μM)；A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-016、B-003、B-004、B-005及B-007。
本發明化合物編號(40μM)；A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-016、A-017、B-001、B-003、B-004、B-005、B-006及B-007。
[試驗例2]本發明化合物對於SKOV3細胞增殖之作用評估2
與試驗例1相同，使進行前培養之SKOV3細胞懸濁於15%FBS/McCoy’s5a培養基(西格瑪奧瑞奇公司製造)後於96孔U底微盤(康寧公司製造、#4515)之洞分注，使每1孔成為700cells/90μL/孔。接著，將溶解於二甲亞碸(DMSO)之本發明化合物各個於上述培養基稀釋。於上述之細胞懸濁液90μL各個每次添加本稀釋液10μL使化合物之最終濃度成為10μM、20μM或40μM。於一部分之孔只添加DMSO作為對照組。各盤於CO2保溫器(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養4日。對於第4日之培養液添加ATP試藥100μL(CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造)，以盤振盪器(AS ONE公司製造，Micro plate mixer NS-P)於室溫攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值顯示125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
本發明化合物編號(10μM)；A-004A、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
本發明化合物編號(20μM)；A-001、A-002、A-004、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012、A-013及B-005。
本發明化合物編號(40μM)；A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012、A-013、A-016、B-004及B-007。
[試驗例3]本發明化合物對於NIH3T3細胞增殖之作用評估1
將小鼠胎兒纖維母細胞株NIH3T3(ATCC公司製造)於含有10%胎牛血清(以下簡稱為FCS。ATCC公司製造)之DMEM培養基(ATCC公司製造)進行前培養(單層培養)。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨。對於貼附細胞，係添加0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士軟片和光純藥公司製造)，於37℃保溫3分鐘後剝離。添加上述培養基、離心，再以相同之培養基再懸濁。
依照專利文獻1(WO2014/017513)之方法，將含有0.015%(w/v)脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三昌(股)公司製造)及10%(v/v)FCS之DMEM培養基(ATCC公司製造)之組成物於FCeM-series Preparation Kit(富士軟片和光純藥公司製造)進行調製。接著，使於上述調製之NIH3T3細胞懸濁於添加上述脫醯化結蘭膠之培養基組成物後分注於96孔平底超低貼附表面微盤(康寧公司製造，#3474)之孔，使每1洞成為2000cells/90μL/洞。將溶解於二甲亞碸之本發明化合物於上述培養基稀釋，將該稀釋液分別逐次添加10μL，以使本發明化合物之最終濃度成為10μM。於一部分之孔只添加二甲亞碸(DMSO)作為對照組。各盤於CO2保溫器(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養4日。對於第4日之培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造]，以盤振盪器(Micro plate mixer NS-P，AS ONE公司製造)於室溫攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值顯示125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於 下。
本發明化合物編號(10μM)；A-004。
[試驗例4]本發明化合物於MDCK細胞之作用之檢討
將狗腎小管上皮細胞(MDCK細胞，DS Pharma Biomedical公司製造)於含有10% FBS及1% NEAA之EMEM培養基進行前培養。將冷Matrigel(註冊商標)基質減少生長因子(Matrix Growth Factor Reduced)(以下，亦記載為Matrix GFR。康寧公司製造)於24孔盤各塗抹50μL擴散，於37℃保溫15分鐘使固化。將前述之MDCK細胞以11000cells/mL濃度懸濁於培養基，再加入冷Matrigel(註冊商標)Matrix GFR 20μL/mL，以0.9mL/孔播種。將溶解於培養基之本發明化合物每次少量添加0.1mL，使最終濃度成為10μM、20μM、40μM，於37℃、5%CO2之條件下，於保溫器培養6日。將不添加本發明化合物，只添加DMSO使最終濃度成為0.1%之試驗區作為對照組。6日後、以Cell3iMager(SCREEN Holdings公司製造)測定形成之Cyst之大小及個數。以下述之計算式算出直徑30μm以上之Cyst中直徑80μm以上Cyst之比例(%)。
直徑80μm以上之Cyst之比例(%)
=直徑80μm以上之Cyst數/直徑30μm以上之Cyst數×100
於作為對照之DMSO，直徑80μm以上之Cyst之比例為12%。此時，於各個之最終濃度，直徑80μm以上之Cyst之比例在20%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
本發明化合物編號(10μM)；A-002、A-004、A-004A及B-005。
本發明化合物編號(20μM)；A-002、A-004及B-001。
本發明化合物編號(40μM)；B-004。
[試驗例5]藉由共焦螢光顯微鏡觀察Cyst之形態
對於以添加含有試驗例3獲得之DMSO或A-004A(10μM)之培養基培養之Cyst之各個Matrix GFR以PBS洗淨後(1mL/孔)添加4%三聚甲醛/PBS(富士軟片和光純藥公司製造)(1mL/孔)，於室溫固定20分鐘。之後除去上清液，添加染色緩衝液[含有0.2% Triton X-100(西格瑪奧瑞奇公司製造)、0.05% Tween20(西格瑪奧瑞奇公司製造)之PBS]1mL/孔，靜置30分鐘，除去。添加浸透化緩衝液(0.5% Triton X-100(西格瑪奧瑞奇公司製造)/PBS)1mL/孔，於室溫保溫30分鐘。除去上清液，以染色緩衝液放置5分鐘，洗淨3次，添加阻隔緩衝液[1%牛血清白蛋白(BSA，西格瑪奧瑞奇公司製造)/染色緩衝液]0.5mL/孔，保溫30分鐘。除去上清液，於阻隔緩衝液將抗β連環蛋白抗體(BD Bioscience公司製造)稀釋100倍，以250μL/洞添加，於室溫保溫60分鐘。以染色緩衝液放置5分鐘，洗淨3次，於阻隔緩衝液將2次抗體(Alexa Fluor555，Thermo Fisher Scientific公司製造)及鬼筆環肽(Phalloidin)(Alexa Fluor 488，Thermo Fisher Scientific公司製造)分別稀釋250倍，以250μL/孔添加，於室溫、遮光下保溫60分鐘。以染色緩衝液放置5分鐘，洗淨3次後滴下VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories公司製造)，以共焦螢光顯微鏡(FV1200 IX83，奧林巴斯(Olympus)公司製造)進行觀察。觀察之結果確認於化合物A-004A存在下進行培養時形成正常形態之Cyst(第1圖)。
[試驗例6]本發明化合物對於抑制LATS1及LATS2活性之評估
對於本發明化合物進行LATS1及LATS2(Carna Biosciences公司製造)之抑制活性評估(算出激酶抑制率)。活性測定使用以下記載之激酶分析法進行。本發明化合物之試驗濃度係設定成使最終濃度成為100nM或1000nM。
數據之解析方法為將含有本發明化合物以外之反應組件之對照孔之平均信號作為0%抑制，將未添加酵素之平均信號作為100%抑制，從各化合物之試驗2孔之平均信號計算抑制率。
激酶分析法：
將以分析緩衝液(20mM HEPES、0.01% Triton X-100、2mM DTT、50μg/mL BSA、pH7.5)調製之2μL之本發明化合物2.5倍濃度之溶液、1μL之5倍濃度基質(SGKtide：NH2-CKKRNRRLSVA-COOH，SignalChem公司製造)、ATP(西格瑪奧瑞奇公司製造)、MgCl2(富士軟片和光純藥公司)溶液(最終濃度各個為10μM、400μM及5mM)及2μL之2.5倍濃度激酶溶液(LATS1或LATS2之最終濃度5μg/mL)於聚丙烯製384孔盤(Greiner Bio-One公司製造，#784900)之孔內混合，於室溫進行反應5小時。於該溶液中添加5μL之檢出溶液[Fluorospark(註冊商標)Kinase/ADP Multi-Assay Kit；富士軟片和光純藥公司製造]，於室溫進行反應30分鐘。接著，添加5μL之反應停止液[Fluorospark(註冊商標)Kinase/ADP Multi-Assay Kit；富士軟片和光純藥公司製造]將反應停止。之後以EnSpire(Perkin Elmer公司製造)定量反應溶液中之ADP濃度，檢出激酶反應。算出藉由本發明化合物之激酶抑制率，抑制率為40%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
對於LATS1之抑制效果：
本發明化合物編號(100nM)；A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-015、A-016、A-017、A-019及B-005。
本發明化合物編號(1000nM)；A-001、A-002、A-004、A-004A、A-004B、A- 005、A-006、A-007、A-007R、A-008、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-015、A-016、A-017、A-018、A-019、A-020、B-001、B-002、B-003、B-004、B-005、B-006、B-007及C-001。
對於LATS2之抑制效果：
本發明化合物編號(100nM)；A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-016、A-017及B-005。
本發明化合物編號(1000nM)；A-001、A-002、A-004、A-004A、A-004B、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-008、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-015、A-016、A-017、A-018、A-019、A-020、B-001、B-002、B-003、B-004、B-005、B-006、B-007及C-001。
[試驗例7]本發明化合物於人類間葉系幹細胞之作用
將源自骨髓之人類間葉系幹細胞(BM-hMSC，PromoCell公司製造)藉由使用間質幹細胞增殖培養基(PromoCell公司製造)之單層培養進行前培養。將上述細胞以HEPES-緩衝生理鹽水(Buffered Saline Solution)(PromoCell公司製造)洗淨後添加0.04%胰蛋白酶/0.03%EDTA溶液(PromoCell公司製造)，於室溫靜置3分鐘後剝離之，添加等量之胰蛋白酶中和溶液(PromoCell公司製造)將細胞回收。進行離心，除去上清液，於同培養基再懸濁。
依照專利文獻1(WO2014/017513)之方法，以FCeM-series Preparation Kit(富士軟片和光純藥公司製造)調製含有0.015%(w/v)脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌(股)公司製造)之間葉系幹細胞增殖培養基(PromoCell公司製造)之組成物。接著，使於上述調製之BM-hMSC細胞懸濁於添加上述脫 醯化結蘭膠之培養基組成物後播種於96孔平底超低貼附表面微盤(康寧公司製造，#3474)，使用成為6000cells/90μL/孔(3D)。不含脫醯化結蘭膠之培養基亦相同，將細胞懸濁，播種於96孔平底貼附表面微盤(康寧公司製造，#3585)及EZSPHERE(註冊商標)-SP 96洞微盤(AGC Techno Glass公司製造)使各個成為2000cells/90μL/孔(各個2D，EZSPHERE)。接著，將溶解於培養基之本發明化合物以10μL/孔添加以使最終濃度成為10或12.5μM，於37℃、5%CO2之條件下，於保溫器培養4日。將未加入本發明化合物，只添加DMSO最終濃度0.1%之群作為對照群。對於第4日之培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造]，以盤震盪器(Micro plate mixer NS-P，AS ONE公司製造)於室溫攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值為125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
2D培養條件
本發明化合物編號(10μM)；A-005及A-007。
本發明化合物編號(12.5μM)；A-002、A-001及A-004。
3D培養條件
本發明化合物編號(10μM)；A-005及A-007。
本發明化合物編號(12.5μM)；A-002、B-005、A-001及A-004。
EZSPHERE培養條件
本發明化合物編號(10μM)；A-005及A-007。
本發明化合物編號(12.5μM)；A-002、B-005、A-001及A-004。
[試驗例8]本發明化合物於各種細胞之作用
將各種細胞於如下所述之各個培養基進行前培養。源自人類肝癌之細胞株HuH-7(JCRB細胞庫製，含有10%FBS之D-MEM)、源自狗腎小管上皮細胞之細胞株MDCK(DS Pharma Biomedical公司製造，含有1%NEAA及10%FBS之E-MEM)、源自小鼠胎兒纖維芽細胞之細胞株C3H 10T1/2(理研生物資源研究中心(RIKEN BioResource Research Center)製、含有10%FBS之BME(ThermoFisher公司製造))、源自中國倉鼠卵巢之細胞株CHO-K1(DS Pharma Biomedical公司製造，含有10%FBS之Ham’s F12(富士軟片和光純藥公司製造))、源自非洲綠猴腎上皮細胞之細胞株Vero(JCRB細胞庫製，含有5%FBS之Medium199(西格瑪奧瑞奇公司製造))、人類臍帶靜脈內皮細胞株HUVEC(PromoCell公司製造，內皮細胞生長培養液(Endothelial Cell Growth Medium)(PromoCell公司製造))。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨。添加0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士軟片和光純藥公司製造)，於37℃保溫2至8分鐘，剝離之。HUVEC細胞為使用Detach Kit(PromoCell公司製造)於室溫保溫3分鐘，同樣地剝離之。添加各個培養基後進行離心，以相同培養基再懸濁後於各個單細胞回收。
依照專利文獻1(WO2014/017513)之方法，將含有0.015%(w/v)脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌(股)公司製造)之各培養基之組成物以FCeM-series Preparation Kit(富士軟片和光純藥公司製造)調製。接著，使於上述調製之各種細胞懸濁於添加上述脫醯化結蘭膠之培養基組成物或未添加之培養基後於96孔平底超低貼附表面微盤(康寧公司製造，含有脫醯化結蘭膠之培養 基)或96孔U底超低貼附表面微盤(康寧公司製造，未含脫醯化結蘭膠之培養基)之洞分注，使每孔成為700至2000cells/90μL/孔。將溶解於二甲亞碸之本發明化合物以上述培養基稀釋。將該稀釋液各個每次添加10μL使本發明化合物之最終濃度成為10μM。於一部分之孔只添加二甲亞碸(DMSO)作為對照組。各盤於CO2保溫器(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養4日。對於第4日之培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造]，以盤振盪器(Micro plate mixer NS-P，AS ONE公司製造)於室溫攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值為125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
U底超低貼附表面微盤：
本發明化合物編號(HuH-7細胞)；A-001、A-002、A-004、A-005及A-007。
本發明化合物編號(MDCK細胞)；A-001、A-002及A-004。
本發明化合物編號(10T1/2細胞)；A-001、A-002、A-004及B-005。
本發明化合物編號(Vero細胞)；A-001、A-004及A-007。
本發明化合物編號(HUVEC細胞)；A-001、A-002、A-004、A-005、A-007及B-005。
平底超低貼附表面微盤：
本發明化合物編號(HuH-7細胞)；A-001、A-002、A-004、A-005及A-007。
本發明化合物編號(MDCK細胞)；A-001、A-002、A-004及B-005。
本發明化合物編號(10T1/2細胞)；A-004。
本發明化合物編號(CHO-K1細胞)；A-005及A-007。
本發明化合物編號(Vero細胞)；A-001、A-004及A-007。
本發明化合物編號(HUVEC細胞)；A-001、A-002、A-004、A-005、A-007及B-005。
[試驗例9]本發明化合物於A431細胞懸滴培養法之作用
將源自人類上皮樣細胞癌之細胞株(A431，ATCC公司製造)藉由使用含有10% FBS及1% NEAA之EMEM培養基之單層培養進行前培養。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨。添加0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士軟片和光純藥公司製造)，於37℃保溫3分鐘，剝離之。添加培養基、離心，除去上清液。接著再懸濁於上述培養基使成為50000cells/mL，再於培養基添加溶解於DMSO之本發明中使用之化合物使最終濃度成為10μM。將本細胞懸濁液每次10μL播種於35mm皿(Falcon公司製造)之蓋子內面，合計15滴，作成液滴。此時，將添加DMSO之細胞懸濁液(DMSO濃度0.05%)每次10μL播種合計15滴作為對照組。將該蓋子回到添加2mLPBS之35mm皿，於37℃、5%CO2保溫器培養2日。將培養之液滴回收到1.5mL容量之管，添加培養基使最終量成為150μL。添加ATP試藥150μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造]，以盤振盪器(Micro plate mixer NS-P，AS ONE公司製造)於室溫攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值為125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
本發明化合物編號(10μM)；A-001、A-002、A-004、A-005、A-007R及A-010。
[試驗例10]本發明化合物對於人類多能性幹細胞(hiPS細胞)之作用
hiPS細胞253G1(從理化學研究所分讓)為將iMatrix-511(Nippi公司製造)於經塗覆之皿上使用StemFit(註冊商標)AK02N(味之素公司製造)培養基進行培養。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨後添加0.5mmol/L-EDTA/PBS溶液(NacalaiTesque公司製造)，於37℃保溫8-10分鐘，剝離之。添加上述培養基，進行離心除去上清液，以相同之培養基再懸濁。使上述細胞懸濁於含有10μM之Y-27632(富士軟片和光純藥公司製造)之培養基，以16000cells/180μL/孔潘種於96孔EZSPHERE-SP盤(AGC TECHNO GLASS公司製造)。播種後將溶解於二甲亞碸之本發明化合物於上述培養基稀釋，將該稀釋液各個每次添加20μL使本發明化合物之最終濃度成為12.5μM。於一部分之孔只添加二甲亞碸(DMSO)作為對照組。各盤於CO2保溫器(37℃、5%CO2)內培養，將每日半量(100μL)之培養基上清液邊更換為以上述濃度添加化合物之新的培養基邊培養4日。使用微量吸管從第4日之培養液200μL平穩的將上清液100μL吸引除去，添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造]，以盤振盪器(Micro plate mixer NS-P，AS ONE公司製造)於室溫攪拌2分鐘後靜置10分鐘。將100μL移至96孔平底白色盤(康寧公司製造，#3912)，以Enspire(Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。將對照組之RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時，於各個之最終濃度，相對值為125%以上之本發明化合物之化合物編號記載於下。
本發明化合物編號(12.5μM)；A-001、A-002、A-004及A-005。
[試驗例11]本發明化合物抑制YAP磷酸化之作用
將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司製造)以含有15%FBS之McCoy’s5a培養基(西格瑪奧瑞奇公司製造)進行前培養(單層培養)。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨。對於貼附細胞，係添加0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士軟片和光純藥公司製造)，於37℃保溫3分鐘後剝離。添加上述培養基、離心，以相同之培養基再懸濁。
依照專利文獻1(WO2014/017513)之方法，將含有0.015%(w/v)脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌(股)公司製造)之含有10%FBS之DMEM培養基(不含Phenol-red，富士軟片和光純藥公司製造)之組成物以FCeM-series Preparation Kit(富士軟片和光純藥公司製造)調製。接著，使於上述調製之各種細胞懸濁於添加上述脫醯化結蘭膠之培養基組成物(3D培養條件)或未添加之培養基(2D培養條件)後以50μL/孔(康寧公司製造，96孔平底盤，#3585，(2D培養條件)或25μL/洞(康寧公司製造，96孔低貼附平底盤、#3474)播種，使成為10000cell/孔。於37℃、5%CO2保溫器靜置，將從播種起3小時後以最終濃度2倍或6倍之濃度藉由培養基稀釋之本發明化合物、DMSO或只有培養基以50μL/孔(2D培養條件)、5μL/孔(3D培養條件)添加於盤，將各化合物之最終濃度作成10μM。再於37℃、5%CO2保溫器培養1小時後於2D培養條件，將上清液進行抽吸，添加輔助裂解緩衝液(supplemented Lysis緩衝液)(1倍濃度，Cisbio公司製造，YAP-total套組或YAP phospho-S27套組)50μL，於3D培養條件，於培養上清液中添加輔助裂解緩衝液(4倍濃度)10μL，以盤振盪器攪拌30分鐘後將盤離心，將上清液16μL移至384孔白色盤(康寧公司製造，#4512)，添加套組 附屬之各抗體溶液(pYAP d2抗體或Total-YAP d2抗體及pYAP Cryptate抗體或Total-YAP Cryptate抗體)合計4μL/孔，於室溫靜置一晚。作為空白對照組，未進行化合物刺激，於細胞只添加pYAP Cryptate抗體或Total-YAP Cryptate抗體，進行相同之處理。隔日於EnVision(Perkin Elmer公司製造)之HTRF模式測定665nm及615nm波長。
將獲得之信號以如下所述計算。Ratio=signal(665nm)/signal(615nm)×10000、△R=Signal(Ratio)-Background fluorescence。將化合物未添加群(無處理)之△R作為100%時之各化合物之相對磷酸化YAP量或總YAP量表示於表7及8(2D培養)、表9及10(3D培養)。藉由本結果顯示本發明化合物於2D、3D兩培養條件具有抑制YAP磷酸化之作用。
[表7]
Figure 109102822-A0202-12-0078-37
[表8]
Figure 109102822-A0202-12-0079-38
[表9]
Figure 109102822-A0202-12-0079-39
[表10]
Figure 109102822-A0202-12-0079-40
[試驗例12]對於HeLa、人類初代表皮角化細胞及HUVEC細胞之貼附促進作用
將源自各種人類之細胞使用以下表示之各個培養基進行培養。源自人類子宮頸癌之細胞株HeLa(ATCC公司製造，含有10%FBS(康寧公司製造)之DMEM(和光純藥工業公司製造))、人類臍帶靜脈內皮細胞株HUVEC(PromoCell 公司製造、內皮細胞生長培養液(Endothelial Cell Growth Medium)(PromoCell公司製造))、人類初代表皮角化細胞(American Type Culture Collection(ATCC)，#PCS-200-010，添加角質細胞用添加物套組(ATCC，#PCS-200-040)之表皮細胞系基礎培養基(ATCC，#PCS-200-030)。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨後HeLa為添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業公司製造)於37℃保溫3分鐘、HUVEC及人類初代表皮角化細胞為使用DetachKit(PromoCell公司製造)，於室溫保溫3分鐘，剝離之，添加各個培養基，進行離心，除去上清液後以相同之培養基再懸濁後一部分以台盼藍(trypan blue)(和光純藥工業公司製造)懸濁，以TC-20(BIO-RAD公司製造)計算活細胞數。
將溶解於DMSO之本發明化合物溶液添加於HeLa及HUVEC懸濁之各培養基，使最終濃度成為10μM，各以8000cells/100μL/孔播種於96孔貼附盤(康寧公司製造，#3585)。又，將溶解於DMSO之本發明化合物溶液添加於人類初代表皮角化細胞懸濁之各培養基，使最終濃度成為10μM，各以19000cells/190μL/孔播種於48孔貼附盤(康寧公司製造，#3548)。對照組為播種添加DMSO之細胞懸濁液(DMSO終濃度0.1%)。將本盤於37℃、5%CO2保溫器靜置培養30分鐘(HeLa及HUVEC)或60分鐘(人類初代表皮角化細胞)後藉由將培養液抽吸，使用PBS洗淨2次，藉此除去未貼附於培養盤之細胞後，將各個培養基以100或200μL/洞添加。接著，對於培養液等量添加ATP試藥(CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測，Promega公司製造)懸濁之，於室溫靜置10分鐘。再以EnSpire(PerkinElmer公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定貼附於盤之細胞數。將只添加DMSO之群之RLU值(ATP測定，發光強度)作為100%時，顯示120%以上之值者表示於下。藉由本結果顯示 本發明化合物具有細胞貼附促進之效果。
對於HeLa之細胞貼附促進效果(120%以上)：本發明化合物編號；A-001、A-002、A-004、A-005、A-007及B-005。
對於HeLa之細胞貼附促進效果(150%以上)：本發明化合物編號；A-001、A-002、A-007及B-005。
對於HUVEC之細胞貼附促進效果(120%以上)：本發明化合物編號；A-001、A-002、A-004、A-007及B-005。
對於人類初代表皮角化細胞之細胞貼附促進效果(200%以上)：本發明化合物編號；A-004、A-004A及A-007。
[試驗例13]使用人類角膜上皮細胞之細胞增殖試驗
人類初代角膜上皮細胞(ATCC，#PCS-700-010)為使用添加角膜上皮細胞系添加物套組(ATCC，#PCS-700-040)之角膜上皮細胞系基礎培養基(ATCC，#PCS-700-030)，以單層培養法進行前培養。使角膜上皮細胞懸濁於相同之培養基後各個添加溶解於DMSO之本發明化合物使最終濃度成為10μM(於A-011及A-012最終濃度為5μM)、於單層培養(2D培養條件)以成為700cells/64μL/孔播種於96孔平底盤(康寧公司製造，#3585)。於三次元培養法(3D培養條件)以成為700cells/64μL/洞播種於96孔U底細胞低貼附盤(康寧公司製造，#4520)。將該等盤於37℃、5% CO2保溫器培養4日。添加DMSO使最終濃度成為0.1%作為對照組。培養後使用ATP試藥(Promega公司製造，CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測)計測活細胞數。對於平底盤之培養液將ATP試藥以64μL/孔添加而使其懸濁，將懸濁液100μL/孔移至分析用白色盤(康寧公司製造，#3912)，於室溫靜置10分鐘後使用平板讀數器(珀金埃爾默公司製造，EnSpire)測定發光量。
對於測定之發光量，算出對於對照群(DMSO)之相對值時，於添加下述編號之化合物，發光量於2D培養條件增加1.2倍以上，於3D培養條件增加4倍以上。亦即，藉由添加下述之化合物，細胞數增加1.2倍以上，顯示本發明化合物具有人類角膜上皮細胞的增殖促進效果。
細胞數增加1.2倍以上之本發明化合物編號(2D培養條件)：A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012及A-016。
細胞數增加2倍以上之本發明化合物編號(2D培養條件)：A-004、A-004A及A-007。
細胞數增加4倍以上之本發明化合物編號(3D培養條件)：A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
[試驗例14]使用牛角膜內皮細胞之細胞增殖試驗
將牛角膜內皮細胞株BCE C/D-1b(ATCC，#CRL-2048)使用添加10%牛血清(ATCC，#30-2030)之DMEM(ATCC，#30-2002)進行前培養。使角膜內皮細胞懸濁於相同之培養基後於單層培養法(2D培養條件)播種於96孔平底盤(康寧公司製造，#3585)使成為700cells/90μL/孔。於三次元培養法(3D培養條件)播種於96孔U底細胞低貼附盤(康寧公司製造，#4520)使成為700cells/90μL/孔。接著，以10μL/孔添加溶解於DMSO之本發明化合物使最終濃度成為10μM，於37℃、5% CO2保溫器培養4日。添加DMSO使最終濃度成為0.1%作為對照組。培養後使用ATP試藥(Promega公司製造，CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測)計測活細胞數。對於培養液，添加ATP試藥100μL/洞，懸濁之，將懸濁液100μL/孔移至分析用白色盤(康寧公司製造，#3912)。於室溫靜置10分鐘後使用平板讀數器(珀金埃爾默公司製造、EnSpire)測定發光量。
對於測定之發光量，於以2D及3D各個之培養條件算出對於對照群(DMSO)之相對值，於添加下述之化合物，發光量於2D增加1.2倍以上、於3D增加2倍以上。亦即，藉由添加下述編號之化合物，細胞數增加2倍以上。由此顯示本發明化合物具有角膜內皮細胞的增殖促進效果。
細胞數增加1.2倍以上之本發明化合物編號(2D培養條件)：A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
細胞數增加4倍以上之本發明化合物編號(3D培養條件)：A-007、A-007R及A-012。
細胞數增加3倍以上之本發明化合物編號(3D培養條件)：A-004A、A-007、A-007R、A-010及A-012。
細胞數增加2倍以上之本發明化合物編號(3D培養條件)：A-004、A-004A、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
[試驗例15]使用人類初代表皮角化細胞之細胞增殖試驗
將人類初代表皮角化細胞(ATCC，#PCS-200-010)使用添加角質細胞用添加物套組(ATCC，#PCS-200-040)之表皮細胞系基礎培養基(ATCC，#PCS-200-030)，以單層培養法進行前培養。使表皮角化細胞懸濁於相同之培養基後各個添加溶解於DMSO之本發明化合物使最終濃度成為10μM，播種於96孔U底細胞低貼附盤(康寧公司製造，#4520)使成為700cells/64μL/孔。於37℃、5% CO2保溫器培養4日。添加DMSO使最終濃度成為0.1%作為對照群。培養後使用ATP試藥(Promega公司製造，CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞活力檢測)計測活細胞數。對於平底盤之培養液添加ATP試藥64μL/孔使懸濁，將懸濁液100μL/孔移至分析用白色盤(康寧公司製造，#3912)。於室溫靜置10分鐘後使用平板讀數器(珀 金埃爾默公司製造，EnSpire)測定發光量。
對於測定之發光量，算出對於對照群(DMSO)之相對值，於添加下述編號之化合物，發光量增加4倍以上。亦即，藉由添加下述編號之化合物，細胞數增加4倍以上。由此顯示本發明化合物具有角膜內皮細胞的增殖促進效果。
細胞數增加4倍以上之本發明化合物編號：A-004、A-004A及A-007。
細胞數增加6倍以上之本發明化合物編號：A-004A及A-007。
[試驗例16]本發明化合物對於SKOV3細胞、人類初代角膜上皮細胞及人類初代表皮角化細胞基因表現之作用
與試驗例13(評估使用人類初代角膜上皮細胞之增殖)相同，將人類初代角膜上皮細胞(ATCC，#PCS-700-010)使用添加角膜上皮細胞系添加物套組(ATCC，#PCS-700-040)之角膜上皮細胞系基礎培養基(ATCC，#PCS-700-030)，以單層培養法進行前培養。又，對於人類初代表皮角化細胞亦與試驗例15(評估人類初代表皮角化細胞之增殖)相同，將人類初代表皮角化細胞(ATCC，#PCS-200-010)使用添加角質細胞用添加物套組(ATCC，#PCS-200-040)之表皮細胞系基礎培養基(ATCC，#PCS-200-030)以單層培養法進行前培養。將角膜上皮細胞及表皮角化細胞播種於24孔平底盤(康寧公司製造，#3526)使成為50,000cells/380μL/孔，於37℃、5% CO2保溫器培養24小時。接著，更換為添加溶解於DMSO之本發明化合物使最終濃度成為10μM之培養基(對於A-011及A-012，最終濃度為5μM)，再培養24小時。培養後除去細胞培養液，添加D-PBS(富士軟片和光純藥(股)公司製造，#049-29793)500μL/孔、除去。接著，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司製造)將總RNA(核糖核酸)從細胞分離。對於本RNA，實施使用 TaqmanAssay(AppliedBioSystems公司製造)之基因表現分析，分析藉由添加本發明化合物，YAP及TAZ蛋白質下游之人類基因表現之變化。以下表示分析之基因名及使用之探針之AssayID。
基因名 AssayID
GAPDH Hs02758991_g1
CYR61 Hs00155479_m1
ANKRD1 Hs00173317_m1
CCND1 Hs00765553_m1
將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司製造)於含有15%FBS之McCoy’s5a培養基(西格瑪奧瑞奇公司製造)進行前培養(單層培養)。將處於對數生長期之上述細胞以PBS洗淨。對於貼附細胞，係添加0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士軟片和光純藥公司製造)，於37℃保溫3分鐘後剝離。添加上述培養基、離心，以相同之培養基再懸濁。
依照專利文獻1(WO2014/017513)之方法，將含有0.015%(w/v)脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌(股)公司製造)之含有15%FBS之McCoy’s5a培養基之組成物以FCeM-series Preparation Kit(富士軟片和光純藥公司製造)調製，添加EGF(PeproTech公司製造)使最終濃度成為30ng/mL。接著，使於上述調製之細胞懸濁於添加上述脫醯化結蘭膠之培養基組成物後播種於超低貼附表面24孔盤(康寧公司製造，#3473)，使成為300000cells/1mL/孔。於37℃、5%CO2保溫器靜置一晚後於盤中添加本發明化合物、DMSO或只有培養基，將各化合物之最終濃度作成10μM。化合物添加後24小時從盤中將細胞及培養 液回收於管中。添加冷D-PBS(富士軟片和光純藥(股)公司製造，#049-29793)，進行400g、3分鐘離心，除去上清液。接著使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司製造)將總RNA(核糖核酸)從細胞分單。對於本RNA，實施使用TaqmanAssay(AppliedBioSystems公司製造)之基因表現分析，分析藉由添加特定化合物，YAP及TAZ蛋白質下游之人類基因表現之變化。以下表示分析之基因名及使用之探針之AssayID。
基因名 AssayID
GAPDH Hs02758991_g1
CYR61 Hs00155479_m1
ANKRD1 Hs00173317_m1
CCND1 Hs00765553_m1
CTGF Hs00170014_m1
對於獲得之表現量算出對於GAPDH之相對值。此時算出將添加DMSO時之相對值(表現量)作為1時添加本發明化合物時之相對表現量。該結果與對照群(DMSO)比較，藉由添加本發明化合物，相對表現量增加。亦即，本發明化合物關於藉由YAP蛋白質調控表現之基因具有提昇其表現量之效果。
CYR61相對表現量增加2倍以上之本發明化合物編號(人類初代角膜上皮細胞)：A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012及A-016。
CYR61相對表現量增加2倍以上之本發明化合物編號(人類初代表皮角化細胞)：A-004、A-004A及A-007。
CYR61相對表現量增加30倍以上之本發明化合物編號(SKOV3細胞)：A- 004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
ANKRD相對表現量增加2倍以上之本發明化合物編號(人類初代角膜上皮細胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
ANKRD相對表現量增加5倍以上之本發明化合物編號(人類初代角膜上皮細胞)：A-004、A-004A、A-007及A-007R。
ANKRD相對表現量增加5倍以上之本發明化合物編號(人類初代表皮角化細胞)：A-004、A-004A及A-007。
ANKRD相對表現量增加100倍以上之本發明化合物編號(SKOV3細胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
CCND1相對表現量增加1.5倍以上之本發明化合物編號(人類初代角膜上皮細胞)：A-004、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012及A-016。
CCND1相對表現量增加1.5倍以之本發明化合物編號(人類初代表皮角化細胞)：A-004、A-004A及A-007。
CCND1相對表現量增加4倍以上之本發明化合物編號(SKOV3細胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
CTGF相對表現量增加20倍以上之本發明化合物編號(SKOV3細胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
[試驗例17]本發明化合物對於YAP蛋白質及TAZ蛋白質的核內移行之作用
對於本發明化合物進行對於YAP蛋白質及TAZ蛋白質的核內移行之評估。核內移行使用人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司製造)，藉由使用下述記載之OperettaCLS(PerkinElmer公司製造)之影像分析進行。本發明化 合物之試驗濃度為添加以使最終濃度成為10μM。
影像分析：
根據DS Pharma Biomedical公司之推薦計劃書，將培養之人類卵巢癌細胞株SKOV3播種於環烯烴底面之96孔盤(PerkinElmer公司製造，CellCarrier-Ultra)，使成為15,000細胞/90μL/孔，於CO2保溫器(37℃、5%CO2)內培養1日。培養後各個添加溶解於DMSO之本發明中使用之特定化合物之溶液。再於37℃之CO2保溫器培養4小時，將培養基更換為4%三聚甲醛，於室溫靜置10分鐘，將細胞固定。對於經固定之細胞，使用AlexaFluor(R)647標識YAP抗體(CellSignalingTechnology公司製造)、抗小鼠TAZ(D-8)抗體(SantaCruz公司製造)、AlexaFluor(R)555標識抗小鼠IgG抗體(ThermoFisherScientific公司製造)依照CellSignalingTechnology公司之推薦計劃書進行免疫染色，再以10μg/mL之Hoechst33342溶液將細胞核染色。
使用OperettaCLS之20倍對物鏡，以每1孔9視野攝影。從獲得之螢光像使用分析軟體Harmony(PerkinElmer公司製造)各個鑑定細胞核領域及細胞質領域，抽出各領域內YAP蛋白質-AlexaFluor(R)647螢光強度及TAZ蛋白質-AlexaFluor(R)555螢光強度。從抽出之值算出細胞核領域之螢光強度對於細胞質領域之螢光強度之比。此次，螢光強度比為1.4以上時，定義YAP蛋白質及TAZ蛋白質為向核內移行之細胞集團，算出其比例。
對於算出之細胞集團比例，於算出對於對照群(DMSO)之相對值時，於添加下述編號之化合物，YAP蛋白質細胞集團增加5倍以上，TAZ蛋白質細胞集團增加1.5倍以上。由此明瞭本發明化合物具有促進YAP蛋白質及TAZ蛋白質的核內移行之作用。
YAP蛋白質的核內移行之細胞集團增加5倍以上之本發明化合物編號：A-004、A-004A及A-007。
TAZ蛋白質的核內移行之細胞集團增加1.5倍以上之本發明化合物編號：A-004、A-004A及A-007。
[試驗例18]對於小鼠肝部分切除模型肝重量增加之作用
以下述記述之方法製作將小鼠肝臟部分切除之肝部分切除模型，比較剛切除後之肝重量與切除3日後之肝重量，評估本發明化合物增加肝重量之效果。
評估試樣：
評估0.5w/v%甲基纖維素水溶液(0.5%MC，富士軟片和光純藥製造)及A-007。A-007為懸濁於0.5%MC調製使最終濃度成為1mg/mL。
步驟：
小鼠使用BALB/cAnNCrlCrlj、5週齡、雄性，購自日本Charles River(股)公司。0.5%MC投予-對照群為於腹腔內單次投予0.5%MC 10mL/kg，24小時後將肝臟全部摘出，測定肝重量(n=3)。此處，對照群係指未摘除肝臟之群。又，0.5%MC-肝切除群為於腹腔內每24小時投予0.5%MC 10mL/kg，連續投予4次。
剛投予第2次後即刻於異氟醚(Interbet(股)公司製造)麻醉下剖腹，使用縫線將肝臟葉之根結紮，切除經結紮之葉之頭，最終切除約肝臟之30%。之後閉腹，從最後投予起24小時後摘出全部之肝臟，測定肝重量(n=3)。A-007投予-對照群為於腹腔內單次投予10mg/kg之A-007，於24小時將肝臟全部摘出，測定肝重量(n=3)。又，A-007-肝切除群為於腹腔內每24小時投予10mg/kg之A-007，連續投予合計4次。第2次剛投予後於異氟醚麻醉下剖腹，使用縫線將肝臟葉之 根結紮，切除經結紮之葉之頭，最終切除約肝臟之30%。之後閉腹，從最後投予起24小時後摘出全部之肝臟，測定肝重量(n=3)。
本試驗之結果將投予0.5%MC、A-007之肝部分切除小鼠之肝體重比變化表示於第2圖。如第2圖所示，明瞭A-007具有促進肝重量增加之作用。
[實施例19]於大腸炎模型小鼠之炎症抑制效果
如以下之記述製作投予聚葡萄糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium，DSS，富士軟片和光純藥製造)之大腸炎模型。又，大腸炎之評估利用大腸之長度作為形態學參數，對應炎症程度，大腸短小化。因此，比較大腸之長度評估化合物抑制炎症之效果。
評估試樣：
緩衝液使用於0.5w/v%甲基纖維素水溶液(富士軟片和光純藥製造)中添加二甲亞碸(富士軟片和光純藥製造)使成為1v/v%者。將化合物A-004A懸濁於上述緩衝液調製使成為5mg/mL。
步驟：
小鼠使用C57BL/6NCrl、6週齡、雄性，購自日本Charles River(股)公司。飲水為蒸餾水或2.5w/v%DSS水溶液自由飲水。將DSS飲水開始日作為第1日，飲水至第8日。從第1日起每24小時腹腔內投予化合物A-004A 50mg/kg作為陰性對照以同樣之方法只投予緩衝液。於第8日解剖，摘出大腸，測定大腸長度。各群以3至4例實施。
本試驗之結果將投予緩鵆液、化合物A-004A之小鼠大腸長度表示於第3圖。如第3圖所示，DSS飲水-緩衝液投予群與蒸餾水飲水群比較，大 腸變短，DSS飲水-化合物A-004A投予群的大腸短小化受到抑制。從以上明膫化合物A-004A具有抑制源自DSS之大腸炎發症之效果。
[實施例20]對於小鼠腸管類器官培養之作用
從日本Charles River(股)公司購入7週齡雄C57BL/6N小鼠。馴養期後於麻醉下摘出小腸及結腸。將摘出之小腸、結腸依照IntestiCult(商標)Organoid Growth Medium之計劃書加密回收。具體而言，為以1mL之冷PBS將腸管內洗淨後縱向切開，以1mL冷PBS洗淨3次。將腸管移至裝滿冷PBS之10cm培養皿，再度充分清洗，於放入15mL冷PBS之50mL管子邊切成2mm斷片邊移開。以10mL微量分注器將斷片攪拌3次，靜置30秒鐘後(斷片沈澱後)平穩的除去上清液，反覆操作15次以上。除去上清後以25mL之Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL Technologies公司製造)於室溫邊以20rpm攪拌15分鐘(小腸)或20分鐘(結腸)邊保溫。靜置，於斷片沈澱後除去上清液，以10mL之0.1%BSA/冷PBS攪拌3次，斷片沈澱後取出上清液，通過70μm之細胞過濾器回收於管。再重複操作3次，作成Flaction 1至4。於4℃進行290g×5分鐘離心，除去上清液，再次懸濁於10mL之0.1%BSA/冷PBS，移至15mL管。於4℃進行200g×3分鐘離心，除去上清液，作成顆粒。於前述之顆粒添加10mL之冷DMEM/F-12培養基，再懸濁，將其中之1mL移至6孔盤，於顯微鏡下觀察，各個決定含有加密多之Flaction。於顯微鏡下計算懸濁液10μL中含有之加密數，決定濃度，分注於15mL管使成為800加密/管，於4℃進行200g×5分鐘離心。除去上清液，於各管添加200μL之IntestiCult(商標)Organoid Medium攪拌之。再添加200μL Matrigel GFR(康寧公司製造)使混合後於預溫為37℃之24孔盤中各分注50μL，於37℃保溫器保溫10分鐘，固化成圓頂狀。於各孔添加750μL 之IntestiCult(商標)Organoid Medium，添加溶解於DMSO之A-007使最終濃度為10μM(以DMSO換算為0.025%以下)。此時，於一部分之洞只添加DMSO作為對照組。接著，於37℃、5%CO2保溫器靜置培養，每2至3日更換培養基。經時性以Cell3iMager duos(SCREEN HOLDINGS公司製造)影像解析類器官。影像分析為測定直徑30-200μm之加密數作為於培養第1日之播種加密數，之後經時性的計數成長為70μm以上者作為類器官，算出從加密之類器官形成率。此時，算出同時計測之類器官之直徑平均值。以下表示類器官形成率(%)及平均直徑(μm)。
[表11]
Figure 109102822-A0202-12-0092-42
又，除去培養第9日之小腸類器官及培養第21日之結腸類器官之培養上清液，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司製造)將總RNA(核糖核酸)從細胞分離。對於本RNA使用寶生(Takara-Bio)公司製造之PrimeScript RT Master Mix合成cDNA，實施使用TaqmanAssay(AppliedBioSystems公司製造)之基因表現分析，分析於添加DMSO或A-007之類器官，小腸、結腸或腸管特異性基因之表現量。再進行與為內部標準之甘油醛3-磷酸脫氫酶基因(Gapdh)之表現量之比較。將確認Gapdh之表現量作為1時相對表現量確認為0.5以上之基因及試樣表示於下。
小腸類器官小腸特異性基因Lyz1；DMSO、A-007。
結腸類器官結腸特異性基因Muc2；DMSO、A-007。
小腸類器官及結腸類器官腸管特異性基因Vil1；DMSO、A-007。
從以上之結果確認A-007大幅度改善小鼠小腸及結腸類器官之形成率，平均直徑亦增大。又，形成之小腸及結腸類器官確認於各個部位表現特異性之標識物基因。從以上明瞭A-007顯示促進腸管類器官形成之效果。
[產業上之利用可能性]
根據本發明可達成細胞增殖的促進。藉由本發明調製之細胞等，於例如藥物研發領域非常有用。又，根據本發明，可治療伴隨細胞增殖不全之疾病或組織損傷。
本專利申請以於日本提出之專利申請之特願2019-014899(申請日期：2019年1月30日)及特願2019-103322(申請日期：2019年5月31日)為基礎，該等內容全包含於本說明書中。
Figure 109102822-A0202-11-0002-3

Claims (20)

  1. 一種式(I)表示之醯肼化合物或其鹽，
    Figure 109102822-A0202-13-0001-64
    式中，X為-N(R5)C(R2)(R3)-、-C(R2)(R3)N(R5)-或-C(R2)(R3)O-，
    W表示下列D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11或D-12之任一者所示之環，
    Figure 109102822-A0202-13-0001-65
    R1為C1至C6烷基或鹵(C1至C6)烷基，
    R2及R3各自獨立地為氫原子或C1至C6烷基，
    R4及R5各自獨立地為氫原子或C1至C6烷基，
    Ra為羥基、硝基、鹵素原子、C1至C6烷基、鹵(C1至C6)烷基、C2至C6烯基、C2至C6炔基、C1至C6烷氧基、鹵(C1至C6)烷氧基、C1至C6烷硫基、鹵(C1至C6)烷硫基、C1至C6烷基亞磺醯基或C1至C6烷基磺醯基，
    m為0、1、2、3或4，
    p為0、1、2或3，
    r為0或1。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
    X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
    W為D-1、D-2或D-3之任一者所示之環，
    R4及R5為氫原子，
    Ra為C1至C6烷基或鹵素原子，
    m為0或1，
    r為0。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
    X為-N(R5)C(R2)(R3)-，
    W為D-2、D-4、D-5、D-6或D-7之任一者所示之環，
    R2、R3、R4及R5為氫原子，
    p、m及r為0。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
    X為-C(R2)(R3)O-，
    W為D-2所示之環，
    m及r為0。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之醯肼化合物或其鹽，其中，
    X為-C(R2)(R3)N(R5)-，
    W為D-8、D-9、D-10、D-11或D-12之任一者所示之環，
    R4及R5為氫原子，
    p為0。
  6. 一種培養基添加用組成物，為含有如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之培養基添加用組成物，其為細胞增殖促進用者。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之培養基添加用組成物，其中，細胞為選自由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所組成之群組。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之培養基添加用組成物，其係用於球狀體形成、囊胞形成或類器官形成的促進。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之培養基添加用組成物，其係用於移植用細胞或移植用類器官的製造。
  11. 如申請專利範圍第6項所述之培養基添加用組成物，其為細胞貼附促進用者。
  12. 一種細胞培養之培養基，係含有如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
  13. 一種促進細胞增殖的方法，包含向細胞培養之培養基添加如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中，細胞為選自由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所組成之群組。
  15. 一種促進細胞貼附的方法，包含向細胞培養之培養基添加如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
  16. 一種激酶抑制劑，包含如申請專利範圍第1項至第5項中任一項 所述之醯肼化合物或其鹽。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之激酶抑制劑，其中，激酶為LATS。
  18. 一種Hippo信號傳達路徑抑制劑，包含如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
  19. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之醯肼化合物或其鹽。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之醫藥組成物，其係用於眼、肝臟、皮膚或腸之疾病的治療。
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