JP2022191370A - 線維化抑制作用を有する細胞シート - Google Patents
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Abstract
Description
細胞シートは、患者の組織または確立された細胞株から採取した細胞を培養し、シート状にしたものである。培養して増やした一定量の細胞がそれぞれ結合して単層のシートになっている。細胞シートの下部には細胞外マトリックスなどの接着タンパク質が維持されているため、外科的な縫合をすることなく細胞シートが移植組織に生着する。生着した細胞シートは液性因子を放出し再生治癒を促進する。これまでに角膜・心臓・食道などへのヒト移植・再生治療が実施されており、今後ますます応用範囲が拡大していくものと期待される。
本願発明者らは、Wnt/β-カテニンシグナル抑制作用のある化合物を用いて、間葉系幹細胞および患者骨髄由来間葉系幹細胞を肝機能を有する細胞に分化させ、該分化させた細胞をシート化し、該シートを複数枚重ねて、マウスにて肝障害を抑制したことを報告している(特許文献1)。
肝障害の一症状として、組織の線維化が挙げられる。肝臓において線維化が進むと、肝硬変、肝癌になる。そのほか、線維化は肺、腎臓、心臓、皮膚などにも生じる。非特許文献1には、線維化治療に関するものとして、ピルフェニドンの臨床試験の結果が記載されている。
発明者らによる前述の細胞シートはヒトにおいて所定の治療効果を得るために、直径15cmの培養皿で培養してなる細胞シートを2もしくは3枚重ねたものを、複数個所適用することが必要であると推定されている。
また、上記文献では間葉系幹細胞から分化させた肝細胞を用いている。分化させた細胞シートにおいて分化細胞数を全ての試料において厳密に管理・把握することは難しく、ゆえに上記のような細胞シートを製品としての管理することは労力が必要とされる。
上記のような事情から、再生医療においては、対象検体あたりのコストが嵩む傾向にあり、このことが再生医療等製品の実現及び普及の足かせとなっている。
該方法は、骨髄単核球細胞をWnt/β-カテニンシグナル抑制効果のある化合物で処理した場合にも同様の傾向を示し、この場合更に線維化抑制効果は強固になることを発見し、本願発明に至った。
即ち、本開示の一態様によれば、:
骨髄単核細胞からなる細胞シートであって、該細胞シートは骨髄単核細胞の懸濁液から骨髄単核細胞をシート化し、縮小させた後、浮遊培養してなる細胞シートが提供される。
該細胞シートにおいて、骨髄単核細胞は接着性骨髄単核細胞でもよい。
該細胞シートにおいて、骨髄単核細胞は間葉系幹細胞でもよい。
該細胞シートにおいて、骨髄単核細胞をシート化するときに、Wnt/β-カテニンシグナル抑制作用のある化合物に曝してもよく、該化合物はIC-2でもよい。
該細胞シートは、線維化抑制効果が高く、各種組織に適用可能である。
該細胞シートは、MMP活性が高く、肝疾患治療用細胞シートとして有用である。
本開示において、該細胞シートを積層してなる線維化治療用積層細胞シートも提供される。
該方法において、骨髄単核細胞は、接着性骨髄単核細胞でもよく、間葉系幹細胞でもよい。また、該方法の骨髄単核細胞の懸濁液を温度応答性培養皿に播種し、インキュベートする工程において、培養液がWnt/β-カテニンシグナル抑制作用のある化合物を含んでいてもよい。
該方法において、Wnt/β-カテニンシグナル抑制作用のある化合物はIC-2でもよい。
該方法において、得られた細胞シートは、各種組織に適用可能である。
該方法において得られた細胞シートは、肝疾患治療用細胞シートとして有用である。
理論により拘束されることを意図するものではないが、本開示の細胞シートは、シート化した後に単層のコンフルエント状態を維持して、縮小させることにより、細胞膜間のギャップジャンクションが強固になった上に、一定期間浮遊培養することで、細胞シートを構成する細胞間の小分子代謝産物やイオン等を共有させることにより細胞間の活動を強調させているものと考えられる。
ここにおいて、浮遊培養期間における細胞シートの変質・劣化が問題となる。例えば、骨格筋芽細胞からなる虚血性心疾患治療用細胞シートは、調整後15℃から25℃で保存した場合、10時間以内に患者に適用することが求められている。本願発明者らは、骨髄単核細胞から細胞シートを本開示に記載のように作製した場合、作製後少なくとも8時間、あるいは24時間まで、20℃、5%CO2環境下で静置させた場合も、高いMMP活性を示す細胞シートを確認している。
本開示の細胞シートは骨髄単核細胞から作製することができる。骨髄には血管内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞などに分化可能とされる造血系・間葉系由来の幹細胞が含まれている。
骨髄細胞を特定の条件で培養すると、接着性細胞の間質細胞層が基材に付着し、増殖する。間質細胞層は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、内皮細胞、およびマクロファージなどの多様な細胞型から構成されている。本開示において、骨髄単核細胞とは、骨髄液から密度勾配遠心分離法により分離した分画中にある細胞群を意味する。骨髄単核細胞を継代培養することにより間質細胞層の細胞を増やして細胞シートを作成することも可能である。
骨髄単核細胞は、ヒトまたは動物骨髄から採取するほか、ロンザジャパン株式会社等から入手可能である。
本開示の一実施形態は、上記のようにして作製された、骨髄単核細胞からなる細胞シートである。この細胞シートは後述する実施例で説明されるように、線維化抑制活性が高い。
また、本開示の一実施形態は、骨髄単核細胞からなる細胞シートをWnt/β-カテニンシグナル抑制作用を有する化合物で処理してなる細胞シートにも関する。該シートは線維化抑制活性が更に高められていることを特徴とする。
また、本開示の一態様において、細胞シートは骨髄単核細胞からなる細胞シートである。該シートは拒絶反応の起こらない限り、各種組織における線維化抑制に用いることが可能である。
培地を含む温度応答性反応皿に骨髄単核細胞を播種する。培地の例としては、bFGFを含むDMEM/20%FBSがある。播種する細胞の数は、例えば、1.3×104 cell/cm2である。これらはフラスコの大きさ、培養環境に応じて適宜変更することができ、それらは当業者の知識の範囲内である。培地は4日毎に交換しながら、細胞がコンフルエントになるまで37℃、5%CO2にて培養する。
本開示において、コンフルエントとは、播種した細胞がシャーレ一面に隙間なく密接して状態を言う。本開示において、コンフルエントのパーセンテージは重要ではないが、目視にてシャーレ表面の70%から90%が細胞で密に覆われた状態をコンフルエントであるとする。なお、直径6 cmのシャーレにて1.3×104 cell/cm2の細胞を播種し、37℃、5%CO2にて培養した場合、およそ8日でコンフルエントとなる。培地交換は原則として4日毎に行う。
本開示において、「32℃以下に維持された」とは、インキュベータが32℃より高くならないように設定されている事を意味する。シート化する時の温度は播種した細胞により異なり、接着性骨髄単核細胞あるいは間葉系幹細胞をシート化する際には、32℃にすればよいが、Wnt/β-カテニンシグナル抑制作用を有する化合物で処理した場合には、シート化に時間がかかるため、なるべく高温を避ける意味から20℃で行うことが好ましい。
本開示の細胞シートの作製工程において、シート化した細胞は収縮する。例えば直径6 cmの温度応答性培養皿でシート化した細胞シートは1 cm程度の直径となる。縮小することで、患部に適用する細胞数が調整しやすくなる。本開示において、収縮の割合は重要ではなく、本開示の一態様である細胞シートを複数重ねる時に積層を阻害する程度の大きさの違いがなければ問題はない。
播種密度をコントロールすることである。平板培養において、播種細胞数は播種する細胞の増えやすさや、容器などの培養条件により適宜選択される。例えば、間葉系幹細胞を分化させてなる肝細胞シートにおいては、6 cmの培養皿で9.0×103 cells/cm2となるように播種細胞数を選んでいる(特許文献1)。本開示のような再生医療用細胞シートにおいては、精確な単層シートを得ることが重要であり、適宜これらを積層して治療に用いる。適切に立証されている播種細胞数を超えて播種を行うことは、この精確な単層細胞シートを得るとの観点からはリスクが伴うものと考えられてきた。しかしながら、本願発明者らは、播種細胞数を高くした細胞シートにおいて、MMP活性が顕著に高くなることを発見した。
本開示において、Wnt/β-カテニンシグナル抑制化合物は、特開2011-219435、WO2012/141038A1、WO2015/147107A1、WO2017/047762A1に記載されている化合物を含む。これらの文献に記載の化合物を引用により本願明細書に援用する。
好適な化合物としては、WO2012/141038A1に記載のIC-2およびその誘導体がある。好適な例としては、
式(1)及び式(2)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である。
R1、R2、R4、R5、及びR6は、同一又は互いに異なって、H、ハロゲン、ニトロ、シアノ、OH、置換されていてもよいC1~C6アルキル、置換されていてもよいC2~C6アルケニル、置換されていてもよいC1~C6アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール;
R3、及びR7は、H、置換されていてもよいC1~C6アルキル、置換されていてもよいC2~C6アルケニル;
環Aは、置換されていてもよいアリール、又は置換されていてもよいヘテロアリール;
m、及びqは、1~4いずれかの整数;
nは、1~3いずれかの整数;
p及びrは、1~5いずれかの整数である。
但し、N-[(5-メチル-2-フリル)メチリデンアミノ]-2-フェノキシ-ベンザミドを除く。)
更なる好適なWnt/β-カテニンシグナル抑制化合物の例としては、式(1)及び式(2)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含む分化誘導剤が提供される。または、式(8)に示す化合物、その塩もしくはそれらの溶媒和物を含む分化誘導剤が提供される。
R8、及びR9は、同一又は互いに異なって、置換されていてもよいC1~C6アルキル、又は置換されていてもよいC2~C6アルケニルである。)
上記化合物は一例であって、これらの化合物の誘導体であり、Wnt/β-カテニンシグナル抑制効果を有する化合物である限り、本開示にて意図するWnt/β-カテニンシグナル抑制化合物である。化合物がWnt/β-カテニンシグナル抑制効果を有するか否かについては、各種手段により決定することができ、例えば、培養された細胞中のルシフェラーゼ活性を基準とすることができる。
本開示において、前述のようにして温度応答性培養皿から回収された細胞シートを、浮遊培養する。浮遊培養を行う時間は縮小した細胞シートにおいてMMP活性が十分高く且つ細胞シートの安定性に問題のない範囲で適宜変更することができる。一例としては、8時間から24時間の間で適宜選択可能である。本開示における浮遊培養とは、回収した細胞シートを、再び容器に接着させずに、培養液中に浮遊した状態で静置することを意味する。該工程に用いる培養液はシート化工程にて用いた培養液が好ましい。浮遊培養に供した細胞シートは、シート化直後の細胞シートと同様に細胞外マトリクスが維持されており、別の細胞シート、基材、あるいは疾患対象組織に生着することが可能である。
本願発明者らは、細胞シート作製時に、得られた細胞シートを浮遊培養させることにより、細胞シートにおいてMMP活性が有意に高くなることを発見し本願発明に至った。本開示にて説明するように、MMP活性が高くなることは骨髄単核細胞から細胞シートを作製した場合と、細胞シート化工程において、Wnt/β-カテニンシグナル抑制作用を有する化合物に曝した場合と同様の傾向にあったが、Wn/β-カテニンシグナル抑制化合物に曝して作製した細胞シートは骨髄単核細胞から作製した細胞シートよりもMMP活性が高かった。
<MMP活性>
本願発明者らは、IC-2化合物により分化させた肝細胞シートを用いて、慢性肝障害モデルマウスの肝星細胞の活性化を抑制したことを報告している(特許文献1)。このことから、本願発明者らは肝線維化抑制の主要成分となるI型コラーゲンの分解に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)群に着目し、MMP-1およびMMP-14が慢性および急性の肝疾患の線維化に強く関与していることを発見し、報告している(肝臓フォーラム 2017年3月)。
本開示において、MMP活性は、MMPによる切断で蛍光を生じるFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)ペプチドを使用して酵素活性を測定することにより決定することができる。
凍結肝組織片(細胞シート)をホモジナイザーにより破砕し、破砕液を得る。該破砕液を窒素で一度凍結し、室温で融解した後、超音波細胞破砕装置BioRuptur(コスモバイオ、東京、日本)を用いて超音波処理を行う。この破砕溶液に等量の12N濃塩酸を加えて加水分解処理を行う。残った破砕液は溶液中のタンパク質量の測定に用いる。加水分解処理後、室温にて冷却した後にピペッティングにより加水分解産物を細かく砕き、室温、3000 rpmで5分間の遠心操作を行い、上清を1.5 mLチューブに入れ、冷却エバポレーター(佐久間製作所、東京、日本)にて塩酸を除去する。ヒドロキシプロリンの測定はHydroxyproline quantification kit(BioVision、California、USA)を用いてを実施する。
破砕溶液中のタンパク質量はプロテインアッセイ濃縮色素試薬(Bio-Rad、California、USA)を用いてBradford法により測定する。
線維化の抑制効果の組織学的検討はシリウスレッド染色およびアザン染色にて行う。
骨髄由来間葉系幹細胞(UE7T-13細胞株)をDMED/10%FBSに懸濁し、温度応答性培養皿ならびに通常細胞培養皿にそれぞれ細胞播種密度が3.6×104 cells/cm2、5.4×104 cells/cm2、7.2×104 cells/cm2となるよう各々播種した。4日後、温度応答性培養皿を32℃、5%CO2インキュベータ中に移動させ、シート化を行った。得られた細胞シートはPBSにて3回洗浄後、MMP活性測定用キット(SensoLyte(R) 520 MMP-1 Assay Kit Fluorimetric,(ANASPEC社:Cat#:AS-71150)およびSensoLyte(R) 520 MMP - 14 Assay Kit Fluorimetric(ANASPEC社:Cat#:AS-72025))の緩衝液中でホモジナイズした。通常の細胞培養皿に播種された細胞はそれぞれ、0.025%トリプシン/0.1 mM EDTAにて分散し、遠心にて回収後、PBSにて3回洗浄し、MMP活性測定用の緩衝液にてホモジナイズした。測定したMMP活性の結果を表1および図1A及び図1Bに示す。図1の結果は、細胞あたりのMMP-1(図1A)およびMMP-14(図1B)の結果を示したものである。トリプシン処理した細胞懸濁液よりもシート化後浮遊培養を行った細胞シートにてMMP-1およびMMP-14が、高い播種密度において高くなっていることが明らかとなった。更に、胞播種密度を高くして本開示の細胞シートを作った場合、細胞あたりのMMP-1の活性が高くなることも明らかとなった。播種密度を高くすることで、細胞あたりのMMP-1活性が高くなったことは驚くべき結果であった。更には、播種密度を4倍にしたところトリプシン処理した細胞懸濁液では4倍程度活性が上昇していたのに対し、本開示の細胞シートでは5~6倍活性が上昇していた。また、細胞播種密度の高い細胞シートは物理的な強度にも優れていた。
図3より、細胞がシート化されることにより細胞中のMMP-1およびMMP-14活性が数倍高められ、さらにDMSOよりもIC-2化合物がこれらの活性を更に高めることが明らかとなった。
Claims (6)
- 線維化抑制作用のある細胞シートの製造方法において、
間葉系幹細胞または骨髄単核細胞を培養液に懸濁する工程、
間葉系幹細胞または骨髄単核細胞の懸濁液を、少なくとも5.4×104 cells/cm2の播種密度で温度応答性培養皿に播種し、インキュベートする工程、
培養された間葉系幹細胞または骨髄単核細胞が、コンフルエントになったことを確認して、温度応答性培養皿を20℃の環境下に移動させて、細胞シートを得る工程、
得られた細胞シートを浮遊培養する工程、からなる、細胞シートの製造方法。 - 前記骨髄単核細胞が接着性である、請求項1に記載の細胞シートの製造方法。
- 前記間葉系幹細胞または骨髄単核細胞の懸濁液を温度応答性培養皿に播種し、インキュベートする工程において、培養液がWnt/β-カテニンシグナル抑制作用のある化合物を含む、請求項1に記載の細胞シートの製造方法。
- 前記化合物がIC-2である、請求項3に記載の細胞シートの製造方法。
- 得られた細胞シートは、各種組織または臓器に適用可能である、請求項1に記載の細胞シートの製造方法。
- 得られた細胞シートが、肝疾患治療用細胞シートであるか、各種組織または臓器の治療用細胞シートである、請求項1に記載の細胞シートの製造方法。
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