KR20220132672A

KR20220132672A - 저분자화합물에 의한 암과 섬유화의 억제 효과

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Publication number: KR20220132672A
Application number: KR1020227032586A
Authority: KR
Inventors: 고시 시오타; 노리코 이타바; 케이타 칸키; 켄조 세토; 히로키 시미즈; 요헤이 코우노; 신야 쿠니타; 준야 아즈미; 토모히코 사카베; 켄이치로 아베; 미노루 모리모토; 히로유키 오카
Original assignee: 코쿠리츠 다이가쿠 호우진 돗토리 다이가쿠; 카논큐어 가부시키가이샤
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2022-09-30
Also published as: JPWO2015147107A1; CN106132417B; EP3150207B1; US11213527B2; WO2015147107A1; KR20160130861A; US20180028536A1; EP3150207A1; JP6552005B2; ES2774790T3; EP3150207A4; US20210386747A1; CN106132417A

Abstract

악성종양, 암 줄기세포 또는 섬유증에 대한 신규 치료약을 얻는다. 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양 또는 암 줄기세포의 치료약을 사용한다. 또는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 섬유증의 치료약을 사용해도 된다.

Description

저분자화합물에 의한 암과 섬유화의 억제 효과{INHIBITORY EFFECT OF LOW MOLECULAR WEIGHT COMPOUND ON CANCER AND FIBROSIS}

본 발명은 악성종양 또는 섬유증의 치료약에 관한 것이다.

인간의 사망원인으로서 악성종양, 심장질환, 뇌혈관질환 등의 질환이 상위에 꼽힌다. 이 중에서도 악성종양은 발생기전이 복잡하기 때문에 특히 예방 및 치료가 어려운 질환이라고 할 수 있다.

이 악성종양의 연구분야에서 근년 암 줄기세포의 존재가 발견되어 새로운 치료전략의 입안을 위해 주목을 받고 있다. 암 줄기세포는 분화되어 암세포로 되는 것으로 여겨지고 있다. 암환자에서는 암세포를 제거한 후 일정기간이 지나면 재발할 수 있는데, 이는 극소수의 살아남은 암 줄기세포에 기인한 것이라고 알려져 있다.

이 암 줄기세포의 특징은 기존의 많은 항암제로 효과를 보기 어렵다는 것이다. 이에 관해 큐슈대학의 나카야마 교수 등은 모델마우스의 Fbxw7을 결손시키면, 암 줄기세포가 이마티닙(항암제)에 의해 사멸한다는 연구결과를 보고하고 있다(비특허문헌 1). 그러나 암 줄기세포의 증식을 직접 억제하는 화합물은 얻지 못했다.

한편, 악성종양의 원인이 되는 증상으로서 조직 섬유화를 들 수 있다. 예를 들어 간장의 섬유화가 진행되면, 간경변, 간암으로 된다. 기타 섬유화는 폐, 신장, 심장, 피부 등에도 생긴다. 비특허문헌 2에는 섬유화 치료에 관한 것으로서 피르페니돈(Pirfenidone)의 임상시험 결과가 기재되어 있다.

또한, 본원의 발명자들은 저분자화합물에 대해 3가지의 보고를 하고 있다 (비특허문헌 3,4, 특허문헌 1). 비특허문헌 3, 4에는 간암세포증식의 억제 효과 및 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과를 나타내는 저분자화합물이 기재되어 있다. 또한, 비특허문헌 4의 저분자화합물은 CD44의 발현을 증가시킨 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 3, 4에는 어떤 구조 및 기능을 갖고 있는 화합물이 간암세포에 대해 증식억제 효과를 나타낼 수 있는지에 대해서는 기재되어 있지 않다.

특허문헌 1에는 PN-1-2, PN-3-4, PN-3-13, HC-1 및 IC-2가 간엽계 줄기세포의 Wnt/β-카테닌 신호를 억제하고 간엽계 줄기세포를 간세포로 분화유도시킨 것이 기재되어 있다. 이 문헌에는 암세포 또는 암 줄기세포의 증식억제에 관해서는 기재되어 있지 않다.

특허문헌 1: WO2012/141038호

비특허문헌 1: Takeishi et al., Cancer Cell. 2013 Mar 18; 23(3):347-61. 비특허문헌 2: Noble et al., Lancet. 2011 May 21; 377(9779):1760-9. 비특허문헌 3: Sakabe et al., 간장, 53권, Supplement 1, 2012, A226, WS-54 비특허문헌 4: Seto et al., 간장, 54권, Supplement 1, 2013, P-12

상기한 바와 같이 악성종양의 치료전략은 서서히 진전되고 있다. 그러나 악성종양은 현재도 인간의 사망원인의 상위에 위치하며 종래의 치료전략만으로는 충분하지 않았다.

악성종양의 치료분야에서는 개개의 골격이 갖고 있는 특성에 따라 투여하는 저분자화합물이 갖고 있는 약리작용이 크게 변하는 것이 알려져 있다. 또한, 이 분야는 불확실성이 높은 분야이며 새로운 치료방법을 개발할 때 원하는 약리작용을 얻을 수 있을지 없을지는 예상하기 어렵다고 할 수 있다. 그 때문에, 악성종양에 대한 치료효과를 갖고 있는 저분자화합물을 새로 동정(同定)하는 것은 쉬운 일이 아니었다.

더욱이, 악성종양세포뿐만 아니라 암 줄기세포의 증식도 억제하는 저분자화합물을 새로 동정하는 것은 쉬운 일이 아니다.

또한, 상기한 바와 같이 섬유화 치료에 관한 연구성과가 서서히 보고되고 있다. 그러나 섬유화의 치료에 유효한 치료약은 적고 또한 환자에 따라서는 부작용이 문제가 되는 경우도 있다. 그 때문에, 기존의 항섬유증제만으로는 충분하지 않았다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 실시된 것이며 악성종양, 암 줄기세포 또는 섬유증에 대한 새로운 치료약을 제공하는 것 등을 목적으로 한다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과 후술하는 실시예에 기재한 바와 같이 항악성종양 효과를 가지는 저분자화합물의 동정(同定)에 성공했다. 또한, 이 저분자화합물은 종양세포뿐만 아니라 암 줄기세포의 증식도 억제하는 효과를 가지고 있었다. 암 줄기세포는 악성종양의 재발이나 전이의 원인이 될 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에 암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있는 상기 저분자화합물은 악성종양의 치료약의 유효성분으로서 매우 뛰어난 화합물이라 할 수 있다. 또한, 섬유화의 억제 효과도 가지고 있었다. 그리고 이러한 지견을 토대로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명의 일 태양에 따르면 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양의 치료약이 제공된다.

[화 1]

[화 2]

[화 5]

(식 중, R1, R2, R4, R5 및 R6은 동일하거나 다르며, H, 할로겐, 니트로, 시아노, OH, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬, 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴;

R3 및 R7은 동일하거나 다르며, H, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬 또는 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐;

고리A는 치환되어 있어도 되는 아릴 또는 치환되어 있어도 되는 헤테로아릴;

R8 및 R9는 동일하거나 다르며, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬 또는 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐;

m 및 q는 동일하거나 다르며 1~4 중의 임의의 정수;

n은 1~3 중의 임의의 정수;

p 및 r은 동일하거나 다르며, 1~5 중의 임의의 정수이다. )

또한, 본 발명의 일 태양에 따르면 상기 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 암 줄기세포의 치료약이 제공된다:

(식 중, R1, R2, R4, R5 및 R6은 동일하거나 다르며 H, 할로겐, 니트로, 시아노, OH, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬, 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴;

R3 및 R7은 동일하거나 다르며 H, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬 또는 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐;

R8 및 R9는 동일하거나 다르며 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬 또는 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐;

m 및 q는 동일하거나 다르며, 1~4 중의 임의의 정수;

n은 1~3 중의 임의의 정수;

p 및 r은 동일하거나 다르며 1~5 중의 임의의 정수이다. )

또한, 본 발명의 일 태양에 따르면 상기 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 섬유증의 치료약이 제공된다:

m 및 q는 동일하거나 다르며, 1~4 중의 임의의 정수;

n은 1~3 중의 임의의 정수;

p 및 r은 동일하거나 다르며, 1~5 중의 임의의 정수이다. )

또한, 본 발명의 바람직한 형태에 따르면 상기 악성종양, 암 줄기세포 또는 섬유증의 치료약에서의 상기 R1, R2, R4, R5 및 R6은 동일하거나 다르며, H, 할로겐, 니트로, 시아노, OH, C1~C6알킬, 할로게노C1~C6알킬, 히드록시C1~C6알킬, C1~C6알킬아미노, C1~C6알콕시, 할로게노C1~C6알콕시, 히드록시C1~C6알콕시 또는 C1~C6알콕시아미노, C1~C6알콕시로 치환된 C1~C6알콕시, C1~C6알콕시페닐로 치환된 C1~C6알콕시, 트리알킬실록시C1~C6알킬 또는 알킬디페닐실록시C1~C6알킬이며, 상기 R3 및 R7은 H이며, 상기 고리A는 나프틸, 5개의 할로겐으로 치환된 페닐 또는 1개의 메틸로 치환된 푸릴이며, R8 및 R9은 동일하거나 다르며, C1~C6알킬이다.

본 발명에 의하면 새로운 치료약을 사용함으로써 악성종양, 암 줄기세포 또는 섬유증을 치료할 수 있다.

도 1은 간암세포를 IC-2 처리한 후의 세포생존율(농도의존적)에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 간암세포를 IC-2 처리한 후의 세포생존율(시간의존적)에 대해　조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 간암세포를 PN3-13 처리한 후의 세포생존율(농도의존적)에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 간암세포를 PN3-13 처리한 후의 세포생존율(시간의존적)에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 간암세포를 HC-1 처리한 후의 세포생존율(시간의존적)에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 암 줄기세포를 저분자화합물로 처리한 후의 CD44 양성세포수에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 간암 모델 마우스의 체중변화에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 간암 모델 마우스의 치료결과를 나타낸 도이다.
도 9는 저분자화합물의 스피어(Sphere)형성능에 대한 영향에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 암 줄기세포를 저분자화합물로 처리한 후의 CD90 양성세포수에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 암 줄기세포를 저분자화합물로 처리한 후의 CD133 양성세포수에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 암 줄기세포를 저분자화합물로 처리한 후의 EpCAM 양성세포수에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 루시페라아제 분석(Luciferase Assay)결과를 나타낸 도이다.
도 14는 대장암에 있어서의 항종양효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 대장암에 있어서의 항종양효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 대장암에 있어서의 항종양효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 대장암세포의 스피어(Sphere)형성능에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 대장암에 있어서의 암 줄기세포의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 대장암에 있어서의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 대장암에 있어서의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 대장암에 있어서의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 편평상피암에 있어서의 항종양 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 편평상피암에 있어서의 항종양 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 편평상피암에 있어서의 항종양 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 편평상피암에 있어서의 항종양 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 편평상피암에 있어서의 암 줄기세포의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 대장암에 있어서의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 대장암에 있어서의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 대장암에 있어서의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 실시예 8에서 채용한 IC-2 유도체의 합성 스킴을 나타낸 도이다.
도 31은 실시예 8에서 채용한 IC-2 유도체의 합성 스킴을 나타낸 도이다.
도 32는 실시예 8에서 채용한 IC-2 유도체의 합성 스킴을 나타낸 도이다.
도 33은 실시예 8에서 채용한 IC-2 유도체의 합성 스킴을 나타낸 도이다.
도 34는 실시예 8에서 채용한 IC-2 유도체의 합성 스킴을 나타낸 도이다.
도 35는 실시예 8에서 채용한 IC-2 유도체의 합성 스킴을 나타낸 도이다.
도 36은 실시예 8에서 얻은 IC-2 유도체의 구조식과 스펙트럼 데이터를 나타낸 도이다.
도 37은 실시예 8에서 얻은 IC-2 유도체의 구조식과 스펙트럼 데이터를 나타낸 도이다.
도 38은 IC-2 유도체에 의한 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 39는 IC-2 유도체에 의한 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 40은 실시예에 관계되는 루시페라아제 분석의 프로토콜을 나타낸 도이다.
도 41은 간성상세포를 IC-2 처리 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 42는 간성상세포를 IC-2+TGFβ 처리 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 43은 간성상세포를 IC-2+Wnt3a 처리 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 44는 간성상세포를 IC-2 처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 45는 간성상세포를 IC-2+TGFβ 처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 46은 간성상세포를 IC-2+Wnt3a 처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 47은 간성상세포를 PN3-13+TGFβ처리 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 48은 간성상세포를 PN3-13+TGFβ처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 49는 간성상세포를 HC-1 처리하고 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 50은 간성상세포를 HC-1+ Wnt3a 처리하고 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 51은 간성상세포를 HC-1+TGFβ 처리 24시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 52는 간성상세포를 HC-1 처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 53은 간성상세포를 HC-1+Wnt3a 처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 54는 간성상세포를 HC-1+TGFβ 처리 48시간 후에 루시페라아제 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 55는 실시예에 관한 실시간 PCR 프로토콜을 나타낸 도이다.
도 56은 간성상세포를 IC-2+TGFβ 처리 후 TGFβ의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 57은 간성상세포를 IC-2+TGFβ 처리 후 COL1A1의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 58은 간성상세포를 IC-2+TGFβ 처리 후 α-SMA의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 59는 간성상세포를 PN3-13+TGFβ 처리 후 TGFβ의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 60은 간성상세포를 PN3-13+TGFβ 처리 후 COL1A1의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 61은 간성상세포를 PN3-13+TGFβ 처리 후 α-SMA의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 62는 간성상세포를 HC-1+TGFβ 처리 후 TGFβ의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 63은 간성상세포를 HC-1+TGFβ 처리 후 COL1A1의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 64는 간성상세포를 HC-1+TGFβ 처리 후 α-SMA의 발현량에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 65는 IC-2 투여 후의 간장해 모델 마우스의 히드록시프롤린의 양에 대해 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 66은 IC-2 투여 후의 간장해 모델 마우스의 섬유화 영역의 정량결과에 대해 나타낸 도이다.

이하 본 발명의 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다. 또한, 같은 내용에 대해서는 반복의 번잡을 피하기 위해서 적당히 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양의 치료약이다. 이 치료약을 사용하면, 악성종양을 치료할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 암 줄기세포의 치료약이다. 이 치료약을 사용하면, 암 줄기세포를 치료할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양세포 또는 암 줄기세포의 증식억제제이다. 이 치료약을 사용하면, 악성종양세포 또는 암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양의 재발억제약이다. 이 억제약을 사용하면, 악성종양의 재발을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 섬유증의 치료약이다. 이 치료약을 사용하면, 섬유증을 치료할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 섬유화에 따른 질환의 치료약이다. 이 치료약을 사용하면, 섬유화에 따른 질환을 치료할 수 있다.

식(1), (2) 및 (5)에 있어서 R1, R2, R4, R5 및 R6은 동일하거나 다르며, H, 할로겐, 니트로, 시아노, OH, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬, 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴이다. 또한, R3 및 R7은 H, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬 또는 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐이다. 또한, 고리A는 치환되어 있어도 되는 아릴 또는 치환되어 있어도 되는 헤테로아릴이다. 또한, R8 및 R9는 동일하거나 다르며, 치환되어 있어도 되는 C1~C6알킬 또는 치환되어 있어도 되는 C2~C6알케닐이다. 또한, m 및 q는 동일하거나 다르며, 1~4 중의 임의의 정수이다. 또한, n은 1~3 중의 임의의 정수이다. 또한, p 및 r은 동일하거나 다르며, 1~5 중의 임의의 정수이다.

상기 R1, R2, R4, R5 및 R6은 바람직하게는 동일하거나 다르며, H, 할로겐, 니트로, 시아노, OH, C1~C6알킬, 할로게노C1~C6알킬, 히드록시C1~C6알킬, C1~C6알킬아미노, C1~C6알콕시, 할로게노C1~C6알콕시, 히드록시C1~C6알콕시, C1~C6알콕시아미노 또는 C1~C6알콕시로 치환된 C1~C6알콕시, C1~C6알콕시페닐로 치환된 C1~C6알콕시, 트리알킬실록시C1~C6알킬 또는 알킬디페닐실록시C1~C6알킬이다. 또한, 상기 R3 및 R7은 바람직하게는 H이다. 또한, 상기 고리A는 바람직하게는 나프틸, 5개의 할로겐으로 치환된 페닐 또는 1개의 메틸로 치환된 푸릴이다. 이 경우의 식(2)의 화합물은 예를 들면 WO2012/141038에 기재된 방법으로 합성할 수 있다. 또한, 상기 R8 및 R9는 바람직하게는 동일하거나 다르며, C1~C6알킬이다.

본 발명의 일 실시형태에서 「할로겐」이란 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「알킬」 및 「알케닐」이란 특별히 설명이 없는 한 직쇄 또는 분지상의 탄화수소 사슬을 의미한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「C1~C6」은 탄소수가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 탄화수소이다. 즉 「C1~C6알킬」은 탄소수가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 알킬이다. C1~C6알킬로서는 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실기 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「알케닐」은 예를 들면 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-헥세닐, 3-헥세닐 또는 5-헥세닐 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「알콕시」는 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 이소펜톡시, 헥속시 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「치환되어 있어도 된다」는 무치환 또는 치환가능한 위치에 치환기를 1, 2, 3, 4 혹은 5개 가지고 있는 것을 의미한다. 한편, 복수개의 치환기를 가질 경우 그것들의 치환기는 동일하여도 되고 서로 달라도 된다. 또한, 치환 위치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9위치여도 된다. 여기에서 치환기로서는 예를 들면, H, 할로겐, 니트로, 시아노, OH, C1~C6알킬, 할로게노C1~C6알킬, 히드록시C1~C6알킬, C1~C6알킬아미노, C3~C6시클로알킬, C2~C6알케닐, 할로게노C2~C6알케닐, 히드록시C2~C6알케닐, C2~C6알케닐아미노, C3~C6시클로알케닐, C2~C6알키닐, 할로게노C2~C6알키닐, 히드록시C2~C6알키닐, C2~C6알키닐아미노, C1~C6알콕시, 할로게노C1~C6알콕시, 히드록시C1~C6알콕시, C1~C6알콕시아미노, C1~C6알콕시페닐, 트리알킬실록시, 알킬디페닐실록시, 아릴 또는 헤테로아릴 등을 들수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서 「할로게노C1~C6알킬」이란 1개 이상의 할로겐으로 치환된 C1~C6알킬이다. 이 할로겐의 개수는 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 13개이어도 되고, 여기서 예시한 임의의 2개의 값의 범위내여도 좋다. 또한, 할로겐이 2개 이상일 경우의 각 할로겐의 종류는 동일하거나 달라도 좋다. 할로게노C1~C6알킬은 예를 들면 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 브로모메틸, 디브로모메틸, 트리브로모메틸, 클로로에틸, 디클로로에틸, 트리클로로에틸, 플루오로에틸, 디플루오로에틸, 트리플루오로에틸 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「히드록시C1~C6알킬」이란 1개 이상의 히드록시로 치환된 C1~C6알킬이다. 이 히드록시의 개수는 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 13개이어도 좋고, 여기서 예시한 임의의 2개의 값의 범위내여도 좋다.

히드록시C1~C6알킬은 예를 들면 히드록시메틸, 1-히드록시에틸, 2-히드록시에틸, 2-히드록시-n-프로필 또는 2,3-디히드록시-n-프로필 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「C1~C6알킬아미노」란 1개 이상의 아미노로 치환된 C1~C6알킬이다. 이 아미노의 개수는 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 13개여도 되고, 여기서 예시한 임의의 2개의 값의 범위내여도 좋다. C1~C6알킬아미노는 예를 들면 메틸아미노 또는 에틸아미노 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「할로게노C1~C6알콕시」란 할로게노C1~C6알킬의 알킬을 알콕시로 바꿔 놓은 것과 등가이다. 할로게노C1~C6알콕시는 예를 들면 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 1-플루오로에톡시, 2-플루오로에톡시, 2-클로로에톡시, 2-브로모에톡시, (1,1-디플루오로)에톡시, (1,2-디플루오로)에톡시, (2,2,2-트리플루오로)에톡시, (1,1,2,2-테트라플루오로)에톡시, (1,1,2,2,2-펜타플루오로)에톡시, 1-플루오로-n-프로폭시, 1,1-디플루오로-n-프로폭시, 2,2-디플루오로-n-프로폭시, 3-플루오로-n-프로폭시, (3,3,3-트리플루오로)-n-프로폭시, (2,2,3,3,3-펜타플루오로)-n-프로폭시, 4-플루오로-n-부톡시, (4,4,4-트리플루오로)-n-부톡시, 5-플루오로-n-펜틸옥시, (5,5,5-트리플루오로)-n-펜틸옥시, 6-플루오로-n-헥실옥시, (6,6,6-트리플루오로)-n-헥실옥시, 2-플루오로시클로프로폭시, 2-플루오로시클로부톡시 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「히드록시C1~C6알콕시」란 히드록시C1~C6알킬의 알킬을 알콕시로 바꿔 놓은 것과 등가이다. 히드록시C1~C6알콕시는 예를 들면 2-히드록시에톡시, 2-히드록시-n-프로폭시, 3-히드록시-n-프로폭시, 2,3-디히드록시-n-프로폭시, 2-히드록시시클로프로필 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「C1~C6알콕시아미노」란 C1~C6알킬아미노의 알킬을 알콕시로 바꿔 놓은 것과 등가이다. C1~C6알콕시아미노는 예를 들면 메톡시아미노, 에톡시아미노를 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「아릴」이란 C6~14의 단환, 2환 또는 3환식 방향족 탄화수소 고리기이다. 아릴은 예를 들면 페닐, 나프틸 (1-나프틸, 2-나프틸), 테트라하이드로 나프탈렌, 인데닐 또는 플루오레닐 등을 들 수 있다. 특히 나프틸 또는 5개의 할로겐으로 치환된 페닐이 바람직하다. 또한, 아릴은 예를 들면 C5~8시클로알켄과 그 이중결합 부위에서 축합한 고리기를 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「헤테로아릴」이란 환 내에 5개에서 14개의 환 원자 및 공유π전자계를 가지며, N, S 및 O로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로 원자를 1~4개 함유하는 기를 들 수 있다. 헤테로아릴은 예를 들면 티에닐, 벤조티에닐, 푸릴, 벤조푸릴, 디벤조푸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 테트라졸, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 이소옥사졸릴 등을 포함한다. 특히 1개의 메틸로 치환된 푸릴이 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에서 식(1)에 나타내는 화합물의 구조는 R1, R2 및 R3이 각각 H이며, R4은 4위치이며, 또한 H, F, Cl, 니트로, OH, CH₂OH, 메톡시, 메톡시메톡시 또는 tert-부틸디메틸실록시메틸인 것이 바람직하다. 특히 식(1)에 나타내는 화합물의 구조는 악성종양 또는 섬유증의 치료 효과의 관점에서는 식(3)에 나타내는 화합물의 구조에 가까울수록 바람직하다. 본 발명의 일 실시형태에서 식(2)에 나타내는 화합물의 구조는 악성종양 또는 섬유증의 치료 효과의 관점에서는 식(4)에 나타내는 화합물의 구조에 가까울수록 바람직하다. 본 발명의 일 실시형태에서 식(5)에 나타내는 화합물의 구조는 악성종양 또는 섬유증의 치료 효과의 관점에서는 식(6)에 나타내는 화합물의 구조에 가까울수록 바람직하다. 한편, 식(3), (4), (6)에 나타내는 화합물은 각각 IC-2, PN3-13, HC-1이라고 부르기도 한다. 본 명세서에 있어서 PN3-13과 PN-3-13은 동등한 의미이다.

[화 3]

[화 4]

[화 6]

본 발명의 일 실시형태에서 「염」은 특히 한정되지 않지만 예를 들면 임의의 산성(예를 들면 카르복실)기로 형성되는 음이온 염 또는 임의의 염기성(예를 들면 아미노)기로 형성되는 양이온 염을 포함한다. 염류에는 무기염 및 유기염을 포함하며 [Berge, Bighley 및 Monkhouse, J.Pharm.Sci., 1977, 66, 1-19]에 기재되어 있는 염이 포함된다. 예를 들면 금속염, 암모늄 염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다. 금속염은 예를 들면, 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토류 금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등을 들수 있다. 유기염기와의 염은 예를 들면, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에타놀아민(triethanolamine), 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N, N'-디벤질에틸렌디아민 등과의 염을 들 수 있다. 무기산과의 염은 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염은 예를 들면, 포름산, 초산, 트리플루오로초산, 프탈산, 푸말산, 옥살산, 주석산, 말레산, 구연산, 호박산, 사과산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염을 들 수 있다. 염기성 아미노산과의 염은 예를 들면, 알기닌, 리진, 오르니틴 등과의 염을 들 수 있으며, 산성아미노산과의 염은 예를 들면, 아스파라긴산, 글루타민산 등과의 염을 들 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서 「용매화물」은 용질 및 용매에 의해 형성되는 화합물이다. 용매화물에 관해 예를 들면 [J.Honig et al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650(1953)]을 참조할 수 있다. 용매가 물일 경우 형성되는 용매화물은 수화물이다. 이 용매는 용질의 생물활성을 방해하지 않는 것이 바람직하다. 그러한 바람직한 용매의 예로서 한정하는 것은 아니지만 물, 에탄올 및 초산을 들 수 있다. 가장 바람직한 용매는 물이다. 본 발명에 따른 화합물 또는 그 염은 대기에 접촉하거나 또는 재결정할 때에 수분을 흡수하여, 경우에 따라서는 흡습한 물을 가지거나 또는 수화물이 될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서 「이성체」는 분자식은 동일하지만 구조가 다른 분자를 포함한다. 거울상이성체(Enantiomer), 기하(시스/트랜스)이성체 또는 서로 거울상이 아닌 비대칭 중심을 1개 이상 가지는 부분입체이성체(diastereomer)를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서 「프로드러그(prodrug)」는 전구체(前驅體)인 화합물이며, 그 화합물을 피실험체에 투여했을때 대사과정 또는 여러 가지 화학반응에 의해 화학적 변화를 일으켜, 본 발명에 따른 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 초래하는 화합물을 포함한다. 프로드러그에 대해서는 예를 들면, [T. Higuchi and V. Stella, "Pro-Drugs as Novel Delivery Systems", A.C.S. Symposium Series, Volume 14]을 참조할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서 「악성종양」은 예를 들면, 정상적인 세포가 돌연변이를 일으켜서 발생하는 종양을 포함한다. 악성종양은 전신의 모든 장기나 조직으로부터 생길 수 있다. 이러한 악성종양은 예를 들면 폐암, 식도암, 위암, 간장암, 췌장암, 신장암, 부신암, 담도암, 유방암, 대장암, 소장암, 난소암, 자궁암, 방광암, 전립선암, 뇨관암, 신우암, 뇨관암, 음경암, 고환암, 뇌종양, 중추 신경계의 암, 말초 신경계의 암, 머리경부암, 신경교종, 다형성교모세포종, 피부암, 흑색종, 갑상선암, 타액선암, 악성림프종, 암종, 육종 및 혈액악성종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함한다. 상기 간장암은 예를 들면 상피성종양 또는 비상피성종양이어도 되고 간세포암, 담관세포암이어도 된다. 상기 피부암은 예를 들면 기저세포암, 편평상피암 또는 악성흑색종을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「암 줄기세포」는 암세포의 기원이 되는 세포를 포함한다. 이 암 줄기세포는 암 줄기세포 마커를 발현하는 세포를 포함한다. 암 줄기세포 마커는 예를 들면 CD44, CD90, CD133 또는 EpCAM을 포함한다.

섬유화는 전형적으로는 콜라겐 등을 구성요소로 하는 결합조직이 증생하여 정상조직에 바뀌어 놓임으로써 조직이 경화하여 정상적 기능을 상실하는 함으로써 생기게 되는 증상으로 알려지고 있다. 예를 들면 간장, 폐, 신장, 심장, 피부 등의 각 조직에서 생긴다. 또한, 예를 들면 간조직에 다량의 섬유화가 생겼을 경우에 간경변이 되며, 나아가서 간암이 될 수 있다. 또한, 간조직 이외에도 섬유화의 진행에 따라 각 조직에 악성종양이 생기는 경우가 있다. 섬유증은 섬유화에 수반하는 질환을 포함한다. 섬유화에 따른 질환은 예를 들면 섬유화에 수반하는 상기 각 조직의 섬유증, 경화, 악성종양 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서 「치료」는 환자의 질환, 혹은 질환에 따른 1개 이상의 증상의 증상개선효과, 억제 효과 또는 예방효과를 발휘할 수 있는 것을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서 「치료약」은 유효성분과 약리학적으로 허용되는 1개 혹은 그 이상의 담체를 포함하는 의약조성물이어도 좋다. 의약조성물은 예를 들면, 유효성분과 상기 담체를 혼합하여 조제학(調劑學)의 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 치료약은 치료를 위해 사용하는 것인 한 사용형태는 한정되지 않으며, 유효성분 단독이어도 좋고 유효성분과 임의의 성분과의 혼합물이어도 좋다. 또 상기 담체의 형상은 특별히 한정되지 않으며 예를 들면 고체 또는 액체(예를 들면, 완충액)여도 좋다. 또한, 악성종양의 치료약은 예를 들면, 악성종양의 예방을 위해 사용할 수 있는 약물(예방약), 악성종양의 재발억제약 또는 악성종양세포의 증식억제제를 포함한다. 암 줄기세포의 치료약은 예를 들면, 암 줄기세포를 표적으로 한 치료약, 암 줄기세포에 기인하는 악성종양의 치료약 또는 암 줄기세포의 억제제를 포함한다.

치료약의 투여경로는 치료시에 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고 예를 들면 정맥내, 피하(皮下), 근육내, 복강내 또는 경구투여 등이어도 된다. 투여형태로서는 예를 들면 주사제, 캡슐제, 정제, 과립제 등이어도 된다. 주사용 수용액은 예를 들면 생리식염수, 당(예를 들면 트레할로오스(trehalose)), NaCl 또는 NaOH 등을 배합해도 좋다. 또한, 치료약은 예를 들면 완충제 (예를 들면 인산염 완충액), 안정제 등을 배합해도 좋다.

투여량은 특히 한정되지 않지만 예를 들면 1회당 0.001, 1, 10, 100 또는 1000mg/kg체중이어도 되고, 그들 중 임의의 2개의 값의 범위내여도 된다. 투여간격은 특히 한정되지 않지만 예를 들면 1, 7, 14, 21 또는 28일당 1 또는 2회 투여해도 좋고, 그들 중 임의의 2개의 값의 범위당 1회 또는 2회 투여해도 좋다. 투여량, 투여간격, 투여방법은 환자의 연령이나 체중, 증상, 대상장기 등에 의해 임의로 선택해도 좋다. 또한, 치료약은 치료 유효량 또는 원하는 작용을 발휘하는 유효량의 유효성분을 포함하는 것이 바람직하다.

악성종양의 치료효과는 화상검사, 내시경검사, 생검 또는 악성종양 마커의 검출에 의해 평가해도 된다. 또한, 암 줄기세포의 치료 효과는 화상검사, 내시경검사, 생검 또는 암 줄기세포 마커의 검출에 의해 평가해도 된다. 또한, 섬유증의 치료 효과는 화상검사, 내시경검사, 생검 또는 섬유화 마커의 검출에 의해 평가해도 된다. 각 치료 효과는 환자 또는 환자유래 샘플(예를 들면, 조직, 세포, 세포집단 또는 혈액)중의 마커량이, 치료약 투여 후에 유의(有意)하게 감소했을 경우에 치료 효과가 있었다고 판단해도 된다. 이때, 치료약 투여 후의 마커량은 투여전(또는 컨트롤)에 비해 0.7, 0.5, 0.3 또는 0.1배 이하로 감소해 있어도 된다. 또는, 환자 유래 샘플 중의 마커 양성세포수가, 치료약 투여 후에 유의하게 감소했을 경우에 치료 효과가 있었다고 판단해도 된다. 이때 치료약 투여 후의 마커 양성세포수는 투여전(또는 컨트롤)에 비해 0.7, 0.5, 0.3 또는 0.1배 이하로 감소해 있어도 된다. 한편, 후술하는 실시예 2에서는 CD44 양성 HuH7 세포를 피하에 이식한 마우스를 이용하여 치료 효과를 평가하였지만, 본원 발명자들은 상기 CD44 양성 HuH7 세포 대신에 통상의 HuH7 세포를 이용했을 경우에도 IC-2가 악성종양의 치료효과를 나타낸 것을 실험을 통해 확인하였다.

또한, 악성종양의 치료 효과는 환자유래의 피실험세포의 증식속도가 치료약 투여 후에 유의하게 감소했을 경우에 치료 효과가 있었다고 판단해도 좋다. 이때, 치료약 투여 후의 피실험세포의 증식속도는 투여전(또는 컨트롤)에 비해 0.7, 0.5, 0.3 또는 0.1배 이하로 감소하고 있어도 된다. 한편, 본 발명의 일 실시형태에서 「유의하게」는 예를 들면 통계학적 유의차를 스튜던트t 검정(Student t-test)(한쪽 또는 양쪽)을 사용하여 평가하며 p <0.05 또는 p <0.01인 상태여도 좋다. 또는, 실질적으로 차이가 생긴 상태여도 좋다.

본 발명의 일 실시형태에서 「환자」는 인간 또는 인간을 제외하는 포유동물 (예를 들면 마우스, 모르모트, 햄스터, 래트(rat), 쥐, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 고양이, 개, 마모셋, 원숭이 또는 침팬지 등의 1종 이상)을 포함한다. 또한, 환자는 악성종양 또는 섬유증을 발증하고 있다고 판단 또는 진단된 환자여도 된다. 또는, 환자는 악성종양 또는 섬유증의 치료를 필요로 하고 있는 환자여도 된다. 또는, 환자는 건강한 사람에 비해 조직 중의 암 줄기세포수가 유의하게 많다고 판단 또는 진단된 환자여도 된다. 한편, 판단 또는 진단은 화상검사, 내시경검사, 생검 또는 각종 마커를 검출하는 것에 의해 실시해도 된다.

본 발명의 일 실시형태에서 「세포의 증식이 억제되고 있는 상태」는 피실험세포의 증식속도가 약제 처리전과 비교해서 유의하게 감소하고 있는 상태를 포함한다. 증식속도는 일정 기간의 세포의 증식량을 측정하는 것으로 평가할 수 있다. 증식량의 측정은 예를 들면 흡광도를 지표로 하여 측정해도 좋고 목시(目視)로 판단해도 좋다. 또는, 증식량의 측정은 환자 또는 환자유래 샘플 중의 악성종양 마커의 양을 지표로 하여 측정해도 좋다. 본 발명의 일 실시형태에서 「암 줄기세포의 억제」는 예를 들면 암 줄기세포의 증식억제, 기능억제 (예를 들면 스피어 형성억제, 마커 발현억제)를 포함한다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1), (2), 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양, 암 줄기세포 또는 섬유화의 마커 억제제이다. 본 발명의 일 실시형태는 식(1) 및 (2) 및 (5)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양 또는 암 줄기세포의 스피어형성 저해제이다. 이 스피어형성 저해제는 악성종양 또는 암 줄기세포의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 상기 어느 하나의 실시형태에 관련되는 치료약에 포함되는 저분자화합물을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는 치료방법이다. 본 발명의 일 실시형태는 상기 어느 하나의 실시형태에 관련되는 치료약에 포함되는 저분자화합물의, 치료약의 제조를 위한 사용이다. 본 발명의 일 실시형태는 상기 어느 하나의 실시형태에 관련되는 증식 억제제에 포함되는 저분자화합물을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는 증식 억제방법이다. 본 발명의 일 실시형태는 상기 어느 하나의 실시형태에 관련되는 증식 억제제에 포함되는 저분자화합물의 증식 억제제의 제조를 위한 사용이다. 본 발명의 일 실시형태는 상기 어느 하나의 실시형태에 관련되는 재발 억제약에 포함되는 저분자화합물을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는 악성종양의 재발 억제방법이다. 본 발명의 일 실시형태는 상기 어느 하나의 실시형태에 관련되는 재발 억제약에 포함되는 저분자화합물의 악성종양의 재발 억제약의 제조를 위한 사용이다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물이다(여기에서, 식(1)의 R1, R2 및 R3이 각각 H이며, R4가 4위치이고, 또한 F, Cl, 니트로, OH, CH₂OH, 메톡시, 메톡시메톡시 또는 tert-부틸디메틸실록시메틸이다). 이 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 사용하면 악성종양, 암 줄기세포, 섬유증을 치료할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 식(1)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 Wnt/β-카테닌 신호 억제제이다(여기에서, 식(1)의 R1, R2 및 R3은 각각 H이며, R4은 4위치며, 또한 F, Cl, 니트로, OH, CH₂OH, 메톡시, 메톡시메톡시 또는 tert-부틸디메틸실록시메틸이다). 이 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 사용하면 Wnt/β-카테닌 신호를 억제할 수 있다. Wnt/β-카테닌 신호 억제제는 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo)의 각종 용도에 사용할 수 있다. Wnt/β-카테닌 신호 억제제는 예를 들면 Wnt/β-카테닌 신호 억제 효과에 의해 개선되는 질환의 치료에 사용할 수 있다.

본 명세서에서 인용하고 있는 모든 간행물, 공보류(특허 또는 특허출원)는 그 전체를 참조에 의해 인용한다.

본 명세서에서 「또는」은 문장 중에 열거하고 있는 사항의 「적어도 1개 이상」을 채용할 수 있을 때에 사용된다. 「혹은」도 상술한 바와 같다. 본 명세서에서 「2개의 값의 범위내」라고 명기했을 경우에 그 범위는 2개의 값 자체도 포함한다. 본 명세서에서 「A~B」는 A 이상 B 이하를 의미한다.

이상 본 발명의 실시형태에 대해서 서술했지만 이들은 본 발명의 예시이며, 상기 이외의 각종 구성을 채용할 수도 있다. 또한, 상기 실시형태에서 기재한 구성을 조합시켜 채용할 수도 있다.

실시예

이하에 본 발명을 실시예로 보다 더 상세히 설명하지만 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니다.

<실시예 1> 암세포 및 암 줄기세포의 억제실험

1.1 사용한 시약예

·DMEM: 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 분말 (Nissui, 히로시마(廣島), 일본), 10mL 10% NaHCO₃, 5mL 100×글루코오스, 10mL 50×글루타민, 10% 소태아혈청(FBS)(EQUITECH-BIO, Texas, USA)

·PBS (-): 137mM NaCl, 8.10mM Na₂HPO₄·12H₂O, 2.68mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄

·트립신/EDTA 용액: 나칼라이 테스크(Nacalai Tesque), 0.25% 트립신, 1mM EDTA

·저분자화합물 IC-2(식(3)), PN3-13(식(4)), HC-1(식(6)), ICG-001은 WO2012/141038에 기재된 방법에 따라 합성했다.

1.2 세포배양

간암세포주 HuH7 세포를 10cm의 세포배양접시(TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) 상에서 DMEM을 사용하여 5% CO₂, 37℃, 100% 습도하에서 배양했다. 70~90% 컨플루언트(Confluent)된 상태에서 트립신/EDTA 용액 200μL을 가하여 세포를 떼어내고 1000rpm로 5분간 실온에서 원심하여 세포를 회수하고, 1디쉬(dish)분을 4디쉬에 나누어서 계대했다.

1.3 암세포의 억제 효과 (WST 분석(assay))

70~90% 컨플루언트된 HuH7세포를 회수하여 96웰 플레이트 (FALCON)의 각 웰에 농도의존적 항종양 효과 검토에서는 1×10⁴개씩, 시간의존적 항종양 효과 검토에서는 5×10³개씩 파종했다. 24시간 후 IC-2, PN3-13 또는 HC-1로 세포를 처리하고 37℃에서 배양했다. 컨트롤에는 DMSO를 사용했다.

각 저분자화합물의 농도는 이하와 같다. IC-2: 0, 1, 5, 10, 25, 50μM, PN3-13: 0, 1, 5, 10, 25, 50μM, HC-1: 0, 1, 5, 10, 25, 50μM. 농도의존적 항종양 효과 검토에서는 약제처리 4일 후에, 시간의존적 항종양 효과 검토에서는 약제처리 0, 1, 2, 4일 후에 10% 테트라칼라 원(TetraColor ONE)(SEIKAGAKU CORPORATION, 도쿄 (東京), 일본)을 100μL 가하여 37℃에서 45분간 배양 후, 96구멍용 마이크로 플레이트 리더(Micro Plate Reader)(TECAN, Zurich, Switzerland)를 사용하여 흡광도(측정파장 450nm/대조파장 600nm)를 측정했다. 측정 결과는 시약만의 흡광도와의 차를 취함으로써, 세포만의 흡광도로 하고, 이것을 생(生) 세포수로 했다. 또한, 각 저분자화합물의 IC50은 IC50=10{LOG(A/B)×(50-C)/(D-C)+LOG(B)}에 의해 구했다. A는 50%를 포함하는 높은 농도, B는 50%를 포함하는 낮은 농도, C는 B에서의 저해율, D는 A에서의 저해율을 나타낸다.

이상의 결과, IC-2로 처리한 결과 HuH7 세포의 증식이 현저하게 억제되었다(도 1, 2). 또한, PN3-13으로 처리했을 경우에도 HuH7 세포의 증식이 현저하게 억제되었다(도 3, 4). 또한, HC-1로 처리했을 경우에도 HuH7 세포의 증식이 억제되었다(도 5).

1.5 암 줄기세포의 억제 효과(FACS 분석)

이하의 순서로 암 줄기세포 마커 CD44를 지표로 저분자화합물에 의한 암 줄기세포의 억제 효과를 조사했다. 70~90% 컨플루언트된 HuH7 세포를 회수하여 10cm 디쉬(TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland)에 1.5×10⁶개씩 파종했다. 15시간 후 헥사클로로펜(Hexachlorophen)(15μM), ICG-001(15μM), PKF118-310(5μM), IC-2(50μM), PN3-13(10μM) 또는 5-FU(0.5μM)로 처리하여 37℃에서 배양했다. 컨트롤에는 각 저분자화합물, 항암제의 용매로 했던 DMSO를 사용했다. 약제처리 2일 후 세포를 디쉬로부터 회수하여 1000rpm, 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 1mL의 0.5% FBS/2mM EDTA/PBS로 2번 세척했다. 5% BSA/0.5% FBS/2mM EDTA/PBS 500μL에 현탁하고 15분간 4℃에서 1 블로킹 (blocking)을 실시했다.

항-인간 CD44 단일클론항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)를 5μL 가한 후 현탁하여 10분간 4℃, 암소(暗所)에서 1차항체반응을 진행했다. 그 후, PBS 1mL로 3번 세정했다. 염소 항-마우스 IgG Alexa 488표지(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)를 1.0μg 가한 후 현탁하고 10분간 4℃, 암소에서 2차항체반응을 진행했다. PBS 1mL로 3번 세정한 후 5% FBS/2mM EDTA/DMEM으로 1번 더 세정했다. 그리고 5% FBS/2mM EDTA/PBS 500μL에 현탁하고 40μm의 메쉬 튜브(Becton, Dickinson and Company, Franklin, Lakes NJ, USA)에 통과시켰다. 벡크만 쿨터-모플로 XDP(Beckman Coulter-Moflo XDP)(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA)를 사용하여 해석을 했다. 한편, 유의차는 스튜던트t검정(양측)으로 평가하고, 도면 중의 *은 p<0.05을, **은 p<0.01을 의미한다(실시예 중의 전 도면에 공통). n=5에서 진행했다.

이상의 결과, IC-2 또는 PN3-13을 사용했을 경우 암 줄기세포의 세포수가 컨트롤에 비해 유의하게 감소해 있었다(도6). 대표적인 항암제인 5-FU를 사용했을 경우에 오히려 암 줄기세포의 세포수가 증가해 있었다.

<실시예 2> 간암 모델 마우스를 사용한 악성종양 치료 효과의 평가

CD44 양성 HuH7 세포를 피하에 이식한 마우스를 3군(DMSO군: 5마리, 5-FU군: 4마리, IC-2군: 4마리)으로 나누어 30mg/kg 5-FU, 50mg/kg IC-2, 각 약제의 용매인 DMSO를 컨트롤로 하여, 3일마다 복강 내에 투여했다. 각 마우스의 체중, 종양의 장경, 단경을 3일마다 측정하고, 종양체적은 다음과 같은 계산식에 의해 산출했다. 종양체적=장경×(단경)²×0.5. 종양체적은 0일(Day 0)의 체적으로 표준화하여 그래프를 작성했다. 5-FU의 투여량은 5-FU의 효과를 충분히 평가하기 위해 논문에서 일반적으로 채용되고 있는 25mg/kg의 두 배의 양으로 설정했다. IC-2의 투여량은 인비트로(in vitro)에서 Wnt/β-카테닌 신호 억제 효과를 나타낸 농도로부터 대응하는 농도를 산출하여 그 두 배의 양으로 설정했다.

이상의 결과, IC-2 및 5-FU 중 어느 하나를 투여했을 경우도 체중의 변화는 생기지 않았다(도 7). 이것은 IC-2 및 5-FU가 모두 안전하게 투여 가능한 것을 의미한다. 더욱이, IC-2는 5-FU보다도 현저하게 높은 악성종양의 치료효과를 나타냈다(도 8).

<실시예 3> 스피어형성능에 대한 영향

HuH7 세포를 회수 후 항-인간 CD44 단일클론항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), 염소 항체 마우스 IgG Alexa 488을 사용하여 염색하고 벡크만 쿨터-모플로 XDP(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA)에 의해 CD44 음성, CD44 양성 분획으로 분리했다. 분획한 세포를 각각 5×10⁴cells/well씩 24-웰 울트라-로 어태치먼트 멀티웰 플레이트(Ultra-Low attachment multiwell plate)(Corning, NY, USA)에 파종하고, 37℃, 5% CO₂존재하에서 20ng/mL 재조합 인간 표피성장인자(recombinant human epidermal growth factor), 20ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(human basic fibroblast growth factor), 1×B27, L-글루타민을 포함하는 DMEM/Nutrient Mixture F-12 Ham(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 배양했다. 파종 24시간 후 1% DSMO, 50μM IC-2, 10μM PN-3-13을 각 웰에 가하여 배양하고 약제처리 1주일 후 15시야/well내의 100μm 이상의 스피어수를 카운트했다.

이상의 결과, IC-2 및 PN-3-13은 CD44 음성 및 CD44 양성의 HuH7 세포의 스피어형성을 억제했다(도 9). 이것은 IC-2 및 PN-3-13이 암세포 및 암 줄기세포의 기능을 억제했다는 것을 의미한다.

<실시예 4> 암 줄기세포의 FACS 분석

4.1 CD90(암 줄기세포 마커)

간암세포주 HLF를 10cm 디쉬에 1.5×10⁶cells/dish씩 파종하고 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 배양하고 24시간 후 1% DSMO, 0.5μM 5-FU, 50μM IC-2를 가하여서 배양했다. 약제처리 2일 후 세포를 회수하고, 0.5% BSA/0.5% FBS/2mM EDTA/PBS로 블로킹 처리를 했다. 500μL 세포현탁액에 APC마우스 항-인간 CD90 항체(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 5μL 가하여 현탁하고, 4℃에서 10min 배양하는 것으로 1차 항체반응을 진행했다. 항체반응후 0.5% FBS/2mM EDTA/PBS로 2회, 5% FBS/2mM EDTA/DEME로 1회 세정하고 5% FBS/2mM EDTA/PBS 500μL로 현탁 후 1μg/mL 프로피디움 이오디드(propidium iodide)를 가하여 40μm 메쉬튜브에 통과시켰다. CD90발현세포는 벡크만 쿨터-모플로 XDP를 사용하여 해석을 했다. 5-FU의 농도는 WST분석 24시간에서의 IC₅₀의 농도에 근거하여 설정했다. IC-2의 농도는 Wnt/β-카테닌 신호 억제 효과를 나타낸 농도에 근거하여 설정했다.

상기의 결과, CD90 발현세포의 비율은 DMSO가 21.8%, 5-FU가 24.1%, IC-2가 13.5%이었다(도 10). 즉 IC-2는 높은 간암 줄기세포 억제 효과를 나타냈다.

4.2 CD133(암 줄기세포 마커)

간암세포주 HepG2를 10cm 디쉬에 1.5×10⁶cells/dish씩 파종하고, 37℃, 5% CO₂존재하에서 배양했다. 24시간 후 1% DSMO, 0.5μM 5-FU, 50μM IC-2를 가하여 배양하고 약제처리 2일 후에 회수한 세포는 0.5% BSA/0.5% FBS/2mM EDTA/PBS로 블로킹처리를 했다. 500μL 세포현탁액에 항-인간 CD133 단일클론항체(Miltenyi Biotec)를 50μL 가하여 현탁하고 4℃에서 10min 배양하는 것으로 1차 항체반응을 진행했다. 1차항체반응 후 PBS 1mL로 3회 세정하고 염소 항-마우스 IgG Alexa 488표지(Life Technologies Corp., Carls bad, CA, USA)를 1.0μg 가한 후 현탁하고 10분, 4℃, 암소에서 2차항체반응을 진행했다. 5% FBS/2mM EDTA/PBS로 2회, 5% FBS/2mM EDTA/DEME로 1회 세정하고, 5% FBS/2mM EDTA/PBS 500μL로 현탁 후 1μg/mL 프로피디움 이오디드(propidium iodide)를 가하고 40μm 메쉬 튜브에 통과시켰다. CD133발현세포는 벡크만 쿨터-모플로 XDP를 사용하여 해석을 했다.

상기의 결과, CD133 발현세포의 비율은 DMSO가 57.1%, 5-FU가 33.3%, IC-2가 1.45%이었다(도 11). 즉, IC-2는 높은 간암줄기세포 억제 효과를 나타냈다.

4.3 EpCAM(암줄기세포 마커)

간암세포주 HepG2를 10cm 디쉬에 1.5×10⁶ cells/dish씩 파종하고 37℃, 5% CO₂존재하에서 배양했다. 24시간 후 1% DSMO, 0.5μM 5-FU, 50μM IC-2을 가하여 배양하고 약제처리 2일 후에 회수한 세포는 0.5% BSA/0.5% FBS/2mM EDTA/PBS로 블로킹처리를 했다. 500μL 세포현탁액에 항-인간 EpCAM 단일클론항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)를 0.3μL 가하여 현탁하고 4℃에서 10min 배양하는 것으로 1차항체반응을 진행했다. 1차항체반응 후 PBS 1mL로 3회 세정하고 염소 항-마우스 IgG Alexa 488표지(Life Technologies Corp., Carls bad, CA, USA)를 1.0μg 가한 후 현탁하고 10분, 4℃, 암소에서 2차항체반응을 진행했다. 5% FBS/2 mM EDTA/PBS로 2회, 5% FBS/2mM EDTA/DEME로 1회 세정하고 5% FBS/2mM EDTA/PBS 500μL로 현탁 후 1μg/mL 프로피디움 이오디드(propidium iodide)를 가하여 40μm 메쉬 튜브에 통과시켰다. EpCAM 발현세포는 벡크만 쿨터-모플로 XDP를 사용하여 해석을 했다.

상기의 결과, EpCAM 발현세포의 비율은 DMSO가 76.2%, 5-FU가 81.4%, IC-2가 51.1%이었다(도 12). 즉 IC-2는 높은 간암줄기세포 억제 효과를 나타냈다.

<실시예 5> Wnt/β-카테닌 신호 억제 효과의 평가

5.1 CF4-CMVpro-Luc안정발현주의 수립

5×10⁶개의 HuH7세포에 30μg의 pTCF4-CMVpro-Luc를 가하여 셀젝트 프로(Cellject Pro)(Thermo, Massachusetts, USA)로 플라스미드(plasmid)의 도입을 실시했다(250V, 1500μF). 유전자도입 24시간 후 2μg/mL 푸로마이신(puromycin)을 첨가하여 셀렉션(selection)을 행하고 배지는 3~5일마다 교환했다. pTCF4-CMVpro-Luc를 도입한 HuH7 세포는 각 셀렉션(selection)을 개시한 20일 후에 콜로니 형성이 확인되었다. 형성된 콜로니는 피펫팁의 선단을 절단하여 제작한 클로닝(cloning) 링의 테두리에 바셀린을 발라 콜로니를 둘러싸고, PBS로 5배 희석한 0.25% 트립신/1mM EDTA 용액 30μL로 세포를 박리 회수하여 70μL의 DMEM을 가하고 96-웰 플레이트에 파종했다.

다음에, 70~90% 컨플루언트 된 HuH7 세포를 회수하여 24구멍 플레이트(FALCON)의 각 웰에 3.5×10⁵개씩 파종했다. 24시간 후 15mL 튜브에 세포를 회수하여 1000rpm, 5분, 실온에서 원심분리 후 1×PBS(-) 1mL로 세정하고 다시 1000rpm, 5분, 실온에서 원심분리했다. 세포덩어리를 프로테이나제 K 버퍼(Proteinase K Buffer) 375μL에 재현탁하고 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate)(SDS)를 25μL, 프로테이나제 K(20mg/mL)를 4μL 가하여 55℃, 밤새 배양함으로써 세포단백을 소화(digestion)시켰다. 다음에, 페놀/클로로포름을 400mL 가하여 보텍스(vortex)되게 하고 15000rpm, 5분, 4℃에서 원심분리한 후 상층액을 회수하여 2배량의 100% 에탄올을 가하여 -80℃, 30분 배양했다. 15000rpm, 20분, 4℃에서 원심분리 후 상층액을 버리고 70% 에탄올 500μL을 가했다. 15000rpm, 10분, 4℃에서 또 한번 원심분리하고 마지막으로 상층액을 버린 후 펠렛(pellet)을 초순수 20μL로 용해하고 1μL 분광 광도계(엘 엠에스, 도쿄(東京), 일본)으로 DNA량을 측정하여 1ng/μL이 되게 조정했다. 다음에, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)(PCR)을 실시했다. 인터널 컨트롤(internal control)로서 글리세르알데히드-3-인산 수소이탈효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH) 영역에 대한 프라이머(primer)를 사용했다. 그리고 루시페라아제(Luciferase) 영역에 대한 프라이머(primer)를 사용했다.

PCR 반응은 rTaq(TOYOBO, 오사카(大阪), 일본)을 사용하고 10μL 스케일로, 각 유전자의 증폭은 각각 95℃에서 2분, 그 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 25사이클, 72℃에서 5분(GAPDH), 95℃에서 2분, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30사이클, 72℃에서 5분(루시페라아제 유전자) 진행했다.

다음에 루시페라아제 분석을 진행했다. 70~90% 컨플루언트된 HuH7세포를 회수하고 24구멍 플레이트(FALCON)의 각 웰에 5×10⁴개씩 파종했다. 20% 패시브 리시스 버퍼(Passive Lysis Buffer)(PLB)(PROMEGA, Wisconsin, USA)를 세포파종으로부터 17시간 후에 100μL씩 24구멍 플레이트의 각 웰에 가한 후 실온에서 30분 진탕했다. 3.5ml 로렌 튜브(Rohren tube)(SARSTEDT, Numbrecht, German)에 루시페라아제 분석 시약(Luciferase Assay Reagent)(LAR)(PROMEGA)을 50μL씩 가했다.

24구멍 플레이를 사용하여 PLB로 용해한 세포를 10μL씩 가한 후 미니루매트(MiniLumat) LB 9506(Berthold Technologies, Bad Wildbad, German)을 사용해서 루시페라아제 활성을 측정했다.

5.2 루시페라아제 분석

70~90% 컨플루언트된 pTCF4-CMVpro-Luc를 안정발현하는 HuH7세포를 회수하여 96구멍 플레이트(FALCON)의 각 웰에 1×10⁴개씩 파종했다. 12시간 후 도 13에서 나타내는 농도의 IC-2, PN-3-13 또는 5-FU로 처리하고 37℃에서 배양했다. 컨트롤에는 DMSO를 사용했다. 저분자화합물 처리 2일 후 스테디-글로(Steady-Glo)(PROMEGA, Wisconsin, USA)를 96구멍 화이트 플레이트(Corning Inc., New York, USA)에 100μL씩 각 웰에 가한 후 5분간 실온에서 배양했다. 그후, 형광 플레이트 리더 인피니트 F500(TECAN, Zurich, Switzerland)을 이용하여 루시페라아제 활성을 측정했다.

이상의 결과, IC-2 및 PN-3-13은 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과를 나타냈다(도 13). 5-FU는 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과를 나타내지 않았다.

<실시예 6> 대장암에 대한 항종양 효과

6.1 세포배양

대장암세포(DLD-1, HCT 116, colo 205)를 10cm 세포배양접시(TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) 위에서, DMEM을 사용하여 5% CO2, 37℃, 100% 습도하에서 배양했다. 계대는 70~90% 컨플루언트 시에 PBS(-)로 세정한 후 PBS(-) 2mL에 대해 트립신/EDTA를 300μL 가하여 37℃에서 5분 배양하고, 세포를 박리한 후 DMEM 5mL를 사용하여 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1000rpm으로 3분 원심분리 후 상층액을 제거하고 DMEM에 현탁 후, 1:4로 계대했다.

6.2 항종양 효과

대장암세포(DLD-1, HCT 116 또는 colo 205)를 96-웰 플레이트(TPP)에 5×10⁵개씩 파종했다.

24시간 후 IC-2, PN3-13 또는 HC-1을 도 14~16에 나타내는 농도로 처리했다. 저분자화합물로 처리 후 48시간 후에, 10% 테트라칼라 원(TetraColor ONE)(SEIKAGAKU CORPORATION, 도쿄(東京), 일본) 100μL을 가한 후 37℃에서 배양하여 96-웰용 마이크로 플레이트 리더(Micro Plate Reader)(TECAN, Zurich, Switzerland)를 이용하여 흡광도(측정파장 450nm/대조파장 600nm)를 측정했다.

이상의 결과, IC-2, PN3-13 및 HC-1은 대장암세포의 증식억제 효과를 나타냈다(도 14~16).

6.3 스피어 형성능의 평가

DLD-1에 대하여 세포표면 마커 CD44의 발현을 지표로서, 상위 5%의 집단 및 하위 5%의 집단으로 분획했다. 1차항체는 항-인간 CD44 항체(Anti-human CD44 antibody)(Abcam Ltd., Cambridge, UK)를 사용하고 goat IgG Alexa 488 anti-mouse(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)를 사용한 후 MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)로 각 집단을 해석·분취했다. 회수한 세포는 24웰 울트라-로 어태치먼트 멀티웰 플레이트(Ultra-Low attachment multiwell plates)(Corning Inc., Corning, NY)를 이용해 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(recombinant human basic fibroblast growth factor)(bFGF:코어 프론트 주식회사, 도쿄(東京), 일본) 20ng/mL, 및 재조합 인간 표피성장인자(recombinant human epidermal growth factor)(Sigma Life Science, St. Louis, United States) 20ng/mL, B-27 (life technologies), L-글루타민(invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) 200mmol/L, 0.6% 메틸셀룰로오스(methyl cellulose)(Sigma Life Science)를 첨가한 혈청무첨가 DMEM/F12 배지(Sigma Life Science) 500μl하에서 각 웰에 5000세포를 산포하고, 스피어형성능의 차이를 검토했다. 3일째에 상기 조성의 배지 500ml를 추가하고 7일째에 평가했다. 위상차현미경으로 웰마다 10시야를 사진촬영하고, 합계 스피어수를 무료 소프트웨어 Image J로 계산하고, 그 합계수를 각 군에서 비교했다.

DLD-1에서 CD44를 보다 강하게 발현하는 세포집단에서의 1 웰당의 스피어형성수는 CD44의 발현이 약한 세포집단과 비교해 유의차를 가져서 높았다(도 17). 이로부터 CD44를 강하게 발현하는 군에는 스피어형성능을 나타내고, 또한 암줄기세포성을 가진 세포가 보다 많이 포함된다는 것이 나타났다.

6.4 암 줄기세포의 억제 효과

DLD-1을 10cm 디쉬에 1×10⁶개 파종했다. 24시간 후 5-FU: 0.5, 5μM 또는 IC-2: 50μM으로 처리했다. 48시간 후 세포를 회수했다. 1차 항체는 Anti-human CD44 antibody(Abcam Ltd., Cambridge, UK)를 사용하고 goat IgG Alexa 488 anti-mouse(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)를 사용했다. 그 후, MoFlo XDP(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)로 해석을 했다.

이상의 결과, IC-2의 처리에 의해, 컨트롤에 대해서 CD44^high세포(CD44을 강하게 발현하는 세포)의 비율이 유의하게 감소해 있었다(도 18). 즉, IC-2는 암 줄기세포에 대해 억제 효과를 나타냈다. 한편, 5-FU에서는 오히려 증가해 있었다.

6.5 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과

대장암세포(DLD-1, HCT 116, colo 205)를 24-웰 플레이트에 3.34×10⁴개씩 파종했다. 24시간 후 1μL 리포펙타민(lipofectamine) 2000(invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), 50ng pTCF4-CMVpro-FLuc, 2.5 ng pCMVpro-Rluc을 사용하여 트랜스펙션(transfection)을 진행했다. 4시간 후 IC-2, PN3-13 또는 HC-1을 도 19~21에 나타내는 농도로 처리했다. 저분자화합물 처리 48시간 후 20% 패시브 리시스 버퍼(Passive Lysis Buffer)(PROMEGA, Wisconsin, USA)을 24구멍 플레이트에 100μL씩 가하여 상온에서 15분 진탕한 후 -30℃에서 하루밤 정치했다. 다음날 듀얼-루시페라아제R 리포터 분석시스템(Dual-LuciferaseR Reporter Assay System)(PROMEGA)을 사용해 미니루매트(MiniLumat) LB 9506(Berthold Technologies, Bad Wildbad, German)로 루리페라아제 활성을 측정했다.

이상의 결과, IC-2, PN3-13 및 HC-1은 대장암세포의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과를 나타냈다(도 19~21).

<실시예 7> 편평상피암에서의 항종양 효과

7.1 세포배양

편평상피암세포주 HSC2를 10cm 세포배양접시(TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) 위에서 DMEM을 사용하여 5% CO₂, 37℃, 100% 습도하에서 배양했다. 계대는 70~90% 컨플루언트 시에 PBS(-)로 세정한 후 PBS(-) 2mL에 대해 트립신/EDTA를 300μL 가하여 37℃에서 5분 배양하고 세포를 박리한 후, DMEM 5mL를 사용하여 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1000rpm으로 3분 원심분리하여 상층액을 제거하고 DMEM에 현탁한 후 1:4로 계대했다.

7.2 항종양 효과

HSC2를 96-웰 플레이트(TPP)에 2.5×10³개씩 파종했다. 24시간 후 IC-2, PN3-13 또는 HC-1을 도 22~24에 나타내는 농도 및 시간으로 처리했다. 저분자화합물로 처리 후 48시간 후에, 10% 테트라칼라 원(TetraColor ONE)(SEIKAGAKU CORPORATION, 도쿄(東京), 일본) 100μL를 가하여 37℃에서 배양한 후 96웰용 마이크로 플레이트 리더(Micro Plate Reader)(TECAN, Zurich, Switzerland)를 이용하여 흡광도(측정파장 450nm/대조파장 600nm)를 측정했다. 또한, 편평상피암세포주 HSC3에 대해서도 상기와 같은 방법으로 배양한 후에 IC-2에 의한 항종양 효과를 조사했다.

이상의 결과, IC-2, PN3-13 및 HC-1은 편평상피암세포의 증식억제 효과를 나타냈다(도 22~25).

7.3 암줄기세포의 억제 효과

HSC2를 10cm 디쉬에 5×10⁵개 파종했다. 24시간 후 5-FU: 0.5μM, IC-2: 25μM, PN-3-13: 7.5μM 또는 HC-1: 50μM으로 처리했다. 또한, 저분자화합물로 처리하지 않은 세포도 조제했다(0μM). 48시간 후 각 세포를 회수했다. 1차항체로 Anti-human CD44 antibody(Abcam Ltd., Cambridge, UK)를 사용하고 goat IgG Alexa 488 anti-mouse (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)를 사용했다. 그 후 BD bioscience FACS Aria cell sorter(BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 해석을 했다. 한편, 각 저분자화합물의 농도는 WST분석 48시간에서의 IC₅₀의 농도에 근거하여 설정했다.

이상의 결과, CD44 발현세포의 비율은 저분자화합물로 처리하지 않은 경우가 83.9%였던 것에 비해 IC-2에서는 71.4%로, PN-3-13에서는 68.4%로, HC-1에서는 49.8%로 감소했다(도 26). 즉, IC-2, PN3-13 및 HC-1은 암줄기세포의 억제 효과를 나타냈다. 또한, 그 중에서도 HC-1의 효과가 현저했다. 한편, 5-FU에서는 83.3%로서 변화는 보이지 않았다.

7.4 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과

HSC2를 24-well plate에 5×10⁴개씩 파종했다. 24시간 후 1μL 리포펙타민 2000(invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), 50ng pTCF4-CMVpro-FLuc, 2.5 ng pCMVpro-Rluc을 사용해서 트랜스펙션처리했다. 4시간 후 IC-2, PN3-13 또는 HC-1을 도 27~29에 나타내는 농도로 처리했다. 저분자화합물로 처리 후 48시간 후에 20% 패시브 리시스 버퍼(Passive Lysis Buffer)(PROMEGA, Wisconsin, USA)를 24구멍 플레이트에 100μL씩 가하여 상온에서 15분간 진탕한 후 -30℃에서 하루밤 정치했다. 다음날, 듀얼-루시페라아제R 리포터 분석시스템(Dual-LuciferaseR Reporter Assay System)(PROMEGA)을 이용하여 미니루매트(MiniLumat) LB 9506(Berthold Technologies, Bad Wildbad, German)로 루시페라아제 활성을 측정했다.

이상의 결과, IC-2, PN3-13 및 HC-1은 편평상피암세포의 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과를 나타냈다(도 27~29).

<실시예 8> IC-2 유도체의 평가

8.1 합성

IC-2 유도체의 합성을 도 30~35에 나타내는 스킴(scheme)에 따라 진행했다. 합성의 상세에 대해서는 이하에 설명한다. 합성한 IC-2 유도체의 구조식과 스펙트럼(spectrum) 데이터를 도 36 및 37에 나타낸다.

화합물 1

1-나프탈데히드(1-naphtaldehyde)(1.6g, 10mmol)와 2,2-디에톡시에탄아민(2,2-dietoxyethanamine)(1.3g, 10mmol)을 혼합하여 100℃에서 30min~1hr교반했다. 냉각한 후 반응혼합물에 EtOH(25mL)을 넣고 균일하게 교반한 후 NaBH₄(0.38g, 10mmol)을 소량씩 넣고, 그 후는 실온에서 1hr~하루밤 교반했다. 반응 종료 후 감압농축함으로써 EtOH를 증류제거하고 취득한 잔사에 물(적량)을 넣어 생성물을 AcOEt로 추출했다. 분리한 유기층은 포화식염수로 세정하고 Na₂SO₄로 건조시킨 후 여과 및 감압농축을 진행했다. 취득한 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피 (AcOEt/hexane=5/1)로 정제함으로써 화합물 1(2.3g, 8.5mmol, 85%)을 무색투명한 액체로 얻었다.

화합물 2b

Fmoc-L-Phe-OH(0.54g, 2.0mmol)의 dry-DMF(7mL) 용액에 HATU(0.76g, 2.0mmol) 및 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)(DIEA)(0.26g, 2.0mmol)을 넣고 실온에서 30분간 교반한 후 그 반응혼합물에 화합물1(0.54g, 2.0mmol)을 첨가하고 실온에서 하루밤 교반했다. 반응 종료 후 물(20mL)을 넣고 생성물을 AcOEt로 추출했다. 분리한 유기층은 포화식염수로 2번 세정하고 Na₂SO₄로 건조시킨 후 여과 및 감압농축을 진행했다. 취득한 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피 (AcOEt/hexane=1/2)로 정제함으로써 화합물 2b(1.2g, 1.9mmol, 95%)를 무색고체로 얻었다.

화합물 3b

화합물 2b(1.1g, 1.7mmol)의 CH₂Cl₂(20mL) 용액에 디에틸아민(diethylamine)(DEA)(10mL)을 넣고 실온에서 3시간 교반했다. 반응 종료 후에 감압농축에 의해 CH₂Cl₂ 및 과잉의 DEA를 증류제거하고 취득한 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/EtOH=5/1)로 정제함으로써 화합물 3b(0.55g, 1.3mmol, 76%)를 무색투명한 점성액체로 얻었다.

화합물 4b

Fmoc-β-Ala-OH(2.5g, 8.0mmol)의 dry-DMF (15mL) 용액에 HATU(3.3g, 8.7mmol)과 DIEA(1.1g, 8.5mmol)를 넣고 실온에서 30분간 교반 후 그 반응 혼합물에 화합물 3b(3.3g, 7.8mmol)를 넣고 실온에서 하루밤 교반했다. 반응종료 후 물(30mL)을 넣고 생성물을 AcOEt로 추출했다. 분리한 유기층을 포화식염수로 2번 세정하고 Na₂SO₄로 건조시킨 후 여과 및 감압농축을 진행했다. 취득한 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/hexane=3/1)로 정제함으로써 화합물 4b(5.1g, 7.1mmol, 91%)를 무색고체로 얻었다.

화합물 6b

화합물 4b(2.8g, 3.9mmol)의 CH₂Cl₂(10mL) 용액에 DEA(6mL)를 넣고 실온에서 3~4시간 교반했다. 감압농축에 의해 CH₂Cl₂ 및 과잉의 DEA를 증류제거하여 얻은 잔사에 CH₂Cl₂(적량)을 가하고 균일한 용액으로 한 후 다시 감압농축을 진행했다. 이 조작을 2번 진행한 후 얻어진 잔사에 CH₂Cl₂(10mL)을 넣고 균일하게 교반한 후 벤질이소시아네이트(benzyl isocyanate)(0.78g, 5.9mmol)을 넣고 실온에서 하루밤 교반했다. 반응종료 후 감압농축에 의해 CH₂Cl₂을 증류제거하고 얻어진 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/EtOH=30/1)로 정제함으로써 화합물 6b(1.5g, 2.4mmol, 62%)를 무색고체로 얻었다.

화합물 6b-R

화합물 6b-R(치환기 R = OMe, Cl, F)에 관해서는 도 31에 나타낸 스킴에 따라서 합성을 실시하였다.

화합물 8b

화합물 4b(1.6g, 2.3mmol)에 포름산(10mL)을 넣고 실온에서 하루밤 교반했다. 반응종료 후 감압농축에 의해 포름산을 증류제거하여 얻어진 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/hexane=4/1)로 정제해 화합물 8b(1.3g, 2.1mmol, 91%)를 무색고체로 얻었다.

화합물 9b

화합물 8b(1.1g, 1.8mmol)의 CH₂Cl₂(5.5mL) 용액에 디에틸아민(diethylamine)(1.3g, 18mmol, 1.8mL)을 넣고 실온에서 3시간 교반했다. 반응종료 후 감압농축에 의해 CH₂Cl₂을 증류제거하여 얻은 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/EtOH=7/1)로 정제해 화합물 9b(0.57g, 1.4mmol, 78%)를 무색고체로 얻었다.

IC-2(화합물 6b로 합성)

화합물 6b(1.3g, 2.1mmol)에 포름산(8mL, 0.21mol)을 넣고 실온에서 하루밤 교반했다. 반응종료 후 감압농축에 의해 포름산을 증류제거하고 얻은 잔사를 컬럼크로마토그래피(AcOEt/EtOH=30/1)로 정제함으로써 무색고체 IC-2(1.0g, 1.9mmol, 90%)를 얻었다.

IC-2-R

화합물 IC-2-R(치환기 R = OMe, Cl, F, NO₂)에 관해서는 도 31에 나타낸 스킴에 따라서 합성을 실시하였다.

IC-2(화합물 9b로 합성)

화합물 9b(3.3g, 8.3mmol)의 CH₂Cl₂(10mL) 용액에 벤질이소시아네이트(benzyl isocyanate)(1.4g, 11mmol)를 넣고 실온에서 하루밤 교반했다. 반응종료 후 감압농축에 의해 CH₂Cl₂을 증류제거하여 얻은 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피 (AcOEt/EtOH=30/1)로 정제함으로써 무색고체 IC-2(3.7g, 6.9mmol, 83%)를 얻었다.

4-(4-메톡시벤질옥시)페닐아세트산(4-(4-Methoxybenzyloxy)phenylacetic acid)

메틸 4-하이드록시페닐아세테이트(methyl 4-hydroxyphenylacetate)(2.7g, 16mmol)의 dry-DMF(20mL) 용액에 K₂CO₃(4.4g, 32mmol), 4-메톡시벤질클로라이드(4-methoxybenzyl chloride)(1.3g, 8mmol)를 넣고 실온에서 24시간 교반했다. 반응혼합물을 얼음물(30mL)에 넣고 생성물을 EtOAc로 추출했다. 분리한 유기층은 포화식염수로 세정하고 Na₂SO₄로 건조시킨 후 여과 및 감압농축을 진행했다. 얻은 잔사에 MeOH(24mL), THF(8mL)을 넣고 균일하게 교반한후 NaOH수용액(0.96g, 24mmol, 6mL)을 천천히 넣으면서 실온에서 2시간 교반했다. 감압농축에 의해 유기용매를 증류제거한 후, 물(50mL)을 넣고 1M-황산으로 산성으로 조절한 후 초산에틸과 THF로 생성물을 추출했다. 유기층을 포화식염수로 2번 세정한 후 Na₂SO₄로 건조시키고 여과 및 감압농축을 진행했다. 얻은 잔사를 재결정(EtOAc-THF)에 의해 순수한 4-(4-메톡시벤질옥시)페닐아세트산(4-(4-Methoxybenxyloxy)phenylacetic acid)(1.8g, 6.8mmol, 85%)을 얻었다.

4-메톡시메톡시페닐아세트산(4-Methoxymethoxyphenylacetic acid)

메틸 4-하이드록시페닐아세테이트(Methyl 4-hydroxyphenylacetate)(2.5g, 15mmol)의 CH₂Cl₂(15mL) 용액에 DIEA(3.9g, 30mmol)을 넣고 빙수욕에서의 냉각하에, 클로로메틸 메틸 에테르(Chloromethyl Methyl Ether)(1.8g, 23mmol)를 넣고 10분간 그 온도에서 교반한 후, 실온으로 되돌리고 하루밤 더 교반했다. 감압농축에 의해 CH₂Cl₂ 및 과잉의 클로로메틸 메틸 에테르(Chloromethyl Methyl Ether)를 제거한 후 MeOH (25mL)을 넣고 균일하게 교반한 후 KOH수용액(3.0g, 45mmol, 5mL)을 넣고 실온에서 1.5시간 교반했다. 반응혼합물에 물(20mL)을 넣고 물층을 분리한 후 포화NH₄Cl수용액(20mL)을 넣고 희황산으로 pH를 약 4로 조정했다. 거기에 EtOAc을 넣고 유기층을 분리한 후 포화식염수로 세정하고 Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과, 감압농축 및 감압건조로 4-메톡시메톡시페닐아세트산(4-methoxymethoxyphenylacetic acid)(2.2g, 11mmol, 76%)을 얻었다.

벤질 4-하이드록시페닐아세테이트(Benzyl 4-hydroxyphenylacetate)

Ar하에서 빙수욕에 의해 냉각된 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenylacetic acid)(3.0g, 20mmol)의 dry-DMF (20mL) 용액에 NaH(60% in oil, 0.88g, 22mmol)를 가하고 30분간 교반한 후 벤질브로마이드(benzyl bromide)(6.8g, 40mmol)를 여러 번 나누어 30분간 걸쳐 투여했다. 빙수욕 냉각하에서 3시간 교반한 후 실온에서 하루밤 교반했다. 반응혼합물에 물 (20mL)과 EtOAc (20mL)을 넣고 충분히 교반한 후 유기층을 분리하고 5%-NaHCO₃ 수용액 및 포화식염수로 세정한 후 Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과 및 감압농축 후 얻어진 고체에 헥산(hexane)을 넣고 흡인여과를 진행하여 얻은 고체를 감압건조함으로써 벤질 4-하이드록시페닐아세테이트(benzyl 4-hydroxyphenylacetate)(3.4g, 14mmol, 70%)를 얻었다.

4-(tert-부틸디메틸실록시메틸)페닐아세트산(4-(tert-Butyldimethylsiloxymethyl)phenylacetic acid)

Ar하에서 빙수욕으로 냉각한 4-하이드록시메틸페닐아세트산(4-Hydroxymethylphenylacetic acid)(1.7g, 10mmol)의 dry-DMF(10mL) 용액에 NaH(60% in oil, 0.44g, 11mmol)을 넣고, 그 온도에서 30분간 교반한 후 벤질브로마이드(benzyl bromide)(3.4g, 20mmol)를 30분간 여러 번 나누어 첨가했다. 빙수욕 냉각하에서 2시간 교반한 후 실온에서 하루밤 교반했다. 반응혼합물에 물(20mL)과 AcOEt (20mL)을 넣고 충분히 교반한 후 유기층을 분리하고, 5%-NaHCO₃수용액 및 포화식염수로 세정한 후 Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과한 후 감압농축에 의해 AcOEt를 증류제거하고 감압증류에 의해 과잉의 벤질브로마이드를 증류제거했다. 얻은 잔사에 dry-DMF (10mL)를 넣고 균일하게 교반한 후 tert-부틸디메틸실릴클로라이드(tert-butyldimethylsilyl chloride)(2.0g, 13mmol)와 이미다졸(imidazole)(1.4g, 20mmol)을 넣고 실온에서 2시간 교반했다. 반응혼합물에 물(20mL)을 넣고 생성물을 AcOEt로 추출했다. 분리한 유기층은 포화식염수로 세정한 후 Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과 및 감압농축을 진행한 후 얻은 잔사에 EtOH(15mL)을 넣고 균일하게 교반한 후 5%-Pd/C(1.1g)을 넣고 계 내를 H₂로 치환했다. 실온에서 4시간 교반 후 거름종이를 2장 겹쳐 여과하여 Pd/C를 제거하고 여과액을 감압농축한 후 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피 (AcOEt/hexane=1/2)에 통과시켜 4-(tert-부틸디메틸실록시메틸)페닐아세트산(4-(tert-butyldimethylsiloxymethyl)phenylacetic acid)(0.95g, 3.4mmol, 34%)을 얻었다.

IC-2-OMOM

4-메톡시메톡시페닐아세트산(4-Methoxymethoxyphenylacetic acid)(0.59g, 3mmol)의 톨루엔(10mL) 용액에 디페닐포스포릴아자이드(diphenylphosphoryl azide)(0.83g, 3mmol)와 Et₃N(0.36g, 3.6mmol)을 넣고 80℃에서 2시간 교반했다. 냉각시킨 후 헥산(15mL)을 넣고 잠깐 교반한 후 상층액을 데칸테이션으로 채취했다.

잔사에 다시 헥산(7 mL)을 넣고 잠깐 교반한 후 데칸테이션으로 상층액을 채취하고, 다시 한번 더 같은 조작을 진행했다. 채취한 상층액을 감압농축하고 잔사에 CH₂Cl₂(8mL)을 넣고 균일하게 한 후 9b(0.40g, 1mmol)을 넣었다. 실온에서 혼합물을 하루밤 교반한 후 감압농축에 의해 유기용매를 증류제거하고 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt)에 통과시켜 IC-2-OMOM(0.50g, 0.85mmol, 84%)을 취득했다.

IC-2-NO2

IC-2-OMOM과 같은 순서로 4-니트로페닐아세트산(4-nitrophenylacetic acid)을 사용해 같은 조작을 했다. 단, 도중에 헥산을 넣고 상층액을 채취하는 조작은 생략하고 냉각한 후 반응혼합물에 직접 CH₂Cl₂과 화합물 9b를 넣고 진행했다. 실리카겔컬럼크로마토그래피: AcOEt/EtOH=8/1. 수율: 24%.

IC-2-OPMB

IC-2-OMOM과 같은 순서로 4-(4-메톡시벤질옥시)페닐아세트산(4-(4-Methoxybenzyloxy)phenylacetic acid)을 이용해 조작을 했다. 다만, 4-(4-메톡시벤질옥시)페닐아세트산은 톨루엔만으로는 균일한 용액을 얻을 수 없기 때문에 dry-THF(5mL)도 첨가했다. 실리카겔컬럼크로마토그래피: AcOEt/EtOH=30/1. 수율: 93%.

IC-2-MOTBS

IC-2-OMOM과 같은 순서로 4-(tert-부틸디메톡시실록시메틸)페닐아세트산(4-(tert-butyldimethylsiloxymethyl)phenylacetic acid)을 사용하여 조작을 했다. 실리카겔컬럼크로마토그래피: AcOEt. 수율: 66%.

IC-2-OH

IC-2-OMOM(0.44g, 0.74mmol)의 CH₂Cl₂(3mL) 용액에 CF₃CO₂H(1.1mL, 14mmol)을 넣고 실온에서 1시간 교반했다. 반응혼합물을 5%-NaHCO₃용액(40mL)에 천천히 투입하고 생성물을 AcOEt로 추출했다. 분리한 유기층은 포화식염수로 세정하고 Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과 및 감압농축을 진행한 후 얻은 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피 (AcOEt/EtOH=30/1)로 정제함으로써 IC-2-OH(0.16g, 0.29mmol, 39%)을 얻었다.

IC-2-MOH

IC-2-MOTBS(0.51g, 0.75mmol)의 dry-THF(8mL)용액에 빙수냉각화로 TBAF의 THF용액(1M, 1.5mL, 1.5mmol)을 넣고, 그 온도에서 10분간 교반 후 실온에서 1.5시간 교반했다. 반응혼합물에 물(20mL)을 넣은 후 생성물을 AcOEt로 추출했다. 분리한 유기층은 포화식염수로 세정하고 Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과 및 감압농축을 진행한 후 얻은 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/EtOH=10/1)로 정제함으로써 IC-2-MOH(0.30g, 0.53mmol, 71%)를 얻었다.

8.2 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과

70~90% 컨플루언트 된 pTCF4-CMVpro-Luc를 안정발현하는 HuH7 세포를 회수하여, 96구멍 플레이트(FALCON)의 각 웰에 1×10⁴개씩 파종했다. 24시간 후 도 38 및 39에 나타내는 농도의 IC-2 유도체(IC-2-OMe, IC-2-F, IC-2-Cl 또는 IC-2-NO2)로 처리하고 37℃에서 배양했다. 컨트롤에는 DMSO를 사용했다. 저분자화합물 처리 4일 후에 스테디-글로(Steady-Glo)(PROMEGA, Wisconsin, USA)를 96구멍 화이트 플레이트(Corning Inc., New York, USA)에 100μL씩 각 웰에 넣고 5분간 실온에서 배양했다. 그 후, 형광 플레이트 리더 인피니트 F500(TECAN, Zurich, Switzerland)을 이용하여 루시페라아제 활성을 측정했다.

이상의 결과, IC-2 유도체는 Wnt/β-카테닌 신호의 억제 효과를 나타냈다(도 38 및 39).

<실시예 9> 섬유화의 억제

9.1 세포배양 조건

인간 간성상세포주 LX-2 세포는 10% FBS DMEM에서 유지 배양했다. 실험에 사용하는 세포는 1% FBS DMEM에 현탁하고 파종했다. 세포밀도는 약 2.0×10⁵cell/cm²로 진행했다.

9.2 사용한 저분자화합물의 농도

IC-2: 0, 15, 20, 25μM, PN-3-13:0, 5.5, 6.0, 6.5μM, HC-1: 0, 12, 16, 20μM.

9.3 루시페라아제 분석

루시페라아제 분석에서 각 저분자화합물의 Wnt/β-카테닌 신호 억제 효과를 조사했다. 루시페라아제 분석은 도 40 및 이하 9.3.1~9.3.2에 나타내는 조건으로 실시했다. 도 40은 저분자화합물+TGFβ로 처리했을 경우의 프로토콜이지만 저분자화합물을 단독으로 또는 저분자화합물+Wnt3a로 처리했을 경우에도 같은 실험을 진행했다. 한편, TGFβ과 Wnt3a는 Wnt/β-카테닌 신호의 강도를 상승시키기 위해 첨가했다.

9.3.1 샘플회수

5×패시브 리시스 버퍼(Passive Lysis Buffer)를 MQ로 5배 희석한다. 100μl/well로 첨가하여 20분간 진탕한다. -30℃에서 O/N으로 동결한다.

9.3.2 측정

전날에 동결시킨 샘플 LARII, Stop&Glo Buffer, Stop&Glo Substrate를 약 한시간 실온에서 배양한다(샘플 이외는 차광한다). Stop&Glo액(Stop&Glo Buffer 49μl, Stop&Glo Substrate 1μl)을 샘플수+1샘플 분 준비한다. 3.5ml 튜브에 50μl의 LARII를 분주하여 샘플을 10μl 첨가한 후 측정기에 세트한다. １회째 측정이 종료하면 50μl의 Stop&Glo액을 첨가하고 다시 한번 측정기에 세트하여 측정한다.

9.3.3 결과

IC-2 처리 24시간 후의 루시페라아제 분석결과를 도 41~43에 나타낸다. IC-2단독, IC-2+TGFβ, IC-2+Wnt3a중의 어느 하나로 처리한 경우에도 LX-2세포의 Wnt/β-카테닌 신호가 억제되었다.

IC-2 처리 48시간 후의 루시페라아제 분석결과를 도 44~46에 나타낸다. IC-2단독 또는 IC-2+TGFβ로 처리한 경우에도 LX-2세포의 Wnt/β-카테닌 신호가 억제되었다.

PN3-13 처리 24, 48시간 후의 루시페라아제 분석결과를 도 47, 48에 나타낸다. PN3-13+TGFβ로 처리한 경우에 농도에 따라 LX-2세포의 Wnt/β-카테닌 신호가 억제되었다.

HC-1 처리 24시간 후의 루시페라아제 분석결과를 도 49~51에 나타낸다. HC-1단독 또는 HC-1+TGFβ로 처리한 경우에 LX-2세포의 Wnt/β-카테닌 신호가 억제되었다.

HC-1 처리 48시간 후의 루시페라아제 분석결과를 도 52~54에 나타낸다. HC-1단독, HC-1+TGFβ, HC-1+Wnt3a 중의 어느 하나로 처리한 경우에도 LX-2세포의 Wnt/β-카테닌 신호가 억제되었다.

9.4 실시간 PCR

실시간 PCR로 각 저분자화합물의 섬유화 억제 효과를 조사했다. 실시간 PCR은 도 55 및 이하 9.4.1~9.4.2에 나타내는 조건으로 진행했다. 한편, TGFβ, α-SMA, COL1A1은 섬유화 마커이다.

9.4.1 샘플 조제

MQ: 5.2μL/샘플, MgCl₂: 0.8μl/샘플, 10μM 프라이머 F: 0.5μl, 10μM 프라이머 R: 0.5μl, LightCycler FastStart DNA Master SYBER GreenI (1a+1b): 1.0μM/샘플을 pre-Mix로써 조제하고 각 웰에 8μL씩 분주한다. 샘플은 2μL 첨가한다.

9.4.2 PCR 반응 온도

- GAPDH

95℃:10min→[95℃:10sec→60℃:10sec→72℃:10sec]×35cycle

-α-SMA

95℃:10min→[95℃:10sec→56℃:5sec→72℃:10sec]×40cycle

- COL1A 1

95℃:10min→[95℃:10sec→58℃:5sec→72℃:10sec]×40cycle

- TGFβ

95℃:10min→[95℃:1sec→56℃:5sec→72℃:10sec]×40cycle

9.4.3 결과

IC-2+TGFβ 처리 24, 48시간 후의 실시간 PCR 결과를 도 56~58에 나타낸다. IC-2농도의 증가에 따라 섬유화 마커의 발현량이 감소했다. 특히 α-SMA의 발현량은 현저하게 감소했다.

PN3-13+TGFβ 처리 24, 48시간 후의 실시간 PCR의 결과를 도 59~61에 나타낸다. 24시간 처리시의 TGFβ 이외는 PN3-13 농도의 증가에 따라 섬유화 마커의 발현량이 감소했다. 특히 α-SMA의 발현량은 현저하게 감소해 있었다.

HC-1+TGFβ 처리 24, 48시간 후의 실시간 PCR 결과를 도 62~64에 나타낸다. HC-1농도의 증가에 따라 섬유화 마커의 발현량이 감소했다. 특히 α-SMA의 발현량은 현저하게 감소해 있었다.

<실시예 10> 간장해 모델 마우스를 사용한 섬유증 치료효과의 평가

10.1 실험동물 및 사육조건

7주령의 C57BL/6수컷 마우스(일본SLC, 시즈오카(靜岡), 일본)를 1주일 예비사육해 건강한 마우스를 사용했다. 예비사육 및 실험기간을 통하여 실온 22±1℃, 습도 50±5%의 동물실에서 사육하고 사료 및 물은 자유롭게 섭취시켰다.

10.2 간섬유화 유도방법 및 약품의 투여방법

사염화탄소(CCl₄: 와코쥰야쿠공업(和光純藥工業), 오사카(大阪), 일본)를 0.2ml/kg, 주 3회, 4, 6 및 8주간, 마이크로시린지(micro syringe)(이토(伊藤) 제작소, 시즈오카(靜岡), 일본)로 복강내에 투여했다. 사염화탄소는 옥수수 기름 (와코쥰야쿠공업(和光純藥工業))에 용해한 농도 10%의 용액을 사용했다. 이 사염화탄소 용액을 4주간 투여　후 마우스를 비히클(Vehicle)투여군, 글리시리진 투여군, ICG-001투여군 및 IC-2투여군으로 나누어, 사염화탄소와 동시에 하기한 방법에 의해 조제한 약액을 주 3회, 4주간 마이크로시린지를 이용하여 복강　내에 투여했다. 한편, 사염화탄소와 약액은 1일마다 교차적으로 투여했다.

글리시리진(도쿄화성공업, 도쿄(東京), 일본)을 생리식염수 중에 용해시켜 4M NaOH액으로 pH 7.0로 조절해 30mg/ml의 농도로 조제했다. IC-2 및 ICG-001(AdooQ BioScience, California, USA)은 각각 40mg/ml 및 10mg/ml의 농도로 되게 WellSolve (세레스테(celeste), 도쿄, 일본)중에 용해하고, 계속하여 60℃의 탕욕에서 10분간 가열하여 완전히 용해시켰다. 이들 약제가 용해된 WellSolve용액에 9배량의 생리식염수를 첨가했다. 다음에 글리시리진은 150mg/kg, IC-2은 10.6, 21.2mg/kg, ICG-001은 5mg/kg로 되게끔 필요한 양의 약액을 취하고, IC-2 및 ICG-001은 웰솔브(WellSolve) 및 생리식염수를 1:9의 비율로 혼합한 용액, 글리시리진은 생리식염수를 가하여 액량을 200μl로 조제했다. 또한, WellSolve 및 생리식염수를 1:9의 비율로 혼합한 용액을 비히클로서 준비했다. 한편, IC-2의 투여량은 인비트로(in vitro)에서의 유효농도에 근거하여 설정했다.

10.3 간장의 적출

사염화탄소를 4주일 투여한　후, 5마리의 마우스에 대하여 27G주사 바늘을 장착한 1mL의 일회용 시린지(Disposable syringe)를 사용하여 1g당 1μl의 전신마취약 솜노펜틸(somnopentyl)(교리쯔(共立) 제약, 도쿄(東京), 일본)을 복강내에 투여하고 마취 도입했다. 마취 도입 후 27G주사바늘 및 1 mL시린지 (syringe)를 이용하여 하대정맥으로부터 혈액을 전부 채취한 뒤 간장 전부를 적출했다. 또 사염화탄소 8주간 투여 후에 각 군의 8마리 마우스에 대해 상기와 같은 조작을 진행했다. 적출한 간장 중에서 1cm 각(角) 정도의 조직편을 조직학적 해석용으로서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(nacalai tesque, 교토(京都), 일본)에 침지했다. 나머지 간조직편은 수술용 기구로 세편하여 액체질소로 순간동결한 후 실험에 사용할때까지 -80℃의 초저온에 보존했다.

10.4 히드록시 프롤린 (proline)의 측정

상기한 방법에 의해 적출한 동결간조직편을 습중량 50mg이 되도록 수술용 기구로 베어내고 500μl의 초순수(超純水)를 넣고 폴리트론 균질기로 파쇄했다. 파쇄액을 액체질소로 한번 동결하고 실온에서 융해한 후 초음파세포파쇄장치 BioRuptur (코스모 바이오, 도쿄(東京), 일본)을 이용하여 얼음물 중에서 15초, 냉각 15초를 1사이클로 해서, 계 30사이클, 15분간 초음파처리를 실시했다. 이 파쇄용액 100μl에 등량의 12N 농염산을 넣고 120℃로 설정한 블록 인큐베이터(IKA, Staufen, Germany)로 16시간의 가수분해처리를 실시했다. 남은 파쇄액은 용액 중의 단백질량의 측정에 사용했다. 가수분해처리 후 실온에서 냉각시킨 후에, 피페팅(petting)에 의해 가수분해산물을 잘게 분쇄하고, 실온에서 3000 rpm으로 5분간 원심조작을 실시했다. 원심조작 후 10μl 상층액을 1.5mL튜브에 넣고 냉각증발기(사쿠마(佐久間) 제작소, 도쿄(東京), 일본)로 염산을 제거했다. 계속해서 하이드록시프롤린 정량화 키트(Hydroxyproline quantification kit)(BioVision, California, USA)를 사용하여 하이드록시 프롤린(proline) 측정을 진행했다. 염산을 제거한 가수분해용물에 100μl의 클로라민T용액을 첨가하여 보텍스(vortex)로 충분히 교반한후 25분간 정치했다. 그 후에 DMAB용액을 100μl 넣고 60℃의 탕욕에서 90분간 반응시켰다. 실온까지 냉각　후 96구멍 플레이트에 반응용액을 옮겨 560nm의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(TECAN, Zurich, Switzerland)로 측정했다. 검량선에 의해 얻어진 흡광도로부터 하이드록시 프롤린의 양을 산출했다.

파쇄용액 중의 단백질량은 단백질 분석 농축색소시약 (Bio-Rad, California, USA)을 이용하여 브래드포드(Bradford)법에 의해 측정했다. 파쇄용액을 15000rpm, 4℃, 10분간 원심분리해 얻어진 상층액을 1μl씩 96구멍 플레이트에 분주했다. 거기에 초순수로 5배 희석한 프로테인 분석 염료 시약 농축물(Protein assay Dye Reagent concentrate)을 200μl 넣고 교반한 후 15분간 정치하고 595nm의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(TECAN)로 측정했다. 검량선에 의해 얻어진 흡광도로부터 파쇄용액 1μl당의 단백질량을 산출하고 단백질량당의 하이드록시 프롤린의 양을 계산하여 섬유화 레벨을 평가했다.

10.5 시리우스 레드 염색

상기의 방법에 의해 적출한 간조직편은 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 실온에서 16시간 고정하고 파라핀 (Parrafin)으로 포매(包埋)한 후 마이크로톰으로 조직절편을 제작하여 Picosirius Red Stain Kit (Polysciences, Pennsylvania, USA)을 이용해서 첨부된 사용방법으로 시리우스 레드 염색에 의한 콜라겐 섬유 염색을 진행했다. 그 후, 도립형 형광위상차현미경 BZ-9000(키엔스, 도쿄(東京), 일본)을 이용하여 밝은 시야하에서 100배 확대상을 각 조직절편 당 10장씩 촬영하고 각 촬영 이미지 중의 조직면적에 대해 빨갛게 염색된 섬유의 면적을 측정하여 섬유화 양성면적비를 정량했다.

10.6 결과

히드록시 프롤린 (proline) 량의 측정 결과를 도 65에 나타낸다. 비히클 투여군과 비교하여 글리시리진 투여군 (양성 컨트롤)에서 히드록시 프롤린 (proline) 량이 저하되고 IC-2 투여군에서는 큰 저하를 확인했다.

시리우스 레드 염색에 의한 섬유화영역의 정량결과를 도 66에 나타낸다. 비히클군과 비교하여 IC-2 투여군에서 섬유화영역의 감소를 확인했다.

<고찰>

상술한 바와 같이, IC-2 등을 채용함으로써 암세포 및 암 줄기세포의 증식이 억제되는 것이 나타났다. 암 줄기세포는 악성종양의 재발이나 전이의 원인이 될 수 있는 것이 알려져 있다. 그 때문에 암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있는 IC-2 등은 악성종양의 치료약의 유효성분으로서 매우 뛰어난 화합물이라고 할 수 있다. 또한, IC-2 등은 암의 발생 원인이 될 수 있는 섬유화의 억제 효과도 갖고 있었다.

이상 본 발명을 실시예에 근거하여 설명했다. 이상의 실시예는 어디까지나 예시이며 이외에 여러가지 변형예가 가능하며 또 그러한 변형예도 본 발명의 범위라는 것을 당업자들도 이해하고 있다.

Claims

하기식 (1), (4) 및 (6)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 악성종양의 치료약:
[화 1]

[화 4]

[화 6]

(식 중, R1, R2 및 R3는 H,
R4는 4 위치이고, 또한 H, F, Cl, 니트로 또는 메톡시이다.)
제1항에 있어서,
상기 식(1)은 하기 식(3)으로 나타내는 화합물인, 악성종양의 치료약.
하기 식(1), (4), 및 (6)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 암 줄기세포의 치료약:
[화 1]

[화 4]

[화 6]

(식 중, R1, R2 및 R3는 H,
R4는 4 위치이고, 또한 H, F, Cl, 니트로 또는 메톡시이다.)
제3항에 있어서,
상기 식(1)은 하기 식(3)으로 나타내는 화합물인, 악성종양의 치료약.
하기 식(1), (4) 및 (6)에 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 그 염, 또는 그들의 용매화물을 포함하는 섬유증의 치료약:
[화 1]

[화 4]

[화 6]

(식 중, R1, R2 및 R3는 H,
R4는 4 위치이고, 또한 H, F, Cl, 니트로 또는 메톡시이다.)
제5항에 있어서,
상기 식(1)은 하기 식(3)으로 나타내는 화합물인, 악성종양의 치료약.