ES2774790T3

ES2774790T3 - Efecto inhibidor de compuesto de bajo peso molecular en cáncer y fibrosis

Info

Publication number: ES2774790T3
Application number: ES15769676T
Authority: ES
Inventors: Goshi Shiota; Noriko Itaba; Keita Kanki; Kenzo Seto; Hiroki Shimizu; Yohei Kouno; Shinya Kunita; Zyunya Adumi; Tomohiko Sakabe; Kenichiro Abe; Minoru Morimoto; Hiroyuki Oka
Original assignee: Tottori University NUC; KanonCure Inc
Current assignee: Tottori University NUC; KanonCure Inc
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2035-03-25
Also published as: EP3150207A1; JP6552005B2; JPWO2015147107A1; KR20160130861A; US20210386747A1; US20180028536A1; WO2015147107A1; KR20220132672A; CN106132417B; EP3150207A4; US11213527B2; EP3150207B1; CN106132417A

Abstract

Un fármaco terapéutico para su uso en un método de tratamiento de un tumor maligno hepático, que comprende al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos: **(Ver fórmula)** en donde R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, arilo, o heteroarilo; R3 representa H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido; m representa un entero de cualquiera de 1 a 4; n es un entero de cualquiera de 1 a 3; p representa un entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde la expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados entre halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halogenoalquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, alquilamino C1-6, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halogenoalquenilo C2-6, hidroxialquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halogenoalquinilo C2-6, hidroxialquinilo C2-6, alquinilamino C2-6, alcoxi C1-6, halogenoalcoxi C1-6, hidroxialcoxi C1-6, alcoxiamino C1-6, alcoxifenilo C1-6, trialquilsiloxi, alquildifenilsiloxi, arilo, y heteroarilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Efecto inhibidor de compuesto de bajo peso molecular en cáncer y fibrosis

Campo técnico

La presente invención se refiere a fármacos terapéuticos para tumores malignos o fibrosis.

Antecedentes en la técnica

Los ejemplos de las principales causas de muerte humana incluyen tumores malignos, enfermedad cardíaca, y enfermedad cerebrovascular. Entre ellos, el mecanismo de la causa de tumores malignos es complicado, de modo que los tumores malignos, en particular, se puede decir que son una enfermedad difícil de prevenir y difícil de tratar.

Recientemente, se ha dilucidado la presencia de una célula madre cancerosa en el campo de investigación de estos tumores malignos. Esta célula madre cancerosa ha recibido atención para establecer una nueva estrategia terapéutica. Se considera que las células madre cancerosas se diferencian en células cancerosas. En algunos pacientes, el cáncer puede recaer después de que se hayan eliminado las células cancerosas y después haya pasado un cierto período. Esto parece deberse a un número muy pequeño de células madre cancerosas supervivientes.

Esta célula madre cancerosa se caracteriza porque muchos medicamentos anticancerígenos convencionales son ineficaces. Con respecto a este punto, el Prof. Nakayama de Univ. Kyushu ha informado resultados de investigaciones en las que cuando ratones modelo con deficiencia de Fbxw7 se trataron con imatinib (fármaco anticancerígeno), las células madre cancerosas fueron destruidas (Bibliografía no patentada 1). A este respecto, sin embargo, no se ha obtenido ningún compuesto que inhiba directamente la proliferación de células madre cancerosas.

Mientras tanto, ejemplos de un síntoma que causa tumores malignos incluyen fibrosis tisular. Por ejemplo, cuando avanza la fibrosis hepática, esta causa cirrosis hepática, que conduce a cáncer de hígado. Además, la fibrosis se produce en pulmón, riñón, corazón, piel, etc. La Bibliografía no patentada 2 describe el resultado de un ensayo clínico en pirfenidona involucrado con el tratamiento de fibrosis.

Aquí, los presentes inventores han informado compuestos de bajo peso molecular en tres publicaciones (Bibliografías no patentadas 3 y 4 y Bibliografía patentada 1). Las Bibliografías no patentadas 3 y 4 describen compuestos de bajo peso molecular que ejercen un efecto inhibidor en la proliferación de células de cáncer de hígado y un efecto inhibidor en una señal de Wnt/p-catenina. Además, se describe que el compuesto de bajo peso molecular descrito en la Bibliografía no patentada 4 aumentó la expresión de CD44. Sin embargo, ninguna de las Bibliografías no patentadas 3 y 4 describen qué tipos de estructura y función de un compuesto hacen que el compuesto ejerza un efecto inhibidor del crecimiento en células de cáncer de hígado.

El documento WO2012/141038 A1 describe que PN-1-2, PN-3-4, PN-3-13, HC-1 e IC-2 inhiben una señal de Wnt/pcatenina en una célula madre mesenquimal, induciendo así la diferenciación de la célula madre mesenquimal en hepatocitos. Esta Bibliografía, sin embargo, no desvela nada sobre la inhibición de la proliferación de células cancerosas o células madre cancerosas.

F. Takahashi-Yanaga et al., Clin Cancer Res, vol. 16, n.° 12, páginas 3153 a 3162, y el documento WO 2007/139346 A1 desvelan que la ruta de señalización Wnt/p-catenina está implicada en el desarrollo de cáncer y más particularmente en la regulación de células madre cancerosas. Se ha demostrado que los inhibidores de la ruta de señalización de Wnt/p-catenina tales como ICG-001 son fármacos antitumorales eficaces capaces de inhibir la proliferación de células madre cancerosas.

El documento WO 2006/1 01 858 A1 desvela que la ruta de señalización Wnt/p-catenina está implicada en el desarrollo de fibrosis. Se ha demostrado que los inhibidores de la ruta de señalización Wnt/p-catenina tales como ICG-001 son agentes antifibróticos eficaces.

Lista de citas

Bibliografía no patentada

[Bibliografía no patentada 1] Takeishi et al., Cancer Cell, 2013, 18 de marzo; 23(3): 347-61.

[Bibliografía no patentada ²] Noble et al., Lancet, 2011,21 de mayo; 377(9779): 1760-9.

[Bibliografía no patentada ³] Sakabe et al., "Kanzo (Liver)", vol.53, Suplemento 1, 2012, A226, WS-54.

[Bibliografía no patentada ⁴] Seto et al., "Kanzo (Liver)", vol.54, Suplemento 1, 2013, P-12.

Sumario de la invención

Problema técnico

Como se describió anteriormente, la estrategia de tratamiento contra tumores malignos avanza gradualmente. No obstante, los tumores malignos son una de las principales causas actuales de muerte humana. Por tanto, las estrategias de tratamiento convencionales son simplemente insuficientes.

En el campo del tratamiento de tumores malignos, se sabe que el efecto farmacológico de un compuesto de bajo peso molecular administrado varía en gran medida según las características de la estructura del compuesto individual. Además, este campo implica una considerable incertidumbre. Es difícil predecir si se puede lograr o no un efecto farmacológico deseable durante el desarrollo de un nuevo protocolo de tratamiento. Debido a esto, no ha sido fácil identificar un nuevo compuesto de bajo peso molecular que ejerza un efecto en el tratamiento de tumores malignos.

Además, es difícil identificar un nuevo compuesto de bajo peso molecular que inhiba la proliferación no solo de células tumorales malignas, sino también células madre cancerosas.

Además, como se describió anteriormente, hay un número creciente de investigaciones relacionadas con el tratamiento de la fibrosis. Sin embargo, solo hay unos pocos medicamentos terapéuticos eficaces en el tratamiento de fibrosis. Además, un efecto adverso puede causar un problema a algunos pacientes. Por tanto, los agentes antifibrosis convencionales son simplemente insuficientes.

La presente invención se ha realizado en vista de las situaciones anteriores. El fin de la presente invención es proporcionar un nuevo fármaco terapéutico para tumores malignos hepáticos, células madre de cáncer de hígado, o fibrosis hepática.

Solución al problema

Los presentes inventores han realizado una investigación exhaustiva. Como resultado, los presentes inventores han identificado con éxito compuestos de bajo peso molecular que ejercen un efecto antitumor maligno como se describe en los ejemplos posteriormente. Además, se ha descubierto que estos compuestos de bajo peso molecular ejercen un efecto inhibidor en la proliferación no solo de células tumorales, sino también células madre cancerosas. Se sabe que las células madre cancerosas causan recaídas y metástasis de tumores malignos. Por tanto, se puede decir que los compuestos de bajo peso molecular anteriores que pueden inhibir la proliferación de células madre cancerosas son compuestos muy prometedores como ingredientes activos en un fármaco terapéutico para tumores malignos. Además, también se ha descubierto que los compuestos anteriores ejercen un efecto inhibidor en fibrosis. Entonces, los presentes inventores han completado la presente invención basándose en estos hallazgos.

Específicamente, un aspecto de la presente invención proporciona un fármaco terapéutico para un tumor maligno hepático como se define en la reivindicación 1. El fármaco incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos:

en donde

R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido, alquenilo C^2-6opcionalmente sustituido, alcoxi C^1-6opcionalmente sustituido, arilo, o heteroarilo;

R3 representa H, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido, o alquenilo C^2-6opcionalmente sustituido;

m representa un entero de cualquiera de 1 a 4;

n es un entero de cualquiera de 1 a 3;

p representa un entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde

la expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados entre halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C^1-6, halogenoalquilo C^1-6, hidroxialquilo C^1-6, alquilamino C^1-6, cicloalquilo C^3-6, alquenilo C^2-6, halogenoalquenilo C^2-6, hidroxialquenilo C^2-6, alquenilamino C^2-6, cicloalquenilo C^3-6, alquinilo C^2-6, halogenoalquinilo C^2-6, hidroxialquinilo C^2-6, alquinilamino C^2-6, alcoxi C^1-6, halogenoalcoxi C^1-6, hidroxialcoxi C^1-6, alcoxiamino C^1-6, alcoxifenilo C^1-6, trialquilsiloxi, alquildifenilsiloxi, arilo, y heteroarilo.

Además, otro aspecto de la presente invención proporciona un fármaco terapéutico para una célula madre de cáncer

de hígado como se define en la reivindicación 4. El fármaco incluye al menos un compuesto seleccionada entre el

grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1) anterior, una sal de los mismos o un solvato de

los mismos.

Además, otro aspecto de la presente invención proporciona un fármaco terapéutico para fibrosis hepática como se

define en la reivindicación 7. El fármaco incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

compuestos representados por la fórmula (1) anterior, una sal de los mismos o un solvato de los mismos.

Además, una realización preferente de la presente invención proporciona el fármaco terapéutico anterior para un tumor

maligno de hígado, una célula madre de cáncer de hígado, o fibrosis hepática, en donde los R1, R2, y R4 anteriores

son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C^1-6, halogenoalquilo C^1-6,

hidroxialquilo C^1-6, alquilamino C^1-6, alcoxi C^1-6, halogenoalcoxi C^1-6, hidroxialcoxi C^1-6, alcoxiamino sustituido con alcoxi C^1-6, alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C^1-6-fenilo, (trialquilsiloxi)alquilo C^1-6, o

(alquildifenilsiloxi)alquilo C^1-6; y el R3 anterior es H.

Ventajas

Según la presente invención, puede usarse un nuevo fármaco terapéutico para tratar tumores malignos del hígado,

células madre de cáncer de hígado, o fibrosis hepática.

Breve descripción de los dibujos

[FIG. 1] FIG. 1 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la viabilidad celular (dependiente de

concentración) de células de cáncer de hígado después del tratamiento con IC-2.

[FIG. 2] FIG. 2 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la viabilidad celular (dependiente de tiempo) de

células de cáncer de hígado después del tratamiento con IC-2.

[FIG. 3] FIG. 3 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la viabilidad celular (dependiente de

concentración) de células de cáncer de hígado después del tratamiento con PN3-13.

[FIG. 4] FIG. 4 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la viabilidad celular (dependiente de tiempo) de

células de cáncer de hígado después del tratamiento con PN3-13.

[FIG. 5] FIG. 5 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la viabilidad celular (dependiente de tiempo) de

células de cáncer de hígado después del tratamiento con HC-1.

[FIG. 6] FIG. 6 es un gráfico que muestra los resultados del recuento del número de células CD44 positivas después

de que las células madre cancerosas se tratarán con compuestos de bajo peso molecular.

[FIG. 7] FIG. 7 es un gráfico que muestra el curso temporal del cambio en el peso corporal de cada uno de los ratones

modelo de cáncer de hígado.

[FIG. 8] FIG. 8 es un gráfico que muestra la eficacia del tratamiento cuando se trataron ratones modelo con cáncer de

hígado.

[FIG. 9] FIG. 9 es un gráfico que muestra los resultados de ensayar un efecto de cada compuesto de bajo peso

molecular en la capacidad de formación de esfera.

[FIG. 10] FIG. 10 son gráficos que muestran los resultados de contar el número de células CD90 positivas después de

que las células madre cancerosas se trataran con compuestos de bajo peso molecular.

[FIG. 11] FIG. 11 son gráficos que muestran los resultados de contar el número de células CD133 positivas después

de que las células madre cancerosas se trataran con compuestos de bajo peso molecular.

[FIG. 12] FIG. 12 son gráficos que muestran los resultados de contar el número de células EpCAM positivas después

[FIG. 13] FIG. 13 son gráficos que muestran los resultados de un ensayo de luciferasa.

[FIG. 14] FIG. 14 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto antitumoral en cáncer de colon.

[FIG. 15] FIG. 15 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto antitumoral en cáncer de colon.

[FIG. 16] FIG. 16 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto antitumoral en cáncer de colon.

[FIG. 17] FIG. 17 contiene un gráfico que muestra los resultados de probar la capacidad de formación de esferas de células de cáncer de colon.

[FIG. 18] FIG. 18 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto inhibidor en células madre cancerosas en cáncer de colon.

[FIG. 19] FIG. 19 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto inhibidor en una señal de Wnt/pcatenina en cáncer de colon.

[FIG. 20] FIG. 20 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto inhibidor en una señal de Wnt/pcatenina en cáncer de colon.

[FIG. 21] FIG. 21 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto inhibidor en una señal de Wnt/pcatenina en cáncer de colon.

[FIG. 22] FIG. 22 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto antitumoral en carcinoma de células escamosas.

[FIG. 23] FIG. 23 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto antitumoral en carcinoma de células escamosas.

[FIG. 24] FIG. 24 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto antitumoral en carcinoma de células escamosas.

[FIG. 25] FIG. 25 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto antitumoral en carcinoma de células escamosas.

[FIG. 26] FIG. 26 son histogramas que muestran los resultados del examen de un efecto inhibidor en células madre cancerosas en carcinoma de células escamosas.

[FIG. 27] FIG. 27 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto inhibidor en una señal de Wnt/pcatenina en cáncer de colon.

[FIG. 28] FIG. 28 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto inhibidor en una señal de Wnt/pcatenina en cáncer de colon.

[FIG. 29] FIG. 29 es un gráfico que muestra los resultados de examinar un efecto inhibidor en una señal de Wnt/pcatenina en cáncer de colon.

[FIG. 30] FIG.30 es un diagrama que ilustra un esquema sintético de un derivado de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 31] FIG.31 es un diagrama que ilustra un esquema sintético de un derivado de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 32] FIG.32 es un diagrama que ilustra un esquema sintético de un derivado de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 33] FIG. 33 es un diagrama que ilustra un esquema sintético de derivados de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 34] FIG.34 es un diagrama que ilustra un esquema sintético de un derivado de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 35] FIG.35 es un diagrama que ilustra un esquema sintético de un derivado de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 36] FIG. 36 es una tabla que enumera la fórmula estructural y datos del espectro de cada uno de los derivados de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 37] FIG. 37 es una tabla que enumera la fórmula estructural y datos del espectro de cada uno de los derivados de IC-2 según el Ejemplo 8.

[FIG. 38] FIG. 38 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto inhibidor de derivados de IC-2 en una señal de Wnt/p-catenina.

[FIG. 39] FIG. 39 son gráficos que muestran los resultados de examinar un efecto inhibidor de derivados de IC-2 en una señal de Wnt/p-catenina.

[FIG. 40] FIG. 40 es un diagrama que ilustra un protocolo de un ensayo de luciferasa según los Ejemplos.

[FIG. 41] FIG. 41 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después del tratamiento de células estrelladas de hígado con IC-2.

[FIG. 42] FIG. 42 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con IC-2 TGFp.

[FIG. 43] FIG. 43 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con IC-2 Wnt3a.

[FIG. 44] FIG. 44 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después del tratamiento de células estrelladas de hígado con IC-2.

[FIG. 45] FIG. 45 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con IC-2 TGFp.

[FIG. 46] FIG. 46 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con IC-2 Wnt3a.

[FIG. 47] FIG. 47 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con PN3-13 TGFp.

[FIG. 48] FIG. 48 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con PN3-13 TGFp.

[FIG. 49] FIG. 49 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después del tratamiento de células estrelladas de hígado con HC-1.

[FIG. 50] FIG. 50 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con HC-1 Wnt3a.

[FIG. 51] FIG. 51 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 24 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con HC-1 TGFp.

[FIG. 52] FIG. 52 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después del tratamiento de células estrelladas de hígado con HC-1.

[FIG. 53] FIG. 53 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con HC-1 Wnt3a.

[FIG. 54] FIG. 54 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de luciferasa realizado 48 h después de que células estrelladas del hígado se trataran con HC-1 TGFp.

[FIG. 55] FIG. 55 es un diagrama que ilustra un protocolo de una PCR en tiempo real según los Ejemplos.

[FIG. 56] FIG. 56 es un gráfico que muestra los resultados de verificar la cantidad de expresión de TGFp después de que células estrelladas del hígado se trataron con IC-2 TGFp.

[FIG. 57] FIG. 57 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la cantidad de expresión de COL1A1 después de que células estrelladas del hígado se trataron con IC-2 TGFp.

[FIG. 58] FIG. 58 es un gráfico que muestra los resultados de verificar la cantidad de expresión de a-SMA después de que células estrelladas del hígado se trataran con IC-2 TGFp.

[FIG. 59] FIG. 59 es un gráfico que muestra los resultados de verificar la cantidad de expresión de TGFp después de que células estrelladas del hígado se trataron con PN3-13 TGFp.

[FIG. 60] FIG. 60 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la cantidad de expresión de COL1A1 después de que células estrelladas del hígado se trataron con PN3-13 TGFp.

[FIG. 61] FIG. 61 es un gráfico que muestra los resultados de verificar la cantidad de expresión de a-SMA después de que células estrelladas del hígado se trataran con PN3-13 TGFp.

[FIG. 62] FIG. 62 es un gráfico que muestra los resultados de verificar la cantidad de expresión de TGFp después de que células estrelladas del hígado se trataron con HC-1 TGFp.

[FIG. 63] FIG. 63 es un gráfico que muestra los resultados de comprobar la cantidad de expresión de COL1A1 después de que células estrelladas del hígado se trataron con HC-1 TGFp.

[FIG. 64] FIG. 64 es un gráfico que muestra los resultados de verificar la cantidad de expresión de a-SMA después de que células estrelladas del hígado se trataran con HC-1 TGFp.

[FIG. 65] FIG. 65 es un gráfico que muestra los resultados de determinar el contenido de hidroxiprolina en ratones modelo con enfermedad hepática después de la administración de IC-2.

[FIG. 66] FIG. 66 contiene un gráfico que muestra los resultados de cuantificar el área de fibrosis en ratones modelo con enfermedad hepática después de la administración de IC-2.

Descripción de realizaciones

En lo sucesivo en el presente documento, se describirán con detalle realizaciones de la presente invención. Se ha de observar que no se repiten descripciones para evitar redundancia.

Una realización de la presente invención proporciona un fármaco terapéutico para un tumor maligno, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este fármaco puede usarse para tratar tumores malignos hepáticos. Una realización de la presente invención proporciona un fármaco terapéutico para una célula madre de cáncer de hígado, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este fármaco puede usarse para tratar las células madre del cáncer hepático.

Una realización de la presente invención proporciona un fármaco inhibidor del crecimiento para una célula tumoral maligna hepática o una célula madre de cáncer hepático, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este medicamento puede usarse para inhibir la proliferación de células tumorales malignas o células madre cancerosas hepáticas.

Una realización de la presente invención proporciona un fármaco para inhibir la recaída de un tumor maligno hepático, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este medicamento inhibidor puede usarse para inhibir la recaída de un tumor maligno hepático.

Una realización de la presente invención proporciona un fármaco terapéutico para fibrosis hepática, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este medicamento puede usarse para tratar fibrosis hepática. Una realización de la presente invención proporciona un fármaco para tratar una enfermedad acompañada de fibrosis hepática, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1) anterior, una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este medicamento puede usarse para tratar una enfermedad acompañada de fibrosis hepática.

En la fórmula (1), R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido, alquenilo C^2-6opcionalmente sustituido, alcoxi C^1-6opcionalmente sustituido, arilo, o heteroarilo. Además, R3 representa H, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido, o alquenilo C^2-6opcionalmente sustituido. Además, m representa un entero de 1 a 4. Además, n es un entero de 1 a 3. Además, p representa un entero de 1 a 5.

Preferentemente, los R1, R2, y R4 anteriores, son iguales o diferentes y pueden representar cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C¹-⁶, halogenoalquilo C¹-⁶, hidroxialquilo C¹-⁶, alquilamino C¹-⁶, alcoxi C¹-⁶, halogenoalcoxi C¹-6, hidroxialcoxi C¹-⁶, o alcoxiamino C¹-⁶, o alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C¹-⁶, alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C¹-⁶fenilo, (trialquilsiloxi)alquilo C¹-⁶, o (alquildifenilsiloxi)alquilo C¹-⁶. Además, el R3 anterior es preferentemente H.

Como se usa en este documento, el término "halógeno" significa F, Cl, Br o I.

Como se usa en este documento, a menos que se indique otra cosa, los términos "alquilo" y "alquenilo" significan una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada.

Como se usa en este documento, el término "C¹-⁶" se refiere a hidrocarburos que contienen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono. Es decir, la expresión "alquilo C¹-⁶" se refiere a alquilo que contiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono. Ejemplos de alquilo C^1-6incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, n-pentilo, y n-hexilo.

Como se usa en este documento, ejemplos de "alquenilo" incluyen etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 4-metil-3-pentenilo, 1-hexenilo, 3-hexenilo, y 5-hexenilo.

Como se usa en este documento, ejemplos de "alcoxi" incluyen metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentoxi, isopentoxi, y hexoxi.

Como se usa en este documento, la expresión "opcionalmente sustituido" significa que un compuesto no está sustituido o tiene 1,2, 3, 4 o 5 sustituyentes en posiciones sustituibles. Tenga en cuenta que cuando se incluye una pluralidad de sustituyentes, estos sustituyentes pueden ser iguales o diferentes. Además, la posición de cada sustitución puede ser la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Aquí, ejemplos de los sustituyentes incluyen H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C¹-⁶, halogenoalquilo C¹-⁶, hidroxialquilo C¹-⁶, alquilamino C¹-⁶, cicloalquilo C³-⁶, alquenilo C²-⁶, halogenoalquenilo C²-⁶, hidroxialquenilo C²-⁶, alquenilamino C²-⁶, cicloalquenilo C³-⁶, alquinilo C²-⁶, halogenoalquinilo C²-⁶, hidroxialquinilo C²-⁶, alquinilamino C²-⁶, alcoxi C¹-⁶, halogenoalcoxi C¹-⁶, hidroxialcoxi C¹-⁶, alcoxiamino C¹-⁶, alcoxifenilo C¹-⁶, trialquilsiloxi, alquildifenilsiloxi, arilo, y heteroarilo.

Como se usa en este documento, "halogenoalquilo C W se refiere a alquilo C^1-6que está sustituido con uno o más halógenos. El número de halógenos puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 13. Además, el número puede estar entre dos de los números indicados anteriormente. Además, cuando se incluyen dos o más halógenos, el tipo de cada halógeno puede ser igual o diferente. Ejemplos de halogenoalquilo C^1-6incluyen, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, bromometilo, dibromometilo, tribromometilo, cloroetilo, dicloroetilo, tricloroetilo, fluoroetilo, difluoroetilo, y trifluoroetilo.

Como se usa en este documento, "hidroxialquilo C¹-⁶" se refiere a alquilo C^1-6que está sustituido con uno o más grupos hidroxi. El número de los grupos hidroxi puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 13. Además, el número puede estar entre dos de los números indicados anteriormente. Ejemplos de hidroxialquilo C^1-6incluyen hidroximetilo, 1 -hidroxietilo, 2- hidroxietilo, 2-hidroxi-n-propilo, y 2,3-dihidroxi-n-propilo.

Como se usa en este documento, "alquilamino C¹-⁶" se refiere a alquilo C^1-6que está sustituido con uno o más grupos amino. El número de grupos amino puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 13. Además, el número puede estar entre dos de los números indicados anteriormente. Ejemplos de alquilamino C^1-6incluyen metilamino y etilamino.

Como se usa en este documento, "halogenoalcoxi C¹-⁶" es equivalente a halogenoalquilo C¹-⁶, cuyo alquilo se reemplaza por alcoxi. Ejemplos de halogenoalcoxi C^1-6incluyen fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, 1-fluoroetoxi, 2-fluoroetoxi, 2-cloroetoxi, 2-bromoetoxi, (1,1 -difluoro)etoxi, (1,2-difluoro)etoxi, (2,2,2-trifluoro)etoxi, (1,1,2,2-tetrafluoro)etoxi, (1,1,2,2,2-pentafluoro)etoxi, 1-fluoro-n-propoxi, 1,1-difluoro-n-propoxi, 2,2-difluoro-n-propoxi, 3- fluoro-n-propoxi, (3,3,3-trifluoro)-n-propoxi, (2,2,3,3,3-pentafluoro)-n-propoxi, 4-fluoro-n-butoxi, (4,4,4-trifluoro)-nbutoxi, 5-fluoro-n-pentiloxi, (5,5,5-trifluoro)-n-pentiloxi, 6-fluoro-n-hexiloxi, (6,6,6-trifluoro)-n-hexiloxi, 2-fluorociclopropoxi, y 2-fluorociclobutoxi.

Como se usa en este documento, "hidroxialcoxi C¹-⁶" es equivalente a hidroxialquilo C¹.⁶, cuyo alquilo se reemplaza por alcoxi. Ejemplos de hidroxialcoxi C^1-6incluyen 2-hidroxietoxi, 2-hidroxi-n-propoxi, 3-hidroxi-n-propoxi, 2,3-dihidroxin-propoxi, y 2-hidroxiciclopropilo.

Como se usa en este documento, "alcoxiamino C¹-⁶" es equivalente a alquilamino C¹-⁶, cuyo alquilo se reemplaza por alcoxi. Ejemplos de alcoxiamino C^1-6incluyen metoxiamino y etoxiamino.

Como se usa en este documento, el término "arilo" se refiere a un grupo anular hidrocarburo aromático monocíclico, bicíclico, o tricíclico C⁶-¹⁴. Ejemplos de arilo incluyen fenilo, naftilo (por ejemplo, 1 -naftilo, 2-naftilo), tetrahidronaftalenilo, indenilo, y fluorenilo. Son particularmente preferentes naftilo o fenilo sustituido con cinco halógenos. Además, el arilo incluye un grupo anular que está condensado con cicloalqueno C^5-8en su posición de doble enlace.

Como se usa en este documento, "heteroarilo" incluye grupos que tienen de 5 a 14 átomos de anillo en sus anillos, con un sistema de electrones n compartido, y con 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, S y O. Ejemplos de heteroarilo incluyen tienilo, benzotienilo, furilo, benzofurilo, dibenzofurilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, tetrazolilo, oxazolilo, tiazolilo, e isooxazolilo. Es particularmente preferente furilo que está sustituido con un grupo metilo.

Según una realización de la presente invención, la estructura de un compuesto representado por la fórmula (1) implica preferentemente una configuración en la que R1, R2, y R3 son cada uno H; y R4 está en posición 4 y representa H, F, Cl, nitro, OH, CH²OH, metoxi, metoximetoxi, o terc-butildimetilsiloximetilo. Es particularmente preferente que la estructura de un compuesto representado por la fórmula (1) sea tan próxima como la estructura de un compuesto representado por la fórmula (3) en vista del efecto del tratamiento de tumores malignos o fibrosis. Los compuestos representados por las fórmulas (3), (4), y (6) a veces se denominan IC-2, PN3-13, y HC-1, respectivamente. Como se usa en este documento, el significado de PN3-13 es el mismo que PN-3-13.

[Fórm ula Quím ica 3]

[Fórmula Química 6]

Como se usa en este documento, ejemplos de la "sal" incluyen, pero sin limitación particular, sales aniónicas que se forman usando cualquier grupo ácido (por ejemplo, carboxilo) y sales catiónicas que se forman usando cualquier grupo básico (por ejemplo, amino). Ejemplos de sales incluyen sales inorgánicas, sales orgánicas y sales desveladas en el artículo (Berge, Bighley, y Monkhouse, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19). Los ejemplos incluyen además sales metálicas, sales de amonio, sales de una base orgánica, sales de un ácido inorgánico, sales de un ácido orgánico, y sales de un aminoácido básico o ácido. Los ejemplos de las sales metálicas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio, sales de potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sales cálcicas, sales de magnesio, sales de bario), y sales de aluminio. Los ejemplos de las sales de una base orgánica incluyen sales de trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, 2,6-lutidina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, ciclohexilamina, diciclohexilamina, o N,N'-dibenciletilendiamina. Los ejemplos de las sales de un ácido inorgánico incluyen sales de ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. Ejemplos de las sales de un ácido orgánico incluyen sales de ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, o ácido p-toluenosulfónico. Ejemplos de las sales de un aminoácido básico incluyen sales de arginina, lisina, u ornitina. Ejemplos de las sales de un aminoácido ácido incluyen sales de ácido aspártico o ácido glutámico.

Como se usa en este documento, el término ''solvato'' se refiere a un compuesto formado usando un soluto y un disolvente. J. Honig et al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650 (1953), puede consultarse en lo que respecta al solvato. Si el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato. Preferentemente, el disolvente no interfiere con la actividad biológica del soluto. Ejemplos de tal disolvente preferente incluyen, pero sin limitación, agua, etanol, y ácido acético. El disolvente más preferente es el agua. Un compuesto o una sal del mismo según una realización de la presente invención absorbe humedad cuando entra en contacto con el aire o recristaliza. Pueden tener humedad higroscópica o convertirse en un hidrato. Como se usa en este documento, el término "isómero" incluye una molécula, cuya fórmula molecular es idéntica, pero cuya estructura es diferente. Ejemplos del isómero incluyen enantiómeros, isómeros geométricos (cis/trans) e isómeros (diastereómeros) que tienen uno o más centros quirales que no son imágenes especulares entre sí. Como se usa en este documento, el término "profármaco" incluye un compuesto precursor en el que cuando el compuesto anterior se administra a un sujeto, se produce un cambio químico debido a procesos metabólicos o diversas reacciones químicas para dar lugar a un compuesto, una sal del mismo, o un solvato del mismo según la presente invención. Con respecto al profármaco, el artículo (T. Higuchi y V. Stella, "Pro-Drugs as Novel Delivery Systems", A.C.S. Symposium Series, Volumen 14) puede referirse.

Como se usa en este documento, ejemplos de un "tumor maligno" incluyen tumores causados por una mutación en una célula normal. Los tumores malignos se producen en todos los órganos y tejidos del cuerpo. El tumor maligno es, por ejemplo, al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer suprarrenal, cáncer de las vías biliares, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer ureteral, cáncer de pelvis renal, cáncer ureteral, cáncer de pene, cáncer de testículos, tumor cerebral, cáncer del sistema nervioso central, cáncer del sistema nervioso periférico, carcinoma de cabeza y cuello, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de piel, melanoma, cáncer de tiroides, cáncer de glándula salival, linfoma maligno, carcinoma, sarcoma, y tumores malignos hematológicos. El cáncer hepático anterior puede ser, por ejemplo, un tumor epitelial o tumor no epitelial, y puede ser carcinoma de hepatocitos o carcinoma colangiocelular. Ejemplos del cáncer de piel anterior incluyen el carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, y melanoma maligno. La presente invención se refiere a un tumor maligno hepático.

Como se usa en este documento, la expresión "célula madre cancerosa" incluye una célula que genera células cancerosas. Esta célula madre cancerosa incluye una célula que expresa un marcador de células madre cancerosas. Ejemplos del marcador de células madre cancerosas incluyen CD44, CD90, CD133, y EpCAM. La presente invención se refiere a una célula madre cancerosa hepática.

La "fibrosis" se conoce como un síntoma causado por pérdida de función normal debido a esclerosis tisular en la que aumenta el volumen de una masa de tejido conectivo incluyendo componentes tisulares tales como colágeno y un tejido normal es reemplazado por el tejido conectivo. La fibrosis ocurre en, por ejemplo, tejidos respectivos tales como hígado, pulmón, riñón, corazón, y piel. Además, la aparición de gran cantidad de fibrosis en un tejido hepático, por ejemplo, puede resultar en cirrosis hepática, que conduce a cáncer de hígado. Cada tejido, distinto del tejido hepático, puede albergar un tumor maligno mientras progresa la fibrosis. El término "fibrosis" incluye una enfermedad acompañada de fibrosis. Ejemplos de la enfermedad acompañada de fibrosis incluyen la fibrosis tisular anterior, cirrosis, y tumores malignos acompañados de fibrosis. La presente invención se refiere a una fibrosis hepática.

Como se usa en este documento, el término "tratamiento" incluye ejercer un efecto profiláctico, un efecto inhibidor, o un efecto que mejora los síntomas en una enfermedad de un sujeto o en uno o más síntomas que implican la enfermedad. Como se usa en este documento, "fármaco terapéutico" puede ser una composición farmacéutica que contiene un ingrediente activo y al menos un vehículo farmacológicamente aceptable. La composición farmacéutica puede producirse mediante cualquier proceso conocido en la técnica de formulación de fármacos. Ejemplos del proceso incluyen: mezclar un ingrediente activo con el vehículo anterior. Además, la forma de dosificación del fármaco no está limitada siempre que el fármaco pueda usarse para el tratamiento. El fármaco puede ser un ingrediente activo solo o una mezcla de un ingrediente activo y cualquier componente. Además, ejemplos de la forma de dosificación del vehículo anterior incluyen, pero sin limitación particular, un sólido y líquido (por ejemplo, un tampón). Tenga en cuenta que los ejemplos de un fármaco terapéutico para tumores malignos incluyen: un fármaco (profiláctico) usado para prevenir un tumor maligno; un fármaco para inhibir la recaída de un tumor maligno; y un fármaco para inhibir la proliferación de una célula tumoral maligna. Ejemplos de un fármaco terapéutico para células madre cancerosas incluyen: un agente para tratar una célula madre cancerosa como diana; un fármaco terapéutico para tumores malignos derivados de una célula madre cancerosa; y un inhibidor para células madre cancerosas.

Se usa preferentemente una ruta de administración de fármacos eficaz en el tratamiento. Ejemplos de la ruta de administración incluyen intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, y administración oral. Ejemplos de la forma de dosificación pueden incluir una inyección, una cápsula, un comprimido, y gránulos. Además, una solución acuosa para inyección puede combinarse con, por ejemplo, una solución salina, azúcar (por ejemplo, trehalosa), NaCl, o NaOH. Además, el fármaco puede formularse con, por ejemplo, un tampón (por ejemplo, un tampón fosfato) y/o un estabilizador.

Una dosis no está particularmente limitada, y puede ser, por ejemplo, 0,001, 1, 10, 100 o 1000 mg/kg de peso corporal por administración. La dosificación puede estar entre dos de los valores anteriores. El intervalo de administración no está particularmente limitado y el fármaco puede dosificarse, por ejemplo, una o dos veces a los 1, 7, 14, 21 o 28 días. El fármaco puede dosificarse una o dos veces por período entre dos de los valores anteriores. Además, la dosificación, el intervalo de administración, y el método de administración se pueden seleccionar adecuadamente según la edad, peso corporal, síntoma, órgano afectado, etc., de un paciente. Además, el fármaco contiene preferentemente una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz, que es eficaz para ejercer un efecto deseado, de un principio activo.

El efecto del tratamiento de tumores malignos puede evaluarse mediante formación de imágenes, examen endoscópico, biopsia, o detección de un marcador tumoral maligno. Además, el efecto del tratamiento de las células madre cancerosas puede evaluarse mediante formación de imágenes, examen endoscópico, biopsia, o detección de un marcador de células madre cancerosas. Además, el efecto del tratamiento de la fibrosis puede evaluarse mediante formación de imágenes, examen endoscópico, biopsia, o detección de un marcador de fibrosis. Se puede juzgar tal que cuando el nivel de un marcador en un paciente o una muestra derivada del paciente (por ejemplo, un tejido, células, una población celular, o sangre) disminuye significativamente después de la administración de un fármaco terapéutico, hay un efecto terapéutico. En este momento, el nivel de un marcador después de administración de un medicamento terapéutico puede ser 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 veces el nivel antes de la administración (o de un control). Alternativamente, se puede juzgar que cuando el número de células marcadoras positivas en la muestra derivada del paciente disminuye significativamente después de la administración del fármaco terapéutico, hay un efecto terapéutico. En este momento, el número de células marcadoras positivas después de la administración del fármaco terapéutico puede ser 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 veces el número antes de la administración (o de un control). Tenga en cuenta que en el Ejemplo 2 posterior, el efecto terapéutico se evaluó utilizando ratones en los que se habían trasplantado subcutáneamente células HuH7 CD44 positivas. Los presentes inventores también reemplazaron las células HuH7 CD44 positivas anteriores por células HuH7 sin clasificar. Este experimento ha demostrado que IC-2 exhibe un efecto de tratamiento de un tumor maligno.

Además, con respecto al efecto terapéutico de tratar un tumor maligno, se puede juzgar que cuando la tasa de crecimiento de las células de ensaya derivadas del paciente disminuye significativamente después de la administración del fármaco terapéutico, hay un efecto terapéutico. En este momento, la tasa de crecimiento de las células de ensaya derivadas del paciente después de la administración del fármaco terapéutico puede reducirse a 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 veces la tasa antes de la administración (o de un control). Además, como se usa en este documento, el término "significativamente" puede incluir un caso de p <0,05 o p <0,01 cuando la prueba t de Student (de un lado o dos lados), por ejemplo, se usa para evaluar una diferencia estadísticamente significativa. Además, el término puede incluir un estado en el que hay una diferencia sustancial.

Como se usa en este documento, ejemplos del "paciente" incluyen mamíferos humanos y no humanos (por ejemplo, al menos uno de un ratón, cobaya, hámster, rata, ratón, conejo, cerdo, oveja, cabra, vaca, caballo, gato, perro, tití, mono, y chimpancé). Mientras tanto, el paciente puede ser un paciente que se determina o diagnostica que tiene aparición de un tumor maligno o fibrosis. Además, el paciente puede ser un paciente que necesita tratamiento de un tumor maligno o fibrosis. Además, el paciente puede ser un paciente que se determina o diagnostica que tiene un número significativamente mayor de células madre cancerosas en un tejido que las personas sanas. Tenga en cuenta que la determinación o el diagnóstico pueden realizarse mediante formación de imágenes, examen endoscópico, biopsia, o detección de varios marcadores.

Como se usa en este documento, la expresión "un estado en el que se inhibe la proliferación celular" incluye un estado en el que la tasa de crecimiento de las células de ensayo es significativamente menor que la anterior al tratamiento farmacológico. La tasa de crecimiento se puede evaluar midiendo el nivel de proliferación de las células durante un período de tiempo determinado. Se puede medir el nivel de proliferación, por ejemplo, visualmente o usando la absorbancia como índice. Alternativamente, el nivel de proliferación puede medirse utilizando, como índice, el nivel de un marcador tumoral maligno en un paciente o una muestra derivada del paciente. Como se usa en este documento, la expresión "inhibir una célula madre cancerosa" incluye, por ejemplo, inhibir la proliferación de una célula madre cancerosa e inhibir la función de una célula madre cancerosa (por ejemplo, inhibir la formación de esferas, inhibir la expresión del marcador).

Una realización de la presente invención proporciona un fármaco para inhibir la expresión de un marcador para una célula tumoral maligna, una célula madre cancerosa, o fibrosis, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Una realización de la presente invención proporciona un fármaco para inhibir la formación de una esfera a partir de un tumor maligno o de células madre cancerosas, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos. Este medicamento para inhibir la formación de una esfera puede usarse para el tratamiento de tumores malignos o células madre cancerosas.

Una realización de la presente invención proporciona un método de tratamiento que comprende la etapa de administrar a un paciente un compuesto de bajo peso molecular contenido en un fármaco terapéutico según cualquiera de las realizaciones anteriores. Una realización de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de bajo peso molecular contenido en el fármaco terapéutico según cualquiera de las realizaciones anteriores en la fabricación del fármaco terapéutico. Una realización de la presente invención proporciona un método de inhibición del crecimiento que comprende la etapa de administrar a un paciente un compuesto de bajo peso molecular contenido en el fármaco para inhibir la proliferación según cualquiera de las realizaciones anteriores. Una realización de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de bajo peso molecular contenido en el fármaco para inhibir la proliferación según cualquiera de las realizaciones anteriores en la fabricación del fármaco. Una realización de la presente invención proporciona un método para inhibir la recaída de un tumor maligno, comprendiendo el método la etapa de administrar a un paciente un compuesto de bajo peso molecular contenido en el fármaco para inhibir la recaída según cualquiera de las realizaciones anteriores. Una realización de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de bajo peso molecular contenido en el fármaco para inhibir la recaída según cualquiera de las realizaciones anteriores en la fabricación del fármaco.

Una realización de la presente invención proporciona al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos, en donde R1, R2, y R3 son cada uno H; y R4 está en posición 4 y representa F, Cl, nitro, OH, CH²OH, metoxi, metoximetoxi, o terc-butildimetilsiloximetilo. Este compuesto, una sal del mismo, o un solvato del mismo puede usarse para tratar tumores malignos hepáticos, células madre de cáncer hepático y/o fibrosis hepática.

Un aspecto no reivindicado de la presente descripción proporciona un fármaco para inhibir una señal de Wnt/pcatenina, fármaco que incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (i), una sal de los mismos o un solvato de los mismos, en donde R1, R2, y R3 son cada uno H; y R4 está en posición 4 y representa F, Cl, nitro, OH, CH²OH, metoxi, metoximetoxi, o terc-butildimetilsiloximetilo. Este compuesto, una sal del mismo, o un solvato del mismo puede usarse para inhibir una señal de Wnt/p-catenina. El fármaco para inhibir una señal de Wnt/p-catenina puede usarse para diversas aplicaciones in vitro o in vivo. El fármaco para inhibir una señal de Wnt/p-catenina puede usarse para el tratamiento de enfermedades que pueden mejorarse mediante, por ejemplo, un efecto inhibidor sobre una señal de Wnt/p-catenina.

Como se usa en este documento, el término "o" puede usarse cuando puede emplearse "al menos un" asunto enumerado en el texto de especificación. Lo mismo se aplica al término "o". Como se usa en este documento, cuando se indica la expresión "entre dos de los valores anteriores", los dos valores se incluyen en el intervalo. Como se usa en este documento, la expresión "de A a B" significa "A o más y B o menos".

Como se describió anteriormente, se han ilustrado las realizaciones de la presente invención. Estas realizaciones son ejemplos de la presente invención. Por tanto, pueden adoptarse diversas configuraciones distintas de las realizaciones anteriores. Además, también pueden emplearse combinaciones entre las realizaciones descritas anteriormente.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se ilustra adicionalmente por referencia a Ejemplos. La presente invención, sin embargo, no se limita a ellos.

<Ejemplo 1> Experimento de inhibición de células cancerosas y células madre cancerosas

1.1 Reactivos utilizados

• DMEM: Polvo medio Eagle modificado por Dulbecco (Nissui, Hiroshima, Japón), 10 ml de NaHCO³al 10 %, 5 ml de glucosa 100x, 10 ml de glutamina 50x, suero fetal bovino al 10 % (FBS) (Eq Uit Ec H-BIO, Texas, USA)

• PBS (-): NaCl 137 mM, Na2HPO4-12H2O 8,10 mM, KCI 2,68 mM, KH²PO⁴1,47 mM

• Solución de tripsina/EDTA: (Nacalai Tesque) tripsina al 0,25 %, EDTA 1 mM

• Compuestos de bajo peso molecular: lC-2 (fórmula (3)), PN3-13 (fórmula (4)), HC-1 (fórmula (6)) e ICG-001 se sintetizaron según un proceso descrito en el documento WO2012/141038.

1.2 Cultivo celular

Se cultivaron células HuH7 (una línea celular de cáncer hepático) en DMEM en una placa de cultivo celular de 10 cm (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza) al 5 % de CO², 37 °C y una humedad del 100 %. Después de que las células crecieran de 70 a 90 % de confluencia, se añadieron 200 pl de una solución de tripsina/EDTA para separar las células. Las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente para recuperación. Entonces, las células en una placa se dividieron en cuatro placas y se subcultivaron.

1.3 Efecto inhibidor en células cancerosas (ensayo WST)

Cuando se examinó un efecto antitumoral dependiente de la concentración, se recogieron células HuH7 con una confluencia de 70 a 90 %, y se sembraron 1 x 104 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (FALCON). Cuando se examinó un efecto antitumoral dependiente del tiempo, se sembraron 5 x 103 células. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron con IC-2, PN3-13, o HC-1, y se incubaron además a 37 °C. DMSO se utilizó como control.

La concentración de cada compuesto de bajo peso molecular se proporcionó a continuación. IC-2: 0,1, 5, 10, 25, 50 pM; PN3-13: 0, 1,5, 10, 25, 50 pM; y HC-1: 0, 1, 5, 10, 25, 50 pM. Cuando se examinó el efecto antitumoral dependiente de la concentración, 100 pl de TetraColor ONE al 10 % (SEIKAGAKU CORPORATION, Tokio, Japón) se añadieron 4 días después del tratamiento químico. Cuando se examinó el efecto antitumoral dependiente del tiempo, se añadieron 100 pl de TetraColor ONE al 10 % 0, 1,2 y 4 días después del tratamiento químico. Entonces, las células se incubaron a 37 °C durante 45 min. Después de eso, se midió la absorbancia (a una longitud de onda de medición de 450 nm/una longitud de onda de control de 600 nm) mediante un lector de microplacas de 96 pocillos (TECAN, Zúrich, Suiza). La absorbancia de las células se calculó restando la absorbancia del blanco de reactivo del resultado medido, y luego se convirtió en recuento de células viables. Además, se determinó CI⁵⁰de cada compuesto de bajo peso molecular usando la ecuación:

CI ⁵⁰- 10{LOG(A/B)x(50-C)/(D-C)+LOG(B)} en donde A indica una concentración superior a 50 %; B indica una concentración inferior a 50 %; C indica la tasa de inhibición en B; y D indica la tasa de inhibición en A.

Los resultados demuestran que el tratamiento con IC-2 inhibió significativamente la proliferación de células HuH7 (Figuras 1 y 2). Además, el tratamiento con PN3-13 también inhibió significativamente la proliferación de células HuH7 (Figuras 3 y 4). Además, el tratamiento con HC-1 también inhibió la proliferación de células HuH7 (Figura 5).

1.5 Efecto inhibidor en células madre cancerosas (análisis FACS)

El siguiente protocolo se usó para investigar un efecto inhibidor de cada compuesto de bajo peso molecular en células madre cancerosas. CD44, un marcador de células madre cancerosas, se usó como índice. Se recogieron células HuH7 con una confluencia de 70 a 90 % y se sembraron 1,5 x 106 células en una placa de 10 cm (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza). Después de 15 horas, las células se trataron con cada uno de hexaclorofeno (15 ^|J M), ICG-001 (15 ^|J M), PKF118-310 (5 pM), IC-2 (50 pM), PN3-13 (10 pM) y 5-FU (0,5 pM) y se incubaron a 37 °C. DMSO, que era el solvente para cada uno de los compuestos de bajo peso molecular y fármacos anticancerígenos, se usó como control. Dos días después del tratamiento químico, se recogieron las células en una placa. A continuación, las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar el sobrenadante. Entonces, las células se lavaron dos veces con 1 ml de FBS al 0,5 %/EDTA 2 mM/PBS. Después de eso, las células se suspendieron en 500 pl de BSA al 5 %/FBS al 0,5 %/EDTA 2 mM/PBS y se bloquearon una vez durante 15 minutos a 4 °C.

A continuación, se añadieron 5 pl de un anticuerpo monoclonal anti-CD44 humano (Cell Signaling Technology Inc., Danvers MA, USA). Entonces, las células se suspendieron y se realizó una reacción primaria de anticuerpos en una habitación oscura durante 10 minutos a 4 °C. Después de esto, las células se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS. Después se añadió 1,0 pg de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA), la mezcla se resuspendió y se realizó una reacción de anticuerpo secundario en una habitación oscura durante 10 minutos a 4 °C. Después, las células se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS, y se lavaron una vez más con FBS al 5 %/EDTA 2 mM/DMEM. A continuación, las células se resuspendieron en 500 pl de FBS al 5 %/EDTA 2 mM/PBS y la mezcla se hizo pasar a través de un tubo con un filtro de malla de 40 pm (Becton, Dickinson and Company, Franklin, Lakes NJ, USA). Un contador Beckman Coulter-MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) se usó para realizar análisis. Tenga en cuenta que se evaluó una diferencia significativa usando el ensayo t de Student (dos colas). En los gráficos, * significa p <0,05 y ** significa p <0,01 (esto se aplica a todos los gráficos en los Ejemplos) (n - 5).

Los resultados demuestran que cuando se usaron IC-2 y PN3-13, el número de células madre cancerosas fue significativamente menor que el del control (figura 6). Sin embargo, el uso de 5-FU, un medicamento anticancerígeno representativo, en su lugar aumentó el número de células madre cancerosas.

<Ejemplo 2> Se utilizaron ratones modelo de cáncer hepático para evaluar el efecto terapéutico del tratamiento de tumores malignos

Se trasplantaron células HuH7 CD44 positivas subcutáneamente en ratones. Los ratones se dividieron en 3 grupos (grupo de DMSO: 5 ratones; grupo de 5-FU: 4 ratones; y grupo de IC-2: 4 ratones). Posteriormente, 30 mg/kg de 5-FU, 50 mg/kg de IC-2, o DMSO (como control), que era el disolvente para cada compuesto químico, se administraron intraperitonealmente cada 3 días. El peso corporal y la longitud y el ancho del tumor de cada ratón se midieron cada 3 días. El volumen tumoral se calculó usando la siguiente ecuación: Volumen tumoral - Largo x (Ancho)2 x 0,5. El volumen en el día 0 se usó para normalizar el volumen de cada tumor, y luego se creó un gráfico. Para evaluar suficientemente un efecto de 5-FU, la dosis que generalmente era de 25 mg/kg en artículos de investigación se duplicó para establecer una dosis de 5-FU. Se calculó la concentración de IC-2 correspondiente a la concentración a la que se inhibió una señal de Wnt/p-catenina in vitro. Entonces, la concentración se duplicó para establecer la dosis de IC-2.

Lo anterior no dio lugar a cambios observables en el peso corporal en el caso de la administración de cualquiera de IC-2 y 5-FU (Figura 7). Esto significa que es posible administrar de forma segura cualquiera de IC-2 y 5-FU. Además, IC-2 dio un efecto terapéutico significativamente mayor de tratar un tumor maligno que el de 5-FU (Figura 8).

<Ejemplo 3> Efecto en la capacidad de formación de esferas

Primero, se recogieron células HuH7. A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo monoclonal CD44 antihumano (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)), y luego con un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488. Después de eso, un Contador Beckman Coulter-MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) Se usó para clasificar las células en una fracción CD44 negativa y una fracción CD44 positiva. Las células clasificadas se sembraron a 5 x 104 células/pocillo en una placa multipocillo de fijación ultra baja de 24 pocillos (Corning, NY, USA). Posteriormente, las células se cultivaron a 37 °C en presencia de 5 % de CO²en un medio DMEM/Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) que contiene 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico humano, 1 x B27, y L-glutamina. Veinticuatro horas después de la siembra en placa, se añadieron DSMO al 1 %, IC-250 jM y PN-3-l3 10 |jM al pocillo correspondiente y las células se cultivaron adicionalmente. Una semana después del tratamiento químico, se contó el número de esferas (con un tamaño de 100 jm o mayor) en 15 campos visuales/pocillo.

Los resultados demostraron que IC-2 y PN-3-13 inhibieron la formación de esferas de células HuH7 CD44 negativas y CD-44 positivas (Figura 9). Esto significa que IC-2 y PN-3-13 inhibieron la función de las células cancerosas y las células madre cancerosas.

<Ejemplo 4> Análisis FACS de células madre cancerosas

4.1 CD90 (marcador de células madre cancerosas)

Se sembró una línea celular de cáncer de hígado HLF a 1,5 x 106 células/placa en placas de 10 cm. A continuación, las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO². Después de 24 horas, se añadieron DSMO al 1 %, 5-FU 0,5 jM o IC-2 50 jM a las mismas y las células se incubaron adicionalmente. Dos días después del tratamiento químico, las células se recogieron. Entonces, las células se bloquearon en BSA al 0,5 %/FBS al 0,5 %/EDTA 2 mM/PBS. Posteriormente, 5 j l de un anticuerpo CD90 antihumano de ratón marcado con APC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) se añadieron a 500 j l de una suspensión celular y la mezcla resultante se resuspendió e incubó a 4 °C durante 10 minutos para llevar a cabo una reacción de anticuerpo primario. Después de la reacción del anticuerpo, las células se lavaron dos veces con FBS al 0,5 %/EDTA 2 mM/PBS y una vez con FBS al 5 %/EDTA 2 mM/DMEM. A continuación, las células se resuspendieron en 500 j l de FBS al 5 %/EDTA 2 mM/PBS. Entonces, a esto se añadió 1 jg/m l de yoduro de propidio. Después de eso, se hizo pasar la mezcla a través de un tubo con un filtro de malla de 40 jm . Finalmente, se usó un equipo Beckman Coulter-MoFlo XDP para analizar las células que expresan CD90. La concentración de 5-FU se determinó basándose en la concentración CI⁵⁰a 24 horas en un ensayo WST. La concentración de IC-2 se determinó basándose en una concentración a la que se inhibió una señal de Wnt/p-catenina.

Los resultados demostraron que la proporción de las células que expresan CD90 fue 21,8 % para DMSO, 24,1 % para 5-FU, y 13,5 % para IC-2 (FIG. 10). Es decir, IC-2 ejerció un efecto inhibidor superior sobre las células madre de cáncer de hígado.

4.2 CD133 (marcador de células madre cancerosas)

Se sembró una línea celular de cáncer de hígado HepG2 a 1,5 x 106 células/placa en placas de 10 cm. A continuación, las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO². Después de 24 horas, se añadieron DSMO al 1 %, 5-FU 0,5 jM o IC-2 50 jM a las mismas y las células se incubaron adicionalmente. Entonces, las células se recogieron dos días después del tratamiento químico. Mientras tanto, las células se bloquearon en BSA al 0,5 %/FBS al 0,5 %/EDTA 2 mM/PBS. Posteriormente, se añadieron 50 j l de un anticuerpo monoclonal CD133 antihumano (Miltenyi Biotec) a 500 j l de una suspensión celular y la mezcla resultante se resuspendió y se incubó a 4 °C durante 10 minutos para llevar a cabo una reacción de anticuerpo primario. Después de la reacción de anticuerpo primario, las células se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS. Después se añadió 1,0 jg de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA), la mezcla se resuspendió y se realizó una reacción de anticuerpo secundario en una habitación oscura durante 10 minutos a 4 °C. Después de eso, las células se lavaron dos veces con FBS al 5 %/EDTA 2 mM/PBS y una vez con FBS al 5 %/EDTA 2 mM/DEME. A continuación, las células se resuspendieron en 500 j l de FBS al 5 %/EDTA 2 mM/PBS. Entonces, a esto se añadió 1 jg/m l de yoduro de propidio. Después de eso, se hizo pasar la mezcla a través de un tubo con un filtro de malla de 40 jm . Finalmente, se usó un equipo Beckman Coulter-MoFlo XDP para analizar las células que expresan CD133.

Los resultados demostraron que la proporción de células que expresan CD133 fue 57,1 % para DMSO, 33,3 % para 5-FU, y 1,45 % para IC-2 (FIG. 11). Es decir, IC-2 ejerció un efecto inhibidor superior sobre las células madre de cáncer de hígado.

4.3 EpCAM (marcador de células madre cancerosas)

Se sembró una línea celular de cáncer de hígado HepG2 a 1,5 x 106 células/placa en placas de 10 cm. A continuación, las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO². Después de 24 horas, se añadieron DSMO al 1 %, 5-FU 0,5 jM o IC-2 50 jM a las mismas y las células se incubaron adicionalmente. Entonces, las células se recogieron dos días después del tratamiento químico. Mientras tanto, las células se bloquearon en BSA al 0,5 %/FBS al 0,5 %/EDTA 2 mM/PBS. Posteriormente, se añadieron 0,3 j l de un anticuerpo monoclonal EpCAM antihumano (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) a 500 j l de una suspensión celular y la mezcla resultante se resuspendió e incubó a 4 °C durante 10 minutos para llevar a cabo una reacción de anticuerpo primario. Después de la reacción de anticuerpo primario, las células se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS. Después se añadió 1,0 jg de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA), la mezcla se resuspendió y se realizó una reacción de anticuerpo secundario en una habitación oscura durante 10 minutos a 4 °C. Después de eso, las células se lavaron dos veces con FBS al 5 %/EDTA 2 mM/PBS y una vez con FBS al 5 %/EDTA 2 mM/DEME. A continuación, las células se resuspendieron en 500 |jl de FBS al 5 %/EDTA 2 mM/PBS. Entonces, a esto se añadió 1 |jg/ml de yoduro de propidio. Después de eso, se hizo pasar la mezcla a través de un tubo con un filtro de malla de 40 jm . Finalmente, se usó un equipo Beckman Coulter-MoFlo XDP para analizar las células que expresan EpCAM.

Los resultados demostraron que la proporción de las células que expresan EpCAM fue 76,2 % para DMSO, 81,4 % para 5-FU, y 51,1 % para IC-2 (FIG. 12). Es decir, IC-2 ejerció un efecto inhibidor superior sobre las células madre de cáncer de hígado.

<Ejemplo 5> Evaluación del efecto inhibidor en la ruta de señalización de Wnt/p-catenina

5.1 Establecimiento de la línea celular que expresa de forma estable CF4-CMVpro-Luc

Primero, se añadieron 30 jg de un pTCF4-CMVpro-Luc a 5 x 106 células HuH7 y el plásmido se introdujo usando Cellject Pro (Thermo, Massachusetts, USA) (a 250 V, 1500 jF). Veinticuatro horas después de la introducción del gen, se añadieron 2 jg/m l de puromicina. Entonces, se seleccionaron las células mientras se cambiaba un medio cada 3 a 5 días. Se observó que se formaron colonias de células HuH7 que contenían pTCF4-CMVpro-Luc a los 20 días después del inicio de la selección. Un anillo de clonación, que se fabricó de tal manera que se cortara una parte final de una punta azul, (el borde inferior del anillo de clonación estaba provisto de vaselina), se utilizó después para rodear una de las colonias formadas. Posteriormente, 30 j l de una solución de tripsina al 0,25 %/EDTA 1 mM, que se preparó diluyendo una solución madre 5 veces con PBS, se añadieron para separar y recoger las células. Después de eso, se añadieron 70 j l de DMEM y la mezcla se sembró en una placa de 96 pocillos.

A continuación, se recogieron células HuH7 con una confluencia de 70 a 90 %, y se sembraron 3,5 x 105 células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (FALCON). Después de 24 horas, Las células se recogieron en un tubo de 15 ml, centrifugaron a 1000 rpm y temperatura ambiente durante 5 minutos, lavaron con 1 ml de 1 x PBS (-), y centrifugaron nuevamente a 1000 rpm y temperatura ambiente durante 5 minutos. La masa celular se resuspendió en 375 j l de un tampón de proteinasa K. Entonces, a esto se añadieron 25 j l de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 4 j l de Proteinasa K (20 mg/ml). Después de eso, la mezcla se incubó durante la noche a 55 °C para degradar las proteínas celulares. A continuación, se añadieron 400 ml de fenol/cloroformo, y la mezcla se sometió a agitación vorticial y luego se centrifugó a 15000 rpm y 4 °C durante 5 minutos para recuperar el sobrenadante. Posteriormente, se añadió un volumen de 2 veces etanol al 100 % al sobrenadante y la mezcla se incubó a -80 °C durante 30 minutos. Después de centrifugar la muestra a 15000 rpm y 4 °C durante 20 min, se desechó el sobrenadante y se añadieron 500 j l de etanol al 70 %. La muestra se centrifugó adicionalmente a 15000 rpm y 4 °C durante 10 min. Finalmente, se descartó el sobrenadante y se usaron 20 j l de agua ultrapura para disolver el sedimento resultante. Se midió un j l del sedimento disuelto usando un espectrofotómetro (LMS, Tokio, Japón) para ajustar el contenido de ADN de la muestra a 1 ng/jl. A continuación, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se usaron cebadores para un locus de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno. Además, se usaron cebadores para una región de luciferasa.

Se realizó una PCR utilizando rTaq (TOYOBO, Osaka, Japón) para amplificar cada gen a una escala de 10 jl. Para GAPDH, la PCR consistió en: 95 °C durante 2 min; 25 ciclos (95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 30 segundos); y 72 °C durante 5 min. Para el gen de luciferasa, la PCR consistió en: 95 °C durante 2 min; 30 ciclos (95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 30 segundos); y 72 °C durante 5 min.

A continuación, se realizó un ensayo de luciferasa. Se recogieron células HuH7 a una confluencia de 70 a 90 %, y se sembraron 5 x 104 células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (FALCON). Entonces, se añadieron 100 j l de 20 % de tampón de lisis pasivo (PLB) (PROMEGA, Wisconsin, USA) a cada pocillo de la placa de 24 pocillos 17 horas después de la siembra celular. La placa se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, se añadieron 50 j l de reactivo de ensayo de luciferasa (LAR) (PROMEGA) a cada tubo de Rohren de 3,5 ml (SARSTEDT, Numbrecht, Alemania). Posteriormente, Se añadieron al tubo 10 j l del lisado celular preparado usando PLB en la placa de 24 pocillos, y se midió la actividad de luciferasa usando un MiniLumat LB 9506 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania).

5.2 Ensayo de luciferasa

Primero, se recogieron células HuH7 que tenían una confluencia de 70 a 90 % y expresaban de forma estable pTCF4-CMVpro-Luc, y se sembraron 1 x 104 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (FALCON). Después de 12 horas, las células se trataron con IC-2, PN3-13, o 5-FU a las concentraciones indicadas en la FIG. 13, y se incubaron adicionalmente a 37 °C. DMSO se utilizó como control. Dos días después del tratamiento con compuesto de bajo peso molecular, se añadieron 100 j l de Steady-Glo (PROMEGA, Wisconsin, USA) a cada pocillo de una placa blanca de 96 pocillos (Corning Inc., Nueva York, USA) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, un lector de placa de fluorescencia Infinite f 500 (TECAN, Zurich, Suiza) se usó para medir la actividad de luciferasa.

Los resultados demostraron que IC-2 y PN-3-13 ejercen un efecto inhibidor sobre una señal de Wnt/p-catenina (Figura 13). Sin embargo, 5-FU no ejerció ningún efecto inhibidor sobre una señal de Wnt/p-catenina.

<Ejemplo 6> Efecto antitumoral en cáncer de colon (ejemplo de referencia)

6.1 Cultivo celular

Células de cáncer de colon (DLD-1, HCT 116, colo 205) se cultivaron en DMEM en una placa de cultivo celular de 10 cm (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza) al 5 % de CO², 37 °C y una humedad del 100 %. Las células al 70-90 % de confluencia se dividieron y se lavaron con PBS (-). A continuación, se añadieron 300 pl de tripsina/EDTA a 2 ml de PBS (-) y las células se incubaron con esta solución a 37 °C durante 5 minutos para separar las células. Entonces, se usaron 5 ml de DMEM para recuperar las células. Las células recuperadas se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos para retirar el sobrenadante. Luego, las células se suspendieron en DMEM a 1:4 y se subcultivaron.

6.2 Efecto antitumoral

Primero, 5 x 105 células de cáncer de colon (DLD-1, HCT 116, o colo 205) se sembraron en una placa de 96 pocillos (TPP). Después de 24 horas, las células se trataron con IC-2, PN3-13, o HC-1 a las concentraciones indicadas en las Figuras 14 a 16. Cuarenta y ocho horas después del tratamiento con compuesto de bajo peso molecular, 100 pl de TetraColor ONE al 10 % (SEIKAGAKU CORPORATION, Tokio, Japón) se añadieron y la mezcla se incubó a 37 °C. Después de esto, se midió la absorbancia (a una longitud de onda de medición de 450 nm/una longitud de onda de control de 600 nm) utilizando un lector de microplacas de 96 pocillos (TECAN, Zúrich, Suiza).

Los resultados demostraron que IC-2, PN3-13, y HC-1 ejercieron un efecto inhibidor en la proliferación de las células de cáncer de colon (Figuras 14 a 16).

6.3 Evaluación de la capacidad de formación de esferas

La expresión de un marcador de superficie celular CD44 se usó como índice para clasificar células DLD-1 en el grupo del 5 % superior y el grupo del 5 % inferior. Un anticuerpo anti-CD44 humano (Abcam Ltd., Cambridge, Reino Unido) se utilizó como anticuerpo primario y a continuación se usó un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA). Después de eso, un equipo MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) se usó para analizar y fraccionar cada grupo. A continuación, las 5.000 células recogidas se colocaron en placas en cada pocillo de placas multipocillo de fijación ultra baja de 24 pocillos (Corning Inc., Corning, NY) en 500 pl de medio DMEM/F12 sin suero que contiene 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos humano básico recombinante (bFGF: Corefront Corporation, Tokio, Japón), 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (Sigma Life Science, St. Louis, Estados Unidos), B-27 (life technologies), 200 mmol/l de L-glutamina (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) y metilcelulosa al 0,6 % (Sigma Life Science). Entonces, se examinó una diferencia en la capacidad de formación de esferas. El día 3, se añadieron adicionalmente 500 ml del medio que contenía los componentes anteriores. El día 7, se realizó la evaluación. Se usó un microscopio de contraste de fase para tomar fotos con respecto a 10 campos visuales por pocillo. A continuación, el software libre Image J se utilizó para contar el número total de esferas. Entonces, el número total se comparó entre los grupos.

Con respecto a DLD-1, el número de esferas formadas por pocillo en una población celular que expresa CD44 más fuertemente es significativamente mayor que en una población celular que expresa CD44 débilmente (Figura 17). Esto demostró que el grupo que expresaba CD44 contenía fuertemente un mayor número de células que exhibían capacidad de formación de esferas y que tenían características de células madre cancerosas.

6.4 Efecto inhibidor en células madre cancerosas

Primero, se sembraron 1 x 106 células DLD-1 en una placa de 10 cm. Después de 24 horas, las células se trataron con 5-FU (0,5, 5 pM) o IC-2 (50 pM). Después de 48 horas adicionales, las células se recogieron. Un anticuerpo anti-CD44 humano (Abcam Ltd., Cambridge, Reino Unido) se utilizó como anticuerpo primario y a continuación se usó un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA). Después de eso, el análisis se realizó usando un equipo MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA).

Los resultados demostraron que el tratamiento con IC-2 disminuyó significativamente la proporción de células CD44alto (células que expresan CD44 fuertemente) sobre un control (Figura 18). Es decir, IC-2 ejerció un efecto inhibidor en células madre cancerosas. Tenga en cuenta que 5-FU aumentó bastante la proporción de células CD44alto.

6.5 Efecto inhibidor en señal de Wnt/p-catenina

Primero, 3,34 x 104 células de cáncer de colon (DLD-1, HCT 116, o colo 205) se sembraron en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de 24 horas, se llevó transfección a cabo utilizando 1 pl de lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), 50 ng de pTCF4-CMVpro-FLuc y 2,5 ng de pCMVpro-Rluc. Después de 4 horas, las células se trataron con IC-2, PN3-13, o HC-1 a las concentraciones indicadas en las Figuras 19 a 21. Después de 48 horas de tratamiento con compuesto de bajo peso molecular, se añadieron 100 |jl de 20 % de tampón de lisis pasivo (PROMEGA, Wisconsin, USA) a cada pocilio de una placa de 24 pocilios. La placa se agitó a temperatura normal durante 15 minutos y luego se dejó reposar durante la noche a -30 °C. Al día siguiente, se usó un sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (marca registrada) (PROMEGA), y luego se midió la actividad de luciferasa usando un MiniLumat LB 9506 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania).

Los resultados demostraron que IC-2, PN3-13 y HC-1 ejercen un efecto inhibidor sobre una señal de Wnt/p-catenina en células de cáncer de colon (Figuras 19 a 21). -

<Ejemplo 7> Efecto antitumoral en carcinoma de células escamosas (ejemplo de referencia)

7.1 Cultivo celular

Se cultivaron células HSC2 (una línea celular de carcinoma de células escamosas) en DMEM en una placa de cultivo celular de 10 cm (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza) al 5 % de CO², 37 °C y una humedad del 100 %. Las células al 70-90 % de confluencia se dividieron y se lavaron con PBS (-). A continuación, se añadieron 300 j l de tripsina/EDTA a 2 ml de PBS (-) y las células se incubaron con esta solución a 37 °C durante 5 minutos para separar las células. Entonces, se usaron 5 ml de DMEM para recuperar las células. Las células recuperadas se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos para retirar el sobrenadante. Las células sedimentadas se suspendieron en DMEM y se subcultivaron a 1:4.

7.2 Efecto antitumoral

Primero, se sembraron 2,5 x 103 de células HSC2 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (TPP). Después de 24 horas, las células se trataron con IC-2, PN3-13, o HC-1 a las concentraciones y duraciones indicadas en las Figuras 22 a 24. Después de 48 horas de tratamiento con compuesto de bajo peso molecular, 100 j l de TetraColor ONE al 10 % (SEIKAGAKU CORPORATION, Tokio, Japón) se añadieron y la mezcla se incubó a 37 °C. Después de esto, la absorbancia (a una longitud de onda de medición de 450 nm/una longitud de onda de control de 600 nm) se midió mediante un lector de microplacas de 96 pocillos (TECAN, Zúrich, Suiza). El mismo procedimiento se utilizó para investigar un efecto antitumoral de IC-2 en una línea celular de carcinoma de células escamosas HSC3 después del cultivo.

Los resultados demostraron que IC-2, PN3-13 y HC-1 ejercieron efectos inhibidores sobre la proliferación de células de carcinoma de células escamosas (figuras 22 a 25).

7.3 Efecto inhibidor en células madre cancerosas

Primero, se sembraron 5 x 105 de células HSC2 en una placa de 10 cm. Después de 24 horas, las células se trataron con 5-FU (0,5 jM ), IC-2 (25 jM ), PN-3-13 (7,5 jM ) o HC-1 (50 jM ). Además, algunas de las células se prepararon sin tratamiento compuesto de bajo peso molecular (0 jM ). Después de 48 horas adicionales, las células se recogieron. Un anticuerpo anti-CD44 humano (Abcam Ltd., Cambridge, Reino Unido) se utilizó como anticuerpo primario y a continuación se usó un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA). Después de eso, el análisis se realizó utilizando un clasificador celular, BD bioscience FACS Aria (BD Biosciences, CA, USA). Tenga en cuenta que la concentración de cada compuesto de bajo peso molecular se determinó basándose en la concentración CI⁵⁰a las 48 horas en un ensayo WST.

Los resultados demostraron que la proporción de células que expresan CD44 fue 83,9 % en el caso de ningún tratamiento de compuesto de bajo peso molecular; la proporción se redujo a 71,4 % en el caso de tratamiento con IC-2; la proporción se redujo a 68,4 % en el caso de tratamiento con PN-3-13; y la proporción se redujo a 49,8 % en el caso del tratamiento con HC-1 (Figura 26). Es decir, IC-2, PN3-13 y HC-1 ejercieron un efecto inhibidor en células madre cancerosas. Entre ellos, el efecto de HC-1 fue notable. Tenga en cuenta que en el caso de 5-FU la proporción fue de 83,3 % y se observó poco cambio.

7.4 Efecto inhibidor en señal de Wnt/p-catenina

Primero, se sembraron 5 x 104 de células HSC2 en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de 24 horas, se llevó transfección a cabo utilizando 1 j l de lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), 50 ng de pTCF4-CMVpro-FLuc y 2,5 ng de pCMVpro-Rluc. Después de 4 horas, las células se trataron con IC-2, PN3-13, o HC-1 a las concentraciones indicadas en las Figuras 27 a 29. Después de 48 horas de tratamiento con compuesto de bajo peso molecular, se añadieron 100 j l de 20 % de tampón de lisis pasivo (PROMEGA, Wisconsin, USA) a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. La placa se agitó a temperatura normal durante 15 minutos y luego se dejó reposar durante la noche a -30 °C. Al día siguiente, se usó un sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (marca registrada) (PROMEGA), y luego se midió la actividad de luciferasa usando un MiniLumat LB 9506 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania).

Los resultados demostraron que IC-2, PN3-13 y HC-1 ejercieron un efecto inhibidor en una señal de Wnt/p-catenina en las células de carcinoma de células escamosas (Figuras 27 a 29).

<Ejemplo 8> Evaluación de derivados de IC-2

8.1 Síntesis

Los derivados de IC-2 se sintetizaron según los esquemas indicados en las Figuras 30 a 35. Los detalles de la síntesis se ilustraron posteriormente. Las Figuras 36 y 37 muestran las estructuras y los datos espectrales de los derivados de IC-2 sintetizados.

Compuesto 1

Primero, se mezclaron 1-naftaldehído (1,6 g, 10 mmol) y 2,2-dietoxietanamina (1,3 g, 10 mmol), y la mezcla se agitó a 100 °C durante 30 min a 1 h. Después de dejar enfriar, la mezcla de reacción se mezcló con EtOH (25 ml) y la mezcla resultante se agitó y se hizo homogénea. A continuación, una pequeña cantidad de NaBH⁴(0,38 g, 10 mmol) se añadió gradualmente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora hasta la noche. Después de finalizar la reacción, el EtOH se retiró por destilación mientras la mezcla se concentró a presión reducida. Se añadió (una cantidad apropiada de) agua al residuo resultante, y se extrajo un producto con AcOEt. Una capa orgánica separada se lavó con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Después de eso, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/hexano = 5/1) para producir el compuesto 1 (2,3 g, 8,5 mmol, 85 %) como un líquido transparente incoloro.

Compuesto 2b

Se añadieron HATU (0,76 g, 2,0 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA) (0,26 g, 2,0 mmol) a una solución de DMF seca (7 ml) que contenía Fmoc-L-Phe-OH (0,54 g, 2,0 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El compuesto 1 (0,54 g, 2,0 mmol) se añadió a la mezcla de reacción y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, se añadió agua (20 ml). Entonces, se extrajo un producto con AcOEt. Una capa orgánica separada se lavó dos veces con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Después de eso, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/hexano = 1/2) para producir el compuesto 2b (1,2 g, 1,9 mmol, 95 %) como un sólido incoloro.

Compuesto 3b

Se añadió dietilamina (DEA) (10 ml) a una solución de CH²O ²(20 ml) que contenía el compuesto 2b (1,1 g, 1,7 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de finalizar la reacción, se retiraron CH²Cl²y el exceso de DEA por destilación mientras la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 5/1) para producir el compuesto 3b (0,55 g, 1,3 mmol, 76 %) como un líquido incoloro transparente viscoso.

Compuesto 4b

Se añadieron HATU (3,3 g, 8,7 mmol) y DIEA (1,1 g, 8,5 mmol) a una solución de DMF seca (15 ml) que contenía Fmoc-p-Ala-OH (2,5 g, 8,0 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El compuesto 3b (3,3 g, 7,8 mmol) se añadió a la mezcla de reacción y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, se añadió agua (30 ml). Entonces, se extrajo un producto con AcOEt. Una capa orgánica separada se lavó dos veces con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Después de eso, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/hexano = 3/1) para producir el compuesto 4b (5,1 g, 7,1 mmol, 91 %) como un sólido incoloro.

Compuesto 6b

Se añadió DEA (6 ml) a una solución de CH²Cl²(10 ml) que contenía el compuesto 4b (2,8 g, 3,9 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 a 4 h. Se retiraron CH²Cl²y el exceso de DEA por destilación mientras la mezcla se concentró a presión reducida. Se añadió (una cantidad apropiada de) CH²Ch al residuo resultante y la mezcla se hizo una solución homogénea. Después de eso, la muestra se concentró nuevamente a presión reducida. Después de que este procedimiento se repitiera dos veces, se añadió CH²O ²(10 ml) al residuo resultante. La mezcla se agitó y se hizo homogénea. Entonces, se añadió isocianato de bencilo (0,78 g, 5,9 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, se retiró CH²Cl²por destilación mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 30/1) para producir el compuesto 6b (1,5 g, 2,4 mmol, 62 %) como un sólido incoloro.

Compuesto 6b-R

El Compuesto 6b-R (un sustituyente R = OMe, Cl, o F) se sintetizó según el esquema indicado en la Figura 31.

Compuesto 8b

Se añadió ácido fórmico (10 ml) al compuesto 4b (1,6 g, 2,3 mmol), y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, el ácido fórmico se retiró por destilación mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/hexano = 4/1) para producir el compuesto 8b (1,3 g, 2,1 mmol, 91 %) como un sólido incoloro.

Compuesto 9b

Se añadió dietilamina (1,3 g, 18 mmol, 1,8 ml) a una solución de CH²Cl²(5,5 ml) que contenía el compuesto 8b (1,1 g, 1,8 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de finalizar la reacción, se retiró CH²Cl²por destilación mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 7/1) para producir el compuesto 9b (0,57 g, 1,4 mmol, 78 %) como un sólido incoloro.

IC-2 (Sintetizado a partir del compuesto 6b)

Se añadió ácido fórmico (8 ml, 0,21 mol) al compuesto 6b (1,3 g, 2,1 mmol), y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, el ácido fórmico se retiró por destilación mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 30/1) para proporcionar IC-2 (1,0 g, 1,9 mmol, 90 %) como un sólido incoloro.

IC-2-R

El Compuesto IC-2-R (un sustituyente R = OMe, Cl, F o NO?) se sintetizó según el esquema indicado en la Figura 31.

IC-2 (Sintetizado a partir del compuesto 9b)

Se añadió isocianato de bencilo (1,4 g, 11 mmol) a una solución de CH²Cl²(10 ml) que contenía el compuesto 9b (3,3 g, 8,3 mmol), y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de finalizar la reacción, se retiró CH²Cl²por destilación mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 30/1) para proporcionar IC-2 (3,7 g, 6,9 mmol, 83 %) como un sólido incoloro.

Ácido 4-(4-metoxibenciloxi)fenilacético

Se añadieron K²CO³(4,4 g, 32 mmol) y cloruro de 4-metoxibencilo (1,3 g, 8 mmol) a una solución de DMF seca (20 ml) que contenía 4-hidroxifenilacetato de metilo (2,7 g, 16 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se inyectó en agua helada (30 ml) y luego se extrajo un producto con EtOAc. Una capa orgánica separada se lavó con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Después de eso, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. Se añadieron MeOH (24 ml) y THF (8 ml) al residuo resultante, y la mezcla se agitó y se hizo homogénea. A continuación, se añadió lentamente una solución acuosa de NaOH (0,96 g, 24 mmol, 6 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se retiró por destilación un disolvente orgánico mientras la mezcla se concentró a presión reducida. Entonces, se añadió agua (50 ml) y la mezcla se hizo ácida con ácido sulfúrico 1 M. Posteriormente, se usaron acetato de etilo y THF para extraer un producto. Una capa orgánica se lavó dos veces con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Después de eso, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. El residuo resultante se recristalizó (usando EtOAc-THF) para dar ácido 4-(4-metoxibenciloxi)fenilacético puro (1,8 g, 6,8 mmol, 85 %).

Ácido 4-metoximetoxifenilacético

Se añadió DIEA (3,9 g, 30 mmol) a una solución de CH²Cl²(15 ml) que contenía 4-hidroxifenilacetato de metilo (2,5 g, 15 mmol). Mientras la mezcla se enfriaba en un baño de agua con hielo, se añadió clorometil metil éter (1,8 g, 23 mmol). La mezcla se agitó a esa temperatura durante 10 minutos. Luego, la temperatura volvió a la temperatura ambiente y la mezcla se agitó adicionalmente durante la noche. Se retiraron CH²Cl²y el exceso de clorometil metil éter mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. Después de eso, se añadió MeOH (25 ml) y la mezcla se agitó y se hizo homogénea. Después de eso, se añadió una solución acuosa de KOH (3,0 g, 45 mmol, 5 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se añadió agua (20 ml) a la mezcla de reacción y se separó una capa acuosa. Después, se añadió una solución acuosa saturada de NH⁴Cl (20 ml) para ajustar usando ácido sulfúrico diluido a un pH de aproximadamente 4. Luego se añadió EtOAc a la misma para separar una capa orgánica. Después de eso, la capa orgánica se lavó con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. La muestra resultante se filtró, se concentró a presión reducida y se secó a presión reducida para dar ácido 4-metoximetoxifenilacético (2,2 g, 11 mmol, 76 %).

4-Hidroxifenilacetato de bencilo

NaH (60 % en aceite, 0,88 g, 22 mmol) se añadió a una solución de DMF seca (20 ml) que contenía ácido 4-hidroxifenilacético (3,0 g, 20 mmol) que se enfrió en atmósfera de Ar en un baño de agua con hielo. La mezcla se agitó a esa temperatura durante 30 minutos. A continuación, se añadió bromuro de bencilo (6,8 g, 40 mmol) en varias porciones durante 30 minutos. La mezcla se agitó durante 3 h mientras se enfriaba en un baño de agua con hielo, y se agitó adicionalmente durante la noche a temperatura ambiente. Entonces, se añadieron agua (20 ml) y EtOAc (20 ml) a la mezcla de reacción y se agitó bien. Después de eso, se separó una capa orgánica, se lavó con solución acuosa al 5 % de NaHCO³y solución salina saturada, y se secó con Na²SO⁴. Después de filtrar y concentrar la muestra a presión reducida, se añadió hexano al sólido resultante. Posteriormente, se llevó a cabo una filtración por succión y el sólido resultante se secó a presión reducida para dar 4-hidroxifenilacetato de bencilo (3,4 g, 14 mmol, 70 %).

Ácido 4-(ferc-butildimetilsiloximetil)fenilacético

NaH (60 % en aceite, 0,44 g, 11 mmol) se añadió a una solución de DMF seca (10 ml) que contenía ácido 4-hidroximetilfenilacético (1,7 g, 10 mmol) que se enfrió en atmósfera de Ar en un baño de agua con hielo. Después de agitar la mezcla a esa temperatura durante 30 minutos, se añadió bromuro de bencilo (3,4 g, 20 mmol) en varias porciones durante 30 minutos. La mezcla se agitó durante 2 h mientras se enfriaba en un baño de agua con hielo, y se agitó adicionalmente durante la noche a temperatura ambiente. Entonces, se añadieron agua (20 ml) y AcOEt (20 ml) a la mezcla de reacción y se mezclaron bien. Después de eso, se separó una capa orgánica, se lavó con solución acuosa al 5 % de NaHCO³y solución salina saturada, y se secó con Na²SO⁴. Después de filtración, se retiró AcOEt por destilación mientras la muestra se concentraba a presión reducida. La muestra se destiló adicionalmente a presión reducida para eliminar el exceso de bromuro de bencilo. Se añadió DMF seco (10 ml) al residuo resultante y la mezcla se agitó y se hizo homogénea. Entonces, se añadieron cloruro de terc-butildimetilsililo (2,0 g, 13 mmol) e imidazol (1,4 g, 20 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se añadió agua (20 ml) a la mezcla de reacción, y luego se extrajo un producto con AcOEt. Una capa orgánica separada se lavó con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Después de filtrar y concentrar la muestra a presión reducida, se añadió EtOH (15 ml) al residuo resultante. La mezcla se agitó y se hizo homogénea, seguido de la adición de Pd al 5 %/C (1,1 g). Mientras tanto, el interior del sistema se reemplaza con H². Después de agitar la muestra a temperatura ambiente durante 4 h, se retiró el Pd/C por filtración usando un papel de filtro de doble capa. Después de concentrar el filtrado a presión reducida, el residuo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/hexano = 1/2) para dar ácido 4-(tercbutildimetilsiloximetil)fenilacético (0,95 g, 3,4 mmol, 34 %).

IC-2-OMOM

Se añadieron difenilfosforilazida (0,83 g, 3 mmol) y Et3N (0,36 g, 3,6 mmol) a una solución de tolueno (10 ml) que contenía ácido 4-metoximetoxifenilacético (0,59 g, 3 mmol), y la mezcla se agitó a 80 °C durante 2 h. Después de dejar enfriar la mezcla, se añadió hexano (15 ml) y la mezcla se agitó durante cierto tiempo. A continuación, se recogió el sobrenadante por decantación. Se añadió nuevamente hexano (7 ml) al residuo, y la mezcla se agitó durante cierto tiempo. Entonces, se recogió el sobrenadante por decantación, y esta operación se repitió una vez más. El sobrenadante recogido se concentró a presión reducida. Después de eso, se añadió CH²Cl²(8 ml) al residuo y la mezcla se hizo homogénea. Posteriormente, se añadió el compuesto 9b (0,40 g, 1 mmol) a ello. Después de agitar la mezcla durante una noche a temperatura ambiente, se retiró el disolvente orgánico por destilación mientras la mezcla se concentraba a presión reducida. El residuo resultante se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt) para dar IC-2-OMOM (0,50 g, 0,85 mmol, 84 %).

IC-2-NO2

Para la manipulación se utilizó el mismo protocolo que para IC-2-OMOM y ácido 4-nitrofenilacético. En el protocolo, sin embargo, se omitió el paso de recoger el sobrenadante mediante la adición de hexano. Después de dejar enfriar la muestra, se añadieron CH²O ²y el compuesto 9b directamente a la mezcla de reacción. La cromatografía en columna de gel de sílice se realizó a AcOEt/EtOH = 8/1. El rendimiento fue 24 %.

IC-2-OPMB

Para la manipulación se utilizó el mismo protocolo que para IC-2-OMOM y ácido 4-(4-metoxibenciloxi)fenilacético. En este sentido, sin embargo, la adición de tolueno solo no logró convertir el ácido 4-(4-metoxibenciloxi)fenilacético en una solución homogénea. Por tanto, también se añadió THF seco (5 ml). La cromatografía en columna de gel de sílice se realizó a AcOEt/EtOH = 30/1. El rendimiento fue 93 %.

IC-2-MOTBS

Se usó el mismo protocolo que para IC-2-OMOM y ácido 4-(terc-butildimetilsiloximetil)fenilacético para la manipulación. La cromatografía en columna de gel de sílice se realizó usando AcOEt. El rendimiento fue 66 %.

IC-2-OH

Se añadió CF³CO²H (1,1 ml, 14 mmol) a una solución de CH²CI²(3 ml) que contenía IC-2-OMOM (0,44 g, 0,74 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se inyectó lentamente en solución acuosa al 5 % de NaHCO³(40 ml), y se extrajo un producto usando AcOEt. Una capa orgánica separada se lavó con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Entonces, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 30/1) para dar IC-2-OH (0,16 g, 0,29 mmol, 39 %).

IC-2-MOH

A una solución seca de THF (8 ml) que contenía IC-2-MOTBS (0,51 g, 0,75 mmol) se añadió una solución de THF que contenía TBAF (1 M, 1,5 ml, 1,5 mmol) enfriado con agua con hielo. Después de agitar a esa temperatura durante 10 minutos, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se añadió agua (20 ml) a la mezcla de reacción, y luego se extrajo un producto con AcOEt. Una capa orgánica separada se lavó con solución salina saturada y se secó con Na²SO⁴. Entonces, la muestra se filtró y concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = ¹⁰/ ¹) para dar IC-2-MOH (0,30 g, 0,53 mmol, 71 %).

8.2 Efecto inhibidor en señal de Wnt/p-catenina

Primero, se recogieron células HuH7 que tenían una confluencia de 70 a 90 % y expresaban de forma estable pTCF4-CMVpro-Luc, y se sembraron 1 x 104 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (FALCON). Después de 24 horas, las células se trataron con derivados de IC-2 (IC-2-OMe, IC-2-F, IC-2-CI, o IC-2-NO2) a las concentraciones indicadas en las Figuras 38 y 39, y se incubaron adicionalmente a 37 °C. DMSO se usó como control. Cuatro días después del tratamiento con compuesto de bajo peso molecular, se añadieron 100 pl de Steady-Glo (PROMEGA, Wisconsin, USA) a cada pocillo de una placa blanca de 96 pocillos (Corning Inc., Nueva York, USA) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, un lector de placa de fluorescencia Infinite F500 (TECAN, Zurich, Suiza) se usó para medir la actividad de luciferasa.

Los resultados demostraron que los derivados de IC-2 ejercieron un efecto inhibidor en una señal de Wnt/p-catenina (Figuras 38 y 39).

<Ejemplo 9> Inhibición de fibrosis

9.1 Condiciones de cultivo celular

Se mantuvo una línea celular estrellada de hígado humano (células LX-2) y se cultivó en DMEM que contenía FBS al 10 %. Las células utilizadas para los experimentos se suspendieron en DMEM que contenía FBS al 1 % y se sembraron en placas. La densidad celular fue aproximadamente 2,0 x 105 células/cm2.

9.2 Concentraciones de compuesto de bajo peso molecular utilizado

IC-2: 0, 15, 20, 25 pM; PN-3-13: 0, 5,5, 6,0, 6,5 pM; HC-1: 0, 12, 16, 20 pM.

9.3 Ensayo de luciferasa

Se usó un ensayo de luciferasa para investigar un efecto inhibidor de cada compuesto de bajo peso molecular en una señal de Wnt/p-catenina. El ensayo de luciferasa se realizó en las condiciones indicadas en la Figura 40 y las siguientes secciones 9.3.1 a 9.3.2. La Figura 40 ilustra el protocolo cuando las células se trataron con un compuesto de bajo peso molecular TGFp. Básicamente se realizó el mismo experimento cuando las células se trataron con un compuesto de bajo peso molecular solo o un compuesto de bajo peso molecular Wnt3a. Tenga en cuenta que se añadió TGFp o Wnt3a para aumentar la intensidad de una señal de Wnt/p-catenina.

9.3.1 Recuperación de muestra

Primero, se diluyó tampón de lisis pasivo 5 x 5 veces con agua MilliQ. El tampón de lisis se añadió a 100 pl/pocillo y la placa se agitó durante 20 minutos. El lisado se congeló a -30 °C durante la noche.

9.3.2 Medición

La muestra congelada un día antes, LARII, un tampón Stop & Glo y un sustrato Stop & Glo (se sombrearon materiales distintos de la muestra) se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. Se preparó una solución Stop & Glo (49 pl de tampón Stop & Glo y 1 pl del sustrato Stop & Glo) para el número de muestras 1. A continuación, se dispensaron 50 pl de LARII en un tubo de 3,5 ml. Entonces, se añadieron 10 pl de la muestra y el tubo se colocó en un instrumento de medición. Después de completar el primer ensayo, se añadieron 50 pl de la solución Stop & Glo y el tubo se ajustó nuevamente en el instrumento de medición para otro ensayo.

9.3.3 Resultados

Las Figuras 41 a 43 muestran los resultados del ensayo de luciferasa 24 horas después del tratamiento con IC-2. El tratamiento usando cualquiera de IC-2 solo, IC-2 TGFp e IC-2 Wnt3a dio como resultado la inhibición de una señal de Wnt/p-catenina en las células LX-2.

Las Figuras 44 a 46 muestran los resultados del ensayo de luciferasa 48 horas después del tratamiento con IC-2. El tratamiento usando IC-2 solo o IC-2 TGFp dio como resultado la inhibición de una señal de Wnt/p-catenina en las células LX-2.

Las Figuras 47 y 48 muestran los resultados del ensayo de luciferasa 24 o 48 horas después del tratamiento con PN3-13 (no incluido en la presente invención). El tratamiento con PN3-13 TGFá dio como resultado una inhibición dependiente de concentración de una señal de Wnt/p-catenina en las células LX-2.

Las Figuras 49 a 51 muestran los resultados del ensayo de luciferasa 24 horas después del tratamiento con HC-1 (no incluido en la presente invención). El tratamiento usando HC-1 solo o HC-1 TGFp dio como resultado la inhibición de una señal de Wnt/p-catenina en las células LX-2.

Las Figuras 52 a 54 muestran los resultados del ensayo de luciferasa 48 horas después del tratamiento con HC-1 (no incluido en la presente invención). El tratamiento usando cualquiera de HC-1 solo, HC-1 TGFp e HC-1 Wnt3a dio como resultado la inhibición de una señal de Wnt/p-catenina en las células LX-2.

9.4 PCR en tiempo real

Se realizó una PCR en tiempo real para examinar un efecto inhibidor de cada compuesto de bajo peso molecular en la fibrosis. La PCR en tiempo real se realizó en las condiciones indicadas en la Figura 55 y las siguientes secciones 9.4.1 a 9.4.2. Tenga en cuenta que TGFp, a-SMA, y COL1A1 son marcadores de fibrosis.

9.4.1 Preparación de la muestra

Se preparó una premezcla usando agua MilliQ: 5,2 pl/muestra, MgCh: 0,8 pl/muestra, cebador F 10 pM: 0,5 pl, cebador R 10 pM: 0,5 pl, y LightCycler FastStart DNA Master SYBER Green I (1a 1b): 1,0 pM/muestra. A continuación, se pipetearon 8 pl de la premezcla en cada pocillo. Entonces, A esto se añadieron 2 pl de la muestra.

9.4.2 Temperaturas de reacción de PCR

•GAPDH

95 °C: 10 min -> [95 °C: 10 s -> 60 °C: 10 s -> 72 °C: 10 s] x 35 ciclos.

•a-SMA

95 °C: 10 min -> [95 °C: 10 s -> 56 °C: 5 s -> 72 °C: 10 s] x 40 ciclos.

•COL1A1

95 °C: 10 min -> [95 °C: 10 s -> 58 °C: 5 s -> 72 °C: 10 s] x 40 ciclos.

•TGFp

95 °C: 10 min -> [95 °C: 1 s -> 56 °C: 5 s -> 72 °C: 10 s] x 40 ciclos.

9.4.3 Resultados

Las Figuras 56 a 58 muestran los resultados de PCR en tiempo real 24 o 48 horas después del tratamiento con IC-2 TGFp. A medida que aumentó la concentración de IC-2, disminuyó el nivel de expresión de cada uno de los marcadores de fibrosis. El nivel de expresión de a-SMA, en particular, se redujo notablemente.

Las Figuras 59 a 61 muestran los resultados de PCR en tiempo real 24 o 48 horas después de tratamiento con PN3-13 TGFp (no incluido en la presente invención). A medida que aumentó la concentración de PN3-13, el nivel de expresión de cada uno de los marcadores de fibrosis disminuyó, excepto en el caso del nivel de TGFp 24 horas después del tratamiento. El nivel de expresión de a-SMA, en particular, se redujo notablemente.

Las Figuras 62 a 64 muestran los resultados de PCR en tiempo real 24 o 48 horas después del tratamiento con HC-1 TGFp (no incluido en la presente invención). A medida que aumentó la concentración de HC-1, disminuyó el nivel de expresión de cada uno de los marcadores de fibrosis. El nivel de expresión de a-SMA, en particular, se redujo notablemente.

<Ejemplo 10> Se usaron ratones modelo de enfermedad hepática para evaluar el efecto del tratamiento de fibrosis 10.1 Animales experimentales y condiciones de cría

Primero, ratones macho C57BL/6 de 7 semanas de edad (Japan SLC, Shizuoka, Japón) se sometieron a una cría preparatoria de 1 semana. Entre ellos, se usaron ratones sanos. Los ratones se alojaron en una jaula de animales a una temperatura ambiente de 22 ± 1 °C y una humedad de 50 ± 5 % durante todo el período de cría preparatoria y experimental y se les dio acceso a voluntad a alimentos y agua.

10.2 Método para inducir fibrosis hepática y método para administrar el fármaco

Una microjeringa (ITO CORPORATION, Shizuoka, Japón) se usó para administrar intraperitonealmente tetracloruro de carbono (CCU: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón) a 0,2 ml/kg, 3 veces por semana, durante 4, 6 u 8 semanas. El tetracloruro de carbono se disolvió en aceite de cono (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a una concentración de 10 %. Se usó la solución resultante. Después de administrar esta solución de tetracloruro de carbono durante 4 semanas, los ratones se dividieron en un grupo de administración de vehículo, un grupo de administración de glicirricina, un grupo de administración de ICG-001 y un grupo de administración de IC-2. Entonces, se usó una microjeringa para administrar intraperitonealmente, 3 veces a la semana durante 4 semanas, tetracloruro de carbono y una solución de fármaco preparada según el siguiente proceso. Tenga en cuenta que el tetracloruro de carbono y la solución de fármaco se administraron alternativamente con un intervalo de un día.

La glicirricina (TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., Tokio, Japón) se disolvió en solución salina fisiológica. La solución se preparó a una concentración de 30 mg/ml mientras que el pH se ajustó a 7,0 con NaOH líquido 4 M. IC-2 e ICG-001 (AdooQ BioScience, California, USA) se disolvieron en WellSolve (Celeste Corporation, Tokio, Japón) a una concentración de 40 mg/ml y 10 mg/ml, respectivamente. A continuación, la mezcla se calentó durante 10 minutos en un baño de agua caliente a 60 °C y luego se disolvió por completo. Se añadió un volumen 9 veces mayor de solución salina fisiológica a la solución de WellSolve en la que se habían disuelto los fármacos anteriores. A continuación, se pesó una cantidad requerida de la solución de fármaco de modo que glicirricina, IC-2 e ICG-001 se administraron a 150 mg/kg, 10,6 o 21,2 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente. Para IC-2 e ICG-001, se mezclaron WellSolve y solución salina fisiológica a 1:9 para preparar cada solución. Para la glicirricina, se agregó solución salina fisiológica. El volumen de cada solución se ajustó a 200 pl. Además, se preparó una solución en la que se mezclaron WellSolve y solución salina fisiológica a 1:9 como vehículo. Tenga en cuenta que la dosis de IC-2 se determinó basándose en una concentración eficaz in vitro.

10.3 Retirada del hígado

Cuatro semanas después de la administración de tetracloruro de carbono, se usó una jeringa desechable de 1 ml con una aguja de 27 G para administrar intraperitonealmente, a 5 ratones, el anestésico sistémico Somnopentyl (Kyoritsuseiyaku Corporation, Tokio, Japón) a 1 pl/g de peso corporal. Entonces, se indujo anestesia. Después de la inducción de anestesia, se usó una jeringa de 1 ml con una aguja 27G para recoger sangre completa de la vena cava inferior y se extrajo todo el hígado. Además, 8 semanas después de la administración de tetracloruro de carbono, 8 ratones de cada grupo recibieron la misma operación que se ha indicado anteriormente. Se cortaron secciones de tejido cuboidal de aproximadamente 1 cm del hígado extraído y se impregnaron en paraformaldehído al 4 % (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) para el análisis histológico. El resto del tejido hepático se cortó en pequeños trozos utilizando un instrumento quirúrgico. Las piezas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron en un congelador a -80 °C hasta su uso en experimentos.

10.4 Cuantificación de hidroxiprolina

Las piezas de tejido vivo congeladas preparadas mediante el procedimiento anterior se diseccionaron adicionalmente con un peso húmedo de 50 mg usando un instrumento quirúrgico. A continuación, se añadieron 500 pl de agua ultrapura y la mezcla se homogeneizó con un homogeneizador polytron. La solución homogeneizada se congeló una vez en nitrógeno líquido y se descongeló a temperatura ambiente. Entonces, un sonicador BioRupture (COSMO BIO co., ltd., Tokio, Japón) se utilizó para realizar sonicación durante 15 minutos en un total de 30 ciclos, incluyendo cada ciclo 15 segundos en un baño de agua con hielo y 15 segundos de enfriamiento. Se añadió un volumen equivalente de ácido clorhídrico concentrado 12 N a 100 pl de la solución sonicada resultante y la mezcla se sometió a hidrólisis durante 16 h en una incubadora de bloque (IKA, Staufen, Alemania) ajustada a 120 °C. La solución sonicada restante se usó para medir la cantidad de proteína en la solución. Después de hidrólisis, la solución se enfrió a temperatura ambiente, seguido de pipetear y moler el producto de hidrólisis en trozos finos. La muestra se centrifugó a 3000 rpm durante 5 min. Después de la centrifugación, se colocaron 10 pl de sobrenadante en un tubo de 1,5 ml. Entonces, un evaporador de enfriamiento (SAKUMA Corporation, Tokio, Japón) se utilizó para eliminar el ácido clorhídrico. Posteriormente, un kit de cuantificación de hidroxiprolina (BioVision, California, USA) se usó para cuantificar el contenido de hidroxiprolina. Al lisado de hidrólisis libre de ácido clorhídrico se añadieron 100 pl de una solución de cloramina T, y la mezcla se mezcló bien usando un agitador vorticial y se dejó reposar durante 25 minutos. Después de esto, se añadieron 100 pl de una solución de DMAB y la mezcla se hizo reaccionar durante 90 minutos en un baño de agua caliente a 60 °C. Después de enfriar a temperatura ambiente, la solución de reacción se transfirió a una placa de 96 pocillos. Posteriormente, se midió la absorbancia a 560 nm utilizando un lector de microplacas (TECAN, Zúrich, Suiza). El contenido de hidroxiprolina se calculó a partir de la absorbancia obtenida según una curva estándar.

La cantidad de proteína en el lisado se determinó por el método de Bradford usando un concentrado de reactivo de colorante para ensayo de proteínas (Bio-Rad, California, USA). El lisado se centrifugó a 15000 rpm y 4 °C durante 10 minutos, y 1 |jl del sobrenadante resultante se colocó en un pocilio de una placa de 96 pocilios. A continuación, 200 |jl del concentrado reactivo de colorante de ensayo de proteínas, que se diluyeron 5 veces con agua ultrapura, se añadieron al pocillo y la mezcla se agitó y luego se dejó reposar durante 15 minutos. Después, se midió la absorbancia a 595 nm mediante un lector de microplacas (TECAN). La cantidad de proteína por j l de lisado se calculó a partir de la absorbancia obtenida según una curva estándar. Finalmente, se determinó el contenido de hidroxiprolina por masa de proteína para evaluar el nivel de fibrosis.

10.5 Tinción con rojo Sirius

La pieza de tejido hepático, que se cortó utilizando el procedimiento anterior, se fijó en paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de la inclusión en parafina, se prepararon secciones de tejido usando un microtomo. A continuación, un kit Picosirius Red Stain (Polysciences, Pensilvania, USA) se utilizó para teñir las fibras de colágeno mediante el uso de un colorante rojo Sirius según las instrucciones adjuntas. Entonces, un microscopio de contraste de fase de fluorescencia invertido BZ-9000 (KEYENCE CORPORATION, Tokio, Japón) se utilizó para tomar 10 fotos de una imagen de campo claro (con un aumento de 100x) por sección de tejido. Finalmente, una relación de área positiva para fibrosis, que se determinó como la proporción del área de fibra, que se tiñó de rojo, al área del tejido en cada imagen capturada, se cuantificó.

10.6 Resultados

La Figura 65 muestra los resultados de cuantificar el contenido de hidroxiprolina. Cuando se compara con el grupo de administración del vehículo, el grupo de administración de glicirricina (control positivo) tenía un contenido reducido de hidroxiprolina. En el grupo de administración de IC-2, se observó una gran disminución.

La Figura 66 muestra los resultados de cuantificar el área de fibrosis usando la tinción con rojo Sirius. En comparación con el grupo de vehículo, se detectó una disminución en el área de fibrosis en el grupo de administración de IC-2.

<Discusión>

Como se describió anteriormente, se demostró que el uso de IC-2, etc., inhibió la proliferación de células cancerosas y células madre cancerosas. Se sabe que las células madre cancerosas causan recaídas y metástasis de tumores malignos. IC-2, etc., que puede inhibir la proliferación de células madre cancerosas, se puede decir por tanto que es un compuesto muy prometedor como ingrediente activo en un fármaco terapéutico para tumores malignos. Además, IC-2, etc., también ejerció un efecto inhibidor en fibrosis, que es probable que cause la aparición de cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un fármaco terapéutico para su uso en un método de tratamiento de un tumor maligno hepático, que comprende al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos:

en donde

m representa un entero de cualquiera de 1 a 4;

n es un entero de cualquiera de 1 a 3;

p representa un entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde

la expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados entre halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C¹-⁶, halogenoalquilo C¹-⁶, hidroxialquilo C¹-⁶, alquilamino C¹-⁶, cicloalquilo C³-⁶, alquenilo C²-⁶, halogenoalquenilo C²-⁶, hidroxialquenilo C²-⁶, alquenilamino C²-⁶, cicloalquenilo C³-⁶, alquinilo C²-⁶, halogenoalquinilo C²-⁶, hidroxialquinilo C²-⁶, alquinilamino C²-⁶, alcoxi C¹-⁶, halogenoalcoxi C¹-⁶, hidroxialcoxi C¹-⁶, alcoxiamino C¹-⁶, alcoxifenilo C¹-⁶, trialquilsiloxi, alquildifenilsiloxi, arilo, y heteroarilo.

2. El fármaco terapéutico para el uso en un método de tratamiento de un tumor maligno hepático según la reivindicación 1, en donde R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C¹-⁶, halogenoalquilo C¹-⁶, hidroxialquilo C¹-⁶, alquilamino C¹-⁶, alcoxi C¹-⁶, halogenoalcoxi C¹-⁶, hidroxialcoxi C¹-⁶, o alcoxiamino C¹-⁶, o alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C¹-⁶, alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C¹-⁶fenilo, (trialquilsiloxi)alquilo C^1-6o (alquildifenilsiloxi)alquilo C¹-⁶; y

R3 es H.

3. El fármaco terapéutico para el uso en un método de tratamiento de un tumor maligno hepático según la reivindicación 1 o 2, en donde en la fórmula (1),

R1, R2, y R3 son cada uno H, y

R4 está en posición 4 y representa H, F, Cl, nitro, OH, CH²OH, metoxi, metoximetoxi, terc-butildimetilsiloximetilo, o 4-metoxibenciloxi.

4. Un fármaco terapéutico para su uso en un método de tratamiento de una célula madre de cáncer hepático, que comprende al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos:

en donde

R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C i-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C^2-6opcionalmente sustituido, alcoxi C^1-6opcionalmente sustituido, arilo, o heteroarilo;

m representa un entero de cualquiera de 1 a 4;

n es un entero de cualquiera de 1 a 3;

p representa un entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde

la expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados entre halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C^1-6, halogenoalquilo C^1-6, hidroxialquilo C^1-6, alquilamino C i-6, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halogenoalquenilo C2-6, hidroxialquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C^3-6, alquinilo C^2-6, halogenoalquinilo C^2-6, hidroxialquinilo C^2-6, alquinilamino C^2-6, alcoxi C^1-6, halogenoalcoxi C i-6, hidroxialcoxi C i-6, alcoxiamino C i-6, alcoxifenilo C i-6, trialquilsiloxi, alquildifenilsiloxi, arilo, y heteroarilo.

5. El fármaco terapéutico para el uso en un método de tratamiento de una célula madre de cáncer hepático según la reivindicación 4, en donde R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C i-6, halogenoalquilo C i-6, hidroxialquilo C i-6, alquilamino C i-6, alcoxi C i-6, halogenoalcoxi C i-6, hidroxialcoxi C i-6, o alcoxiamino C^1-6, o alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C^1-6, alcoxi C^1-6sustituido con alcoxi C^1-6fenilo, (trialquilsiloxi)alquilo C i-6 o (alquildifenilsiloxi)alquilo C i-6; y

R3 es H.

6. El fármaco terapéutico para el uso en un método de tratamiento de una célula madre de cáncer hepático según la reivindicación 4 o 5, en donde en la fórmula (1),

R1, R2, y R3 son cada uno H, y

R4 está en posición 4 y representa H, F, Cl, nitro, OH, CH2OH, metoxi, metoximetoxi, ferc-butildimetilsiloximetilo, o 4-metoxibenciloxi.

7. Un fármaco terapéutico para su uso en un método de tratamiento de fibrosis hepática, que comprende al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en compuestos representados por la fórmula (1), una sal de los mismos o un solvato de los mismos:

en donde

R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alcoxi C i-6 opcionalmente sustituido, arilo, o heteroarilo;

m representa un entero de cualquiera de 1 a 4;

n es un entero de cualquiera de 1 a 3;

p representa un entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde

la expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados entre halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C i-6, halogenoalquilo C i-6, hidroxialquilo C i-6, alquilamino C^1-6, cicloalquilo C^3-6, alquenilo C^2-6, halogenoalquenilo C^2-6, hidroxialquenilo C^2-6, alquenilamino C^2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halogenoalquinilo C2-6, hidroxialquinilo C2-6, alquinilamino C2-6, alcoxi C i-6, halogenoalcoxi C^1-6, hidroxialcoxi C^1-6, alcoxiamino C^1-6, alcoxifenilo C^1-6, trialquilsiloxi, alquildifenilsiloxi, arilo, y heteroarilo.

8. El fármaco terapéutico para el uso en un método de tratamiento de fibrosis hepática según la reivindicación 7, en donde R1, R2, y R4 son iguales o diferentes y representan cada uno H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C i-6, halogenoalquilo C^1-6, hidroxialquilo C^1-6, alquilamino C^1-6, alcoxi C^1-6, halogenoalcoxi C^1-6, hidroxialcoxi C^1-6, o alcoxiamino C i-6, o alcoxi C i-6 sustituido con alcoxi C i-6, alcoxi C i-6 sustituido con alcoxi C i-6fenilo, (trialquilsiloxi)alquilo C^1-6, o (alquildifenilsiloxi)alquilo C^1-6; y

R3 es H.

9. El fármaco terapéutico para el uso en un método de tratamiento de fibrosis hepática según la reivindicación 7 u 8, en donde en la fórmula (1),

R1, R2, y R3 son cada uno H, y

R4 está en posición 4 y representa H, F, Cl, nitro, OH, CH²OH, metoxi, metoximetoxi, terc-butildimetNsiloximetilo, o 4-metoxibenciloxi.