CN103501785A - 用于治疗脑肿瘤的csf-1r抑制剂 - Google Patents

用于治疗脑肿瘤的csf-1r抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了式I的化合物；

Description

用于治疗脑肿瘤的CSF-1R抑制剂
背景
脑或神经系统的癌症是最难以治疗的。具有这些癌症的患者的预后取决于肿瘤的类型和位置及其发展阶段。就许多类型的脑癌而言，症状发作后的平均预期寿命可以为数月或者一年或两年。治疗主要由手术切除和放疗组成；也使用化疗，但适合的化疗剂范围有限，可能因为大部分治疗剂无法充分地穿透血脑屏障以治疗脑肿瘤。与手术和放疗一起使用已知的化疗剂很少将手术和放疗所产生的存活延长很多。因此，需要针对脑肿瘤的改进的治疗选择。
神经胶质瘤是常见类型的脑肿瘤。它们源于神经胶质细胞构成的支持性神经元组织(因此名称为神经胶质瘤)，其维持神经元的位置和功能。神经胶质瘤根据它们类似的胶质细胞类型被分类：星形细胞瘤(包括成胶质细胞瘤)类似于星星-形状的星形胶质细胞，少突神经胶质细胞瘤类似于少突神经胶质细胞；室管膜瘤类似于形成脑中流体腔内层的室管膜神经胶质细胞。在一些情况中，肿瘤可以含有这些细胞类型的混合物并且将被称作混合性神经胶质瘤。
典型的目前用于脑癌的治疗是手术切除大部分肿瘤组织，其可以通过侵入性手术或使用活组织检查或抽取方法进行。神经胶质瘤倾向于无规则地发散，非常难以完全除去。因此，在切除肿瘤后几乎总是迅速复发。放疗和/或化疗可以与手术切除组合使用，但它们一般仅提供中度的存活时间延长。例如，最近的统计学显示在美国被诊断为成胶质细胞瘤的患者仅有约一半在诊断后1年是存活的，仅有约25%在2年后仍然存活，甚至当用目前的护理组合治疗标准治疗时也是如此。
多形性成胶质细胞瘤(GBM)是最常见的成年人原发性脑肿瘤，其死亡率尽人皆知且对目前的治疗手段缺乏响应性。不幸的是，近年来在治疗选择方面基本上没有改善，且在患有GBM的患者的存活预期方面改善甚微。因此，迫切需要针对脑癌例如神经胶质瘤的改进的治疗。
除了癌细胞本身以外，神经胶质瘤还发生在脑实质中由许多不同类型的细胞构成的复杂组织微环境中。肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)是存在的突出的基质细胞类型之一，通常占肿瘤组织中细胞的绝大部分。它们的来源不确定：这些TAM可能来源于小神经胶质、脑中居留巨噬细胞，或者它们可募集自外周。
TAM可以以组织特异性方式调节肿瘤的开始和进展：在一些情况中，它们似乎抑制癌症发生，但是在迄今为止的大部分研究中它们促进肿瘤进展。实际上，在其中存在巨噬细胞浸润增加的癌症的约80%中，升高的TAM水平与更具攻击性的疾病和差的患者预后相关。多项研究已经证实人神经胶质瘤还显示出TAM数量的显著增加，其与晚期肿瘤等级相关，TAM典型地是神经胶质瘤中的主要免疫细胞类型。然而，TAM在神经胶质瘤发生(gliomagenesis)中的功能仍然知之甚少，目前不了解靶向这些细胞是否代表有活力的治疗策略。实际上，在文献中已经报道了在一些情况中对肿瘤生长的相反作用，甚至其中类似的实验策略被用于在相同的正位神经胶质瘤植入模型中耗竭巨噬细胞。在一些研究中，TAM所产生的TNF-α或整联蛋白β3已经参与抑制神经胶质瘤生长，而在另一些报道中，已经提出CCL2和MT1-MMP是肿瘤发生和侵入的促进剂。
抑制CSF-1R信号发放代表了一种新的翻译相关性的方法，其已经被用在多种肿瘤学环境中，包括异种移植胫骨内骨肿瘤。然而，尚未证实它在脑肿瘤中有效。一些非脑癌癌症已经用影响与肿瘤细胞相关的或支持肿瘤细胞的各种细胞类型、而非直接靶向于肿瘤细胞自身的化合物靶向治疗。例如，据报道PLX3397共同抑制三种靶标(FMS、Kit和Flt3-ITD)并且减量调节各种细胞类型，包括巨噬细胞、小神经胶质、破骨细胞和肥大细胞。已经针对治疗霍奇金淋巴瘤对PLX3397进行了测试。然而，根据PLX3397文献，霍奇金淋巴瘤对各种化疗剂均具有良好响应，而脑肿瘤对化疗剂的耐药性高得多且尚未被成功治疗。正如本文所证实的那样，CSF-1R抑制剂对培养物中的成胶质细胞瘤细胞的增殖没有直接作用，它不减少所治疗的动物的肿瘤中巨嗜细胞的数量。因此，令人意外地是，也如本文所证实的那样，CSF-1R抑制剂能有效地在体内抑制脑肿瘤的生长，导致晚期GBM中肿瘤体积减小，甚至明显地根除一些成胶质细胞瘤。
本发明的实施方案的概述
本发明基于如下证明：脑肿瘤、特别是成胶质细胞瘤能用CSF-1R抑制剂治疗。认为本文所述的CSF-1R抑制剂的有效性归因于它们抑制TAM的某些活性(尽管似乎其不显著减少存在的TAM的数量)，并且还可能是所证实的这些化合物有效穿透具有脑肿瘤的个体的血脑屏障的能力的函数。这些方法为被诊断为脑肿瘤、特别是成胶质细胞瘤的患者提供了非常需要的新治疗选择。
集落刺激因子-1(CSF-1)也被称作巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，通过其受体CSF-1R(也称作c-FMS)信号发放，从而调节巨嗜细胞的分化、增殖、募集和存活。已经开发了小分子CSF-1R抑制剂，其与其它受体酪氨酸抑制剂一样通过在活性位点上竞争ATP结合来阻断受体磷酸化。本发明使用了强效选择性CSF-1R抑制剂，其能穿透血脑屏障(BBB)，从而阻断神经胶质瘤中的CSF-1R信号发放，如在神经胶质瘤发生的RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠模型中所阐释的那样。这种遗传改造的神经胶质瘤模型作为人GBM的模型用于临床前测试是理想的，因为它概括了免疫活性环境中人GBM的所有特征。由于它接近地模拟人GBM且特别是促神经形成(proneural)GBM，所以预计在该模型中的效力可转化成对人成胶质细胞瘤如多形性成胶质细胞瘤和混合性神经胶质瘤的临床效力。
可使用任何能穿透脑的CSF-1R抑制剂实施本发明。一些这样的化合物是在WO2007/121484中公开的6-O-取代的苯并
Figure BDA0000408243410000031
唑和苯并噻唑化合物，特别是该文献中式IIa和IIb的化合物，以及本文所公开的化合物。
在一个方面，本发明提供了在哺乳动物个体中治疗脑肿瘤的方法，其包含给所述个体施用有效量的式(I)的化合物：
Figure BDA0000408243410000041
其中R1是烷基吡唑或烷基甲酰胺；且
R2是羟基环烷基；
或其药学上可接受的盐。
该方法可用于治疗已经被诊断为脑肿瘤的患者、通常是人个体。本发明的另外的实施方案如下所述。
附图简要说明
图1A是显示在正常脑和成胶质细胞瘤组织中活的DAPI-阳性细胞的相对量的图，其是通过在肿瘤组织中CD45(全白细胞标记物(pan leukocytemarker))和CD11b(髓样细胞标记物)细胞染色阳性的增加比例来测量的。还显示了荧光活化细胞分选(FACS)数据。
图1B描绘了来自正常脑组织和来自IV级成胶质细胞瘤的CD68染色的脑细胞，并且显示了肿瘤组织中丰富的巨噬细胞浸润。参见实施例1。
图1C描绘了在相对于正常脑组织的GBM组织中，相对于持家基因遍在蛋白C(Ubc)而言CD68、CSF-1R和CSF-1的mRNA的增加水平。
图1D显示了相对于肿瘤细胞在TAM中CD11b、TVA、CSF-1和CSF-1R的相对量。
图2描绘了用BLZ945治疗同龄组小鼠后几个时间点在血浆中、在来自含有GBM的脑左半侧和来自无可见GBM的相同脑的右半侧的脑组织中BLZ945的量。
图3A显示了CSF-1刺激后在骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)中BLZ945对CSF-1R磷酸化的抑制作用。
图3B显示了未处理的BMDM细胞的群倍增速率，并且证明用67nMBLZ945处理细胞与在不存在CSF-1刺激的情况下对该速率具有相同影响。
图3C-3E显示了来自lnk4a/Arf-/-小鼠的BMDM细胞、CRL-2647正常小鼠脑细胞和两种小鼠GBM细胞培养物的增殖速率。
图3F显示了神经球(neurosphere)的总数和大小不受670nM的BLZ945影响。
图4A描绘了用单独的介质处理的或用介质+BLZ945处理的RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠的无症状存活率。参见实施例4。
图4B描绘了在26周研究终点时治疗的和未治疗的小鼠的肿瘤等级。所有对照小鼠都具有III或IV级肿瘤。
图5A显示了在用BLZ945治疗的前6天期间针对治疗的动物和对照动物提供MRI测量的肿瘤大小数据。
图5B显示了在开始用BLZ945给药后的前6天期间各对照小鼠(上图)和治疗的小鼠(下图)的肿瘤体积。
图5C和5D描绘了在开始时具有大肿瘤(体积>40mm3)的BLZ945-治疗的动物中通过MRI测量的肿瘤体积，并且显示即使具有大肿瘤，在几乎所有个体中肿瘤体积均减小。
图5-2显示了实施例5的对照组(5-2A)和治疗组(5-2B)中各动物的肿瘤体积数据，图5-2C显示了实施例5中用BLZ945治疗的大肿瘤个体的肿瘤大小数据。
图6:第一个图显示了实施例5中介质组、治疗组和‘大肿瘤’组中动物脑中Olig2+细胞的百分比。第二个图显示了通过溴脱氧尿苷(BrdU)标记测量的正活跃分裂的肿瘤细胞的分数。第三个图显示了通过裂解的胱天蛋白酶3(CC3)染色测量的肿瘤细胞中的细胞凋亡水平，并且证明BLZ945促进肿瘤细胞的细胞凋亡。
图7A显示了在实施例7中用于基因表达分析的细胞的FACS分离中所用的步骤。
图7B显示了治疗的和未治疗的动物的SVM基因特征，从其中鉴别出了被治疗增量调节和减量调节的基因。
图7C-7E显示了M2-相关基因和EGR2靶标的选择性增量调节。
图8A以图的方式描绘了用于对SVM基因特征中差别表达的基因进行分类的增量调节程度和统计学相关性。
图8B显示了5-基因Lasso回归特征。
图8C显示了TCGA数据组中促神经形成GBM肿瘤的Lasso基因特征预测。
图8D显示了合并数据组中促神经形成GBM肿瘤的Lasso基因特征预测。
图8E显示了TCGA数据组中促神经形成GBM肿瘤的SVM基因特征预测。
图8F显示了合并数据组中促神经形成GBM肿瘤的SVM基因特征预测。
图8G描绘了对于促神经形成GBM肿瘤、经典GBM肿瘤、间充质GBM肿瘤和神经GBM肿瘤而言BLZ945基因特征危害比，并且突显了所有数据中促神经形成GBM的统计学相关性。
详细描述
本发明提供了用于治疗脑肿瘤的式(I)的化合物和使用式(I)的化合物治疗脑肿瘤的方法。所述式(I)的化合物具有下面的结构式：
其中R1是烷基吡唑或烷基甲酰胺；且
R2是羟基环烷基；
并且包括该结构式的药学上可接受的盐和中性(neutral)化合物。
本发明范围内的具体化合物如下文进一步描述。
脑肿瘤的治疗可以包括抑制脑肿瘤的生长速率(减慢肿瘤生长)或逆转脑肿瘤生长(即减小肿瘤体积)或基本上消除肿瘤，这已经通过本文对具有这类肿瘤的小鼠进行治疗得到了证实。特定地，治疗可以减慢成胶质细胞瘤的进展或逆转成胶质细胞瘤的进展。其可以与其它治疗(包括切除脑肿瘤块)联合使用，并且可以用于减慢或逆转手术或活组织检查法切除脑肿瘤后残留肿瘤组织的再生长或减小其体积或质量。化合物也可以与其它化疗剂联合使用。
式(I)的化合物包括其中基团定义如下的化合物：R1是烷基-取代的吡唑或甲酰胺，例如式–C(O)NHR的C1-C4烷基吡唑或甲酰胺，其中R是C1-C4烷基。在优选的实施方案中，烷基是Me或Et。用于本发明的某些优选的化合物如下所述。在这些方法的一些实施方案中，R1是
Figure BDA0000408243410000071
其中R’是Me或Et。优选地，吡唑环连接在4位上，即：
在这些化合物中，R2可以是羟基环己基，例如为或2-羟基环戊-1-基。
特别优选的化合物包括下列化合物中的任意一种、或者这些化合物中任意两种或更多种的混合物、或者这些化合物中任意一种的药学上可接受的盐：
Figure BDA0000408243410000074
Figure BDA0000408243410000081
这些化合物和它们的药学上可接受的盐各自就本发明的目的而言是优选实施方案。这些化合物的优选实施方案还包括下面这些结构式的化合物：
Figure BDA0000408243410000091
其中R’是Me、Et或丙基，优选甲基。这些化合物的特定实施方案可以具有(R,R)绝对立体化学或(S,S)绝对立体化学。
基于这些化合物极为相似的理化性质，预计这些化合物显示出血脑屏障穿透性，如BLZ945，并且因此适合用在本发明的治疗方法中。
式(I)的化合物在本领域中是已知的，制备它们的方法公开在例如WO2007/121484中；它们在治疗神经胶质瘤中的有用性以及它们对血脑屏障的穿透性之前是不知道的。化合物(1c)对应于BLZ945，其在本文所述的体外和体内试验中被应用。
在环己基环上具有(1S,2S)立体化学的式(Ih)的化合物是新的。出乎预料地，这些化合物是PDGFRβ的良好抑制剂，同时还非常有效地抑制CSF-1R(参见本文的数据)。因此，下面结构式的新化合物是本发明的另一个方面：
Figure BDA0000408243410000101
其中R’是Me、Et或丙基，其提供了双重抑制剂作用，预计可在本文所公开的治疗方法中增加有效性。
所述化合物可以单独使用或者可以将它们配制成药物组合物，所述药物组合物还含有至少一种药学上可接受的赋形剂，且通常含有至少两种药学上可接受的赋形剂。应当理解的是，药学上可接受的赋形剂典型地是灭菌的。在本文中公开了一些适合的赋形剂；在一些实施方案中，将化合物配制成包含captisol、例如20%captisol的组合物。
在一些实施方案中，脑肿瘤选自脑转移灶(brain metastasis)、星形细胞瘤(包括成胶质细胞瘤)、少突神经胶质细胞瘤、室管膜瘤和混合性神经胶质瘤。在优选的实施方案中，脑肿瘤是神经胶质瘤，特别是多形性成胶质细胞瘤。在另一些实施方案中，脑肿瘤是脑转移灶，即，源自起源于体内其它部位的癌症的转移性肿瘤。
在一些实施方案中，患者是患有成胶质细胞瘤的患者。在特定的实施方案中，个体是被诊断为促神经形成成胶质细胞瘤的个体。参见Verhaak,等人,Cancer Cell17(1):98-110(2010)。这种亚型的成胶质细胞瘤倾向于发生在较为年轻的个体中，并且涉及TP53、IDH1和PDGFRA的突变。Verhaak等人报道了具有促神经形成成胶质细胞瘤的患者比其它亚型(经典成胶质细胞瘤、神经成胶质细胞瘤、间充质成胶质细胞瘤)对2010年使用的攻击性化疗的响应性更低，甚至提示这类治疗可能对这些患者而言是禁忌的。如本文所用的促神经形成GBM动物模型所证实的那样，本发明的方法治疗促神经形成成胶质细胞瘤尤其有效。发现在用BLZ945治疗的小鼠的TAM中发现的特异性遗传特征与具有比平均中位数存活时间更长的存活时间的人促神经形成成胶质细胞瘤患者的特异性遗传特征相匹配；当与具有其它亚型的成胶质细胞瘤的患者比较时，这种相关性没有出现。因此，遗传特征信息可用于选择用本文所述的CSF-1R抑制剂治疗的患者或用于评价接受这类治疗的个体的预后。
在一些实施方案中，所述方法用于在其它治疗方法例如切除肿瘤之前治疗个体。在另一些实施方案中，所述方法用于与其它治疗方法例如通过手术或活组织检查法切除肿瘤联合或者与放疗联合或者与肿瘤切除和放疗联合治疗个体。
任选地，其它化疗剂可以与上文所公开的化合物和方法一起使用。用于这些方法的适合的另外的化疗剂是本领域已知为用于治疗成胶质细胞瘤的常规化疗剂的那些。一些这类化疗剂包括抗血管生成剂、具有或不具有伊立替康的贝伐珠单抗、亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、铂例如顺式-铂(顺铂)、烷化剂例如替莫唑胺、酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、Ukrain和大麻素类。这些另外的治疗剂(共用治疗剂)可以与CSF-1R抑制剂同时使用，例如并行施用、将共用治疗剂与CSF-1R抑制剂混合，或者相继施用。一个优选的实施方案包括与替莫唑胺或铂化合物组合使用选自本文所公开的式I化合物(例如，式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、Ig或Ih)的化合物。
此外，巨噬细胞与乳癌的治疗响应降低和放疗后成胶质细胞瘤异种移植物中的血管再生成增加有关。由于这些巨噬细胞效应降低其它疗法的效力，所以可以预计抑制体内成胶质细胞瘤中巨噬细胞活性的本发明的化合物当与其它治疗剂或放疗组合使用时提供协同作用。
在一些实施方案中，本文所述的方法用式(Ic)化合物实施。在另一些实施方案中，所述方法可以用不是式(Ic)化合物的式(I)化合物、例如本文所公开的其它化合物种类来实施，。
在一些实施方案中，式(I)的化合物还抑制至少一种其它靶标，从而提供增强的抗肿瘤作用。例如，下式的这些化合物
Figure BDA0000408243410000111
Figure BDA0000408243410000121
在典型治疗剂量例如本文所述的那些所达到的浓度下也抑制PDGFR。因此，在需要双重作用机制的情况下可以使用这些化合物，并且这些化合物可以用在上文所述的方法中的任意方法中。
下面的表中包括了式Ig和Ih的举例性化合物以举例说明对CSF-1R和PDGFR的相对活性。许多这类化合物在本领域中是已知的，参见WO2007/066898，制备这些化合物的方法也是公知的。如下面的表中所示，无论环己基环上的立体化合物如何，式I的化合物均对CSF-1R具有非常好的活性。在各种异构体中，S,S异构体也对PDGFR-β以及CSF-1R具有高活性，因此可通过两种机制对神经胶质瘤起作用以提供增强的效力。
Figure BDA0000408243410000122
化合物 R’ 立体化学 CSF-1R IC-50(μM) PDGFR-βIC-50(μM)
Ig-A Me (1R,2R) 0.001 5.9
Ig-B Et (1R,2R) 0.006μM 13.9
Ig-C Pr (1R,2R) 0.008 7.7
Ig-D Me (1S,2S) 0.0008 0.048
Ig-E Me (1R,2S) 0.006 6.6
Ig-F Me (1S,2R) 0.001 0.78
Ih-A Me (1R,2R) 0.0009 0.74
Ih-B Et (1R,2R) 0.003 1.7
Ih-C Pr (1R,2R) 0.007 1.5
Ih-D Me (1S,2S) 0.001 0.02
Ih-E Me (1S,2R) 0.002 0.63
下面举出的实施方案是本发明的代表：
1.在哺乳动物个体中治疗脑肿瘤的方法，其包括给所述个体施用有效量的式(I)的化合物：
Figure BDA0000408243410000131
其中R1是烷基吡唑或烷基甲酰胺；且
R2是羟基环烷基；
或其药学上可接受的盐。
2.实施方案1的方法，其中R1是
Figure BDA0000408243410000132
其中R’是Me或Et。
3.实施方案1或2的方法，其中R2是
Figure BDA0000408243410000133
4.以上实施方案中任意一项的方法，其中所述脑肿瘤是神经胶质瘤，优选促神经形成成胶质细胞瘤。
5.实施方案4的方法，其中所述神经胶质瘤是多形性成胶质细胞瘤。
6.实施方案1-3中任意一项的方法，其中所述脑肿瘤是脑转移灶、星形细胞瘤(包括成胶质细胞瘤)、少突神经胶质细胞瘤、室管膜瘤或混合性神经胶质瘤。
7.以上实施方案中任意一项的方法，其中式(I)的化合物是
Figure BDA0000408243410000141
或其药学上可接受的盐；
或这些化合物之一的分离的立体异构体。
8.实施方案7的方法，其中式(I)的化合物是：
Figure BDA0000408243410000142
9.实施方案7的方法，其中式(I)的化合物是：
Figure BDA0000408243410000143
10.实施方案7的方法，其中式(I)的化合物是：
Figure BDA0000408243410000151
11.实施方案7的方法，其中式(I)的化合物是：
Figure BDA0000408243410000152
12.以上实施方案中任意一项的方法，其中所述方法进一步包括给所述个体施用有效量的另外的癌症治疗剂抗血管生成剂、具有或不具有伊立替康的贝伐珠单抗、亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、铂例如顺式-铂(顺铂)、烷化剂例如替莫唑胺、酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、Ukrain和大麻素类。
13.以上实施方案中任意一项的方法，其中式(I)的化合物被口服施用。
14.以上实施方案中任意一项的方法，其中给所述个体施用的式(I)的化合物的量为约50mg/kg/天－约500mg/kg/天，或5－500mg/kg或100－300mg/kg/天。
15.以上实施方案中任意一项的方法，其中所述个体具有促神经形成成胶质细胞瘤。
16.以上实施方案中任意一项的方法，其中所述个体是选择的个体，因为该个体具有升高的水平的PDGF或PDGFR信号发放。
17.以上实施方案中任意一项的方法，其中所述个体用PDGFR抑制剂同时治疗，或者用作为PDGFR抑制剂的具有次-纳摩尔(sub-nanomolar)活性的CSF-1R抑制剂、例如化合物(Id)或(If)治疗。
18.以上实施方案中任意一项的方法，其中所述个体是人。
19.用于治疗脑肿瘤的实施方案1的化合物。
20.实施方案19的化合物，其中所述脑肿瘤是成胶质细胞瘤。
21.实施方案20的化合物，其中所述成胶质细胞瘤是促神经形成成胶质细胞瘤。
22.实施方案20的化合物，其被配制用于与共用治疗剂一起使用。
23.下式的化合物：
其中R’是Me、Et或丙基。
24.实施方案23的化合物，其中R’是Me。
25.药物组合物，其包含实施方案23或24的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本文所用的术语“盐”是指本发明的化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别地包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指保留了本发明的化合物的生物学有效性和性质并且典型地在生物学上或其它方面不具有不希望的性质的盐。
药学上可接受的酸加成盐可以用无机酸和有机酸形成，例如，乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、chlortheophyllonate、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以自其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以自其衍生得到盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸和磺基水杨酸等。药学上可接受的碱加成盐可以使用无机碱和有机碱形成。
可以自其衍生得到盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表I－XII族的金属。在某些实施方案中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别适合的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
可以自其衍生得到盐的有机碱包括例如伯、仲和叔胺、被取代的胺(包括天然存在的被取代的胺)、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙基胺、苄星盐(benzathine)、胆碱酸盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法制备。一般而言，可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量的适宜的碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量的适宜的酸反应来制备这类盐。这类反应典型地在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中进行。一般而言，如果可行，则非水性介质例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的使用是合乎需要的。另外的适合的盐的列表可以例如在REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES,第20版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；以及Stahl和Wermuth的HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:PROPERTIES,SELECTION,AND USE(Wiley-VCH,Weinheim,德国,2002)中找到。
本文给出的任何结构式也代表化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。同位素标记的化合物具有本文所给出的结构式所描绘的结构，不同之处是一个或多个原子被具有所选择的原子质量或原子数的原子所代替。可被掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，分别例如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。在优选的实施方案中，本发明的化合物是未标记的，即对所有原子而言它们大致包含天然同位素丰度。在另一些实施方案中，本发明的化合物通过选择性掺入式(I)的化合物中一种原子的富集的非天然同位素而被标记。本发明包括各种同位素标记的本文所定义的化合物，例如，其中掺入了放射性同位素例如3H和14C的那些，或者其中掺入了非放射性同位素例如2H和13C的那些。这类同位素标记的化合物可用于代谢研究(使用14C)、反应动力学研究(使用例如2H或3H)、检测或成象技术如正电子发射断层成象术(PET)或单光子发射计算机断层成象术(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定法，或者可用于患者的放疗中。特定地，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究而言是特别合乎需要的。同位素标记的式(I)化合物通常可参照式I化合物的合成描述(例如在美国专利申请No.2008/0045528(WO2007/121484)中所述的合成描述)通过本领域技术人员已知的常规技术来制备。在该文献中描述了BLZ945以及其异构体中的几种。该文献中的实施例173和174描述了使用1R,2R-氨基环己醇合成吡唑化合物(Ie)，并且可以适用于合成标记的和未标记的式I的其它吡唑化合物。相同公开物在第163页上描述了1R,2R-和1S,2S-氨基环己醇的合成，其可以容易地被置换入实施例173的方法，从而得到标记的和未标记的(If)和式I的其它化合物。
此外，被更重的同位素、特别是氘(即2H或D)取代可因更大的代谢稳定性而提供某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求或治疗指数的改善。应当理解的是，在本文的上下文中氘被视为式(I)化合物的取代基。这类更重的同位素、特别是氘的浓度可以用同位素富集因子来定义。本文所用的术语“同位素富集因子”意指给定的同位素的同位素丰度与天然丰度之间的比。如果本发明的化合物上的取代基是所示的氘，则这类化合物对每个指定的氘原子而言具有至少3500(在每个指定的氘原子上52.5%氘掺入)、至少4000(60%氘掺入)、至少4500(67.5%氘掺入)、至少5000(75%氘掺入)、至少5500(82.5%氘掺入)、至少6000(90%氘掺入)、至少6333.3(95%氘掺入)、至少6466.7(97%氘掺入)、至少6600(99%氘掺入)或至少6633.3(99.5%氘掺入)的同位素富集因子。
如本领域技术人员已知的那样，本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”包括任意和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂(isotonic agent)、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等以及它们的组合(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则其在治疗或药物组合物中的应用将被考虑。
术语本发明的化合物的“治疗有效量”是指将引起个体的生物学或医药响应的本发明化合物的量，所述响应例如是降低或抑制酶或蛋白质活性，或者改善症状、缓解病症、减慢或延迟疾病进展，或者预防疾病等。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”是指当施用于个体时有效地(1)至少部分缓解、抑制、预防和/或改善(i)由CSF-1R介导的或(ii)与CSF-1R活性相关的或(iii)以CSF-1R的(正常的或异常的)活性为特征的病症或障碍或疾病、或者(2)降低或抑制CSF-1R活性、或者(3)减少或抑制CSF-1R表达的本发明的化合物的量。在另一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”是指当施用于细胞或组织或非细胞生物学材料或培养基时有效地至少部分降低或抑制CSF-1R活性、或者至少部分减少或抑制CSF-1R表达的本发明的化合物的量。上面的实施方案中针对CSF-1R举例说明的术语“治疗有效量”的含义也同样适用于任意其它相关蛋白质/肽/酶，例如PDGFR等。
本文所用的术语“个体”是指动物。典型地，所述动物是哺乳动物。个体还指例如灵长类动物(例如，人，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述个体是灵长类动物。在另一些实施方案中，所述个体是人。
本文所用的术语“抑制”是指减轻或抑制给定的病症、症状、或障碍、或疾病，或者显著减少生物学活性或过程的基线活性。
本文所用的术语“治疗”任何疾病或障碍或者任何疾病或障碍的“治疗”在一个实施方案中是指改善所述疾病或障碍(即，减慢或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”是指缓解或改善至少一种物理参数，包括可能不是患者可辨别的那些物理参数。在又一个实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或者这两个方面对所述疾病或障碍进行调节。在又一个实施方案中，“治疗”是指预防或延迟所述疾病或障碍的发作或发生或进展。在涉及脑肿瘤时，‘治疗’典型地包括减慢肿瘤的生长速率或切除肿瘤块后肿瘤再生长的速率，或者减小肿瘤的大小或切除肿瘤块后肿瘤残留部分的大小。
如本文所用的那样，如果个体会在生物学上、医学上或生活质量方面从这类治疗中获益，那么该个体是“需要”治疗的。典型地，个体已经被诊断为脑肿瘤，常常是成胶质细胞瘤的形式，优选已经被诊断为多形性成胶质细胞瘤。
除非本文另有说明或者上下文清楚地有相反含义，否则本文所用的术语“一个”、“一种”、“该/所述”以及本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)所使用的类似术语应理解为既包括单数，又包括复数。
除非本文另有说明或者上下文清楚地有相反含义，否则本文所述的所有方法可以以任意适合的顺序进行。本文提供的任意和所有实施例或举例性语言(例如，“例如”、“如”)的使用仅仅旨在更好地举例说明本发明，不对在另外部分请求保护的本发明的范围构成限制。
在一些实施方案中，本发明使用药物组合物，其包含本发明的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物可被配制用于特定的施用途径如口服施用、肠胃外施用和直肠施用等。另外，本发明的药物组合物可被配制成固体形式(包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、散剂或栓剂)或液体形式(包括但不限于溶液、混悬剂或乳剂)。所述药物组合物可经受常规药学操作如灭菌和/或可含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂以及辅剂(adjuvant)如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂和缓冲剂等。
在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的至少一种另外的化疗剂，例如替莫唑胺。
典型地，药物组合物是片剂或明胶胶囊剂，其包含活性成分以及至少一种赋形剂，例如captisol(其在本文的实施例中被使用)下列成分之一：
a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；
b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；对于片剂而言，还有
c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还有
d)载体，例如含有共溶剂化物质例如captisol、PEG、甘油、环糊精等的水性介质；
e)崩解剂，例如淀粉类物质、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物；和/或
f)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。
可以按照本领域已知的方法给片剂包薄膜衣或肠溶衣。
优选地，所述化合物或组合物被制备用于口服施用，例如制备成片剂或胶囊剂，或者制备成式(I)化合物的溶液或混悬剂，其任选地被包装在单剂量容器例如胶囊中。
用于口服施用的适合的组合物包括片剂、锭剂(lozenge)、水性或油性混悬剂、可分散的散剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、或糖浆剂或酏剂形式的有效量的本发明的化合物。用于口服使用的组合物是按照本领域已知的用于制备药物组合物的任意方法制备的，这类组合物可含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的物质以便提供药学上美观的和口味佳的制剂。片剂可以含有活性成分以及与其混合的适合用于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂有例如：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂是无包衣的或者用已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并且从而在较长的一段时间中提供持续的作用。例如，可使用延时材料如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用于口服使用的制剂可以是其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊或者其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊的形式。
在一些实施方案中，所述化合物或组合物被制备用于通过注射施用。某些可注射的组合物是等张的水性溶液或混悬液，栓剂有利地是由脂肪乳或混悬剂制备的。所述组合物可以被灭菌和/或含有辅剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别按照常规的混合、造粒或包衣方法制备，含有约0.1-75%或含有约1-50%活性成分。
在一些实施方案中，所述化合物或组合物被制备用于局部施用。用于透皮应用的适合的组合物包含有效量的本发明的化合物和适合的载体。适合用于透皮递送的载体包括帮助通过接受主体皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮装置是绷带的形式，其包括背衬层、含有化合物并任选含有载体的贮库，任选地包括在延长的一段时间中将化合物以控制的和预定的速度递送至接受主体皮肤的控速屏障，以及将该装置固定于皮肤的器具。
用于局部应用、例如局部应用于皮肤和眼的适合的组合物包括水溶液、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂或可喷雾制剂例如用于通过气雾剂递送的可喷雾制剂等。这类局部递送系统将特别适宜用于皮肤应用，例如用于治疗皮肤癌，例如以防晒霜、洗剂、喷雾剂等形式用于预防用途。因此它们特别适合用在本领域公知的局部制剂(包括美容制剂)中。这类局部制剂可含有增溶剂、稳定剂、张力促进剂(tonicity enhancing agent)、缓冲剂和防腐剂。
本文所用的局部应用还可以涉及吸入或鼻内应用。它们可以方便地以干粉形式(单独的药物，混合物的形式，例如具有乳糖的干掺合物，或混合的组分颗粒，例如具有磷脂的混合的组分颗粒)从干粉吸入器中被递送或以气雾剂喷雾形式从加压的容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器中被递送，使用或不使用抛射剂。
在一些实施方案中，式(I)化合物的有效量为约10mg/kg/天－约500mg/kg/天。在特定的实施方案中，有效量为约25mg/kg/天－约300mg/kg/天，例如约100－约250mg/kg/天。该剂量可以每天分1-4剂被施用，或者其可以隔天被施用。在一个优选的实施方案中，该剂量为约200mg/kg/天，并且每天分1或2剂口服施用。
本发明还提供了包含本发明的化合物作为活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以帮助某些化合物降解。
本发明的无水药物组合物和剂型可用无水或含有低水分含量的成分和低水分或低湿度条件来制备。可以制备和储存无水药物组合物以便维持其无水性质。因此，可以用已知防止与水接触的材料来对无水组合物进行包装，以便它们能被包括在适合的制剂盒中。适合的包装的实例包括但不限于气密性密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装和窄条(strip)包装。
本发明还提供了包含一种或多种降低作为活性成分的本发明的化合物分解速度的物质的药物组合物和剂型。这类物质在本文中也称为“稳定剂”，其包括但不限于抗氧化剂如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。
基于它们被证明的穿透血脑屏障和抑制TAM在脑肿瘤内和/或周围蓄积的能力，本文所述的化合物和方法可用于治疗各种脑肿瘤。在一些实施方案中，所述脑肿瘤是起源于体内其它部位的癌症的转移灶。在另一些实施中，所述脑肿瘤是神经胶质瘤，例如多形性成胶质细胞瘤。
游离形式或盐形式的式I化合物显示出有价值的药理学性质，例如CSF-1R和任选的PDGFR调节性质，例如，如在下面的部分中提供的体外和体内试验中所证实的那样，并且因此适用于疗法。
因此，作为另一个实施方案，本发明提供了式(I)的化合物的用途或在疗法中的应用。在另一个实施方案中，所述疗法选自能通过抑制CSF-1R被治疗的疾病。在另一个实施方案中，所述疾病选自上述列表、适合地选自任意脑肿瘤，更适合地是成胶质细胞瘤，例如多形性成胶质细胞瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗通过抑制CSF-1R被治疗的疾病的方法，其包括施用治疗上可接受的量的本文所公开的式(I)化合物或这些化合物的实施方案中的任意一个。在另一个实施方案中，所述疾病选自上述列表，适合地选自任意脑肿瘤，例如神经胶质瘤之一，特别包括多形性成胶质细胞瘤。
对于约50-70kg的个体，本发明的药物组合物或组合产品可以是约1-1000mg一种或多种活性成分的单位剂量，或者约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg活性成分。化合物、药物组合物或其组合的治疗有效剂量取决于个体的种属、体重、年龄和个体情况、待治疗的障碍或疾病或其严重程度。普通技术的医师、临床医师或兽医根据本申请的公开内容能容易地确定治疗所述障碍或疾病或抑制所述障碍或疾病进展所需的各活性成分的有效量。
上述剂量性质可有利地使用哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗、猴或离体的器官、组织和其制备物在体外和体内证明。本发明的化合物可以以溶液(例如水溶液)的形式体外应用和例如以混悬剂或以水溶液的形式肠内、肠胃外(有利地，静脉内)体内应用。体外剂量可以为约10-3摩尔浓度至10-9摩尔浓度。根据施用途径，体内治疗有效量可以为约0.1-500mg/kg、典型地为10-400mg/kg、或约100-300mg/kg、或1-100mg/kg。在一些实施方案中，约200mg/kg的剂量适合用于治疗成胶质细胞瘤，并且可以口服施用。
本发明的化合物的活性可以通过下面的体外和体内方法来评价。
使用US20080045528中所述的测定方法，可以证实本发明的化合物抑制CSF-1R。如本文所述，这些化合物很容易地跨过血脑屏障，并且还抑制或逆转脑中肿瘤的生长。优选地，肿瘤可通过已知方法检测，治疗进程可通过已知方法监测。在一些实施方案中，通过使用MRI(磁共振成像)监测治疗进程以确定肿瘤和任何转移灶的大小。
本发明的化合物可以与一种或多种另外的治疗剂(例如本文所述的共用治疗剂)同时施用或在其之前或之后施用。本发明的化合物可以与另外的活性剂通过相同或不同的施用途径分别施用或者与另外的活性剂在同一药物组合物中一起施用。
在一个实施方案中，本发明提供了一种产品，其包含式(I)的化合物和至少一种另外的治疗剂，其是组合制剂的形式，用于在治疗中同时、分别或相继使用。在一个实施方案中，所述治疗是由CSF-1R的抑制介导的疾病或病症的治疗。以组合制剂的形式提供的产品包括在同一药物组合物中一起包含式(I)的化合物和一种或多种另外的治疗剂的组合物或者分开的形式、例如药盒形式的式(I)的化合物和一种或多种另外的治疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含式(I)的化合物和一种或多种另外的治疗剂。任选地，所述药物组合物可以包含上文所述的药学上可接受的赋形剂或超过一种的所述共用治疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种药盒，其包含两种或更多种分开的药物组合物，其中至少一种药物组合物含有式(I)的化合物。在一个实施方案中，该药盒包含分别盛装所述组合物的器具，例如容器、分开的瓶或分开的箔袋。这类药盒的实例有泡罩包装，其典型地用于包装片剂、胶囊剂等。
本发明的药盒可用于施用不同的剂型，例如口服和肠胃外剂型，用于以不同的给药间隔施用分开的组合物，或者用于针对彼此逐步增加分开的组合物的剂量。为了有助于依从性，本发明的药盒典型地包含施用说明书。
在本发明的组合治疗中，本发明的化合物和另外的治疗剂可以由相同或不同的制造商制备和/或配制。此外，本发明的化合物和另外的治疗剂可以(i)在将组合产品发放给医师之前(例如，在包含本发明的化合物和另外的治疗剂的药盒的情况下)、(ii)在施用前即刻由医师本身(或在医师指导下)、(iii)由患者本身、例如在相继施用本发明的化合物和另外的治疗剂期间被一起用于组合治疗。
因此，本发明提供了式(I)的化合物用于治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的用途，其中药剂被制备用于与另外的治疗剂(包括本文公开的适合用于与式I化合物组合的另外的化疗剂之一)一起施用。本发明还提供了另外的治疗剂用于治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的用途，其中药剂被与式(I)的化合物一起施用。
本发明还提供了用在治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的方法中的式(I)的化合物，其中所述式(I)的化合物被制备用于与另一种治疗剂一起施用。本发明还提供了用在治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的方法中的另外的治疗剂，其中所述另外的治疗剂被制备用于与式(I)的化合物一起施用。本发明还提供了用在治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的方法中的式(I)的化合物，其中所述式(I)的化合物与另外的治疗剂一起施用。本发明还提供了用在治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的方法中的另外的治疗剂，其中所述另外的治疗剂与式(I)的化合物一起施用。
本发明还提供了式(I)的化合物用于治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的用途，其中患者之前(例如在24小时内)已经用另外的治疗剂治疗。本发明还提供了另外的治疗剂用于治疗由CSF-1R介导的疾病或病症的用途，其中患者之前(例如在24小时内)已经用式(I)的化合物治疗。
在一个实施方案中，所述的另外的治疗剂选自抗血管生成剂、具有或不具有伊立替康的贝伐珠单抗、亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、铂例如顺式-铂(顺铂)、烷化剂例如替莫唑胺、酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、Ukrain和大麻素类。在一些实施方案中，所述的另外的活性剂是共用治疗剂，其选自：抗血管生成化合物、大麻素类和替莫唑胺。
可以提供特定治疗的特定的各组合产品包括化合物Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、1g或1h与替莫唑胺的组合产品。该组合产品可以如本文所述口服施用，以治疗各种脑肿瘤，例如多形性成胶质细胞瘤。
除了治疗方法、化合物和药物组合物以外，还已经鉴定了与CSF-1R化合物在治疗GBM中的效力相关的某些基因特征改变。下面的实施例提供了有关这些改变的信息并且鉴定了能与本文所公开的治疗方法联合使用的基因特征或生物标记物。正如本领域技术人员显而易见的，通过获得来自患者的样品并且比较该样品的基因表达数据与和积极的预后和/或延长的存活相关的本文所公开的基因表达改变和特征，本文提供的Lasso特征和SVM特征数据可用于确定使用这些方法治疗的患者的预后。
实施例
根据本领域已知的方法、特别是WO2007/121484中描述的方法制备了本发明的化合物。
通过使用带有2695分离模块的Waters Millenium色谱系统(Milford,MA)的高效液相色谱法(HPLC)表征了化合物和/或中间体。分析柱是反相Phenomenex Luna C18-5　,4.6×50mm，来自Alltech(Deerfield,IL)。使用梯度洗脱(流速2.5mL/min)，典型地从5%乙腈/95%水开始，历经10分钟的时间进行至100%乙腈。所有溶剂均含有0.1%三氟乙酸(TFA)。化合物是在220或254nm下根据紫外光(UV)吸收进行检测的。HPLC溶剂来自Burdick and Jackson(Muskegan,MI)或Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)。
在两种LCMS仪器之一上进行了质谱分析：Waters System(AllianceHT HPLC和Micromass ZQ质谱仪；柱：Eclipse XDB-C18,2.1×50mm；梯度：含有0.05%TFA的5-95%(或35-95%、或65-95%或95-95%)乙腈的水溶液，历经4分钟的时间；流速0.8mL/min；分子量范围200-1500；锥形电压20V；柱温40℃)；或者Hewlett Packard System(Series1100HPLC；柱：Eclipse XDB-C18,2.1×50mm；梯度：含有0.05%TFA的5-95%乙腈的水溶液，历经4分钟的时间；流速0.8mL/min；分子量范围150-850；锥形电压50V；柱温30℃)。所有质量均以质子化母离子的质量进行报告。
化合物(If)的分析数据：HPLC保留时间1.93min。分子离子(MH+):m/z=422.1(LC/MS RT=0.50min)。
实施例1：与正常脑相比，巨噬细胞数量在神经胶质瘤发生小鼠模型中增 加
本实施例证实肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)对RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠模型中神经胶质瘤发生的贡献。在这些小鼠中，当在成年小鼠中诱导肿瘤发生时，发生的大部分损害是高等级的多形性成胶质细胞瘤(GBM)，其在组织学上模拟人GBM。图1.(A)将来自未注射的巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠的大脑/前脑(正常脑)或来自有症状的RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-(PDG)小鼠的IV级肿瘤(GBM)的大脑/前脑用木瓜蛋白酶处理成单细胞混悬液，用于流式细胞术(各自n=5)。CD45+白细胞显著地从3.6±0.6%增加至13.1±2.0%。CD11b+髓样细胞/巨噬细胞占白细胞的压倒性多数(CD45+细胞的89.9-98.5%)，其中肿瘤中的CD45+CD11b+细胞(12.7±2.0%)比正常脑中(3.3±0.5%)增加3.8-倍，并且在CD45+CD11b-细胞群方面无差异。(B)将正常脑或来自有症状PDG小鼠的GBM组织切片针对CSF-1R、CD68(巨噬细胞)和DAPI进行免疫荧光共染色。(C)将正常脑和GBM肿瘤(各自n=3)用于RNA分离、cDNA合成和qPCR。测定法是一式三份地进行的，对每个样品针对遍在蛋白C(Ubc)将表达归一化。相对于正常脑描绘表达。(D)将来自正常脑或有症状PDG小鼠的GBM组织切片针对CSF-1R与巨噬细胞标记物F4/80和CD11b的组合以及F4/80、CD11b和CD68与Iba-1(巨噬细胞/小神经胶质细胞)的组合进行染色。将DAPI用于核复染色。比例尺条50μm。数据以平均值+SEM的形式给出。使用未配对双尾Student t-检验得到了P值；*P<0.05；**P<0.01。
巨噬细胞的数量在GBM组织中大大高于正常脑，如通过用巨噬细胞-特异性抗体CD68染色所证实的那样(图1B)。这一结果通过流式细胞术分析被确证，其中肿瘤相关性白细胞(CD45+)占肿瘤质量的13.1%，并且大部分是巨噬细胞(CD11b+)(图1A)。与GBM相比正常脑的表达分析揭示出CSF-1和CSF-1R的mRNA水平以及CD68在肿瘤中增加(图1C)。
不同细胞类型特异性群体也来自GBM，以确定CSF-1及其受体的来源。根据TVA受体仅在肿瘤细胞部分中表达和CD11b仅在TAM中表达确证了不同群体的纯度。尽管肿瘤细胞和TAM二者均表达CSF-1，但是CSF-1R仅被TAM表达(图1D)。在图1D中的3个柱中的各组的第一个柱是混合细胞，第二个柱是FACS-纯化的肿瘤细胞，第三个柱是FACS-纯化的TAM；将混合细胞设定为1以便对数据进行归一化。这些图显示在肿瘤细胞中无CD11b表达且在肿瘤细胞中无CSF-1R表达，而TVA仅染色肿瘤细胞，不染色TAM，并且CSF-1以大约相等的量存在于肿瘤和TAM细胞这二者中。这些观察结果通过免疫染色被确证，所有CSF-1R+细胞对CD68而言均是阳性的(未显示)。这证明在该模型中CSF-1R抑制后对肿瘤发生(tumorigenesis)的任何作用都是巨噬细胞依赖性的。
实施例2：CSF-1R抑制剂BLZ945的分析：药动学和基于细胞的测定法
BLZ945(化合物Ic)已经作为选择性c-fms(CSF-1R)激酶抑制剂被公开，用于抑制骨中肿瘤诱导的溶骨性病损。BLZ945是ATP竞争性抑制剂，其在生物活性测定法中在1nM下抑制CSF-1R，并且以约67nM的IC-50抑制CSF-依赖性细胞增殖。通过比较，大部分所测试的>200混杂激酶的IC50值>10μM(10,000nM)，且对于cKIT和PDGFRβ，IC-50分别为3.5μM(3500nM)和5.9μM(5900nM)。当针对
Figure BDA0000408243410000291
激酶阵列中几百种激酶筛选时，该化合物仅对CSF-1R、PDGFRα和PDGFRβ显示出低于对照组的50%的活性，对两种PDGFR的活性远低于其在直接抑制测定法中对CSF-1R的活性。如本文所讨论的那样，诸如BLZ945、但具有(S,S)立体化学的化合物以其对CSF-1R的活性的高水平类似的水平显示出对PDGFRβ的活性。
用BLZ945治疗仅在其脑的右半侧中可检测到GBM的小鼠，然后在不同时间点(15分钟、2小时、8小时、24小时)测量化合物在血浆中和在脑的右半侧和左半侧中的浓度。如图2所显示的那样，血浆浓度迅速升高至略微超过100uM并且在8小时时保持在50uM以上，然后截至到24小时降至低水平。脑组织中的浓度遵循类似的模式：它保持略低于血浆水平，但是在15分钟和2小时的时间点升高至远高于50uM。这表明BLZ945通过了血脑屏障(BBB)，并且浓度足以抑制巨噬细胞生长和/或能在脑中实现存留。还表明化合物以类似水平穿透到含肿瘤的和无肿瘤的半侧脑中，这说明穿透可能不依赖于由于肿瘤的存在导致的BBB中的病损。这表明其足够快速地穿透血脑屏障以在脑中提供治疗有效的药物水平，所述水平远高于有效抑制培养物中巨噬细胞所需的水平。
实施例3：BLZ945在体外对不同细胞类型的抑制活性
如文献中之前描述的那样分离和分化骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)，然后用67nM BLZ945处理。BLZ945导致在各时间点(1.5分钟、3分钟、5分钟)CSF-1刺激后CSF-1R磷酸化的明显抑制(图3A)。
还检验了BLZ945对巨噬细胞的作用：从67nM到6700nM范围的剂量显著地阻断了巨噬细胞的存活，与CSF-1撤消的作用相当(图3B)。
还在存在或不存在BLZ945的情况下测试了来自Ink4a/Arf裸鼠(GBM模型的遗传背景)的BMDM。图3C显示象来自野生型小鼠的那些一样，这些BMDM基本上被67nM和更高浓度的BLZ945抑制(图3D)。因此，BLZ945是CSF-1R信号发放的有效抑制剂，其导致巨噬细胞存活的完全阻断。图3C-3E显示来自lnk4a/Arf-/-小鼠的BMDM细胞增殖在67nM和更高的BLZ945浓度下被强烈抑制，CRL-2467细胞(正常小鼠脑)也是如此，而甚至在6700nM下，它对4种小鼠和1种人成胶质细胞瘤细胞培养物的增殖几乎没有或没有作用。
为了确定BLZ945对肿瘤细胞缺乏直接作用，以发现对抗巨噬细胞生长有效的浓度类似的浓度用BLZ945处理人神经胶质瘤细胞系和一系列原代肿瘤细胞和神经球。在与上述相同的剂量下，用BLZ945处理不影响已经在培养物和在体内证实依赖于PDGFR信号发放的来源于人GBM的U87-MG细胞(图3E)。类似地，用BLZ945处理不改变由原代神经球(来源于小鼠RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-GBM)的二代神经球的形成(图3F)。神经球的数量和大小均不被BLZ945显著影响。最后，检验了BLZ945对由二代小鼠GBM神经球建立的多种肿瘤细胞系的作用，并且再次证明没有差异(图3F)。总的而言，这些实验证实BLZ945对CSF-1R的抑制作用对巨噬细胞是特异性的，对肿瘤细胞没有可辨别的直接结果。
实施例4：用CSF-1R抑制剂BLZ945进行治疗阻断神经胶质瘤进展
由于在基于巨噬细胞的测定法中BLZ945的强抑制作用以及经证明的其跨越血脑屏障的能力，显然需要在临床前试验中用RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-模型测试该抑制剂。如所述的那样(Hambardzumyan等人,Transl.Oncol.,vol.2,89-95(2009)，给这些遗传改造的小鼠在5-6周龄时注射RCAS-PDGF-B-HA病毒-感染的DF-1细胞以引发神经胶质瘤形成。在肿瘤引发后2.5周时，通过口服管饲法每天给小鼠同龄组施用200mg/kg在20%captisol中的BLZ945或作为对照的介质(20%captisol)。随后评价小鼠的无症状存活。用介质处理的同龄组的平均存活时间为5.71周(40天)，而用BLZ945处理的同龄组中64.4%在注射后26周的试验终点时仍然存活(31-32周龄)(图4A,P<0.0001)。选择该终点是因为Ink4a/Arf-/-背景中的小鼠在30周龄左右开始出现自发性肿瘤，大部分是淋巴瘤和肉瘤，这使得更长时间的研究的神经胶质瘤表型的解释变得复杂。图4A中的数据显示对照小鼠(仅给予介质)在截止到病毒注射后8周时没有一只小鼠无症状，而经治疗的小鼠在26周的终点时超过一半无症状。注意：在12周时处死4只经治疗的小鼠用于组织学研究。其中，3只无肿瘤，1只具有II级神经胶质瘤。
确定两个同龄组小鼠中小鼠的肿瘤等级(参见图4B)。所有用介质处理的小鼠在最终阶段均具有高等级肿瘤，其中14只小鼠中有13只小鼠具有IV级GBM病损。相反，用BLZ945治疗的动物具有显著更少的恶性肿瘤：80%是II级肿瘤或无肿瘤；其余20%具有III级肿瘤。在26周试验终点时存活的56%的小鼠中，没有可检测到的病损(图4B)。在试验期间用BLZ945治疗的小鼠中有5只小鼠因有症状而被处死(n=5)，并且将其与试验结束时被处死时仍然无症状的组(n=9)比较。在两个组中，与用介质处理的动物相比，肿瘤等级仍然有显著降低。这表明在该长期用BLZ945治疗的试验中，存活明显增加且肿瘤恶性病明显减少。
实施例5：监测BLZ945对肿瘤生长的作用的MRI成像
通过定期MRI扫描以测量当肿瘤生长正常快速时短期治疗期间的肿瘤大小改变来监测在肿瘤诱导的小鼠中进行的BLZ945短期7天试验。通过MRI测定RCAS-PDGF-B-HA/巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠的肿瘤体积，当其为至少4.5mm3或更大时将小鼠加入到试验中。如上所述用BLZ945或介质对照治疗小鼠7天。在开始治疗前一天、在治疗中点和试验期结束前一天进行MRI扫描。在该短期试验过程中，用介质治疗的小鼠显示出肿瘤体积进行性地明显增加，如图5A中所示，平均肿瘤体积增加约5-倍。如通过MRI所测定的那样，BLZ945治疗阻断了肿瘤进展(图5A)，在所述相同的短期过程中肿瘤大小不增加。被治疗的个体(下部的线)显示几乎没有或没有肿瘤增大，而在用介质治疗的同龄组中肿瘤体积急剧增加。图5B显示了在开始用BLZ945给药后前6天期间各对照组小鼠(上部的图)和治疗的小鼠(下部的图)的肿瘤体积。几乎所有用BLZ945治疗的动物均显示几乎没有或没有肿瘤大小的增加，而所有对照组动物均显示出肿瘤体积的大的增加。
如图5B所示，在该时间期间未治疗的肿瘤体积增加了约150-850%，而在11只治疗的动物中有7只动物的肿瘤大小减小，仅有2只治疗的动物肿瘤体积增加超过了50%。图5-2A和5-2B描绘了所有11只试验和对照动物的肿瘤体积数据，其显示治疗大幅度地阻止了肿瘤大小的增加，而未治疗的肿瘤在6-天治疗中明显生长。这些结果表明CSF-1R信号发放和推定的CSF-1R-依赖性巨噬细胞的贡献对这种小鼠模型中的神经胶质瘤进展是关键性的，且BLZ945能在针对人成胶质细胞瘤的高度相关的哺乳动物模型中预防脑肿瘤生长。
在用相同GBM模型进行的第二个对较大肿瘤的体内试验中(“大肿瘤”同龄组)，用BLZ945治疗具有48.7－132mm3肿瘤体积的小鼠，历经6天的跨度通过MRI监测肿瘤体积改变。在几乎所有测试动物中，肿瘤体积实际上都下降了，在18只治疗的小鼠中有6只肿瘤大小减小了至少30%(图5D和5-2C)。在本试验中不包括对照动物，因为已经预计到它们不会存活至终点。
实施例6：用BLZ945治疗的肿瘤中癌症标志能力(hallmark capability)分 析
鉴定CSF-1R抑制对神经胶质瘤发生的引人注目的作用导致我们研究了这种响应的潜在机制并且确定了BLZ945治疗如何影响癌症的几种标志能力。对来自短期试验的组织进行分析(参见实施例5)，以便能在相同的既定的终点比较来自不同治疗组的肿瘤。使用之前已经被用于鉴定神经胶质瘤细胞的少突神经胶质细胞标记物Olig2检验肿瘤细胞密度。与介质对照相比，在BLZ945治疗组中Olig2显著减少，这表明BLZ945显著地减少了肿瘤细胞的数量(图6A)。
如通过溴脱氧尿苷(BrdU)掺入所测定的那样，分析正在增殖的Olig2+细胞的比例揭示出在BLZ945组中其显著减少(图6B)。而且，BLZ945显著地减少了肿瘤细胞的增殖。
还评价了这些细胞中的细胞凋亡水平。将凋亡的细胞计数为具有胞质裂解的胱天蛋白酶-3(CC3)+染色和固聚的(condensed)细胞核的那些。如图6C所示，CSF-1R抑制剂治疗特别是在较早的时间点导致细胞凋亡增加，不过在第7天的大肿瘤同龄组中几乎未观察到染色。
下面的表概述了用来自实施例5的样品进行的组织学分析：
表1.组织学分析
Figure BDA0000408243410000331
肿瘤体积改变是相对于与第1天终点时的体积(第6天)，所报告的改变是相对于对照(介质)组而言的。
这些分析加在一起表明，抑制CSF-1R信号发放通过对减少肿瘤细胞增殖和增加细胞死亡的组合作用有效地阻断了神经胶质瘤的生长和恶性。
概括而言，这些数据证明CSF-1R抑制剂BLZ945是强效的新疗法，其在极具攻击性的小鼠神经胶质瘤模型中阻断了肿瘤进展。该化合物在神经胶质瘤发生的临床前小鼠模型中明显地促进了存活，并且急剧地降低了肿瘤生长速率，还在短和较长期的试验期过程中减小了肿瘤大小。在长期试验中，BLZ945显然在显著量的小鼠中消除了可见的肿瘤，并且急剧地降低了大部分被治疗的小鼠的肿瘤等级。
由于已经证实增加的巨噬细胞浸润与人神经胶质瘤的恶性相关，所以BLZ945在该小鼠模型中的效力显然归因于在具有GBM的个体中对TAM的治疗靶向，预计在包括人在内的哺乳动物中可转化成对抗成胶质细胞瘤的效力。由于包括巨噬细胞在内的髓样细胞与乳癌模型中钝化化疗响应和在GBM异种移植物模型中增强放疗后的适应反应有关，所以这种和类似的CSF-1R抑制剂与定向对抗神经胶质瘤中癌细胞的疗法组合可能是有效的—一种值得进一步研究的可能。特定地，化合物例如
Figure BDA0000408243410000341
在类似的浓度下具有靶向CSF-1R和PDGFR的能力，因此可以比BLZ945甚至更有效。实际上，化合物(Id)抑制PDGFR，其抑制PDGFR的IC50比其对CSF-1R的IC50高仅约4倍。因此，预计治疗有效浓度的这些化合物之一影响这两种靶标位点，并且显示出对神经胶质瘤的协同作用活性。
实施例7
为了研究用BLZ945-治疗的TAM能在体内引起这类引人注目的抗肿瘤响应的分子机制，尽管缺乏TAM的明显耗竭或任何对人GBM细胞的直接抗增殖作用，但从用介质或BLZ945治疗的小鼠中分离了CD11b+Gr-1-TAM并且进行微阵列表达情况分析(参见图7)。微阵列分析将257基因鉴定为组间显著性差别表达：52个基因被增量调节，205个基因被减量调节(图7B；还有8A)。其中，基因组富集分析(GSEA)揭示，Egr2靶标(即CSF-1R信号发放的转录因子下游)在BLZ945治疗的TAM中被减量调节(图7C)。不成比例的是，与M2期相关的基因被增量调节(图7D和7E)。
实施例8.CFR-1R抑制剂诱导的基因表达改变
Lasso回归模型建立被用于测定最佳区分两个处理组的基因的最少数量。它针对BLZ945治疗鉴定了由肾上腺髓质素(adrenomedullin)(Adm)、精氨酸酶1(Arg1)、凝血因子F13a1、甘露糖受体C1型(Mrc1/CD206)和蛋白酶抑制剂serpinB2组成的5基因特征(图8B)。有意义的是，这些基因各自与交替活化的/M2巨噬细胞极化相关，且5个基因中4个在BLZ945治疗后被增量调节。SerpinB2(也称作PAI2)是5-基因特征中唯一被增量调节的基因，总体而言其与存活增加正相关，特别是乳癌患者中。
在许多组织环境中，已经发现TAM是更M2极化的，其已经被与它们的免疫抑制和促肿瘤发生功能相关联。此外，人神经胶质瘤中的巨噬细胞显示出M2-样表型(通过清除受体CD163和CD204的水平增加来确定)，其与较高的肿瘤等级相关。由于有限的5-基因特征中M2基因的引人注目的富集，所以检验了257-基因列表以确定是否存在在BLZ945治疗后改变的另外的M2-相关性标记物。这揭示出10种另外的基因[Alox15(花生四烯酸15-脂加氧酶(arachidonate 15-lipoxygenase))；Cdh1(钙粘着蛋白)；Cd163(CD163抗原)；Fpr2(甲酰基肽受体2)；Hmox1(血红素加氧酶(去环化)1)；il1b(白细胞介素1β)；和Stab1(stabilin1)]，它们中的大部分被减量调节(图7D，表2)。除了白细胞介素1β受体以外，经典活化的/M1极化基因没有被相应地增量调节(图7E)。这些数据表明，作为对用BLZ945抑制CSF-1R的响应，TAM失去了其M2极化并且可得到抗肿瘤发生功能。
这还表明，监测这些作为生物标记物的基因表达改变可以为用CSF-1R抑制剂治疗神经胶质瘤患者提供有价值的预后信息。可以预计所治疗的其基因表达情况以与这些观察到的改变相同或相似的模式改变的个体对用CSF-1R抑制剂治疗会积极地响应，不显示这类基因表达改变的那些个体可能需要接受交替治疗或另外的治疗，这是由于使用单独的CSF-1R抑制剂的消极预后。
表2.作为CSF-1R抑制剂治疗的结果的差别基因表达
Figure BDA0000408243410000361
Figure BDA0000408243410000381
Figure BDA0000408243410000391
Figure BDA0000408243410000401
Figure BDA0000408243410000411
Figure BDA0000408243410000431
Figure BDA0000408243410000441
Figure BDA0000408243410000451
*对BLZ945的响应的Lasso回归特征的组分。
#相关的M2巨噬细胞相关基因。
在表中，减量调节的基因被给出负‘倍增改变’数值，而增量调节的基因具有正值。标称p值得自Student双尾t-检验。
此外，由小鼠的用BLZ945-治疗的TAM产生的基因特征显然与GBM患者中的差别存活相关。支持向量机(support vector machine,SVM)和Lasso特征被用于分析来自Cancer Gene Atlas(TCGA)和第二种合并的系列GBM数据组的GBM数据并且将患者分入‘BLZ945’或‘介质’分类物。这些分析揭示了从使用Lasso特征的TCGA促神经形成患者的10个月(图8C和8D)至具有SVM特征的合并数据组中的31.5个月(图8E和8F)的中位数存活时间的增加。有趣的是，这种存活时间的增加在其它GBM亚型中不明显，且不依赖于G-CIMP+促神经形成患者的富集。
表3.不同GBM群体中支持向量机(SVM)和Lasso模型的存活数据。
Figure BDA0000408243410000461
Figure BDA0000408243410000471
相关的危害比分析在TCGA和合并数据组中均显示了促神经形成-特异性存活优势(图8G)。促神经形成特异性与最初已经从神经胶质瘤发生PDG模型中产生的TAM特征一致，其最接近地代表了促神经形成GBM。这表明这些基因特征能为用化疗剂进行治疗的个体、特别是用CSF-1R抑制剂治疗的GBM患者提供有用的预后指导。因为与其它亚型相比，促神经形成GBM对攻击性化疗和放疗无响应，所以与这些特征相关的预后值的发现对这组患者而言可具有重要的转化潜能。基于所观察到的相关性，预计显示出与Lasso或SVM基因特征至少约80%相似性的基因特征的接受化疗的患者对所述化疗剂有积极响应。特别地，预计这种相关性可用于用CSF-1R抑制剂、特别是本文所述的式(I)化合物治疗的个体。
表4.不同G-CIMP和非-G-CIMP患者组中Lasso回归模型的危害比和相关95%置信区间。G-CIMP对应于神经胶质瘤CpG岛甲基化物(Methylator)表型。P值是用Wald检验得到的。
Figure BDA0000408243410000472
*具有确定非G-CIMP阳性的甲基化数据的促神经形成患者组(67/133全部促神经形成TCGA患者。)**使用G-CIMP和‘BLZ945’分类层的多变量cox比例风险模型。
表5.不同患者数据组中Lasso回归模型的危害比。P值是使用Wald检验得到的。仅来自促神经形成亚型的危害比具有统计学显著性。
所用的方法和材料
小鼠
所有动物研究均得到了Institutional Animal Care and Use Committeeof Memorial Sloan-Kettering Cancer Center批准。之前已经描述了巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠模型(混合品种背景)(参见E.Tchougounova等人,Oncogene26,6289(2007))。野生型(WT)C57BL/6小鼠和β-肌动蛋白-GFP(C57BL/6)小鼠分别购自Charles River Laboratories和JacksonLaboratories，并且还在我们的动物设施中养育。
颅内注射
之前已经描述了在成年小鼠中使用RCAS-PDGF-B-HA引发肿瘤(A.H.Shih等人,Cancer Res64,4783(2004))。简言之，用10mg/ml氯胺酮/1mg/ml赛拉嗪充分麻醉小鼠，在手术部位皮下注射50μl局部麻醉药0.25%布比卡因。使用固定立体定向仪(Stoelting)给小鼠颅内注射1μl含有2×105个5-6周龄的DF-1:RCAS-PDGF-B-HA细胞。对右侧额皮质进行注射，距离前囟点侧面约1.5mm和近尾部1mm，深2mm。
为了研究流式细胞计数分选的细胞群中CSF-1和CSF-1R的细胞类型特异性表达，如之前所述的那样(E.I.Fomchenko等人,PloS ONE6,e20605(2011).)用RCAS-PDGF-B-HA-SV40-eGFP(RCAS-PDGF-GFP)在小鼠中引发肿瘤。在出生后第2天将1μl DF-1:RCAS-PDGF-B-GFP细胞注射入巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-幼鼠的眼与耳之间的左侧皮质中。
BLZ945抑制剂和治疗
用20%captisol将CSF-1R抑制剂BLZ945配制成12.5mg/ml浓度。按照相同方式加工介质对照20%captisol。为了进行BLZ945研究，通过口服管饲法每天一次给小鼠施用200mg/kg BLZ945或介质(20%captisol)。
为了测定药物是否能通过血脑屏障，用单剂量的BLZ945治疗带有肿瘤的小鼠，在治疗后的不同时间点处死。将血浆和脑的左(对侧)和右(带有肿瘤)半球骤然冷冻在液氮中，以便随后分析组织中的BLZ945浓度。为了进行长期存活研究，从注射RCAS-PDGF-B-HA后17天/2.5周开始给药。为了进行固定时间点研究，如之前所述的那样(Transl Oncol2,89(2009))，在注射RCAS-PDGF-B-HA后4-5周时对小鼠进行MRI扫描。
为了测定肿瘤体积，使关注的区域(ROI)局限于T2加权图像上并且将其相应的以mm2计的面积乘以0.7mm的切片高度。总肿瘤体积是每个切片中ROI体积的总和，将其中出现肿瘤的第一个和最后一个切片的体积二等分以近似梯形体积。当肿瘤体积为4.5-40mm3时，将动物随机分入治疗组。也用BLZ945治疗具有大于40mm3的肿瘤的第三同龄组小鼠(表示为BLZ945大肿瘤)。对具有较大起始肿瘤负荷的该同龄组而言不包括大小匹配的介质治疗的同龄组，因为这些小鼠不能存活至试验终点。
小鼠处死和组织采集
在图例中所述的确定的时间点或当它们变得有来自肿瘤的症状时，对小鼠实施安乐死，所述症状包括理毛行为差、体重减轻、弯腰驼背、大头畸形或癫痫发作。
为了分离组织以便骤然冷冻在液氮中，将小鼠通过二氧化碳窒息实施安乐死或者用阿佛丁(2,2,2-三溴乙醇，Sigma)充分麻醉并且颈部脱位，然后采集组织。为了进行流式细胞术，用阿佛丁充分麻醉小鼠，用20ml PBS跨贲门(transcardially)灌注。然后分离脑，从周围正常组织中宏观剥离肿瘤。为了进行增殖分析，在处死前2小时给小鼠腹膜内注射100mg/g溴脱氧尿苷(BrdU;Sigma)。为了分离用于冷冻组织学的组织，用阿佛丁充分麻醉小鼠，用10ml PBS、然后用10ml4%低聚甲醛的PBS溶液(PFA)跨贲门灌注。在4℃将脑后固定过夜，同时在4℃将其它组织冷藏保存在30%蔗糖中。后固定后，将脑转入30%蔗糖，在4℃孵育直至脑充分平衡，沉积在试管底部(典型地2－3天)。然后将所有组织包埋在OCT(Tissue-Tek)中，将10μm低温保存的组织切片用于所有随后的分析。
组织学、免疫组织化学和分析
为了对肿瘤恶性进行分级，进行苏木精和伊红(H&E)染色，由独立的神经病理学家以双盲方式对组织进行评分。
为了进行免疫荧光法，将10μm厚度的冷冻切片融化，在室温下干燥，然后用PBS洗涤。为了进行标准染色方案，将组织切片在0.5%PNB的PBS溶液中在室温下封闭1小时或在4℃封闭至多过夜，然后在位于0.25%PNB中的一级抗体中在室温下孵育2小时或在4℃下孵育过夜。一级抗体的信息和稀释度列在表6中。然后用PBS洗涤切片，在室温下与适宜的荧光团-轭合的二级抗体(Molecular Probes)以在0.25%PNB中1:500的稀释度一起孵育1小时。用PBS洗涤后，将组织切片用DAPI(用PBS按1:5000稀释的5mg/ml储备溶液)复染色5分钟，然后用ProLong Gold Antifade封固剂(Invitrogen)固定。
为了进行血管生成和增殖分析，首先将组织切片如下进行基于柠檬酸盐缓冲液的抗原恢复：首先将组织切片浸没在抗原暴露溶液(0.94%v/v的蒸馏水溶液;Vector Laboratories)中，使用一半功率微波处理10分钟，然后冷却至室温达至少30分钟。为了进行血管生成分析，然后将组织用PBS洗涤，用小鼠Ig封闭试剂(Vector Laboratories)根据制造商的说明在室温下封闭1小时。为了进行增殖分析，在抗原恢复后，将组织切片与2M HCl一起在室温下孵育15分钟以使DNA变性，然后在中和0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)中5分钟。PBS洗涤后，根据标准方案进行其余染色。
为了进行用于吞噬作用分析的染色，将10μm厚度的冷冻切片融化，在室温下干燥，然后用PBS洗涤。将组织切片在室温下用0.5%PNB的PBS溶液封闭至少1小时，然后在4℃在用0.5%PNB按1:500稀释的兔抗-裂解的胱天蛋白酶-3一级抗体中孵育过夜。第二天，用PBS将载玻片洗涤6次达5分钟，然后在室温下与山羊-抗-兔Alexa568二级抗体(用0.5%PNB按1:500稀释)一起孵育1小时。然后用PBS将组织切片洗涤6次达5分钟，在4℃下用新的5%驴血清、3%牛血清白蛋白和0.5%PNB的PBS溶液的缓冲液封闭过夜。第二天，将载玻片在室温下与下一组一级抗体一起孵育2小时：用5%驴血清、3%牛血清白蛋白和0.5%PNB的PBS溶液稀释的兔抗-Olig2(1:200)和大鼠抗-CD11b(1:200)。将载玻片用PBS洗涤6次达5分钟，然后在室温下与驴-抗-兔Alexa647(1:500)和驴-抗-兔Alexa488(1:500)二级抗体一起孵育1小时。然后将组织切片用PBS洗涤4次达5分钟，然后用DAPI(用PBS按照1:5000稀释的5mg/mL储备溶液)染色5分钟，再用PBS洗涤2次达5分钟，用ProLong Gold Antifade封固剂(Invitrogen)固定。还依次以相同方式对CSF-1R(第一一级抗体)和Iba1(第二一级抗体)进行了共染色，其中在开始时加入基于柠檬酸盐缓冲液的抗原恢复。
用装配了Apotome的Carl Zeiss Axioimager Z1显微镜观察组织切片。如之前所述的那样(Journal Immunol Methods237,39(2000))使用TissueQuest分析软件(TissueGnostics)进行免疫荧光染色、细胞数量、增殖、细胞凋亡和共区域化研究的分析。
通过将各200x影像接合在一起用TissueGnostics获取软件产生了来自为血管生成分析染色的神经胶质瘤的组织切片概貌。如之前所述的那样(V.Gocheva等人,Biol Chem391,937(2010))用MetaMorph(MolecularDevices)对血管生成的所有参数进行定量。
为了进行吞噬分析，使用63x油浸物镜(总放大倍数630x)和Apotome获取来自肿瘤内的15个随机选择的视野，以确保细胞在相同的光学切面中。使用Volocity(PerkinElmer)对阳性细胞进行手动计数并且通过存在DAPI+核分辨。将凋亡细胞计数为具有胞质裂解的胱天蛋白酶-3(CC3)+染色和固聚的细胞核的那些。当细胞被连续的CD11b+环包围(该环环绕了细胞边界的至少三分之二)时，视为其已经被巨噬细胞吞噬。在图例中具体给出了分析的小鼠的数量。
蛋白质分离和蛋白质印迹法
用BLZ945或介质治疗小鼠，并且在最终剂量后1小时处死小鼠，采集肿瘤。如之前所述对样品进行生物化学分级分离。用NP-40裂解缓冲液(0.5%NP-40、50mM Tris-HCl[pH7.5],50mM NaCl、1×完全小蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1×PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche))裂解突出膜级分并且使用BCA测定法(Pierce)对蛋白质定量。将蛋白质裂解物荷载(90μg/泳道)到SDS-PAGE凝胶上并且转至PVDF膜上用于进行免疫印迹。
使用针对磷酸-CSF-1R Y721(1:1000;Cell Signaling Technology)、CSF-1R(1:1000;Santa Cruz Biotechnology)或GAPDH(1:1000;CellSignaling Technology)的抗体探测膜并且使用HRP-轭合抗兔(JacksonImmunoresearch)抗体、用化学发光检测法(Millipore)进行检测。使用ImageJ软件中的凝胶分析模块在动态范围内对来自蛋白质印迹的谱带进行定量。
在不存在CSF-1的情况下将原代骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)培养12小时，然后在存在或不存在67nM BLZ945的情况下用CSF-1(10ng/ml)刺激达图S2中所示的时间点。用NP40裂解缓冲液分离完整蛋白质裂解物并且如上文所述的那样通过蛋白质印迹进行检测。
单细胞混悬液的制备和流式细胞术
为了通过流式细胞术分析或分选研究脑巨噬细胞群，通过与5ml木瓜蛋白酶消化溶液(0.94mg/ml木瓜蛋白酶[Worthington]、0.48mM EDTA、0.18mg/ml N乙酰-L-半胱氨酸[Sigma]、0.06mg/ml脱氧核糖核酸酶I[Sigma]，用Earl平衡盐溶液稀释，并且在室温下活化至少30分钟)一起孵育将肿瘤消化成单细胞混悬液。消化后，通过加入2ml0.71mg/ml卵类粘蛋白(Worthington)使酶失活。然后使细胞混悬液通过40μm筛以除去未消化的组织，用FACS缓冲液(1%IgG Free BSA的PBS溶液[JacksonImmunoresearch])洗涤，以750rpm的低速离心(Sorvall Legend RT)，以除去碎片，得到细胞沉淀物。由于许多免疫细胞表位是木瓜蛋白酶敏感性的，为了通过流式细胞术分析研究免疫细胞浸润，通过在37℃下与5mL1.5mg/ml胶原酶III(Worthington)和0.06mg/mL脱氧核糖核酸酶I一起在具有钙和镁的1×Hanks平衡盐溶液(HBSS)中孵育10分钟将肿瘤消化成单细胞混悬液。
然后用PBS洗涤细胞混悬液，使其通过40μm筛以除去未消化的组织。为了除去髓磷脂碎片，将细胞沉淀物重新混悬于15ml室温的由等张的Percoll储备溶液(90%Percoll[Sigma]，10%10×HBSS)制备的25%Percoll中，然后使用加速器以1500rpm旋转15分钟(Sorvall Legend RT)，制动设定在1。然后用1×HBSS洗涤细胞沉淀物，然后重新混悬于FACS缓冲液中。固定后，在4℃下将细胞与1μl Fc Block/一百万个细胞一起孵育至少15分钟。然后在4℃下用适宜的抗体将细胞染色10分钟，用FACS缓冲液洗涤，重新混悬于含有DAPI的FACS缓冲液(按照1:5000稀释的5mg/ml)中，以排除活细胞/死细胞。在表6中列出了流式细胞术中所用的抗体。
表6.抗体和来源列表
Figure BDA0000408243410000531
为了进行分析，在BD LSR II(Becton Dickstein)上运行样品，用FlowJo分析软件(TreeStar)进行所有随后的补偿和门控。为了进行分选，在BDFACSAria(Becton Dickstein)细胞分选仪上运行样品，将细胞采集入FACS缓冲液中。然后将细胞离心，重新混悬于500μl Trizol(Invitrogen)中，然后迅速冷冻在液氮中并且贮存在-80℃下。
小鼠原代神经胶质瘤培养物、神经球和神经胶质瘤细胞系的衍生
如上文所述通过在37℃下孵育8-12分钟将宏观剥离的肿瘤消化成单细胞混悬液。用神经干细胞(NSC)基本培养基(Stem Cell Technologies)洗涤细胞混悬液，在低速下离心(750rpm Sorvall Legend RT)，以除去碎片。为了衍生小鼠原代神经胶质瘤培养物，将细胞碎片重新混悬于含有10%FBS的DMEM中(Gibco)。这些原代培养物在早期传代(P2-P3)时被使用，并且含有神经胶质瘤中发现的不同细胞类型的混合物，所述细胞类型包括肿瘤细胞、巨噬细胞和星形细胞，如根据免疫荧光染色所确定的那样。使原代神经胶质瘤培养物在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片(BD Biocoat)上生长24小时。然后在4℃下用4%PFA的0.1M磷酸盐缓冲液溶液固定细胞过夜，用0.1%Triton-X透化5分钟，用0.5%PNB封闭至少1小时。分别通过CD11b(1:200)、巢蛋白(1:500)和GFAP(1:1000)的免疫荧光染色检验巨噬细胞、肿瘤细胞和星形细胞的存在(表7)。
表7.染色所用的抗体列表
Figure BDA0000408243410000541
Figure BDA0000408243410000551
为了神经球形成，将细胞沉淀物重新混悬于由小鼠NSC基本培养基、NSC增殖补体、10ng/ml EGF、20ng/ml碱性-FGF和1mg/ml肝素组成的神经球培养基(Stem Cell Technologies)中。每72小时加入一次新鲜培养基，持续2周。采集原代神经球，以机械方式分离成单细胞混悬液并且通过连续传代繁殖。为了生成神经胶质瘤细胞系，将二代神经球分离成单细胞混悬液并且以单层形式在DMEM+10%FBS中培养。多神经胶质瘤细胞系源自独立的小鼠，在本文中被称为GBM1-4。如之前所述的那样(O.Florey等人,Nat Cell Biol13,1335(2011))用pBabe-H2B-mCherry构建体感染神经胶质瘤细胞。
骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)的分离
为了进行骨髓分离、然后进行巨噬细胞衍生，使用阿佛丁(Sigma)麻醉C57BL/6WT,C57BL/6β-肌动蛋白-GFP或巢蛋白-Tv-a;Ink4a/Arf-/-小鼠，然后通过颈部脱位处死。在无菌条件下从双腿采集股骨和胫骨，冲洗。使骨髓通过40μm滤过器，在具有10ng/ml重组小鼠CSF-1(R&D Systems)的30ml
Figure BDA0000408243410000552
袋(PermaLife PL-30)中培养。在
Figure BDA0000408243410000553
袋中将骨髓细胞培养7天，隔天用新鲜的含CSF-1的培养基替换旧培养基，以诱导巨噬细胞分化。
另外的细胞系U-87MG(HTB-14)神经胶质瘤和CRL-2467小胶质细胞系购自ATCC。在DMEM+10%FBS中培养U-87MG细胞系。在具有30ng/ml重组小鼠CSF-1的DMEM+10%FBS中培养CRL-2467细胞系。
神经胶质瘤细胞-条件培养基(GCM)实验使已经用在无血清培养基中生长的神经胶质瘤肿瘤细胞系调节24小时的培养基通过0.22μm滤膜，以除去细胞碎片，该培养基在本文中被称为神经胶质瘤细胞-条件培养基(GCM)。用GCM刺激分化的C57BL/6WT或β-肌动蛋白-GFP+BMDM。对照巨噬细胞接受含有10%FBS和10ng/m重组小鼠CSF-1的新鲜培养基。当给出时，在含有作为介质的DMSO或67nM BLZ945、670nM BLZ945的GCM中或在含有10ng/ml小鼠重组CSF-1和10ng/ml IL-4(R&DSystems)的常规培养基中将分化的BMDM培养24小时或48小时，然后进行实验分析。
通过流式细胞术分析Mrc1/CD206表达
对于小鼠原代神经胶质瘤培养物(肿瘤细胞、TAM、星形细胞等的混合群)，将1×106个细胞在存在BLZ945或作为介质的DMSO的情况下在DMEM+10%FBS中培养。对于BMDM，将1×106个细胞在存在BLZ945或作为介质的DMSO的情况下在补充了重组小鼠CSF-1或GCM的DMEM中培养。48小时后，刮取细胞，用FACS缓冲液洗涤。对细胞进行计数，在4℃下与1μl Fc Block(BD Pharmingen)/106个细胞一起孵育至少15分钟。然后将细胞在4℃下用CD45和CD11b抗体染色10分钟，用FACS缓冲液洗涤。用BD Cytofix/CytopermTM试剂盒(BD Biosciences)根据制造商的说明固定和透化细胞。随后将细胞用抗-CD206抗体染色。为了进行分析，将样品在BD LSR II(Becton Dickstein)上运行，并且用FlowJo分析软件(TreeStar)进行所有随后的补偿和门控。
细胞周期分析
按照1:1比例将对照或源自β-肌动蛋白-GFP+小鼠的GCM预刺激的巨噬细胞与1×105血清饥饿的mCherry-阳性神经胶质瘤细胞(来自上述衍生的细胞系)一起在存在670nM BLZ945或作为介质的DMSO的情况下共培养48小时。在采集胰蛋白酶消化的共培养的细胞后，将孔用另外的培养基冲洗，采集该体积以确保采集到所有巨噬细胞，其紧密地粘附在细胞培养皿上。然后将样品用FACS缓冲液洗涤1次，然后在室温下在含有0.1mgDAPI(Invitrogen)的透化缓冲液(10mM PIPES、0.1M NaCl、2mMMgCl2、0.1%Triton X-100，pH6.8)中孵育10分钟。在LSR II流式细胞仪(BD)上用UV激光(350-360nm)获取后，使用用于细胞周期分析的FlowJo Dean-Jett-Fox程序分析神经胶质瘤肿瘤细胞的细胞周期状态。
增殖测定法
使用MTT细胞增殖试剂盒(Roche)测定细胞生长。简言之，在存在或不存在6.7-6700nM BLZ945的情况下将细胞一式三份地铺在96-孔板中(对于神经胶质瘤细胞系，1×103个细胞/孔；对于BMDM和CRL-2467细胞，5×103个细胞/孔)。每48小时改变一次培养基。除非另有说明，否则分别给BMDM和CRL-2467细胞补充10ng/ml和30ng/ml重组小鼠CSF-1。将10μl MTT标记试剂加入到各孔中，然后在37℃下孵育4小时，然后添加100μl MTT增溶试剂过夜。将混合物温和地重新混悬，在spectraMax340pc板读数器(Molecular Devices)上在595nm和750nm测定吸光度。
二代神经球形成测定法
使原代神经球分解成单细胞混悬液，在存在BLZ945或作为介质的DMSO的情况下将5×103个细胞在神经球培养基中铺在6孔板中。每48小时改变一次培养基。通过在2周后对获得的神经球的数量进行计数测定了二代神经球的形成。
RNA分离、cDNA合成和定量实时PCR
用Trizol分离RNA，脱氧核糖核酸酶处理，将0.5μg RNA用于cDNA合成。用于Cd11b(Mm00434455_m1)、Cd68(Mm03047343_m1)、Csf-1(Mm00432688_m1)、Csf-1r(Mm00432689_m1)、Il34(Mm00712774_m1)、Mrc1(Mm00485148_m1)和Tv-a(定制)的Taqman探针(AppliedBiosystems)用于qPCR。测定法一式三份地进行，对每个样品将表达用遍在蛋白C(Mm01201237_m1)归一化。
微阵列和基因表达谱
在MSKCC下通过基因核心设施制备和加工所有样品。使用Trizol分离RNA，通过在Agilent Bioanalyzer上运行评价质量。逆转录75ng总RNA，使用Genechip3'IVT表达试剂盒(Affymetrix)标记。将得到的cRNA与Affymetrix MOE430A2.0芯片杂交。使用GCOS1.4(Affymetrix)分析粗表达数据。将数据用500的目标强度归一化以说明总体芯片强度差异。
微阵列分析
使用Bioconductor Suite包完成R中的所有生物信息分析。使用‘affy’包生成稳健的多阵列平均(Robust Multi-Array Average,RMA)表达值并且将分位数归一化(R.A.Irizarry等人,Nucleic Acids Res31,e15(2003);L.Gautier等人,Bioinformatics20,307(2004)。‘limma’包(G.K.Smyth,Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology3,Article3(2004))被用于鉴定介质与BLZ945治疗的样品之间的差别表达基因。差别表达在+/-2的倍数改变与10%的错误发现率下被视为是显著性的。如之前所述的那样(15)使用基因组富集分析(GSEA)。对于随后的分析和与人数据组的比较而言，小鼠表达值被跨所有样品平均集中。
用于基因特征鉴定的Lasso回归方法
将小鼠表达数据归一化并且如上所述进行平均集中。差别表达的基因被用于进一步分析。使用‘glmnet’包训练Lasso回归模型以区分介质与BLZ945治疗的样品(J.Friedman等人,Journal of Statistical Software33,1(2010).)。通过4-倍交叉验证选择用于Lasso回归的规律化参数。
患者数据组
TCGA表达数据是从TCGA数据入口下载的，所有临床数据是从数据入口<http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp>下载的。Rembrandt数据组的临床和表达数据是从<https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/>下载的。Freije(GSE4412)、Murat(GSE7696)和Phillips(GSE4271)数据组是从NCBI<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/>下载的。就Freije数据组而言，仅考虑在HGU133A平台上运行的样品，因为在HGU133B平台上的样品含有与其余数据组的最小重叠。使用‘Affy’包分别输入每个数据组并且生成RMA表达值。对所有数据组进行分位数归一化，每个基因被跨所有患者平均集中。
非TCGA患者的亚型分型
为了研究所有可公开获得的数据组中的亚型特定存活差异，利用职权所述的亚型分类物(R.G.Verhaak等人,Cancer Cell17,98(2010))训练支持向量机(SVM)。Verhaak和其同事针对ClacNc分析所用的840个基因被用于将数据组再分组。然后，将数据组针对被称为跨上文所述的所有患者数据组存在的基因进行再分组。其余776个基因被用于对来自TCGA数据组的核心样品训练多级SVM。使用Gaussian半径基础核函数用‘kernlab’包(A.Karatzoglou等人,J.Statistical Software,11,9(2004))完成SVM。然后将该SVM用于预测其余TCGA患者和公开数据组的亚型。
患者分类
用小鼠表达数据组训练SVM以将患者分类入“介质”类别或“BLZ945”类别。将患者表达数据针对跨所有数据组的共有基因和具有已知小鼠同系物的基因进行再分组。类似地，将小鼠表达数据针对具有跨所有患者样品共有的人同系物的基因进行再分组。随后，将小鼠数据针对用‘limma’包鉴定的差别表达基因进行再分组。将人数据针对这些差别表达的基因的人同系物进行再分组。这产生了从257个差别表达基因到具有跨所有患者数据组的已知人同系物的206个差别表达基因的特征减少。然后用‘kernlab’包对小鼠表达数据应用香草(vanilla)核函数训练SVM。然后将该SVM用于预测进入“介质”分类物或“BLZ945”分类物的患者。
类似的方法被用于使用Lasso回归模型将患者分类。患者和小鼠数据的再分组与上文所述的相同。不使用‘kernlab’包，而使用‘glmnet’包训练Lasso回归模型。然后将该模型用于预测进入“介质”分类物或“BLZ945”分类物的患者类别。如下面所述根据患者甲基化数据的分级集合确定G-CIMP患者状态(H.Noushmehr等人,Cancer Cell17,510(2010))。
根据G-CIMP状态对患者分层
从实验看，显然由“BLZ945”治疗提供的存活优势并非归因于神经胶质瘤CpG岛甲基化物表型(GCIMP)患者的富集，之前已经证明其与改进的总体存活率相关(Noushmehr)。在来自TCGA数据组的被分析的453个GBM中，263个也具有基因组甲基化数据并且如之前所述被分类入甲基化群体。在21个G-CIMP患者中，20个(95%)被分类入“BLZ945”类别，这表明了G-CIMP患者中BLZ945样品的强富集。尽管该富集，已知为GCIMP阴性的促神经形成患者的存活分析(67/133全部促神经形成患者)揭示，“BLZ945”类别组仍然显示了～10.8个月的存活增加(P=0.014)。
此外，cox比例危害模型证明，通过“BLZ945”类别证明的存活增加不依赖于G-CIMP患者。具有或不具有G-CIMP患者的情况下，与BLZ945特征相关的危害比都是显著的。此外，当在混合模型中BLZ945特征也被考虑时，G-CIMP层次的危害比不显著。因此，尽管G-CIMP患者显然富含模拟“BLZ945”类别样品，但是由该类别提供的存活益处不依赖于GCIMP状态。
存活分析
使用R形式的‘存活’包完成存活分析(T.Therneau,R包版本2.36-12.(2012))。使用来自‘存活’包的‘coxph’函数确定了危害比。如所示的那样，基于Lasso回归分类模型、G-CIMP状态或这两者的可能性将患者分层。P值是用Wald检验产生的。
患者分析图
所有Kaplan-Meier存活曲线、heatmaps和火山图是用‘gplots’包(G.R.Warnes等人,R包版本2.10.1,(2011).)在R v2.14.1中产生的。危害比森林图是用GraphPad Prism Pro5产生的。
数据表示和统计学分析
使用GraphPad Prism Pro5将数据表示为平均值以及它们各自的标准误(SEM)或者表示为统计学散布图。除非另有注明，否则数值数据是通过未配对双尾Student t-检验分析的。对于存活曲线而言，P值是用Log Rank(Mantel-Cox)检验得到的，Fisher精确检验被用于进行组织学肿瘤分级。P=0.05被视为具有统计学显著性。

Claims (24)

1.在哺乳动物个体中治疗脑肿瘤的方法，其包括给所述个体施用有效量的式(I)的化合物：
Figure FDA0000408243400000011
其中R1是烷基吡唑或烷基甲酰胺；且
R2是羟基环烷基；
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法，其中R1是
Figure FDA0000408243400000012
其中R’是Me或Et。
3.权利要求1或2的方法，其中R2是
Figure FDA0000408243400000013
4.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述脑肿瘤是神经胶质瘤。
5.权利要求4的方法，其中所述神经胶质瘤是多形性成胶质细胞瘤。
6.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述脑肿瘤是脑转移灶、星形细胞瘤(包括成胶质细胞瘤)、少突神经胶质细胞瘤、室管膜瘤或混合性神经胶质瘤。
7.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述式(I)的化合物是
Figure FDA0000408243400000021
或其药学上可接受的盐；
或这些化合物之一的分离的立体异构体。
8.权利要求7的方法，其中所述式(I)的化合物是：
Figure FDA0000408243400000022
9.权利要求7的方法，其中所述式(I)的化合物是：
10.权利要求7的方法，其中所述式(I)的化合物是：
Figure FDA0000408243400000031
11.权利要求7的方法，其中所述式(I)的化合物是：
Figure FDA0000408243400000032
12.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述方法进一步包括给所述个体施用有效量的另外的癌症治疗剂抗血管生成剂、具有或不具有伊立替康的贝伐珠单抗、亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、铂例如顺式-铂(顺铂)、烷化剂例如替莫唑胺、酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、Ukrain和大麻素类。
13.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述式(I)的化合物被口服施用。
14.以上权利要求中任意一项的方法，其中给所述个体施用的式(I)的化合物的量为约50mg/kg/天－约500mg/kg/天。
15.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述个体具有促神经形成成胶质细胞瘤。
16.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述个体是选择的个体，因为该个体具有升高的水平的PDGF或PDGFR信号发放。
17.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述个体用PDGFR抑制剂同时治疗。
18.以上权利要求中任意一项的方法，其中所述个体是人。
19.用于治疗脑肿瘤的权利要求1的化合物。
20.权利要求19的化合物，其中所述脑肿瘤是成胶质细胞瘤。
21.权利要求20的化合物，其中所述成胶质细胞瘤是促神经形成成胶质细胞瘤。
22.下式的化合物：
Figure FDA0000408243400000041
其中R’是甲基、乙基或丙基。
23.权利要求22的化合物，其中R’是甲基。
24.药物组合物，其包含实施方案22的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
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