BR112013028095B1 - Uso de inibidores de csf-1r para o tratamento de tumores cerebrais - Google Patents
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Abstract
resumo patente de invenção: "inibidores de csf-1r para o tratamento de tumores cerebrais". a presente invenção refere-se a um composto de fórmula i: (i) em que r1 é uma alquil pirazol ou uma alquil carboxamida e r2 é uma hidroxicicloalquila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e composições que contêm estes compostos para uso no tratamento de um tumor cerebral, particularmente glioblastoma. a invenção proporciona um tratamento eficaz de um tumor cerebral e pode ser usada através de administração oral de um composto de fórmula i, conforme ainda descrito aqui. a invenção também proporciona um método para tratar um indivíduo que tem um tumor cerebral, tal como glioblastoma, em que o método compreende administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um composto de fórmula i. assinaturas gênicas correlacionadas ao tratamento com sucesso usando estes métodos são também descritas.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE INIBIDORES DE CSF-1R PARA TRATAMENTO DE TUMORES CEREBRAIS.
ANTECEDENTES [0001] Cânceres do sistema nervoso e cérebro estão entre os mais difíceis de tratar. O prognóstico para pacientes com estes cânceres depende do tipo e localização do tumor, bem como seu estágio de desenvolvimento. Para muitos tipos de câncer cerebral, a expectativa média de vida após o início dos sintomas pode ser de meses ou um ano ou dois. O tratamento consiste principalmente em remoção cirúrgica e radioterapia; quimioterapia também é usada, mas a variedade de agentes quimioterapêuticos adequados é limitada, talvez porque a maioria dos agentes terapêuticos não penetrem na barreira hematoencefálica adequadamente para tratar tumores cerebrais. Uso de produtos quimioterapêuticos conhecidos, juntamente com cirurgia e radioterapia, raramente prolonga a sobrevivência muito além daquela produzida por cirurgia e radioterapia individualmente. Assim, opções terapêuticas aprimoradas são necessárias para tumores cerebrais.
[0002] Gliomas são um tipo comum de tumor cerebral. Eles surgem do tecido neuronal de suporte composto por células gliais (daí o nome de glioma), o qual mantêm a posição e função de neurônios. Gliomas são classificados de acordo com o tipo de células gliais com as quais eles se assemelham: astrocitomas (incluindo glioblastomas) se assemelham às células gliais astrócitos em formato de estrela, oligodendrogliomas se assemelham às células gliais oligodendrócitos e ependimomas se assemelham às células gliais ependimais que formam o revestimento de cavidades de fluidos no cérebro. Em alguns casos, um tumor pode conter uma mistura destes dois tipos de células e será referido como um glioma misto.
[0003] O tratamento atual típico para cânceres cerebrais é a remo
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2/84 ção cirúrgica da maioria do tecido tumoroso, o qual pode ser feito por uma cirurgia invasiva ou usando biópsia ou métodos extrativos. Os gliomas tendem a se disseminar de forma irregular, no entanto e são muito difíceis de remover completamente. Como um resultado, recorrência quase sempre ocorre logo após remoção do tumor. Radioterapia e/ou quimioterapia podem ser usadas em combinação com remoção cirúrgica, mas estas geralmente fornecem extensão do tempo de sobrevivência apenas modesta. Por exemplo, estatísticas recentes mostram que apenas cerca de metade dos pacientes nos EUA que são diagnosticados com glioblastoma estão vivos um ano após o diagnóstico e apenas cerca de 25% ainda estão vivos após dois anos, mesmo quando tratados com o padrão atual de tratamentos combinados.
[0004] Glioblastoma multiforme (GlioBlastoma Multiforme - GBM) é o tumor cerebral primário mais comum em adultos e é notório por sua letalidade e falta de capacidade de resposta às abordagens atuais de tratamento. Infelizmente, não houve melhoras substanciais nas opções de tratamento nos últimos anos e melhoras mínimas nas perspectivas de sobrevivência para pacientes com GBM. Assim, continua a haver uma necessidade urgente por tratamentos aprimorados para cânceres cerebrais, tais como gliomas.
[0005] Os gliomas se desenvolvem em um microambiente tecidual complexo composto de muitos tipos diferentes de células do parênquima cerebral, além das próprias células cancerosas. Macrófagos associados a tumores (Tumor-Associated Macrophages - TAMs) são um dos tipos de células estromais proeminentes presentes e muitas vezes são responsáveis por uma parte substancial das células nos tecidos tumorais. Sua origem não é certa: estes TAMs podem se originar a partir da microglia, a população de macrófagos residentes no cérebro, ou eles podem ser recrutados a partir da periferia.
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3/84 [0006] TAMs podem modular o início e progressão de tumor de uma forma tecido-específica: eles parecem suprimir o desenvolvimento do câncer em alguns casos, mas eles aumentam a progressão do tumor na maioria dos estudos até o momento. Na verdade, em aproximadamente 80% dos cânceres nos quais há um aumento da infiltração de macrófagos, os níveis TAM elevados estão associados a uma doença mais agressiva e pobre prognóstico para o paciente. Vários estudos têm mostrado que os gliomas humanos também exibem um aumento significativo no número de TAMs, o qual se correlaciona com o grau de tumor avançado e TAMs são, tipicamente, o tipo de célula imune predominante em gliomas. No entanto, a função de TAMs em gliomagênese permanece pouco compreendida e atualmente não se sabe se objetivação dessas células representa uma estratégia terapêutica viável. Na verdade, efeitos opostos sobre o crescimento de tumor têm sido reportados na literatura, em alguns casos mesmo onde uma estratégia experimental similar foi usada para depleção dos macrófagos no mesmo modelo de implante de glioma ortotópico. Em alguns estudos, TNF-α ou integrina β3 produzidos pelos TAMs foram implicados na supressão do crescimento de gliomas enquanto que, em outros relatórios, CCL2 e MT1-MMP foram propostos como agentes que aumentam o desenvolvimento e invasão tumoral.
[0007] Inibição de sinalização ao CSF-1R representa uma nova abordagem traducionalmente relevante que tem sido usada em vários contextos oncológicos, incluindo tumores ósseos intratibiais por xenoenxerto. No entanto, ainda não foi demonstrado que ela é eficaz em tumores cerebrais. Alguns cânceres cerebrais têm sido objetivados com compostos que afetam uma grande variedade de tipos de células que estão associadas ou suportam células tumorosas, em vez de objetivá-las diretamente. Por exemplo, é reportado que o PLX3397 coinibe três alvos (FMS, Kit e Flt3-ITD) e modula negativamente vários tipos
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4/84 de células, incluindo macrófagos, microglia, osteoclastos e mastócitos. O PLX3397 tem sido testado para o tratamento de linfoma de Hodgkin. No entanto, o linfoma de Hodgkin responde bem a vários agentes quimioterapêuticos, de acordo com a literatura referente ao PLX3397, enquanto que os tumores cerebrais são muito mais resistentes a agentes quimioterapêuticos e não têm sido tratados com sucesso. Conforme demonstrado aqui, um inibidor de CSF-1R não teve qualquer efeito direto sobre a proliferação de células de glioblastoma em cultura, no entanto, e que não reduzem o número de células de macrófagos em tumores de animais tratados. É, portanto, surpreendente que, conforme demonstrado aqui, um inibidor de CSF-1R possa inibir eficazmente o crescimento de tumores cerebrais in vivo, causar redução no volume do tumor em GBM em estágio avançado e mesmo aparentemente erradicar alguns glioblastomas.
SUMÁRIO DE MODALIDADES DA INVENÇÃO [0008] A presente invenção baseia-se na demonstração de que tumores cerebrais, particularmente glioblastoma, podem ser tratados com um inibidor de CSF-1R. Acredita-se que a eficácia dos inibidores de CSF-1R descritos aqui se deve à sua inibição de determinadas atividades de TAMs, embora não pareça reduzir significativamente o número de TAMs presentes e provavelmente é também uma função da capacidade demonstrada por estes compostos de penetrar na barreira hematoencefálica eficazmente em indivíduos com um tumor cerebral. Esses métodos fornecem novas opções terapêuticas muito necessárias para pacientes diagnosticados com tumores cerebrais, particularmente glioblastomas.
[0009] O Fator-1 de Estimulação de Colônia (Colony Stimulating
Factor-1 - CSF-1), também denominado Fator de Estimulação de Colônias de Macrófagos (Macrophage Colony Stimulating Factor - MCSF), sinaliza através de seu receptor CSF-1R (também conhecido
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5/84 como c-FMS) para regular a diferenciação, proliferação, recrutamento e sobrevivência de macrófagos. Foram desenvolvidos inibidores de pequenas moléculas de CSF-1R que bloqueiam a fosforilação do receptor competindo pela ligação ao ATP no sítio ativo, conforme para outros inibidores de quinase de tirosina de receptor. A presente invenção usa um inibidor de CSF-1R potente e seletivo que penetra a barreira hematoencefálica (Blood Brain Barrier - BBB) para bloquear a sinalização ao CSF-1R no glioma, conforme ilustrado no modelo de gluomagênese com camundongos RCAS-PDGF-B-HA/Mesf/n-7Va;Ink4a/Arf-/-. Este modelo de glioma geneticamente modificado é ideal para testagem pré-clínica como um modelo para GBM humano, uma vez que recapitula todas as características de GBM humano em um ambiente imunocompetente. Uma vez que se assemelha intimamente ao GBM humano e GBM pró-neural em particular, espera-se que a eficácia deste modelo se traduza em eficácia clínica sobre glioblastomas humanos, tais como glioblastoma multiforme e gliomas mistos.
[00010] A invenção pode ser praticada com qualquer inibidor de CSF-1R capaz de penetrar no cérebro. Alguns destes compostos são os compostos de benzoxazol e benzotiazol 6-O-substituídos descritos no documento WO2007/121484, em particular os compostos de Fórmulas IIa e IIb nesta referência e os compostos descritos aqui.
[00011] Em um aspecto, a invenção proporciona um método para o tratamento de um tumor cerebral em um mamífero compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I):
(I) em que R1 é um alquil pirazol ou uma alquil carboxamida; e R2 é uma hidroxicicloalquila;
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6/84 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00012] O método pode ser usado para tratar um paciente, muitas vezes um ser humano, que tenha sido diagnosticado com um tumor cerebral. Outras modalidades da invenção são descritas abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00013] A Figura 1A é um gráfico que mostra as quantidades relativas de células DAPI-positivas vivas em cérebro normal e tecido de glioblastoma, conforme medido pela proporção aumentada de células coradas positivamente para CD45 (marcador pan-leucocitário) e CD11b (marcador de células mielóides) no tecido do tumor. Os dados de triagem de células ativada por fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS) são mostrados também.
[00014] A Figura 1B representa células cerebrais coradas com CD68 de Tecido Cerebral Normal e de um glioblastoma de Grau IV e mostra a infiltração abundante de macrófagos no tecido do tumor. Vide Exemplo 1.
[00015] A Figura 1C representa o nível aumentado de mRNA de CD68, CSF-1R e CSF-1 em relação ao gene de Ubiquitina C (Ubc) de controle para tecido de GBM em relação ao tecido cerebral normal.
[00016] A Figura 1D mostra as quantidades relativas de CD11b,
TVA, CSF-1 e CSF-1R em TAMs em relação à células tumorosas.
[00017] A Figura 2 mostra valores de BLZ945 no plasma, tecido cerebral da metade esquerda de um cérebro contendo GBM e da metade direita do mesmo cérebro sem GBM visível em vários pontos de tempo após tratamento de grupos de camundongos com BLZ945.
[00018] A Figura 3A mostra a inibição, por BLZ945, de fosforilação de CSF-1R após estimulação com CSF-1 em células de macrófagos derivados de medula óssea (Bone Marrow Derived Macrophage BMDM).
[00019] A Figura 3B mostra a taxa de duplicação de população de
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7/84 células de BMDM não tratadas e demonstra que o tratamento das células com BLZ945 a 67 nM tem o mesmo efeito sobre esta taxa que a ausência de estimulação com CSF-1.
[00020] As Figuras 3C-3E mostram a taxa de proliferação de células de BMDM em camundongos lnk4a/Arf-/-, de células cerebrais de camundongos normais CRL-2647 e para duas culturas de células de GBM de camundongo.
[00021] A Figura 3F mostra que o número total e tamanho de neuroesferas não foram afetados por BLZ945 a 670 nM.
[00022] A Figura 4 mostra a sobrevida sem sintomas de camundongos RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tv-a;Ink4a/Aif/~ tratados com veículo apenas ou veículo + BLZ945. Vide Exemplo 4.
[00023] A Figura 4B representa o grau de tumor para camundongos tratados e não tratados no endpoint do estudo de 26 semanas. Todos os camundongos de controle tinham tumores de Grau III ou IV.
[00024] A Figura 5A mostra os dados do tamanho de tumor medido por MRI para animais tratados e de controle durante os primeiros 6 dias de tratamento com BLZ945.
[00025] A Figura 5B mostra o volume de tumor para camundongos de controle individuais (gráfico superior) e camundongos tratados (gráfico inferior) durante os primeiros 6 dias após dosagem com BLZ945 começar.
[00026] As Figuras 5C e 5D representam o volume de tumor medido por MRI em animais tratados com BLZ945 começando com tumores grandes (volume > 40 mm3) e mostram que, mesmo com grandes tumores, o volume do tumor diminuiu em quase todos os indivíduos.
[00027] A Figura 5-2 mostra dados sobre volume de tumor para animais individuais no grupo de controle para o Exemplo 5 (5-2A) e no grupo tratado (5-2B) e a Figura 5-2C mostra os dados do tamanho do tumor para indivíduos com tumores grandes tratados com BLZ945 no
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8/84
Exemplo 5.
[00028] Figura 6: O primeiro gráfico mostra a percentagem de células Olig2+ nos cérebros de animais no grupo tratado com veículo e grupos com 'Tumor Grande' no Exemplo 5. O segundo gráfico mostra a fração de células tumorosas que estavam em divisão ativa, conforme medido por marcação com bromodeoxiuridina (BrdU). O terceiro gráfico mostra o nível de apoptose nas células tumorosas, conforme medido por coloração com caspase 3 (CC3) e demonstra que BLZ945 promove a apoptose de células tumorosas.
[00029] A Figura 7A mostra as etapas usadas para separação por FACS de células para as análises de expressão gênica no Exemplo 7.
[00030] A Figura 7B mostra a assinatura do gene SVM para animais tratados e não tratados, a partir dos quais genes positiva e negativamente regulados pelo tratamento foram identificados.
[00031] As Figuras 7C-7E mostram a regulação positiva seletiva de genes M2-associados e alvos EGR2.
[00032] A Figura 8A mostra graficamente o grau de regulação positiva e relevância estatística usada para classificar genes diferencialmente expressos na assinatura do gene SVM.
[00033] A Figura 8B mostra a assinatura de regressão do 5-gene Lasso.
[00034] A Figura 8C mostra a previsão de assinatura do gene Lasso para tumores GBM pró-neurais no conjunto de dados por TCGA.
[00035] A Figura 8D mostra a previsão de assinatura do gene Lasso para tumores GBM pró-neurais no conjunto de dados combinados.
[00036] A Figura 8E mostra a previsão de assinatura do gene SVM para tumores GBM pró-neurais no conjunto de dados por TCGA.
[00037] A Figura 8F mostra a previsão de assinatura do gene SVM para tumores GBM pró-neurais no conjunto de dados combinados.
[00038] A Figura 8G representa as proporções de risco de assina
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9/84 tura do gene BLZ945 para os conjuntos de dados por TCGA e combinados para tumores GBM pró-neurais, clássicos, mesenquimais e neurais e destaca a correlação estatística com GBM pró-neural em todos os dados.
DESCRIÇÃO DETALHADA [00039] A invenção proporciona compostos de Fórmula (I) para uso no tratamento de tumores cerebrais e métodos de uso de compostos de Fórmula (I) para o tratamento de tumores cerebrais. Os compostos de Fórmula (I) têm esta Fórmula:
(I) em que R1 é um alquil pirazol ou uma alquil carboxamida; e R2 é uma hidroxicicloalquila;
e incluem os sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como compostos neutros desta Fórmula.
[00040] Os compostos específicos dentro do âmbito da invenção são ainda descritos abaixo.
[00041] O tratamento de um tumor cerebral pode incluir inibição da taxa de crescimento de um tumor cerebral (diminuição de crescimento de tumor) ou reversão de crescimento de um tumor cerebral (isto é, redução no volume do tumor) ou eliminação substancial do tumor, a qual foi demonstrada por meio de tratamento aqui de camundongo tendo tais tumores. Em particular, o tratamento pode diminuir a progressão ou reverter a progressão de um glioblastoma. Ele pode ser usado em conjunto com outros tratamentos, incluindo remoção da maior parte de um tumor cerebral, e pode ser usado para diminuir ou reverter a regeneração ou reduzir o volume ou massa de tecido tumoral residual após remoção do tumor cerebral através de métodos cirúrgicos ou biópsia. Os compostos também podem ser usados em conPetição 870190090036, de 11/09/2019, pág. 16/97
10/84 junto com outros agentes quimioterapêuticos.
[00042] Os compostos de Fórmula (I) incluem compostos em que R1 é uma pirazol alquila-substituída ou carboxamida, por exemplo, uma C1-C4 alquil pirazol ou uma carboxamida da Fórmula -C(O)NHR, onde R é um grupo C1-C4 alquila. Em modalidades preferidas, o grupo alquila é Me ou Et. Determinados compostos preferidos para uso na invenção são descritos abaixo. Em algumas modalidades desses métodos, R1 é
R' /
O ou , em que R' é Me ou Et. De preferência, o anel de pirazola é preso na posição 4, isto é:
R'
[00043] Nesses compostos, R2 pode ser um grupo hidroxiciclohexila tal como este:
HO ou um grupo 2-hidróxiciclopent-1-ila.
[00044] Compostos especificamente preferidos incluem qualquer um dos compostos a seguir ou uma mistura de quaisquer dois ou mais destes compostos ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um desses:
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(Ia);
(Ib);
(Ic);
MeHN
(Id);
(Ie);
ou
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(If).
[00045] Cada um desses compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis são modalidades preferidas para fins da presente invenção. Modalidades preferidas desses compostos também incluem compostos dessas Fórmulas:
onde R' é Me, Et ou Propila, de preferência metila. Modalidades específicas desses compostos podem ser de estereoquímica absoluta (R,R) ou estereoquímica absoluta (S,S).
[00046] Espera-se que estes compostos exibam penetração da barreira hematoencefálica similar ao BLZ945, com base em suas propriedades físico-químicas muito semelhantes e, portanto, são adequados para uso nos presentes métodos de tratamento.
[00047] Os compostos de Fórmula (I) são conhecidos na técnica e métodos para sua produção são descritos, por exemplo, no documento
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13/84
WO2007/121484; sua utilidade no tratamento de glioma e sua penetração da barreira hematoencefálica não eram conhecidas anteriormente. O composto (1c) corresponde ao BLZ945, o qual foi utilizado para testes in vitro e in vivo descritos aqui.
[00048] Compostos de Fórmula (Ih) tendo a estereoquímica (1S,2S) no anel de ciclo-hexila são novos. Estes compostos são inesperadamente bons inibidores de PDGFRp, ao mesmo tempo em que inibem o CSF-1R muito eficazmente (vide dados aqui). Consequentemente, os novos compostos desta Fórmula:
em que R' é Me, Et ou Propila, são outro aspecto da presente invenção que conferem um efeito inibidor duplo que espera-se que aumente a eficácia dos métodos de tratamento descritos aqui.
[00049] Os compostos podem ser usados individualmente ou eles podem ser formulados em uma composição farmacêutica que também contém pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável e frequentemente contém pelo menos dois excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Deverá ser entendido que os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são tipicamente esterilizados. Alguns excipientes adequados são descritos aqui; em algumas modalidades, o composto é formulado como uma composição compreendendo Captisol, por exemplo, Captisol a 20%.
[00050] Em algumas modalidades, o tumor cerebral é selecionado de uma metástase cerebral, um astrocitoma (incluindo glioblastoma), um oligodendroglioma, um ependimoma e um glioma misto. Em modalidades preferidas, o tumor cerebral é um glioma, particularmente
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14/84 glioblastoma multiforme. Em outras modalidades, o tumor cerebral é uma metástase cerebral, ou seja, um tumor metastático resultante de um câncer que teve origem em outro local no corpo.
[00051] Em algumas modalidades, o paciente é um que tem glioblastoma. Em modalidades específicas, o indivíduo é um diagnosticado com glioblastoma pró-neural. Vide Verhaak et al., Cancer Cell 17(1): 98-110 (2010). Este subtipo de glioblastoma tende a ocorrer em indivíduos mais novos e envolve mutações de TP53, IDH1 e PDGFRA. Verhaak et al. reportaram que pacientes com glioblastoma pró-neural eram menos sensíveis do que outros subtipos (clássico, neural, mesenquimal) às quimioterapias agressivas em uso em 2010 e sugeriram até mesmo que esse tratamento pode ser contra-indicado para estes pacientes. Os presentes métodos são especialmente eficazes para tratar glioblastoma pró-neural, conforme demonstrado pelo modelo animal de GBM pró-neural usado aqui. Constatou-se que assinaturas genéticas específicas encontradas em TAMs em camundongos tratados com BLZ945 coincidem com aquelas de pacientes com glioblastoma pró-neural humano que tinham tempos de sobrevida mediana mais longos; esta correlação não ocorreu quando comparado com pacientes com outros subtipos de glioblastoma. Assim, a informação de assinatura genética pode ser usada para selecionar pacientes para tratamento com um inibidor de CSF-1R conforme descrito aqui ou para avaliar o prognóstico de um indivíduo que está recebendo tais tratamentos.
[00052] Em algumas modalidades, o método é usado para tratar um indivíduo antes de outros métodos de tratamento, tal como remoção do tumor. Em outras modalidades, o método é usado para tratar um indivíduo em conjunto com outros métodos de tratamento, tal como remoção do tumor, quer através de métodos cirúrgicos ou biópsia, ou em conjunto com radioterapia ou em conjunto tanto com remoção do
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15/84 tumor quanto radioterapia.
[00053] Opcionalmente, outros agentes quimioterapêuticos podem ser usados juntamente com os compostos e métodos descritos acima. Agentes quimioterapêuticos adicionais adequados para uso nestes métodos são aqueles conhecidos na técnica como os convencionais para uso no tratamento de glioblastoma. Alguns desses agentes quimioterapêuticos incluem agentes antiangiogênicos, bevacizumab com ou sem irinotecan, nitrosoureias tal como carmustina (BCNU), platinas tal como cis-platina (cisplatina), agentes de alquilação tal como temozolomida, inibidores de quinase de tirosina (gefitinib ou erlotinib), Ucraína e canabinoides. Estes agentes terapêuticos adicionais (agentes coterapêuticos) podem ser usados simultaneamente com o inibidor de CSF-1R, tal como por meio de administração simultânea, mistura do agente coterapêutico com o inibidor de CSF-1R ou mediante administração sequencial. Uma modalidade preferida envolve o uso de um composto selecionado daqueles de Fórmula I descritos aqui (por exemplo, Fórmulas Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If, Ig ou Ih) em combinação com temozolomida ou um composto de platina.
[00054] Além disso, macrófagos foram implicados em respostas terapêuticas reduzidas em câncer de mama e revascularização aumentada em xenoenxertos de glioblastoma após radioterapia. Uma vez que estes efeitos dos macrófagos reduzem a eficácia de outras terapias, espera-se que os compostos da invenção, os quais inibem a atividade de macrófagos em glioblastoma in vivo, produzam um efeito sinergístico quando usados em combinação com outros agentes terapêuticos ou radioterapia.
[00055] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui são praticados com um composto de Fórmula (Ic). Em outras modalidades, os métodos podem ser praticados com um composto de Fórmula (I) que não é o composto de Fórmula (Ic), tal como as outras espécies
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16/84 descritas aqui.
[00056] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula (I) também inibe pelo menos um outro alvo para conferir efeitos antitumor aprimorados. Por exemplo, compostos dessas Fórmulas:
MeHN
(Id)
(If) também inibem o PDGFR em concentrações obtidas em dosagens terapêuticas típicas, tais como aquelas descritas aqui. Consequentemente, estes compostos podem ser usados onde um mecanismo de ação dupla é desejado e podem ser usados em qualquer um dos métodos descritos acima.
[00057] Compostos de Fórmula Ig e Ih exemplificativos são incluídos na tabela a seguir para ilustrar as atividades relativas sobre CSF1R e PDGFR. Muitos destes compostos são conhecidos na técnica; vide documento WO2007/066898 e métodos de produção destes compostos também são bem conhecidos. Os compostos de Fórmula I são bastante ativos sobre o CSF-1R, independentemente da estereoquímica no anel de ciclo-hexila, conforme mostrado na tabela abaixo. Dentre os vários isômeros, os isômeros S,S são também altamente ativos sobre PDGFR-β, bem como sobre CSF-1R e, assim, podem atuar em gliomas por meio de dois mecanismos para conferir maior
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17/84 eficácia.
(ig)
(Ih)
| Composto | R' | Estereoquímica | CSF-1R IC-50 (pM) | PDGFR-β IC-50 (pM) |
| Ig-A | Me | (1R,2R) | 0,001 | 5,9 |
| Ig-B | Et | (1R,2R) | 0,006 pM | 13,9 |
| Ig-C | Pr | (1R,2R) | 0,008 | 7,7 |
| Ig-D | Me | (1S,2S) | 0,0008 | 0,048 |
| Ig-E | Me | (1R,2S) | 0,006 | 6,6 |
| Ig-F | Me | (1S,2R) | 0,001 | 0,78 |
| Ih-A | Me | (1R,2R) | 0,0009 | 0,74 |
| Ih-B | Et | (1R,2R) | 0,003 | 1,7 |
| Ih-C | Pr | (1R,2R) | 0,007 | 1,5 |
| Ih-D | Me | (1S,2S) | 0,001 | 0,02 |
| Ih-E | Me | (1S,2R) | 0,002 | 0,63 |
[00058] As modalidades enumeradas a seguir são representativas da invenção:
1. Um método para tratar um tumor cerebral em um mamífero compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I):
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(I) em que R1 é uma alquil pirazola ou uma alquil carboxamida; e
R2 é uma hidroxicicloalquila;
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. O método de acordo com a modalidade 1, em que R1 é
ou em que R' é Me ou Et.
3. O método de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que
R2 é
4. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o tumor cerebral é um glioma, de preferência glioblastoma pró-neural.
5. O método de acordo com a modalidade 4, em que o glioma é glioblastoma multiforme.
6. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1-3, em que o tumor cerebral é uma metástase cerebral, astrocitoma (incluindo glioblastoma), oligodendroglioma, ependimoma ou um glioma misto.
7. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o composto de Fórmula (I) é:
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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;
ou um estereoisômero isolado de um destes.
8. O método de acordo com a modalidade 7, em que o composto de Fórmula (I) é:
MeHN
9. O método de acordo com a modalidade
7, em que composto de Fórmula (I) é:
O
MeHN
S
OH
10. O método de acordo com a modalidade 7, em que o composto de Fórmula (I) é:
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11. O método de acordo com a modalidade 7, em que o composto de Fórmula (I) é:
12. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o método compreende ainda administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico contra o câncer adicional, tais como agentes antiangiogênicos, bevacizumab com ou sem irinotecan, nitrosoureias tal como carmustina (BCNU), platinas tal como c/s-platina (cisplatina), agentes de alquilação tal como temozolomida, inibidores de quinase de tirosina (gefitinib ou erlotinib), Ucraína e canabinoides.
13. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o composto de Fórmula (I) é administrado por via oral.
14. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a quantidade do composto de Fórmula (I) administrada ao indivíduo varia entre cerca de 50 mg/kg por dia e cerca de 500 mg/kg por dia ou entre 5-500 mg/kg ou entre 100 e 300 mg/kg por dia.
15. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o indivíduo tem glioblastoma pró-neural.
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16. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o indivíduo é um selecionado por ter um elevado nível de sinalização ao PDGF ou PDGFR.
17. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o indivíduo é tratado simultaneamente com um inibidor de PDGFR ou é tratado com um inibidor de CSF-1R tendo atividade sub-nanomolar como um inibidor de PDGFR, por exemplo, o composto (Id) ou (If).
18. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o indivíduo é um ser humano.
19. Um composto de acordo com a modalidade 1, para uso no tratamento de um tumor cerebral.
20. O composto de acordo com a modalidade 19, em que o tumor cerebral é glioblastoma.
21. O composto de acordo com a modalidade 20, em que o glioblastoma é glioblastoma pró-neural.
22. O composto de acordo com a modalidade 20, o qual é formulado para uso com um agente coterapêutico.
23. Um composto da Fórmula:
onde R' é Me, Et ou Propila.
24. O composto de acordo com a modalidade 23, em que R' é Me.
25. Uma composição farmacêutica compreendendo o composto de acordo com a modalidade 23 ou 24 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
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22/84 [00059] Conforme usado aqui, os termos sal ou sais se refere a um sal de adição de ácido ou sal de adição de base de um composto da invenção. Sais inclui, em particular, sais farmaceuticamente aceitáveis. O termo sais farmaceuticamente aceitáveis se refere a sais que retêm a eficácia e as propriedades biológicas dos compostos da presente invenção e, tipicamente, não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis.
[00060] Os sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados com ácidos inorgânicos e ácidos orgânicos, por exemplo, os sais acetato, aspartato, benzoato, besilato, brometo/bromidrato, bicarbonato/carbonato, bissulfato/sulfato, cânforsulfonato, cloreto de metileno/cloridrato, clorteofilonato, citrato, etandissulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, iodidrato/iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, lauril-sulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metil-sulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/difosfato, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, sulfo-salicilato, tartarato, tosilato e trifluoroacetato.
[00061] Os ácidos inorgânicos dos quais sais podem ser derivados incluem, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares.
[00062] Ácidos orgânicos dos quais os sais podem ser derivados incluem, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido mandélico, ácido metano-sulfônico, ácido etano-sulfônico, ácido toluenosulfônico, ácido sulfo-salicílico e similares. Os sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados com bases inorgânicas e orgânicas.
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23/84 [00063] Bases inorgânicas das quais os sais podem ser derivados incluem, por exemplo, sais de amônio e metais das colunas I a XII da tabela periódica. Em determinadas modalidades, os sais são derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, prata, zinco e cobre e, mais particularmente, sais adequados incluem sais de amônio, potássio, sódio, cálcio e magnésio.
[00064] Bases orgânicas das quais os sais podem ser derivados incluem, por exemplo, aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas que ocorrem naturalmente, aminas cíclicas, resinas de permuta iônica básicas e similares. Determinadas aminas orgânicas incluem isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina e trometamina.
[00065] Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser preparados por meio de métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados reagindo as formas de ácido livre destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base apropriada (tal como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg ou K ou similares) ou reagindo as formas de base livre destes compostos com uma quantidade estequiométrica do ácido apropriado. Estas reações são tipicamente realizadas em água ou em um solvente orgânico ou em uma mistura dos dois. Geralmente, o uso de meios não aquosos, tais como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila, é desejável sempre que possível. Listas de sais adequados adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em REMINGTON'S Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); e em Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use por Stahl e Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemanha, 2002).
[00066] Qualquer Fórmula fornecida aqui se destina a representar
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24/84 formas não marcadas, bem como as formas isotopicamente marcadas dos compostos. Compostos isotopicamente relacionados têm estruturas representadas pelas Fórmulas indicadas aqui, exceto que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa selecionado. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36Cl, 125I, respectivamente. Em modalidades preferidas, os compostos da invenção não são marcados, isto é, eles compreendem aproximadamente abundâncias de isótopos naturais para todos os átomos. Em outras modalidades, os compostos da invenção são marcadas por meio de incorporação seletiva de um isótopo não natural enriquecido por um átomo no composto de Fórmula (I). A invenção inclui diversos compostos isotopicamente marcados, conforme definido aqui, por exemplo, aqueles nos quais isótopos radioativos, tais como 3H e 14C, ou aqueles nos quais isótopos não radioativos, tais como 2H e 13C estão presentes. Tais compostos isotopicamente marcados são úteis em estudos metabólicos (com 14C), estudos de cinética de reação (por exemplo, com 2H ou 3H), detecção e técnicas de imagiologia, tal como tomografia por emissão de positrons (Positron Emission Tomography - PET) ou tomografia computadorizada por emissão de um único fóton (Single-Photon Emission Computed Tomography - SPECT) incluindo ensaios de distribuição tecidual de substrato ou fármaco ou no tratamento radioativo de pacientes. Em particular, um composto 18F ou marcado pode ser particularmente desejável para estudos de PET ou SPECT. Os compostos isotopicamente marcados de Fórmula (I) podem, em geral, ser preparados por meio de técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica levando em conta a descrição de síntese dos compostos de Fórmula I, por exemplo, Publicação de Patente dos Es
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25/84 tados Unidos N° US2008/0045528 (WO2007/121484). BLZ945 é descrito nesta referência, bem como vários de seus isômeros. Exemplos 173 e 174 nesta referência descrevem a síntese de composto de pirazola (Ie) usando 1R,2R-aminociclo-hexanol e pode ser adaptado à síntese de outros compostos de pirazola de Fórmula I, marcados e não marcados. A mesma publicação, na página 163, descreve a síntese de 1R,2R- e 1S,2S-aminociclo-hexanol, o qual pode ser prontamente substituído no método do Exemplo 173 para produzir (If) e outros compostos de Fórmula I, marcados e não marcados.
[00067] Além disso, a substituição com isótopos mais pesados, em particular (isto é, deutério, 2H ou D) pode produzir determinadas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida aumentada in vivo ou requisitos de dosagem reduzida ou um aprimoramento no índice terapêutico. Deverá ser entendido que, neste contexto, o deutério é considerado como um substituinte de um composto de Fórmula (I). A concentração de um tal isótopo mais pesado, mais especificamente deutério, pode ser definida pelo fator de enriquecimento isotópico. O termo fator de enriquecimento isotópico, conforme usado aqui, significa a proporção entre a abundância isotópica e a abundância natural de um isótopo especificado. Se um substituinte em um composto da presente invenção é denotado deutério, tal composto tem um fator de enriquecimento isotópico para cada átomo de deutério designada de pelo menos 3500 (52,5% de incorporação de deutério em cada átomo de deutério designado), pelo menos 4000 (incorporação de deutério de 60%), pelo menos 4500 (incorporação de deutério de 67,5%), pelo menos 5000 (incorporação de deutério de 75%), pelo menos 5500 (incorporação de deutério de 82,5%), pelo menos 6000 (incorporação de deutério de 90%), pelo menos 6333,3 (incorporação de deutério de 95%), pelo menos 6466,7 (incorporação de deutério de 97%), pelo menos 6600 (incorporação de deutério de
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99%) ou pelo menos 6633,3 (incorporação de deutério de 99,5%). [00068] Conforme usado aqui, o termo excipientes farmaceuticamente aceitáveis inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção, sais, conservantes, estabilizantes de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes e similares e combinações dos mesmos, como seria conhecido por aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, páginas 1289- 1329). Exceto à medida que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é considerado.
[00069] O termo quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção se refere a uma quantidade do composto da presente invenção que estimulará a resposta biológica ou médica de um indivíduo, por exemplo, redução ou inibição de uma atividade de enzima ou proteína ou melhorar sintomas, aliviar condições, diminuir ou retardar a progressão da doença ou prevenir uma doença, etc. Em uma modalidade não limitativa, o termo uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade do composto da presente invenção que, quando administrada a um indivíduo, é eficaz para: (1) aliviar, inibir, prevenir e/ou melhorar pelo menos parcialmente uma condição ou um distúrbio ou uma doença (i) mediada por CSF-1R ou (ii) relacionada à atividade de CSF-1R ou (iii) caracterizada por atividade (normal ou anormal) de CSF-1R ou (2) reduzir ou inibir a atividade de CSF-1R ou (3) reduzir ou inibir a expressão de CSF-1R. Em outra modalidade não limitativa, o termo uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade do composto da presente inven
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27/84 ção que, quando administrada a uma célula ou um tecido ou um material biológico não celular ou um meio é eficaz para reduzir ou inibir pelo menos parcialmente a atividade de CSF-1R ou reduzir ou inibir pelo menos parcialmente a expressão de CSF-1R. O significado do termo uma quantidade terapeuticamente eficaz, conforme ilustrado na modalidade acima para CSF-1R, também se aplica similarmente a quaisquer outros peptídeos/proteínas/enzimas relevantes, tal como PDGFR e similares.
[00070] Conforme usado aqui, o termo indivíduo se refere a um animal. Tipicamente, o animal é um mamífero. Um indivíduo se refere também, por exemplo, a primatas (por exemplo, seres humanos, homens ou mulheres), vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, coelhos, ratos, camundongos, peixes, aves e similares. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um primata. Em modalidades preferidas, o indivíduo é um ser humano.
[00071] Conforme usado aqui, o termo inibir ou inibição se refere à redução ou supressão de uma determinada condição, sintoma ou distúrbio, ou doença, ou uma diminuição significativa na atividade de linha de base de uma atividade ou processo biológico.
[00072] Conforme usado aqui, o termo tratar, tratando ou tratamento de uma doença ou distúrbio se refere, em uma modalidade, à melhora doença ou distúrbio (ou seja, retardar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença, ou pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma). Em outra modalidade, tratar , tratando ou tratamento se refere ao alívio ou melhora de pelo menos um parâmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser perceptíveis pelo paciente. Em ainda outra modalidade, tratar, tratando ou tratamento se refere à modulação da doença ou distúrbio, quer fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma perceptível), fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em
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28/84 ainda outra modalidade, tratar, tratando ou tratamento se refere à prevenção ou retardo do aparecimento ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio. Em referência a um tumor cerebral, tratamento inclui, tipicamente, a taxa de retardo de crescimento de um tumor ou regeneração de um tumor após a massa do tumor ser removida ou redução do tamanho do tumor ou restos de tumor após a massa do tumor ser removida.
[00073] Conforme usado aqui, um indivíduo que precisa de tal tratamento, é um que se beneficiará biologicamente, clinicamente ou na qualidade de vida de tal tratamento. Normalmente, o indivíduo foi diagnosticado com um tumor cerebral, muitas vezes uma forma de glioblastoma e, de preferência, com glioblastoma multiforme.
[00074] Conforme usado aqui, os termos um, uma, o, a e similares usados no contexto da presente invenção (especialmente no contexto das reivindicações), devem ser entendidos como abrangendo o singular e plural, a menos que de outro modo aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto.
[00075] Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos ou linguagem exemplificativa (por exemplo, tal como) fornecido aqui visa apenas explicar melhor a invenção e não constitui uma limitação do âmbito da invenção de outro modo reivindicada.
[00076] Em algumas modalidades, a presente invenção usa uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada para vias de administração particulares, tais como administração oral, administração parenteral e administração retal, etc. Além disso, as composições farmacêuti
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29/84 cas da presente invenção podem ser feitas em uma forma sólida (incluindo, sem limitação, cápsulas, comprimidos, pílulas, grânulos, pós ou supositórios) ou uma forma líquida (incluindo, sem limitação, soluções, suspensões ou emulsões). As composições farmacêuticas podem ser submetidas às operações farmacêuticas convencionais tal como esterilização e/ou podem conter diluentes inertes, agentes lubrificantes ou agentes de tamponamento convencionais, bem como adjuvantes, tais como conservantes, estabilizantes, agentes de umedecimento, emulsificantes e tampões, etc.
[00077] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos um agente quimioterapêutico adicional, tal como temozolomida, em uma quantidade eficaz.
[00078] Tipicamente, as composições farmacêuticas são comprimidos ou cápsulas de gelatina compreendendo o ingrediente ativo juntamente com pelo menos um excipiente, tal como Captisol (usado nos exemplos aqui) ou um dos seguintes:
a) diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina;
b) lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicol; para comprimidos também
c) ligantes, por exemplo, silicato de magnésio e alumínio, pasta de amido, gelatina, tragacanto, metil celulose, carbóxi metil celulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona e, se desejado:
d) veículos, tal como um veículo aquoso contendo um material co-solvatação, tal como Captisol, PEG, glicerina, ciclodextrina ou similares;
e) agentes de desintegração, por exemplo, amidos, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio ou misturas efervescentes; e/ou
f) absorventes, corantes, aromatizantes e edulcorantes.
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30/84 [00079] Os comprimidos podem ser revestidos com filme ou com um revestimento entérico de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[00080] De preferência, o composto ou composição é preparado para administração oral, tal como um comprimido ou cápsula, por exemplo, ou como uma solução ou suspensão do composto de Fórmula (I), opcionalmente embalada em um recipiente de dose unitária, tal como uma cápsula.
[00081] Composições adequadas para administração oral incluem uma quantidade eficaz de um composto da invenção na forma de comprimidos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersíveis, emulsões, cápsulas duras ou moles ou xaropes ou elixires. As composições destinadas a uso oral são preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes e agentes conservantes, a fim de proporcionar preparados farmaceuticamente elegantes e saborosos. Comprimidos podem conter o ingrediente ativo em mistura com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis que sejam adequados para a fabricação de comprimidos. Estes excipientes são, por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio, agentes de granulação e desintegração, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico, agentes aglutinantes, por exemplo, amido, gelatina ou acácia, e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos são não revestidos ou revestidos por meio de técnicas conhecidas para atrasar a desintegração e absorção no trato gastrintestinal e, assim, conferir uma ação sustentada durante um período mais longo. Por exemplo, um material de retardo,
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31/84 tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, pode ser empregado. As formulações para uso oral podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura nas quais o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou como cápsulas de gelatina mole nas quais o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva. [00082] Em algumas modalidades, o composto ou composição é preparado para ser administrado por injeção. Determinadas composições injetáveis são soluções ou suspensões isotônicas aquosas e supositórios são, vantajosamente, preparados a partir de emulsões ou suspensões gordurosas. As referidas composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, estabilizantes, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, elas podem também conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As referidas composições são preparadas de acordo com métodos de mistura, granulação ou revestimento convencionais, respectivamente, e contêm cerca de 0,1-75% ou contêm cerca de 1-50% do ingrediente ativo.
[00083] Em algumas modalidades, o composto ou composição é preparado para ser administrado topicamente. Composições adequadas para aplicação transdérmica incluem uma quantidade eficaz de um composto da invenção com um veículo adequado. Veículos adequados para administração transdérmica incluem solventes absorvíveis farmacologicamente aceitáveis para auxiliar na passagem através da pele do hospedeiro. Por exemplo, dispositivos transdérmicos estão na forma de uma bandagem compreendendo um elemento de suporte, um reservatório contendo o composto opcionalmente com veículos, opcionalmente uma barreira de controle de taxa para distribuição do
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32/84 composto à pele do hospedeiro em uma taxa controlada e predeterminada ao longo de um período de tempo prolongado e meios para prender o dispositivo à pele.
[00084] Composições apropriadas para aplicação tópica, por exemplo, à pele e aos olhos, incluem soluções aquosas, suspensões, pomadas, cremes, géis ou formulações pulverizáveis, por exemplo, para distribuição por aerossol ou similar. Tais sistemas de distribuição tópica serão, em particular, adequados para aplicação dérmica, por exemplo, para o tratamento de câncer da pele, por exemplo, para uso profilático em protetores solares, loções, sprays e similares. Eles são, portanto, particularmente adequados para uso em formulações tópicas, incluindo cosméticas, bem conhecidas na técnica. Esta pode conter solubilizantes, estabilizantes, agentes para intensificação de tonicidade, tampões e conservantes.
[00085] Conforme usado aqui, uma aplicação tópica pode também referir-se a uma inalação ou uma aplicação intranasal. Elas podem, convenientemente, ser apresentadas na forma de um pó seco (quer isoladamente, como uma mistura, por exemplo, uma mistura seca com lactose, ou como uma partícula de componente misto, por exemplo, com fosfolipídios) a partir de um inalador de pó seco ou uma apresentação de spray em aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador, atomizador ou nebulizador, com ou sem o uso de um propulsor adequado.
[00086] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz do composto de Fórmula (I) está entre cerca de 10 mg/kg por dia e cerca de 500 mg/kg por dia. Em modalidades particulares, a quantidade eficaz está entre cerca de 25 mg/kg por dia e cerca de 300 mg/kg por dia, tal como cerca de 100 a cerca de 250 mg/kg por dia. A dosagem pode ser administrada em 1-4 doses por dia ou pode ser administrada em dias alternados. Em uma modalidade preferida, a dosagem é de cerca de
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200 mg/kg por dia e é administrada em uma ou duas doses orais por dia.
[00087] A presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem que compreendem os compostos da presente invenção como ingredientes ativos, uma vez que a água pode facilitar a degradação de alguns compostos.
[00088] Composições farmacêuticas e formas de dosagem anidras da invenção podem ser preparadas usando ingredientes anidros ou contendo baixa umidade e condições de baixa umidade. Uma composição farmacêutica anidra pode ser preparada e armazenada de tal forma que sua natureza anidra seja mantida. Assim, as composições anidras são embaladas usando materiais conhecidos por prevenir a exposição à água, de modo que elas possam ser incluídas em kits de formulação adequados. Exemplos de embalagens adequadas incluem, porém sem limitações, folhas hermeticamente seladas, plásticos, recipientes de doses unitárias (por exemplo, frascos), embalagens bolha e embalagens em tiras.
[00089] A invenção proporciona ainda composições farmacêuticas e formas de dosagem que compreendem um ou mais agentes que reduzem a taxa na qual o composto da presente invenção, como um ingrediente ativo, se decomporá. Tais agentes, os quais são referidos aqui como estabilizantes incluem, porém sem limitações, antioxidantes tal como ácido ascórbico, tampões de pH ou tampões salinos, etc.
[00090] Os compostos e métodos descritos aqui são úteis para tratar uma variedade de tumores cerebrais com base em sua capacidade demonstrada de penetrar a barreira hematoencefálica e inibir o acúmulo de TAMs e/ou em torno de um tumor cerebral. Em algumas modalidades, o tumor cerebral é uma metástase de um câncer que teve origem em outro local do corpo. Em outras modalidades, o tumor cerebral é um glioma, tal como glioblastoma multiforme.
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34/84 [00091] Os compostos de Fórmula I, na forma livre ou na forma de sal, apresentam propriedades farmacológicas valiosas, por exemplo, propriedades de modulação de CSF-1R e opcionalmente PDGFR, por exemplo, conforme indicado em testes in vitro e in vivo, conforme previsto nas seções a seguir e, portanto, são indicados para terapia.
[00092] Assim, como uma outra modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um composto de Fórmula (I) em terapia. Em uma outra modalidade, a terapia é selecionada para uma doença que possa ser tratada por meio de inibição de CSF-1R. Em outra modalidade, a doença é selecionada da lista mencionada acima, adequadamente qualquer tumor cerebral, mais apropriadamente um glioblastoma, tal como glioblastoma multiforme.
[00093] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de tratamento de uma doença que é tratada por meio de inibição de CSF-1R compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável de um composto de Fórmula (I) ou qualquer uma das modalidades destes compostos descritas aqui. Em uma outra modalidade, a doença é selecionada da lista mencionada acima, adequadamente um tumor cerebral, tal como um glioma, especificamente incluindo glioblastoma multiforme.
[00094] A composição farmacêutica ou combinação da presente invenção pode estar em unidade de dosagem de cerca de 1-1000 mg de ingrediente(s) ativo(s) para um indivíduo de cerca de 50-70 kg ou cerca de 1-500 mg ou cerca de 1-250 mg ou cerca 1-150 mg ou cerca de 0,5-100 mg ou cerca de 1-50 mg de ingredientes ativos. A dosagem terapeuticamente eficaz de um composto, composição farmacêutica ou combinações das mesmas é dependente da espécie do indivíduo, peso corporal, idade e condição individual, o distúrbio ou doença que está sendo tratada ou a gravidade da mesma. Um médico, clínico ou veterinário pode determinar facilmente a quantidade eficaz de cada um
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35/84 dos ingredientes ativos necessários para tratar ou inibir a progressão do distúrbio ou doença com base na presente descrição.
[00095] As propriedades de dosagem citadas acima são demonstráveis em testes in vitro e in vivo usando vantajosamente mamíferos, por exemplo, camundongos, ratos, cães, macacos ou órgãos isolados, tecidos e preparados dos mesmos. Os compostos da presente invenção podem ser aplicados in vitro na forma de soluções, por exemplo, soluções aquosas, e in vivo entericamente, parenteralmente, vantajosamente intravenosamente, por exemplo, como uma suspensão ou em solução aquosa. A dosagem in vitro pode variar entre concentrações de cerca de 10-3 molar e 10-9 molar. Uma quantidade terapeuticamente eficaz in vivo pode variar, dependendo da via de administração, entre cerca de 0,1-500 mg/kg, tipicamente 10-400 mg/kg ou entre cerca de 100-300 mg/kg ou entre 1-100 mg/kg. Em algumas modalidades, uma dose de cerca de 200 mg/kg é adequada para o tratamento de glioblastoma e pode ser administrada por via oral.
[00096] A atividade de um composto de acordo com a presente invenção pode ser avaliada pelos métodos in vitro e in vivo a seguir.
[00097] Usando os métodos de ensaio descritos no documento US20080045528, pode ser mostrado que os compostos da invenção inibem o CSF-1R. Conforme descrito aqui, estes compostos atravessam facilmente a barreira hematoencefálica e também inibem ou revertem o crescimento de um tumor cerebral. De preferência, o tumor é detectado através de métodos conhecidos e a progressão de tratamento pode ser monitorada por meio de métodos conhecidos. Em algumas modalidades, a progressão de tratamento é monitorada usando imagiologia por ressonância magnética (Magnetic Resonance Imaging - MRI) para determinar o tamanho do tumor e quaisquer metástases.
[00098] O composto da presente invenção pode ser administrado simultaneamente com ou antes ou após um ou mais outros agentes
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36/84 terapêuticos, tais como os agentes coterapêuticos descritos aqui. O composto da presente invenção pode ser administrado separadamente, pela mesma ou uma via de administração diferente ou em conjunto na mesma composição farmacêutica que os outros agentes.
[00099] Em uma modalidade, a invenção proporciona um produto que compreende um composto de Fórmula (I) e pelo menos um outro agente terapêutico como um preparado combinado para uso simultâneo, separado ou sequencial em terapia. Em uma modalidade, a terapia é o tratamento de uma doença ou condição mediada por inibição de CSF-1R. Produtos fornecidos como um preparado combinado incluem uma composição compreendendo o composto de Fórmula (I) e outro(s) agente(s) terapêutico(s) em conjunto na mesma composição farmacêutica ou o composto de Fórmula (I) e outro(s) agente(s) terapêutico(s) em uma forma distinta, por exemplo, na forma de um kit.
[000100] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula (I) e outro(s) agente(s) terapêutico(s). Opcionalmente, a composição farmacêutica pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, conforme descrito acima, ou mais de um de tais agentes coterapêuticos.
[000101] Em uma modalidade, a invenção proporciona um kit que compreende duas ou mais composições farmacêuticas distintas, em que pelo menos uma contém um composto de Fórmula (I). Em uma modalidade, o kit compreende meios para reter separadamente as referidas composições, tais como um recipiente, garrafa dividida ou embalagem de folha dividida. Um exemplo de tal kit é a embalagem de bolha, conforme é tipicamente usado para acondicionar comprimidos, cápsulas e similares.
[000102] O kit da invenção pode ser usado para administrar diferentes formas de dosagem, por exemplo, oral e parenteral, para adminis
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37/84 tração das composições distintas em diferentes intervalos de dosagem, ou por meio de titulação das composições distintas uma contra a outra. Para auxiliar no cumprimento, o kit da invenção compreende, tipicamente, instruções para administração.
[000103] Nas terapias combinadas da invenção, o composto da invenção e o outro agente terapêutico podem ser fabricados e/ou formulados pelos mesmos ou por diferentes fabricantes. Além disso, o composto da invenção e o outro agente terapêutico podem ser reunidos em uma terapia combinada: (i) antes de liberação do produto combinado para os médicos (por exemplo, no caso de um kit que compreende o composto da invenção e o outro terapêutico agente), (ii) pelo médico si (ou sob a orientação do médico) pouco antes de administração, (iii) no próprio paciente, por exemplo, durante a administração sequencial do composto da invenção e outro agente terapêutico.
[000104] Consequentemente, a invenção proporciona o uso de um composto de Fórmula (I) para o tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o medicamento é preparado para administração com outro agente terapêutico, incluindo um dos agentes quimioterapêuticos adicionais descritos aqui como adequados para uso em combinação com compostos de Fórmula I. A invenção também proporciona o uso de outro agente terapêutico para o tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o medicamento é administrado com um composto de Fórmula (I).
[000105] A invenção também proporciona um composto de Fórmula (I) para uso em um método de tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o composto de Fórmula (I) é preparado para administração com outro agente terapêutico. A invenção proporciona também outro agente terapêutico para uso em um método de tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o outro agente terapêutico é preparado para administração de um
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38/84 composto de Fórmula (I). A invenção também proporciona um composto de Fórmula (I) para uso em um método de tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o composto de Fórmula (I) é administrado com outro agente terapêutico. A invenção proporciona também um outro agente terapêutico para uso em um método de tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o outro agente terapêutico é administrado com um composto de Fórmula (I).
[000106] A invenção também proporciona o uso de um composto de Fórmula (I) para o tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o paciente foi anteriormente (por exemplo, dentro de 24 horas) tratado com outro agente terapêutico. A invenção também proporciona o uso de outro agente terapêutico para o tratamento de uma doença ou condição mediada por CSF-1R, em que o paciente foi anteriormente (por exemplo, dentro de 24 horas) tratado com um composto de Fórmula (I).
[000107] Em uma modalidade, o outro agente terapêutico é selecionado de um agente de antiangiogênico, bevacizumab com ou sem irinotecan, nitrosoureias tal como carmustina (BCNU), platinas tal como c/s-platina (cisplatina), agentes de alquilação tal como temozolomida, inibidores de quinase de tirosina (gefitinib ou erlotinib), Ucraína e canabinoides. Em algumas modalidades, o outro agente é um agente coterapêutico selecionado de: um composto antiangiogênico, um canabinoide e temozolomida.
[000108] Combinações específicas individuais que podem oferecer benefícios especiais de tratamento incluem composto Ia, Ib, Ic, Id, Ie, Id, Ig ou Ih em combinação com temozolomida. Esta combinação pode ser administrada por via oral, conforme descrito aqui para o tratamento de diversos tipos de tumores cerebrais, tal como glioblastoma multiforme.
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39/84 [000109] Além dos métodos de tratamento, compostos e composições farmacêuticas, determinadas alterações de assinatura gênica associada à eficácia dos compostos de CSF-1R para o tratamento de GBM também foram identificados. Os Exemplos a seguir fornecem informações sobre estas alterações e identificam assinaturas ou biomarcadores gênicos que podem ser usados em conjunto com os métodos de tratamento descritos aqui. Conforme será evidente para aqueles versados na técnica, os dados de assinatura Lasso e assinatura SVM fornecidos aqui podem ser usados na determinação de um prognóstico para um paciente tratado com esses métodos obtendo uma amostra do paciente e comparando os dados de expressão gênica para a amostra contra as alterações na expressão gênica e assinaturas descritas aqui como se correlacionando a um bom prognóstico e/ou sobrevida prolongada.
EXEMPLOS [000110] Os compostos da invenção foram preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica, particularmente aqueles descritos no documento WO2007/121484.
[000111] Os compostos e/ou intermediários foram caracterizados por cromatografia de líquido de alto desempenho (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) usando um sistema de cromatografia Waters Millenium com um Módulo de Separação 2695 (Milford, MA). As colunas analíticas foram Phenomenex Luna de fase reversa C18-5 μ, 4,6 x 50 mm da Alltech (Deerfield, IL). Um gradiente de eluição foi usado (fluxo de 2,5 mL/min), tipicamente começando com 5% de acetonitrilo/95% de água e progredindo para 100% de acetonitrilo ao longo de um período de 10 minutos. Todos os solventes continham ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA). Os compostos foram detectados por meio de absorção de luz ultravioleta (UV) a 220 ou 254 nm. Os solventes de HPLC eram da Burdick and Jackson (Muskegan, MI) ou Fisher
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Scientific (Pittsburgh, PA).
[000112] Análise por espectrometria de massa foi realizada em um de dois instrumentos de LCMS: um sistema Waters (um espectrômetro de massa Alliance HT HPLC ou um Micromass ZQ; Coluna: Eclipse XDB C18, 2,1 x 50 mm; gradiente: 5-95% (ou 35-95% ou 65-95% ou 95-95%) de acetonitrilo em água com TFA a 0,05% ao longo de um período de 4 min, taxa de fluxo de 0,8 mL/min, faixa de peso molecular de 200-1500; Tensão de cone de 20 V, temperatura da coluna de 40 °C) ou um sistema Hewlett Packard (HPLC Série 1100; coluna: Eclipse XDB C18, 2,1 x 50 mm, gradiente: 95-5% de acetonitrilo em água com TFA a 0,05% ao longo de um período de 4 min, taxa de fluxo de 0,8 mL/min, faixa de peso molecular de 150-850; Tensão de cone de50 V, temperatura da coluna de 30 ° C). Todas as massas foram reportadas como aquelas dos íons parentais protonados.
[000113] Dados analíticos para o Composto (If): tempo de retenção por HPLC: 1,93 min. Íon molecular (MH+): m/z = 422,1 (LC/MS RT = 0,50 min).
Exemplo 1: Números de macrófagos são aumentados em um modelo de gliomagênese com camundongo comaprado com cérebro normal [000114] Este exemplo demonstrou a contribuição de macrófagos associados a tumor (Tumor-Associated Macrophages - TAMs) para a gliomagênese no modelo de camundongos RCAS-PDGF-B-HA/NestinTv-a;Ink4a/Arf-/-. Nestes camundongos, quando o desenvolvimento do tumor é induzido em adultos, a grande maioria de lesões que se desenvolvem são glioblastoma multiforme (GlioBlastoma Multiforme GBM) de alto grau o qual, histologicamente, se assemelha ao GBM humano. Figura 1. (A) Cérebro/prosencéfalo de camundongos NestinTv-a;Ink4a/Arf-/- não injetados (cérebro normal) ou tumores de grau IV (GBM) de camundongos RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/-
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41/84 sintomáticos (PDG); os camundongos foram em uma suspensão de uma única célula com papaína por citometria de fluxo (n = 5 cada). Houve um aumento significativo nos leucócitos CD45+, de 3,6 ± 0,6% para 13,1 ± 2,0%. Células mieloides CD11b+/macrófagos representavam a esmagadora maioria dos leucócitos (89,9-98,5% das células CD45+), com um aumento de 3,8 vezes nas células CD45+ CD11b+ nos tumores (12,7 ± 2,0%) em comparação com cérebro normal (3,3 ± 0,5%) e não houve diferenças nas populações de células CD11b CD45+. (B) Cérebro normal ou seções teciduais de GBM de camundongos PDG sintomáticos foram co-coradas por imunofluorescência para CSF-1R, CD68 (macrófagos) e DAPI. (C) Cérebro normal e tumores GBM (n = 3 cada) foram usados para isolamento de RNA, síntese de cDNA e qPCR. Os ensaios foram realizados em triplicata e a expressão normalizada para ubiquitina C (UBC) para cada amostra. A expressão é descrita em relação àquela do cérebro normal. (D) Cérebro normal ou seções teciduais de GBM de camundongos PDG sintomáticos foram coradas para CSF-1R em combinação com os marcadores de macrófagos F4/80 e CD11b, bem como F4/80, CD11b, CD68 e em combinação com Iba-1 (macrófagos/microglia). DAPI foi usado para contracoloração nuclear. Barra de escala, 50 μm. Os dados são apresentados como a média ± SEM. Os P valores foram obtidos usando o t-teste de Student não emparelhado duplamente configurado, * P < 0,05, ** P < 0,01.
[000115] Os números de células de macrófagos eram substancialmente mais elevados em tecido de GMB em relação ao cérebro normal, conforme mostrado por coloração com o anticorpo específico para macrófagos CD68 (Figura 1B). Isto foi confirmado através de análise por citometria de fluxo, na qual leucócitos associados a tumor (CD45+) constituem 13,1% da massa tumoral e a grande maioria são macrófagos (CD11b+) (Figura 1A). Análise de expressão em cérebro normal
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42/84 comparado com GBM revelou que o nível de mRNA de CSF-1 e CSF1R, bem como CD68, aumenta em tumores (Figura 1C).
[000116] As diferentes populações de tipos de células específicas para GBMs também foram usadas para determinar a fonte de CSF-1 e seu receptor. A pureza das populações distintas foi confirmada por expressão do receptor TVA apenas na fração de células tumorosas e CD11b unicamente nos TAMs. Enquanto que CSF-1 foi expresso por células tumorosas e TAMs, CSF-1R foi expresso apenas por TAMs (Figura 1D). A primeira coluna em cada grupo de três na Figura 1D é células misturadas, o segundo é células tumorosas purificadas por FACS e a terceira é TAMs purificados por FACS; as células mistas são ajustadas em 1 para normalizar os dados. Os gráficos não mostram nenhuma expressão de CD11b em células tumorosas e nenhuma expressão de CSF-1R nas células tumorosas, enquanto que as células tumorosas coraram para TVA apenas, não TAM, e CSF-1 está presente em quantidades aproximadamente iguais em células tumorosas e TAMs. Estes resultados foram confirmados por imunocoloração e todas as células CSF-1R+ foram também positivas para CD68 (não mostrado). Isto demonstra que quaisquer efeitos sobre a tumorigênese após inibição de CSF-1R neste modelo são dependentes de macrófagos.
Exemplo 2: Análise do inibidor de CSF-1R BLZ945: farmacocinética e ensaios à base de células [000117] BLZ945 (composto Ic) foi descrito como um inibidor de quinase c-fms (CSF-1R) seletivo para a supressão de lesões osteolíticas induzida por tumor no osso. BLZ945 é um inibidor competitivo de ATP que inibe o CSF-1R em ensaios bioquímicos a 1 nM e inibe a proliferação celular dependente de CSF em uma IC50 de cerca de 67 nM. Em comparação, os valores de IC50 para a maioria das > 200 quinases diversas testadas são > 10 pM (10000 nM) e para c-kit e PDGFRp, a
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ICõü é de 3,5 μΜ (3500 nM) e 5,9 μΜ (5,900 nM), respectivamente. Quando sofre triagem contra várias centenas de quinases na matriz de quinase Ambit®, o composto mostrou atividade inferior a 50% do controle apenas contra CSF-1R, PDGFRa e PDGFRp e a atividade sobre os dois PDGFRs foi muito inferior à sua atividade sobre CSF-1R em ensaios de inibição direta. Conforme discutido aqui, compostos similares ao BLZ945 mas tendo a estereoquímica (S,S) exibem atividade contra PDGFRp em níveis similares ao seu alto nível de atividade de CSF-1R.
[000118] Camundongos tendo GBM detectável apenas na metade direita de seus cérebros foram tratados com BLZ945 e a concentração do composto no plasma e nas metades direita e esquerda do cérebro foram, então, medidas em vários pontos de tempo (15 minutos, 2 horas, 8 horas, 24 horas). Conforme mostrado na Figura 2, a concentração plasmática aumenta rapidamente para um pouco acima de 100 μM e permanece acima de 50 μM a 8 horas, em seguida, declina para um baixo nível a 24 horas. A concentração em tecido cerebral segue um padrão similar: ela continua a ser um pouco inferior ao nível plasmático, mas sobe bem acima de 50 μM nos pontos de tempo de 15 min e 2 horas. Isto mostra que BLZ945 atravessa a barreira hematoencefálica (Blood-Brain Barrier - BBB) e que concentrações suficientes para inibir o crescimento e/ou sobrevivência de macrófagos podem ser obtidas no cérebro. Também é mostrado que o composto penetra em níveis similares em metades contendo tumor e sem tumor do cérebro, sugerindo que a penetração pode não depender de uma lesão na BBB causada pela presença do tumor. Isto demonstra penetração da barreira hematoencefálica suficientemente rápida para conferir níveis terapeuticamente eficazes do fármaco no cérebro, bem acima dos níveis necessários para inibir eficazmente macrófagos em cultura.
Exemplo 3: Atividade inibidora de BLZ945 contra dife
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44/84 rentes tipos de células in vitro [000119] Macrófagos derivados da medula óssea (Bone MarrowDerived Macrophages - BMDMs) foram isolados e diferenciados conforme anteriormente descrito na literatura e, em seguida, foram tratados com BLZ945 a 67 nM. BLZ945 causou uma inibição clara na fosforilação de CSF-1R após estimulação com CSF-1R (Figura 3A) em cada ponto de tempo (1,5 min, 3 min, 5 min.) [000120] Os efeitos de BLZ945 sobre macrófagos foram também examinados: uma faixa de doses, de 67 nM a 6700 nM, bloqueou dramaticamente a sobrevivência de macrófagos, comparável aos efeitos de remoção de CSF-1 (Figura 3B).
[000121] BMDMs de camundongos nus Ink4a/Arf (a base genética do modelo de GBM), também foram testados na presença e ausência de BLZ945. A Figura 3C mostra que estes BMDMs, conforme aqueles dos camundongos do tipo selvagem, foram substancialmente inibidos por concentrações de BLZ945 de 67 nM e acima (Figura 3D). Assim, BLZ945 é um inibidor eficaz da sinalização ao CSF-1R, o qual leva a um bloqueio completo na viabilidade dos macrófagos. As Figuras 3C3E demonstram que a proliferação de células de BMDM dos camundongos Ink4a/Arf-/- foi fortemente inibida em concentrações de BLZ945 de 67 nM e acima, assim como CRL-2467 (células de cérebro de camundongo normal) enquanto que, mesmo a 6700 nM, ele tem pouco ou nenhum efeito sobre a proliferação de culturas de células de um glioblastoma humano e quatro de camundongo.
[000122] Para determinar a ausência de um efeito direto de BLZ945 sobre as células tumorosas, uma linhagem de células de glioma humano e uma série de células de tumor primário e neuroesferas foram tratadas com BLZ945 em concentrações similares àquelas constatações eficazes contra o crescimento de macrófagos. Células U87-MG, derivadas de um GBM humano, as quais foi mostrado serem depen
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45/84 dentes de sinalização ao PDGFR em cultura e in vivo, não foram afetadas pelo tratamento com BLZ945 nas mesmas doses conforme acima (Figura 3E). Similarmente, a formação de neuroesferas secundárias a partir de neuroesferas primárias (derivadas de GBM de camundongos RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tv-a;Ink4a/Aif/-) não foi alterada por tratamento com BLZ945 (Figura 3F). Nem o número nem o tamanho das neuroesferas foram significativamente afetados pelo BLZ945. Finalmente, os efeitos de BLZ945 sobre várias linhagens de células tumorosas que foram estabelecidas a partir de neuroesferas secundárias de GBM de camundongo foram examinados e, novamente, não houve diferenças significativas (Figura 3F). Coletivamente, estes experimentos demonstram que os efeitos de inibição de CSF-1R por BLZ945 são específicos para macrófagos, sem consequências diretas discerníveis sobre as células tumorosas.
Exemplo 4: Tratamento com o inibidor de CSF-1R BLZ945 bloqueia a progressão de glioma [000123] Dados os efeitos inibitórios potentes de BLZ945 em ensaios com base em macrófagos e sua capacidade demonstrada de atravessar a barreira hematoencefálica, pareceu desejável testar este inibidor em ensaios pré-clínicos no modelo RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tva;Ink4a/Aif/-. Estes camundongos geneticamente modificados foram injetados a 5-6 semanas de idade com células DF-1 infectadas com vírus RCAS-PDGF-B-HA para iniciar a formação de gliomas, conforme descrito (Hambardzumyan, et al., Transl. Oncol., vol. 2, 89-95 (2009). A 2,5 semanas após início do tumor, grupos de camundongos foram dosados diariamente via sonda oral com 200 mg/kg de BLZ945 em Captisol a 20% ou veículo (Captisol a 20%) como um controle. Os camundongos foram posteriormente avaliados pela sobrevida sem sintomas. A sobrevida média no grupo tratado com veículo foi de 5,71 semanas (40 dias), enquanto que 64,4% do grupo tratado com BLZ945
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46/84 ainda estavam vivos no endpoint do ensaio de 26 semanas pósinjeção (31-32 semanas de idade) (Figura 4A, P < 0,0001). Este endpoint foi escolhido porque os camundongos na base Ink4a/Aif/- começam a desenvolver tumores espontâneos, principalmente linfomas e sarcomas, em torno de 30 semanas de idade, o qual complicaria a interpretação do fenótipo do glioma em estudos mais longos. Os dados da Figura 4A mostram que nenhum dos camundongos de controle (apenas veículo) estavam livres de sintomas por oito semanas após a injeção do vírus, enquanto mais da metade dos camundongos tratados estavam sem sintomas no endpoint de 26 semanas Nota: 4 camundongos tratados foram sacrificados a 12 semanas para estudos histológicos. Destes, 3 estavam sem tumor e um deles tinha um glioma de grau II.
[000124] Os graus de tumor foram determinados para os camundongos em ambos os grupos de camundongos (vide Figura 4B). Todos os animais tratados com veículo em estágio final tinham tumores de alto grau, com lesões por GBM de Grau IV em 13 de 14 camundongos. Em contraste, os animais tratados com BLZ945 tinham tumores malignos significativamente menores: 80% tinham tumor de Grau II ou nenhum tumor, enquanto os restantes 20% tinham tumor de Grau III. Em 56% dos camundongos vivos no endpoint do ensaio de 26 semanas, não havia lesões detectáveis (Figura 4B). Cinco dos camundongos tratados com BLZ945 foram sacrificados como sintomáticos durante o ensaio (n = 5) e comparados com o grupo que ainda era assintomático quando sacrificados no final do ensaio (n = 9). Em ambos os grupos, houve ainda uma redução significativa no grau do tumor em comparação com os animais tratados com veículo. Isto demonstra um aumento dramático na sobrevida e redução na malignidade do tumor neste ensaio a longo prazo com tratamento com BLZ945.
Exemplo 5: Imagiologia por MRI para monitorar os efei
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47/84 tos de BLZ945 sobre o crescimento do tumor [000125] Um ensaio a curto prazo de sete dias de BLZ945 em camundongos com tumor induzido foi monitorado por exames de ressonância magnética para medir alterações regulares do tamanho do tumor durante um curto período de tratamento quando o crescimento do tumor normalmente é rápido. O volume do tumor em camundongos RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf/- foi determinado por MRI e os camundongos foram adicionados ao ensaio quando este tinha pelo menos 4,5 mm3 ou mais. Os camundongos foram tratados com BLZ945 ou controle de veículo durante 7 dias, conforme descrito acima. Varreduras por MRI foram realizadas um dia antes de tratamento ser iniciado, no ponto médio de tratamento e no dia antes do final do período de ensaio. Murinos tratados com veículo mostraram um aumento progressivo, dramático no volume do tumor ao longo deste curto ensaio, conforme mostrado na Figura 5A, com o volume médio do tumor aumentando cerca de 5 vezes. Tratamento com BLZ945 bloqueou a progressão do tumor, conforme determinado por MRI (Figura 5A), sem qualquer aumento no tamanho do tumor ao longo do mesmo curto período. Os indivíduos tratados (linha inferior) mostraram pouco ou nenhum aumento do tumor, enquanto o volume de tumor aumentou drasticamente nos controles tratados com veículo. A Figura 5B mostra o volume do tumor para camundongos de controle individuais (gráfico superior) e camundongos tratados (gráfico inferior) durante os primeiros 6 dias após tratamento com BLZ945 começar. Quase todos os animais tratados com BLZ945 mostram pouco ou nenhum aumento no tamanho do tumor, enquanto que todos os animais de controle mostraram grandes aumentos no volume do tumor.
[000126] Conforme mostrado na Figura 5B, os tumores não tratados aumentaram cerca de 150-850 % de volume durante esse tempo, enquanto o tamanho do tumor foi reduzido em 7 dos 11 animais tratados
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48/84 e apenas dois dos animais tratados tinham aumentos de volume de tumor de mais de 50%. As Figuras 5-2A e 5-2B representam os dados de volume de tumor para todos os 11 animais de teste e de controle e mostram que o tratamento interrompeu grandemente o aumento de tamanho do tumor, enquanto que os tumores não tratados cresceram substancialmente no tratamento de 6 dias. Estes resultados indicam que a sinalização ao CSF-1R e a contribuição presumida de macrófagos dependentes de CSF-1R são críticas para a progressão de glioma neste modelo com murino e que BLZ945 pode impedir o crescimento de um tumor cerebral em um modelo com mamíferos altamente relevante para o glioblastoma humano.
[000127] Em um segundo ensaio in vivo em tumores maiores no mesmo modelo de GBM (grupo com tumor grande), camundongos com volumes de tumor de 48,7-132 mm3 foram tratados com BLZ945 e as alterações no volume do tumor foram monitoradas por MRI em um período de 6 dias. O volume do tumor diminuiu efetivamente em quase todos os animais de teste e 6 de 18 camundongos tratados tinham uma redução de pelo menos 30% no tamanho do tumor (Figuras 5D e 5-2C). Os animais de controle não foram incluídos neste teste, pois não era esperado que sobrevivessem ao endpoint.
Exemplo 6: Análise das capacidades de indicação de câncer em tumores tratados com BLZ945 [000128] A identificação de um efeito impressionante de inibição de CSF-1R em gliomagênese nos levou a investigar os mecanismos subjacentes a essa resposta e determinar como o tratamento com BLZ945 afetava várias das capacidades de indicação de câncer. As análises foram realizadas sobre tecidos a partir do ensaio a curto prazo (vide Exemplo 5), de modo que tumores de diferentes grupos de tratamento pudessem ser comparados no mesmo endpoint definido. A densidade de células tumorosas foi examinada usando o marcador de oligoden
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49/84 drócito Olig2, o qual tinha sido previamente usado para identificar células de glioma. Olig2 foi significativamente reduzido no grupo tratado com BLZ945 comparado com os controles com veículo, indicando que BLZ945 reduziu significativamente o número de células tumorosas (Figura 6A).
[000129] Análise da proporção de células Olig2+ que estavam proliferando, conforme determinado por incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), revelou uma redução significativa no grupo com BLZ945 (Figura 6B). Novamente, BLZ945 reduziu significativamente a proliferação de células tumorais.
[000130] O nível de apoptose nestas células foi avaliado também. As células apoptóticas foram contadas como aquelas que tiveram coloração citoplásmica de caspase-3 clivada (CC3)+ e núcleos condensados. Conforme mostrado na Figura 6C, o tratamento com inibidor de CSF1R causou um aumento na apoptose no ponto de tempo anterior em particular, embora pouca coloração tenha sido observada no Dia 7 no grupo com tumor grande.
[000131] A tabela a seguir resume as análises histológicas realizadas sobre as amostras do Exemplo 5:
TABELA 1. Análises Histológicas
| Parâmetro | Veículo | BLZ945, Dia 3 | BLZ945, Dia 7 | BLZ945 Large, Dia 3 | BLZ945 Large, Dia 7 |
| Volume do tumor (Dia -1 vs Dia 6) | + 498% | -- | + 0.68% | - | - 24,3% |
| Celulas DAPI* totais | -- | - 72% | - 80% | - 40% | - 65% |
| Células tumorosas (%Olig2+) | -- | - 27% | - 77% | - 14% | - 73% |
| Proliferação (%BrdU+Olig2+) | -- | -91% | - 67% | - 98% | - 94% |
| Apoptose (%CC3+) | -- | + 17-vezes | + 6-vezes | + 9-vezes | + 2-vezes |
| Vasculatura (CD31 MVD) | -- | -- | -17% | - | - 67% |
| Macrófagos (% CD68+) | -- | + 3-vezes | + 2-vezes | + 2-vezes | + 4-vezes |
| Índice fagocítico | -- | + 2,6-vezes | + 3,0-vezes | + 2,2-vezes | + 4,1-vezes |
| Capacidade fagocítica | -- | + 11,5-vezes | + 5,0-vezes | + 7,1-vezes | + 6,0-vezes |
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50/84 [000132] A alteração no volume do tumor é o volume no endpoint (dia 6) em relação ao dia um e as alterações são reportadas em relação ao grupo de controle (veículo).
[000133] Em conjunto, estas análises demonstram que inibição da sinalização ao CSF-1R bloqueia eficazmente o crescimento e malignidade dos gliomas por meio de um efeito combinado sobre a redução de proliferação de células tumorosas e aumento de morte celular.
[000134] Em resumo, estes dados demonstram que o inibidor de CSF-1R BLZ945 é uma nova terapia potente que bloqueia a progressão de tumor em um modelo de glioma muito agressivo em murinos. O composto aumentou dramaticamente a sobrevida em um modelo préclínico de gliomagênese com camundongos e reduziu drasticamente as taxas de crescimento de tumor e também reduziu o tamanho do tumor ao longo de um período de teste a curto prazo. No teste de longa duração, BLZ945 parece eliminar os tumores visíveis em números significativos em camundongos e reduz drasticamente o grau do tumor na maioria dos camundongos tratados.
[000135] Uma vez que foi demonstrado que o aumento da infiltração de macrófagos se correlaciona com a malignidade em gliomas humanos, espera-se que a potência de BLZ945 neste modelo com camundongos, aparentemente em virtude de objetivação terapêutica de TAMs em indivíduos com GBM, se traduza em eficácia contra glioblastoma em outros mamíferos, incluindo seres humanos. Dado que as células mieloides, incluindo macrófagos, foram implicadas na resposta de embotamento quimioterapêutico em modelos de câncer de mama e no aumento da resposta adaptativa após irradiação em modelos de xenoenxerto de GBM, este e outros inibidores de CSF-1R podem ser eficazes em combinação com terapias dirigidas contra as células cancerosas em gliomas, uma possibilidade que merece uma investigação mais aprofundada. Em particular, compostos tais como:
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(Id) e
(If) oferecem a capacidade de objetivar CSF-1R e PDGFR em concentrações similares e, assim, podem ser ainda mais eficazes do que
BLZ945. Na verdade, o composto (Id) inibe PDGFR com uma IC50 apenas cerca de 4 vezes superior à sua IC50 para CSF-1R. Assim, es pera-se que uma concentração terapeuticamente eficaz de um desses compostos afete ambos os sítios-alvo e exiba atividade sinergística sobre gliomas.
Exemplo 7 [000136] Para investigar os mecanismos moleculares pelos quais
TAMs tratados com BLZ945 podem estimular uma resposta anti-tumor in vivo surpreendente, apesar de uma falta evidente de depleção de TAMs ou qualquer efeito antiproliferativo direto sobre células de GBM humano, TAMs CD11b+Gr-1- foram isolados de camundongos tratados com veículo ou BLZ945 e caracterização de perfil de expressão por microarranjo foi realizada (vide Fig. 7.). Análise de microarranjo de 257 genes identificados como significativamente expressos diferenci almente entre os grupos: 52 genes eram positivamente regulados e
205 negativamente regulados (Figuras 7B; também 8A). Entre estes,
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52/84 análise de enriquecimento do conjunto de genes (Gene Set Enrichment Analysis - GSEA) revelou que alvos de Egr2, um fator de transcrição a jusante da sinalização ao CSF-1R, foram negativamente regulados em TAMs tratados com BLZ945 (Fig. 7C). Desproporcionalmente, genes associados à fase M2 foram positivamente regulados (Figuras 7D e 7E).
Exemplo 8. Alterações na expressão gênica induzidas pelo inibidor de CFR-1R [000137] O modelo de regressão Lasso foi usado para determinar o número mínimo de genes que melhor discriminava os dois grupos de tratamento. Este identificou uma assinatura de 5-genes para tratamento com BLZ945 compreendido de adrenomedulina (ADM), arginase 1 (Arg1), o fator de coagulação F13a1, receptor de manose C de tipo 1 (Mrc1/ CD206) e o inibidor de protease serpinaB2 (Fig. 8B). De modo interessante, cada um destes genes foi associado à polarização de macrófagos M2/alternadamente ativados e 4 de 5 genes são reprimidos após tratamento com BLZ945. SerpinaB2 (também conhecido como PAI2), o único gene positivamente regulado na assinatura de 5genes, geralmente se correlaciona positivamente com o aumento da sobrevida, particularmente em pacientes com câncer de mama.
[000138] Em muitos contextos teciduais, constatou-se que TAMs eram mais M2 polarizados, o qual estava associado às suas funções imunossupressoras e pró-tumorigênicas. Ainda, macrófagos em gliomas humanos exibem um fenótipo similar a M2, determinado pelo aumento dos níveis de receptores de varredura CD163 e CD204 que estão associados a um maior grau de tumor. Dado o enriquecimento por genes M2 na assinatura restrita a 5-genes, a lista de 257-genes foi examinada para determinar se havia marcadores M2 adicionais associados alterados após tratamento com BLZ945. Isto revelou 10 genes adicionais [Alox15 (15-lipoxigenase de araquidonato); CDH1 (caderi
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53/84 na), CD163 (antígeno CD163); FPR2 (receptor 2 de peptídeo formila); HMOX1 (heme oxigenase (deciclização) 1); IL1B (interleucina 1-beta); e Stab1 (Estabilina 1)], a maioria dos quais foram reprimidos (Fig. 7D, Tabela 2). Genes de M1 polarização/classicamente ativados não foram correspondentemente regulados positivamente, com a exceção do receptor de interleucina-1-beta (Fig. 7E). Estes dados sugerem que, em resposta à inibição de CSF-1R por BLZ945, os TAMs perdem sua polarização M2 e podem ganhar funções anti- tumorigênicas.
[000139] Isto também sugere que monitoramento destas alterações de expressão gênica como biomarcadores podem fornecer informações prognósticas valiosas para o tratamento de pacientes com glioma com inibidores de CSF-1R. Pode-se esperar que os indivíduos tratados cujas caracterizações de perfil de expressão gênica mudam no mesmo ou em um padrão similar àquelas alterações observadas respondam positivamente ao tratamento com o inibidor de CSF-1R e aqueles que não exibem essas alterações na expressão gênica podem precisar receber um tratamento alternativo ou adicional em virtude de um prognóstico negativo do inibidor de CSF-1R isoladamente.
TABELA 2. Expressão gênica diferencial como um resultado de tratamento com inibidor de CSF-1R
| Símbolo | Descrição | Vezes de Alteração BLZ945Veículo | P valor nominal |
| Akap12 | Uma proteína de âncora de quinase (gravina) 12 | -2,85 | 1,31E-04 |
| Abhd15 | Contendo domínio de ab-hidrolase 15 | -2,48 | 1,36E-05 |
| Acp5 | Fosfatase ácida 5, resistente ao tartrato | -2,36 | 2,08E-03 |
| Acah | Hidrolase de acilóxiacila | -2,43 | 3,83E-06 |
| Ada | Deaminase de adenosina | -3,00 | 2,28E-07 |
| Arxes1 | Sequência 1 expressa em cromossomo X relacionada a adipócito | -2,23 | 1,68E-03 |
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| Arxes2 | Sequência 2 expressa em cromossomo X relacionada a adipócito | -2,96 | 3,37E-04 |
| Adm# | adrenomedulina | -10,85 | 2,60E-09 |
| Aldh1a2 | Deidrogenase de aldeído, família 1, subfamília A2 | -2,18 | 8,36E-04 |
| Apbb2 | Ligação à proteína precursora amilóide beta (A4), família B, membro 2 | 2,27 | 2,97E-06 |
| Anin | Anilina, proteína de ligação à actina | -2,99 | 1,38E-04 |
| Asb10 | Repetição de anquirina e contendo caixa SOCS 10 | 2,10 | 1,14E-03 |
| Asb11 | Repetição de anquirina e contendo caixa SOCS 11 | 2,19 | 3,00E-04 |
| Mki67 | Antígeno identificado pelo anticorpo monoclonal Ki 67 | -7,18 | 2,78E-05 |
| Apob | Apolipoproteína B | -2,92 | 3,42E-05 |
| Apoc1 | Apolipoproteína C-I | 3,21 | 1,56E-06 |
| Apoc4 | Apolipoproteína C-IV | 3,14 | 1,91E-04 |
| Alox15# | 15-lipoxigenase de araquidonato | 4,24 | 8,85E-03 |
| Arg1 ·# | Arginase, fígado | -8,48 | 5,07E-03 |
| Aspm | Asp (fuso normal)-similar, associada à microcefalia (Drosophila) | -2,22 | 1,02E-03 |
| Aurka | Quinase aurora A | -2,23 | 1,30E-03 |
| Aurkb | Quinase aurora B | -2,71 | 4,19E-06 |
| Birc5 | Contendo repetição IAP baculoviral 5 | -6,13 | 3,00E-06 |
| Bambi | BMP e inibidor ligado à membrana de activina, homólogo (Xenopus laevis) | 2,64 | 6,53E-05 |
| Bub1 | Homólogo de formação de feixe não inibida por benzimidazolas 1 (S. cerevisiae) | -2,72 | 4,19E-06 |
| Cdh1# | Caderina 1 | -6,43 | 1,70E-04 |
| Cdh2 | Caderina 2 | -2,23 | 6,25E-04 |
| Camkk1 | Quinase de proteína dependente de cál- cio/calmodulina, quinase 1, alfa | -2,13 | 2,69E-06 |
| Calm14 | Calmodulina-like 4 | -2,06 | 2,12E-05 |
| Chst2 | Sulfotransferase 2 de carboidrato 2 | 2,44 | 5,14E-04 |
| Cbr2 | Redutase de carbonila 2 | -4,15 | 2,93E-07 |
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| Cpa3 | Carbóxipeptidase A3, mastócito | 2,17 | 6,30E-04 |
| Ctnnd2 | Catenina (proteína associada à caderina), delta 2 | -2,94 | 8,46E-07 |
| Ctsf | Catepsina F | 2,10 | 1,53E-04 |
| Cd163# | Antígeno CD163 | -2,65 | 3,87E-07 |
| Cd22 | Antígeno CD22 | 2,35 | 1,09E-05 |
| Cd244 | Receptor de célula assassina natural CD244, 2B4 | -2,71 | 1,11E-07 |
| Cd38 | Antígeno CD38 | -3,72 | 4,44E-05 |
| Cd5 | Antígeno CD5 | 3,62 | 2,96E-05 |
| Cd83 | Antígeno CD83 | 2,28 | 2,53E-05 |
| Cd93 | Antígeno CD93 | -2,42 | 2,30E-07 |
| Ckslb | Quinase de proteína CDC28 1b | -2,54 | 1,71E-06 |
| Cdc20 | Homólogo 20 de ciclo de divisão celular (S. cerevisiae) | -2,75 | 1,16E-04 |
| Cdc45 | Homólogo 45 de ciclo de divisão celular (S. cerevisiae) | -2,03 | 9,78E-08 |
| Cdc6 | Homólogo 6 de ciclo de divisão celular (S. cerevisiae) | -3,67 | 8,12E-08 |
| Cdca5 | Associado ao ciclo de divisão celular 5 | -2,24 | 6,77E-06 |
| Cenpe | Proteína centrômero E | -4,18 | 1,96E-05 |
| Cenpk | Proteína centrômero K | -2,45 | 1,46E-05 |
| Cep55 | Proteína centrossômica 55 | -2,40 | 8,23E-05 |
| Cor1 | Receptor 1 de quimiocina (motivo C-C) | -4,56 | 8,86E-05 |
| Cxcr7 | Receptor 7 de quimiocina (motivo C-X-C) | -2,26 | 8,65E-03 |
| Cspg5 | Proteoglicana 5 sulfato de condroitina | -2,61 | 1,09E-05 |
| Clu | clusterina | -2,34 | 3,55E-04 |
| F3 | Fator de coagulação III | -2,11 | 4,58E-03 |
| F9 | Fator de coagulação IX | 2,12 | 5,92E-04 |
| F13a1 ·# | Fator de coagulação XIII, subunidade A1 | -10,66 | 1,39E-09 |
| Col11a1 | Colágeno, tipo XI, alfa 1 | -3,49 | 3,09E-04 |
| Col114a1 | Colágeno, tipo XIV, alfa 1 | -2,65 | 1,37E-06 |
| Cfp | Properdina, fator de complemento | -2,64 | 2,60E-04 |
| Cntn1 | Contactina 1 | -4,93 | 2,80E-08 |
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| Cpne2 | Copina II | -2,20 | 1,13E-05 |
| Crybbl | Cristalina, beta B1 | -2,83 | 2,44E-05 |
| Clec4n | Domínio de lectina tipo C, família 4, membro n | -6,53 | 4,34E-10 |
| Cona2 | Ciclina A2 | -3,90 | 1,19E-05 |
| Ccnbl | Ciclina B1 | -3,55 | 2,25E-05 |
| Ccnb2 | Ciclina B2 | -4,53 | 1,16E-05 |
| Ccndl | Ciclina D1 | -3,01 | 1,06E-08 |
| Ccnd2 | Ciclina D2 | -3,34 | 1,36E-05 |
| Ccne2 | Ciclina E2 | -5,28 | 3,67E-08 |
| Ccnf | Ciclina F | -2,30 | 1,48E-04 |
| Cdk1 | Quinase 1 dependente de ciclina | -2,18 | 2,75E-05 |
| Cst7 | Cistatina F (leucocistatina) | 2,62 | 2,29E-07 |
| Cyp4v3 | Citocromo P450, família 4, subfamília V, polipeptídeo 3 | 2,14 | 1,15E-05 |
| Cpeb1 | Proteína 1 de ligação a elemento de poliadenilação citoplásmico | 2,86 | 1,97E-05 |
| Ckap2 | Proteína 2 associada a citoesqueleto | -2,17 | 1,80E-04 |
| Ddhd1 | Contendo domínio DDHD 1 | 2,06 | 4,86E-03 |
| Dner | Receptor relacionado a GF delta/notch-like | -2,68 | 2,65E-04 |
| Dck | Quinase de deoxicitidina | -2,07 | 2,50E-04 |
| Depdc1a | Contendo domínio DEP 1a | -2,81 | 9,05E-05 |
| Dhfr | Redutase de di-hidrofolato | -2,40 | 5,79E-06 |
| Prim1 | Primase de DNA, subunidade p49 | -2,76 | 2,87E-07 |
| D17H6S56E-5 | Segmento de DNA, Chr 17, humano D6S56E-5 | -2,91 | 1,68E-03 |
| Ddit4 | Transcrito 4 indutível por dano ao DNA | -2,43 | 5,07E-06 |
| Dusp1 | Fosfatase 1 com especificidade dupla | 2,33 | 3,55E-04 |
| E2f8 | Fator 8 de transcrição E2F | -2,71 | 1,20E-05 |
| Ect2 | Oncogene ect2 | -3,19 | 1,65E-04 |
| Emb | Embigina | -2,59 | 9,66E-05 |
| Eepd1 | Contendo domínio 1, família de endonuclease / exonuclease / fosfatase | 2,70 | 1,62E-06 |
| Ezh2 | Intensificador de homólogo 2 zeste (Drosophila) | -2,54 | 1,36E-05 |
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| Etl4 | Intensificador locus trap 4 | 2,41 | 1,24E-05 |
| Eps8 | Substrato 8 da via de receptor de fator de crescimento epidérmico | -2,51 | 4,00E-06 |
| Emp1 | Proteína 1 da membrana epitelial | -3,19 | 6,42E-04 |
| Ephxl | Hidrolase de epóxido 1, microssômica | 2,76 | 1,75E-04 |
| Ero11 | ERO1-similar (S. cerevisiae) | -2,64 | 1,07E-05 |
| Fam20c | Família com similaridade de sequência 20, membro C | 2,79 | 3,62E-06 |
| Fabp3 | Proteína 3 de ligação a ácido graxo, músculo e coração | 2,93 | 4,99E-06 |
| Fabp7 | Proteína 7 de ligação a ácido graxo, cérebro | -6,77 | 9,66E-06 |
| Fbxo32 | Proteína 32 de F-caixa | 2,54 | 1,79E-05 |
| Fbn2 | Fibrilina 2 | -2,13 | 3,89E-03 |
| Fap | Proteína de ativação de fibroblasto | -2,25 | 1,46E-03 |
| Fpr2# | Receptor 2 de peptídeo de formila | -2,83 | 6,68E-05 |
| Fhl1 | Domínios 1, quatro e metade LIM | -2,02 | 5,40E-03 |
| Gja1 | Proteína de junção de fenda, alfa1 | -2,78 | 1,97E-03 |
| Gpnmb | Glicoproteína (transmembrana) nmb | 3,22 | 3,98E-05 |
| Ggta1 | Galactosil transferase alfa 1,3 de glicoproteína | -2,40 | 2,12E-06 |
| Gpm6a | Glicoproteína m6a | -5,35 | 3,23E-06 |
| Gzma | Granzima A | 3,55 | 4,11E-03 |
| Gadd45a | Indutível por interrupção de crescimento e dano ao DNA 45 alfa | 2,40 | 2,77E-04 |
| Gap43 | Proteína 43 associada ao crescimento | -2,58 | 7,42E-05 |
| Gdf3 | Fator de diferenciação de crescimento 3 | -3,33 | 1,40E-07 |
| Gem | Proteína de ligação a GTP (gene superexpresso em músculo esquelético) | 2,17 | 7,03E-04 |
| Hspa1a | Proteína de choque térmico 1A | -4,38 | 1,45E-05 |
| Hspa1b | Proteína de choque térmico 1B | -8,71 | 1,88E-08 |
| Hsp90aa1 | Proteína de choque térmico 90, alfa (citosólica), classe A, membro 1 | -2,23 | 1,01E-03 |
| Hells | Específica para linfoide de helicase | -3,59 | 9,75E-06 |
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| Hmoxl# | Heme oxigenase (deciclização) 1 | -2,98 | 7,05E-05 |
| Hmgb3 | Caixa 3, grupo de alta mobilidade | -2,42 | 2,32E-06 |
| Hmgn5 | Domínio 5 de ligação a nucleossomo do grupo de alta mobilidade | -2,58 | 1,79E-05 |
| Igj | Cadeia de união de imunoglobulina | 3,36 | 4,53E-03 |
| Lkbke | Inibidor de capaB quinase epsilon | 2,38 | 1,50E-04 |
| Igf1 | Fator 1 de crescimento semelhante à insulina | 2,13 | 8,56E-05 |
| Igfbp2 | Proteína 2 de ligação a fator de crescimento semelhante à insulina | -3,54 | 1,24E-06 |
| Igfbp3 | Proteína 3 de ligação a fator de crescimento semelhante à insulina | -6,53 | 1,05E-05 |
| Itgam | Integrina alfa M | -2,25 | 2,27E-04 |
| Itgax | Integrina alfa X | 2,08 | 1,36E-03 |
| Lfitm1 | Proteína 1 transmembrana induzida por interferon | -5,18 | 1,21E-04 |
| Lfitm2 | Proteína 2 transmembrana induzida por interferon | -2,82 | 1,54E-03 |
| Lfitm3 | Proteína 3 transmembrana induzida por interferon | -2,06 | 4,73E-03 |
| Lfitm6 | Proteína 6 transmembrana induzida por interferon | -4,14 | 6,14E-04 |
| Li1b# | Interleucina 1 beta | 2,06 | 4,50E-04 |
| Ll18bp | Proteína de ligação à interleucina 18 | 3,66 | 4,53E-04 |
| Ll7r | Receptor de interleucina 7 | -2,01 | 4,96E-03 |
| Kpna2 | Carioferina (importina) alfa 2 | -2,38 | 1,98E-05 |
| Khdrbs3 | Contendo domínio KH, ligação a RNA, associada a transdução de sinal 3 | -2,10 | 3,94E-04 |
| Klrb1a | Receptor semelhante à lectina de célula assassina, subfamília B, membro 1A | 4,30 | 9,00E-05 |
| Kif11 | Família de cinesina, membro 11 | -2,57 | 9,00E-05 |
| Pbk | Quinase de ligação PDZ | -5,63 | 9,20E-07 |
| Pttg1 | Gene 1 de transformação de tumor na pituitária | -2,83 | 2,73E-06 |
| Plac8 | Placenta-específico 8 | -2,79 | 6,64E-03 |
| Pdgfra | Receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta, polipeptídeo alfa | -3,16 | 4,84E-06 |
| Pt4 | Fator de plaqueta 4 | -2,96 | 1,21E-05 |
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| Pdgtc | Fator de crescimento derivado de plaqueta, polipeptídeo C | -2,25 | 2,98E-03 |
| Ptn | Pleiotropina | -3,21 | 4,42E-04 |
| Pdpn | Podoplanina | -2,01 | 2,51E-04 |
| Plk1 | Quinase 1 polo-similar (Drosophila) | -2,68 | 5,72E-05 |
| Polal | Polimerase (DNA dirigida), alfa 1 | -2,37 | 3,52E-06 |
| Pold2 | Polimerase (DNA dirigida), delta 2, subunidade reguladora | -2,02 | 5,72E-06 |
| Pole | Polimerase (DNA dirigida), epsilon | -2,27 | 5,96E-05 |
| Kcnk2 | Canal de potássio, subfamília K, membro 2 | -2,13 | 8,52E-05 |
| Procklel | Homólogo 1 anemia (Drosophila) | 2,32 | 1,75E-04 |
| P4ha2 | Pró-colágeno-prolina, 4-dioxigenase de 2- oxoglutarato (4-hidroxilase de prolina), polipeptídeo alfa II | -3,54 | 1,25E-06 |
| Ptger4 | Receptor 4 de prostaglandina E (subtipo EP4) | 2,43 | 5,12E-05 |
| Pmepa1 | Proteína transmembrana da próstata, induzida por androgênio 1 | -2,35 | 5,85E-04 |
| Psmb7 | Proteassomo (prossomo, macropaína), subunidade beta, tipo 7 | -2,17 | 4,27E-03 |
| Prc1 | Regulador de proteína de citocinese 1 | -3,06 | 1,26E-04 |
| Ptprz1 | Fosfatase de tirosina de proteína, receptor tipo Z, polipeptídeo 1 | -3,66 | 4,43E-05 |
| P2ry12 | Receptor purinérgico P2Y, acoplado à proteína G 12 | -2,55 | 1,86E-04 |
| Rab34 | TAB34, membro da família de oncogene RAS | 2,08 | 3,95E-05 |
| Racgap1 | Proteína 1 de ativação de GTPase Rac | -2,56 | 2,92E-05 |
| Rad51ap1 | Proteína 1 associada a RAD51 | -2,61 | 1,26E-07 |
| Rad51 | Homólogo de RAD51 (S. cerevisiae) | -2,90 | 3,33E-06 |
| Ranbp1 | Proteína 1 de ligação a RAN | -2,01 | 6,62E-07 |
| Rfc4 | Fator C de replicação (ativador 1) 4 | -2,17 | 4,24E-05 |
| Rbp1 | Proteína 1 de ligação a retinol, celular | -4,22 | 1,88E-05 |
| Rrm1 | Redutase de ribonucleotídeo M1 | -2,14 | 1,79E-05 |
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| Rrm2 | Redutase de ribonucleotídeo M2 | -8,23 | 1,04E-07 |
| 2310016C08Rik | Gene 2310016C08 de cDNA RIKEN | -2,14 | 1,12E-04 |
| 2810417H13Rik | Gene 2819417H13 de cDNA RIKEN | -3,96 | 2,33E-07 |
| 4930583H14Rik | Gene 4930583H14 de cDNA RIKEN | -2,37 | 1,25E-05 |
| Rbm3 | Proteína 3 de motivo de ligação a RNA | -2,20 | 2,23E-09 |
| Slfn4 | Schiafeno 4 | -3,35 | 3,42E-03 |
| Stil | locus de interrupção Scl/Tal1 | -3,15 | 2,15E-06 |
| Serpinab2 · # | Inibidor de peptidase de serina (ou cisteína), clado B, membro 2 | 6,20 | 1,12E-02 |
| Serpinab6b | Inibidor de peptidase de serina (ou cisteína), clado B, membro 6b | 2,03 | 1,22E-03 |
| Smyd2 | Contendo domínio SET e MYND 2 | -2,25 | 6,90E-04 |
| Sh3bgr | Proteína rica em ácido glutâmico com domínio de ligação SH3 | 3,33 | 6,84E-07 |
| Sh3bgrl | Semelhante à proteína rica em ácido glutâmico com domínio de ligação SH3 | -2,02 | 4,68E-04 |
| Shcbp1 | Proteína 1 de ligação com domínio SH2 Shc | -4,72 | 1,74E-06 |
| Slamf8 | Família SLAM, membro 8 | 2,81 | 5,20E-03 |
| Snrpa1 | Pequeno polipeptídeo A' de ribonucleoproteína nuclear | -2,04 | 1,48E-06 |
| Sfl2a5 | Transportador de soluto, família 2 (transportador de glicose facilitado), membro 5 | -3,46 | 8,15E-07 |
| Slc39a4 | Transportador de soluto, família 38 (transportador de zinco), membro 4 | 2,44 | 783E-04 |
| Slc6a1 | Transportador de soluto, família 6 (transportador de neurotransmissor, GABA), membro 1 | -2,09 | 5,66E-04 |
| Sparcl1 | SPARC-like 1 | -3,23 | 1,06E-03 |
| Spon1 | Espondina 1 (f-espondina), proteína da matriz extracelular | -2,50 | 9,32E-05 |
| Sox2 | Gene 2 contendo SRY-caixa | -2,50 | 5,13E-03 |
| Stab1# | Estabilina 1 | -2,64 | 3,92E-06 |
| Stmn1 | Estalmina 1 | -2,52 | 5,52E-05 |
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61/84
| Smc2 | Manutenção estrutural de cromossomos 2 | -2,87 | 7,80E-05 |
| Smc4 | Manutenção estrutural de cromossomos 4 | -3,20 | 2,26E-04 |
| Si14 | Supressão de tumorigenicidade 14 (carcinoma de cólon) | 2,47 | 4,21E-06 |
| Tiparp | (poli)ADP-ribose polimerase TCDD-indutível | -2,06 | 1,25E-03 |
| Tnc | Tenascina C | -2,56 | 2,48E-03 |
| Tk1 | Quinase de timidina 1 | -3,39 | 1,24E-07 |
| Tipin | Proteína de interação não sincronizada | -2,50 | 6,24E-06 |
| Tfpi2 | Inibidor 2 da via de fator tecidual | -2,60 | 3,99E-03 |
| Timpl | Inibidor tecidual de metaloproteinase 1 | -2,07 | 1,54E-04 |
| Top2a | Topoisomerase (DNA) II alfa | -2,11 | 2,13E-05 |
| Topbpl | Proteína 1 de ligação à topoisomerase (DNA) II | -2,37 | 9,96E-06 |
| Tpx2 | TPX2, homólogo de proteína associada a microtúbulo (Xenopus laevis) | -2,52 | 1,16E-05 |
| Tcf19 | Fator de transcrição 19 | -2,32 | 1,67E-06 |
| Tgfbi | Fator de crescimento de transformação, beta induzido | -3,23 | 1,68E-06 |
| Tgm2 | Transglutaminase 2, polipeptídeo C | -2,94 | 2,86E-03 |
| Tmem119 | Proteína transmembrana 119 | -3,12 | 1,71E-06 |
| Tmem163 | Proteína transmembrana 163 | 2,20 | 5,42E-03 |
| Trps1 | Síndrome I tricorrinofalangeal (humano) | -2,97 | 1,68E-07 |
| Trim59 | Contendo motivo tripartido 59 | -2,78 | 3,02E-04 |
| Ttk | Quinase de proteína ttk | -2,63 | 3,35E-05 |
| Tubb2c | Tubulina, beta 2C | -2,13 | 3,84E-06 |
| Ube2c | Enzima E2C de conjugação à ubiquitina | -3,98 | 1,12E-04 |
| Uhrf1 | Semelhante à ubiquitina, contendo domínios PHD e dedos RING, 1 | -2,96 | 3,73E-07 |
| Ung | Glicosilase de DNA de uracila | -2,50 | 5,81E-07 |
| Wdhd1 | Repetição WD e proteína 1 de ligação a DNA de HMG-caixa | -2,01 | 2,52E-04 |
| Zwilch | Zwitch, cinetocoro associado, homólogo (Drosophila) | -4,32 | 3,61E-06 |
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62/84 * Componente da assinatura de regressão Lasso de resposta ao BLZ945.
# Genes associados a macrófagos M2 relevantes.
[000140] Na Tabela, aos genes reprimidos é fornecido um número de alteração negativa, enquanto que os genes positivamente regulados têm valores positivos. Os P valores nominais são de dois t-testes de Student duplamente configurados.
[000141] Além disso, as assinaturas gênicas geradas a partir de TAMs tratados com BLZ945 em camundongos parecem estar associadas à sobrevida diferencial em pacientes com GBM. Uma máquina de vetor de suporte (Support Vector Machine - SVM) e a assinatura Lasso foram usadas para analisar dados de GBM do The Cancer Gene Atlas (The Cancer Gene Atlas - TCGA) e uma segunda série combinada de conjuntos de dados de GBM e separar os pacientes nos classificadores 'BLZ945' ou 'Veículo'. Essas análises revelaram um aumento na sobrevida média que varia de 10 meses em pacientes pró-neurais TCGA usando a assinatura Lasso (Figuras 8C e 8D) a 31,5 meses nos conjuntos de dados combinados com a assinatura SVM (Figuras 8E e 8F). Curiosamente, este aumento da sobrevida não foi evidente nos outros subtipos de GBM e não era dependente de enriquecimento de pacientes pró-neurais L-CIMP+.
TABELA 3. Dados de sobrevida para os modelos Máquina de Vetor de Suporte (Support Vector Machine - SVM) e Lasso nas diferentes populações de GBM
| Grupo | BLZ945 | Veículo | Sobrevida Mediana | P valor |
| SVM Combinado Neural | 49 | 16 | 5,42 | 1,58E-01 |
| SVM Combinado Pró-neural | 46 | 62 | 31,54 | 6,36E-04 |
| SVM Combinado Mesenquimal | 37 | 102 | -2,25 | 8,82E-01 |
| SVM Combinado Clássico | 11 | 48 | 0,40 | 6,67E-01 |
| SVM TCGA Pró-neural | 46 | 88 | 7,64 | 7,27E-03 |
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63/84
| SVM TCGA Pró-neural GCIMP | 13 | 8 | -40,60 | 2,01E-01 |
| SVM TCGA Pró-neural não GCIMP | 22 | 44 | -0,78 | 2,84E-01 |
| SVM TCGA GCIMP | 14 | 8 | -35,60 | 2,03E-01 |
| SVM TCGA não GCIMP | 83 | 157 | -1,06 | 7,27E-01 |
| SVM TCGA Neural | 23 | 30 | 2,84 | 7,73E-01 |
| SVM TCGA Mesenquimal | 53 | 99 | 0,30 | 7,62E-01 |
| SVM TCGA Clássico | 31 | 66 | -3,14 | 7,71E-01 |
| Lasso Combinado Neural | 51 | 14 | 7,01 | 6,50E-02 |
| Lasso Combinado Pró-neural | 79 | 29 | 6 61 | 4,15E-02 |
| Lasso Combinado Mesenquimal | 21 | 118 | 1,88 | 5,55E-01 |
| Lasso Combinado Clássico | 23 | 31 | 0,33 | 9,68E-01 |
| Lasso TCGA Pró-neural | 84 | 49 | 9,98 | 5,41E-06 |
| Lasso TCGA Pró-neural GCIMP | 20 | 1 | NA | NA |
| Lasso TCGA Pró-neural não GCIMP | 40 | 26 | 10,84 | 140E-02 |
| Lasso TCGA GCIMP | 20 | 2 | -16 13 | 7,21E-01 |
| Lasso TCGA não GCIMP | 100 | 140 | 0,10 | 4,14E-01 |
| Lasso TCGA Neural | 31 | 22 | -5,19 | 2,77E-02 |
| Lasso TCGA Mesenquimal | 23 | 129 | 0,40 | 8,35E-01 |
| Lasso TCGA Clássico | 49 | 48 | -1,42 | 6,34E-01 |
[000142] Análise de relações de risco associadas demonstraram a vantagem para a sobrevida pró-neural específica em ambos os conjuntos de dados de TCGA e combinados (Fig. 8G). A especificidade próneural é consistente com as assinaturas de TAM que tinham sido originalmente geradas a partir do modelo PDG de gliomagênese, o qual representa mais intimamente o GBM pró-neural. Isto sugere que estas assinaturas genéticas podem fornecer orientação prognóstica útil para indivíduos submetidos a tratamento com agentes quimioterapêuticos, particularmente pacientes com GBM tratados com inibidores de CSF1R. Uma vez que o GBM pró-neural não responde à quimioterapia agressiva e radioterapia comparado com os outros subtipos, o achado de valor prognóstico associado a estas assinaturas pode ter potencial
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64/84 importante para este grupo de pacientes. Com base na correlação observada, espera-se que pacientes que estão recebendo quimioterapia que apresentam uma assinatura gênica de pelo menos cerca de 80% similar à assinatura gênica Lasso ou SVM respondam positivamente a este agente quimioterapêutico. Em particular, espera-se que esta correlação seja útil para indivíduos tratados com um inibidor de CSF-1R, em particular compostos de Fórmula (I), conforme descrito aqui.
TABELA 4. Relações de risco e intervalos de confiança de 95% associados para o modelo de regressão Lasso em diferentes grupos de pacientes G-CIMP e não G-CIMP. G-CIMP corresponde ao Fenótipo Metilador de Ilhota de CpG em Glioma. P valores foram obtidos através do teste de Wald.
| Estratificação | População de pa- Modelo cientes | Relaçãode CI de 95% risco | P valor | ||
| 'BLZ945'Lasso | Pró-neural não- GCIMP | Univariado | 0,4921 | (0,2796- 0,8766) | 0,0063 |
| 'BLZ945'Lasso | Todos pró-neurais | Univariado | 0,3937 | (0,2301- 0,5961) | 9,729e- 06 |
| G-CIMP | Todos pró-neurais | Univariado | 0,3289 | (0,1481- 0,7304) | 0,01367 |
| G-CIMP | Todos pró-neurais | Multivariado* | 0,4601 | (0,1972- 1,0733) | 0,00783 |
| 'BLZS45'Lasso | Todos pró-neurais | Multivariado* | 0,4296 | (0,2304- 0,8007) | 0,07244 |
* Conjunto de pacientes pró-neurais com dados de metilação que não são definitivamente G-CIMP positivos (total de 67/133 pacientes TCGA pró-neurais).
** Modelo de riscos proporcionais de Cox multivariado usando estratificação de classificação G-CIMP e 'BLZ945'.
TABELA 5. Relações de risco para o modelo de regressão Lasso em
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65/84 diferentes conjuntos de dados de pacientes. P valores foram obtidos através do teste de Wald. Somente relações de risco dos subtipos próneurais são estatisticamente significativas.
| Grupo | Relação de risco | CI de 95% | P valor |
| TCGA - Pró-neural | 0,29 | (0,17-0,50) | 6,32E-06 |
| TCGA - Clássico | 1,28 | (0,73-2,26) | 3,89E-01 |
| TCGA - Mesenquimal | 0,93 | (0,49-1,72) | 8,07E-01 |
| TCGA - Neural | 1,93 | (0,83-4,46) | 1,25E-01 |
| Combinado - Pró-neural | 0,44 | (0,25-0,79) | 5,97E-03 |
| Combinado - Clássico | 1,01 | (0,47-2,17) | 9,79E-01 |
| Combinado - Mesequimal | 1,02 | (0,54-1,94) | 9,43E-01 |
| Combinado - Neural | 0,46 | (0,22-1,01) | 5,23E-02 |
Métodos e Materiais Usados Camundongos [000143] Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e o Use Committee of Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. O modelo de camundongos Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/(base de gênero misto) foi previamente descrito (vide E. Tchougounova et al., Oncogene 26, 6289 (2007)). Camundongos de tipo selvagem (Wild Type - WT), C57BL/6 e β-actina-GFP (C57BL/6) foram adquiridos da Charles River Laboratories e Jackson Laboratories, respectivamente, e também produzidos em nosso biotério.
Injeções Intracranianas [000144] O início dos tumores com RCAS-PDGF-B-HA em camundongos adultos foi previamente descrito (A. H. Shih et al., Cancer Res 64, 4783 (2004)). Resumidamente, os camundongos foram completamente anestesiados com 10 mg/mL de cetamina / 1 mg/mL de xilazina e foram injetados por via subcutânea com 50 ql do anestésico local bupivacaína a 0,25% no local cirúrgico. Os camundongos foram injetados por via intracraniana com 1 ql contendo 2 x 105 células DF
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1:RCAS-PDGF-B-HA entre 5-6 semanas de idade usando um aparelho de estereotaxia fixo (Stoelting). As injeções foram feitas no córtex frontal direito a aproximadamente 1,5 mm lateral e 1 mm caudal do bregma e em uma profundidade de 2 mm.
[000145] Para investigar a expressão específica para tipo de célula de CSF-1 e CSF-1R em populações de células separadas por citometria de fluxo, os tumores foram iniciados em camundongos com RCASPDGF-B-HA-SV40- eGFP (RCAS-PDGF-GFP) conforme anteriormente descrito (E. I. Fomchenko et al., PloS ONE 6, e20605 (2011)). Filhotes Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/- foram injetados com 1 ql de células DF1:RCAS-PDGF-B-GFP no dia 2 pós-natal no córtex esquerdo entre os olhos e ouvidos.
Inibidor e Tratamento com BLZ945 [000146] O inibidor de CSF-1R BLZ945 foi formulado em Captisol a 20% em uma concentração de 12,5 mg/mL. O controle de veículo, Captisol a 20%, foi processado da mesma forma. Para estudos com BLZ945, os camundongos foram dosados com 200 mg/kg de BLZ945 ou veículo (Captisol a 20%) por sonda oral uma vez por dia.
[000147] Para determinar se o fármaco é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica, camundongos portadores de tumor foram tratados com uma dose única de BLZ945 e sacrificados em diferentes pontos de tempo pós-tratamento. Plasma e os hemisférios esquerdo (contralateral) e direito (trazendo tumor) do cérebro foram congelados em nitrogênio líquido para posterior análise das concentrações de BLZ945 no tecido. Para os estudos de sobrevida a longo prazo, a dosagem foi iniciada aos 17 dias/2,5 semanas após a injeção de RCASPDGF-B-HA. Para os estudos de ponto de tempo fixo, os camundongos foram submetidos às varreduras por MRI em 4-5 semanas após a injeção de RCAS-PDGF-B-HA, conforme descrito anteriormente (Transl Oncol 2, 89 (2009)).
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67/84 [000148] Para determinar o volume do tumor, as regiões de interesse (Regions Of Interest - ROI) foram circunscritas sobre imagens ponderadas em T2 e sua área correspondente em mm2 foi multiplicada pela altura da seção de 0,7 mm. O volume total do tumor é a soma do volume ROI em cada seção e o volume para a primeira e última seção na qual o tumor aparece é reduzido pela metade para se aproximar do volume de um trapézio. Quando o volume do tumor estava na faixa de 4,5-40 mm3, os animais foram distribuídos aleatoriamente pelos grupos de tratamento. Um terceiro grupo de camundongos com tumores maiores do que 40 mm3 foi também tratado com BLZ945 (denotado como BLZ945 Large). Um grupo tratado com veículo aleatoriamente combinado não foi incluído para este grupo tendo a maior carga inicial de tumor porque estes camundongos não teriam sido capazes de sobreviver até o endpoint do ensaio.
Sacrifício de Camundongo e Coleta de Tecidos [000149] Camundongos foram sacrificados em momentos definidos, conforme descrito nas legendas de figuras ou quando se tornaram sintomáticos de seus tumores, os quais incluíam sinais de pobre ambulação, letargia, perda de peso, postura curvada, macrocefalia ou convulsões.
[000150] Para isolar os tecidos para congelamento rápido em nitrogênio líquido, os camundongos foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono ou completamente anestesiados com avertina (2,2,2tribromoetanol, Sigma) e deslocamento cervical antes de coleta de tecido. Para citometria de fluxo, os camundongos foram completamente anestesiados com avertina e receberam perfusão transcardíaca com 20 mL de PBS. O cérebro foi, então, isolado e o tumor macrodissecado do tecido normal circundante. Para análise de proliferação, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 100 mg/g de bromodeoxiuridina (BrdU; Sigma) 2 horas antes de sacrifício. Para isoPetição 870190090036, de 11/09/2019, pág. 74/97
68/84 lar os tecidos congelados para histologia, os camundongos foram completamente anestesiados com Avertina, receberam perfusão transcardíaca com 10 mL de PBS, seguido por 10 mL de paraformaldeído a 4% em PBS (PFA). O cérebro foi pós-fixado em PFA durante a noite a 4 ° C, enquanto que os outros tecidos foram criopreservados em sacarose a 30% a 4 °C. Depois de pós-fixação, o cérebro foi, então, transferido para sacarose a 30% e incubado a 4 ° C até que estivesse totalmente equilibrado e sedimentasse no fundo do tubo (tipicamente 2 a 3 dias). Todos os tecidos foram, então, incorporados em OCT (Tissue-Tek) e seções teciduais em criostato de 10 qm foram usadas para todas as análises subsequentes.
Histologia, Imuno-histoquímica e Análise [000151] Para classificação de malignidade do tumor, coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada e os tecidos classificados às cegas por um neuropatologista independente.
[000152] Para imunofluorescência, seções congeladas de 10 qm de espessura foram descongeladas e secas em temperatura ambiente e depois lavadas em PBS. Para o protocolo de coloração padrão, as seções teciduais foram bloqueadas em PNB a 0,5% em PBS durante pelo menos 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C, seguido por incubação com anticorpo primário em PNB a 0,25% durante 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Informação sobre o anticorpo primário e diluições são listadas na Tabela
6. As seções foram, então, lavadas em PBS e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com fluoroforo apropriado (Molecular Probes) em uma diluição de 1:500 em PNB a 0,25% durante 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagem em PBS, as seções teciduais foram contrastadas com DAPI (5 mg/mL de estoque diluído a 1:5000 em PBS) durante 5 minutos antes de montagem com os meios de montagem ProLong Gold Antifade (Invitrogen).
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69/84 [000153] Para a análise de angiogênese e proliferação, seções teciduais foram primeiramente submetidas à recuperação de antígeno com base em tampão de citrato mediante imersão em solução de revelação de antígeno (0,94% v/v em água destilada; Vector Laboratories) e microondas durante 10 minutos em metade da potência, seguido por resfriamento para a temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos. Para análise da angiogênese, os tecidos foram, então, lavados em PBS e bloqueados com reagente de bloqueio de Ig de murino (Vector Laboratories) de acordo com as instruções do fabricante durante 1 hora em temperatura ambiente. Para análise de proliferação, após recuperação do antígeno, as seções teciduais foram incubadas com HCl a 2 M durante 15 minutos em temperatura ambiente para desnaturar o DNA e, em seguida, neutralizadas com tampão de borato de sódio a 0,1 M (pH de 8,5) durante 5 minutos. Após lavagens com PBS, o restante da coloração foi realizada de acordo com o protocolo padrão.
[000154] Para coloração para análise fagocitose, seções congeladas de 10 μm de espessura foram descongeladas e secas em temperatura ambiente e depois lavadas em PBS. As seções teciduais foram bloqueadas em PNB a 0,5% em PBS durante pelo menos 1 hora em temperatura ambiente, seguido por incubação em anticorpo primário anticaspase-3 de coelho diluído a 1:500 em PNB a 0,5% durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas 6 vezes durante 5 minutos em PBS antes de incubação com anticorpo secundário de cabra Alexa568 anticoelho (1:500 em PNB a 0,5%) durante 1 hora em temperatura ambiente. As seções teciduais foram, então, lavadas 6 vezes durante 5 minutos em PBS e bloqueadas durante a noite a 4 °C em um novo tampão de soro de burro a 5%, albumina sérica bovina a 3% e PBS a 0,5% em PNB. No dia seguinte, as lâminas foram incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente com o próximo conjunto de
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70/84 anticorpos primários: anti-Olig2 de coelho (1:200) e anti-CD11b de rato (1:200) diluídos em soro de burro a 5%, albumina sérica bovina a 3% e PBS a 0,5% em PNB. As lâminas foram lavadas 6 vezes durante 5 minutos em PBS antes de incubação com anticorpos secundários de burro anticoelho Alexa647 (1:500) e de burro anti-rato Alexa488 (1:500) em PNB a 0,5% durante 1 hora em temperatura ambiente. As seções teciduais foram, então, lavadas quatro vezes durante 5 minutos em PBS antes de coloração com DAPI (5 mg/mL de estoque diluído a 1:5000 em PBS) durante 5 minutos, lavadas mais duas vezes em PBS durante 5 minutos e montadas com meio de montagem ProLong Gold Antifade (Invitrogen). Co-coloração para CSF-1R (primeiro anticorpo primário) e Iba1 (segundo anticorpo primário) foi também realizada em série do mesmo modo, com a adição de recuperação de antígeno com base em tampão de citrato no início.
[000155] Seções teciduais foram visualizadas sob um microscópio Carl Zeiss Axioimager Z1 equipado com um Apotome. A análise de coloração por imunofluorescência, número de células, proliferação, apoptose e estudos de colocalização foram realizados usando o software de análise TissueQuest (TissueGnostics) conforme anteriormente descrito (Journal Immunol Methods 237, 39 (2000)).
[000156] Visões gerais de seções teciduais de gliomas coradas para análise de angiogênese foram geradas pelo software de aquisição TissueGnostics unido imagens individuais de 200x. Todos os parâmetros de angiogênese foram quantificados usando MetaMorph (Molecular Devices), conforme descrito anteriormente (V. Gocheva et al., Biol Chem 391,937 (2010)).
[000157] Para a análise de fagocitose, 15 campos de vista aleatoriamente selecionados de dentro do tumor foram adquiridos usando a objetiva de imersão em óleo de 63x (ampliação total de 630x) e o Apotome para assegurar que as células estavam na mesma seção óptica.
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As células positivas foram contadas manualmente usando Velocity (PerkinElmer) e foram discriminadas pela presença de um núcleo DAPI+. As células apoptóticas foram contadas como aquelas que tinham coloração de caspase-3 (CC3)+ clivada citoplasmática e núcleos condensados. A célula foi considerada como tendo sido engolfada por um macrófago quando envolvida por um anel CD11b+ contíguo que envolvia pelo menos dois terços da borda da célula. Os números de camundongos analisados são especificados nas legendas das figuras.
Isolamento de Proteínas e Western Blotting [000158] Camundongos foram tratados com veículo ou BLZ945 e sacrificados uma hora após a última dose e os tumores foram coletados. As amostras foram fracionadas bioquimicamente conforme descrito anteriormente. Frações de membrana sinaptossômica foram submetidas à lise em tampão de lise NP-40 (NP-40 a 0,5%, Tris-HCl a 50 mM [pH de 7,5], NaCl a 50 mM, 1x Mini Protease Inhibitor Cocktail completo (Roche), 1x PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail (Roche)) e a proteína quantificada usando o ensaio de BCA (Pierce). Lisatos de proteína foram carregados (90 qg/fileira) sobre géis de SDSPAGE e transferidos para membranas de PVDF para imunoblotting.
[000159] As membranas foram hibridizadas com anticorpos contra fosfo-CSF-1R Y721 (1:1000; Signaling Cell Technology), CSF-1R (1:1000, Santa Cruz Biotechnology) ou GAPDH (1:1000; Signaling Cell Technology) e detectadas usando anticorpos anti-coelho HRPconjugados (Jackson Immunoresearch) usando detecção por quimioluminescência (Millipore). Bandas de Western Blots foram quantificadas na faixa dinâmica usando o módulo de análise Gel no software ImageJ.
[000160] Macrófagos primários derivados de medula óssea (Bone Marrow Derived Macrophages - BMDMs) foram cultivados na ausência de CSF-1 durante 12 horas antes da estimulação com CSF-1 (10
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72/84 ng/mL) durante os pontos de tempo indicados na FIG. S2, na presença ou ausência de BLZ945 a 67 nM. Lisatos de proteína total foram isolados com tampão de lise NP40 e detectados por Western blot conforme descrito acima.
Preparo de Suspensões Com Uma Única Célula e Citometria de Fluxo [000161] Para investigação das populações de macrófagos cerebrais por meio de análise ou triagem por citometria de fluxo, o tumor foi digerido em uma suspensão com uma única célula através de incubação com 5 mL de solução de digestão de papaína (0,94 mg/mL de papaína [Worthington], EDTA a 0,48 mM, 0,18 mg/mL de NAcetil-L-cisteína [Sigma], 0,06 mg/mL de DNase I [Sigma], diluída em solução salina equilibrada de Earl e deixada ativar em temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos). Após digestão, a enzima foi inativada mediante a adição de 2 mL de ovomucoide a 0,71 mg/mL (Worthington). A suspensão de células foi, então, passada através de uma peneira de 40 qm para remover o tecido não digerido, lavada com tampão para FACS (BSA a 1% sem IgG em PBS [Jackson Immunoresearch]) e centrifugada em baixa velocidade de 750 rpm (Sorvall Legend RT) para remover resíduos e obter a pelota de células. Uma vez que muitos epítopos de células imunes são sensíveis à papaína, para investigação da infiltração de células imunes por análise de citometria de fluxo, os tumores foram digeridos em uma suspensão de uma única célula por meio de incubação durante 10 minutos a 37 °C com 5 mL de colagenase III a 1,5 mg/mL (Worthington) e 0,06 mg/mL de DNase I em 1x Solução Salina Equilibrada de Hanks (Hanks Balanced Salt Solution HBSS) com cálcio e magnésio.
[000162] A suspensão de células foi, então, lavada com PBS e passada através de uma peneira de 40 qm para remover o tecido não digerido. Para remover os restos de mielina, a pelota de células foi res
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73/84 suspensa em 15 mL de Percoll a 25% em temperatura ambiente preparado a partir de Percoll de estoque isotônico (Percoll a 90% [Sigma], HBSS a 10%, 10x) e, em seguida, centrifugada durante 15 minutos a 1500 rpm (Sorvall Legend RT) com acelerador e freio definidos como 1. A pelota de células foi, então, lavada com 1x HBSS antes de ser ressuspensa em tampão para FACS. Após contagem, as células foram incubadas com 1 gl Fc Block por cada milhão de células durante pelo menos 15 minutos a 4 °C. As células foram, então, coradas com os anticorpos apropriados durante 10 minutos a 4 °C, lavadas com tampão para FACS e ressuspensas em tampão para FACS contendo DAPI (5 mg/mL, diluído a 1:5000) para exclusão de células vivas/mortas. Os anticorpos usados para citometria de fluxo são listados na Tabela 6.
TABELA 6. Lista de anticorpos e fontes
| Anticorpo | Clone | Vendedor | Fluoroforo(s) | Diluição |
| CD45 | 30-F11 | BD Pharmingen | FITC, APC, PE- Cy7 | 1:100-1:200 |
| CD3e | 145-2C11 | BD Pharmingen | PE-Cy7 | 1:250 |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BD Pharmingen | FITC | 1:200 |
| CD4 | GK1.5 | BD Pharmingen | PE | 1:1000 |
| CD11b | M1/70 | BD Pharmingen | A488, APC, PE | 1:200 |
| Ly6G | 1A8 | BD Pharmingen | PE-Cy7 | 1:2000 |
| F4/80 | Cl:A3-1 | Serotec | PE | 1:50 |
| CD8a | 53-6.7 | Biolegend | A438 | 1:1000 |
| CD19 | 6D5 | Biolegend | PE | 1:2000 |
| NK1.1 | PK136 | Biolegend | APC | 1:1000 |
| CD206 | MR5D3 | Biolegend | A488 | 1:50 |
[000163] Para análise, as amostras foram passadas sobre um BD LSR II (Becton Dickstein) e toda subsequente compensação e ativação realizadas com o software de análise FlowJo (TreeStar). Para triagem, as amostras foram passadas sobre um classificador de células BD
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FACSAria (Becton Dickstein) e as células foram coletadas em tampão para FACS. As células foram, então, centrifugadas e novamente suspensas em 500 mL de Trizol (Invitrogen) antes de congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 °C.
Derivação de Culturas de Glioma Primárias de Camundongo, Neuroesferas e Linhagens de Células de Glioma [000164] Tumores macrodissecados foram digeridos em uma suspensão com uma única célula por meio de incubação durante 8-12 minutos a 37 °C, conforme descrito acima. A suspensão de células foi lavada com meio basal para células estaminais neurais (Neural Stem Cell - NSC) (Stem Cell Technologies) e centrifugada em baixa velocidade (750 rpm, Sorvall Legend RT) para remover os resíduos. Para derivar culturas de glioma de camundongo, culturas primárias da pelota de células foram ressuspensas em DMEM contendo FBS a 10% (Gibco). Estas culturas primárias foram usadas em passagem precoce (P2-P3) e continham uma mistura de diferentes tipos de células encontrados em gliomas, incluindo células tumorosas, macrófagos e astrócitos, conforme determinado pela técnica de coloração por imunofluorescência. Culturas primárias de glioma foram cultivadas durante 24 horas sobre lamínulas revestidas de poli-L-lisina (BD Biocoat). As células foram, então, fixadas com PFA a 4% em tampão de fosfato a 0,1 M durante a noite a 4 °C, permeabilizadas com Triton-X a 0,1% durante 5 minutos e bloqueadas com PNB a 0,5% durante pelo menos uma hora. A presença de macrófagos, células tumorosas e astrócitos foi examinada através de coloração por imunofluorescência de CD11b (1:200), nestina (1:500) e GFAP (1:1000), respectivamente (Tabela 7).
TABELA 7. Lista dos anticorpos usados para coloração
| Anticorpo | Clone | Vendedor | Diluição |
| Anticorpo de cabra anti-CD31 de camundongo | -- | R&D Systems | 1:100 |
| Antiactina de músculo liso humano de camun- | 1A4 | DakoCytomation | 1:100 |
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| dongo (SMA) | |||
| Anticaspase 3 clivada de coelho (Asp175) (CC3) | -- | Cell Signaling Teehnol- ogy | 1:500 |
| Anti-CSF-1 R humano de coelho | C-20 | Santa Cruz | 1:200 |
| Anti-Iba1 de coelho | -- | Wako | 1:1000 |
| Antiproteína fluorescente verde (GFP) de coelho | -- | Molecular Probes | 1:200 |
| Anti-Olig2 de coelho | -- | Millipore/Chernicon | 1:200 |
| Anticorpo de camundongo anti-Nestina de rato | -- | BD Pharmingen | 1:500 |
| Anticorpo de rato anti-CD11 b de camundongo | M1/70 | BD Pharmingen | 1:200 |
| Anti-BrdU de rato | BU1/75(ICR1) | Serotec | 1:200 |
| Anticorpo de rato anti-CD68 de camundongo | FA-11 | Serotec | 1:1000 |
| Anti-GFAP de galinha | -- | Abeam | 1:1000 |
[000165] Para a formação da neuroesferas, a pelota de células foi ressuspensa em meio para neuroesfera que consiste em meio basal de camundongo NSC, suplementos proliferação NSC, 10 ng/mL de EGF, 20 ng/mL de FGF-básico e 1 mg/mL de Heparina (Stem Cell Technologies). Meios frescos foram adicionados a cada 72 horas durante 2 semanas. Neuroesferas primárias foram coletadas, desagregadas mecanicamente em uma suspensão com uma única célula e propagadas por passagens seriais. Para gerar linhagens de células de glioma, neuroesferas secundárias foram dissociadas em suspensões com uma única célula e cultivadas em DMEM + FBS a 10% como uma monocamada. Várias linhagens de células de glioma foram derivadas de camundongos independentes, denotadas GBM1-4 aqui. As células de glioma foram infectadas com um construto pBabe-H2B-mCherry conforme descrito anteriormente (O. Florey et al., Nat. celular Biol 13, 1335 (2011)).
Isolamento de Macrófagos Derivados da Medula Óssea (Bone Marrow-Derived Macrophages - BMDMs) [000166] Para o isolamento de medula óssea, seguido por derivação de macrófagos, C57BL/6 WT, C57BL/6, β-actina-GFP ou Nestin Tv-a,
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76/84 camundongos Ink4a/Arf-/- foram anestesiados com Avertin (Sigma) e depois sacrificados por meio de deslocamento cervical. Fêmures e tíbias foram coletados sob condições estéreis de ambas as pernas e lavados. A medula foi passada através de uma peneira de 40 pm e cultivada em sacos de Teflon® de 30 mL (PermaLife PL-30) com 10 ng/mL de CSF-1 recombinante de camundongo (R&D Systems). Células da medula óssea foram cultivadas em sacos de Teflon® durante 7 dias, com substituição por meios contendo CSF-1 fresco em dias alternados para induzir à diferenciação de macrófagos.
[000167] Linhagens de células adicionais de glioma U-87 MG (HTB14) e linhagens de células de microglias CRL-2467 foram adquiridas da ATCC. A linhagem de células U-87 MG foi cultivada em meio DMEM + FBS a 10%. A linhagem de células CRL-2467 foi cultivada em DMEM + FBS a 10% com 30 ng/mL de CSF-1 recombinante de camundongo.
Experimentos com Meio Condicionado com Células de Glioma (Glioma Cell-conditioned Media - GCM) [000168] Meios que tinham sido condicionados por linhagens de células tumorasas de glioma cultivadas em meio livre de soro durante 24 horas foram passados através de filtros de 0,22 pm para remover os resíduos celulares e são referidos aqui como meios condicionados com células de glioma (Glioma Cell-conditioned Media - GCM). GCM foi usado para estimular C57BL/6 WT ou BMDMs B-actina-GFP+ diferenciados. Macrófagos de controle receberam meio fresco contendo FBS a 10% e 10 ng/mL de CSF-1 recombinante de camundongo. Quando indicado, BMDMs diferenciados foram cultivados em CGM contendo DMSO como veículo ou BLZ945 a 67 nM, BLZ945 a 670 nM ou em meios normais contendo 10 ng/mL de CSF-1 recombinante de camundongo e 10 ng/mL de IL-4 (R&D Systems) durante 24 horas ou 48 horas antes de análise experimental.
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Análise de Expressão de Mrc1/CD206 Por Citometria de Fluxo [000169] Para culturas de glioma primário de camundongo (contendo uma população mista de células tumorosas, TAMs, astrócitos, etc.), 1 x 106 células foram cultivadas em DMEM + FBS a 10% na presença de BLZ945 ou DMSO como veículo. Para BMDMs, 1 x 106 células foram cultivadas em DMEM suplementado com CSF-1 recombinante de camundongo ou MGC na presença de BLZ945 ou DMSO como veículo. Após 48 horas, as células foram raspadas e lavadas com tampão para FACS. As células foram contadas e incubadas com 1 mL de Fc Block (BD Pharmingen) por 106 células durante pelo menos 15 minutos a 4 °C. As células foram, então, coradas com anticorpos CD45 e CD11b durante 10 minutos a 4 °C e lavadas com tampão para FACS. As células foram fixadas e permeabilizadas usando o kit BD Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, as células foram coradas com anticorpo anti-CD206. Para análise, as amostras foram passadas em um BD LSR II (Becton Dickstein) e toda compensação e ativação subsequentes realizadas com o software de análise FlowJo (TreeStar).
Análise de Ciclo Celular [000170] Macrófagos de controle ou pré-estimulados com GCM derivados de camundongos B-actina-GFP+ foram cocultivados em uma proporção de 1:1 com 1 x 105 células de glioma mCherry-positivas privadas de soro (das linhagens de células derivadas supra) durante 48 horas na presença de BLZ945 a 670 nm ou DMSO como veículo. Após coleta de células cocultivadas tripsinizadas, as cavidades foram lavadas em meio adicional e este volume foi recolhido para garantir a coleta de todos os macrófagos os quais aderiram firmemente aos discos de cultura de células. As amostras foram, então, lavadas uma vez com tampão SCAF, seguido por incubação durante 10 minutos em tempe
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78/84 ratura ambiente em tampão de permeabilização (PIPES a 10 mM, NaCI a 0,1 M, MgCl2 a 2 mM, Triton X-100 a 0,1%, pH de 6,8) contendo 0,1 mg de DAPI (Invitrogen). Após aquisição sobre um citômetro de fluxo LSR II (BD) usando um laser de UV (350-360 nm), o estado de ciclo celular de células tumorosas de glioma foi analisado usando o programa Flow Jo Dean-Jett-Fox para análise de ciclo celular.
Ensaios de Proliferação [000171] A taxa de crescimento celular foi determinada usando o kit de proliferação de células MTT (Roche). Resumidamente, as células foram cultivadas em triplicata em placas com 96 cavidades (1 x 103 células/cavidade para linhagens de células de glioma e 5 x 103 células/cavidade para células de BMDM e CRL-2467) na presença ou ausência de BLZ945 a 6,7-6700 nM. O meio foi trocado a cada 48 horas. Células de BMDM e CRL-2467 foram suplementadas com 10 ng/mL e 30 ng/mL de CSF-1 recombinante de camundongo, respectivamente, a menos que indicado de outra forma. 10 μl de reagente de marcação MTT foram adicionados a cada cavidade e depois incubados durante 4 horas a 37 °C, seguido pela adição de 100 μl de reagente de solubilização MTT durante a noite. A mistura foi novamente suspensa delicadamente e absorbância foi medida a 595 nm e 750 nm em um leitor de placas SpectraMax 340pc (Molecular Devices).
Ensaio de Formação de Neuroesfera Secundária [000172] Neuroesferas primárias foram desagregadas em uma suspensão de uma única célula e 5 x 103 células foram colocadas em uma placa com 6 cavidades em meio para neuroesferas na presença de BLZ945 ou DMSO como veículo. O meio foi trocado a cada 48 horas. A formação de neuroesfera secundária foi ensaiada contando-se o número de neuroesferas obtidas após 2 semanas.
Isolamento de RNA, Síntese de cDNA e PCR em Tempo Real Quantitativa
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79/84 [000173] O RNA foi isolado com Trizol, tratado com DNase, e 0,5 μο de RNA foram usados para a síntese de cDNA. Sondas TaqMan (Ap plied Biosystems) para CD11b (Mm00434455_m1), CD68 (Mm03047343_m1), CSF-1 (Mm00432688_m1), CSF-1R (Mm00432689_m1), Il34 (Mm00712774_m1), Mrc1 (Mm00485148_m1) e Tv-a (personalizado) foram usadas para qPCR. Os ensaios foram realizados em triplicata e a expressão foi normalizada para ubiquitina C (Mm01201237_m1) para cada amostra.
Microarranjos e Caracterização de Perfil de Expressão Gênica [000174] Todas as amostras foram preparadas e processadas pela instalação Genomics Core em MSKCC. O RNA foi isolado usando o reagente Trizol e a qualidade foi avaliada passando sobre um Agilent Bioanalyzer. 75 ng de RNA total foram transcritos de forma inversa e marcados usando o kit Genechip 3' IVT Express (Affymetrix). O cRNA resultante foi hibridizado com chips Affymetrix MOE 430A 2.0. Dados de expressão brutos foram analisados usando GCOS 1.4 (Affymetrix). Os dados foram normalizados para uma intensidade alvo de 500 para levar em conta diferenças na intensidade global do chip.
Análise de Microarranjo [000175] Todas as análises de bioinformática foram completadas em R usando o pacote Bioconductor Suite. Valores de expressão da Mé dia Multi-Arranjo Robustos (Robust Multi-Array Average RMA) foram gerados usando o pacote 'affy' e normalizados por quantis (R. A. Irizarry et al., Nucleic Acids Res 31, e15 (2003); L. Gautier et al., Bioinformatics 20, 307 (2004). O pacote 'limma' (G. K. Smyth, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, Artigo 3 (2004)) foi usado para identificar os genes diferencialmente expressos entre o veículo e amostras tratadas com BLZ945. Expressão diferencial foi considerada significativa em uma razão de alteração de +/- 2 com uma
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80/84 taxa de falsa constatação de 10%. Análise de enriquecimento de conjunto gênico (Gene Set Enrichment Analysis - GSEA) foi usada conforme anteriormente descrito (15). Para subsequente análise e comparação dos conjuntos de dados para ser humano, os valores da expressão de conforme foram centralizados por média em todas as amostras.
Método de Regressão Lasso para Identificação de Assinatura Gênica [000176] Dados de expressão de camundongo foram normalizados e centralizados pela média, conforme descrito acima. Genes diferencialmente expressos foram usados para análise posterior. Um modelo de regressão Lasso foi treinado para distinguir entre Veículo e amostras tratadas com BLZ945 usando o pacote 'glmnet' (J. Friedman et al., Journal of Statistical Software 33, 1 (2010)). O parâmetro de regularização para a regressão Lasso foi escolhido por validação cruzada 4 vezes.
Conjuntos de Dados de Pacientes [000177] Dados de expressão TCGA foram baixados do portal de dados de TCGA e todos os dados clínicos foram baixados do portal de dados <http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp>. Os dados clínicos e de expressão para o conjunto de dados Rembrandt foram baixados em <https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/>. Os conjuntos de dados Freije (GSE4412), Murat (GSE7696) e Phillips (GSE4271) foram baixados em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/> NCBI. Para os conjuntos de dados Freije, apenas as amostras que foram executadas sobre a plataforma HGU133A foram considerados, uma vez que as amostras na plataforma HGU133B continham um mínimo de sobreposição com os conjuntos de dados restantes. Cada conjunto de dados foi importado separadamente usando o pacote 'Affy' e valores de expressão RMA foram gerados. Todos os conjuntos de dados foram normalizados por quantis e cada gene foi centralizado
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81/84 pela média em todos os pacientes.
Subtipagem de Pacientes não TCGA [000178] Para investigar diferenças de sobrevida específicas para subtipo em todos os conjuntos de dados publicamente disponíveis, um classificador de subtipo descrito anteriormente (R. G. Verhaak et al., Cancer Cell 17, 98 (2010)) foi usado para treinar uma máquina de vetor de suporte (Support Vector Machine - SVM). Os 840 genes usados por Verhaak e colaboradores para a análise ClacNc foram usados para subconjunto do conjunto de dados. Subsequentemente, os conjuntos de dados foram subdivididos por genes que foram verifcados presentes em todos os conjuntos de dados dos pacientes descritos acima. Os 776 genes restantes foram usados para treinar uma SVM multiclasse sobre amostras Core do conjunto de dados de TCGA. O SVM foi completada usando uma função 'kernel' de base radial Gaussiana usando o pacote 'kernlab' (Karatzoglou A. et al., J. Statistical Software, 11, 9 (2004)). Este SVM foi, então, usada para prever o subtipo dos pacientes TCGA restantes e conjuntos de dados públicos.
Classificação de Pacientes [000179] A SVM foi treinada sobre dados de expressão de camundongo para classificar os pacientes na classificação Veículo ou na classificação BLZ945. Dados de expressão dos pacientes foram subdivididos para genes comuns em todos os conjuntos de dados e genes que têm homólogos conhecidos em camundongo. Similarmente, dados de expressão de camundongos foram subdivididos para genes com homólogos humanos que eram comuns em todas as amostras dos pacientes. Subsequentemente, os dados de camundongo foram subdivididos para genes diferencialmente expressos identificados usando o pacote 'limma'. Os dados para seres humanos foram subdivididos para os homólogos humanos destes genes diferencialmente expressos. Isto levou a uma redução característica de 257 genes diferencialmente ex
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82/84 pressos para 206 genes diferencialmente expressos com homólogos humanos conhecidos em todos os conjuntos de dados dos pacientes. O pacote 'kernlab' foi, então, usado para treinar uma SVM sobre os dados de expressão de camundongo usando uma função 'kernel vanilla'. Esta SVM foi, então, usada para classificar os pacientes no classificador Veículo ou no classificador BLZ945.
[000180] Uma abordagem similar foi usada para classificar os pacientes com um modelo de regressão Lasso. A subdivisão de dados do paciente e de camundongos foi idêntica àquela descrita acima. Em vez de usar o pacote 'kernlab', o modelo de regressão Lasso foi treinado usando o pacote 'glmnet'. Este modelo foi, então, usado para prever a classificação do paciente no classificador Veículo ou no classificador BLZ945. O estado do paciente G-CIMP foi determinado por meio de agrupamento hierárquico de dados de metilação do paciente (Noushmehr H. et al., Cancer Cell 17, 510 (2010)), conforme descrito abaixo.
Estratificação de Pacientes Pelo Estado G-CIMP [000181] Experimentalmente, parece que a vantagem de sobrevida conferida pela assinatura de tratamento BLZ945 não foi em virtude de um enriquecimento de pacientes com Fenótipo Metilador de Ilhota de CpG em Glioma (Glioma CpG Island Methylator Phenotype GCIMP), o qual tinha sido mostrado anteriormente estar associado à sobrevida global aprimorada (Noushmehr). Dos 453 GBMs analisados a partir do conjunto de dados de TCGA, 263 também tinham dados de metilação genômica e foram classificados nos agrupamentos de metilação, conforme descrito anteriormente. Dos 21 pacientes G-CIMP, 20 (95%) foram classificados na classificação BLZ945, mostrando um forte enriquecimento de amostras de BLZ945 nos pacientes G-CIMP. Apesar deste enriquecimento, análise de sobrevida de pacientes próneurais conhecidos por serem GCIMP negativos (total de 67/133 pacientes pró-neurais) revelou que o grupo na classificação BLZ945 ain
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83/84 da mostrava um aumento na sobrevida de ~ 10,8 meses (P = 0,014). [000182] Além disso, modelos de risco proporcional de Cox demonstraram que o aumento na sobrevida demonstrado pela classificação BLZ945 não era dependente de pacientes G-CIMP. A proporção de risco associada à assinatura de BLZ945 foi significativa, com e sem pacientes G-CIMP. Além disso, a proporção de risco para a estratificação G-CIMP não foi significativa quando a assinatura de BLZ945 também foi considerada em um modelo misto. Assim, embora os pacientes G-CIMP sejam claramente enriquecidos para amostras com classificação BLZ945 simulada, o benefício de sobrevida conferido por esta classificação não é dependente do estado de G-CIMP.
Análise de Sobrevida [000183] A análise de sobrevida foi completada usando o pacote 'Survival' no R (T. Therneau, em R Package, versão 2.36-12 (2012)). As proporções de risco foram determinadas usando a função 'coxph' do pacote 'Survival'. Os pacientes foram estratificados com base na probabilidade do modelo de classificação de regressão Lasso, estado G-CIMP ou ambos, conforme indicado. P valores foram gerados usando o teste de Wald.
Representações Gráficas Para Análises de Pacientes [000184] Todas as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier, mapas térmicos e representações gráficas Volcano foram gerados no R v
2.14.1 usando o pacote 'gplots' (G. R. Warnes et al., R Package, versão 2.10.1, (2011)). As representações gráficas de Forest de proporção de risco foram geradas no GraphPad Prism Pro5.
Apresentação de Dados e Análise Estatística [000185] Os dados são apresentados como médias com seu respectivo erro-padrão (SEM) ou como gráficos de dispersão estatística usando GraphPad Prism Pro5. Os dados numéricos foram analisados pelo t-teste de Student não pareado duplamente configurado, salvo
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84/84 indicação em contrário. Para curvas de sobrevida, os P valores foram obtidos usando o teste Log Rank (Mantel-Cox) e o teste exato de Fisher foi usado para classificação histológica do tumor. P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1. Uso de uma quantidade eficaz de um composto de Fór- mula (I):
(I)
sendo que R' é Me ou Et; eR2 é
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar um tumor cerebral em um mamífero. - 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de Fórmula (I) é:MeHN
- 3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peloPetição 870190090036, de 11/09/2019, pág. 92/972/2 fato de que o composto de Fórmula (I) é:
- 4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tumor é um glioma.
- 5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o glioma é glioblastoma multiforme.
- 6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tumor cerebral é uma metástase cerebral, astrocitoma (incluindo glioblastoma), oligodendroglioma, ependimomas, ou um glioma misto.
- 7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o composto é formulado para uso com um co-agente terapêutico.
- 8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o co-agente terapêutico é selecionado dentre agentes antiangiogênicos, bevacizumab com ou sem irinotecan, nitrosoureias tal como carmustina (BCNU), platinas tal como c/s-platina (cisplatina), agentes de alquilação tal como temozolomida, inibidores de quinase de tirosina (gefitinib ou erlotinib), ucraína e canabinoides.
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