JP2017519006A

JP2017519006A - 低用量ナルトレキソンによるがん細胞の準備刺激

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Publication number: JP2017519006A
Application number: JP2016572543A
Authority: JP
Inventors: ダルグリッシュ，アンガス; リウ，ワイ
Original assignee: キャンサーワクチンインスティテュート
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2017-07-13
Anticipated expiration: 2035-06-09
Also published as: DK3151831T3; US20170119755A1; ES2730348T3; WO2015189597A1; US11065245B2; PT3151831T; GB201410216D0; EP3151831A1; PL3151831T3; TR201908660T4; JP6620338B2; EP3151831B1; US20210308125A1

Abstract

本発明は、ナルトレキソンまたはその類似体が第一治療段階において対象に投与され、その後に回復段階が続き；回復段階の後、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤が第二治療段階において対象に投与され；回復段階が、ナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤の投与がないことを特徴とする、腫瘍／がんを有する対象の治療で使用されるナルトレキソンまたはその類似体を含む医薬組成物を提供する。また、第一治療段階に対する対象の応答を評価するための診断検査、ナルトレキソンと併用された場合の小分子シグナル伝達阻害剤の有効性を試験するインビトロ法、およびインビボでの、そのような方法におけるナルトレキソンの用途も企図される。

Description

本発明は、がんの治療で使用するための薬剤投与および薬剤併用のレジーム（regime）に関する。

ナルトレキソンは、アヘン中毒に対する処置として一般的に使用される、モルフィナン‐６‐オン，１７‐（シクロプロピルメチル）‐４，５‐エポキシ‐３，１４‐ジヒドロキシ‐（５α）という化学名を有する、経口投与用のオピオイド拮抗薬である。しかしながら、多くの患者が、低用量のナルトレキソン（ＬＤＮ）を一連の免疫関連病態およびがんに対する適応外処置として使用している。ＬＤＮが多発性硬化症（Rahn et al. 2011）、クローン病（Smith et al. 2011）およびある種のがんにおいて有効であり得るという予備的証拠がある。

がんに関連して、Zagon and McLaughlin (1983)およびHytrek et al. (1996)によって、マウス異種移植モデルにおいて評価された場合の、マウス神経芽細胞腫およびヒト結腸がん細胞成長のＬＤＮ介在性阻害がそれぞれ報告された。さらに、ＬＤＮと追加の治療薬との併用が、ある種のがん型の成長および進行に対して有効であることが分かった。例えば、Donahue et al. (2011a)では、インビトロおよびインビボのマウス異種移植モデルの両方における、ヒト卵巣がん細胞に対するＬＤＮおよびシスプラチンの強力な抗増殖作用が報告された。臨床では、Berkson et al. (2006)によって、肝臓への転移を伴う膵がんを有する患者の、ＬＤＮと併用したα‐リポ酸による治療後の長期生存が記述され；以来、前記著者らによって、転移性膵がんを有するさらに３人の患者における同様の所見が報告されている（Berkson et al. 2009）。

ナルトレキソンによる成長阻害の機構に関して、Donahue et al. (2011b)によって、ｐ１６および／またはｐ２１サイクリン依存性阻害キナーゼ経路に依存した、ＤＮＡ合成の減少に関連する、ヒト卵巣がん細胞における短期間ナルトレキソン暴露の抗増殖作用が報告された。前記著者らによって、細胞生存（壊死およびアポトーシス）に関連する経路においての、この暴露によって生じるいかなる変化も報告されなかった。従って、ナルトレキソン、特にＬＤＮの抗増殖作用の基礎を成す機構は未だ大部分が未調査であり、それ故、ＬＤＮのより深い機構的理解から得られる合理的な治療方針も未だ開発されていない。

最初に、腫瘍／がんの細胞成長の阻害に使用された場合の低用量ナルトレキソン（ＬＤＮ）の有効性が、投与後の回復（または洗浄）段階の使用を通じて増大することが、本発明者らによって発見された（実施例１）。第二に、アポトーシスの制御に関与する細胞タンパク質（とりわけ、Bcl-2-associated death promoter (BAD)タンパク質、およびプロテインキナーゼＢとしても知られているＡＫＴ等のセリン／トレオニン特異的キナーゼ）のレベルに対し、ＬＤＮが特異的な作用を有することが、本発明者らによって確定された（実施例２）。

当該技術分野においてそれまで知られていなかったＬＤＮの上記の特性は、小分子シグナル伝達阻害剤（ＬＤＮによって仲介されることが分かった経路に流れ込む）と併用された場合の特定の投与レジーム（regime）によって、前記薬剤のアポトーシス誘発能が最大化され、それにより抗腫瘍形成能が最大化されることを示している。このことから、ＬＤＮは、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤による治療介入
（第二治療段階）に先立つ、腫瘍／がんの細胞の準備刺激（第一治療段階）に使用されることになる。

例示的な小分子シグナル伝達阻害剤による治療介入の前の、第一治療段階の一部としてのＬＤＮによる準備刺激が、実施例３に示される。前記準備刺激によって、処置無し段階（ＬＤＮが投与されない）の後の阻害剤の投与、および継続的なＬＤＮ投与の両方よりも、より大きな細胞殺傷がもたらされることが、本発明者らによって示された。ＬＤＮによる前記準備刺激は、ＬＤＮも小分子シグナル伝達阻害剤も投与されない、（上記で詳述された）間に挟まれる回復段階の使用によって、より効果的なものとなる。

本発明の第一の態様により、ナルトレキソンまたはその類似体が第一治療段階において対象に投与され、その後に回復段階が続き；回復段階の後、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤が第二治療段階において対象に投与され；回復段階が、ナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤の投与がないことを特徴とする、腫瘍／がんを有する対象の治療で使用されるナルトレキソンまたはその類似体を含む医薬組成物が提供される。

本発明の第二の態様により、対象にナルトレキソンまたはその類似体が投与される腫瘍／がんを有する対象の第一治療段階に対する応答をモニターするための診断検査が提供され；前記診断検査は、前記第一治療段階を受けている対象から得られた試料を分析することによって、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか、
を決定することを含み、
前記診断検査では、そうである場合、対象が、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤の投与を含む第二治療段階を受けるのに適しているということが示される。

本発明の第三の態様により、ナルトレキソンまたはその類似体と併用された場合の腫瘍／がんの治療における有効性について小分子シグナル伝達阻害剤を試験するインビトロ法が提供され；前記インビトロ法は、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤を、ナルトレキソンもしくはその類似体と同時に、またはナルトレキソンもしくはその類似体の後に、腫瘍／がんの細胞に投与し、一つまたは複数の前記細胞を含む試料を分析することで、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
前記インビトロ法では、そうである場合、小分子シグナル伝達阻害剤の有効性が示される。

本発明の第四の態様により、ナルトレキソンまたはその類似体と併用される場合の腫瘍
／がんの治療における有効性について小分子シグナル伝達阻害剤を試験する方法で使用するための、ナルトレキソンまたはその類似体を含む医薬組成物が提供され、前記方法は、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤を、ナルトレキソンもしくはその類似体と同時に、および／またはナルトレキソンもしくはその類似体の後に、腫瘍／がんを有する対象に投与し、一つまたは複数の腫瘍／がんの細胞を含む試料を分析することで、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか、
を決定することを含み；
前記方法では、そうである場合に、小分子シグナル伝達阻害剤の有効性が示される。

図１は、細胞数減少を引き起こす、ＬＤＮ暴露後の回復段階を示している。（Ａ）Ａ５４９細胞（肺がん細胞株）および（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞（結腸直腸癌細胞株）を、１μＭおよび１０ｎＭ（低用量）ナルトレキソン（ＬＤＮ）中、並びに１μΜおよび１０μΜ（標準用量）ナルトレキソン（ＮＴＸ）中で、４８時間培養した。次に細胞を、洗浄し、無薬剤培地中で２４時間成長させ（洗浄）、または、ナルトレキソン中で合計７２時間連続培養した（７２）ところ；細胞は吸光度の読み取りによって評価された生存率であった。また、ＨＣＴ１１６細胞に対する洗浄段階の効果を、（Ｃ）３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）比色分析、（Ｄ）細胞計数および（Ｅ）生細胞の割合によって測定した。図１は、細胞数減少を引き起こす、ＬＤＮ暴露後の回復段階を示している。（Ａ）Ａ５４９細胞（肺がん細胞株）および（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞（結腸直腸癌細胞株）を、１μＭおよび１０ｎＭ（低用量）ナルトレキソン（ＬＤＮ）中、並びに１μΜおよび１０μΜ（標準用量）ナルトレキソン（ＮＴＸ）中で、４８時間培養した。次に細胞を、洗浄し、無薬剤培地中で２４時間成長させ（洗浄）、または、ナルトレキソン中で合計７２時間連続培養した（７２）ところ；細胞は吸光度の読み取りによって評価された生存率であった。また、ＨＣＴ１１６細胞に対する洗浄段階の効果を、（Ｃ）３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）比色分析、（Ｄ）細胞計数および（Ｅ）生細胞の割合によって測定した。図１は、細胞数減少を引き起こす、ＬＤＮ暴露後の回復段階を示している。（Ａ）Ａ５４９細胞（肺がん細胞株）および（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞（結腸直腸癌細胞株）を、１μＭおよび１０ｎＭ（低用量）ナルトレキソン（ＬＤＮ）中、並びに１μΜおよび１０μΜ（標準用量）ナルトレキソン（ＮＴＸ）中で、４８時間培養した。次に細胞を、洗浄し、無薬剤培地中で２４時間成長させ（洗浄）、または、ナルトレキソン中で合計７２時間連続培養した（７２）ところ；細胞は吸光度の読み取りによって評価された生存率であった。また、ＨＣＴ１１６細胞に対する洗浄段階の効果を、（Ｃ）３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）比色分析、（Ｄ）細胞計数および（Ｅ）生細胞の割合によって測定した。図１は、細胞数減少を引き起こす、ＬＤＮ暴露後の回復段階を示している。（Ａ）Ａ５４９細胞（肺がん細胞株）および（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞（結腸直腸癌細胞株）を、１μＭおよび１０ｎＭ（低用量）ナルトレキソン（ＬＤＮ）中、並びに１μΜおよび１０μΜ（標準用量）ナルトレキソン（ＮＴＸ）中で、４８時間培養した。次に細胞を、洗浄し、無薬剤培地中で２４時間成長させ（洗浄）、または、ナルトレキソン中で合計７２時間連続培養した（７２）ところ；細胞は吸光度の読み取りによって評価された生存率であった。また、ＨＣＴ１１６細胞に対する洗浄段階の効果を、（Ｃ）３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）比色分析、（Ｄ）細胞計数および（Ｅ）生細胞の割合によって測定した。図１は、細胞数減少を引き起こす、ＬＤＮ暴露後の回復段階を示している。（Ａ）Ａ５４９細胞（肺がん細胞株）および（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞（結腸直腸癌細胞株）を、１μＭおよび１０ｎＭ（低用量）ナルトレキソン（ＬＤＮ）中、並びに１μΜおよび１０μΜ（標準用量）ナルトレキソン（ＮＴＸ）中で、４８時間培養した。次に細胞を、洗浄し、無薬剤培地中で２４時間成長させ（洗浄）、または、ナルトレキソン中で合計７２時間連続培養した（７２）ところ；細胞は吸光度の読み取りによって評価された生存率であった。また、ＨＣＴ１１６細胞に対する洗浄段階の効果を、（Ｃ）３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）比色分析、（Ｄ）細胞計数および（Ｅ）生細胞の割合によって測定した。図２は、吸光度読み取りによって評価された、Ｔ９８Ｇ細胞およびＵ８７ＭＧ細胞（神経膠腫細胞株）に対する上記効果を示している。図３は、（Ａ）ウエスタンブロット、および（Ｂ）（Ａ）におけるタンパク質バンドのデンシトメトリー分析によって評価された、いくつかの細胞周期タンパク質のレベルに対する、未処理細胞と比較した、ＨＣＴ１１６細胞における１０μΜ（ＮＴＸ）および１０ｎＭ（ＬＤＮ）のナルトレキソンの効果を示している。方法論的には、ＨＣＴ１１６細胞を、ＮＴＸおよびＬＤＮで４８時間処理し、その後、図面において標識されたような細胞タンパク質の測定を行った。各バンドの強度は、これらのタンパク質が発現されたレベルを示しており、密度分析で計数された。図４は、（Ａ）マイクロアレイ解析で測定された上記細胞周期タンパク質の遺伝子発現レベル（ＮＴＸおよびＬＤＮ処理後）を、（Ｂ）図３（Ｂ）に示されるタンパク質レベルと比較している。図４は、（Ａ）マイクロアレイ解析で測定された上記細胞周期タンパク質の遺伝子発現レベル（ＮＴＸおよびＬＤＮ処理後）を、（Ｂ）図３（Ｂ）に示されるタンパク質レベルと比較している。図５は、ＨＣＴ１１６細胞の（Ａ）細胞数および（Ｂ）細胞生存率に対する、実施例３に詳述される治療レジメンの効果を示している。Ｕ‐Ｕ：無処理９６時間；Ｌ‐Ｌ：ＬＤＮ９６時間；Ｕ‐Ｃ：無処理４８時間、その後シクロホスファミド４８時間；Ｌ‐Ｃ：ＬＤＮ４８時間、その後シクロホスファミド４８時間；Ｕ‐Ｇ：無処理４８時間、その後ゲムシタビン４８時間；Ｌ‐ＧＬＤＮ４８時間、その後ゲムシタビン４８時間；Ｕ‐Ｏ：無処理４８時間、その後オキサリプラチン４８時間。図５は、ＨＣＴ１１６細胞の（Ａ）細胞数および（Ｂ）細胞生存率に対する、実施例３に詳述される治療レジメンの効果を示している。Ｕ‐Ｕ：無処理９６時間；Ｌ‐Ｌ：ＬＤＮ９６時間；Ｕ‐Ｃ：無処理４８時間、その後シクロホスファミド４８時間；Ｌ‐Ｃ：ＬＤＮ４８時間、その後シクロホスファミド４８時間；Ｕ‐Ｇ：無処理４８時間、その後ゲムシタビン４８時間；Ｌ‐ＧＬＤＮ４８時間、その後ゲムシタビン４８時間；Ｕ‐Ｏ：無処理４８時間、その後オキサリプラチン４８時間。

本発明は、腫瘍／がんを有する対象の治療におけるＬＤＮの新規の用途を提供する。さらに、ＬＤＮによる準備刺激に対する対象の応答を評価するための診断検査が提供される。さらに、ＬＤＮと併用される場合の、インビトロにおいて小分子シグナル伝達阻害剤の有効性を試験する方法も企図される。

ＬＤＮ投与後の回復段階または洗浄段階の使用によって、連続的な投与と比較した場合に、細胞数のより多くの減少がもたらされることが、本発明者らによって発見された。これはいくつかのがん細胞株において観察される（実施例１；図１および図２）。さらに、いくつかの細胞周期タンパク質のレベルに対するＬＤＮの効果を調べたところ、ＬＤＮ処理後に、Bcl-2-associated death promoter (BAD)タンパク質が発現増加され、リン酸化
ＡＫＴ（ＢＡＤの阻害物質）が発現減少されることが発見された（実施例２；図３および図４）。これらのことから、ＬＤＮ投与を、これらの細胞生存制御経路に流れ込む（本明細書で定義されるような）小分子シグナル伝達阻害剤による治療介入と組み合わせることによって、ナルトレキソン使用のための新しい合理的な治療方針が得られる。

ＬＤＮによる準備刺激の効果が実施例３に示される。ＬＤＮを４８時間投与された後、例示的な代謝拮抗剤およびアルキル化剤と一緒にさらに４８時間培養されたＨＣＴ‐１１６細胞（結腸直腸癌）は、ＬＤＮ準備刺激無しよりも、より少ない細胞数およびより低い生存率を示す（図５Ａおよび図５Ｂ；Ｌ‐Ｃ、Ｌ‐ＧおよびＬ‐Ｏ対Ｕ‐Ｃ、Ｕ‐ＧおよびＵ‐Ｏ）。これらのレジーム（regime）によって達成される細胞殺傷も、連続的なＬＤＮ投与の細胞殺傷よりも多数である（図５Ａおよび図５Ｂ；Ｌ‐Ｌ）。これらのデータは、業界標準の結腸直腸がんインビトロ細胞株モデルを用いて得られる。しかし、インビボにおけるＬＤＮ準備刺激の有効性は、前記薬剤の免疫学的効果により（例えば、エフェクターＴ細胞とプロフェッショナル抗原提示細胞との間のクロストークの増強を介して）、細胞株で観察される有効性よりも大きいことが予測される。理論に拘束されることを望むものではないが、ＬＤＮはまた、細胞周期の特定の段階にがん細胞を停止させ得る（加えて、ＢＡＤ等のアポトーシス誘発性タンパク質を発現上昇させ得る）。これは、小分子シグナル伝達阻害剤が、細胞周期で揃えられた状態の細胞集団に対して作用することを可能とし、これにより感受性が増加され得る。

ＢＡＤタンパク質は当業者に公知であり、本明細書で使用される場合、前記用語は当該技術分野において使用される（例えばDanial (2009)によって）その通常の意味を有する。同様に、当該技術分野において公知のタンパク質を示すために本明細書で使用される全ての他の用語も、当業者によって理解されるであろう、それらの通常の意味を有する。ＢＡＤは、活性化により細胞死を惹起するＢＨ３−ｏｎｌｙアポトーシス促進性タンパク質ファミリーに属し、それらの活性は大部分、種々の細胞生存シグナルまたは細胞死シグナルを統合する翻訳後修飾によって制御される（Danial 2009）。ＢＡＤは、ミトコンドリアに位置する、その抗アポトーシス性パートナーであるＢＣＬ‐２、ＢＣＬ‐Ｘ_LおよびＢＣＬ‐Ｗの結合および中和を介してアポトーシスを特異的に促進し、ミトコンドリアにおいて、ＢＡＤは、増殖因子である生存シグナルの離脱後に、（細胞質ゾルから）移動する。ＢＡＤのリン酸化（上流の生存シグナルがもたらす）は阻害性であり；これは、特に３つのセリン残基によってもたらされる（Ｓ１１２、Ｓ１３６およびＳ１５５）。前者２つの部位におけるリン酸化は、ＢＡＤ阻害剤である１４‐３‐３タンパク質とのドッキングを可能とさせ、後者におけるリン酸化（および随伴する負電荷）は、ＢＡＤとＢＣＬ‐２、ＢＣＬ‐Ｘ_LおよびＢＣＬ‐Ｗの疎水性結合部位との間の相互作用を、エネルギー的に不都合なものにさせる。従って、リン酸化された場合、ＢＡＤは、１４‐３‐３タンパク質に結合されることにより、細胞質ゾルに隔離され（これにより、ミトコンドリアに移動してアポトーシスを惹起することが阻止される）、そのミトコンドリア抗アポトーシス性標的タンパク質への結合およびその中和が阻止される。しかし、正常な細胞では、リン酸化ＢＡＤの一部が、ミトコンドリア内にも存在し得る（Danial et al. 2003）。

ＢＡＤの阻害性リン酸化は、種々の上流の生存シグナルおよび細胞死シグナルによって制御され；それ自体として、ＢＡＤはいくつかのシグナル伝達経路の頂端にある。ＢＡＤ阻害活性（リン酸化を介した）は、限定はされないが、ＡＫＴ、ＲＳＫ、Ｓ６Ｋ、ＰＫＡおよびＰＩＭキナーゼによって示される。従って、とりわけ、上記キナーゼまたはそれらの上流活性化配列を（活性または発現に関して）負に調節する小分子シグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮの抗増殖効果を補完する。上記キナーゼに関して、ＡＫＴは、とりわけ、ＰＩ３‐キナーゼおよびＲＡＦキナーゼ活性によって正に調節され（増殖因子およびサイトカインによって制御される経路を介して）；ＲＳＫは、とりわけ、ＭＡＰ‐キナーゼ活性によって正に調節され（増殖因子およびサイトカインによって制御される経路を介して）；
ＰＩＭは、とりわけ、ＳＴＡＴタンパク質によって正に調節され（サイトカインによって制御される経路を介して）；Ｓ６Ｋは、とりわけ、ｍＴＯＲによって正に調節され（増殖因子介在経路および栄養分レベルを含む種々の刺激を介して）；ＰＫＡは、とりわけ、サイクリックＡＭＰレベルによって正に調節される（サイトカインおよびＧタンパク質共役受容体によって制御される経路を介して）（Danial 2009）。従って、小分子シグナル伝達阻害剤によるこれらの上流タンパク質またはシグナル伝達分子の負の調節も、ＬＤＮ活性を補完する。

理論に拘束されることを望むものではないが、ＬＤＮ処理後の回復段階は、細胞死のプロセスと絡み合った細胞周期のプロセスに、細胞を再び従事させると考えられる。従って、回復段階を通じて、細胞死も増強されるさらに、上記のシグナル伝達経路は、腫瘍細胞の細胞周期動態（cell cycling dynamics）の能力に敏感である。細胞周期を進めている細胞は、これらの経路に干渉する小分子シグナル伝達阻害剤により一層応答する傾向がある。従って、回復段階は、腫瘍細胞が細胞周期機構のいくつかの側面に再従事するための時間を許し、これにより、小分子阻害剤を、より効果的に作用させ、細胞傷害反応を増加させる。

本明細書で使用される場合、「ナルトレキソン」は、モルフィナン‐６‐オン，１７‐（シクロプロピルメチル）‐４，５‐エポキシ‐３，１４‐ジヒドロキシ‐（５α）、並びにその薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグを指す。ナルトレキソンの構造的類似体であるナロキソンの使用も本発明の範囲内であり、明細書および特許請求の範囲で使用される用語「類似体」に包含される。同様に、メチルナルトレキソンも、本発明の全ての態様における使用に適した類似体と見なされる。ナルトレキソンの好ましい形態は、その塩酸塩形態である。

本明細書で使用される場合、用語「小分子シグナル伝達阻害剤」は、３０００ダルトン未満の分子量を有する化合物、例えば、限定はされないが、有機小分子、ペプチドおよびペプチド模倣薬、を指し；前記化合物は、一つまたは複数の細胞シグナル伝達経路の一つまたは複数の成分に対する阻害活性または拮抗活性を有し；前記細胞シグナル伝達経路は、細胞の成長および／または増殖、例えば、限定はされないが、アポトーシスのプロセス、を仲介することが当該技術分野において知られている。小分子シグナル伝達阻害剤に関して、「阻害」活性または「拮抗」活性とは、細胞シグナル伝達経路の一つまたは複数の成分の活性が、別様の類似の条件下で測定された場合の、小分子シグナル伝達阻害剤の非存在下でのそのような活性のレベルと比較した場合に、小分子シグナル伝達阻害剤の存在下で低減されることを指す。前記成分としては、限定はされないが；細胞表面受容体（例えば、増殖因子受容体、サイトカイン受容体およびＧタンパク質共役受容体）；細胞内酵素、例えば、膜繋留酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼおよびＧＴＰアーゼ）；並びに細胞シグナル伝達経路の他の介在物質および下流エフェクター（例えば、シャペロン、アダプター、スキャフォールド、微小管、転写因子および翻訳の発動因子）が挙げられる。前記細胞シグナル伝達経路としては、限定はされないが、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）介在経路、インテグリン介在経路、Ｊａｋ‐ＳＴＡＴ介在経路、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ介在経路、Ｗｎｔ／β‐カテニン介在経路、腫瘍壊死因子介在経路が挙げられ；前記経路にはその上流制御因子が含まれる。ある場合では、小分子シグナル伝達阻害剤は、上記特性および１０００ダルトン未満、典型的には５００ダルトン未満の分子量を有する化合物である。本発明による適切な小分子シグナル伝達阻害剤は、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択され；前記クラスは当該技術分野において使用されるそれらの通常の意味を有する。「細胞周期阻害剤」とは、細胞周期のある段階にある細胞（複数可）の進行を、細胞周期の次の段階への進行から、遅延または停止させることが可能な化合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「阻害剤」は、当該技術分野において使用されるその通常の意味を有する。

本明細書で使用される場合、タンパク質の細胞レベルに関する、用語「発現増加」および「発現減少」とは、それぞれ、別様の類似の条件下で測定された、同じ組織型の未処理および／または未刺激細胞における前記タンパク質の基礎レベルと比較した場合に、レベルがより大きなこと、またはより小さなことを指す。タンパク質の細胞レベルがより大きいまたはより小さいことは、典型的には、必ずしもそうである必要はないが、未処理および／または未刺激細胞と比較した場合に、タンパク質の細胞質ゾル濃度がより高いことまたはより低いことに反映される。「発現増加」および「発現減少」にはそれぞれ、限定はされないが、問題のタンパク質の発現の増加または減少（それぞれ、標的ｍＲＮＡの転写レベルおよび／またはポリペプチドの翻訳レベルの増加または減少による）が包含されるが；前記用語にはそれぞれ、前記タンパク質の隔離および／または分解の減少および増加が包含されてもよく；上記作用の組合せも包含される。

本明細書で使用される場合、用語「細胞内局在」とは、タンパク質を考慮する場合、細胞内タンパク質の合計量のかなり大きな割合の、細胞の体積内の、特異的な局在化を指し；より具体的には、前記用語は、前記かなり大きな割合が、同定可能な細胞小器官、特徴または区画（例えば、限定はされないが、細胞膜、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体およびエンドソーム小胞）に対して局在している場合を指す。上記文脈において、「実質的に局在している」とは、前記かなり大きな割合が、所与の細胞小器官、特徴または区画の体積内に局在していること、またはその近位にあることを指し；「近位にある」は、限定はされないが、タンパク質が細胞小器官、特徴または区画の外周を形成するリン脂質膜と接触していることを包含する。限定ではなく一例として、処理および／または刺激された細胞を考慮する場合、細胞小器官、特徴または区画の体積内の、またはその近位にある前記タンパク質の量が、別様の類似の条件下で測定された、同じ組織型の未処理および／または未刺激細胞（すなわち、基礎状態の細胞）と比較した場合に、増加している場合に、タンパク質は所与の細胞小器官、特徴または区画に「実質的に局在している」と見なされ得；繰り返しになるが、「近位にある」は、限定はされないが、タンパク質が細胞小器官、特徴または区画の外周を形成するリン脂質膜と接触していることを包含する。

本明細書で使用される場合、ＢＡＤタンパク質に関連した、用語「リン酸化した」および「リン酸化状態」とは、一つまたは複数のリン酸基が、あらゆる適切な残基、例えば、一つまたは複数のセリン、トレオニン、チロシンおよび／またはヒスチジン残基、を介してタンパク質に結合していることを指す。上流キナーゼ、特に、ＡＫＴ、ＲＳＫ、Ｓ６Ｋ、ＰＫＡおよび／もしくはＰＩＭキナーゼの作用を介した、Ｓ１１２、Ｓ１３６および／もしくはＳ１５５残基におけるＢＡＤタンパク質の酵素的リン酸化、またはそのような活性の不在が、特に考慮される。上記の文脈において、ＢＡＤタンパク質が「実質的にリン酸化状態にある」とは、リン酸化状態が細胞性ＢＡＤタンパク質の主な形態であること、並びに、それによって、特に、ＡＫＴ、ＲＳＫ、Ｓ６Ｋ、ＰＫＡおよび／またはＰＩＭキナーゼの活性から生じている場合に、ＢＡＤタンパク質の細胞活性が実質的に阻害されていること、を指す。タンパク質が実質的に上記の状態では「ない」とは、特に上記キナーゼの活性の実質的な不在により、ＢＡＤタンパク質の非リン酸化状態が優勢である、上記の状態の反対を指す。

本明細書で使用される場合、用語「治療すること（treating）」および「治療（treatment）」および「治療すること（to treat）」とは、１）診断された病的状態または障害を治癒、緩徐化、および／または進行停止させる治療的処置、並びに、２）標的の病的状態または障害の発症を阻止および／または遅延させる予防的（prophylactic）または予防
的（preventative）処置の両方を指す。従って、治療を必要としているものには、障害を既に有しているもの；障害を有する傾向にあるもの；および障害が予防されるべきであるものが含まれる。場合によっては、対象は、対象が以下のうちの一つまたは複数を示す場合に、本発明により腫瘍／がんを成功裏に「治療される」：がん細胞の数の減少もしくは完全な不在；腫瘍サイズの減少；例えば、軟部組織および骨へのがんの転移を含む、末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害もしくは欠如；腫瘍転移の阻害もしくは欠如；腫瘍成長の阻害もしくは欠如；罹患率および死亡率の減少；腫瘍の腫瘍形成能（tumourigenicity）、腫瘍形成頻度（tumourigenic frequency）、もしくは腫瘍形成能（tumourigenic capacity）の低減；腫瘍内のがん幹細胞の数もしくは頻度の減少；腫瘍形成性細胞の非腫瘍形成性状態への分化；または、いくつかの作用の組合せ。

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍／がん」とは、前がん病変を含む、良性（非がん性）または悪性（がん性）の、過剰な細胞成長、細胞増殖および／または細胞生存から生じるあらゆる組織塊を指す。用語「腫瘍／がん」および「新生物」は同義的に使用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍形成性の（tumourigenic）」とは、固形腫瘍幹細胞による腫瘍の形成を可能にする、自己複製（さらなる腫瘍形成性がん幹細胞を生じる）および全ての他の腫瘍細胞を生み出す増殖（分化による非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる）という特性を含む、固形腫瘍幹細胞の機能的特徴を指す。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ＬＤＮが本発明に従って使用される治療の受容者になる、あらゆる動物（例えば、哺乳動物）、例えば、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類等、を指す。典型的には、用語「対象」および「患者」は、本明細書ではヒト対象に関連して同義的に使用される。

前記第一態様によれば、ナルトレキソンまたはその類似体は、第一治療段階において、０．５ｍｇ／ｋｇ未満、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇの「低」用量で、対象に投与されることが好ましい。前記組成物はいかなる従来の方法によっても投与することができる。投与は、経口投与であっても非経口投与であってもよく、好ましくは経口投与である。しかし、他の投与経路も企図される。前記第一治療段階は、１〜７日間、より好ましくは１〜４日間、最も好ましくは１〜２日間の投与が好ましく；「日」は２４時間の連続期間を意味する。ナルトレキソンは、第一治療段階の間に毎日（上記の用量で）投与されることが好ましい。ナルトレキソン（またはその類似体）も小分子シグナル伝達阻害剤も投与されない前記回復段階は、少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも２日間であることが好ましい。あるいは、回復段階は２４〜４８時間、２４〜３６時間、または２４〜３０時間であってもよい。前記第二治療段階の特徴は使用される小分子シグナル伝達阻害剤に依存するが、投与は少なくとも１日間の毎日投与であることが好ましい。

さらに、前記第一態様によれば、小分子シグナル伝達阻害剤は代謝拮抗剤およびアルキ
ル化剤からなる群から選択されることが好ましい。小分子シグナル伝達阻害剤は、いかなる従来の方法によっても投与することができ、投与法は、使用される小分子シグナル伝達阻害剤に大きく依存する。従って、とりわけ、非経口経路、経口経路、舌下経路、経鼻経路および／または経肺経路による投与が企図される。

小分子シグナル伝達阻害剤がＰＩ３‐キナーゼ阻害剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、デメトキシビリジン（demethoxyviridin）、ＩＣ８７１１４、ＮＶＰ‐ＢＥＺ２３５、ＢＡＹ８０‐６９４６、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ‐０９４１、ＧＤＣ‐９０８０が挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。

小分子阻害剤がＡＫＴ阻害剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、ＭＫ‐２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシン、ＰＨＴ‐４２７、ＡＴ７８６７、ホオノキオール、ＰＦ‐０４６９１５０２が挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。

小分子シグナル伝達阻害剤がタキサンである場合、適切な例としては、限定はされないが、パクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。。

小分子阻害剤が代謝拮抗剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、メトトレキサート、５‐フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド（cytosinarabinoside）（シタラビン）、ゲムシタビン、６‐チオグアニン、ペントスタチン、アザチオプリン、６‐メルカプトプリン、フルダラビンおよびクラドリビンが挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。ゲムシタビンは特に好ましい代謝拮抗剤である。一例として、ゲムシタビンは、８００〜１２００ｍｇ／ｍ²、好ましくは９００〜１１００ｍｇ／ｍ²、例えば約１０００ｍｇ／ｍ²、または１０００ｍｇ／ｍ²の用量（投与当たり）で投与され得る。ゲムシタビンは、ある特定のがん細胞型の周囲に免疫抑制性の「障壁」を形成し得る、骨髄サプレッサー細胞の阻害により、特に有効であり得ると考えられており；これは膵がんの治療に特に関連している。

小分子シグナル伝達阻害剤がアルキル化剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、メルファラン（Ｌ‐サルコリシン）、クロラムブシル、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）テモゾロミドおよびオキサリプラチンが挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。シクロホスファミドおよびオキサリプラチンは特に好ましいアルキル化剤である。一例として、オキサリプラチンは、６５〜１０５ｍｇ／ｍ²、好ましくは７５〜９５ｍｇ／ｍ²、例えば約８５ｍｇ／ｍ²、または８５ｍｇ／ｍ²の用量（投与当たり）で投与され得る。一例として、シクロホスファミドは、１８００ｍｇ／ｍ²以下、例えば４００〜１８００ｍｇ／ｍ²の用量（投与当たり）で投与され得る。

小分子シグナル伝達阻害剤が細胞周期阻害剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、エポシロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＵＣＮ‐０１、１７ＡＡＧ、
ＸＬ８４４、ＣＨＩＲ‐１２４、ＰＦ‐００４７７７３６、ＣＥＰ‐３８９１、フラボピリドール、ベルベリン、Ｐ２７６‐００、テラメプロコール（terameprocol）、イソフラボンダイゼイン（isoflavone daidzein）、ＢＩ２５３６、ＢＩ６７２７、ＧＳＫ４６１３６４、シクラポリン（Cyclapolin）、ＯＮ‐０１９１０、ＮＭＳ‐Ｐ９３７、ＴＡＫ‐９６０、イスピネシブ（Ispinesib）、モナストロール、ＡＺＤ４８７７、ＬＹ２５２３３５５、ＡＲＲＹ‐５２０、ＭＫ‐０７３１、ＳＢ７４３９２１、ＧＳＫ９２３２９５、ロナファーニブ、ｐｒｏＴＡＭＥ、ボルテゾミブ、ＭＬＮ９７０８、ＯＮＸ０９１２、ＣＥＰ‐１８７７０が挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含され；細胞周期阻害剤の特に適切な例としては、限定はされないが、ヘスパエラジン（Hespaeradin）、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ‐６８０、ＭＬＮ‐８０５４、ＰＨＡ‐７３９３５８、ＡＴ‐９２８３、ＡＺＤ１１５２、ＭＬＮ８２３７、ＥＮＭＤ２０７６、ＳＵ６６６８が挙げられ；それらの組合せ；並びにオーロラキナーゼの他の阻害剤；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。

本発明の第二の態様により、対象にナルトレキソンまたはその類似体が投与される腫瘍／がんを有する対象の第一治療段階に対する応答をモニターするための診断検査が提供され；前記診断検査は、前記第一治療段階を受けている対象から得られた試料を分析することによって、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
前記診断検査では、そうである場合に、対象が、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤の投与を含む第二治療段階を受けるのに適しているということが示される。

上記の所見は全て、ＬＤＮによる準備刺激を介して刺激されているＢＡＤタンパク質活性の抗アポトーシス活性の陽性指標である。

前記第二態様によれば、ナルトレキソンまたはその類似体は、第一治療段階において、０．５ｍｇ／ｋｇ未満、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇの「低」用量で、対象に投与されることが好ましい。前記組成物はいかなる従来の方法によっても投与することができる。投与は、経口投与であっても非経口投与であってもよく、好ましくは経口投与である。しかし、他の投与経路も企図される。前記第一治療段階は、１〜７日間、より好ましくは１〜４日間、最も好ましくは１〜２日間の投与が好ましく；「日」は２４時間の連続期間を意味する。ナルトレキソンは、第一治療段階の間に毎日（上記の用量で）投与されることが好ましい。

さらに、前記第二の態様によれば、ＢＡＤタンパク質の発現増加および／またはリン酸化ＡＫＴタンパク質の発現減少が、それぞれ、対象から得られた試料由来の細胞内に存在する場合、決定され得る。対象から採取された試料中の一つまたは複数の細胞における特定のタンパク質レベルの定量化は、半定量法を含む、当該技術分野において公知のいかなる適切な方法によっても実行され得る。そのような適切な方法としては、限定はされない
が、定量的ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析（具体的には、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析）、並びに上記の適切な派生法および組合せが挙げられ；一つまたは複数の同定可能なタンパク質断片が定量化される方法も企図され、本発明の範囲内である。発現増加および／または発現減少は、好ましくは第一治療段階の前に対象から採取された試料における、類似の条件下で測定された、同じ組織型の一つまたは複数の未処理および／または未刺激細胞（すなわち、基礎状態の細胞）を含む対照と比較して決定される。

さらに、前記第二の態様により、対象から得られた試料由来の細胞におけるＢＡＤタンパク質の細胞内局在が決定され得る。これは、免疫組織化学、免疫細胞化学、並びに上記の適切な派生法および組合せを含むがこれらに限定はされない、当該技術分野におけるいかなる適切な方法によっても実行され得る。ＢＡＤタンパク質は、好ましくは、第一治療段階の前に対象から採取された試料における、別様の類似の条件下で測定された、同じ組織型の未処理および／または未刺激細胞（すなわち、基礎状態の細胞）と比較した場合に、ミトコンドリア体積内の、またはミトコンドリア近位にあるＢＡＤタンパク質の量が増加している場合に、ミトコンドリアに「実質的に局在している」と見なされ得る。

さらに、第二の態様により、腫瘍／がんの細胞におけるＢＡＤタンパク質のリン酸化状態が決定され得る。これは、当該技術分野におけるいかなる適切な方法によっても実行され得る。一つもしくは複数のリン酸基の存在によってもたらされるＢＡＤタンパク質の分子量の増加が検出される、および／またはリン酸化状態にある場合のＢＡＤタンパク質の特異的な認識（例えば抗体による）が誘発される方法が特に企図され；これらの発生が無いことは、ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態ではないことを示している。このような方法には、イースタンブロッティングおよびその適切な派生法が包含される。ＢＡＤのリン酸化状態は、第一治療段階の前に対象から採取された試料における、同じ組織型の未処理および／または未刺激細胞（すなわち基礎状態の細胞）を含む対照と比較されることが好ましい。

さらに、前記第二態様によれば、対象が第二治療段階を受けるのに適しているという陽性指標がある場合、第一治療段階と第二治療段階の間に回復段階が存在することが好ましい。ナルトレキソン（またはその類似体）も小分子シグナル伝達阻害剤も投与されない前記回復段階は、少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも２日間であることが好ましい。あるいは、回復段階は２４〜４８時間、２４〜３６時間、または２４〜３０時間であってもよい。前記第二治療段階の特徴は使用される小分子シグナル伝達阻害剤に依存するが、投与は少なくとも１日間の毎日投与であることが好ましい。

さらに、前記第二態様によれば、小分子シグナル伝達阻害剤は代謝拮抗剤およびアルキル化剤からなる群から選択されることが好ましい。小分子シグナル伝達阻害剤は、いかなる従来の方法によっても投与することができ、投与法は、使用される小分子シグナル伝達阻害剤に大きく依存する。従って、とりわけ、非経口経路、経口経路、舌下経路、経鼻経路および／または経肺経路による投与が企図される。

小分子阻害剤がＡＫＴ阻害剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、ＭＫ
‐２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシン、ＰＨＴ‐４２７、ＡＴ７８６７、ホオノキオール、ＰＦ‐０４６９１５０２が挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。

小分子シグナル伝達阻害剤がタキサンである場合、適切な例としては、限定はされないが、パクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。

小分子阻害剤が代謝拮抗剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、メトトレキサート、５‐フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド（cytosinarabinoside）（シタラビン）、ゲムシタビン、６‐チオグアニン、ペントスタチン、アザチオプリン、６‐メルカプトプリン、フルダラビンおよびクラドリビンが挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。ゲムシタビンは特に好ましい代謝拮抗剤である。

小分子シグナル伝達阻害剤がアルキル化剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、メルファラン（Ｌ‐サルコリシン）、クロラムブシル、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）テモゾロミドおよびオキサリプラチンが挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。シクロホスファミドおよびオキサリプラチンは特に好ましいアルキル化剤である。

小分子シグナル伝達阻害剤が細胞周期阻害剤である場合、適切な例としては、限定はされないが、エポシロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＵＣＮ‐０１、１７ＡＡＧ、ＸＬ８４４、ＣＨＩＲ‐１２４、ＰＦ‐００４７７７３６、ＣＥＰ‐３８９１、フラボピリドール、ベルベリン、Ｐ２７６‐００、テラメプロコール（terameprocol）、イソフラボンダイゼイン（isoflavone daidzein）、ＢＩ２５３６、ＢＩ６７２７、ＧＳＫ４６１３６４、シクラポリン（Cyclapolin）、ＯＮ‐０１９１０、ＮＭＳ‐Ｐ９３７、ＴＡＫ‐９６０、イスピネシブ（Ispinesib）、モナストロール、ＡＺＤ４８７７、ＬＹ２５２３３５５、ＡＲＲＹ‐５２０、ＭＫ‐０７３１、ＳＢ７４３９２１、ＧＳＫ９２３２９５、ロナファーニブ、ｐｒｏＴＡＭＥ、ボルテゾミブ、ＭＬＮ９７０８、ＯＮＸ０９１２、ＣＥＰ‐１８７７０が挙げられ；それらの組合せ；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含され；細胞周期阻害剤の特に適切な例としては、限定はされないが、ヘスパエラジン（Hespaeradin）、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ‐６８０、ＭＬＮ‐８０５４、ＰＨＡ‐７３９３５８、ＡＴ‐９２８３、ＡＺＤ１１５２、ＭＬＮ８２３７、ＥＮＭＤ２０７６、ＳＵ６６６８が挙げられ；それらの組合せ；並びにオーロラキナーゼの他の阻害剤；並びに上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物、立体異性体、包接体およびプロドラッグも包含される。

本発明の第三の態様により、ナルトレキソンまたはその類似体と併用された場合の腫瘍／がんの治療における有効性について小分子シグナル伝達阻害剤を試験するインビトロ法が提供され；前記インビトロ法は、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナ
ル伝達阻害剤を、ナルトレキソンもしくはその類似体と同時に、またはナルトレキソンもしくはその類似体の後に、腫瘍／がんの細胞に投与し、一つまたは複数の前記細胞を含む試料を分析することで、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
前記インビトロ法では、そうである場合、小分子シグナル伝達阻害剤の有効性が示される。

本発明の第四の態様により、ナルトレキソンまたはその類似体と併用される場合の腫瘍／がんの治療における有効性について小分子シグナル伝達阻害剤を試験する方法で使用するための、ナルトレキソンまたはその類似体を含む医薬組成物が提供され、前記方法は、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤を、ナルトレキソンもしくはその類似体と同時に、および／またはナルトレキソンもしくはその類似体の後に、腫瘍／がんを有する対象に投与し、一つまたは複数の腫瘍／がんの細胞を含む試料を分析することで、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
前記方法では、そうである場合に、小分子シグナル伝達阻害剤の有効性が示される。

前記第三および第四の態様により、ＢＡＤタンパク質の発現増加および／またはリン酸化ＡＫＴタンパク質の発現減少がそれぞれ、腫瘍／がんの細胞（第四の態様により、対象から得られた試料由来の場合）に存在する場合、決定され得る。対象から採取された試料中の一つまたは複数の細胞における特定のタンパク質レベルの定量化は、半定量法を含む、当該技術分野において公知のいかなる適切な方法によっても実行され得る。そのような適切な方法としては、限定はされないが、定量的ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析（具体的には、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析）、並びに上記の適切な派生法および組合せが挙げられ；一つまたは複数の同定可能なタンパク質断片が定量化される方法も企図され、本発明の範囲内である。発現増加および／または発現減少は、類似の条件下で測定された、同じ組織型の一つまたは複数の未処理および／または未刺激細胞（すなわち、基礎状態の細胞）（第四の態様によれば、これは、ナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤を投与する前の対象から採取された試料中のものであることが好ましい）を含む対照と比較して決定される。

さらに、前記第三および第四の態様により、腫瘍／がんの細胞（第四の態様によれば、対象から得られた試料由来）におけるＢＡＤタンパク質の細胞内局在が決定され得る。これは、免疫組織化学、免疫細胞化学、並びに上記の適切な派生法および組合せを含むがこれらに限定はされない、当該技術分野におけるいかなる適切な方法によっても実行され得る。好ましくは、ＢＡＤタンパク質は、別様の類似の条件下で測定された、同じ組織型の未処理および／または未刺激細胞（すなわち、基礎状態の細胞）（第四の態様によれば、これは、ナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤を投与する前
の対象から採取された試料中のものであることが好ましい）と比較した場合に、ミトコンドリア体積内の、またはミトコンドリア近位にあるＢＡＤタンパク質の量が増加している場合に、ミトコンドリアに「実質的に局在している」と見なされる。

さらに、前記第三および第四の態様により、腫瘍／がんの細胞（第四の態様によれば、対象から得られた試料由来）におけるＢＡＤタンパク質のリン酸化状態が決定され得る。これは、当該技術分野におけるいかなる適切な方法によっても実行され得る。一つもしくは複数のリン酸基の存在によってもたらされるＢＡＤタンパク質の分子量の増加が検出される、および／またはリン酸化状態にある場合のＢＡＤタンパク質の特異的な認識（例えば抗体による）が誘発される方法が特に企図され；これらの発生が無いことは、ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態ではないことを示している。このような方法には、イースタンブロッティングおよびその適切な派生法が包含される。前記第四の態様によれば、ＢＡＤのリン酸化状態は、ナルトレキソンの投与またはナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤の投与の前の対象から採取された試料中の、同じ組織型の未処理および／または未刺激細胞（すなわち基礎状態の細胞）を含む対照と比較されることが好ましい。

前記第四態様によれば、ナルトレキソンまたはその類似体は、第一治療段階において、０．５ｍｇ／ｋｇ未満、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇの「低」用量で、対象に投与されることが好ましい。

さらに、前記第三および第四の態様によれば、小分子シグナル伝達阻害剤が代謝拮抗剤およびアルキル化剤からなる群から選択されることが好ましい本発明のさらなる態様により、治療有効量のナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤を投与することを含み、本発明の第一の態様に適応可能であるような、同じ任意の好ましい特徴を有する、腫瘍／がんの予防または治療を必要としている対象における腫瘍／がんを治療または予防する方法が提供される。

本発明の全ての態様により、治療される腫瘍／がんは何ら限定されるものではないということに留意されたい。従って、前がん病変を含む、過剰な細胞成長、増殖および／もしくは生存からもたらされる組織塊、良性（非がん性）または悪性（がん性）を含むあらゆる状態の治療が企図される。従って、例としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病を含む腫瘍／がんが挙げられ；このような腫瘍／がんのより具体的な例としては、限定はされないが、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵がん、グリア芽腫、子宮頸がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌、腎がん、肝臓がん、前立腺がん、メラノーマ、外陰がん、甲状腺がん、肝癌および種々の頭頚部がんを含む腫瘍／がんが挙げられる。しかし、本発明の第一の態様の１つの好ましい実施形態では、がんは、肺がん、結腸直腸がん神経膠腫または膵がんを含み；より好ましくは、がんは、実施例１に示されるように、肺がんまたは結腸直腸がんを含む。

小分子阻害剤がゲムシタビンである場合（本発明の第一の態様によれば）、膵がんの治療における使用が特に好ましい。

上記の全ての文書は、参照によって本明細書に援用される。

次に、以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。

実施例１
細胞成長に対する各薬剤の効果を研究するために、指数関数的に増殖している細胞を、３×１０⁴／ウェルの密度で９６ウェルプレートに加えた。次に、薬剤をウェルに添加し、等量の２００μｌがプレートに行き渡るようにした。標準的なメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）に基づくアッセイを改変無しで用いて、７２時間の時点で細胞数を測定した。簡潔に説明すると、ＭＴＴを各ウェルに添加して０．４ｍｇ／ｍｌの作用濃度を与え、プレートをさらに１時間恒温器に戻した。この時間の後、培地を吸引除去し、次に２００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、プレートを５分間穏やかに撹拌し、その後、各ウェルにおける５４０ｎｍでの吸光度を測定した。４８時間後にナルトレキソン含有培地を除去してこれを新鮮な無薬剤培地に置換し、その後、７２時間の時点での細胞数を評価することにより、洗浄段階が含まれる場合の回復の効果を調べた。死細胞／瀕死細胞の区別の補助にトリパンブルーによる染色を用いる光学顕微鏡法によって、細胞計数を行った。図１および図２の説明を参照されたい。

実施例２
細胞を１０μΜナルトレキソン（ＮＴＸ）または１０ｎＭナルトレキソン（ＬＤＮ）で４８時間処理し、その後、細胞を回収し、全細胞タンパク質を溶解緩衝液中に可溶化させ、４〜１２％ビス‐トリス勾配ゲルを用いるトリス‐グリシン電気泳動で分離させた。タンパク質を０．４５ｌｍニトロセルロース膜に転写した後、ＴＴＢＳ［ＴＢＳ（５０ｍＭ
トリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中の０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ‐２０］中の５％（ｗ／ｖ）脱脂乳中でブロッキングを行った。一次抗体による図中で指定されるタンパク質の標識を４℃で一晩行い、その後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合型抗複数種（anti-species）ＩｇＧ１を用いる二次標識を行い、ＥＣＬ‐ｐｌｕｓ検出系によりバンドを可視化した。専売の解析用ソフトウェアを用いてデンシトメトリー解析を行った。遺伝子発現解析用にこれらの細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌと、その後のイソプロパノールによる沈殿によって精製した。ＲＮＡペレットを７０％（ｖ／ｖ）エタノール中で洗浄し、風乾し、ＲＮａｓｅフリー水に再懸濁させた。イルミナ社製ＴｏｔａｌＰｒｅｐＲＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社、ウォリントン、英国）を製造業者の説明書に従って使用して、ビオチン化ｃＲＮＡを１００ｎｇの全ＲＮＡから作製した。等量（７５０ｎｇ）のｃＲＮＡをイルミナ社製ｈｕｍａｎＨＴ１２‐ｖ３のアレイに１８時間ハイブリダイズし、その後、製造業者の説明書に従って処理し、その後、イルミナ社製ＢｅａｄＡｒｒａｙＲｅａｄｅｒで走査した。画像データを、欠測データを補完してＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏｖ２００９．１で初期値を用いて加工し、その後、データ正規化およびフィルタリングのためにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇｖ９．０にロードした。Ｅｘｃｅｌを用いてさらなる解析を行った。図３および図４の説明を参照されたい。

実施例３
ＨＣＴ１１６（ヒト結腸がん）細胞を、２つの段階から成る処理スケジュールに従って、標準培地中で培養した。各段階は２日間（４８時間）に亘った。細胞を１×１０⁴細胞／ｍｌの濃度にリセット（reset）し、培養プレートに接着させ、その後、第一処理段階の一部として薬剤を添加した。細胞は未処理または１０ｎＭのナルトレキソンで処理され、３７℃の空気中に５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で維持された。２日後、培地を各ウェルから穏やかに吸引し、新鮮な培地を加えた。細胞をおよそ１５分間薬剤無しに曝した後、第二処理段階の一部として、ナルトレキソン（１０ｎＭ）、シクロホスファミド（１０ｕＭ）、ゲムシタビン（１ｕＭ）またはオキサリプラチン（１ｕＭ）を添加した。２日後、細胞をトリプシンで回収し、各試料の細胞数および生存率を、トリパンブルーを用いる細胞計数によって評価した。結果は図５に示される：Ｕ‐Ｕ：非処理９６時間；Ｌ‐
Ｌ：ＬＤＮ９６時間；Ｕ‐Ｃ：非処理４８時間、その後シクロホスファミド４８時間；Ｌ‐Ｃ：ＬＤＮ４８時間、その後シクロホスファミド４８時間；Ｕ‐Ｇ：非処理４８時間、その後ゲムシタビン４８時間；Ｌ‐ＧＬＤＮ４８時間、その後ゲムシタビン４８時間；Ｕ‐Ｏ：非処理４８時間、その後オキサリプラチン４８時間。

参考文献
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Smith, J. P., S. I. Bingaman, F. Ruggiero, D. T. Mauger, A. Mukherjee, C. O. McGovern, and I. S. Zagon. 2011. Therapy with the opioid antagonist naltrexone promotes mucosal healing in active Crohn's disease: a randomized placebo-controlled trial. Dig Dis Sci 56: 2088-2097.
Zagon, I. S., and P. J. McLaughlin. 1983. Naltrexone modulates tumour response
in mice with neuroblastoma. Science 221: 671.

Claims

腫瘍／がんを有する対象の治療で使用されるナルトレキソンまたはその類似体を含む医薬組成物であって；ナルトレキソンまたはその類似体が第一治療段階において対象に投与され、その後に回復段階が続き；回復段階の後、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤が第二治療段階において対象に投与され；回復段階が、ナルトレキソンまたはその類似体および小分子シグナル伝達阻害剤の投与がないことを特徴とする、前記医薬組成物。
ナルトレキソンまたはその類似体が第一治療段階において０．５ｍｇ／ｋｇ未満、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、請求項１に記載の用途のための医薬組成物
前記第一治療段階が、１〜７日間、好ましくは１〜４日間、より好ましくは１〜２日間の投与である、請求項１または請求項２に記載の用途のための医薬組成物
前記第二治療段階が少なくとも１日間の連日投与である、請求項１〜３のいずれかに記載の用途のための医薬組成物。
前記回復段階が少なくとも１日間、好ましくは少なくとも２日連続である、請求項１〜４のいずれかに記載の用途のための医薬組成物。
小分子シグナル伝達阻害剤が代謝拮抗剤およびアルキル化剤からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の用途のための医薬組成物。
小分子シグナル伝達阻害剤が代謝拮抗剤、好ましくはゲムシタビンである、請求項７に記載の用途のための医薬組成物。
小分子シグナル伝達阻害剤がアルキル化剤、好ましくはオキサリプラチンまたはシクロホスファミドである、請求項７に記載の用途のための医薬組成物。
小分子シグナル伝達阻害剤がゲムシタビン、オキサリプラチンまたはシクロホスファミドから選択される、請求項７に記載の用途のための医薬組成物。
治療される腫瘍／がんが肺がん、結腸直腸癌、神経膠腫または膵がんを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の用途のための医薬組成物。
対象にナルトレキソンまたはその類似体が投与される腫瘍／がんを有する対象の第一治療段階に対する応答をモニターするための診断検査であって；前記第一治療段階を受けている対象から得られた試料を分析することによって、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
そうである場合に、対象が、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤の投与を含む第二治療段階を受けるのに適しているということが示される、
前記診断検査。
第一治療段階の前に対象から採取された試料の分析を含む、前記発現増加、発現減少、局在化および／またはリン酸化状態が対照と比較して評価される、請求項１２に記載の診断検査。
ナルトレキソンまたはその類似体が第一治療段階において０．５ｍｇ／ｋｇ未満、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、請求項１２または請求項１３に記載の診断検査
前記第一治療段階が、１〜７日間、好ましくは１〜４日間、より好ましくは１〜２日間の投与である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の診断検査
小分子シグナル伝達阻害剤が代謝拮抗剤およびアルキル化剤からなる群から選択される、請求項１２〜１５のいずれかに記載の診断検査。
小分子シグナル伝達阻害剤が代謝拮抗剤、好ましくはゲムシタビンである、請求項１６のいずれかに記載の用途のための医薬組成物。
小分子シグナル伝達阻害剤がアルキル化剤、好ましくはオキサリプラチンまたはシクロホスファミドである、請求項１６に記載の用途のための医薬組成物。
小分子シグナル伝達阻害剤がゲムシタビン、オキサリプラチンまたはシクロホスファミドから選択される、請求項１６に記載の用途のための医薬組成物。
ナルトレキソンまたはその類似体と併用された場合の腫瘍／がんの治療における有効性について小分子シグナル伝達阻害剤を試験するインビトロ法であって、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤を、ナルトレキソンもしくはその類似体と同時に、またはナルトレキソンもしくはその類似体の後に、腫瘍／がんの細胞に投与し、一つまたは複数の前記細胞を含む試料を分析することで、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
そうである場合に、小分子シグナル伝達阻害剤の有効性が示される、前記インビトロ法。
ナルトレキソンまたはその類似体と併用される場合の腫瘍／がんの治療における有効性について小分子シグナル伝達阻害剤を試験する方法で使用するための、ナルトレキソンまたはその類似体を含む医薬組成物であって、前記方法が、ＰＩ３‐キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤および細胞周期阻害剤からなる群から選択される小分子シグナル伝達阻害剤を、ナルトレキソンもしくはその類似体と同時に、および／またはナルトレキソンもしくはその類似体の後に、腫瘍／がんを有する対象に投与し、一つまたは複数の腫瘍／がんの細胞を含む試料を分析することで、
（ａ）ＢＡＤタンパク質が発現増加しているかどうか、および／もしくは、リン酸化ＡＫＴタンパク質が発現減少しているかどうか、
（ｂ）ＢＡＤタンパク質が実質的にミトコンドリアに局在しているかどうか、並びに／または、
（ｃ）ＢＡＤタンパク質が実質的にリン酸化状態でないかどうか；
を決定することを含み、
そうである場合に、小分子シグナル伝達阻害剤の有効性が示される、前記医薬組成物。
ナルトレキソンまたはその類似体が第一治療段階において０．５ｍｇ／ｋｇ未満、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、請求項２１に記載の用途のための医薬組成物
小分子シグナル伝達阻害剤が代謝拮抗剤およびアルキル化剤からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法または請求項２１もしくは請求項２２に記載の用途のための医薬組成物。