ES2863996T3 - Terapia de combinación para el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Sarah K Knutson
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Abstract

Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 que tiene la siguiente fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de cuidado estándar en un método de tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita, en el que el agente de cuidado estándar es un inhibidor de BCR seleccionado de MK-2206, idelalisib, trametinib, tamatinib e ibrutinib.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia de combinación para el tratamiento del cáncer
Campo de la invención
Esta invención se refiere a combinaciones que comprenden inhibidores de la histona metiltransferasa humana EZH2, la subunidad catalítica del complejo PRC2 que cataliza la mono-a trimetilación de lisina 27 en la histona H3 (H3-K27), y uno o más otros agentes terapéuticos.
Antecedentes de la invención
Los tratamientos de terapia de combinación para el cáncer se han vuelto más comunes, en parte debido a la ventaja percibida de atacar la enfermedad a través de múltiples vías. Aunque se han identificado muchos tratamientos de terapia de combinación eficaces en las últimas décadas; En vista del elevado número de muertes cada año a causa del cáncer, existe una necesidad constante de identificar regímenes terapéuticos eficaces para su uso en el tratamiento contra el cáncer.
El documento WO 2013/155464 A1 describe composiciones que comprenden inhibidores de la histona metiltransferasa humana EZH2 y uno o más otros agentes terapéuticos.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones.
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que un inhibidor de EZH2 tal como el compuesto 44 (también conocido como EPZ-6438, E7438)
Figure imgf000002_0001
en combinación con una variedad de agentes, incluido el estándar actual de cuidado, es muy activo en el tratamiento de ciertos cánceres independientemente del estado de la mutación EZH2. En una determinada realización, el cáncer es un linfoma. En una determinada realización, el cáncer es un linfoma no Hodgkin (NHL) o un linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) de origen de células B del centro germinal (GCB). En determinadas realizaciones, el linfoma es un linfoma mutante EZH2. En determinadas realizaciones, el linfoma es un linfoma EZH2 no mutante o EZH2 de tipo salvaje.
En un aspecto, la invención proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000003_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de cuidado estándar en un método de tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita, en el que el agente de cuidado estándar es un inhibidor de BCR seleccionado entre MK-2206, idelalisib, trametinib, tamatinib e ibrutinib.
En algunas realizaciones, el linfoma mutante EZH2 es una mutación Y646, A682 o A692.
En el inhibidor de BCR se encuentra MK-2206, idelalisib, trametinib, tamatanib o ibrutinib.
En algunas realizaciones, el inhibidor de EZH2 y el agente de cuidado estándar se administran simultánea o secuencialmente. En otras realizaciones, el inhibidor de EZH2 se administra antes de la administración del agente de cuidado estándar.
En algunas realizaciones, al menos un gen está regulado positivamente en el paciente. En determinadas realizaciones, el gen que está regulado positivamente se selecciona del grupo que consiste en Sestrina, TNF y GILZ. En otras realizaciones, el gen que está regulado positivamente es un gen diana de glucocorticoides.
En algunas realizaciones, la regulación positiva de un gen se usa para determinar o ajustar la cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de EZH2 y el agente de cuidado estándar.
En una realización, el paciente se selecciona en base al perfil de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en Sestrina, TNF y GILZ.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer resistente o refractario al inhibidor de EZH2.
En algunas realizaciones, el cáncer se caracteriza por un aumento de la trimetilación en H3K27.
El inhibidor de EZH2 es el compuesto 44, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más otros agentes terapéuticos.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1A-1F son una serie de gráficos Fa-CI que demuestran el beneficio de la combinación con los componentes CHOP y el compuesto 44 (Comp. 44) en líneas celulares de linfoma de células B de centro germinal EZH2 mutantes. El compuesto 44 y la doxorrubicina actúan de forma sinérgica en las células WSU-DLCL2 (Figura 1A) y producen un efecto aditivo en las células SU-DHL-10 (Figura 1D). Se observa el beneficio de la combinación con mafosfamida en células WSU-DLCL2 (Figura 1C) y células SU-DHL-10 (Figura 1F). También se observa el beneficio de la combinación con vincristina en ambas líneas celulares mutantes EZH2 Y646: células WSU-DLCL2 (Figura 1B) y células SUDHL-10 (Figura 1E). En WSU-DLCL2, las dosis variaron desde 0.16-20 nM para la doxorrubicina, 0.04 y 5 nM para la vincristina, 0.156-10 |iM para la mafosfamida y entre 15-1000 nM para el compuesto 44. En células SU-DHL-10, las dosis variaron desde 0.5 y 60 nM para doxorrubicina, 0.016-2 nM para vincristina, 0.156-10 |iM para mafosfamida y 1.56-100 nM para el compuesto 44. Las células se trataron según el modelo de pretratamiento A y los datos se analizaron con el software Calcusyn.
Las figuras 2A-2D son una serie de gráficos que demuestran que los agonistas de glucocorticoides mejoran la potencia del compuesto 44 (Comp. 44) en líneas de linfoma mutante EZH2. La potencia del compuesto 44 aumenta drásticamente cuando se combina con agonistas de glucocorticoides. La adición de prednisolona (Figura 2A, 2C) o dexametasona (Figura 2B, 2D) en 2 líneas de DLBCL mutantes EZH2 Y646F según el modelo de pretratamiento A produce un cambio dependiente de la dosis en la IC50 del compuesto 44. Las dosis variaron de 15 nM-1000 nM para prednisolona y 1.5 nM-100 nM para dexametasona en ambas líneas celulares. Las dosis del compuesto 44 variaron desde 15-1000 nM en células WSU-DLCL2 y 1.5 a 100 nM en células SU-DHL-10.
Las figuras 3A-3D son una serie de gráficos de respuesta a la dosis que demuestran los beneficios de las combinaciones del compuesto 44 (Comp. 44) con prednisolona o dexametasona en WSU-DLCL2 EZH2 mutante (Figura 3A, 3B) y líneas celulares de linfoma GCB, DOHH2 EZH2 de tipo salvaje (Figura 3C, 3D), respectivamente. Las dosis del compuesto 44 variaron desde 15.6-1000 nM, las dosis de prednisolona variaron desde 7.8-1000 nM y las dosis de dexametasona variaron desde 0.8-100 nM. (Figuras 3A y 3B). La potencia del compuesto 44 se incrementó con prednisolona o dexametasona en células WSU-DLCL2 mutantes EZH2 (Figuras 3C y 3D). El compuesto 44 no mostró ningún efecto antiproliferativo como agente único en las células de tipo salvaje DOHH2 EZH2, por lo tanto se midió el cambio de potencia de prednisolona o dexametasona. La potencia de prednisolona o dexametasona aumentó con la adición del compuesto 44 en células DOHH2.
La figura 4 es una tabla del resumen que muestra que la combinación del compuesto 44 (Comp. 44)/agonista de glucocorticoides supera la insensibilidad a los inhibidores de EZH2 (EZH2i) en líneas celulares resistentes a los inhibidores de EZH2. En general, una combinación de prednisolona y el compuesto 44 conduce a una mayor sensibilidad en todas las líneas celulares GCB probadas, no solo en las líneas celulares sensibles a EZH2i. Excepto para las células RL, donde la secuencia de adición del fármaco es crucial ya que la preincubación con prednisolona, seguida del compuesto 44, no es eficaz.
Las figuras 5A y 5B son dos gráficos que muestran la sinergia muy fuerte observada en la línea celular de linfoma mutante EZH2 con la combinación del compuesto 44 (Comp. 44) y otras terapias dirigidas. Se observa una sinergia muy fuerte cuando el compuesto 44 se combina con el inhibidor de BCL2 navitoclax (en la figura 5A), así como con el inhibidor de mTOR everolimus (en la figura 5B). Los intervalos de dosis para navitoclax son 0.16-10 |iM, 0.04-5 nM para everolimus y 31-2000 nM para el compuesto 44. Estos datos se generaron en el modelo de pretratamiento A y los datos se analizaron con el software Calcusyn.
La figura 6 es una tabla del resumen de los resultados de combinaciones de diversos fármacos y/o terapias con fármacos con el compuesto 44 (Comp. 44). El beneficio de la combinación con el compuesto 44 se logró con todos los fármacos probados en líneas de linfoma EZH2 mutante. Los agonistas de glucocorticoides demostraron un beneficio de combinación con las líneas de linfoma EZH2 WT y GCB mutante.
Las figuras 7A-7C son una serie de gráficos que demuestran que las combinaciones del compuesto 44 (Comp. 44)-CHOP muestran una actividad antitumoral mejorada en comparación con agentes individuales en varios modelos de xenoinjerto de linfoma mutante EZH2. Se trataron xenoinjertos WSU-DLCL2 (EZH2 Y646F) con el compuesto 44, CHOP o la combinación durante 28 días, como se especifica en los métodos (Figura 7A). Se representan los volúmenes tumorales medios /- SEM. Ambas dosis del compuesto 44 a 150 mg/kg TID y 225 mg/kg BID fueron estadísticamente más significativas en la inhibición del crecimiento tumoral que el vehículo solo (* valor de p < 0.05). El tratamiento con el compuesto 44 a 225 mg/kg BID más CHOP dio como resultado una mayor regresión del tumor que con cualquier agente único solo (*** valor de p <0.001 frente al vehículo). Estadísticas calculadas mediante An OVA de medidas repetidas. Se trataron xenoinjertos de SUDHL6 (EZH2 Y646N) con el compuesto 44, CHOP o la combinación durante 28 días, como se especifica en los métodos (Figura 7B). Los volúmenes tumorales medios /-SEM se representan en el panel superior. CHOP o el compuesto 44 como agente único solo no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral, pero el tratamiento con el compuesto 44 a 225 mg/kg BID más CHOP dio como resultado una regresión del crecimiento tumoral durante el período de tratamiento de 28 días, mientras que también mantuvo el retraso del crecimiento tumoral después de 32 días de cese de la dosis (* valor de p <0.0001). Las curvas de supervivencia (panel inferior) hasta 60 días demuestran un retraso significativo en el crecimiento tumoral en animales tratados con una combinación del compuesto 44 y CHOP (** valor p <0.05). Estadísticas calculadas mediante la prueba t de dos colas. Se trataron xenoinjertos de SUDHL-10 (EZH2 Y646F) con el compuesto 44, COP (SOC sin el componente de doxorrubicina) o la combinación durante 28 días, como se especifica en los métodos (Figura 7C). Los volúmenes tumorales medios /- SEM se representan en el panel superior. El porcentaje de supervivencia hasta los 60 días en un estudio de retraso del crecimiento tumoral se representa en el panel central (Nota: las curvas de supervivencia de 500 mg/kg y 250 mg/kg COP se superponen). Los pesos medios de los tumores se comparan en el panel inferior, lo que demuestra las diferencias significativas en el peso del tumor entre los grupos (*valor de p < 0.05, ** valor de p <0.01, **** valor de p <0.0001).
Las figuras 8A-8C son paneles que muestran el cambio en los niveles de expresión de los genes diana de glucocorticoides Sestrina 1 (SESN1, Figura 8A), TNF (Figura 8B) y GILZ (Figura 8C) cuando se tratan diversas líneas celulares con el compuesto 44, prednisolona, una combinación del compuesto 44 y prednisolona, o DMSO. Como se muestra en las figuras 8A-8C, se observó un aumento en los niveles de expresión de Sestrina 1, TNF y GILZ después del cotratamiento en comparación con el compuesto 44 o prednisolona sola.
Las figuras 9A-9D son paneles que muestran que la acetilación y trimetilación global de H3K27 no se ven afectadas por la prednisolona o el tratamiento de combinación. Las células se trataron durante 4 días con dosis crecientes de prednisolona, compuesto 44 (Comp. 44) o una combinación del compuesto 44 con una dosis constante de prednisolona. Las histonas extraídas con ácido se analizaron mediante ELISA para los niveles de H3K27Me3 (Figura 9A) (prednisolona sola, panel izquierdo; combinación del compuesto 44/prednisolona, panel derecho, con valores de IC50 como recuadros de cada gráfico). Para el tratamiento con prednisolona, los valores de H3K27Me3 se representan como un gráfico de barras, ya que no se observaron cambios dependientes de la dosis con este compuesto. Se trataron células WSU-DLCL2 (Figura 9B), OCI-LY19 (Figura 9C) o RL (Figura 9D) durante 4 días con dosis crecientes de prednisolona, compuesto 44 o una combinación del compuesto 44 con una dosis constante de prednisolona. Las histonas extraídas con ácido se analizaron mediante transferencia Western para determinar los niveles de acetilación de H3K27.
La figura 10 es una transferencia de Western que muestra que el tratamiento de agente único con el compuesto 44 o prednisolona no tiene ningún efecto sobre los niveles de proteína SMARCB1.
Las figuras 11A y 11D son gráficos Fa-CI que demuestran el beneficio de combinación del compuesto 44 y everolimus. Las figuras 11B y 11E son paneles que muestran apoptosis en células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 tratadas con el compuesto 44, everolimus, una combinación del compuesto 44 y everolimus, o DMSO. Las figuras 11C y 11F son gráficos que muestran los cambios en la fase G1 del ciclo celular observados después del cotratamiento en comparación con el compuesto 44 solo en las células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5. Se observaron fuertes efectos sinérgicos para una combinación del compuesto 44 y everolimus tanto en células WSU-DLCL2 como en SU-DHL-5 (Figura 11A, 11D).
Las figuras 12A y 12D son gráficos Fa-CI que demuestran el beneficio de combinación del compuesto 44 e ibrutinib. Las figuras 12B y 12E son paneles que muestran apoptosis en células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 tratadas con el compuesto 44, ibrutinib, una combinación del compuesto 44 e ibrutinib o DMSO. Las figuras 12C y 12F son gráficos que muestran los cambios en la fase G1 del ciclo celular observados después del cotratamiento en comparación con el compuesto 44 solo tanto en las células WSU-DLCL2 como en SUDHL-5. Se observaron fuertes efectos sinérgicos para una combinación del compuesto 44 e ibrutinib tanto en células WSU-DLCL2 como en SU-DHL-5 (Figuras 12A, 12D).
Las figuras 13A, 13D y 13G son gráficos Fa-CI que demuestran el beneficio de combinación del compuesto 44 y MK-2206 en las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19. Las figuras 13B, 13E y 13H son paneles que muestran apoptosis en células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 tratadas con el compuesto 44, MK-2206, una combinación del compuesto 44 y MK-2206, o DMSO. Las figuras 13C, 13F y 13I son gráficos que muestran los cambios en la fase G1 del ciclo celular observados después del cotratamiento en comparación con el compuesto 44 solo en las tres líneas celulares. Se observaron fuertes efectos sinérgicos para una combinación del compuesto 44 y MK-2206 en células WSU-DLCL2, células SU-DHL-5 y OCI-LY19 (Figuras 13A, 13D y 13G).
Las figuras 14A-14C son gráficos de barras que muestran el cambio en la expresión génica de EGR1, FOS, TCL1, AICDA y GJA1 cuando las células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 se trataron con el compuesto 44, ibrutinib, MK-2206, una combinación del compuesto 44 e ibrutinib, o una combinación del compuesto 44 y MK-2206. La regulación negativa de EGR1 (40 veces) y FOS (4 veces) y la regulación positiva de AICDA (3 veces), TCL1A (5 veces) y GJA1 (3 veces) se observó con una combinación del compuesto 44 y un segundo agente que se observó con tratamiento de agentes individuales solos (Figuras 14A-14C).
La figura 15 es un diagrama de las vías de señalización implicadas en la biología del linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) y las dianas de diversos agentes quimioterapéuticos dentro de la vía de señalización.
Las figuras 16A y 16D son gráficos que muestran los cambios en la fase G1 del ciclo celular observados después del tratamiento de células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 con el compuesto 44, everolimus, una combinación del compuesto 44 y everolimus, y DMSO. Las figuras 16B y 16E son gráficos que muestran los cambios en la fase S del ciclo celular observados después del tratamiento de células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 con el compuesto 44, everolimus, una combinación del compuesto 44 y everolimus y DMSO. Las figuras 16C y 16F son gráficos que muestran los cambios en las fases G2/M del ciclo celular observados después del tratamiento de células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 con el compuesto 44, everolimus, una combinación del compuesto 44 y everolimus, y DMSO. Se observa una disminución sinérgica de células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, 48 horas después del cotratamiento en células SU-DHL-5 (Figuras 16D-16F). No se observó ningún cambio en la fase sub-G1 del ciclo celular cuando las células WSU-DLCL2 se trataron con agentes únicos o en combinación (Figura 16A). Se observó una disminución sinérgica dependiente del tiempo de las células en la fase S y la fase G2/M del ciclo celular, respectivamente, cuando se trataron células WSU-DLCL2 con la combinación (Figuras 16B, 16C).
Las figuras 17A y 17D son gráficos que muestran los cambios en la fase G1 del ciclo celular observados después del tratamiento de WSU-DLCL2 y células SU-DHL-5 con el compuesto 44, ibrutinib una combinación del compuesto 44 e ibrutinib y DMSO. Las figuras 17B y 17E son gráficos que muestran los cambios en la fase S del ciclo celular observados después del tratamiento de células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 con el compuesto 44, ibrutinib, una combinación del compuesto 44 e ibrutinib y DMSO.
Las figuras 17C y 17F son gráficos que muestran los cambios en las fases G2/M del ciclo celular observados después del tratamiento de células WSU-DLCL2 y SU-DHL-5 con el compuesto 44, ibrutinib, una combinación del compuesto 44 e ibrutinib y DMSO. Las figuras 17A-17F muestran una disminución sinérgica de células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, 24 horas después del cotratamiento de células WSU-DLCL2 y células SU-DHL-5 en comparación con el compuesto 44 o ibrutinib como agentes únicos.
Las figuras 18A, 18D y 18G son gráficos que muestran los cambios en la fase G1 del ciclo celular observados después del tratamiento de las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 con el compuesto 44, MK-2206, una combinación del compuesto 44 y MK-2206 y DMSO. Las figuras 18B, 18E y 18H son gráficos que muestran los cambios en la fase S del ciclo celular observados después del tratamiento de las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 con el compuesto 44, MK-2206, una combinación del compuesto 44 y MK-2206 y DMSO. Las figuras 18C, 18F y 18I son gráficos que muestran los cambios en las fases G2/M del ciclo celular observados después del tratamiento de las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 con el compuesto 44, MK-2206, una combinación del compuesto 44 y MK-2206 y DMSO. Las figuras 18A-18I muestran una disminución sinérgica de células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente después del cotratamiento de células WSU-DLCL2 y células SU-DHL-5 en comparación con el compuesto 44 o MK-2206 como agentes únicos.
La figura 19 es un gráfico de barras que muestra el cambio en los niveles de expresión del receptor de glucocorticoides, normalizado a los controles DMSO, para EZH2 de tipo salvaje (OCI-LY19, DOHH2), sensible a EZH2 Y646 (WSU-DLCL2, SUDHL10) y líneas celulares resistentes a EZH2 y 646 (RL, SUDHL) tratadas con el compuesto 44, prednisolona, una combinación del compuesto 44 y prednisolona, o DMSO. Los valores de cambio múltiplo se cuantificaron usando el método AACt y ACTB, B2M y GAPDH como genes de referencia. Como muestran los resultados, los niveles de expresión de los receptores de glucocorticoides no se vieron comúnmente afectados entre las líneas celulares en la combinación.
Las figuras 20A-20C muestran los efectos de omitir uno o todos los componentes de la quimioterapia del régimen CHOP en ratones portadores de xenoinjertos. La figura 20A es un gráfico que muestra el cambio en el peso del tumor en ratones portadores de xenoinjerto SUDHL10 (EZH2 Y646F) tratados con el compuesto 44, COP (quimioterapia sin el componente de doxorrubicina) o su combinación durante 28 días. La figura 20B es un gráfico que muestra el cambio en el volumen del tumor en ratones portadores de xenoinjerto SUDHL 10 (EZH2 Y646F) tratados durante 28 días con dos dosis del compuesto 44, prednisona o su combinación. La figura 20C es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal en ratones portadores de xenoinjerto SUDHL10 (EZH2 Y646F) tratados con el compuesto 44, prednisona o su combinación (véase la figura 20B). Los ratones a los que se les administró la dosis máxima tolerada del compuesto 44 o con la combinación del compuesto 44/COP mostraron una supervivencia del 100 % el día 60, el grupo de combinación mostró los pesos tumorales del día 28 más pequeños de todos los demás grupos de tratamiento, incluida la dosis máxima tolerada para el compuesto 44 (Figura 20A). La dosificación de prednisona sola no indujo ningún efecto antitumoral significativo (Figura 20B). De acuerdo con el estudio anterior, la dosificación del compuesto 44 generó solo una respuesta parcial, pero la dosificación conjunta del compuesto 44 con prednisona, pero no con el régimen de prednisona de 2 ciclos, indujo la regresión máxima posible lograda con dosis más altas del compuesto 44 solo.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de que el compuesto 44 en combinación con una variedad de agentes, incluido el estándar actual de cuidado, es activo en el tratamiento de ciertos cánceres independientemente del estado de mutación EZH2. En una determinada realización, el cáncer es un linfoma. En una determinada realización, el cáncer es un linfoma no Hodgkin (NHL) o un linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) de origen de células B del centro germinal (GCB). En determinadas realizaciones, el linfoma es un linfoma mutante EZH2. En determinadas realizaciones, el linfoma es un linfoma EZH2 no mutante o EZH2 de tipo salvaje.
El inhibidor de EZH2 empleado en las reivindicaciones es el compuesto 44 (también conocido como EPZ-6438, E7438) que tiene la siguiente fórmula:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que los inhibidores de la histona metiltransferasa EZH2 y otros agentes contra el cáncer se pueden usar en combinación para tratar determinados tumores con resultados superiores a los que se obtienen al tratar tumores con inhibidores de la histona metiltransferasa EZH2 y los agentes contra el cáncer solos. De acuerdo con lo anterior, la presente descripción proporciona una composición que comprende un inhibidor de la histona metiltransferasa EZH2 y uno o más otros agentes terapéuticos, y métodos para su uso para tratar enfermedades en cuyo curso se puede influir modulando el estado de metilación de histonas u otras proteínas, por ejemplo, cáncer. También se describen en este documento métodos para terapias de combinación que comprenden inhibidor de la histona metiltransferasa EZH2 y uno o más agentes terapéuticos para tratar el cáncer, por ejemplo, linfoma folicular (FL) y linfoma difuso de células B grandes de células (DCLBL). Específicamente, los métodos son útiles para tratar o prevenir el cáncer o inhibir la proliferación de células cancerosas.
En este documento se describen métodos de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o afección precancerosa en un sujeto administrando a un sujeto que expresa un EZH2 mutante una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 y uno o más agentes terapéuticos. El EZH2 mutante se refiere a un polipéptido EZH2 mutante o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido EZH2 mutante. En determinadas realizaciones, el EZH2 mutante comprende una o más mutaciones en su dominio de bolsillo de sustrato.
En este documento se describen métodos de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o afección precancerosa en un sujeto administrando a un sujeto que expresa un EZH2 mutante o un EZH2 de tipo salvaje una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 y uno o más otros agentes terapéuticos. El EZH2 mutante se refiere a un polipéptido EZH2 mutante o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido EZH2 mutante. En determinadas realizaciones, el EZH2 mutante comprende una o más mutaciones en su dominio de bolsillo de sustrato.
En este documento se describen métodos de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o afección precancerosa en un sujeto administrando a un sujeto que expresa un EZH2 mutante o un EZH2 de tipo salvaje una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2. El EZH2 mutante se refiere a un polipéptido EZH2 mutante o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido EZH2 mutante. En determinadas realizaciones, el EZH2 mutante comprende una o más mutaciones en su dominio de bolsillo de sustrato.
Se han descrito previamente ácidos nucleicos y polipéptidos de EZH2 humanos. Véase, por ejemplo, Chen et al. (1996) Genomics 38:30-7 [746 aminoácidos]; No. de acceso Swiss-Prot Q15910 [746 aminoácidos]; Nos. de acceso GenBank NM_004456 y Np_004447 (isoforma a [751 aminoácidos]); y Nos. de acceso GenBank NM_152998 y NP_694543 (isoforma b [707 aminoácidos]).
Para los fines de esta solicitud, se debe entender que el residuo de aminoácido Y641 de EZH2 humano se refiere al residuo de tirosina que es o corresponde a Y641 en el No. de acceso de Swiss-Prot Q15910.
También para los fines de esta solicitud, un mutante Y641 de EZH2 humano y, de manera equivalente, un mutante Y641 de EZH2, se debe entender que se refiere a un EZH2 humano en el que el residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humano de tipo salvaje está sustituido por un residuo de aminoácido distinto de tirosina.
En determinadas realizaciones, el inhibidor de las vías de señalización del receptor de células B (BCR) es el inhibidor de AKT MK-2206, idelalisib, trametinib, tamatanib o ibrutinib.
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los inhibidores de la vía de señalización PI3K-AKT-mTOR BCR, por ejemplo, idelalisib, MK-2206 y everolimus, indujeron una sinergia muy fuerte en las líneas celulares WSU-DLCL2 y SU-DHL-10 cuando se combina con el compuesto 44. La invención también se basa, en parte, en el descubrimiento de que la combinación del compuesto 44 e inhibidores de la vía del receptor de células B, por ejemplo, ibrutinib y tamatanib, mostraron una sinergia muy fuerte en ambas líneas celulares.
En algunas realizaciones, el cáncer es un linfoma no Hodgkin, un linfoma difuso de células B grandes o un linfoma no Hodgkin de células B del centro germinal.
El inhibidor de BCR es el inhibidor de AKT MK-2206, idelalisib, trametinib, tamatanib o ibrutinib.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer EZH2 mutante.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer resistente o refractario al inhibidor de EZH2.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por la sustitución de un único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humano de tipo salvaje por un residuo de aminoácido distinto de la tirosina.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por sustitución de fenilalanina (F) por el residuo de aminoácido único correspondiente a Y641 de EZH2 humano de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641F o, de forma equivalente, Y641F.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por sustitución de histidina (H) para el residuo de aminoácido único correspondiente a Y641 de EZH2 humano de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641H o, de forma equivalente, Y641H.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por sustitución de asparagina (N) por el residuo de aminoácido único correspondiente a Y641 de EZH2 humano de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641N o, de forma equivalente, Y641N.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por sustitución de serina (S) por el residuo de aminoácido único correspondiente a Y641 de humano de tipo salvaje. EZH2. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641S o, de forma equivalente, Y641S.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por sustitución de cisteína (C) por el residuo de aminoácido único correspondiente a Y641 de EZH2 humano de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641C o, de forma equivalente, Y641C.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante A677 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por la sustitución de un aminoácido que no es alanina, preferiblemente glicina (G) por el residuo de aminoácido único correspondiente a A677 del EZH2 humano de tipo salvaje. El mutante A677 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante A677, y preferiblemente un mutante A677G o, de manera equivalente, A677G. A677 también se conoce como A682.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante A687 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje solo por la sustitución de un aminoácido que no es alanina, preferiblemente valina (V) por el residuo de aminoácido único correspondiente a A687 del EZH2 humano de tipo salvaje. El mutante A687 de EZH2 de acuerdo con esta realización se denomina en este documento un mutante A687 y preferiblemente un mutante A687V o, de manera equivalente, A687V. A687 también se conoce como A692.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humano de tipo salvaje en uno o más residuos de aminoácidos en su dominio de bolsillo de sustrato. El mutante de EZH2 según esta realización se denomina en este documento como mutante EZH2.
Otra mutación de aminoácido de sustitución de ejemplo incluye una sustitución en la posición 677, 687 o 641 del aminoácido, tal como, pero no se limita a, una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición 677 del aminoácido (A677G); una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición 687 del aminoácido (A687V); una sustitución de fenilalanina (F) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición 641 del aminoácido (Y641F); una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición 641 del aminoácido (Y641H); una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición 641 del aminoácido (Y641N); una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición 641 del aminoácido (Y641S); o una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición 641 del aminoácido (Y641C). Y641 también se conoce como Y646.
Se esperaría que las células heterocigotas para EZH2 exhibieran un fenotipo maligno debido a la formación eficiente de H3-K27mel por la enzima WT y la transición posterior eficiente de esta especie progenitora a H3-K27me2, y, especialmente, H3-K27me3, por la (s) forma (s) de enzima mutante.
Otro aspecto de la presente descripción es un método para inhibir en un sujeto la conversión de H3-K27 en H3-K27 trimetilado. La inhibición puede implicar inhibir en un sujeto la conversión de H3-K27 no metilado en H3-K27 monometilado, conversión de H3-K27 monometilado en H3-K27 dimetilado, conversión de H3-K27 dimetilado en H3-K27 trimetilado, o cualquier combinación de los mismos, incluyendo, por ejemplo, conversión de H3- K27 monometilado en H3-K27 dimetilado y conversión de H3-K27 dimetilado en H3-K27 trimetilado. Como se usa en este documento, H3-K27 no metilado se refiere a histona H3 sin grupo metilo unido covalentemente al grupo amino de lisina 27. Como se usa en este documento, H3-K27 monometilado se refiere a histona H3 con un solo grupo metilo unido covalentemente al grupo amino de lisina 27. H3-K27 monometilado también se denomina en este documento H3-K27me1. Como se usa en este documento, H3-K27 dimetilado se refiere a histona H3 con dos grupos metilo unidos covalentemente al grupo amino de lisina 27. H3-K27 dimetilado también se denomina en este documento H3-K27me2. Como se usa en este documento, H3-K27 trimetilado se refiere a histona H3 con tres grupos metilo unidos covalentemente al grupo amino de lisina 27. H3-K27 trimetilado también se denomina en este documento H3-K27me3. Una composición de la presente descripción comprende el compuesto 44 y uno o más otros agentes terapéuticos. Los compuestos y combinaciones de la invención son apropiados para la administración como parte de una terapia de combinación con uno o más otros agentes terapéuticos o modalidad de tratamiento, apropiados que se van a administrar juntos, de forma secuencial, o en alternancia. Otros compuestos apropiados para los métodos de la descripción se describen en la Publicación de los Estados Unidos 20120264734.
Un inhibidor de EZH2 "inhibe selectivamente" la actividad de histona metiltransferasa de la EZH2 mutante cuando inhibe la actividad de histona metiltransferasa de la EZH2 mutante más eficazmente que inhibe la actividad de histona metiltransferasa de EZH2 de tipo salvaje. Por ejemplo, el inhibidor selectivo puede tener una IC50 para el EZH2 mutante que sea al menos un 40 por ciento más baja que la IC50 para el EZH2 de tipo salvaje. El inhibidor selectivo puede tener una IC50 para el EZH2 mutante que sea al menos un 50 por ciento más bajo que la IC50 para el EZH2 de tipo salvaje. El inhibidor selectivo puede tener una IC50 para el EZH2 mutante que sea al menos un 60 por ciento más bajo que la IC50 para el EZH2 de tipo salvaje. El inhibidor selectivo puede tener una IC50 para el EZH2 mutante que sea al menos un 70 por ciento más bajo que la IC50 para el EZH2 de tipo salvaje. El inhibidor selectivo puede tener una IC50 para el EZH2 mutante que sea al menos un 80 por ciento más bajo que la IC50 para el EZH2 de tipo salvaje. El inhibidor selectivo puede tener una IC50 para el EZH2 mutante que sea al menos un 90 por ciento más baja que la IC50 para el EZH2 de tipo salvaje.
El inhibidor puede inhibir la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3. En una realización, se dice que el inhibidor inhibe la trimetilación de H3-K27. Dado que la conversión de H3-K27mel en H3-K27me2 precede a la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3, un inhibidor de la conversión de H3-K27mel en H3-K27me2 también inhibe naturalmente la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3, es decir, inhibe trimetilación de H3-K27. También es posible inhibir la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3 sin inhibir la conversión de H3-K27mel en H3-K27me2. La inhibición de este tipo también daría como resultado la inhibición de la trimetilación de H3-K27, aunque sin inhibición de la dimetilación de H3-K27.
En una realización, el inhibidor inhibe la conversión de H3-K27me1 en H3-K27me2 y la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3. Tal inhibidor puede inhibir directamente la conversión de H3-K27mel en H3-K27me2 solo. Alternativamente, tal inhibidor puede inhibir directamente tanto la conversión de H3-K27mel en H3-K27me2 como la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3.
La inhibición de la actividad de la histona metiltransferasa se puede detectar usando cualquier método apropiado. La inhibición se puede medir, por ejemplo, ya sea en términos de tasa de actividad de histona metiltransferasa o como producto de la actividad de histona metiltransferasa.
La inhibición es una inhibición medible en comparación con un control apropiado. En una realización, la inhibición es al menos un 10 por ciento de inhibición en comparación con un control apropiado. Es decir, la tasa de actividad enzimática o la cantidad de producto con el inhibidor es menor o igual al 90 por ciento de la tasa o cantidad correspondiente preparada sin el inhibidor. En diversas otras realizaciones, la inhibición es de al menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90 o 95 por ciento de inhibición en comparación con un control apropiado. En una realización, la inhibición es al menos un 99 por ciento de inhibición en comparación con un control apropiado. Es decir, la tasa de actividad enzimática o la cantidad de producto con el inhibidor es menor o igual al 1 por ciento de la tasa o cantidad correspondiente preparada sin el inhibidor.
En este documento se describe una composición que comprende un inhibidor de EZH2 o compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más otros agentes terapéuticos, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En este documento se describe la administración de un inhibidor de EZH2 o compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticos o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como una coformulación o formulaciones separadas, en la que la administración de formulaciones es simultánea, secuencial, o en alternancia. En determinadas realizaciones, los otros agentes terapéuticos pueden ser un agente que se reconoce en la técnica como útil para tratar la enfermedad o afección que está siendo tratada por la composición descrita en este documento. En otra realización, el otro agente terapéutico puede ser un agente que no se reconoce en la técnica como útil para tratar la enfermedad o afección que está siendo tratada por la composición descrita en este documento. En un aspecto, los otros agentes terapéuticos pueden ser un agente que imparta un atributo beneficioso a la composición descrita en este documento (por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición). El atributo beneficioso de la composición descrita en este documento incluye, pero no se limita a, la coacción farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de un inhibidor de EZH2 o compuesto 44 y uno o más otros agentes terapéuticos.
Los agentes terapéuticos expuestos a continuación son para fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes. La presente invención incluye al menos otro agente terapéutico seleccionado de las siguientes listas. La presente invención puede incluir más de un otro agente terapéutico, por ejemplo, otros dos, tres, cuatro o cinco otros agentes terapéuticos de manera que la composición descrita en este documento pueda realizar su función pretendida.
Se describe en este documento, el otro agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico (también denominado agente antineoplásico o agente antiproliferativo), seleccionado del grupo que incluye un agente alquilante; un antibiótico; un antimetabolito; un agente desintoxicante; un interferón; un anticuerpo policlonal o monoclonal; un inhibidor de EGFR; un inhibidor de HER2; un inhibidor de histona desacetilasa; una hormona; un inhibidor mitótico; un inhibidor de MTOR; un inhibidor de múltiples quinasas; un inhibidor de serina/treonina quinasa; inhibidores de la tirosina quinasa; un inhibidor de VEGF/VEGFR; un taxano o derivado de taxano, un inhibidor de la aromatasa, una antraciclina, un fármaco dirigido a microtúbulos, un fármaco tóxico para la topoisomerasa, un inhibidor de una diana molecular o enzima (por ejemplo, una quinasa o una proteína metiltransferasa), un fármaco análogo de citadina o cualquier quimioterapéutico, agente antineoplásico o antiproliferativo incluido en www.cancer.org/docroot/cdg/cdg_0.asp.
En este documento se describen métodos para terapia de combinación en los que se administra una composición que comprende un inhibidor de EZH2 o compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más otros agentes terapéuticos a un sujeto que necesita el tratamiento de una enfermedad o cáncer. La terapia de combinación también se puede administrar a células cancerosas para inhibir la proliferación o inducir la muerte celular. En un aspecto, el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra después de la administración de la composición descrita en este documento que comprende el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más otros agentes terapéuticos. En un aspecto, el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra antes de la administración de la composición descrita en este documento que comprende el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más otros agentes terapéuticos. En un aspecto, el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra después de la administración de uno o más agentes terapéuticos, de manera que los otros agentes terapéuticos se administran en una composición única o en dos o más composiciones, por ejemplo, administrado simultáneamente, de forma secuencial o en alternancia. En un aspecto, el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra antes de la administración de uno o más agentes terapéuticos, de manera que los otros agentes terapéuticos se administran en una composición única o en dos o más composiciones, por ejemplo, administrado simultáneamente, de forma secuencial o en alternancia.
En determinadas realizaciones, la "combinación que comprende un inhibidor de EZH2 y un agente de cuidado estándar" pretende abarcar la administración de agentes terapéuticos que no están coformulados.
En determinadas realizaciones, la "terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de forma secuencial, en la que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos al mismo tiempo, o de una manera sustancialmente simultánea. La administración simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una sola cápsula que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede realizar por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de los tejidos de las membranas mucosas. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse mediante inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía oral o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar mediante inyección intravenosa. Los agentes terapéuticos también se pueden administrar en alternancia.
En determinados aspectos de la invención, las terapias de combinación presentadas en la presente invención pueden dar como resultado un efecto sinérgico en el tratamiento de una enfermedad o cáncer. Un "efecto sinérgico" se define como cuando la eficacia de una combinación de agentes terapéuticos es mayor que la suma de los efectos de cualquiera de los agentes administrados solos. Un efecto sinérgico también puede ser un efecto que no se puede lograr mediante la administración de ninguno de los compuestos u otros agentes terapéuticos como agentes individuales. El efecto sinérgico puede incluir, pero no se limita a, un efecto de tratamiento del cáncer reduciendo el tamaño del tumor, inhibiendo el crecimiento del tumor o aumentando la supervivencia del sujeto. El efecto sinérgico también puede incluir reducir la viabilidad de las células cancerosas, inducir la muerte de las células cancerosas e inhibir o retrasar el crecimiento de las células cancerosas.
En determinados aspectos de la invención, la "terapia de combinación" también abarca la administración de los agentes terapéuticos como se describió anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía o tratamiento con radiación). Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico se puede realizar en cualquier momento apropiado siempre que se logre un efecto beneficioso de la coacción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento no farmacológico se retira temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás en días o incluso semanas.
En otro aspecto, una composición de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, se puede administrar en combinación con radioterapia. La radioterapia también se puede administrar en combinación con una composición de la presente invención y otro agente quimioterapéutico descrito en este documento como parte de una terapia con múltiples agentes.
La terapia de combinación se puede lograr administrando dos o más agentes, por ejemplo, un compuesto 44 y uno o más otros agentes terapéuticos, cada uno de los cuales se formula y administra por separado, o administrando dos o más agentes en una única formulación. Otras combinaciones también están incluidas en la terapia de combinación. Por ejemplo, se pueden formular dos agentes juntos y administrar junto con una formulación separada que contenga un tercer agente. Si bien los dos o más agentes en la terapia de combinación se pueden administrar simultáneamente, no es necesario. Por ejemplo, la administración de un primer agente (o combinación de agentes) puede preceder a la administración de un segundo agente (o combinación de agentes) en minutos, horas, días o semanas. De este modo, los dos o más agentes se pueden administrar con unos minutos de diferencia entre sí o con una diferencia de 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 o 24 horas o con una diferencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 días entre sí o con una diferencia de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 semanas entre sí. En algunos casos, son posibles intervalos incluso más largos. Si bien en muchos casos es deseable que los dos o más agentes usados en una terapia de combinación estén presentes dentro del cuerpo del paciente al mismo tiempo, esto no tiene por qué ser así.
La presente descripción también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto 44 o sus sales farmacéuticamente aceptables, y uno o más otros agentes terapéuticos descritos en este documento, mezclados con portadores o excipientes farmacéuticamente apropiados en dosis para tratar o prevenir una enfermedad o afección como se describe en este documento. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos o modalidades terapéuticas de forma simultánea, secuencial o en alternancia.
Las mezclas de composiciones descritas en este documento también se pueden administrar al paciente como una mezcla simple o en composiciones farmacéuticas formuladas apropiadas. Por ejemplo, un aspecto de la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 o compuesto 44, o una sal, hidrato, enantiómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo; uno o más otros agentes terapéuticos y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
Una "composición farmacéutica" es una formulación que contiene los compuestos de la presente invención en una forma apropiada para la administración a un sujeto. El compuesto 44 y uno o más otros agentes terapéuticos descritos en este documento se pueden formular cada uno individualmente o en múltiples composiciones farmacéuticas en cualquier combinación de los ingredientes activos. De acuerdo con lo anterior, se pueden elegir apropiadamente una o más vías de administración en base a la forma de dosificación de cada composición farmacéutica. Alternativamente, el compuesto 44 y uno o más otros agentes terapéuticos descritos en este documento se pueden formular como una composición farmacéutica.
En una realización, la composición farmacéutica está a granel o en forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, una cápsula, una bolsa intravenosa, un comprimido, una sola bomba en un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto descrito o sal, hidrato, solvato o isómero del mismo) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y varía según el tratamiento particular implicado. Un experto en la técnica apreciará que a veces es necesario realizar variaciones rutinarias de la dosis dependiendo de la edad y el estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Se contemplan una variedad de rutas, que incluyen oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inhalatoria, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, pulverizadores, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una realización, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, soluciones reguladoras o propulsor que se requiera.
Como se usa en este documento, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, aniones, cationes, materiales, composiciones, portadores y/o formas de dosificación que, están dentro del alcance del buen juicio médico, son apropiados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción beneficio/riesgo razonable.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y ni biológica ni de otra manera indeseable, e incluye un excipiente que es aceptable para uso veterinario así como para uso farmacéutico humano. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en la especificación y las reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de tales excipientes.
Se formula una composición farmacéutica de la invención para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; soluciones reguladoras tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Se puede administrar una composición de la invención a un sujeto en muchos de los métodos bien conocidos que se usan actualmente para el tratamiento quimioterapéutico. Por ejemplo, para el tratamiento de cánceres, un compuesto de la invención puede inyectarse directamente en tumores, inyectarse en el torrente sanguíneo o en las cavidades corporales o tomarse por vía oral o aplicarse a través de la piel con parches. La dosis elegida debe ser suficiente para constituir un tratamiento eficaz, pero no tan alta como para causar efectos secundarios inaceptables. El estado del estado de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, precáncer y similares) y la salud del paciente se deben controlar de cerca preferiblemente y durante un período razonable después del tratamiento.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección identificada, o para exhibir un efecto terapéutico o inhibidor detectable. El efecto se puede detectar mediante cualquier método de ensayo conocido en la técnica. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del peso corporal, el tamaño y la salud del sujeto; la naturaleza y extensión de la condición; y el tratamiento o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para su administración. Las cantidades terapéuticamente eficaces para una situación dada se pueden determinar mediante experimentación de rutina que esté dentro de la habilidad y el juicio del médico. En un aspecto preferido, la enfermedad o afección que se va a tratar es el cáncer. En otro aspecto, la enfermedad o afección que se va a tratar es un trastorno de proliferación celular.
En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de cada agente farmacéutico usado en combinación será menor cuando se use en combinación en comparación con la monoterapia con cada agente solo. Tal menor cantidad terapéuticamente eficaz podría permitir una menor toxicidad del régimen terapéutico.
Para cualquier compuesto, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, normalmente ratas, ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Luego, tal información se puede usar para determinar dosis y vías útiles para la administración en humanos. La eficacia terapéutica/profiláctica y la toxicidad se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción LD50/ED50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.
La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del (los) agente (s) activo (s) o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la (s) combinación (es) de fármacos, la sensibilidad a las reacciones y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, dependiendo de la semivida y la tasa de aclaramiento de la formulación particular.
Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento que contienen compuestos activos se pueden fabricar de una manera generalmente conocida, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Por supuesto, la formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores apropiados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol y cloruro de sodio en la composición. Se puede conseguir una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y el liofilizado que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible farmacéuticamente aceptable. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimirse en forma de comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos, grageas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, en las que el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se enjuaga y expectora o traga. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizador en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado, que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles, o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos activos se pueden preparar con portadores farmacéuticamente aceptables que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr.
En aplicaciones terapéuticas, las dosificaciones de los compuestos inhibidores de EZH2 descritos en este documento, otros agentes terapéuticos descritos en este documento, composiciones que comprenden el compuesto 44 y uno o más otros agentes terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas usadas de acuerdo con la invención varían dependiendo del agente, la edad, el peso y el estado clínico del paciente receptor, y la experiencia y el criterio del médico o practicante que administra la terapia, entre otros factores que afectan la dosificación seleccionada. En general, la dosis debe ser suficiente para provocar una ralentización, y preferiblemente una regresión, el crecimiento de los tumores y también preferiblemente causar una regresión completa del cáncer. Las dosificaciones pueden variar desde aproximadamente 0.01 mg/kg por día hasta aproximadamente 5000 mg/kg por día. En aspectos preferidos, los dosajes pueden variar desde aproximadamente 1 mg/kg por día hasta aproximadamente 1000 mg/kg por día. En un aspecto, la dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 mg/día hasta aproximadamente 50 g/día; aproximadamente 0.1 mg/día hasta aproximadamente 25 g/día; aproximadamente 0.1 mg/día hasta aproximadamente 10 g/día; aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 3 g/día; o aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 1 g/día, en dosis únicas, divididas o continuas (dosis que se pueden ajustar al peso del paciente en kg, área de superficie corporal en m2 y edad en años). Una cantidad eficaz de un agente farmacéutico es aquella que proporciona una mejora objetivamente identificable según lo observado por el médico u otro observador calificado. Por ejemplo, la regresión de un tumor en un paciente se puede medir con referencia al diámetro de un tumor. La disminución del diámetro de un tumor indica regresión. La regresión también está indicada por la falta de reaparición de los tumores después de que se ha detenido el tratamiento. Como se usa en este documento, el término "forma de dosificación eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo para producir el efecto biológico deseado en un sujeto o célula.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración.
La composición descrita en este documento es capaz de formar sales adicionalmente. La composición descrita en este documento es capaz de formar más de una sal por molécula, por ejemplo, mono-, di-, tri-. Todas estas formas también se contemplan dentro del alcance de la invención reivindicada.
Como se usa en este documento, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos de la presente invención en los que el compuesto original se modifica produciendo sales ácidas o básicas del mismo. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas, sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto original formado, por ejemplo, a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de ácidos orgánicos e inorgánicos seleccionados entre 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietanosulfónico, acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etano disulfónico, 1,2-etanosulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, lauril sulfónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicíclico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, toluenosulfónico y los aminoácidos que se encuentran comúnmente, por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc
Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácido hexanoico, ácido ciclopentano propiónico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinámico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2] -oct-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido mucónico y similares. La presente invención también abarca las sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinotérreo o un ion de aluminio; o coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares.
Se debe entender que todas las referencias a sales farmacéuticamente aceptables incluyen formas de adición de disolvente (solvatos) de la misma sal.
La composición, o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, se administran por vía oral, nasal, transdérmica, pulmonar, por inhalación, bucal, sublingual, intraperintoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, rectal, intrapleural, intratecal y parenteral. En una realización, el compuesto se administra por vía oral. Un experto en la técnica reconocerá las ventajas de determinadas vías de administración.
El régimen de dosificación que usa los compuestos se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la gravedad de la afección que se va a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular o sal del mismo empleado. Un médico o veterinario habitualmente capacitado puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del fármaco necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.
Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos descritos de la invención se pueden encontrar en Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co, Easton, PA (1995). En una realización, los compuestos descritos en este documento, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se usan en preparaciones farmacéuticas en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables apropiados incluyen cargas o diluyentes sólidos inertes y soluciones acuosas u orgánicas estériles. Los compuestos estarán presentes en tales composiciones farmacéuticas en cantidades suficientes para proporcionar la cantidad de dosificación deseada en el intervalo descrito en este documento.
Todos los porcentajes y proporciones usados en este documento, a menos que se indique lo contrario, son en peso. Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodología útiles en la práctica de la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. Basándose en la presente divulgación, el experto puede identificar y emplear otros componentes y metodología útiles para poner en práctica la presente invención.
En este documento se describen composiciones y métodos de tratamiento de afecciones y enfermedades en cuyo curso se puede influir modulando el estado de metilación de histonas u otras proteínas, en los que dicho estado de metilación está mediado al menos en parte por la actividad de EZH2. La modulación del estado de metilación de las histonas puede influir a su vez en el nivel de expresión de genes diana activados por metilación y/o genes diana suprimidos por metilación. El método incluye administrar a un sujeto que necesite tal tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la presente invención o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, a un sujeto que necesite tal tratamiento.
Basado al menos en el hecho de que se ha encontrado que la metilación anormal de histonas está asociada con determinados cánceres y afecciones precancerosas, un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa con un EZH2 mutante en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la metilación. En una realización, un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la conversión de H3-K27 no metilado en H3-K27 monometilado (H3-K27mel). En una realización, un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la conversión de H3-K27 monometilado (H3-K27mel) en H3-K27 dimetilado (H3-K27me2). En una realización, un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la conversión de H3-K27me2 en H3-K27 trimetilado (H3-K27me3). En una realización, un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe tanto la conversión de H3-K27me1 en H3-K27me2 como la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3. Es importante señalar que el aumento específico de la enfermedad en la metilación puede ocurrir en la cromatina en loci genómicos clave en ausencia de un aumento global en los niveles celulares de metilación de histonas o proteínas. Por ejemplo, es posible que se produzca una hipermetilación aberrante en genes clave relevantes para la enfermedad en un contexto de hipometilación global de histonas o proteínas.
Se pueden usar moduladores de metilación para modular la proliferación celular, en general. Por ejemplo, en algunos casos la proliferación excesiva se puede reducir con agentes que disminuyen la metilación, mientras que la proliferación insuficiente se puede estimular con agentes que aumentan la metilación. De acuerdo con lo anterior, las enfermedades que se pueden tratar incluyen enfermedades hiperproliferativas, tales como el crecimiento de células benignas y el crecimiento de células malignas (cáncer).
El trastorno en el que interviene la metilación de proteínas mediada por EZH2 puede ser cáncer, un trastorno de proliferación celular o una afección precancerosa. Se describe en este documento el uso de una composición descrita en este documento, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, a un sujeto que necesite dicho tratamiento, para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento del cáncer. Los cánceres de ejemplo que se pueden tratar incluyen linfomas, incluido el linfoma no Hodgkin, el linfoma folicular (FL) y el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), incluido el linfoma GCB.
En general, los compuestos que son moduladores de metilación se pueden usar para modular la proliferación celular, generalmente. Por ejemplo, en algunos casos la proliferación excesiva puede reducirse con agentes que disminuyen la metilación, mientras que la proliferación insuficiente se puede estimular con agentes que aumentan la metilación. De acuerdo con lo anterior, las enfermedades que se pueden tratar con los compuestos de la invención incluyen enfermedades hiperproliferativas, tales como el crecimiento de células benignas y el crecimiento de células malignas.
Como se usa en este documento, un "sujeto que lo necesita" es un sujeto que tiene un trastorno en el que la metilación de proteínas mediada por EZH2 juega un papel, o un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar tal trastorno con respecto a la población en general. Un sujeto que lo necesita puede tener una afección precancerosa. Preferiblemente, un sujeto que lo necesita tiene cáncer. Un "sujeto" incluye un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, primate, pájaro, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo, cabra, camello, oveja o cerdo. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
El sujeto de la presente invención incluye cualquier sujeto humano al que se le haya diagnosticado, tenga síntomas o esté en riesgo de desarrollar un cáncer o una afección precancerosa. El sujeto de la presente invención incluye cualquier sujeto humano que exprese un EZH2 mutante. Por ejemplo, un EZH2 mutante comprende una o más mutaciones, en las que la mutación es una sustitución, una mutación puntual, una mutación sin sentido, una mutación sin sentido, una deleción o una inserción o cualquier otra mutación EZH2 descrita en este documento.
Un sujeto que lo necesite puede tener cáncer refractario o resistente. "Cáncer refractario o resistente" significa cáncer que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser resistente al comienzo del tratamiento o puede volverse resistente durante el tratamiento. En algunas realizaciones, el sujeto que lo necesita tiene recurrencia del cáncer después de la remisión de la terapia más reciente. En algunas realizaciones, el sujeto que lo necesitaba recibió y falló todas las terapias eficaces conocidas para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto que lo necesita recibió al menos una terapia previa. En determinadas realizaciones, la terapia previa es la monoterapia. En determinadas realizaciones, la terapia anterior es una terapia de combinación.
En algunas realizaciones, un sujeto que lo necesite puede tener un cáncer secundario como resultado de una terapia previa. "Cáncer secundario" significa cáncer que surge debido o como resultado de terapias cancerígenas previas, tales como la quimioterapia.
El sujeto también puede exhibir resistencia a inhibidores de la histona metiltransferasa EZH2 o cualquier otro agente terapéutico.
La invención también presenta un método de selección de una terapia de combinación para un sujeto que tiene cáncer. El método incluye las etapas de: detectar una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en una muestra del sujeto; y seleccionar, en base a la presencia de una o más mutaciones de EZH2, una terapia de combinación para tratar el cáncer. En una realización, la terapia incluye administrar al sujeto una composición de la invención. En una realización, el método incluye además administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención. Se puede detectar una mutación EZH2 usando cualquier método apropiado conocido en la técnica. En la Publicación de la Patente de los Estados Unidos US 20130040906 se describen más métodos.
Los métodos y usos descritos en este documento pueden incluir las etapas de detección de una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en una muestra de un sujeto que lo necesite antes y/o después de la administración de una composición de la invención (por ejemplo, una composición que comprende un compuesto 44) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y uno o más agentes terapéuticos) para el sujeto. La presencia de la una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en la muestra analizada indica que el sujeto responde a la terapia de combinación de la invención.
La divulgación en este documento proporciona medicina personalizada, tratamiento y/o manejo del cáncer para un sujeto mediante cribado genético de una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en el sujeto. Por ejemplo, en este documento se describen métodos de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o una afección precancerosa en un sujeto que lo necesita determinando la capacidad de respuesta del sujeto a una terapia de combinación y cuando el sujeto responde a la terapia de combinación, administrando al sujeto una composición de la invención. La capacidad de respuesta se determina obteniendo una muestra del sujeto y detectando una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento, y la presencia de tales una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento indica que el sujeto responde a la composición de la invención. Una vez que se determina la capacidad de respuesta de un sujeto, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, por ejemplo, una composición que comprende el compuesto 44 o sus sales farmacéuticamente aceptables, y uno o más agentes terapéuticos. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición.
Como se usa en este documento, el término "capacidad de respuesta" es intercambiable con los términos "eficaz", "sensible" y "sensibilidad", y significa que un sujeto muestra respuestas terapéuticas cuando se le administra una composición de la invención, por ejemplo, las células tumorales o los tejidos tumorales del sujeto experimentan apoptosis y/o necrosis, y/o muestran un crecimiento, división o proliferación reducidos. Este término también significa que un sujeto tendrá o tiene una mayor probabilidad, con respecto a la población en general, de mostrar respuestas terapéuticas cuando se le administra una composición de la invención, por ejemplo, las células tumorales o los tejidos tumorales del sujeto sufren apoptosis y/o necrosis y/o muestran un crecimiento, división o proliferación reducidos.
Por "muestra" significa cualquier muestra biológica derivada del sujeto, que incluye, pero no se limita a, células, muestras de tejidos, fluidos corporales (que incluyen, pero no se limitan a, moco, sangre, plasma, suero, orina, saliva y semen), células tumorales y tejidos tumorales. Preferiblemente, la muestra se selecciona de médula ósea, células sanguíneas periféricas, sangre, plasma y suero. Las muestras pueden ser proporcionadas por el sujeto bajo tratamiento o prueba. Alternativamente, el médico puede obtener muestras según la práctica habitual en la técnica.
Como se usa en este documento, el término "trastorno de proliferación celular" se refiere a afecciones en las que el crecimiento no regulado o anormal, o ambos, de células puede conducir al desarrollo de una afección o enfermedad no deseada, que puede ser cancerosa o no. Los trastornos proliferativos celulares de ejemplo de la invención abarcan una variedad de afecciones en las que se desregula la división celular. El trastorno de proliferación celular de ejemplo incluye, pero no se limita a, neoplasias, tumores benignos, tumores malignos, afecciones precancerosas, tumores in situ, tumores encapsulados, tumores metastásicos, tumores líquidos, tumores sólidos, tumores inmunológicos, tumores hematológicos, cánceres, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas y células que se dividen rápidamente. El término "célula que se divide rápidamente", como se usa en este documento, se define como cualquier célula que se divide a una velocidad que excede o es mayor de lo que se espera u observa entre las células vecinas o yuxtapuestas dentro del mismo tejido. Un trastorno de proliferación celular incluye un precáncer o una afección precancerosa. Un trastorno de proliferación celular incluye el cáncer. Preferiblemente, los métodos proporcionados en este documento se usan para tratar o aliviar un síntoma de cáncer. El término "cáncer" incluye tumores sólidos, así como tumores hematológicos y/o neoplasias malignas. Una "célula de precáncer" o "célula precancerosa" es una célula que manifiesta un trastorno de proliferación celular que es un precáncer o afección precancerosa. Una "célula precancerosa" o "célula cancerosa" es una célula que manifiesta un trastorno de proliferación celular que es un cáncer. Se puede usar cualquier medio de medición reproducible para identificar células cancerosas o células precancerosas. Las células cancerosas o las células precancerosas se pueden identificar mediante tipificación histológica o clasificación de una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de biopsia). Las células cancerosas o las células precancerosas se pueden identificar mediante el uso de marcadores moleculares apropiados.
Un cáncer que se va a tratar puede evaluarse mediante citometría de ADN, citometría de flujo o citometría de imagen. Un cáncer que se va a tratar puede tipificarse como que tiene 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de células en la etapa de síntesis de la división celular (por ejemplo, en fase S de división celular). Un cáncer que se va a tratar puede tipificarse como que tiene una fracción de fase baja o una fracción de fase S alta.
Como se usa en este documento, una "célula normal" es una célula que no puede clasificarse como parte de un "trastorno de proliferación celular". Una célula normal carece de un crecimiento anormal o no regulado, o de ambos, que pueden conducir al desarrollo de una condición o enfermedad no deseada. Preferiblemente, una célula normal posee mecanismos de control de punto de control del ciclo celular que funcionan normalmente.
Como se usa en este documento, "poner en contacto una célula" se refiere a una afección en la que un compuesto u otra composición de materia está en contacto directo con una célula, o está lo suficientemente cerca para inducir un efecto biológico deseado en una célula.
Como se usa en este documento, "compuesto candidato" se refiere a un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, que se ha probado o se probará en uno o más ensayos biológicos in vitro o in vivo, en orden para determinar si es probable que ese compuesto provoque una respuesta biológica o médica deseada en una célula, tejido, sistema, animal o humano que está siendo buscado por un investigador o médico. Un compuesto candidato es un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento del cáncer. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular. Los ensayos biológicos in vitro o in vivo pueden incluir, pero no se limitan a, ensayos de actividad enzimática, ensayos de cambio de movilidad electroforética, ensayos de genes indicadores, ensayos de viabilidad celular in vitro y los ensayos descritos en este documento.
Como se usa en este documento, "tratamiento" o "tratar" describe el manejo y cuidado de un paciente con el propósito de combatir una enfermedad, condición o trastorno e incluye la administración de un compuesto de la presente invención, o un sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para aliviar los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno, o para eliminar la enfermedad, afección o trastorno.
También se puede usar una composición de la presente descripción, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, para prevenir una enfermedad, afección o trastorno. Como se usa en este documento, "que previene" o "prevenir" describe reducir o eliminar la aparición de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección o trastorno
Como se usa en este documento, el término "aliviar" pretende describir un procedimiento mediante el cual se reduce la gravedad de un signo o síntoma de un trastorno. Es importante destacar que un signo o síntoma se puede aliviar sin eliminarlo. En una realización preferida, la administración de composiciones farmacéuticas de la invención conduce a la eliminación de un signo o síntoma, sin embargo, no se requiere eliminación. Se espera que las dosificaciones eficaces disminuyan la gravedad de un signo o síntoma. Por ejemplo, un signo o síntoma de un trastorno tal como el cáncer, que puede ocurrir en múltiples ubicaciones, se alivia si la gravedad del cáncer disminuye en al menos una de las múltiples ubicaciones.
Como se usa en este documento, el término "gravedad" pretende describir el potencial del cáncer para transformarse de un estado precanceroso o benigno en un estado maligno. Alternativamente, o además, la gravedad pretende describir un estadio del cáncer, por ejemplo, según el sistema TNM (aceptado por the International Union Against Cancer (UICC) y the American Joint Committee on Cancer (AJCC)) o por otros métodos reconocidos en la técnica. El estadio del cáncer se refiere a la extensión o gravedad del cáncer, en base a factores tales como la ubicación del tumor primario, el tamaño del tumor, la cantidad de tumores y la afectación de los ganglios linfáticos (diseminación del cáncer a los ganglios linfáticos). Alternativamente, o además, se pretende que la gravedad describa el grado del tumor mediante métodos reconocidos en la técnica (véase, National Cancer Institute, www.cancer.gov). El grado del tumor es un sistema que se usa para clasificar las células cancerosas en términos de qué tan anormales se ven bajo un microscopio y qué tan rápido es probable que el tumor crezca y se disemine. Se consideran muchos factores al determinar el grado del tumor, incluida la estructura y el patrón de crecimiento de las células. Los factores específicos que se usan para determinar el grado del tumor varían con cada tipo de cáncer. La gravedad también describe un grado histológico, también llamado diferenciación, que se refiere a cuánto se parecen las células tumorales a las células normales del mismo tipo de tejido (véase, National Cancer Institute, www.cancer.gov). Adicionalmente, la gravedad describe un grado nuclear, que se refiere al tamaño y la forma del núcleo de las células tumorales y al porcentaje de células tumorales que se están dividiendo (véase, National Cancer Institute, www.cancer.gov).
En otro aspecto de la invención, la gravedad describe el grado en el que un tumor ha secretado factores de crecimiento, ha degradado la matriz extracelular, se ha vascularizado, ha perdido adhesión a los tejidos yuxtapuestos o ha hecho metástasis. Además, la gravedad describe el número de ubicaciones a los que ha hecho metástasis un tumor primario. Finalmente, la gravedad incluye la dificultad de tratar tumores de diversos tipos y ubicaciones. Por ejemplo, los tumores inoperables, aquellos cánceres que tienen mayor acceso a múltiples sistemas corporales (tumores hematológicos e inmunológicos), y aquellos que son más resistentes a los tratamientos tradicionales se consideran más graves. En estas situaciones, prolongar la esperanza de vida del sujeto y/o reducir el dolor, disminuir la proporción de células cancerosas o restringir las células a un sistema, y mejorar el estadio del cáncer/grado tumoral/grado histológico/grado nuclear se considera aliviar un signo o síntoma del cáncer.
Como se usa en este documento, el término "síntoma" se define como una indicación de enfermedad, dolencia, lesión o que algo no está bien en el cuerpo. La persona que experimenta el síntoma siente o advierte los síntomas, pero es posible que otras personas no los noten fácilmente. Otros se definen como profesionales no sanitarios.
Como se usa en este documento, el término "signo" también se define como una indicación de que algo no está bien en el cuerpo. Pero los signos se definen como cosas que pueden ser vistas por un médico, enfermero u otro profesional de la salud.
El cáncer es un grupo de enfermedades que pueden causar casi cualquier signo o síntoma. Los signos y síntomas dependerán de dónde se encuentre el cáncer, el tamaño del cáncer y cuánto afecta a los órganos o estructuras cercanos. Si un cáncer se propaga (hace metástasis), los síntomas pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una reducción del tamaño de un tumor. Una reducción en el tamaño de un tumor también puede denominarse "regresión tumoral". Preferiblemente, después del tratamiento, el tamaño del tumor se reduce en un 5 % o más con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, el tamaño del tumor se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 20 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; incluso más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 % o más. El tamaño de un tumor se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un tumor se puede medir como el diámetro del tumor.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una reducción del volumen del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, el volumen del tumor se reduce en un 5 % o más con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, el volumen del tumor se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 20 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; incluso más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 % o más. El volumen tumoral se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible.
El tratamiento del cáncer da como resultado una disminución del número de tumores. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de tumores se reduce en un 5 % o más con respecto al número antes del tratamiento; más preferiblemente, el número de tumores se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 20 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; incluso más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 %. El número de tumores se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. El número de tumores se puede medir contando los tumores visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferiblemente, el aumento especificado es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución del número de lesiones metastásicas en otros tejidos u órganos distantes del sitio del tumor primario. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 5 % o más con respecto al número antes del tratamiento; más preferiblemente, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 20 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; incluso más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 %. El número de lesiones metastásicas se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. El número de lesiones metastásicas se puede medir contando las lesiones metastásicas visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferiblemente, el aumento especificado es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, o 50x.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que solo recibe el portador. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia aumenta en más de 30 días; más preferiblemente, por más de 60 días; más preferiblemente, por más de 90 días; y lo más preferiblemente, por más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población se puede medir por cualquier medio reproducible. Se puede medir un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También se puede medir un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos no tratados. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia aumenta en más de 30 días; más preferiblemente, por más de 60 días; más preferiblemente, por más de 90 días; y lo más preferiblemente, por más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población se puede medir por cualquier medio reproducible. Se puede medir un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También se puede medir un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia aumenta en más de 30 días; más preferiblemente, por más de 60 días; más preferiblemente, por más de 90 días; y lo más preferiblemente, por más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población se puede medir por cualquier medio reproducible. Se puede medir un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También se puede medir un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución de la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que solo recibe portador. El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución de la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población no tratada. El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferiblemente, la tasa de mortalidad se reduce en más del 2 %; más preferiblemente, en más del 5 %; más preferiblemente, en más del 10 %; y lo más preferiblemente, en más del 25 %. Una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados se puede medir por cualquier medio reproducible. Puede medirse una disminución en la tasa de mortalidad de una población, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También se puede medir una disminución en la tasa de mortalidad de una población, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo después de completar una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución de la tasa de crecimiento tumoral. Preferiblemente, después del tratamiento, la tasa de crecimiento del tumor se reduce en al menos un 5 % con respecto al número antes del tratamiento; más preferiblemente, la tasa de crecimiento tumoral se reduce en al menos un 10 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 20 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 30 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 40 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; incluso más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, reducido en al menos un 75 %. La tasa de crecimiento tumoral se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. La tasa de crecimiento del tumor se puede medir según un cambio en el diámetro del tumor por unidad de tiempo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en el recrecimiento del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, el recrecimiento del tumor es menos del 5 %; más preferiblemente, el recrecimiento del tumor es menos del 10 %; más preferiblemente, menos del 20 %; más preferiblemente, menos del 30 %; más preferiblemente, menos del 40 %; más preferiblemente, menos del 50 %; incluso más preferiblemente, menos del 50 %; y lo más preferiblemente, menos del 75 %. El recrecimiento del tumor se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. El recrecimiento del tumor se mide, por ejemplo, midiendo un aumento en el diámetro de un tumor después de una contracción del tumor anterior que siguió al tratamiento. Una disminución en el recrecimiento tumoral está indicada por la falta de reaparición de los tumores después de que se ha detenido el tratamiento.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la tasa de proliferación celular. Preferiblemente, después del tratamiento, la tasa de proliferación celular se reduce en al menos un 5 %; más preferiblemente, en al menos un 10 %; más preferiblemente, en al menos un 20 %; más preferiblemente, en al menos un 30 %; más preferiblemente, en al menos un 40 %; más preferiblemente, en al menos un 50 %; incluso más preferiblemente, en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, en al menos un 75 %. La tasa de proliferación celular se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. La tasa de proliferación celular se mide, por ejemplo, midiendo el número de células en división en una muestra de tejido por unidad de tiempo.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la proporción de células en proliferación. Preferiblemente, después del tratamiento, la proporción de células en proliferación se reduce en al menos un 5 %; más preferiblemente, en al menos un 10 %; más preferiblemente, en al menos un 20 %; más preferiblemente, en al menos un 30 %; más preferiblemente, en al menos un 40 %; más preferiblemente, en al menos un 50 %; incluso más preferiblemente, en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, en al menos un 75 %. La proporción de células en proliferación se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. Preferiblemente, la proporción de células en proliferación se mide, por ejemplo, cuantificando el número de células que se dividen con respecto al número de células que no se dividen en una muestra de tejido. La proporción de células en proliferación puede ser equivalente al índice mitótico.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede resultar en una disminución del tamaño de un área o zona de proliferación celular. Preferiblemente, después del tratamiento, el tamaño de un área o zona de proliferación celular se reduce en al menos un 5 % con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, reducido en al menos un 10 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 20 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 30 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 40 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; incluso más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, reducido en al menos un 75 %. El tamaño de un área o zona de proliferación celular se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un área o zona de proliferación celular se puede medir como un diámetro o ancho de un área o zona de proliferación celular.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede resultar en una disminución en el número o proporción de células que tienen una apariencia o morfología anormales. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de células que tienen una morfología anormal se reduce en al menos un 5 % con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, reducido en al menos un 10 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 20 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 30 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 40 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; incluso más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, reducido en al menos un 75 %. Una apariencia o morfología celular anormal se puede medir mediante cualquier medio de medición reproducible. Se puede medir una morfología celular anormal mediante microscopía, por ejemplo, usando un microscopio de cultivo de tejidos invertido. Una morfología celular anormal puede adoptar la forma de pleomorfismo nuclear.
Como se usa en este documento, el término "selectivamente" significa que tiende a ocurrir con una frecuencia más alta en una población que en otra población. Las poblaciones comparadas pueden ser poblaciones de células. Preferiblemente, un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, actúa selectivamente sobre una célula cancerosa o precancerosa pero no sobre una célula normal. Preferiblemente, un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, actúa selectivamente para modular una diana molecular (por ejemplo, una proteína diana metiltransferasa) pero no modula significativamente otra diana molecular (por ejemplo, una proteína no diana metiltransferasa). La presente descripción también proporciona un método para inhibir selectivamente la actividad de una enzima, tal como una proteína metiltransferasa. Preferiblemente, un evento ocurre selectivamente en la población A con respecto a la población B si ocurre con más de dos veces más frecuencia en la población A en comparación con la población B. Un evento ocurre selectivamente si ocurre con más de cinco veces más frecuentemente en la población A. Un evento ocurre selectivamente si ocurre con una frecuencia diez veces más frecuentemente en la población A; más preferiblemente, más de cincuenta veces; incluso más preferiblemente, más de 100 veces; y lo más preferiblemente, más de 1000 veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Por ejemplo, se diría que la muerte celular ocurre selectivamente en las células cancerosas si ocurre con más del doble de frecuencia en las células cancerosas en comparación con las células normales.
Una composición descrita en este documento, por ejemplo, el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más otros agentes terapéuticos pueden modular la actividad de una diana molecular (por ejemplo, una proteína diana metiltransferasa). Modular se refiere a estimular o inhibir la actividad de una diana molecular. Preferiblemente, un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular al menos 2 veces con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones pero careciendo únicamente de la presencia de dicho compuesto. Más preferiblemente, un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones pero sin solo la presencia de dicho compuesto. La actividad de una diana molecular se puede medir por cualquier medio reproducible. La actividad de una diana molecular se puede medir in vitro o in vivo. Por ejemplo, la actividad de una diana molecular se puede medir in vitro mediante un ensayo de actividad enzimática o un ensayo de unión de ADN, o la actividad de una diana molecular se puede medir in vivo ensayando la expresión de un gen indicador.
Una composición descrita en este documento no modula significativamente la actividad de una diana molecular si la adición del compuesto no estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en más del 10 % con respecto a la actividad de la diana molecular bajo las mismas condiciones pero careciendo únicamente de la presencia de dicho compuesto.
Como se usa en este documento, el término "selectivo de isoenzimas" significa inhibición o estimulación preferencial de una primera isoforma de una enzima en comparación con una segunda isoforma de una enzima (por ejemplo, inhibición o estimulación preferencial de una proteína metiltransferasa isoenzima alfa en comparación con una proteína metiltransferasa isoenzima beta). Preferiblemente, un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, demuestra un diferencial mínimo de cuatro veces, preferiblemente un diferencial de diez veces, más preferiblemente un diferencial de cincuenta veces, en la dosificación requerida para lograr un efecto biológico. Preferiblemente, un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, demuestra este diferencial en todo el intervalo de inhibición, y el diferencial se ejemplifica en la IC50, esto es, una inhibición del 50 %, para una diana molecular de interés.
La administración de una composición descrita en este documento a una célula o un sujeto que la necesite puede resultar en la modulación (esto es, estimulación o inhibición) de una actividad de una proteína metiltransferasa de interés.
La administración de un compuesto descrito en este documento, por ejemplo, una composición que comprende el compuesto 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más otros agentes terapéuticos, tales como prednisona, a una célula o un sujeto que lo necesite da como resultado modulación (esto es, estimulación o inhibición) de una actividad de una diana intracelular (por ejemplo, sustrato). Se pueden modular varias dianas intracelulares con los compuestos descritos en este documento, que incluyen, pero no se limitan a, la proteína metiltransferasa.
Activar se refiere a colocar una composición de materia (por ejemplo, proteína o ácido nucleico) en un estado apropiado para llevar a cabo una función biológica deseada. Una composición de materia capaz de activarse también tiene un estado inactivo. Una composición activada de materia puede tener una función biológica inhibidora o estimulante, o ambas. La elevación se refiere a un aumento en la actividad biológica deseada de una composición de materia (por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico). La elevación puede ocurrir a través de un aumento en la concentración de una composición de materia.
Como se usa en este documento, "una ruta de punto de control del ciclo celular" se refiere a una ruta bioquímica que está involucrada en la modulación de un punto de control del ciclo celular. Una ruta de punto de control del ciclo celular puede tener efectos estimulantes o inhibidores, o ambos, en una o más funciones que comprenden un punto de control del ciclo celular. Una ruta de punto de control del ciclo celular está compuesta por al menos dos composiciones de materia, preferiblemente proteínas, las cuales contribuyen a la modulación de un punto de control del ciclo celular. Una ruta de punto de control del ciclo celular se puede activar mediante una activación de uno o más miembros de la ruta de punto de control del ciclo celular. Preferiblemente, una ruta de punto de control del ciclo celular es una ruta de señalización bioquímica.
Como se usa en este documento, "regulador del punto de control del ciclo celular" se refiere a una composición de materia que puede funcionar, al menos en parte, en la modulación de un punto de control del ciclo celular. Un regulador del punto de control del ciclo celular puede tener efectos estimulantes o inhibidores, o ambos, en una o más funciones que comprenden un punto de control del ciclo celular. Un regulador de punto de control del ciclo celular puede ser una proteína o no.
El tratamiento del cáncer o un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado la muerte celular y, preferiblemente, la muerte celular da como resultado una disminución de al menos un 10 % en el número de células en una población. Más preferiblemente, la muerte celular significa una disminución de al menos un 20 %; más preferiblemente, una disminución de al menos un 30 %; más preferiblemente, una disminución de al menos un 40 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 50 %; lo más preferiblemente, una disminución de al menos el 75 %. El número de células en una población se puede medir por cualquier medio reproducible. Se pueden medir un número células de una población mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), microscopía de inmunofluorescencia y microscopía óptica. Los métodos para medir la muerte celular se muestran en Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100(5): 2674-8, 2003. En un aspecto, la muerte celular se produce por apoptosis.
Preferiblemente, una cantidad eficaz de una composición descrita en este documento, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, no es significativamente citotóxica para las células normales. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto no es significativamente citotóxica para las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente eficaz no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto no afecta significativamente a la viabilidad de las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente eficaz no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. En un aspecto, la muerte celular se produce por apoptosis.
Poner en contacto una célula con una composición descrita en este documento, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, puede inducir o activar la muerte celular de forma selectiva en células cancerosas. La administración a un sujeto que lo necesite de un compuesto descrito en este documento, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, puede inducir o activar la muerte celular de forma selectiva en células cancerosas. Poner en contacto una célula con una composición de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, puede inducir la muerte celular de forma selectiva en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular. Preferiblemente, administrar a un sujeto que lo necesite una composición de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, induce la muerte celular selectivamente en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular.
Se describe en este documento un método para tratar o prevenir el cáncer mediante la administración de una composición, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que lo necesite, cuando se administre la composición de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, da como resultado uno o más de los siguientes: prevención de la proliferación de células cancerosas mediante la acumulación de células en una o más fases del ciclo celular (por ejemplo, G1, G1/S, G2/M), o inducción de la senescencia celular, o promoción de la diferenciación de células tumorales; promoción de la muerte celular en células cancerosas mediante citotoxicidad, necrosis o apoptosis, sin una cantidad significativa de muerte celular en células normales, actividad antitumoral en animales con un índice terapéutico de al menos 2. Como se usa en este documento, "índice terapéutico" es la dosis máxima tolerada dividida por la dosis eficaz.
Un experto en la técnica puede consultar textos de referencia generales para obtener descripciones detalladas de técnicas conocidas discutidas en este documento o técnicas equivalentes. Estos textos incluyen Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al, The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, PA, 18th edition (1990). Por supuesto, también se puede hacer referencia a estos textos al realizar o usar un aspecto de la invención.
Ejemplo 1 (referencia)
Actividad antitumoral sinérgica de inhibidores de EZH2 y glucocorticoides
El compuesto 44 se sintetizó como se describe en la en la Patente de los Estados unidos No. 8,410,088.
Se observó una sinergia espectacular cuando el compuesto 44 (Comp. 44) se combinó solo con el agonista del receptor de glucocorticoides (GRag) prednisolona de CHOP o con otro GRag, tales como dexametasona. Cuando se combina con CHOP, los efectos antiproliferativos del compuesto 44 se potenciaron enormemente y la mayor parte de esta sinergia se puede atribuir al componente GRag de CHOP, prednisolona (el metabolito activo de prednisona). Sorprendentemente, la combinación del compuesto 44 y prednisolona amplía la gama de células que son sensibles a la inhibición de EZH2, desde las que solo portan mutantes hasta todas las células GCB NHL.
Se pretrataron dos líneas celulares mutantes EZH2, WSU-DLCL2 y SU-DHL10, con el compuesto 44 durante 4 días y luego se cotrataron con la combinación del compuesto 44 más componentes CHOP individuales durante 3 días adicionales (modelo 4+3). La mafosfamida (un análogo de la ciclofosfamida), la doxorrubicina y la vincristina mostraron por sí mismas una inhibición del crecimiento dependiente de la concentración en las líneas celulares mutantes. Por consiguiente, se obtuvieron índices de combinación (CI, calculados usando el software Calcusyn) para estos fármacos en combinación con el compuesto 44. Sin embargo, estas líneas celulares no mostraron sensibilidad a la prednisolona (el metabolito activo de la prednisona) por sí misma. De este modo, en este caso no se pudo determinar un CI y, en cambio, se calculó una mejora de la potencia en base al cambio en la IC50 del compuesto 44 observado con una curva de concentración-respuesta de prednisolona.
La combinación del compuesto 44 y mafosfamida condujo a un beneficio general de combinación de aditivos en ambas líneas celulares mutantes EZH2 (Figura 1C, 1F). En las células WSU-DLCL2, la combinación del compuesto 44 y doxorrubicina actuó de forma sinérgica en el modelo 4+3 (Figura 1A), mientras que esta combinación fue aditiva en las células SU-DHL10 (Figura 1D). La combinación del compuesto 44 y vincristina también demostró aditividad en ambas líneas celulares mutantes EZH2 (Figura 1B, 1E). Cuando las células WSU-DLCL2 se trataron con la combinación de prednisolona y el compuesto 44, se observó un cambio de 9 veces hacia una mayor potencia para el compuesto 44. El tratamiento con un GRag diferente, dexametasona, dio como resultado un cambio aún mayor en la IC50 del compuesto 44 de 17-veces (Figura 2A, 2B). Se observó una tendencia similar en el cambio de potencia para el compuesto 44 en las células SUDHL10 (Figura 2C, 2D).
Se investigó si el efecto de combinación del compuesto 44 y CHOP podría hacer que las líneas celulares de linfoma WT EZH2 fueran sensibles al Compuesto 44. Dado que el tratamiento con el compuesto 44 solo no induce la inhibición del crecimiento en las líneas de linfoma EZH2 WT, se calcularon los cambios en la potencia en base a las curvas de concentración-respuesta de los componentes CHOP individuales. De los cuatro componentes de CHOP probados, solo la combinación de GRag y el compuesto 44 condujo a un cambio de potencia en una línea celular de linterna WT GCB.
Si el efecto de combinación del compuesto 44 y CHOP podría convertir EZH2 mutante y líneas celulares de tipo salvaje, a continuación, se investigaron las líneas celulares WSU-DLCL2 EZH2 mutante (Figura 3A, 3B) y DOHH2 EZH2 de tipo salvaje (Figura 3C, 3D) linterna GCB sensibles al compuesto 44. El tratamiento de las células WSU-DLCL2 con una combinación de prednisolona y el compuesto 44 provocó una mejora de la actividad del compuesto 44 (figura 3A), con una reducción máxima de 24 veces en la IC50 del compuesto 44. El tratamiento con un GRag diferente, dexametasona, dio como resultado una reducción incluso mayor de 30 veces en la IC50 del compuesto 44 (Figura 3B). A concentraciones biológicamente relevantes de 1 |iM para prednisolona y 100 nM para dexametasona, las mejoras de potencia fueron de 7 y 15 veces, respectivamente. El compuesto 44 no mostró ningún efecto antiproliferativo como agente único en las células DOHH2 EZH2 de tipo salvaje (figura 3C, 3D), por lo tanto se midió el cambio de potencia de prednisolona o dexametasona. Curiosamente, cuando se probó el compuesto 44 en una línea celular de linfoma g Cb de tipo salvaje (DOHH2), solo el componente GRag de CHOP demostró una potencia mejorada en presencia del compuesto 44 (figura 3C, 3D). La potencia de prednisolona o dexametasona aumentó con la adición del compuesto 44 en células DOHH2 (figura 3C, 3D).
Dado que solo la combinación de GRag y EZH2i indujo efectos antiproliferativos dramáticamente mejorados, en comparación con cualquier agente único, en líneas celulares de linfoma EZH2 WT y GCB mutante, se determinó si la duración del tratamiento y/o la secuencia de adición de los compuestos afectaba la sensibilidad. El panel de la línea celular también se amplió para incluir la línea celular EZH2 WT, EZH2 mutante, sensible al compuesto 44 y EZH2 mutante, insensible al compuesto 44 (informada previamente por McCabe et al, y datos internos no publicados). En el modelo 4+3 anterior, el cambio de potencia se basó ya sea en la exposición al compuesto 44 (en líneas celulares sensibles a EZH2 Y646 (también conocido como Y641)) o prednisolona (en líneas celulares EZH2 WT). Para este conjunto de experimentos, se usó el cambio de IC50 del compuesto 44 a una concentración fija de prednisolona para determinar el beneficio de la combinación en líneas celulares tratadas con el modelo 4+3, el cotratamiento de 4 días o 7 días, o con prednisolona de 4 días antes del tratamiento más 3 días del cotratamiento. Cuando las líneas celulares sensibles al compuesto 44, EZH2 mutante se cotrataron durante 4 días, se observó una IC5030-60 veces más baja del compuesto 44, lo que demuestra tendencias similares a las del programa de tratamiento 4+3 (Tabla 1). Se observaron resultados similares con el cotratamiento de 7 días y el modelo 4+3 (Tabla 1). En las líneas celulares EZH2 WT GCB, a pesar de que no produjeron IC50 del compuesto 44 medible después de 4 días, ambas líneas celulares exhibieron una proliferación disminuida y una IC50 del compuesto 44 medible después de 4 días de cotratamiento con prednisolona (Tabla 1). Las células EZH2 WT GCB también respondieron al modelo 4+3 y/o programas de cotratamiento de 7 días (Tabla 1). Sorprendentemente, las líneas celulares insensibles al compuesto 44, EZH2 mutante, que tampoco exhiben IC50 del compuesto 44 medible después de 4 días de tratamiento, demostraron una disminución de la proliferación con 4 días de cotratamiento, con una respuesta aún mayor a la combinación con el programa de tratamiento 4+3, así como con el cotratamiento de 7 días (Tabla 1). Solo una de las líneas celulares demostró un beneficio de combinación cuando las células se pretrataron con prednisolona, luego se cotrataron con el compuesto 44 y prednisolona, lo que sugiere que el orden de adición del fármaco es importante para el efecto de sinergia (Tabla 1).
Tabla 1. La combinación del compuesto 44/GRag aumenta la sensibilidad de EZH2I en líneas celulares EZH2 Y646 (Y641) y supera la Insensibilidad de EZH2I en líneas celulares resistentes a EZH2I
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Para evaluar los posibles mecanismos responsables de los beneficios de combinación observados del compuesto 44 y GRag en estas líneas celulares, se determinó si el tratamiento con prednisolona afectaba la metilación y acetilación global de H3K27 después de un tratamiento de cuatro días ya sea solo o en combinación con el compuesto 44 en células WSU-DLCL2, OCI-LY19y RL(dos experimentos independientes). La prednisolona como agente único no tuvo efecto sobre los niveles de H3K27Me3 en células WSU-DLCL2 o RL, pero sí aumentó los niveles de H3K27Me3 a dosis más altas en células OCI-LY19 (Figura 9A). Debido a la alta sensibilidad de las células OCI-LY19 a la prednisolona, a diferencia de las líneas mutantes EZH2 insensibles a la prednisolona, fue necesaria una dosis más baja de prednisolona para el tratamiento de las células OCY-LY19. La inclusión de prednisolona no alteró la IC50 del compuesto 44 para la inhibición de H3K27Me3 en ninguna línea celular (Figura 9A). Asimismo, los niveles globales de acetilación de H3K27 no se vieron afectados por la prednisolona sola o la combinación del compuesto 44 y prednisolona (figuras 9B, 9C y 9D).
Habiendo encontrado que los niveles globales de acetilación o trimetilación de H3K27 no estaban afectados, se estudió la regulación transcripcional de las rutas de señalización de GR. Las células WSU-DLCL2, SU-DHL10, RL, SU-DHL4, OCI-LY19 y DOHH2 se trataron con una concentración única del compuesto 44, prednisolona o la combinación durante 4 días, y la expresión génica se analizó mediante un conjunto de p Cr de señalización de glucocorticoides (Tabla 4). En general, un mayor número de genes se regularon negativamente tanto con prednisolona como con tratamientos de combinación en todas las líneas celulares, lo que apunta a un papel de Gr como activador y represor de la expresión génica. Aquí, se centró la función de activación de GR y se describieron 3 genes que tienen una regulación positiva sinérgica en el panel de líneas celulares con tratamiento de combinación. La sestrina (SESN1), un supresor del tumor putativo que inhibe la señalización de mTOR (ref), se identificó como un gen comúnmente regulado positivamente entre las 4 líneas celulares mutantes EZH2 de una manera sinérgica con el tratamiento de combinación, pero no en las líneas celulares EZH2 WT (Figura 8A y Tabla 2). La expresión de TNF fue regulada positivamente de forma sinérgica sólo en una de las dos líneas celulares insensibles al compuesto 44 mutante EZH2 (SUDHL4), con una tendencia para la línea celular insensible al compuesto 44 (RL) del otro mutante EZH2, que muestra el mismo resultado (Figura 8B y Tabla 2). La expresión de TSC22D3/GILZ, aunque está regulada positivamente en todas las líneas celulares por prednisolona, sólo se potencia de forma sinérgica mediante el tratamiento de combinación en células sensibles al compuesto 44 mutante EZH2 (Figura 8C y Tabla 2).
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Los niveles de expresión del receptor de glucocorticoides, normalizados para los controles de DMSO, para las líneas celulares EZH2 de tipo salvaje (esto es, OCI-LY19, DOHH2), sensible a EZH2 Y646 (esto es, WSU-DLCL2, SUDHL10) y resistente a EZH2 Y646 (esto es, RL, SUDHL4) se midieron después del tratamiento con el compuesto 44 indicado, prednisolona, la combinación del compuesto 44 y prednisolona, o DMSO (2 réplicas biológicas, véanse los materiales de métodos y sección 5 de métodos para detalles). Como muestran los resultados, los niveles de expresión de los receptores de glucocorticoides no se vieron comúnmente afectados entre las líneas celulares de la combinación. (Figura 19). Los valores de cambio múltiplo se cuantificaron usando el método AACt y ACTB, B2M y GAPDH como genes de referencia.
A continuación, se examinaron los efectos de omitir uno o todos los componentes de la quimioterapia del régimen CHOP en dos estudios de xenoinjerto adicionales. Se trataron ratones portadores de xenoinjerto SUDHL10 (EZH2 Y646F) con el compuesto 44, COP (quimioterapia sin el componente de doxorrubicina) o su combinación durante 28 días (Figura 20A). Se compararon los pesos medios de los tumores de 8/16 ratones, sacrificados el día 28, demostrando las diferencias significativas en el peso del tumor entre los grupos (* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001; prueba t de dos colas). Los ratones a los que se les administró la dosis máxima tolerada del compuesto 44 o con la combinación del compuesto 44/COP mostraron una supervivencia del 100 % el día 60, el grupo de combinación mostró los pesos de tumor del día 28 más pequeños, estadísticamente diferentes (p < 0.05) de todos los demás grupos de tratamiento, incluyendo la dosis máxima tolerada para el compuesto 44 (Figura 20A).
Luego, investigamos la dosificación de combinación del compuesto 44 con prednisona durante 28 días en el modelo de xenoinjerto SUDHL10 con dos dosis del compuesto 44 o prednisona en dos programas diferentes (pred-1 = prednisona a 0.15 mg/kg BID x 5 en días 1-5 y 22-26; pred-2 = prednisona 0.15 mg/kg BID x 28). Como sugieren los datos in vitro, la dosificación de prednisona sola no indujo ningún efecto antitumoral significativo (Figura 20B). De acuerdo con el estudio anterior, la dosificación de 125 mg/kg BID (dos veces al día) del compuesto 44 generó solo una respuesta parcial, pero la codosificación del compuesto 44 con prednisona a 0.15 mg/kg BID, pero no con el régimen de prednisona de 2 ciclos, indujo la máxima regresión posible lograda con dosis más altas del compuesto 44 solo. El peso corporal de todos los ratones dosificados se muestra en la figura 20C.
Se trataron ratones portadores de xenoinjerto SUDHL10 (EZH2 Y646F) con el compuesto 44, COP (quimioterapia sin el componente de doxorrubicina), o su combinación durante 28 días, como se especifica en los métodos. Se comparan los pesos medios de los tumores desde 8/16 ratones, sacrificados el día 28, lo que demuestra las diferencias significativas en el peso del tumor entre los grupos (* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001; prueba t de dos colas). B) Se trataron ratones portadores de xenoinjerto SUDHL10 (EZH2 Y646F) durante 28 días con dos dosis del compuesto 44 o prednisona en dos programas diferentes (pred-1 = prednisona a 0.15 mg/kg BID x 5 los días 1-5 y 22- 26; pred-2 = prednisona 0.15 mg/kg BID x 28). Ambos compuestos también se administraron en combinación como se indica. Los volúmenes tumorales medios ± SEM (n = 10) se representan en el panel superior. Todos los grupos a los que se administró EPZ-6438 mostraron una reducción estadísticamente significativa en el crecimiento tumoral (p <0.01 al menos, frente al vehículo o el agente único de prednisona en ambos programas; ANOVA de medidas repetidas, prueba posterior de Dunnett), mientras que el agente único de prednisona no provocó ningún efecto antitumoral en comparación con el vehículo.
Tabla 3. Resumen de combinaciones con el compuesto 44
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Finalmente, se evaluó la inhibición del crecimiento tumoral en 3 modelos diferentes de xenoinjerto de linterna mutante EZH2. Se codosificaron ratones SCID o desnudos que portaban xenoinjertos de linterna subcutáneo con el compuesto 44 y quimioterapia, ya sea CHOP o COP (CHOP sin doxorrubicina), y se compararon con tratamientos de agente único. En ratones portadores de xenoinjerto WSU-DLCL2, la inhibición del crecimiento tumoral se logró con todas las dosis y programas del compuesto 44 empleados, y fue mejor que la quimioterapia CHOP sola (Figura 7A). Además, la terapia de combinación del compuesto 44 y CHOP indujo una respuesta antitumoral robusta y una inhibición del crecimiento tumoral significativamente (p < 0.001) mejor (93 %) que con cualquier agente único solo (45 % y 71 %, para CHOP y el compuesto 44, respectivamente). Todos los tratamientos únicos fueron tolerados; hubo una pérdida de peso corporal menor (11.3 %) en el grupo combinado compuesto 44/CHOP después del primer ciclo, después del cual los ratones se recuperaron antes del siguiente ciclo de tratamiento.
En un modelo de xenoinjerto SU-DHL6, no se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral con CHOP solo o con el compuesto 44 (Figura 7B, panel superior), en contraste con los resultados publicados previamente por Beguelin et al., usando el inhibidor de EZH2 GSK503. Sorprendentemente, la combinación del compuesto 44/CHOP dio como resultado la regresión del tumor. Cuando se detuvo la dosificación el día 28 y se observaron los ratones hasta el día 60 el retraso en el crecimiento del tumor, esta combinación dio como resultado una supervivencia libre de tumor en el 58 % de los ratones (Figura 7B, panel inferior).
El componente de doxorrubicina de CHOP tiene un límite de dosificación acumulativo de por vida de <550 mg/m2 debido a su cardiotoxicidad. Por lo tanto, se investigó el beneficio de combinación de un régimen del compuesto 44/quimioterapia que eliminó este componente. En un tercer estudio, se trataron ratones portadores de xenoinjerto SU-DHL10 durante 28 días con ya sea dosis crecientes del compuesto 44 (BID), régimen de quimioterapia sin doxorrubicina (COP) o una combinación de COP y Compuesto 44. Se observó inhibición del crecimiento tumoral en todas las dosis del compuesto 44 así como con COP (Figura 7C, panel superior). Los tratamientos de combinación de 266 mg/kg, 532 mg/kg y COP/Compuesto 44 dieron como resultado regresiones que fueron estadísticamente diferentes del vehículo (p> 0.001) según lo evaluado por ANOVA de medidas repetidas y la prueba posterior de Dunnett, con el grupo de combinación del compuesto 44/COP demostrando la mejor respuesta general. Después de la dosificación de 28 días, un subgrupo de ratones con la carga tumoral más pequeña (8 ratones por grupo) se mantuvo vivo sin más dosis para un punto final de retraso del crecimiento del tumor. Hubo un claro beneficio de retraso del crecimiento tumoral dependiente de la dosis para los ratones tratados con el compuesto 44, mientras que los tumores tratados con COP progresaron más rápidamente que los tratados con el compuesto 44 (Figura 7C, panel central). Mientras que los ratones tratados con la dosis máxima tolerada del compuesto 44 o con la combinación del compuesto 44/COP mostraron una supervivencia del 100 % el día 60, el grupo de combinación mostró los pesos de tumores terminales más pequeños, estadísticamente diferentes (p> 0.05) de todos los demás grupos de tratamiento, incluyendo la dosis máxima tolerada para el compuesto 44 (Figura 7C, panel inferior).
Los tratamientos estándar para la NHL de células B son regímenes de quimioterapia combinados compuestos de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona. Si bien se pueden lograr tasas de respuesta completa de 40 a 50 %, una proporción sustancial de pacientes recae, con tasas de supervivencia general a 3 años de solo aproximadamente 30 %. Los linfomas recidivantes pueden presentar resistencia a una amplia gama de fármacos contra el cáncer, lo que plantea un desafío severo en la clínica para el manejo de estas neoplasias malignas agresivas. La adquisición de resistencia a los fármacos en el linfoma se debe en parte a la heterogeneidad genética y la inestabilidad de las células tumorales. El tratamiento exitoso del NHL quimiorresistente requerirá, de este modo, combinaciones racionales de fármacos dirigidos a múltiples vías específicas para los diferentes subtipos de NHL de células B. Por ejemplo, en los linfomas del tipo de células B activadas, la activación constitutiva de la ruta NFkB se ha implicado en la resistencia a la terapia, y varias terapias dirigidas novedosas se han mostrado prometedoras en este subtipo.
Los efectores epigénicos, tales como el policomb, también se han implicado en la quimiorresistencia de las células cancerosas. EZH2, la subunidad catalítica del complejo represivo policomb 2 (PRC2) es un impulsor oncogénico crítico en los linfomas de células B derivados del centro germinal. Estas neoplasias malignas de células B más primitivas, especialmente variantes que expresan mutantes EZH2 con actividad catalítica alterada, requieren EZH2 para la proliferación y supervivencia. Los resultados de los estudios preclínicos pronostican una gran promesa para los inhibidores catalíticos de EZH2 para el tratamiento de cánceres definidos genéticamente, y los inhibidores de EZH2 también pueden mitigar la resistencia a la quimioterapia. Los datos presentados en este documento muestran que el compuesto 44, un inhibidor de EZH2 en estadio clínico, muestra diversos grados de beneficio de combinación, que van desde la aditividad hasta la sinergia, con los componentes de CHOP. Estos efectos de combinación se encontraron específicamente en linfomas del origen del centro germinal y, en el caso de ciclofosfamida, doxorrubicina y vincristina, se restringieron a células portadoras de mutantes EZH2. También se encontró una sinergia significativa en la destrucción de células de linfoma cuando el compuesto 44 se codosificó con CHOP in vivo. Esto fue especialmente cierto en el modelo de xenoinjerto SU-DHL6 en el que ningún agente único mostró ninguna actividad antitumoral significativa, pero la combinación indujo regresiones duraderas en > 50 % de los ratones. Esto reitera la importancia potencial del EZH2 hiperactivo en la quimiorresistencia del linfoma mutante EZH2. Entre los componentes de CHOP, las combinaciones del compuesto 44 con prednisona indujeron la actividad antiproliferativa más fuerte y esta combinación también podría hacer que las líneas celulares de linfoma GCB insensibles fueran sensibles a la inhibición de EZH2, independientemente del estado mutacional de EZH2. Además, este beneficio de combinación es más evidente cuando el compuesto 44 y la prednisolona se dosifican ya sea juntos o de una manera específica de secuencia; de este modo, el cebado de las células con un inhibidor de EZH2, seguido de un tratamiento con agonistas de GR, resultó ser particularmente eficaz. Este sorprendente hallazgo tiene implicaciones potencialmente importantes para la aplicación de inhibidores de EZH2 en la clínica. Primero, los GRag ampliamente usados se coadministran con frecuencia con fármacos contra el cáncer para prevenir reacciones alérgicas inducidas por fármacos y para aliviar el dolor, las náuseas y la emesis, y son fundamentales en el tratamiento de las neoplasias hematopoyéticas debido a su capacidad para inducir la apoptosis en estos cánceres. En comparación con los otros componentes de CHOP, GRag induce los efectos adversos menos graves. Además, la oportunidad de eliminar la doxorrubicina del régimen CHOP mientras se conserva un beneficio de combinación con el compuesto 44, como sugieren los datos del modelo de xenoinjerto SU-DHL10, podría evitar a los pacientes los efectos secundarios cardiotóxicos limitantes de la dosis de la doxorrubicina. Por último, los estudios preclínicos han demostrado que los inhibidores de EZH2 como agente único inducen una destrucción celular significativa solo en los linfomas portadores de mutantes EZH2, que representan una fracción (20 %) de los pacientes con linfoma de GCB con una gran necesidad clínica insatisfecha. Los resultados en este documento demuestran que las combinaciones de inhibidores de GRag/EZH2 pueden tener utilidad clínica en todos los linfomas de células B derivados de centros germinales.
Las moléculas de GR unidas a glucocorticoides se mueven hacia el núcleo y pueden actuar como ya sea activador o represor de la transcripción, dependiendo del entorno celular. Se ha sugerido que GR muestrea constantemente el nucleosoma para una interacción productiva, y el propósito de las enzimas modificadoras de la cromatina es proporcionar acceso regulado de gR, sus cofactores y la maquinaria de transcripción basal al ADN. Otros estudios muestran que GR a menudo se une a regiones preexistentes de cromatina abierta, y la arquitectura de cromatina en un tipo de célula dado está organizada de manera que GR puede actuar de una manera específica de tejido. La accesibilidad a los sitios de unión de GR se puede potenciar aún más mediante la remodelación de la cromatina dependiente de ATP, y el complejo SWI/SNF juega un papel clave en esta actividad. Sin desear estar sujeto a una teoría en particular o un mecanismo de acción específico, es concebible que la represión aberrante de la cromatina, inducida por la hipertrimetilación de H3K27 mediada por EZH2, pueda bloquear algunos de los sitios de unión de GR accesibles de otro modo, interfiriendo con la inducción o represión génica normal mediada por GR. De hecho, todas las líneas celulares de linfoma mutante EZH2 son insensibles al tratamiento con GRag, mientras que la muerte celular dependiente de la concentración se observa en las células EZH2 WT. La observación de que el pretratamiento con prednisolona, seguido del tratamiento con el compuesto 44, no puede inducir sinergia en casi todas las líneas celulares probadas, apunta hacia la posibilidad de que la remodelación de la cromatina inducida por el inhibidor de EZH2 sea la etapa limitante de la velocidad para la acción potenciada de GR. Además, se sabe que PRC2 antagoniza con la función SWI/SNF y la regulación negativa de las subunidades centrales del complejo SWI/SNF-SMARCA4, ARID1A e INI1 se ha asociado con la resistencia a la prednisolona en la leucemia linfoblástica aguda de células T. Dado que la relación entre la pérdida de INI1 y la sobreactivación de EZH2 se ha establecido en los tumores rabdoides, se investigó, si los niveles globales de proteína INI1 aumentarían en diversas células de linfoma expuestas al compuesto 44 o prednisolona, lo que podría permitir una mayor accesibilidad de GR a sus sitios de unión después de un aumento de la función SWI/SNF.
Las matrices de expresión génica de la ruta GR revelaron expresión génica tanto aumentada como disminuida después del tratamiento de varias células de linfoma GCB (tanto EZH2 WT como mutantes) con el compuesto 44, prednisolona o su combinación, lo que confirma la función dual de GR. El único gen que fue regulado positivamente de forma sinérgica con la combinación en todas las células de linfoma mutante EZH2 fue SESN1, un supresor de tumores TP53 con funciones en la respuesta celular al daño del ADN y al estrés oxidativo. Las sestrinas inhiben el crecimiento celular mediante la activación de la proteína quinasa activada por AMP, lo que resulta en la inhibición de la ruta mTOR. Por consiguiente, la inhibición de la ruta de mTOR mediada por SESN1 puede ser un mecanismo importante para reintroducir la sensibilidad de GRag en células de linfoma mutante EZH2 después del tratamiento con el compuesto 44.
Por el contrario, el tratamiento de combinación de GRag/Compuesto 44 también podría inducir la muerte celular en aquellas líneas celulares de linfoma mutante EZH2 que se han informado como refractarias al tratamiento con inhibidor de EZH2 (RL, SU-DHL4). También se indujo SESN1 con tratamiento de combinación en esas líneas celulares, pero se observó una regulación positiva sinérgica adicional de TNF, una potente citoquina inflamatoria, específicamente en células RL y SU-DHL4. Esta observación parece sorprendente, ya que el TNF y los glucocorticoides suelen actuar de forma antagónica. El TNF, a través de su receptor TNFR-1, puede inducir apoptosis, pero también tiene la capacidad de transducir señales de supervivencia, principalmente a través de la ruta NFkB. De este modo, es posible que el aumento de la expresión de TNF, inducida por la combinación del compuesto 44/prednisolona, pueda cambiar la acción del TNF hacia la apoptosis en el contexto de la represión del agonista GR de la transcripción mediada por NFkB. Sin embargo, no está claro por qué este mecanismo daría como resultado la muerte celular sinérgica en células mutantes EZH2 insensibles al compuesto 44. La importancia potencial de la represión aberrante de los reguladores negativos de la ruta NFkB en la resistencia a GRag y el papel potencial de la mediación de EZH2 que está respaldada además por nuestra observación de que GILZ se regula positivamente de forma sinérgica en 2 de 6 líneas celulares con la combinación.
Métodos
Ensayo de rendimiento medio
Se sembraron células de linfoma en matraces (50,000 células/mL para WSU-DLCL2 y DOHH2, 10,000 células/mL para SU-DHL10 y 100,000 células/mL para Toledo) y se pretrataron con 7 dosis del compuesto 44 o DMSO durante 4 días o 6 días para los ensayos de Toledo. A continuación, las células se volvieron a dividir en 50,000 células/mL para WSU-DLCL2 y DOHH2 o 30,000 células/mL para SU-DHL-10 y se cotrataron con el compuesto 44 y el compuesto de interés usando el dispensador digital HP D300 (Tecan). Ambos fármacos se diluyeron en serie dos veces y se combinaron en una matriz con proporciones constantes en diagonal a través de la placa con un contenido final de DMSO de 0.11 % (v/v). Después de 3 días de cotratamiento (5 días para los ensayos de Toledo), se midió la viabilidad celular a través del contenido de ATP usando CellTiter-Glo® (Promega) y se detectó la luminiscencia usando un lector de microplacas SpectraMax M5 (Molecular Devices).
La cuantificación de la sinergia se realiza usando el método de Chou-Talalay para la combinación de fármacos (Ref 1). La ecuación del índice de combinación (CI) ofrece una definición cuantitativa de aditividad (CI = 1), sinergismo (CI <1) y antagonismo (CI> 1). Esta ecuación usó valores de efecto fraccionario (Fa) de una proporción constante de combinación de fármacos para determinar los valores de CI. El gráfico resultante (Fa-CI) muestra los valores de CI resultantes entre corchetes por intervalos de confianza del 95 %. Estos gráficos Fa-CI se generan usando el software Calcusyn para Windows (Ref 2). Los valores de CI < 1 con líneas de intervalo de confianza también por debajo de 1 indican sinergismo estadísticamente significativo.
Para las combinaciones de fármacos en las que sólo un fármaco mostró más del 50 % de inhibición, se determinaron los cambios de potencia. Las respuestas a las dosis se representaron gráficamente usando Graphpad Prism y se interpolaron concentraciones inhibidoras del 50 % o del 60 % a partir de las curvas de respuesta a la dosis. Los cambios de potencia se consideraron significativos cuando los intervalos de confianza para las respuestas a las dosis no se superpusieron.
Líneas celulares, compuestos y esquema de tratamiento.
WSU-DLCL2, SU-DHL10, RL, SU-DHL4, OCI-LY19 y DOHH2 se describieron previamente (NatChemBio 2012). Para los estudios de combinación, se usó una versión modificada de nuestro ensayo de proliferación en células en suspensión, como se describió anteriormente (Daigle et al, Cancel Cell, Vol. 20, 1. Pg. 53-65 (2011); Daigle et al, Blood, 121, 13, 2533-2541 (2013)). Brevemente, el día 0, las células se sembraron por triplicado en placas de 96 pozos a densidades iniciales para asegurar un crecimiento en fase logarítmica lineal durante 4 días. Las células se trataron con una curva de dosis del compuesto 44 (comenzando con una dosis máxima de 1 |iM), una dosis única de prednisolona (número de catálogo y fabricante) a una concentración 10 veces menor que la IC50 de 4 días del fármaco, o una combinación del compuesto 44 y prednisolona. El día 4, las células se contaron usando el reactivo Viacount en el citómetro de flujo guava easyCyte, y el número de células viables se usó para volver a sembrar las células en las densidades originales durante 3 días adicionales. Las células que se pretrataron con el compuesto 44 recibieron el compuesto 44 continuo solo o la combinación del compuesto 44 y prednisolona (dosis constante); las células pretratadas con prednisolona recibieron prednisolona continua o la combinación de prednisolona y compuesto 44; las células cotratadas durante 4 días continuaron recibiendo cotratamiento durante 7 días.
Estudios de xenoinjerto
Todos los procedimientos relacionados con la manipulación, el cuidado y el tratamiento de los animales en este estudio se realizaron según las pautas aprobadas por the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of CRL Piedmont and Shanghai ChemPartner siguiendo la guía de the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Las células WSU-DLCL2, SU-DHL6 o SU-DHL10 se recolectaron durante el crecimiento de la fase media logarítmica y se volvieron a suspender en PBS con MatrigelTM al 50 % (BD Biosciences) y se inyectaron en ratones inmunodeprimidos. Cada ratón recibió 1 x 107 células (0.2 mL de suspensión de células) por vía subcutánea en el flanco derecho, y una vez que los tumores alcanzaron un tamaño predeterminado, se dosificó a los ratones por vía oral con diferentes dosis del compuesto 44 en diversos programas durante hasta 28 días y/o CHOP/COP en los siguientes programas: se administró ciclofosfamida por vía intraperitoneal (i.p.), y se administraron cada una de ellas doxorrubicina y vincristina mediante inyecciones en bolo en la vena de la cola (i.v.); cada una se administró una vez al día los días 1 y 8 en el estudio SU-DHL6, y los días 1 y 22 en los estudios WSU-DLCL2 y SU-DHL10. Se administró prednisona p.o. en dos ciclos de cinco dosis diarias, comenzando los días 1 y 8 ((qd x 5) x 2, Días 1, 8) en el estudio SU-DHL6, y los días 1 y 22 ((qd x 5) x 2, Días 1,22) en los estudios WSU-DLCL2 y SU-DHL10. Cada dosis se administró en un volumen de 0.2 mL/20 g de ratón (10 mL/kg) y se ajustó al último peso registrado de animales únicos. Las medidas de los tumores y los pesos corporales se recogieron dos veces por semana durante 28 días para todos los estudios. Para determinar el retraso del crecimiento tumoral en los estudios SU-DHL10 y SU-DHL6, cada animal de prueba fue sacrificado cuando su neoplasia alcanzó el volumen final de 2000 mm3 o en el último día del estudio (día 60), lo que ocurriera primero.
PCR cuantitativa
Se trataron las células WSU-DLCL2, SU-DHL10, RL, SU-DHL4, OCI-LY19 y DOHH2 en paralelo con DMSO, 1 |iM del compuesto 44 (SU-DHL10 tratado con 100 nM del compuesto 44), una dosis de prednisolona a una concentración 10 veces menor que la IC50 de 4 días, o la combinación de fármacos durante 4 días. Se recogieron las células y se extrajo el ARNm total de las pellas celulares usando el Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen; 74134). Para el conjunto de PCR de señalización de glucocorticoides RT2 (Qiagen; PAHS-154ZE-4), el ADNc se preparó con el kit RT2 First Strand (Qiagen; 330401). El conjunto de TA-PCR se realizó usando ViiA 7 Real-Time p Cr Systems [Applied Biosystems (AB)] con RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix (Qiagen; 330521). La expresión génica se normalizó a la matriz B2M y el cambio múltiplo en comparación con DMSO se calculó usando el método AACt. Para validar los datos del conjunto, la qPCR basada en la sonda TaqMan se llevó a cabo usando TaqMan Fast Advanced Master Mix (AB; 4444964) y conjuntos de cebadores/sondas TaqMan para sestrina (AB; Hs00902787_ml) y TNF (AB; Hs01113624_ml). El cambio múltiplo se calculó como anteriormente, normalizándose a RPLPO (AB; 4333761F).
ELISA
Se extrajeron histonas de muestras tumorales como se describió anteriormente. Las histonas se prepararon en concentraciones equivalentes en solución reguladora de recubrimiento (PBS 0.05 % BSA) produciendo 0.5 ng/|il de muestra, y se agregaron 100 |il de muestra o estándar por duplicado a 2 placas ELISA de 96 pozos (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Las placas se sellaron y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron 3x con 300 |il/pozo de PBST (PBS Tween 20 al 0.05 %; 10X PBST, KPL # 51-14-02) en un lavador de placas Bio Tek. Las placas se bloquearon con 300 |il/pozo de diluyente (PBS BSA al 2 % Tween 20 al 0.05 %), se incubaron a TA durante 2 horas y se lavaron 3x con PBST. Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyente. Se agregaron a cada placa 100 |il/pozo de anti-H3K27me3 (CST #9733, solución madre de glicerol al 50 % 1: 1,000) o H3 antitotal (Abcam ab1791, glicerol al 50 % 1:10,000). Las placas se incubaron durante 90 min a TA y se lavaron 3x con PBST. Se agregaron 100 |il/pozo de anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) 1:2,000 a la placa H3K27Me3 y 1:6,000 a la placa H3 y se incubaron durante 90 min a TA. Las placas se lavaron 4X con PBST. Para la detección, se agregaron 100 |il/pozo de sustrato TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) y las placas se incubaron en la oscuridad a TA durante 5 min. La reacción se detuvo con 100 |il/pozo en H2SO4. La absorbancia a 450 nm se leyó en un lector de microplacas SpectaMax M5.
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Ejemplo 2 (referencia)
El compuesto 44 y everolimus actúan de forma sinérgica para mejorar la detención del ciclo celular en la fase G1 en células WSU-DLCL2 EZH2 mutantes, la apoptosis en células EZH2 SU-DH-L5 de tipo salvaje
En la figura 11 paneles B y E, cada punto representa la media del porcentaje de células cerradas en la apoptosis temprana y tardía (Anexina-V positiva, media /- S.D., n = 3). En los paneles C y F, los puntos en la curva de progreso representan el porcentaje medio de células cerradas por contenido de ADN (Pi positivo, media /- S.D., n=2). En el panel A, las células WSU-DLCL2 se trataron en una proporción constante de 400:1 con una combinación del compuesto 44 y everolimus. Se demostró que la combinación induce una sinergia muy fuerte con valores de CI de 0.34-0.003. En el panel B). Niveles de apoptosis evaluados en células WSU-DLCL2 tratadas con el compuesto 44 (500 nM), everolimus (5 nM) o en combinación a las mismas concentraciones. No se observó ningún aumento de la apoptosis en las células WSU-DLCL2. En el panel C, se observó un aumento significativo en la fase G1 del ciclo celular después del cotratamiento en comparación con el compuesto 44 solo. En el panel D, las células SU-DHL-5 se trataron en combinación con una proporción constante de 4000:3. Se demostró que la combinación induce una sinergia muy fuerte con valores de CI de 0.135-0.008. En el panel E, A se midió un aumento significativo en las células positivas a anexina después del cotratamiento (compuesto 44500 nM, everolimus 0.75 nM), en comparación con el compuesto 44 solo (p <0.0001). En el panel F, A se observó un aumento significativo en la fase sub-G1 del ciclo celular después del cotratamiento.
Ejemplo 3
El compuesto 44 y el ibrutinib actúan de forma sinérgica para mejorar la apoptosis en células WSU-DLCL2 mutantes EZH2 y células EZH2 SU-DH-L5 de tipo salvaje
En la figura 12 paneles B y E, cada punto representa la media del porcentaje de células cerradas en la apoptosis temprana y tardía (Anexina-V positiva, media /- S.D., n = 3). En los paneles C y F, los puntos en la curva de progreso representan el porcentaje medio de células cerradas por contenido de ADN (PI positivo, media /- S.D., n = 2). En el panel A, las células WSU-DLCL2 se trataron en una proporción constante de 4:5 con una combinación del compuesto 44 e Ibrutinib. La combinación de estos agentes demuestra una fuerte sinergia con valores de CI entre 0.39 y 0.14. En el panel B, los niveles de apoptosis evaluados en células WSU-DLCL2 tratadas con el compuesto 44 (500 nM), ibrutinib (625 nM) o en combinación. Esta combinación reveló un aumento sinérgico dependiente del tiempo en la apoptosis en las células WSU-DLCL2. En el panel C, el análisis del ciclo celular reveló un aumento dependiente del tiempo en el porcentaje de células WSU-DLCL2 en la fase G1 con un fuerte aumento después del tratamiento de combinación. En el panel D, se trataron células SU-DHL-5 en una proporción constante de 1:5 del compuesto 44:Ibrutinib. La combinación indujo una sinergia muy fuerte con valores de CI de 0.222-0.002. En el panel E, aumento sinérgico y dependiente del tiempo de la tinción positiva anexina de las células SUDHL-5 después del cotratamiento con el compuesto 44 (1000 nM) e ibrutinib (2500 nM) en comparación con el compuesto 44 solo (p < 0.0001). En el panel F, el análisis del ciclo celular de las células SU-DHL-5 tratadas en combinación reveló un aumento en las células de la población sub-G1 después del cotratamiento en comparación con cada agente solo.
Ejemplo 4
El compuesto 44 y MK-2206 actúan de forma sinérgica para potenciar la apoptosis en células WSU-DLCL2 mutantes EZH2 y células EZH2 de tipo salvaje (SU-DH-L5 y OCI-LY-19).
En la figura 13 panel A, se trataron células WSU-DLCL2 en una proporción constante de 4: 1 con una combinación del compuesto 44 y MK-2206. El gráfico Fa-CI demuestra una sinergia muy fuerte con los valores de CI entre 0.77­ 0.005. En el panel B, aumento dependiente del tiempo en el porcentaje de células WSU-DLCL2 positivas a anexina cuando se tratan conjuntamente con el compuesto 44 (2000 nM) y m K-2206 (400 nM). En el panel C, el análisis del ciclo celular reveló un aumento en el porcentaje de células WSU-DLCL2 en la fase G1 con un fuerte aumento después de un día de cotratamiento en comparación con el compuesto 44 solo (p <0.0001). En el panel D, las células SU-DHL-5 se trataron en una proporción constante de 2:1 para el compuesto 44 y MK-2206. La combinación indujo una sinergia muy fuerte con valores de CI de 0.276-0.001. En el panel E, la evaluación del nivel de apoptosis en SU-DHL-5 reveló un aumento en células positivas anexina después de 24 horas de cotratamiento (Compuesto 44 500 nM, MK-2206 250 nM) en comparación con el compuesto 44 solo (p <0.0001). En el panel F, el análisis del ciclo celular de las células SU-DHL-5 tratadas en combinación mostró un aumento en el porcentaje de células en la población sub-G1 en comparación con el tratamiento de los agentes individualmente. En el panel G, se observó una fuerte sinergia en las células OCI-LY19 mediante el tratamiento con una combinación del compuesto 44 y MK-2206 con un valor 1/a de 71.4. En el panel H, se mostró un aumento de la apoptosis dependiente del tiempo cuando se trataron células OCI-LY19 con la combinación (Compuesto 44 1000 nM, MK-22062500 nM) en comparación con el compuesto 44 solo (p < 0.0001). En el panel I, el análisis del ciclo celular de las células OCI-LY19 tratadas con la combinación reveló un aumento dependiente del tiempo de las células en la fase sub-G1 del ciclo celular (p < 0.0001).
Ejemplo 5
Regulación de genes diana con combinaciones del compuesto 44 e inhibidores de la ruta BCR
En la figura 14 panel A, regulación negativa de EGR1 (40 veces) y FOS (4 veces) con una combinación del compuesto 44 e ibrutinib en comparación con agentes únicos en células WSU-DLCL2. En el panel B, la regulación positiva de AICDA (3 veces) y TCL1A (5 veces) con una combinación del compuesto 44 y MK-2206 se compara con agentes individuales en células WSU-DLCL2. En el panel C, la regulación positiva de GJA1 (3 veces) con una combinación del compuesto 44 e ibrutinib se compara con agentes individuales en células SU-DHL-5. Los valores para el análisis estadístico son una media de duplicados o triplicados /- SD. prueba t, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, **** P<0.0001
Ejemplo 6
Interacciones sinérgicas entre la inhibición de EZH2 y la modulación de la ruta de señalización de BCR, inhibición de BCL2 y agonismo de GR en líneas de células B del centro germinal.
Se descubrieron diversas combinaciones sinérgicas en este estudio con jugadores clave en las vías de señalización implicadas en la biología de DLBCL (véase la figura 15). Los inhibidores que se dirigen a los nodos de la ruta del receptor de células B, tales como los de la cascada de señalización PI3K/Akt/mTOR, MEK1/2 en la cascada MAPK, SYK y BTK mostraron una sinergia muy fuerte cuando se combinaron con EZP-6438 extendiendo el impacto de la inhibición de EZH2 desde líneas celulares GCB que portan EZH2 mutantes hasta aquellas del subtipo de tipo salvaje. Los inhibidores de la familia de proteínas BCL-2, obatoclax, navitoclax y ABT-199 mostraron actividad antiproliferativa sinérgica en combinación con el compuesto 44. Los agonistas del receptor de glucorticoides, prednisolona y dexametasona muestran una mejora dramática de la inhibición de EZH2 en líneas celulares mutantes y sensibilizan al tipo salvaje a EZH2i. Rituximab, el anticuerpo combinado con quimioterápicos en R-CHOP se dirige a cd-20 para provocar efectos antiproliferativos mejorados in vitro en líneas celulares mutantes.
Ejemplo 7 (referencia)
El compuesto 44 y everolimus actúan de forma sinérgica para disminuir las poblaciones de células en las fases S y G2/M de las células WSU-DLCL2 mutantes y las fases G1, S y G2/M en las células SU-DHL-5 de tipo salvaje.
Las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 (datos no mostrados) se pretrataron con el compuesto 44 (500 nM para WSU y SU-DHL-5) seguido de un cotratamiento con una combinación del compuesto 44 y Everolimus (WSU: 5 nM, SU-DHL-5: 0.75 nM). En la figura 16 panel A, no se observa ningún cambio en la fase sub-G1 del ciclo celular cuando las células WSU-DLCL2 se tratan con agentes únicos o en combinación. En los paneles B y C, se observa una disminución sinérgica dependiente del tiempo de las células en la fase S y la fase G2/M del ciclo celular, respectivamente, cuando las células WSU-DLCL2 se trataron con la combinación. En los paneles D, E y F, se observa una disminución sinérgica de células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, 48 horas después del cotratamiento en células SU-DHL-5.
Ejemplo 8
El compuesto 44 y el ibrutinib actúan de forma sinérgica para disminuir las poblaciones de células en las fases G1, S y G2/M de células WSU-DLCL2 mutantes y células SU-DHL-5 de tipo salvaje.
Las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 (datos no mostrados) se pretrataron con el compuesto 44 (WSU: 500 nM, SU-DHL-5: 1000nM) seguido de un cotratamiento con una combinación del compuesto 44 e ibrutinib (WSU: 625 nM, SU-DHL-5: 2500 nM). En la figura 17 paneles A, B y C, se observa una disminución sinérgica de células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, 24 horas después del cotratamiento de las células WSU-DLCL2 en comparación con el compuesto 44 o ibrutinib como agentes únicos. En los paneles D, E y F, se observa una disminución sinérgica dependiente del tiempo de las células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, después del cotratamiento de las células SU-DHL-5 en comparación con el compuesto 44 o ibrutinib como agentes únicos.
Ejemplo 9
El compuesto 44 y MK-2206 actúan de forma sinérgica para disminuir las poblaciones de células en las fases G1, S y G2/M de células WSU-DLCL2 mutantes y células SU-DHL-5 y OCI-LY19 de tipo salvaje.
Las células WSU-DLCL2, SU-DHL-5 y OCI-LY19 se pretrataron con el compuesto 44 (2000 nM, 500 nM y 1000 nM respectivamente) seguido de un cotratamiento con una combinación del compuesto 44 y MK-2206 (400 nM, 250 nM y 2500 nM respectivamente). En la figura 18 panel A, se observa una disminución sinérgica dependiente del tiempo en la fase G1 del ciclo celular cuando las células WSU-DLCL2 se trataron en combinación con MK-2206. En los paneles B y C, se observa una disminución sinérgica de células en las fases S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, cuando las células WSU-DLCL2 se trataron en combinación. En los paneles D, E y F, se observa una disminución sinérgica de las células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, 48 horas después del cotratamiento de las células SU-DHL-5 en comparación con agentes individuales. En los paneles G, H e I, se observa una disminución sinérgica dependiente del tiempo de las células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular, respectivamente, cuando las células OCI-LY19 se trataron en combinación.
En la tabla 5 se muestran los resultados de los estudios de proliferación que usan la combinación del compuesto 44 con SOC individual, u otros agentes seleccionados contra las líneas celulares de DLBCL de tipo salvaje que llevan el mutante EZH2.
Figure imgf000050_0001
La potencia de los compuestos usados en los ensayos de proliferación y los intervalos de dosis usados en cada línea celular se muestran en la tabla 6.
Figure imgf000052_0001
Incorporación por referencia
La citación de publicaciones y documentos de patente no pretende ser una admisión de que alguno sea un estado de la técnica pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o la fecha de los mismos. Habiendo sido descrita ahora la invención por medio de una descripción escrita, los expertos en la técnica reconocerán que la invención se puede practicar en una variedad de realizaciones y que la descripción anterior y los ejemplos a continuación tienen el propósito de ilustrar y no limitar las reivindicaciones que siguen.
Equivalentes
La invención se puede realizar en otras formas específicas sin apartarse de las características esenciales de la misma. Por lo tanto, las realizaciones anteriores se deben considerar en todos los aspectos ilustrativas más que limitantes de la invención descrita en este documento. De este modo, el alcance de la invención está indicado por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000054_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de cuidado estándar en un método de tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita, en el que el agente de cuidado estándar es un inhibidor de BCR seleccionado de MK-2206, idelalisib, trametinib, tamatinib e ibrutinib.
2. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según la reivindicación 1, en el que el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación que comprende el compuesto 44 y el agente de cuidado estándar.
3. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según la reivindicación 1, en el que el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el compuesto 44 y el agente de cuidado estándar.
4. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el cáncer es un linfoma no Hodgkin.
5. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según la reivindicación 4, en el que el linfoma no Hodgkin es linfoma DLBCL (linfoma difuso de células B grandes) o GCB (similar a células B del centro germinal).
6. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según la reivindicación 5, en el que el linfoma es un linfoma mutante EZH2, en el que opcionalmente el linfoma mutante EZH2 tiene una mutación Y646, A682, o A692.
7. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que:
(a) el cáncer es un cáncer EZH2 de tipo salvaje; o
(b) el cáncer se caracteriza por un aumento de la trimetilación en H3K27; o
(c) el cáncer es un cáncer resistente o refractario al inhibidor de EZH2; o
(d) el paciente ha regulado positivamente la expresión de Sestrina, TNF o GILZ.
8. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el método comprende administrar el compuesto 44 y el agente de cuidado estándar simultáneamente.
9. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el método comprende administrar el compuesto 44 y el agente de cuidado estándar de forma secuencial.
10. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el método comprende administrar el compuesto 44 antes de la administración del agente de cuidado estándar.
11. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de cuidado estándar para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que al menos un gen está regulado positivamente en el paciente.
12. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44, para su uso según la reivindicación 11, en la que: (a) el gen se selecciona del grupo que consiste en Sestrina, TNF y GILZ; o
(b) el gen es un gen diana de glucocorticoides; o
(c) la regulación positiva de un gen se usa para determinar o ajustar la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 de la reivindicación 1; o
(d) la regulación positiva de un gen se usa para determinar o ajustar la cantidad terapéuticamente eficaz del agente de cuidado estándar de la reivindicación 1.
13. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 44 para su uso según la reivindicación 1, en la que el paciente se selecciona en base al perfil de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en Sestrina, TNF y GILZ.
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