CN116019921A - 用于治疗癌症的组合疗法 - Google Patents

用于治疗癌症的组合疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN116019921A
CN116019921A CN202310008463.1A CN202310008463A CN116019921A CN 116019921 A CN116019921 A CN 116019921A CN 202310008463 A CN202310008463 A CN 202310008463A CN 116019921 A CN116019921 A CN 116019921A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
cells
ezh2
cancer
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310008463.1A
Other languages
English (en)
Inventor
海克·凯尔哈克
萨拉·K·克努森
凯文·W·孔茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epizyme Inc
Original Assignee
Epizyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epizyme Inc filed Critical Epizyme Inc
Publication of CN116019921A publication Critical patent/CN116019921A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A61K31/635—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide having a heterocyclic ring, e.g. sulfadiazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及包含人类组蛋白甲基转移酶EZH2的抑制剂和一种或多种其它治疗药剂、尤其是抗癌药剂例如强的松的组合物，并且涉及用于向对其有需要的受试者进行给药以治疗癌症的组合疗法方法。

Description

用于治疗癌症的组合疗法
本申请是2014年12月08日递交的申请号为201480071510.6，发明名称为“用于治疗癌症的组合疗法”的分案申请。
相关申请
本申请要求于2013年12月6日提交的美国临时申请号61/913,063、2014年1月31日提交的美国临时申请号61/934,388、和2014年5月13日提交的美国临时申请号61/922,881的优先权权益，将其各自的内容通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明涉及包括以下各项的组合物：人类组蛋白甲基转移酶EZH2的抑制剂、催化组蛋白H3(H3-K27)上赖氨酸27的一至三甲基化的PRC2复合体的催化亚基、以及一种或多种其他的治疗药剂，特别是抗癌药剂，并且涉及用于治疗癌症的组合疗法方法。
背景技术
组合疗法治疗癌症已变得更加常见，部分原因是由于通过多途径攻击疾病的已知优势。虽然在过去的几十年中已经确定了许多有效的组合疗法治疗，鉴于每年由癌症造成的持续大量的死亡，仍然对确定用于抗癌治疗的有效治疗方案存在持续的需要。
发明内容
本发明至少部分是基于这样的发现：EZH2抑制剂如化合物44(又名EPZ-6438、E7438)
Figure BDA0004036739770000011
组合各种药剂，包括目前的标准治疗，不管EZH2突变状态，在某些癌症的治疗中是非常有效的。在某一个实施例中，该癌症是淋巴瘤。在某一个实施例中，该癌症是生发中心B细胞(GCB)起源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在某一个实施例中，该淋巴瘤是EZH2突变淋巴瘤。在某一个实施例中，该淋巴瘤是EZH2非突变或EZH2野生型淋巴瘤。本发明也是基于这样的发现：EZH2抑制剂(如化合物44)和糖皮质激素受体激动剂(GRags)(如强的松、泼尼松龙或地塞米松)配合使用大大地提高癌症治疗效果。化合物44和泼尼松龙的组合延伸了对EZH2抑制敏感的细胞的范围，从仅仅带有突变的细胞延伸至所有GCB NHL细胞。
在一个方面，本发明涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的EZH2抑制剂和治疗有效量的标准治疗药剂。
在另一方面，本发明涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的包括EZH2抑制剂和标准治疗药剂的组合。
本发明的另一方面涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的包括EZH2抑制剂和标准治疗药剂的组合物。
在一些实施例中，EZH2突变淋巴瘤是Y646、A682、或A692突变。
在一些实施例中，标准治疗药剂是选自下组的一种或多种化合物，该组由以下各项组成：R-CHOP组分、BCL抑制剂和BCR抑制剂。
在一些实施例中，R-CHOP是CHOP、泼尼松龙或地塞米松的GRag组分。
在一些实施例中，R-CHOP是糖皮质激素受体激动剂。在某些实施例中，糖皮质激素受体激动剂是泼尼松龙或地塞米松。
在一些实施例中，阿霉素从R-CHOP中排除。
在一些实施例中，BCL抑制剂是纳威托克斯(navitoclax)、奥巴克拉或ABT-19。
在一些实施例中，BCR抑制剂是利妥昔单抗、AKT抑制剂MK-2206、艾代拉里斯(idelalisib)、曲美替尼(trametinib)、塔玛塔尼伯(tamatanib)、依维莫司(everolimus)、或依鲁替尼(ibrutinib)。
在一些实施例中，BCR抑制剂是PI3K/Akt/mTOR信号级联抑制剂。
在一些实施例中，BCR抑制剂是利妥昔单抗、MK-2206、艾代拉里斯、曲美替尼、塔玛塔尼伯、依维莫司、VELCADE、或依鲁替尼。
在一些实施例中，EZH2抑制剂和标准治疗药剂同时或依次给予。在其它实施例中，EZH2抑制剂在给予标准治疗药剂之前给予。
在一些实施例中，至少一个基因在患者中上调。在某些实施例中，被上调的基因是选自由瑟斯崔因(Sestrin)、TNF、和GILZ组成的组。在其它实施例中，被上调的基因是糖皮质激素靶基因。
在一些实施例中，基因的上调被用于决定或调整EZH2抑制剂和标准治疗药剂的治疗有效量。
在另一方面，本发明涉及一种筛选接受治疗的患者的方法，其中该患者是基于选自由瑟斯崔因、TNF、和GILZ组成的组的一个或多个基因的表达谱来筛选的。
在一个方面，本发明涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的EZH2抑制剂和治疗有效量的标准治疗药剂，其中所述患者具有上调的瑟斯崔因、TNF、和GILZ表达。
在一些实施例中，所述癌症EZH2抑制剂抗性或难治性癌症。
在一些实施例中，所述癌症的特征在于在H3K27上增加的三甲基化。
本发明的一个方面涉及EZH2抑制剂和GRag的组合逆转在EZH2抑制剂抗性或难治性突变的细胞，包括携带EZH2突变的细胞的不敏感性。
在某些实施例中，EZH2抑制剂是化合物44或其药学上可接受的盐或溶剂化物和一种或多种其它治疗药剂。
本发明的其他特征和优点从以下详细说明和权利要求书将是清楚的。
附图说明
图1A-1F是一系列Fa-CI曲线图，这些曲线图显示了CHOP组分和化合物44(Cpd 44)在突变体EZH2生发中心B细胞淋巴瘤细胞系中的组合益处。化合物44和阿霉素在WSU-DLCL2细胞中协同作用(图1A)，并且在SU-DHL-10细胞中产生累加效应(图1D)。使用马磷酰胺在WSU-DLCL2细胞(图1C)和SU-DHL-10细胞中(图1F)观察到组合益处。使用长春新碱在两个EZH2 Y646突变细胞系中：WSU-DLCL2细胞(图1B)和SU-DHL-10细胞中(图1E)也观察到组合益处。在WSU-DLCL2中，阿霉素的剂量范围是0.16-20nM，长春新碱是0.04-5nM，马磷酰胺是0.156-10μM，并且化合物44是15-1000nM。在SU-DHL-10细胞中，阿霉素的剂量范围是0.5-60nM，长春新碱是0.016-2nM，马磷酰胺是0.156-10μM，并且化合物44是1.56-100nM。根据预处理模型A处理细胞，并用该Calcusyn软件进行数据分析。
图2中的A-D是一系列曲线图，这些曲线图显示了糖皮质激素受体激动剂增强了EZH2突变体淋巴瘤系中化合物44(Cpd 44)的效力。当与糖皮质激素受体激动剂组合，化合物44的效力显著地增加了。根据预处理模型A添加泼尼松龙(图2中的A、C)或地塞米松(图2中的B、D)在2个EZH2 Y646F突变体DLBCL系中产生在化合物44的IC50的剂量依赖性转变。在两种细胞系中，泼尼松龙的剂量范围是15nM-1000nM，且地塞米松的剂量范围是1.5nM-100nM。化合物44的剂量范围在WSU-DLCL2细胞中是15-1000nM，且在SU-DHL-10细胞中是1.5-100nM。
图3A-3D是一系列剂量响应曲线图，这些曲线图显示了化合物44(Cpd 44)与泼尼松龙或地塞米松的组合分别在WSU-DLCL2 EZH2突变体(图3A、3B)和DOHH2 EZH2野生型(图3C、3D)GCB淋巴瘤细胞系中的益处。化合物44的剂量范围是15.6-1000nM，泼尼松龙的剂量范围是7.8-1000nM，地塞米松的剂量范围是0.8-100nM。(图3A和3B)。在EZH2突变体WSU-DLCL2细胞中使用泼尼松龙或地塞米松化合物44的效力增加了(图3C和3D)。化合物44在DOHH2 EZH2野生型细胞中作为单一药剂显示没有抗增生作用，因此测定了泼尼松龙或地塞米松的效力变化。在DOHH2细胞中加入化合物44使泼尼松龙或地塞米松的效力增加了。
图4是一个汇总表，该表显示化合物44(Cpd 44)/糖皮质激素受体激动剂组合克服了抵抗EZH2抑制剂的细胞系中的EZH2抑制剂(EZH2i)不敏感性。总的来说，泼尼松和化合物44的组合导致在所有测试的GCB细胞系中(不仅仅是EZH2i敏感细胞系)的敏感性更高。除了RL细胞，其中药剂加入的顺序是至关重要的，因为预温育泼尼松龙，接着加入化合物44是有无效的。
图5A和5B是两个曲线图，该图显示在EZH2突变体淋巴瘤细胞系中使用化合物44(Cpd 44)和其它靶向治疗的组合而观察到非常强的协同作用。当化合物44与BCL2抑制剂纳威托克斯(图5A)以及与mTOR抑制剂依维莫司(图5B)组合时观察到非常强的协同作用。纳威托克斯的剂量范围是0.16-10μM，依维莫司是0.04-5nM，且化合物44是31-2000nM。在预处理模型A中产生这些数据，且用Calcusyn软件分析数据。
图6是一个从各种药剂和/或药剂疗法与化合物44(Cpd 44)组合的结果的汇总表。在EZH2突变体淋巴瘤系中测试的所有药剂与化合物44实现了组合益处。糖皮质激素受体激动剂在EZH2 WT和突变体GCB淋巴瘤系中显示了组合益处。
图7A-7C是一系列曲线图，这些曲线图显示化合物44(Cpd 44)-CHOP组合在几个EZH2突变体淋巴瘤异种移植模型中显示出相比单一药剂增强的抗肿瘤活性。如在这些方法中指定的，使用化合物44、CHOP、或其组合处理WSU-DLCL2(EZH2 Y646F)异种移植物28天(图7A)。绘制了平均肿瘤体积+/-SEM图。150mg/kg TID和225mg/kg BID剂量的化合物44在肿瘤生长抑制中比单独运载体在统计学上更有意义(*p值<0.05)。相比单独使用任何单一的药剂，使用225mg/kgBID的化合物44加上CHOP处理导致更大的肿瘤消退(相对于运载体，***p值<0.001)。通过重复测量ANOVA计算统计。如在这些方法中指定的，使用化合物44、CHOP、或其组合处理SU-DHL6(EZH2 Y646N)异种移植物28天(图7B)。在顶部图中绘制了平均肿瘤体积+/-SEM图。在28天的处理期中，CHOP或单一药剂化合物44单独对肿瘤生长没有效果，但是使用225mg/kg BID化合物44加上CHOP处理导致肿瘤消退，同时服药停止32天后还保持肿瘤生长延迟(*p值<0.0001)。至60天的存活曲线(底部图)显示使用化合物44与CHOP的组合治疗动物出现的显著的肿瘤生长延迟(**p值<0.05)。使用双尾t检验进行统计。如在这些方法中指定的，使用化合物44、COP(没有阿霉素成分的SOC)、或其组合处理SUDHL-10(EZH2Y646F)异种移植物28天(图7C)。在顶部图中绘制了平均肿瘤体积+/-SEM图。在中部图绘制了在肿瘤生长延迟研究中直至60天的百分比存活图(注意：500mg/kg和250mg/kg+COP存活曲线重叠)。在底部图中比较了平均肿瘤重量，显示出组之间肿瘤重量显著的不同(*p值<0.05，**p值<0.01，****p值<0.0001)。
图8A-8C是图，这些图显示了当使用化合物44、泼尼松龙、化合物44和泼尼松龙的组合、或DMSO处理各种细胞系时，糖皮质激素靶向基因瑟斯崔因1(SESN1，图8A)、TNF(图8B)和GILZ(图8C)的表达水平的变化。如图8A-8C中显示，相比化合物44或泼尼松龙单独使用，共处理后观察到瑟斯崔因1、TNF、和GILZ的表达水平增加了。
图9A-9D是图，该图显示整体的H3K27乙酰化和三甲基化不受泼尼松龙或组合治疗的影响。使用增加剂量的泼尼松龙、化合物44(Cpd 44)、或组合化合物44与恒定剂量的泼尼松龙处理细胞4天。酸萃取的组蛋白通过ELISA对H3K27Me3水平进行分析(图9A)(单独的泼尼松龙，左侧图；化合物44/泼尼松龙的组合，右侧图，其IC50值作为每个图的插图)。对于泼尼松龙的治疗，因为使用该化合物没有观察到剂量依赖性变化，H3K27Me3数值被表示为柱状图。WSU-DLCL2(图9B)、OCI-LY19(图9C)或RL细胞(图9D)使用增加剂量的泼尼松龙、化合物44、或组合化合物44与恒定剂量的泼尼松龙处理4天。酸萃取的组蛋白通过蛋白质印迹对H3K27乙酰化水平进行分析。
图10是蛋白质印迹，该印迹显示使用化合物44或泼尼松龙单一药剂治疗对SMARCB1蛋白质水平没有影响。
图11A和11D是Fa-CI曲线图，该图显示化合物44和依维莫司的组合益处。图11B和11E是图，该图显示使用化合物44、依维莫司、化合物44和依维莫司的组合、或DMSO处理的WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞的细胞凋亡。图11C和11F是曲线图，该图显示相比化合物44单独使用，在WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞中的共处理之后所观察到的细胞周期G1期的变化。在WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞中观察到化合物44和依维莫司组合的强的协同效应(图11A、11D)。
图12A和12D是Fa-CI曲线图，该图显示化合物44和依鲁替尼的组合益处。图12B和12E是图，该图显示使用化合物44、依鲁替尼、化合物44和依维莫司的组合、或DMSO处理的WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞的细胞凋亡。图12C和12F是曲线图，该图显示相比化合物44单独使用，在WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞中的共处理之后所观察到的细胞周期G1期的变化。在WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞中观察到化合物44和依鲁替尼组合的强的协同效应(图12A、12D)。
图13A、13D、和13G是Fa-CI曲线图，该图显示化合物44与MK-2206在WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞中的组合益处。图13B、13E、和13H是图，该图显示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206的组合、或DMSO处理的WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞的细胞凋亡。图13C、13F和13I是曲线图，该图显示相比化合物44单独使用，在三种细胞系中的共处理之后所观察到的细胞周期G1期的变化。在WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞中观察到化合物44和MK-2206组合的强的协同效应(图13A、13D和13G)。
图14A-14C是柱状图，该图显示当使用化合物44、依鲁替尼、MK-2206、化合物44和依鲁替尼的组合或化合物44和MK-2206的组合处理WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞时EGR1、FOS、TCL1、AICDA、和GJA1基因表达的变化。相比使用单一药剂治疗，使用化合物44与第二药剂的组合观察到EGR1(40倍)与FOS(4倍)下调，以及AICDA(3倍)、TCL1A(5倍)与GJA1(3倍)上调(图14A-14C)。
图15是揭示弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)生物学中的信号通路以及该信号通路内各种化学治疗药剂靶标的图表。
图16A和16D是曲线图，该图显示使用化合物44、依维莫司、化合物44和依维莫司组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞后观察到的细胞周期G1期的变化。图16B和16E是曲线图，该图显示使用化合物44、依维莫司、化合物44和依维莫司组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞后观察到的细胞周期S期的变化。图16C和16F是曲线图，该图显示使用化合物44、依维莫司、化合物44和依维莫司组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞后观察到的细胞周期G2/M期的变化。对SU-DHL-5细胞组合治疗48小时后分别观察到细胞周期的G1、S、G2/M期中细胞的协同减少(图16D-16F)。当使用单一药剂或以组合方式治疗WSU-DLCL2细胞时，没有观察到细胞周期G1亚期方面的变化(图16A)。当以组合方式治疗WSU-DLCL2细胞时，分别观察到细胞周期的S期和G2/M期中细胞的协同时间依赖性减少(图16B、16C)。
图17A和17D是曲线图，该图显示使用化合物44、依鲁替尼、化合物44和依鲁替尼组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞后观察到的细胞周期G1期的变化。图17B和17E是曲线图，该图显示使用化合物44、依鲁替尼、化合物44和依鲁替尼组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞后观察到的细胞周期S期的变化。图17C和17F是曲线图，该图显示使用化合物44、依鲁替尼、化合物44和依鲁替尼组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2和SU-DHL-5细胞后观察到的细胞周期G2/M期的变化。图17A-17F显示相对于化合物44或依鲁替尼作为单一药剂，对WSU-DLCL2细胞和SU-DHL-5细胞组合治疗24小时后分别观察到细胞周期的G1、S、G2/M期中细胞协同减少。
图18A、18D和18G是曲线图，该图显示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞后观察到的细胞周期G1期的变化。图18B、18E和18H是曲线图，该图显示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞后观察到的细胞周期S期的变化。图18C、18F和18I是曲线图，该图显示使用化合物44、MK-2206、化合物44和MK-2206组合、以及DMSO治疗WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞后观察到的细胞周期G2/M期的变化。图18A-18I显示相对于化合物44或MK-2206作为单一药剂，对WSU-DLCL2细胞和SU-DHL-5细胞组合治疗后分别观察到细胞周期的G1、S、G2/M期中细胞的协同减少。
图19是显示归一化到DMSO对照的糖皮质激素受体表达水平的变化的柱状图，这些表达水平的变化是针对使用化合物44、泼尼松龙、化合物44和泼尼松龙组合、或DMSO治疗的EZH2野生型(OCI-LY19，DOHH2)、EZH2 Y646敏感性(WSU-DLCL2，SUDHL10)、和EZH2 Y646抗性(RL，SUDHL)细胞系。使用ΔΔCt方法和ACTB、B2M以及GAPDH作为参考基因来定量倍数变化值。如结果显示，糖皮质激素受体表达水平在细胞系中通常不受该组合的影响。
图20A-20C显示在携带异源移植物的小鼠中从CHOP方案中省略一个或所有化疗成分的效果。图20A是一个曲线图，该图显示使用化合物44、COP(没有阿霉素组分的化学治疗)、或它们的组合治疗携带SUDHL10(EZH2 Y646F)异源移植物的小鼠28天的肿瘤重量变化。图20B是一个曲线图，该图显示使用两个剂量的化合物44、强的松、或它们的组合治疗携带SUDHL10(EZH2 Y646F)异源移植物的小鼠28天的肿瘤体积变化。图20C是一个曲线图，该图显示使用化合物44、强的松、或它们的组合治疗携带SUDHL10(EZH2 Y646F)异源移植物的小鼠的身体重量变化(参见图20B)。小鼠服用最大耐受剂量的化合物44或化合物44/COP的组合在第60天显示100％存活，组合组相对其它所有治疗组(包括化合物44的最大耐受剂量组)显示出最小28天肿瘤重量(图20A)。单独服用强的松不会引起任何显著的抗肿瘤效果(图20B)。在前述研究的系中，服用化合物44仅仅产生部分响应，但是同时服用化合物44与强的松(但不是2个周期的强的松方案)，诱导了单独服用更高剂量的化合物44达到的最大可能消退。
具体实施方式
本发明是至少部分基于这样的发现：化合物44组合不同药剂，包括目前的标准治疗，不管EZH2突变状态，在某些癌症的治疗中是有效的。在某一个实施例中，该癌症是淋巴瘤。在某一个实施例中，该癌症是生发中心B细胞(GCB)起源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在某一个实施例中，该淋巴瘤是EZH2突变淋巴瘤。在某一个实施例中，该淋巴瘤是EZH2非突变或EZH2野生型淋巴瘤。
在本发明的某些方面，EZH2抑制剂是具有以下化学式的化合物44(也被称为EPZ-6438、E7438)：
Figure BDA0004036739770000061
或其医药上可接受的盐。
本发明是基于这样的发现：EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂和其它抗癌药剂可以组合用于治疗某些肿瘤，且具有比那些通过单独使用EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂和抗癌药剂治疗肿瘤取得更优的结果。相应地，本发明提供包含EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂和一种或多种其它治疗药剂的组合物，以及它们的使用来治疗疾病(例如癌症)的方法，其中该过程可以受调整组蛋白或其他蛋白质的甲基化状态的影响。在某一实施例中，本发明的特征在于一种包含化合物44和强的松的组合物。本发明也包括组合疗法的方法，该方法包括EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂和一种或多种其它治疗药剂，例如化合物44和强的松，用于治疗癌症，例如滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性细胞大B细胞淋巴瘤(DCLBL)。具体而言，本发明的方法对于治疗或预防癌症或抑制癌细胞增生是有用的。
本发明的一个方面涉及通过给予表达突变体EZH2的受试者治疗上有效量的EZH2抑制剂和一种或多种其它治疗药剂来治疗或缓解受试者的癌症症状或癌症前期状况的方法。本发明的突变体EZH2涉及突变体EZH2多肽或编码突变体EZH2多肽的核酸序列。在某些实施例中突变体EZH2在它的底物口袋结构域中包括一个或多个突变。
本发明的另一个方面涉及通过给予表达突变体EZH2或野生型EZH2的受试者治疗上有效量的EZH2抑制剂和一种或多种其它治疗药剂来治疗或缓解受试者的癌症症状或癌症前期状况的方法。本发明的突变体EZH2涉及突变体EZH2多肽或编码突变体EZH2多肽的核酸序列。在某些实施例中突变体EZH2在它的底物口袋结构域中包括一个或多个突变。
在另一个方面，本发明涉及通过给予表达突变体EZH2或野生型EZH2的受试者治疗上有效量的EZH2抑制剂(例如化合物44)和一种或多种糖皮质激素受体激动剂(GRags)(例如强的松、泼尼松龙、或地塞米松)来治疗或缓解受试者的癌症症状或癌症前期状况的方法。本发明的突变体EZH2涉及突变体EZH2多肽或编码突变体EZH2多肽的核酸序列。在某些实施例中突变体EZH2在它的底物口袋结构域中包括一个或多个突变。
人类EZH2核酸和多肽已经在先前描述。参见，例如，陈(Chen)等人(1996)《基因组学》(Genomics)38:30-7[746氨基酸]；Swiss-Prot登录号Q15910[746氨基酸]；GenBank登录号NM_004456和NP_004447(同种型a[751氨基酸])；以及GenBank登录号NM_152998和NP_694543(同种型b[707氨基酸])，其每一个以其全文通过引用在此结合。
出于本申请的目的，人类EZH2的氨基酸残基Y641应被理解为指的是在Swiss-Prot登录号Q15910中是或对应于Y641的酪氨酸残基。
还出于本申请的目的，人类EZH2的Y641突变体，和相等地，EZH2的Y641突变体应被理解为是指人类EZH2中对应于野生型人类EZH2的Y641的氨基酸残基被除酪氨酸外的氨基酸残基取代。
在某些实施例中，R-CHOP是CHOP、泼尼松龙或地塞米松的GRag组分。在某些实施例中，B细胞受体(BCR)信号通路抑制剂是利妥昔单抗、AKT抑制剂MK-2206、艾代拉里斯、曲美替尼、塔玛塔尼伯、依维莫司、或依鲁替尼。
本发明是部分基于这样的发现：PI3K-AKT-mTOR BCR信号通路的抑制剂，例如艾代拉里斯、MK-2206、和依维莫司当与化合物44组合时在WSU-DLCL2和SU-DHL-10细胞系中诱导非常强的协同作用。本发明还部分基于这样的发现：化合物44和B细胞受体通路的抑制剂(例如依鲁替尼和塔玛塔尼伯)的组合在两个突变体细胞系中展现出非常强的协同作用。在某些实施例中，BCL受体抑制剂是纳沃提克斯(navoticlax)或ABT-199。
在一些实施例中，该癌症是非霍奇金淋巴瘤、或弥漫性大B细胞淋巴瘤、或非霍奇金淋巴瘤生发中心B细胞。
在一些实施例中，标准治疗药剂是选自由R-CHOP、BCL抑制剂和BCR抑制剂组成的一种或多种化合物。
在一些实施例中，R-CHOP是CHOP、泼尼松龙或地塞米松的GRag组分。
在一些实施例中，BCR抑制剂是利妥昔单抗、AKT抑制剂MK-2206、艾代拉里斯、曲美替尼(trametinib)、塔玛塔尼伯、依维莫司(everolimus)、或依鲁替尼(ibrutinib)。
在一些实施例中，该癌症是EZH2突变体癌症。
在一些实施例中，所述癌症EZH2抑制剂抗性或难治性癌症。
在一个实施例中，EZH2的Y641突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的Y641的单个氨基酸残基被除酪氨酸外的氨基酸残基取代。
在一个实施例中，EZH2的Y641突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的Y641的单个氨基酸残基被苯基丙氨酸(F)取代。对应于这个实施例的EZH2的Y641突变体此处被称为Y641F突变体，或等同地，Y641F。
在一个实施例中，EZH2的Y641突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的Y641的单个氨基酸残基被组氨酸(H)取代。对应于这个实施例的EZH2的Y641突变体此处被称为Y641H突变体，或等同地，Y641H。
在一个实施例中，EZH2的Y641突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的Y641的单个氨基酸残基被天冬酰胺(N)取代。对应于这个实施例的EZH2的Y641突变体此处被称为Y641N突变体，或等同地，Y641N。
在一个实施例中，EZH2的Y641突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的Y641的单个氨基酸残基被丝氨酸(S)取代。对应于这个实施例的EZH2的Y641突变体此处被称为Y641S突变体，或等同地，Y641S。
在一个实施例中，EZH2的Y641突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的Y641的单个氨基酸残基被半胱氨酸(C)取代。对应于这个实施例的EZH2的Y641突变体此处被称为Y641C突变体，或等同地，Y641C。
在一个实施例中，EZH2的A677突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的A677的单个氨基酸残基被非丙氨酸的氨基酸，优选是甘氨酸(G)取代。对应于这个实施例的EZH2的A677突变体此处被称为A677突变体，且优选是A677G突变体，或等同地，A677G。A677也被称为A682。
在一个实施例中，EZH2的A687突变体的氨基酸序列不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列，不同之处仅仅是相应于野生型人类EZH2的A687的单个氨基酸残基被非丙氨酸的氨基酸，优选是缬氨酸(V)取代。对应于这个实施例的EZH2的A687突变体此处被称为A687突变体，且优选是A687V突变体，或等同地，A687V。A687也被称为A692。
在一个实施例中，EZH2的突变体的氨基酸序列在它的底物口袋结构域中的一个或多个氨基酸残基不同于野生型人类EZH2的氨基酸序列。对应于这个实施例的EZH2的突变体此处被称为EZH2突变体。
其它示例性的取代氨基酸突变包括在氨基酸位置677、687或641的取代，例如(但不限于)在氨基酸位置677的野生型残基丙氨酸(A)由甘氨酸(G)取代(A677G)；在氨基酸位置687的野生型残基丙氨酸(A)由缬氨酸(V)取代(A687V)；在氨基酸位置641的野生型残基酪氨酸(Y)由苯基丙氨酸(F)取代(Y641F)；在氨基酸位置641的野生型残基酪氨酸(Y)由组氨酸(H)取代(Y641H)；在氨基酸位置641的野生型残基酪氨酸(Y)由天冬酰胺(N)取代(Y641N)；在氨基酸位置641的野生型残基酪氨酸(Y)由丝氨酸(S)取代(Y641S)；在氨基酸位置641的野生型残基酪氨酸(Y)由半胱氨酸(C)取代(Y641C)。Y641也被称为Y646。
对EZH2杂合的细胞预期会显示一个恶性表型，这是因为通过野生型酶有效的形成H3-K27me1，且随后通过突变体酶的形式有效的将这个源种类转换成H3-K27me2，以及特别是，H3-K27me3。
本发明的另一个方面涉及在受试者中抑制H3-K27转换成三甲基化的H3-K27的方法。该抑制可能涉及在受试者中抑制非甲基化的H3-K27转换成一甲基化H3-K27、一甲基化H3-K27转换成二甲基化H3-K27、二甲基化H3-K27转换成三甲基化H3-K27、或其任何组合，包括，例如一甲基化H3-K27转换成二甲基化H3-K27和二甲基化H3-K27转换成三甲基化H3-K27。如本文所用，非甲基化H3-K27是指组蛋白H3没有甲基基团共价连接到赖氨酸27的氨基基团。如本文所用，一甲基化H3-K27是指组蛋白H3有一个甲基基团共价连接到赖氨酸27的氨基基团。一甲基化H3-K27此处也被称为H3-K27me1。如本文所用，二甲基化H3-K27是指组蛋白H3有两个甲基基团共价连接到赖氨酸27的氨基基团。二甲基化H3-K27此处也被称为H3-K27me2。如本文所用，三甲基化H3-K27是指组蛋白H3有三个甲基基团共价连接到赖氨酸27的氨基基团。三甲基化H3-K27此处也被称为H3-K27me3。
本发明的一种组合物包括化合物44和一种或多种治疗药剂。本发明的化合物和组合适合于与一种或多种其它治疗药剂或治疗方法作为组合疗法的一部分给予，适合于一起、顺序或交替给予。其它适用于本发明的方法的化合物被描述在美国出版物20120264734，其内容以其整体通过引用在此结合。
在本发明的某些方面，当EZH2的抑制剂抑制突变体EZH2的组蛋白甲基转移酶活性比它抑制野生型EZH2的组蛋白甲基转移酶活性更有效时，EZH2的抑制剂“选择性地抑制”突变体EZH2的组蛋白甲基转移酶活性。例如，在一个实施例中，选择性的抑制剂具有一个IC50，该IC50对于突变体EZH2比对于野生型EZH2的IC50至少低40％。在一个实施例中，选择性的抑制剂具有一个IC50，该IC50对于突变体EZH2比对于野生型EZH2的IC50至少低50％。在一个实施例中，选择性的抑制剂具有一个IC50，该IC50对于突变体EZH2比对于野生型EZH2的IC50至少低60％。在一个实施例中，选择性的抑制剂具有一个IC50，该IC50对于突变体EZH2比对于野生型EZH2的IC50至少低70％。在一个实施例中，选择性的抑制剂具有一个IC50，该IC50对于突变体EZH2比对于野生型EZH2的IC50至少低80％。在一个实施例中，选择性的抑制剂具有一个IC50，该IC50对于突变体EZH2比对于野生型EZH2的IC50至少低90％。
在本发明的某些方面，该抑制剂抑制从H3-K27me2至H3-K27me3的转换。在一个实施例中，该抑制剂据说是抑制H3-K27的三甲基化。因为从H3-K27me1至H3-K27me2的转换先于从H3-K27me2至H3-K27me3的转换，从H3-K27me1至H3-K27me2的转换天然地也抑制从H3-K27me2至H3-K27me3的转换，即，它抑制H3-K27的三甲基化。也有可能抑制从H3-K27me2至H3-K27me3的转换而不会抑制从H3-K27me1至H3-K27me2的转换。这种类型的抑制尽管不会抑制H3-K27的二甲基化，但也将导致H3-K27的三甲基化的抑制。
在一个实施例中，该抑制剂抑制从H3-K27me1至H3-K27me2的转换和从H3-K27me2至H3-K27me3的转换。这样的抑制剂可以直接单独抑制从H3-K27me1至H3-K27me2的转换。可替换地，这样的抑制剂可以直接抑制从H3-K27me1至H3-K27me2的转换和从H3-K27me2至H3-K27me3的转换。
在本发明的某些方面，该抑制剂化合物抑制组蛋白甲基转移酶活性。组蛋白甲基转移酶活性的抑制可以使用任何适合的方法来检测。该抑制可以被测量，例如，依据组蛋白甲基转移酶的活性比率或者依照组蛋白甲基转移酶活性的产物来测量。
相比合适的对照该抑制是一种可测量的抑制。在一个实施例中，相比合适的对照，抑制是至少10％的抑制。即，使用抑制剂时酶活性的比率或产物的量是少于或等于不使用抑制剂时产生的相应的比率和的量的90％。在各种其它实施例中，相比合适的对照，抑制是至少20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％抑制。在一个实施例中，相比合适的对照，抑制是至少99％抑制。即，使用抑制剂时酶活性的比率或产物的量是少于或等于不使用抑制剂时产生的相应的比率和量的1％。
本发明的组合物包括EZH2抑制剂或化合物44或其药学上可接受的盐，以及一种或多种其它治疗药剂或其药学上可接受的盐。本发明提供了一种EZH2抑制剂或化合物44或其药学上可接受的盐以及一种或多种治疗药剂或其药学上可接受的盐(作为共同配制品或单独的配制品)的给药，其中配制品的给予是同时的、顺序的或交替的。在某些实施例中，其它治疗药剂可以是被本技术领域认为是对治疗正在经本发明的组合物治疗的疾病或病症有用的药剂。在某些实施例中，其它治疗药剂可以是未被本技术领域认为是对治疗正在经本发明的组合物治疗的疾病或病症有用的药剂。在一个方面，其它治疗药剂可以是赋予本发明的组合物有益属性的药剂(例如，影响组合物粘性的药剂)。对本发明的组合物有益的属性包括(但不限于)从EZH2抑制剂或化合物44与一种或多种其它治疗药剂的组合产生的药剂代谢动力学或药效学共同作用。例如，该一种或多种其它治疗药剂可以是抗癌药剂或化学治疗药剂。例如，该一种或多种其它治疗药剂可以是糖皮质激素。例如，该一种或多种其它治疗药剂可以是选自强的松、泼尼松龙、环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、马磷酰胺、顺铂、阿糖胞苷、依维莫司、地西他滨、地塞米松、或其功能类似物、衍生物、前药和代谢物。在另一方面，其它治疗药剂可以是强的松或它的活性代谢物、泼尼松龙。
以下阐述的治疗药剂是为了说明的目的，而不是意在限制。本发明包括从以下列表中选出的至少一种其它治疗药剂。本发明可以包括多于一种其它治疗药剂，例如，两种、三种、四种、或五种其它治疗药剂以至于本发明的组合物可以执行其预期功能。
在另一实施例中，其它治疗药剂是选自包括烷基化药剂的组的化学治疗药剂(也被称为抗瘤药剂或抗增生药剂)；抗生素；抗代谢物；解毒剂；干扰素；多克隆或单克隆抗体；EGFR抑制剂；HER2抑制剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；激素；有丝分裂抑制剂；mTOR抑制剂；多激酶抑制剂；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；VEGF/VEGFR抑制剂；紫杉烷或紫杉烷衍生物、芳香酶抑制剂、蒽环类抗生素、微管靶向药剂、拓扑异构酶毒物药剂、分子靶标或酶的抑制剂(例如，激酶或蛋白甲基转移酶)、胞苷类似物的药剂或任何化学治疗、抗肿瘤或抗增生药剂，这些药剂在www.cancer.org/docroot/cdg/cdg_0.asp列出。
本发明提供用于组合疗法的方法，其中包括EZH2抑制剂或化合物44或其药学上可接受的盐以及一种或多种其它治疗药剂的组合物被给予需要治疗疾病或癌症的受试者。组合疗法也可以是被给予癌症细胞以抑制增生或诱导细胞死亡。在一个方面，在给予了包括化合物44或其药学上可接受的盐和一种或多种其它治疗药剂的本发明的组合物之后，给予化合物44或其药学上可接受的盐。在一个方面，在给予包括化合物44或其药学上可接受的盐和一种或多种其它治疗药剂的本发明的组合物之前，给予化合物44或其药学上可接受的盐。在一个方面，在给予了一种或多种其它治疗药剂之后给予化合物44或其药学上可接受的盐，以至于这些其它治疗药剂是在单一的组合物中或在两种或更多种组合物中被给予，例如，同时地、顺序地、或交替地被给予。在一个方面，在给予一种或多种其它治疗药剂之前给予化合物44或其药学上可接受的盐，以至于这些其它治疗药剂是在单一的组合物中或在两种或更多种组合物中被给予，例如，同时地、顺序地、或交替地被给予。
在一个实施例中，本发明的组合物包括包括化合物44或其药学上可接受的盐和一种或多种抗癌药剂，例如，CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素、长春新碱、以及强的松或泼尼松龙)或R-CHOP(利妥昔单抗从、环磷酰胺、羟基柔红霉素、长春新碱、强的松或泼尼松龙)。在一个实施例中，本发明的组合物包括化合物44或其药学上可接受的盐和强的松或泼尼松龙。本发明的方法包括给予化合物44的化合物或其药学上可接受的盐和抗癌药剂(其中抗癌药剂是CHOP、R-CHOP、强的松或泼尼松龙)的组合疗法。
在某些实施例中，“组合包括EZH2抑制剂和标准治疗药剂”旨在包含不是共同配制的治疗药剂的给予。
在某些实施例中，“组合疗法”旨在包括以顺序方式给予这些治疗剂，其中在不同时间给予每种治疗剂，以及同时或以基本上同时的方式给予这些治疗剂或这些治疗剂中的至少两种。可以例如通过向受试者给予具有固定比率的每种治疗剂的单一胶囊或以针对这些治疗剂中的每种的多个单一胶囊来完成基本上同时给予。依次或基本上同时给予每一治疗剂，可通过任何适当的途径来实现，包括(但不限于)口服途径、静脉途径、肌内途径、并通过粘膜组织直接吸收。可以通过相同途径或通过不同途径给予这些治疗剂。例如，可以通过静脉注射给予选定组合的第一治疗药剂，同时可以口服地给予该组合的其他治疗药剂。可替代地，例如，可以口服地给予所有治疗药剂或可以通过静脉注射给予所有治疗药剂。也可以交替地给予治疗药剂。
在本发明的某些方面，本发明的组合疗法可以在疾病或癌症治疗中产生协同效应。“协同效应”被定义为治疗药剂的组合的效力比任何给定的药剂单独的效果的总和要大。协同效应也可以是任何化合物或其它治疗药剂作为单一药剂给予时所不能达到的效果。协同效应可以包括(但不限于)通过减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长或增加受试者存活来治疗癌症的效果。协同效应还可以包括降低癌症细胞活力、诱发癌症细胞死亡、和抑制或延迟癌症细胞生长。
在本发明的某些方面，“组合疗法”也包括进一步组合其他生物活性成分和非药物治疗(例如，手术或放射治疗)来给予如上文描述的治疗药剂。其中组合疗法进一步包括非药物治疗，该非药物治疗可以在任何合适的时间进行，只要能达到来自所述治疗药剂与非药物治疗共同作用的有益效果。例如，在适当的情况下，当非药物治疗暂时从治疗药剂的给药中移除时(也许是几天甚至几个星期)，仍然能获得有益的效果。
在另一方面，本发明的组合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以与放射治疗组合给予。放射治疗也能与本发明的组合物和本文描述的作为多药剂治疗的一部分的其它化学治疗药剂组合给予。
组合疗法可以通过给予两种或多种药剂来达到，这些药剂是例如化合物44和一种或多种其它治疗药剂，其中每一种单独配制和给予或通过单一配制品给予两种或更多种药剂。组合疗法也包括其它的组合。例如，两种药剂可以一起配制和与包含第三药剂的单独配制品一起给予。然而组合疗法中的两种或更多种药剂可以同时给予，它们不需要如此。例如，给予第一药剂(或药剂的组合)可以先于给予第二药剂(或药剂的组合)几分钟、几小时、几天、或几个星期。因此，两种或更多种药剂可以在间隔几分钟内给予，或间隔1、2、3、6、9、12、15、18、或24小时内给予，或间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天给予，或间隔2、3、4、5、6、7、8、9、或10星期给予。在一些情况下可能是甚至更长的间隔。然而在许多情况下，最好是在组合疗法中使用的两种或更多种药剂可以同时存在于病人的体内，这不必如此。
本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含化合物44或其药学上可接受的盐以及本文披露的一种或多种其它治疗剂，并混合药学上合适剂量的载体或赋形剂来治疗或预防的如本文所述的疾病或病症。本发明的药物组合物也可以与其他治疗剂或治疗方法同时地、依次地、或交替地组合给予。
本发明的组合物混合物也可以作为简单的混合物或合适的配制的药物组合物给予患者。例如，本发明的一个方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包括治疗有效剂量的EZH2抑制剂或化合物44、或其药学上可接受的盐、水合物、对映体或立体异构体；一种或多种其它治疗剂，和药学上可接受的稀释剂或载体。
“药物组合物”是一种配制品，该配制品包含以适合给予至患者的形式存在的化合物。本文描述的化合物44和一种或多种其它治疗药剂每一个可以单独配制或配制成由任何活性成分组合的药物组合物。相应地，可以基于每种药物组合物的剂型选择合适的一种或多种给药途径。可替代地，本文描述的化合物44和一种或多种其它治疗剂可以配制成一种药物组合物。
在一个实施例中，所述药物组合物是以整批或以单位剂型存在。所述单位剂型是任何各种形式，包括例如胶囊、IV包、片剂、上气溶胶吸入器的单个泵、或小瓶。组合物单位剂量中活性成分(如披露的化合物、盐、水化物、溶剂化物或其同分异构物的配制品)的量是有效的量且根据涉及的特定的治疗有所不同。本领域的技术人员应当了解有时候有必要根据患者的年龄和病症对剂量进行常规变化。剂量也取决于给药的途径。各种途径被考虑，包括口腔、肺、直肠、肠胃外、经皮肤、皮下、静脉注射、肌内、腹腔内、吸入、颊、舌下、胸膜腔内、鞘内、鼻内等。用于局部或经皮给予本发明的化合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。在一个实施例中，活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及与任何需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内的那些化合物、阴离子、阳离子、材料、组合物、载体、和/或剂型，这些是适合用于与人类和动物组织接触使用而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。
“药学上可接受的赋形剂”意指用于制备药物组合物的赋形剂，它们通常是安全的、无毒性的和没有生物学上或其它方面不期望的，并且包括兽医使用或人类药物使用可接受的赋形剂。本说明书和权利要求使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和多于一种这样的赋形剂。
本发明的药物组合物被配制成与其预期的给予途径相容。给药途径的实例包括包括(例如)肠胃外、静脉内、皮内、皮下、口腔(例如，吸入)、经皮肤(局部)、和经粘膜给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄醇或苯基甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和调节张力的药剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本发明的组合物可以许多目前用于化学治疗的熟知的方法给予受试者。例如，对于治疗癌症，本发明的化合物可以直接被注射进肿瘤，注射进血流或体腔或口服或使用贴剂应用于皮肤。选择的剂量应该足以构成有效治疗，但不会高到引起不可接受的副作用。疾病病症状况(例如，癌症、癌前病变等)和患者的健康状况在治疗期间和治疗后的合理期限内应优选地被密切监测。
本文使用的术语“治疗有效量”是指对治疗、改善或预防目标疾病或病症所需的治疗剂的量或表现出可检测的治疗或抑制作用所需的治疗剂的量。该作用可以通过本技术领域已知的任何测定方法来检测。对于受试者精确的有效量将取决于受试者的体重、大小和健康状况；病症的性质和程度；和选择用于给药的治疗剂或治疗剂的组合。治疗有效量对于给定的情况下可通过临床医师的技术和判断范围内的常规实验来确定。在一个优选的方面，待治疗的疾病或病症是癌症。在另一个的方面，待治疗的疾病或病症是细胞增生性障碍。
在某些实施例中，相比单独使用各个药剂的单药治疗，当组合使用各个药剂时各个药剂的治疗有效量会更低。这种更低的治疗有效量能负担的治疗方案的毒性更低。
对于任何化合物，最初治疗有效量可以在细胞培养分析(如肿瘤细胞的细胞培养分析)中或者在动物模型(通常大鼠、小鼠、兔、狗、或猪)中估算。动物模型还可以用于确定给药的适当浓度范围和途径。然后这类信息可以用于确定对于在人中给药的适用剂量和途径。治疗/预防效果和毒性可以通过标准药剂程序在细胞培养物或实验性动物中来确定，例如，ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％的群体具杀伤性的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，且可以表达为比率LD50/ED50。呈现大的治疗指数的药物组合物是优选的。该剂量可以根据所采用的剂型、患者的敏感性、和给药途径在此范围内变化。
调整剂量和给药以提供一种或多种活性药剂的足够水平或维持期望的效果。可考虑的因素包括疾病状况的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重以及性别、饮食、给药时间和频率、一种或多种药剂组合、响应灵敏度、以及对疗法的耐受/响应。长效药物组合物根据特定配制品的半衰期和清除率可以每3至4天、每周、或每两周一次给药。
包括本发明的活性化合物的药物组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣、磨粉、乳化、胶囊化、包埋、或冻干工艺的方式。药物组合物能以一种常规的方式使用一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂来配制，它们协助将活性化合物制成制剂的工艺，这些制剂是可以药用的。当然，合适的配制品取决于所选择的给药途径。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液液的无菌粉末。对于静脉内给药，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF，新泽西州派西派尼市(Parsippany，NJ))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制备和存储的条件下必须是稳定的并且必须抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。该载体可以是包含以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及其适合的混合物。恰当的流动性可(例如)通过应用衣料如卵磷脂来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过应用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂(例如糖)、多元醇(例如甘露醇和山梨糖醇)、和氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
按照需要，可以通过将活性化合物以需要的量加入具有以上列举的组分中的一种或多种组合的适当溶剂中，随后进行无菌过滤来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物加入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体包含基础分散介质以及来自以上列举的那些所需的其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法为真空干燥和冷冻-干燥技术，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其先前的无菌-过滤溶液的任何另外的所需成分。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的药学上可接受的载体。它们可以被封装在明胶胶囊中或被压成片剂。出于口服治疗性给药的目的，可以将活性化合物随赋形剂一起加入并且以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。可以使用用以口腔清洗的流体载体来制备口服组合物，其中流体载体中的化合物经口服、漱、咳出或咽下。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、凝胶(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入给药，化合物从加压容器或分配器(其中包含合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))、或喷雾器以气溶胶喷雾形式递送。
系统给药也可以通过经粘膜或经皮肤的方式。对于经粘膜或经皮肤给药，在该配制品中使用适合有待渗透的障碍的渗透剂。这样的渗透剂通常是本技术领域所熟知的，并且对于经粘膜给药包括，例如洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮肤给药，如本领域中公知的，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂、或乳膏。
将这些活性化合物与保护这些化合物免于从体内快速消除的药学上可接受的载体一起制备，如控制释放配制品，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、以及聚乳酸。用于制备此类配制品的方法对本领域的普通技术人员而言应是显而易见的。材料也可以从Alza公司和Nova制药公司购买得到从，脂质体悬浮液(包括靶向受感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域的普通技术人员已知的方法制备，如(例如)描述在美国专利号4,522,811)中的。
特别有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以便给药和剂量统一。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生与所需的药物载体组合产生期望的治疗效果的活性化合物的预定量。对于本发明的剂量单位形式的规格被支配于和直接取决于活性化合物的独特特征和将要实现的特定治疗效果。
在治疗应用中，本文所述的EZH2抑制剂化合物、本文描述的其它治疗剂、包括化合物44和一种或多种其它治疗剂的组合物、或在按照本发明使用的药物组合物的剂量变化，在影响所选剂量的其他因素中，取决于药剂、接受的患者的年龄、体重和临床状况，以及给予治疗的临床医师或执业医师的经验和判断。通常，剂量应足以导致肿瘤生长的减慢、和优选是消退、并且还优选是使肿瘤完全消退。剂量的范围可以是从每天大约0.01mg/kg至每天大约5000mg/kg。在优选的方面，剂量的范围可以是从每天大约1mg/kg至每天大约1000mg/kg。在一个方面，剂量的范围将以单一的、分割的、或连续的剂量为约0.1毫克/天至约50克/天；约0.1毫克/天至约25克/天；约0.1毫克/天至约10克/天；约0.1毫克至约3克/天；或约0.1毫克至约1克/天(剂量可调整为患者的体重(千克)、体表面积(平方米)、年龄(年))。药剂的有效量是它提供了由临床医生或其他合格的观察者注意到的一个客观可识别的改进。例如，患者肿瘤的消退可以参考肿瘤的直径来测量。肿瘤直径的减少表示消退。治疗停止后肿瘤复发失败也表示消退。本文使用的术语“剂量有效的方式”是指活性化合物在受试者或细胞中产生期望的生物效应的量。
药物组合物可以与给药的说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。
本发明的组合物能够进一步形成盐。本发明的组合物每个分子能够形成多于一个(例如单-、二-、三-)盐。所有这些形式也包括在本发明要求的范围内。
本文所用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱的盐来修饰。药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基的矿物盐或有机酸盐，如胺，酸性残基(如羧酸等)的碱盐或有机盐。药学上可接受的盐包括例如从无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规的无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括(但不限于)来自于无机酸和有机酸的那些，所述无机酸和有机酸选自以下物质：2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、重碳酸、碳酸、柠檬酸、依地、乙烷二磺酸、1,2-乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、乙二醇阿散酸、间苯二酚酸、水巴米克酸(hydrabamic)、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基马来酸、羟萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、萘磺酸、硝酸、草酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚醋酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、鞣酸、酒石酸、甲苯磺酸，和通常出现的氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。
药学上可接受的盐的其它实例包括己酸、环戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环-[2,2,2]-辛-2-烯-1-羧酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、粘康酸等。本发明还包括当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子或铝离子)替换或与有机碱(如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等)配合所形成的盐。
应当理解的是，所有引用的药学上可接受的盐包括相同盐的溶剂加成形式(溶剂化物)。
组合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物的给药方式有口服、经鼻、经皮、经肺、吸入、经颊、舌下、腹腔内、皮下、肌内、静脉内、直肠、胸膜内、鞘内和肠胃外。在一个实施例中，该化合物是口服给药。本领域技术人员将认识到某些给药途径的优点。
利用这些化合物的给药方案的选择是根据各种因素，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医疗病症；该被处理病症的严重程度；给药途径；患者的肾和肝功能；以及应用的具体化合物或其盐。一个普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需药物的有效量以预防、对抗、或阻止病症的进展。
本发明披露的化合物的配制品和给药的技术见于文献雷明顿，药学科学与实践，第19版，宾夕法尼亚州伊斯顿的Mack出版公司(1995)(Remington:the Science andPractice of Pharmacy,19th edition,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995))。在一个实施例中，本文所述的化合物，和其药学上可接受的盐，在药物配制中与药学可接受的载体或稀释剂组合使用。合适的药学上可接受的载体包括惰性固体填充剂或稀释剂和无菌水或有机溶液。这些化合物将存在于足以提供在本文所述范围内的所需剂量的这样的药物组合物中。
除非另行说明，本文所用的所有百分比和比率均以重量计。本发明的其它特征和优点从不同的实例显而易见。所提供的实例说明在实施本发明中有用的不同组分和方法。所述实例不限制要求保护的发明。基于本披露，本领域技术人员可以识别和使用对实施本发明有用的其他组分和方法。
本发明提供了用于治疗病症和疾病的组合物和方法，其治疗的过程可以通过调节组蛋白或其它蛋白质的甲基化状态被影响，其中所述甲基化状态是至少部分地由EZH2的活性介导的。组蛋白的甲基化状态的调节可以反过来影响由甲基化激活的靶基因和/或由甲基化抑制的靶基因的表达水平。该方法包括给予需要这种治疗的受试者治疗有效量的本发明的组合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物。
至少基于异常组蛋白甲基化已被发现与某些癌症和癌前状态有关联的事实，在受试者中使用突变体EZH2用于治疗癌症或癌前状态的方法包括给予需要的受试者治疗有效量的抑制甲基化的化合物。在一个实施例中，用于在受试者中治疗癌症或癌前状态的方法包括向对其有需要的受试者给予抑制非甲基化H3-K27向一甲基化H3-K27(H3-K27me1)转换的治疗有效量的化合物。在一个实施例中，用于在受试者中治疗癌症或癌前状态的方法包括向对其有需要的受试者给予抑制一甲基化H3-K27向二甲基化H3-K27(H3-K27me2)转换的治疗有效量的化合物。在一个实施例中，用于在受试者中治疗癌症或癌前状态的方法包括向对其有需要的受试者给予抑制H3-K27me2向三甲基化H3-K27(H3-K27me3)转换的治疗有效量的化合物。在一个实施例中，用于在受试者中治疗癌症或癌前状态的方法包括向对其有需要的受试者给予抑制H3-K27me1向H3-K27me2转换和H3-K27me2向H3-K27me3转换的治疗有效量的化合物。值得注意的是，在没有组蛋白或蛋白质甲基化细胞水平的整体增加时，在关键基因位点的染色质上可以发生疾病特异的甲基化的增加。例如，针对整体组蛋白或蛋白质低甲基化的背景，在关键疾病相关基因上可能发生异常的高甲基化。
通常，甲基化的调节剂可用于调节细胞增生。例如，在一些情况下，使用减少甲基化的药剂可以减少过度增生，反之使用增加甲基化的药剂可以刺激不足的增生。相应地，待治疗的疾病包括过度增生性疾病，例如良性细胞生长和恶性细胞生长(癌症)。
EZH2介导的蛋白质甲基化起作用的疾病可以是癌症、细胞增生性疾病、或前癌状态。本发明进一步提供本发明组合物、或药学上可接受的盐或其溶剂化物对需要这样的治疗的受试者的用途，制备用于治疗癌症的药剂的用途。待治疗的示例性的癌症包括淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(包括GCB淋巴瘤)。
通常，作为甲基化调节剂的化合物可用于调节细胞增生。例如，在一些情况下，使用减少甲基化的药剂可以减少过度增生，反之使用增加甲基化的药剂可以刺激不足的增生。相应地，可以通过本发明的化合物治疗的疾病包括过度增生性疾病，例如良性细胞生长和恶性细胞生长。
本文使用的“对其有需要的受试者”是具有EZH2介导的蛋白质甲基化起作用的疾病的受试者，或者具有相对于大群体发展这样的疾病的风险增加的受试者。对其有需要的受试者可以具有前癌状态。优选地，对其有需要的受试者具有癌症。“受试者”包括哺乳动物。该哺乳动物可以是(例如)任何哺乳动物，如人类、灵长类、鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选地，该哺乳动物是人类。
本发明的受试者包括任何已经被诊断为癌症或前癌状态、具有癌症或前癌状态、或具有发展癌症或前癌状态的风险的人类受试者。本发明的受试者包括任何表达突变体EZH2的人类受试者。例如，突变体EZH2包括一个或多个突变，其中该突变是取代、点突变、无义突变、错义突变、缺失、或插入或任何其它本文描述的EZH2突变。
对其有需要的受试者可以具有难治性或抗性的癌症。“难治性或抗性的癌症”意味着癌症对治疗不响应。该癌症可以从治疗开始就有抗性，或在治疗中变得有抗性。在一些实施例中，对其有需要的受试者在最近治疗缓解后有癌症复发。在一些实施例中，对其有需要的受试者接受了用于治疗癌症的所有已知的有效治疗并都失败了。在一些实施例中，对其有需要的受试者接受了至少一次前治疗。在某些实施例中，前治疗是单药治疗。在某些实施例中，前治疗是组合疗法。
在一些实施例中，对其有需要的受试者由于以前的治疗可以具有第二癌症。“第二癌症”是指由于或因为以前的致癌治疗(例如化疗)发生的癌症。
受试者也可以对EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂或任何其它治疗药剂显示出耐药性。
本发明的特征还在于为具有癌症的受试者选择组合疗法的方法。所述方法包括以下步骤：从受试者的样品中检测本文描述的一个或多个EZH2突变；且基于该一个或多个EZH2突变选择用于治疗癌症的组合疗法。在一个实施例中，该治疗包括给予受试者本发明的组合物。在一个实施例中，该方法进一步包括给予受试者治疗有效量的本发明的组合物。可以使用任何本技术领域已知的合适方法来检测EZH2突变。更多方法描述在美国专利公开号20130040906，以其整体通过引用在此结合。
本文所述的方法和用途可以包括在向受试者给予本发明的组合物(例如，含有化合物44的组合物)或其药学上可接受的盐以及一种或多种治疗剂之前和/或之后，从有需要的受试者的样品中检测本文所述的一个或多个EZH2突变的步骤。在测试样品中存在本文所述的一个或多个EZH2突变表明所述受试者响应于本发明的组合疗法。
通过在受试者中遗传筛查本文所描述的一个或多个EZH2突变，本发明提供了个性化的药物、治疗和/或癌症管理给受试者。例如，本发明通过确定受试者对组合疗法的响应性且当受试者响应于所述组合疗法时给予受试者本发明的组合物而提供了用于治疗或减轻有需要的受试者的癌症或癌前状态的症状的方法。通过从受试者获得样品，并检测本文描述的一个或多个EZH2突变来确定响应性，并且本文描述的这样的一个或多个EZH2突变的存在表明所述受试者响应于本发明的组合物。一旦受试者的响应被确定，可以给予治疗有效量的组合物，例如，包含化合物44或其药学可接受的盐的组合物和一种或多种治疗剂。组合物的治疗有效量可以由本领域的普通技术人员来确定。
本文使用的术语“响应性”是与术语“响应”、“敏感”、和“敏感性”可互换，并且它是指当给予本发明的组合物时受试者表现出治疗响应，例如，受试者的肿瘤细胞或肿瘤组织经受细胞凋亡和/或坏死，和/或显示降低的生长、分裂或增生。该术语也指当给予本发明的组合物时，受试者相对于大的群体会或具有更高的概率表现治疗响应，例如，受试者的肿瘤细胞或肿瘤组织经受细胞凋亡和/或坏死和/或显示降低的生长、分裂或增生。
“样品”是指任何源自于所述受试者的生物样品，包括但不限于细胞、组织样品、体液(包括(但不限于)粘液、血液、血浆、血清、尿液、唾液、精液)、肿瘤细胞和肿瘤组织。优选地，样品是从骨髓、外周血细胞、血液、血浆和血清中选择。样品可以由接受治疗或测试的受试者提供。可替代地，根据本领域的常规实践样品可由医师来获得。
本文使用的术语“细胞增生性疾病”是指一种病症，在其中细胞的非常规或异常的生长或两者可导致有害的病症或疾病，其可以是或可以不是癌性的发展。本发明的示例性细胞增生性疾病包括各种病症，其细胞分裂是失调的。示例性细胞增生性病症包括(但不限于)肿瘤、良性肿瘤、恶性肿瘤、癌前期病症、原位肿瘤、包封的肿瘤、转移瘤、液体肿瘤、实体肿瘤、免疫肿瘤、血液瘤、癌症、癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和快速分裂细胞。本文使用的术语“快速分裂的细胞”被定义为相同的组织内超过或高于相邻或并列的细胞所预期的或观察到的分裂速率的任何细胞。细胞增生性疾病包括癌前期或癌前状态。细胞增生性病症包括癌症。优选地，本文所提供的方法用于治疗或减轻癌症的症状。“癌症”一词包括实体瘤以及血液肿瘤和/或恶性肿瘤。“癌前期细胞”或“癌前细胞”是体现细胞增生性病症是癌前期或癌前状态的细胞。“癌细胞”或“癌性细胞”是体现细胞增生性病症是癌症的细胞。任何可重复测量方式可以被用来识别癌细胞和癌前细胞。癌细胞或癌前细胞可通过组织样品(例如，活组织检查样品)的组织学分型或分级来鉴定。癌细胞和癌前期细胞可以通过使用适当的分子标记来鉴定。
待治疗的癌症可以通过DNA细胞计量术、流式细胞术或图像细胞仪来评估。待治疗的癌症可分型为具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的在细胞分裂的合成阶段(如在细胞分裂的S期)的细胞。待治疗的癌症可以分型为具有低S期分数或高S期分数。
本文使用的“正常细胞”是不能被归类为“细胞增生性病症”的一部分的细胞。一个正常细胞缺乏可导致不希望的病症或疾病发展的非常规生长或异常生长或两者。优选地，正常细胞具有正常功能的细胞周期检验点控制机制。
本文使用的“接触细胞”是指一种状态，其中化合物或其他物质组合物直接接触细胞，或足够接近以在细胞内诱导期望的生物效果。
本文使用的“候选化合物”是指已经或将要在一个或多个体外或体内生物测试中测定，以确定该化合物是否可能在细胞、组织、系统、动物或人中引起正在被研究人员或临床医师所寻求的期望的生物学或医学响应的本发明的化合物、或药学上可接受的盐或其溶剂化物。候选化合物是本发明的化合物、或药学上可接受的盐或其溶剂化物。生物学或医学响应可以是癌症的治疗。生物学或医学响应可以是细胞增生性病症的治疗或预防。体外或体内生物测定可以包括(但不限于)酶活性测定、电泳迁移率变动分析、报告基因测定、体外细胞生存力测定、以及本文所述的测定。
本文使用的“治疗”(“treating”或“treat”)描述了出于防治疾病、病症或失调的目的对患者的管理和护理，并包括给予本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物，以减轻疾病、病症或失调的症状或并发症，或消除疾病、病症或失调。
本发明的组合物，或药学上可接受的盐或其溶剂化物，还可以用于预防疾病、病症或失调。本文使用的“预防”(“preventing”或“prevent”)描述了减少或消除疾病、病症或失调的症状或并发症的发作。
本文使用的“减轻”一词是指用来描述一个过程，其中疾病的体征或症状的严重性降低。重要的是，体征或症状可以减轻而不被消除。在一个优选的实施例中，给予本发明的药物组合物导致体征或症状的消除，然而，不需要消除。有效剂量预期降低体征或症状的严重性。例如，可能发生在多个位置的病症如癌症的体征或症状得以减轻的条件是该癌症的严重性在多个位置中的至少一个内下降了。
本文使用的“严重性”一词是指描述癌症从癌前期或良性的状态转变成恶性状态的潜力。可替代地或另外地，严重性是指例如根据TNM分期系统(由国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症组合委员会(AJCC)接受)或者由其他技术领域公认的方法描述的癌症阶段。癌症阶段指的是基于因素例如原发肿瘤的位置、肿瘤大小、肿瘤数和受累的淋巴结(癌症扩散到淋巴结)癌症的程度或严重性。可替代地或另外地，严重性是指由本领域公认的方法(参见，美国国家癌症研究所，www.cancer.gov)描述的肿瘤分级。肿瘤等级是按照癌细胞在显微镜下的外观和肿瘤生长和扩散的可能速度，用于癌细胞分类的系统。当判断肿瘤等级的时候，包括细胞的结构和生长方式的很多因素被考虑。用于确定肿瘤等级的具体因素因每个类型癌症的不同而不同。严重性还描述了一种组织学分级，也称为分化，其是指有多少肿瘤细胞类似于同一组织类型的正常细胞(参见，美国国家癌症研究所，www.cancer.gov)。此外，严重性描述了一种核级，其是指肿瘤细胞中的核的大小和形状以及正在分裂的肿瘤细胞的百分比(参见，美国国家癌症研究所，www.cancer.gov)。
本发明的另一个方面，严重性描述了肿瘤已分泌生长因子、降低细胞外基质、成为血管、失去粘附到并列组织或转移的程度。此外，严重性描述了原发肿瘤已经转移的位置的数目。最后，严重性包括治疗不同类型和位置的肿瘤的难度。例如，不能手术的肿瘤、那些更多的接近多个身体系统(血液学和免疫学肿瘤)的那些癌症、和最抵抗传统治疗的那些被认为是最严重的。在这些情况下，延长受试者的预期寿命和/或减轻疼痛，减少癌细胞的比例或者限制细胞于一个系统，以及改善癌症阶段/肿瘤分级/组织学分级/核级被认为是减轻癌症的体征或症状。
本文使用的“症状”一词被定义为疾病、病、损伤或某些在体内不正常的的指示。症状被经历该症状的个人感觉到或注意到，但可能不容易被其他人注意。其他人被定义为非医护人员。
本文所用的“体征”一词也被定义为某些在体内不正常的指示。但体征被定义为可以由医生、护士和其他卫生保健专业人士可以看出的事物。
癌症是一组可以导致几乎所有的体征或症状的疾病。症状和体征将取决于癌症在哪里、癌症的尺寸、它对附近器官或结构有多大的影响。如果癌症传播(发生转移)，那么症状可出现在身体的不同部位。
治疗癌症可导致肿瘤尺寸的减小。肿瘤尺寸的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的大小，肿瘤尺寸被减小5％或更多；更优选地，肿瘤尺寸被减小10％或更多；更优选地，被减小20％或更多；更优选地，被减小30％或更多；更优选地，被减小40％或更多；甚至更优选地，被减小50％或更多；以及最优选地，被减小大于75％或更多。肿瘤尺寸可通过任何可重复测量方式来测量肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。
治疗癌症可导致肿瘤体积的减小。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的大小，肿瘤体积被减小5％或更多；更优选地，肿瘤体积被减小10％或更多；更优选地，被减小20％或更多；更优选地，被减小30％或更多；更优选地，被减小40％或更多；甚至更优选地，被减小50％或更多；以及最优选地，被减小大于75％或更多。肿瘤体积可通过任何可重复测量方式来测量。
治疗癌症可导致肿瘤数量的减少。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的数量，肿瘤数量被减少5％或更多；更优选地，肿瘤数量被减少10％或更多；更优选地，被减少20％或更多；更优选地，被减少30％或更多；更优选地，被减少40％或更多；甚至更优选地，被减少50％或更多；以及最优选地，被减少大于75％或更多。肿瘤数量可通过任何可重复测量方式来测量。肿瘤数量可以通过计数肉眼或在指定的放大率下可见的肿瘤来测量。优选地，指定的放大率是2x、3x、4x、5x、10x、或50x。
治疗癌症可以导致原生肿瘤位点遥远的其它组织或器官的转移病灶数量的减少。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的数量，转移病灶数量被减少5％或更多；更优选地，转移病灶数量被减少10％或更多；更优选地，被减少20％或更多；更优选地，被减少30％或更多；更优选地，被减少40％或更多；甚至更优选地，被减少50％或更多；以及最优选地，被减少大于75％或更多。转移病灶数量可通过任何可重复测量方式来测量。转移病灶数量可以通过计数肉眼或在指定的放大率下可见的肿瘤来测量。优选地，指定的放大率是2x、3x、4x、5x、10x、或50x。
相对于仅接受载体的群体，治疗癌症可以导致接受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了多于30天；更优选地，增加了多于60天；更优选地，增加了多于90天；以及最优选地，增加了多于120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式来测量。群体的平均存活时间的增加可以(例如)通过使用活性化合物治疗开始后计算群体的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加可以(例如)通过使用活性化合物治疗第一轮完成后计算群体的平均存活长度来测量。
相对于未治疗的群体，治疗癌症可以导致接受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了多于30天；更优选地，增加了多于60天；更优选地，增加了多于90天；以及最优选地，增加了多于120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式来测量。群体的平均存活时间的增加可以(例如)通过使用活性化合物治疗开始后计算群体的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加可以(例如)通过使用活性化合物治疗第一轮完成后计算群体的平均存活长度来测量。
相对于接受单药治疗(使用的药物不是本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物)的群体，治疗癌症可以导致接受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了多于30天；更优选地，增加了多于60天；更优选地，增加了多于90天；以及最优选地，增加了多于120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的方式来测量。群体的平均存活时间的增加可以(例如)通过使用活性化合物治疗开始后计算群体的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加可以(例如)通过使用活性化合物治疗第一轮完成后计算群体的平均存活长度来测量。
相对于仅接受载体的群体，治疗癌症可以导致接受治疗的受试者群体的死亡率降低。相对于未接受治疗的群体，治疗癌症可以导致接受治疗的受试者群体的死亡率降低。相对于接受单药治疗(使用的药物不是本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物)的群体，治疗癌症可以导致接受治疗的受试者群体的从死亡率降低。优选地，死亡率降低了多于2％；更优选地，降低了多于5％；更优选地，降低了多于10％；以及最优选地，降低了多于25％。接受治疗的受试者群体的死亡率的降低可以通过任何可重复的方式来测量。群体的死亡率的降低可以(例如)通过使用活性化合物治疗开始后计算每个单位时间内群体的疾病相关死亡的平均数量来测量。群体的死亡率的降低可以(例如)通过使用活性化合物治疗第一轮完成后计算每个单位时间内群体的疾病相关死亡的平均数量来测量。
治疗癌症可导致肿瘤生长率降低。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的数量，肿瘤生长率降低了至少5％；更优选地，肿瘤生长率降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少60％；以及最优选地，降低了至少75％。肿瘤生长率可通过任何可重复测量方式来测量。肿瘤生长率可以根据每个单位时间内肿瘤直径的变化来测量。
治疗癌症可导致肿瘤再生长的降低。优选地，治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于60％；以及最优选地，小于75％。肿瘤再生长可通过任何可重复测量方式来测量。肿瘤再生长的测量(例如)是通过测量治疗后的居前肿瘤收缩后肿瘤直径的增加。治疗停止后肿瘤复发的失败表示肿瘤再生长的降低。
治疗或预防细胞增生疾病可以导致细胞增生率的降低。优选地，治疗后，细胞增生率降低了至少5％；更优选地，降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少60％；以及最优选地，降低了至少75％。细胞增生率可通过任何可重复测量方式来测量。细胞增生率的测量(例如)是通过测量每个单位时间内组织样品中分裂细胞的数量。
治疗或预防细胞增生疾病可以导致增生细胞的比例的下降。优选地，治疗后，增生细胞的比例降低了至少5％；更优选地，降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少60％；以及最优选地，降低了至少75％。增生细胞的比例可通过任何可重复测量方式来测量。优选地，增生细胞的比例例如是通过定量相对于非分裂细胞的数量而言组织样品中分裂细胞的数量来测量。增生细胞的比例可以是等同于细胞有丝分裂指数。
治疗或预防细胞增生疾病可以导致细胞增生面积或区域大小的降低。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的大小，细胞增生面积或区域大小降低了至少5％；更优选地，降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少60％；以及最优选地，降低了至少75％。细胞增生面积或区域大小可通过任何可重复测量方式来测量。细胞增生面积或区域大小可以通过细胞增生面积或区域的直径或宽度来测量。
治疗或预防细胞增生疾病可以导致具有异常外观或形态的细胞的数量或比例的下降。优选地，治疗后，相对于它在治疗之前的数量，具有异常外观或形态的细胞数量降低了至少5％；更优选地，降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少60％；以及最优选地，降低了至少75％。异常细胞的外观或形态可通过任何可重复测量方式来测量。异常细胞的形态可通过显微镜检查例如使用倒置的组织培养显微镜来测量。异常的细胞形态可以采取核多形性的形式。
本文使用的“选择性地”一词是指倾向于在一个群体中比另一个群体中以更高的频率发生。比较的群体可以细胞群体。优选地，本发明的化合物、或药学上可接受的盐或其溶剂化物选择性地对癌症或癌前细胞起作用，但不作用于正常细胞。优选地，本发明的化合物、或药学上可接受的盐或其溶剂化物选择性地调节一种分子靶(例如，靶蛋白甲基转移酶)，但不显著调节另一种分子靶(例如，非靶蛋白甲基转移酶)。本发明还提供了一种选择性地抑制酶(如蛋白质甲基转移酶)的活性的方法。优选地，如果相对于群体B，它发生在群体A的频率超过2倍以上，那么相对于群体B，事件选择性地发生在群体A。如果在群体A中发生的频率大于5倍以上，那么事件选择性地发生。如果相对于群体B，在群体A中发生的频率大于10倍以上；更优选地，在群体A中发生的频率大于50倍；甚至更优选地，在群体A中发生的频率大于100倍；以及最优选地，在群体A中发生的频率大于1000倍以上，那么事件选择性地发生。例如，如果细胞死亡相对于正常细胞在癌症细胞中发生的频率多于2倍，细胞死亡被说是选择性地发生在癌症细胞中。
本发明组合物(例如化合物44或其药学上可接受的盐)和一种或多种其它的治疗药物(如强的松)可以调节分子靶标(例如靶蛋白甲基转移酶)的活性。调节是指刺激或抑制分子靶标的活性。优选地，如果相对于分子靶标在相同的条件下仅缺乏本发明的化合物的存在时的活性，分子靶标的活性被刺激或抑制了至少2倍，那么本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物调节分子靶标的活性。更优选地，如果相对于分子靶标在相同的条件下仅缺乏本发明的化合物的存在时的活性，分子靶标的活性被刺激或抑制了至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，那么本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物调节分子靶标的活性。分子靶标的活性可以用任何可重复的方法测量。分子靶标的活性可以在体外或体内测量。例如，分子靶标的活性在体外可以通过酶活性试验或DNA结合试验测量，或分子靶标的活性在体内可以通过报告基因的表达试验来测量。
优选地，如果相对于分子靶标在相同的条件下但仅缺乏本发明的化合物的存在时的活性，所述化合物的加入不能刺激或抑制分子靶标的活性超过10％，那么本发明的化合物不能显著地调节分子靶标的活性。
本文使用的术语“同功酶选择性”是指相比酶的第二同种型，优先抑制或刺激酶的第一同种型(例如相比蛋白质甲基转移酶的同工酶β，优先抑制或刺激蛋白质甲基转移酶同工酶α)。优选地，本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物，在实现生物效应所需的剂量中显示出最小4倍差异，优选是10倍差异，更优选是50倍差异。优选地，本发明的化合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物，显示出这种横跨抑制范围的差别，且该差别的示例为IC50，即，对于感兴趣的分子靶标50％的抑制。
向对其有需要的细胞或受试者给予本发明的组合物可导致感兴趣的蛋白甲基转移酶活性的调节(即刺激或抑制)。
向对其有需要的细胞或受试者给予本发明的化合物(例如包含化合物44或其药学上可接受的盐的组合物)和一种或多种其它治疗剂(如强的松)导致细胞内靶标(如底物)活性的调节(即刺激或抑制)。几个细胞内靶标可以使用本发明的化合物、包括但不限于蛋白质甲基转移酶来调节。
激活是指放置物质组合物(例如蛋白质或核酸)进入适合执行期望的生物学功能的状态。能够被激活的物质组合物也具有非激活的状态。激活的物质组合物可以具有抑制或刺激的生物学功能或两者。提高是指物质组合物(例如蛋白质或核酸)的期望的生物学活性的增加。提高可以发生在物质组合物浓度增加的过程中。
本文使用的“细胞周期关卡通路”是指涉及细胞周期关卡调节的生物化学通路。细胞周期关卡通路可以在包括细胞周期关卡的一个或多个功能中具有刺激或抑制效应或两者都是。细胞周期关卡通路是由至少两种物质组合物(优选是蛋白质)构成，其中两种都对细胞周期关卡的调节有贡献。细胞周期关卡通路可以通过细胞周期关卡通路中一个或多个成员的激活来激活。优选地，细胞周期关卡通路是生物化学信号通路。
本文使用的“细胞周期关卡调节子”是指可以至少部分在细胞周期关卡调节中起作用的物质组合物。细胞周期关卡调节子在包括细胞周期关卡的一个或多个功能上可以具有刺激或抑制效应或两者都是。细胞周期关卡调节子可以是蛋白质或不是蛋白质。
治疗癌症或细胞增生性病症可导致细胞死亡，并且优选地细胞死亡导致群体中细胞数量减少至少10％。更优选地，细胞死亡是指减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；最优选地，减少至少75％。群体中细胞数量可以通过任何可重复的方式来测量。群体中细胞数量可以通过荧光激活细胞分选(FACS)、免疫荧光显微镜和光学显微镜来测量。测量细胞死亡的方法显示在李等人，美国国家科学院院刊，100(5):2674-8，2003(Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.100(5):2674-8,2003)。在一个方面，细胞死亡通过细胞凋亡发生。
优选地，本发明的组合物或药学上可接受的盐或其溶剂化物的有效量是对正常细胞没有显著的细胞毒性。如果给予治疗有效量的化合物不会引起正常细胞大于10％的细胞死亡，那么治疗有效量的化合物对正常细胞没有显著的细胞毒性。如果给予治疗有效量的化合物不会引起正常细胞大于10％的细胞死亡，那么治疗有效量的化合物不会显著地影响正常细胞的生存能力。在一个方面，细胞死亡通过细胞凋亡发生。
使细胞接触本发明的组合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物可选择性地诱发或激活癌细胞的细胞死亡。向对其有需要的受试者给予本发明的化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物可选择性地诱发或激活癌细胞的细胞死亡。使细胞接触本发明的组合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物可选择性地诱发受细胞增生性病症影响的一种或多种细胞的细胞死亡。优选地，向对其有需要的受试者给予本发明的组合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物选择性地诱发受细胞增生性病症影响的一种或多种细胞的细胞死亡。
本发明涉及通过向对其有需要的受试者给予本发明的组合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物来治疗或预防癌症的方法，其中，给予本发明的组合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物导致以下项中的一个或多个：通过在细胞周期的一个或多个阶段(例如，G1期、G1/S期、G2/M期)中的细胞累积、或诱导细胞的衰老、或促进肿瘤细胞分化来阻止癌细胞的增生；通过细胞毒性、坏死或凋亡促进癌细胞的细胞死亡，而不引起大量正常细胞的细胞死亡，且在动物中抗肿瘤活性具有至少2的治疗指数。本文所用的“治疗指数”是由有效剂量除最大耐受剂量。
本领域的技术人员可以参考一般参考文献中在此讨论的已知技术或等效技术的详细说明。这些文献包括Ausubel等人，分子生物学现代方法(Current ProtocolsinMolecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.)(2005)；Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)(第三版)，纽约州冷泉港的冷泉港出版社(2000年)；Coligan等人，免疫学现代方法(CurrentProtocols in Immunology)，纽约约翰威利父子公司；恩纳(Enna)等人，药理学现代方法(Current Protocols in Pharmacology)，纽约约翰威利父子公司；Fingl等人，治疗学的药学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)(1975)，雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，宾夕法尼亚州伊斯顿的Mack出版公司，第18版(1990)。当然，这些文献也可以在建立或使用本发明的一个方面提及。
实例1
EZH2抑制剂和糖皮质激素的协同抗肿瘤活性
化合物44的合成描述于美国专利号8,410,088中，其通过引用以其全文特此结合。
当化合物44(Cpd 44)仅与CHOP的糖皮质激素受体激动剂(GRag)泼尼松龙或与其它GRag如地塞米松组合时观察到显著的协同作用。当与CHOP组合时化合物44的抗增生效应被大大地增加了，且这种协同作用的大部分可以归因于CHOP的GRag成分泼尼松龙(强的松的活性代谢物)。引人注目地，化合物44和泼尼松龙的组合延伸了对EZH2抑制敏感的细胞的范围，从仅仅携带突变的GCB NHL细胞延伸至所有GCB NHL细胞。
两个EZH2突变体细胞系(WSU-DLCL2和SU-DHL10)使用化合物44预处理4天，然后使用化合物44和单独CHOP组分共处理另外的3天(4+3模型)。马磷酰胺(环磷酰胺的类似物)、阿霉素和长春新碱都自身显示出在突变体细胞系中浓度依赖性的生长抑制。因此，在与化合物44组合时获得它们药物的组合指数(使用Calcusyn软件计算的CI)。然而，这些细胞系它们自身没有显示对泼尼松龙(强的松的活性代谢物)的敏感性。因此，在这种情况下不能确定CI，反而基于使用泼尼松龙的浓度响应曲线观察的化合物44的IC50的变化计算出效力的增加。
化合物44和马磷酰胺的组合导致在两个EZH2突变体细胞系中的总体加成组合益处(图1C、1F)。在WSU-DLCL2细胞中化合物44和阿霉素的组合在4+3模型中起到协同作用(图1A)，同时这个组合在SU-DHL10细胞中具有加和性(图1D)。化合物44和长春新碱的组合在两个EZH2突变体细胞系中显示加和性(图1B、1E)。当使用泼尼松龙和化合物44的组合处理WSU-DLCL2细胞时，观察到比化合物44大9倍的效力转变。使用不同的GRag(地塞米松)处理导致甚至更大的转变，是化合物44的IC50的17倍(图2中的A、B)。在SU-DHL10细胞中观察到化合物44效力转变的类似趋势(图2中的C、D)。
调查了化合物44和CHOP的组合效应是否使得野生型EZH2淋巴瘤细胞系对化合物44敏感。因为化合物44单独治疗不会诱发EZH2野生型淋巴瘤系的生长抑制，基于CHOP组分各自的浓度响应曲线来计算效力的转变。在测试的CHOP组分中，仅仅GRag和化合物44的组合导致了野生型GCB淋巴瘤细胞系的效力转变。
下一步调查了化合物44和CHOP的组合效应是否可以使得EZH2突变体和野生型细胞系、WSU-DLCL2 EZH2突变体(图3A、3B)和DOHH2 EZH2野生型(图3C、3D)GCB淋巴瘤细胞系对化合物44敏感。使用泼尼松龙和化合物44组合处理WSU-DLCL2细胞导致了化合物44活性的增加(图3A)，且化合物44的IC50降低了最大24倍。使用不同的GRag(地塞米松)处理导致化合物44的IC50降低甚至更多即30倍(图3B)。在1μM泼尼松龙和100nM地塞米松的生物学相关浓度，效力分别增加了7倍和15倍。化合物44在DOHH2 EZH2野生型细胞中作为单一药剂没有显示抗增生作用(图3C、3D)，因此测定了泼尼松龙或地塞米松的效力转变。有趣地，当在野生型GCB淋巴瘤细胞系(DOHH2)中测试化合物44，仅仅CHOP的GRag组分在化合物44存在下显示出增加的效力(图3C、3D)。在DOHH2细胞中加入化合物44，泼尼松龙或地塞米松的效力增加(图3C、3D)。
鉴于相对于单个药剂，GRag和EZH2i组合在EZH2野生型和突变体GCB淋巴瘤细胞系中诱发了大大增加的抗增生效应，确定了化合物治疗的持续时间和/或添加的顺序是否影响敏感性。细胞系组也被延伸至包括EZH2野生型、EZH2突变体、化合物44敏感型、以及EZH2突变体、化合物44不敏感型细胞系(以前被麦凯布(McCabe)等人报道，和内部未发表数据)。在之前的4+3模型中，效力转变是基于化合物44(在EZH2 Y646(也被称为Y641)敏感型细胞系中)或泼尼松龙(在EZH2野生型细胞系中)的暴露。对于这组实验，在泼尼松龙的固定浓度下化合物44IC50的转变被用于确定接受4+3模型、4天或7天共处理、或4天泼尼松龙前处理加3天共处理的处理的细胞系中的组合益处。当EZH2突变体、化合物44敏感型细胞系被共处理4天时，观察到化合物44IC50降低30-60倍，显示了与4+3处理方案相似的趋势(表1)。使用7天共处理和4+3模型观察到了相似的结果(表1)。在EZH2野生型GCB细胞系中，尽管4天后没有产生可测量的化合物44IC50，但是在与泼尼松龙共处理4天后两个细胞系都显示出降低的增生和可测量的化合物44IC50(表1)。EZH2野生型GCB细胞也响应4+3模型和/或7天共处理方案(表1)。引人注目地，EZH2突变体、化合物44不敏感细胞系，处理4天后也不显示可测量的化合物44IC50，而共处理4天后显示降低的增生，使用4+3处理方案以及7天共处理对该组合显示出更大的响应(表1)。当使用泼尼松龙预处理细胞，然后使用化合物44和泼尼松龙共处理，这些细胞系中仅仅一个细胞系显示组合益处，表明药物添加的顺序对协同效应是重要的(表1)。
表1.化合物44/GRag组合在EZH2 Y646(Y641)细胞系中增加EZH2i敏感性并且在抵抗EZH2i的细胞系中克服EZH2i的不敏感性
Figure BDA0004036739770000261
为了评估对在这些细胞系中观察到的化合物44和GRag的组合益处响应的潜在机制，我们确定了在WSU-DLCL2、OCI-LY19、和RL细胞中单独或组合使用化合物44处理4天后泼尼松龙处理是否影响H3K27整体的甲基化和乙酰化。单一药剂泼尼松龙在WSU-DLCL2或RL细胞中对H3K27Me3水平没有效应，但是在OCI-LY19细胞中更高的剂量的确增加H3K27Me3水平(图9A)。由于OCI-LY19细胞对泼尼松龙的高敏感性，相对于泼尼松龙不敏感的EZH2突变体系，更低的泼尼松龙剂量对于处理OCY-LY19细胞是必要的。泼尼松龙的加入不会改变任何细胞系中对H3K27Me3抑制的化合物44IC50(图9A)。同样地，整体的H3K27乙酰化水平不会被泼尼松龙或化合物44与泼尼松龙组合的影响(图9B、9C和9D)。
已经发现H3K27乙酰化或三甲基化的整体水平不被影响，研究了GR信号通路的转录调节。使用化合物44、泼尼松龙、或其组合的单一浓度处理WSU-DLCL2、SU-DHL10、RL、SU-DHL4、OCI-LY19、和DOHH2细胞4天，且使用糖皮质激素信号PCR试验分析基因表达(表4)。总体上在所有细胞系中使用泼尼松龙和组合治疗很多的基因被下调了，表明GR在基因表达中起到激活剂和抑制剂的作用。这里聚焦了GR的激活功能且描述了在细胞系组中使用组合治疗具有协同上调的3个基因。一个抑制mTOR信号(ref)的候选肿瘤抑制基因瑟斯崔因(SESN1)在4个EZH2突变体细胞系中(而不是在EZH2野生型细胞系中)使用组合治疗以协同作用的方式被识别为通常上调的基因(图8A和表2)。TNF表达仅仅在两个EZH2突变体、化合物44不敏感的细胞系(SUDHL4)的一个中被协同地上调，且其它EZH2突变体、化合物44不敏感的细胞系(RL)的趋势显示了相同的结果(图8B和表2)。TSC22D3/GILZ的表达在所有细胞系中被泼尼松龙上调，但在EZH2突变体化合物44敏感型细胞中仅被组合治疗协同地提高(图8C和表2)。
表2：基因表达数据的统计分析描述在图8
Figure BDA0004036739770000262
Figure BDA0004036739770000271
成对统计比较采用双尾t检验进行。
ns：不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001
对于EZH2野生型(即OCI-LY19、DOHH2)、EZH2 Y646-敏感型(即WSU-DLCL2、SUDHL10)和EZH2 Y646抗性(即RL、SUDHL4)细胞系，在使用指示的化合物44、泼尼松龙、化合物44和泼尼松龙龙的组合或DMSO处理后，测量了归一化至DMSO对照的糖皮质激素受体的表达水平(2个生物学重复，详情请参见方法材料和方法第5部分)。如结果显示，糖皮质激素受体表达水平在细胞系中通常不受该组合的影响。(图19)使用ΔΔCt法和ACTB、B2M和GAPDH作为参考基因定量了倍数变化值。
然后检查了从CHOP方案删除一个或多个化学治疗组分在两个另外的异种移植研究中的效果。使用化合物44、COP(没有阿霉素组分的化学治疗)或它们的组合处理携带SUDHL10(EZH2 Y646F)异种移植物的小鼠28天(图20A)。比较了在第28天处死的8/16只小鼠的平均肿瘤重量，表明各组之间肿瘤重量存在显著差异
(双尾t检验，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。给予小鼠最大耐受剂量的化合物44或化合物44/COP的组合物显示在第60天100％存活，该组合物组显示最小的第28天肿瘤重量，与所有其它治疗组(包括化合物44的最大耐受剂量组)存在统计学上的差异(p<0.05)(图20A)。
然后，我们调查了在SUDHL10异种移植模型中化合物44与强的松的组合给药持续28天，其中在两个不同方案中使用两个剂量的化合物44或强的松(在第1-5和第22-26天，Pred-1＝强的松0.15mg/kg BID x 5；Pred-2＝强的松0.15mg/kg BID x 28)。如体外实验数据显示，单独的强的松给药不会诱发任何有意义的抗肿瘤效果(图20B)。与以前的研究一致，125mg/kg BID(每日两次)剂量的化合物44只产生部分响应，但是化合物44与0.15mg/kgBID的强的松(不是2个周期的强的松方案)组合给药诱发了使用更高剂量的单独化合物44所能达到的最大可能消退。所有给药小鼠的体重显示在图20C。
如在方法中说明，使用化合物44、COP(没有阿霉素成分的化学治疗)、或其组合处理携带SUDHL-10(EZH2 Y646F)异种移植的小鼠28天。比较了在第28天处死的8/16只小鼠的平均肿瘤重量，表明各组之间肿瘤重量存在显著差异(双尾t检验，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。B)在两个不同方案中使用两个剂量的化合物44或强的松处理携带SUDHL10((EZH2 Y646F)异种移植物的小鼠28天(在第1-5和第22-26天，Pred-1＝强的松0.15mg/kgBID x 5；Pred-2＝强的松0.15mg/kg BID x 28)。两种化合物如指示的组合给药。在顶部图绘制了平均肿瘤体积±SEM(n＝10)。所有被给予EPZ-6438的组在肿瘤生长方面显示统计学上显著的降低(至少p<0.01，在两个方案中相对于运载体或强的松单一药剂；重复测量ANOVA、邓尼特事后检验(Dunnett’s post test))，而相比运载体，强的松单一药剂不会引起任何显著的抗肿瘤效果。
表3.与化合物44组合的汇总
Figure BDA0004036739770000281
最后，在3个不同的EZH2突变体淋巴瘤异种移植模型中评估了肿瘤生长抑制。使用化合物44和化学治疗(CHOP或COP(没有阿霉素的CHOP))共同处理SCID或携带皮下淋巴瘤异种移植物的裸鼠，且与单一药剂处理进行了比较。在携带WSU-DLCL2异种移植物的小鼠中，所有化合物44剂量和应用的方案实现了肿瘤生长抑制，且比单独的CHOP化学治疗更好(图7A)。同时，化合物44与CHOP组合疗法诱发了强的抗肿瘤应答且比单独的任何单一药剂(p<0.001)(对于CHOP和化合物44分别是45％和71％)显著地更好的肿瘤生长抑制(93％)。所有单一治疗都被耐受；在第一个周期后化合物44/CHOP组合物组的有小的体重损失(11.3％)，其后小鼠在下一个周期治疗前恢复了。
在SU-DHL6异种移植模型中，使用单独的CHOP或化合物44没有观察到显著的肿瘤生长抑制(图7B，顶部图)，与贝格兰(Beguelin)等人之前使用EZH2抑制剂GSK503发表的结果形成对比。引人注目地，化合物44/CHOP的组合导致肿瘤消退。当在第28天停止给药且小鼠的肿瘤生长延迟被观察到第60天时，这个组合导致58％的小鼠无肿瘤地存活(图7B，底部图)。
CHOP的阿霉素组分具有因为它的心脏毒性具有<550mg/m2的终生累积剂量限制。因此，调查了排除这个组分的化合物44/化学治疗方案的组合益处。在第三个研究中，使用增加剂量的化合物44(BID)、无阿霉素的化学治疗方案(COP)、或COP和化合物44的组合处理携带SU-DHL10异种移植物的小鼠28天，在所有化合物44剂量和包含COP的组中观察到肿瘤生长抑制(图7C，顶部图)。如通过重复测验ANOVA和邓尼特事后检验评估的，266mg/kg、532mg/kg以及COP/化合物44组合治疗导致与运载体显著不同的消退(p>0.001)，其中化合物44/COP组合物组显示出最好的总体响应。给药28天后，具有最小肿瘤负荷的小鼠亚组(每组8只小鼠)保持存活，没有针对肿瘤生长延迟终点的进一步给药。使用化合物44处理的小鼠具有明显的剂量依赖性肿瘤生长延迟益处，而COP治疗的肿瘤比化合物44处理的那些进展要更快(图7C，中部图)。给予小鼠最大耐受剂量的化合物44或化合物44/COP的组合物显示在第60天100％存活，而组合物组显示最小的终点肿瘤重量，与所有其它治疗组(包括化合物44的最大耐受剂量组)存在统计学上的差异(p>0.05)(图7C，底部图)。
B细胞NHL的标准治疗是组合化学治疗方案，该方案包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙。完全响应率可以达到40％-50％，很大比例的患者旧病复发，而3年总体存活率仅为约30％。复发的淋巴瘤可以对很大范围的抗癌药物显示耐药性，其给临床上管理这些激进的恶性肿瘤提出了严峻的挑战。在淋巴瘤中获得耐药性的部分原因是由于肿瘤细胞的遗传异质性和不稳定性。从而，化疗抗性NHL的成功治疗将需要药物的合理组合，这些药物靶向对B细胞NHL不同亚型特异的多种途径。例如，在活化的B细胞型淋巴瘤中，NFkB途径的组成型活化已经涉及治疗耐药性，且几种新型靶向疗法已经在这种亚型显示出潜力。
表观遗传效应物，如多梳蛋白(polycomb)，也被牵连于癌细胞的化疗耐药性。多梳蛋白抑制复合物2(PRC2)的催化亚基EZH2是生发中心起源的B细胞淋巴瘤中的关键的致癌因子。这些更原始的B细胞恶性肿瘤，尤其是表达EZH2突变体具有改变的催化活性的变体需要EZH2来增生和存活。从临床前研究获得的结果预测EZH2抑制剂治疗这种遗传定义的癌症具有很大的潜力，且EZH2抑制剂也可缓和化学治疗耐药性。本文展现的数据显示临床阶段EZH2抑制剂化合物44与CHOP的组分一起显示出从加和效应到协同效应的不同程度的组合益处。那些组合益处被特异地在生发中心起源的淋巴瘤中发现，并且在环磷酰胺、阿霉素和长春新碱的情况下，被限制在携带EZH2突变体的细胞中。当化合物44与CHOP在体内共同给药时，在杀死淋巴瘤细胞方面也发现显著的协同作用。在SU-DHL6异种移植模型中尤其是这样，其中单一药剂都没有显示显著的抗肿瘤活性，但是该组合在>50％的小鼠中诱发了持续的消退。这重申了过于活跃的EZH2在EZH2突变体淋巴瘤的化疗耐药性中潜在的重要性。在CHOP组分中，化合物44与强的松的组合诱发了最强的抗增生活性，且无论EZH2突变的状态如何，该组合也可以使不敏感的GCB淋巴瘤细胞系对EZH2抑制敏感。另外地，当化合物44与强的松一起给药或以特定顺序的方式给药时这种组合益处更加明显；因而，使用EZH2抑制剂致敏细胞，接着使用GR激动剂处理证明特别有效。这个意外的发现对于在临床上应用EZH2抑制剂具有潜在的重要意义。首先，广泛使用的GRag通常与抗癌药物共同给药以防止药物引发的过敏反应并减轻疼痛、恶心和呕吐，而且它们在治疗造血系统的恶性肿瘤中很关键，因为它们在这些癌症中具有诱发细胞凋亡的能力。相比其它的CHOP组分，GRag诱发了最少的严重副作用。同时，如在SU-DHL10异种移植模型中的数据显示，在保留与化合物44的组合益处的同时，从CHOP方案中排除阿霉素的机会可以让患者免受阿霉素的剂量限制的心脏毒素副作用。最后，临床前研究显示单一药剂EZH2抑制剂仅在携带EZH2突变体的淋巴瘤(其代表一部分(20％)具有高的未满足的临床需求的GCB淋巴瘤患者)中诱发显著的细胞死亡。在此的这些结果显示GRag/EZH2抑制剂组合可能在所有生发中心起源的B细胞淋巴瘤中具有临床实用性。
结合糖皮质激素的GR分子移动至细胞核并可以作为转录激活子或抑制子起作用，这取决于细胞环境。已经表明，GR不断地采集核小体以产生相互作用，且染色体修饰酶的目的是给DNA提供GR的受调节的接近、它的辅因子和基本的转录机制。其它研究显示GR经常结合至原有的开放染色质区域，并识别在给定的细胞类型中的染色质结构使得GR可以以组织特异性方式起作用。GR结合位点的可及性可以通过ATP依赖性的染色质重塑进一步提高，并且SWI/SNF复合物在这个活动中起到关键的作用。不想被特定的理论或具体的机制约束，可想象的是，由EZH2介导的H3K27超三甲基化诱发的异常染色质抑制可以阻止一些其他可及的GR结合位点，干扰正常GR介导的基因诱导或抑制。事实上，所有EZH2突变体淋巴瘤细胞系对GRag治疗不敏感，而在EZH2野生型细胞中观察到浓度依赖性的细胞死亡。使用泼尼松龙预处理，接着使用化合物44处理在几乎所有测试的细胞系中不会诱发协同作用，该观察指出EZH2抑制剂诱导的染色质重塑的可能是GR增加活性的速率限制性步骤。另外，PRC2已知与SWI/SNF功能拮抗，并且SWI/SNF复合物的核心亚基(SMARCA4、ARID1A与INI1)的下调与急性淋巴母细胞性T细胞白血病中对泼尼松龙的耐药性有关联。由于INI1损失和EZH2过度激活的关系已经在横纹肌样瘤中建立，调查了是否整体INI1蛋白质水平将在暴露于化合物44和泼尼松龙的各种淋巴瘤细胞中增加，这在SWI/SNF功能增加后潜在地允许GR更多地接近它的结合位点。
GR通路基因表达试验揭示使用化合物44、泼尼松龙和它们的组合处理几种GCB淋巴瘤细胞(EZH2野生型和突变型)后增加和减少的基因表达确认了GR的双向功能。在所有EZH2突变体淋巴瘤细胞中与该组合协同上调的唯一基因是SESN1，它是对DNA损伤和氧化胁迫具有细胞响应功能的TP53肿瘤抑制子。瑟斯崔因通过激活AMP活化的蛋白激酶、导致mTOR通路的抑制来抑制细胞生长。因此，SESN1介导的mTOR通路抑制可以是化合物44处理后在EZH2突变体淋巴瘤细胞中重新引入GRag敏感性的重要机制。
相反地，GRag/化合物44组合治疗也可以在被报道为对EZH2抑制剂治疗顽固的那些EZH2突变体淋巴瘤细胞系(RL、SU-DHL4)中诱导细胞死亡。使用组合治疗，SESN1也在那些细胞系中被诱导，但是尤其是在RL和SU-DHL4细胞中观察到另外的TNF(强的炎性细胞因子)协同上调。这一观察似乎令人惊讶，因为TNF和糖皮质激素通常拮抗作用。TNF通过它的受体TNFR-1可以诱导细胞凋亡，但是也具有转换生存信号的能力，主要是通过NFkB通路。因而，有可能在GR激动剂抑制NFkB介导的转录的背景下由化合物44/泼尼松龙组合诱导的增加的TNF表达可以转变TNF作用朝向细胞凋亡。然而，为什么在化合物44不敏感的EZH2突变体细胞中这种机制会导致协同的细胞死亡还不清楚。我们观察到的GILZ在使用该组合的6个细胞系的2个中被协同地上调，其进一步支持了在GRag耐药性中NFkB通路的负调节因子的异常抑制的潜在重要性和介导它的EZH2的潜在作用。
方法
培养基通量试验
淋巴瘤细胞被接种进烧瓶(WSU-DLCL2和DOHH2为50,000细胞/mL，SU-DHL10为10,000细胞/mL，以及特莱多为100,000细胞/mL)，并且使用7个剂量的化合物44预处理或使用DMSO预处理4天或对于特莱多试验预处理6天。然后细胞分为50,000细胞/mL(WSU-DLCL2和DOHH2)或30,000细胞/mL(SU-DHL-10)，并且使用HP D300数字分配器(Tecan)用化合物44和感兴趣的化合物共处理。两种药物进行连续稀释2倍，并在跨平板的斜对角具有恒定比率的矩阵中进行组合，最终DMSO含量为0.11％(v/v)。共处理3天(对于特莱多试验是5天)后，通过ATP含量使用CellTiter-
Figure BDA0004036739770000311
(Promega公司)测量了细胞活力，并且使用SpectraMax M5酶标仪(分子器件公司(Molecular Devices))检测了发光。
使用Chou-Talalay方法对药物组合进行了协同作用定量(参考文献1)。组合指数(CI)方程式提供了加和作用(CI＝1)、协同作用(CI<1)和拮抗作用(CI>1)的数量定义。此公式采用来自恒定比例的药物组合的分数效应(Fa)值来确定CI值。所得的曲线图(Fa-CI曲线图)示出了由95％置信区间括号内的所得CI值。这些Fa-CI曲线图是使用Windows软件Calcusyn产生的(参考文献2)。CI值<1且置信区间线也低于1表明统计学上显著的协同作用。
用于药物组合，其中只有一种药物显示出超过50％的抑制，对效力位移进行了测定。剂量响应使用图板棱柱(GraphPad Prism)作图，并且50％或60％的抑制浓度从剂量响应曲线内推。当剂量响应的置信区间不重叠时，效力位移被认为是显著的。
细胞系、化合物、和治疗概述
WSU-DLCL2、SU-DHL10、RL、SU-DHL4、OCI-LY19和DOHH2在以前描述过(自然化学生物学(NatChemBio)，2012)。对于组合物研究，使用我们在悬浮细胞中增生测定的修改版本，如先前所述(Daigle等人，癌细胞(Cancer Cell)，20卷，1.53-65页(2011)；Daigle等人，血液(Blood)121，13，2533-2541(2013))。简要地说，在第0天，将细胞一式三份以初始密度接种于96孔平板，以确保4天以上的线性对数生长期。使用化合物44的任一剂量曲线(在1μM的顶剂量开始)、泼尼松龙(目录号和制造商)的单剂量(比该药物的第4天IC50低10倍以上的浓度)或化合物44和泼尼松龙的组合处理细胞。在第4天，在番石榴easyCyte流式细胞仪中使用Viacount试剂计数细胞，并且活细胞数目用于以原始密度重新铺板细胞另外3天。使用化合物44预处理的细胞接受连续的单独的化合物44或化合物44与泼尼松龙的组合(恒定剂量)；接受泼尼松龙预处理的细胞接受连续的泼尼松龙或泼尼松龙和化合物44的组合；共处理4天的细胞继续接受7天的共处理。
异种移植研究
所有涉及到动物处理的过程，本研究中的护理和治疗方法是根据CRL皮埃蒙特和上海化学伙伴的机构动物护理和使用委员会(IACUC，Institutional Animal Care andUse Committee(IACUC)of CRL Piedmont and Shanghai ChemPartner)核准的准则以及实验动物管理评估和评审委员会(AAALAC，Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)的指导意见进行。WSU-DLCL2、SU-DHL6或SU-DHL10细胞在中期对数生长期间收获，并重新悬浮于含有50％基质胶TM(BD Biosciences公司)的PBS中，并注射到免疫缺陷小鼠中。每只小鼠在右胁皮下接受1×107个细胞(0.2毫升细胞悬浮液)，且一旦肿瘤达到预定大小，小鼠在不同时间口服不同剂量的化合物44持续至28天和/或按以下方案服用CHOP/COP：环磷酰胺经腹腔(i.p.)给药，且阿霉素和长春新碱分别经推注尾静脉注射(i.v.)给药；在SU-DHL6研究中在第1天和第8天每种每天给药一次，在WSU-DLCL2和SU-DHL10研究中在第1天和第22天每种每天给药一次。强的松经口服给药进行两个5天剂量的周期，在SU-DHL6研究中起始于第1和8天((qd×5)×2，第1和8天)，并且在WSU-DLCL2和SU-DHL10研究中在第1和22天((qd×5)×2，第1和22天)。每个剂量被递送0.2mL/20g小鼠(10mL/kg)的体积，并针对各个动物的最后记录的重量进行调整。每周两次收集肿瘤测量和体重，所有研究持续28天。为了在SU-DHL10和SU-DHL6研究中确定肿瘤生长延迟，当肿瘤达到2000立方毫米的终点体积或在研究的最后一天(第60天)(无论哪种情况居先)对每个测试动物实施安乐死。
定量PCR
使用DMSO、1μM化合物44(SU-DHL10使用100nM化合物44处理)、低于4天IC50 10倍浓度的泼尼松龙、或药物的组合平行处理WSU-DLCL2、SU-DHL10、RL、SU-DHL4、OCI-LY19和DOHH2细胞4天。细胞被收集且总mRNA使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen；74134)从细胞沉淀中提取。对于RT2糖皮质激素信号PCR试验(RT2 Glucocorticoid Signaling PCR array)(Qiagen；PAHS-154ZE-4)，使用RT2第一链试剂盒(RT2 First Strand Kit)(Qiagen；330401)制备cDNA。使用RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix(Qiagen；330521)，在ViiA7实时PCR系统[应用生物系统公司(Applied Biosystems)(AB)]上进行阵列RT-PCR分析。基因表达归一化至阵列的B2M且使用ΔΔCt方法计算相对于DMSO的倍数变化。为了验证阵列中的数据，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix(AB；4444964)和针对瑟斯崔因(AB；Hs00902787_m1)和TNF(AB；Hs01113624_m1)的TaqMan引物/探针组来执行基于TaqMan探针的qPCR。如上述计算倍数变化，归一化至RPLPO(AB；4333761F)。
ELISA
如上所述，组蛋白从肿瘤样品中提取。以当量浓度在涂层缓冲液(PBS+0.05％BSA)中制备组蛋白，得到0.5ng/μl的样品，并将100μl的样品或标准品一式两份加入到2个96孔ELISA板(热实验室系统公司(Thermo Labsystems)，Immulon4HBX#3885)。将平板密封并在4℃温育过夜。第二天，使用300μl/孔PBST(PBS+0.05％ Tween 20；10X PBST，KPL#51-14-02)在Bio Tek洗板器上洗涤平板3次。用300μl/孔稀释液(PBS+2％ BSA+0.05％ Tween 20)封闭平板，在室温下温育2小时，并用PBST洗涤3次。所有抗体在稀释液中稀释。100μl/孔的抗H3K27me3(CST#9733，50％甘油储液1:1,000)或抗总H3(Abcam ab1791，50％甘油1:10,000)被添加到每个平板。平板在室温温育90分钟并使用PBST洗涤3次。将100μl/孔的抗Rb-IgG-HRP(细胞信号技术公司(Cell SignalingTechnology)，7074)以1:2,000加入到H3K27Me3平板并以1:6,000加入到H3平板，并在室温温育90分钟。将平板在PBST中洗涤4次。对于检测，加入100μl/孔TMB底物(BioFx实验室公司(BioFx Laboratories)，#TMBS)并且将平板在室温暗处温育5分钟。使用100μl/孔1N H2SO4停止反应。在SpectraMax M5酶标仪上读取450nm的吸光值。
表4a.对OCI细胞系进行的RT2糖皮质激素信号PCR阵列分析的Ct值和倍数变化。
Figure BDA0004036739770000331
Figure BDA0004036739770000341
表4b.对DOHH2细胞系进行的RT2糖皮质激素信号PCR阵列分析的Ct值和倍数变化。
Figure BDA0004036739770000351
2104567-FI-IP-EPIZYM
Figure BDA0004036739770000361
Figure BDA0004036739770000371
表4c.对WSU细胞系进行的RT2糖皮质激素信号PCR阵列分析的Ct值和倍数变化。
Figure BDA0004036739770000381
Figure BDA0004036739770000391
Figure BDA0004036739770000401
表4d.对SUDHL10细胞系进行的RT2糖皮质激素信号PCR阵列分析的Ct值和倍数变化。
Figure BDA0004036739770000411
Figure BDA0004036739770000421
Figure BDA0004036739770000431
表4e.对RI细胞系进行的RT2糖皮质激素信号PCR阵列分析的Ct值和倍数变化。
Figure BDA0004036739770000441
Figure BDA0004036739770000451
Figure BDA0004036739770000461
表4f.对SUDHL4细胞系进行的RT2糖皮质激素信号PCR阵列分析的Ct值和倍数变化。
Figure BDA0004036739770000471
2104567-FI-IP-EPIZYM
Figure BDA0004036739770000481
Figure BDA0004036739770000491
实例2.
化合物44和依维莫司协同作用增强在EZH2突变WSU-DLCL2细胞中G1期的细胞周期阻滞和在野生型EZH2 SU-DH-L5细胞中的细胞凋亡
在图11的图B和E中，每个点代表在细胞凋亡早期和晚期门控细胞百分比的平均值(膜联蛋白-V阳性，平均值+/-S.D.，n＝3)。在图C和F中，渐进曲线上的点代表门控细胞的DNA含量的平均百分比(PI阳性，平均值+/-S.D.，n＝2)。在图A中，使用化合物44和依维莫司的组合以400:1的恒定比例处理WSU-DLCL2细胞。该组合被证明诱导很强的协同作用，CI值为0.34-0.003。在图B)中，在使用化合物44(500nM)、依维莫司(5nM)或组合在同一浓度处理的WSU-DLCL2细胞中评估细胞凋亡水平。没有观察到WSU-DLCL2细胞凋亡的增加。在图C中，相比单独的化合物44，共处理后观察到细胞周期G1期显著的增加。在图D中，组合以4000:3的恒定比例处理SU-DHL-5细胞。该组合被证明诱导很强的协同作用，CI值为0.135-0.008。在图E中，相比单独的化合物44，共处理(500nM化合物44，0.75nM依维莫司)后测量了膜联蛋白阳性细胞的显著增加(p<0.0001)。在图F中，共处理后观察到细胞周期G1亚期显著的增加。
实例3
化合物44和依鲁替尼协同作用增强在EZH2突变WSU-DLCL2细胞和野生型EZH2 SU-DH-L5细胞中的细胞凋亡
在图12的图B和E中，每个点代表在细胞凋亡早期和晚期门控细胞百分比的平均值(膜联蛋白-V阳性，平均值+/-S.D.，n＝3)。在图C和F中，渐进曲线上的点代表门控细胞的DNA含量的平均百分比(PI阳性，平均值+/-S.D.，n＝2)。在图A中，使用化合物44和依鲁替尼的组合以4:5的恒定比例处理WSU-DLCL2细胞。这些药剂的组合显示强的协同作用，CI值为0.39和0.14之间。在图B中，在使用化合物44(500nM)、依鲁替尼(625nM)或组合处理的WSU-DLCL2细胞中评估细胞凋亡水平。这一组合揭示了WSU-DLCL2细胞的协同的时间依赖性的细胞凋亡增加。在图C中，组合治疗后细胞周期分析揭示处于G1期的WSU-DLCL2细胞的百分比具有陡然的时间依赖性增加。在图D中，化合物44:依鲁替尼以1:5的恒定比例处理SU-DHL-5细胞。该组合被证明诱导很强的协同作用，CI值为0.222-0.002。在图E中，与化合物44单独相比，使用化合物44(1000nM)和依鲁替尼(2500nM)共同处理后，联蛋白阳性染色的SU-DHL-5细胞的协同性和时间依赖性增加(P<0.0001)。在图F中，相比每个药剂单独处理，组合处理的SU-DHL-5细胞的细胞周期分析揭示共处理后处于G1亚期群体的细胞增加。
实例4
化合物44和MK-2206协同作用增强在EZH2突变WSU-DLCL2细胞和野生型EZH2(SU-DH-L5和OCI-LY-19)细胞中的细胞凋亡。
在图13的图A中，使用化合物44和MK-2206的组合以4:1的恒定比例处理WSU-DLCL2细胞。Fa-CI曲线图证明很强的协同作用，CI值为0.77-0.005。在图B中，当使用化合物44(2000nM)和MK-2206(400nM)共处理时，膜联蛋白阳性WSU-DLCL2细胞百分比时间依赖性增加。在图C中，相比化合物44单独处理，组合治疗1天后细胞周期分析揭示处于G1期的WSU-DLCL2细胞的百分比具有陡然的时间依赖性增加(p<0.0001)。在图D中，化合物44:MK-2206以2:1的恒定比例处理SU-DHL-5细胞。该组合诱导很强的协同作用，CI值为0.276-0.001。在图E中，相比单独的化合物44，共处理(500nM的化合物44，250nM的MK-2206)24小时后，SU-DHL-5的细胞凋亡水平评估揭示膜联蛋白阳性细胞增加(p<0.0001)。在图F中，相比药剂单独处理，组合处理的SU-DHL-5细胞的细胞周期分析揭示处于G1亚期的群体的细胞的百分比增加。在图G中，使用化合物44与MK-2206组合处理观察到在OCI-LY19细胞中强的协同作用，1/ɑ值为71.4。在图H中，相比单独的化合物44，当使用组合(1000nM的化合物44，2500nM的MK-2206)处理OCI-LY19细胞时显示时间依赖的细胞凋亡增加(p<0.0001)。在图I中，使用该组合处理的OCI-LY19细胞的细胞周期分析揭示处于细胞周期的G1亚期中的细胞的时间依赖增加(p<0.0001)。
实例5
使用化合物44与BCR通路抑制剂调节靶标基因
在图14的图A中，相比单一药剂，在WSU-DLCL2细胞中使用化合物44和依鲁替尼组合后EGR1(40倍)和FOS(4倍)下调。在图B中，相比单一药剂，在WSU-DLCL2细胞中使用化合物44和MK-2206组合后AICDA(3倍)和TCL1A|(5倍)上调。在图C中，相比单一药剂，在SU-DHL-5细胞中使用化合物44和依鲁替尼组合后GJA1(3倍)上调。统计分析的值是两个重复或三个重复的平均+/-SD。t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
实例6
在生发中心B细胞系中EZH2抑制和BCR信号通路的调节之间、BCL2抑制和GR激动之间的协同作用。
在这项研究中使用在DLBCL生物学中暗示的信号通路中的关键成员揭示了一些协同作用组合(参见图15)。当与EZP-6438组合(EZP-6438将EZH2抑制的影响从携带突变体EZH2 GCB细胞系延伸向野生型亚型的那些)时，靶向B细胞受体通路节点(例如PI3K/Akt/mTOR信号级联的那些，MAPK级联中的MEK1/2，SYK和BTK)的抑制剂表现出很强的协同作用。BCL-2家族蛋白质的抑制剂、奥巴克拉、纳威托克斯和ABT-199与化合物44的组合显示出协同的抗增生活性。糖皮质激素受体激动剂、泼尼松龙和地塞米松在突变体细胞系中显示EZH2抑制显著的增加且使野生型对EZH2i敏感。利妥昔单抗，该抗体与化学治疗剂R-CHOP组合靶向cd-20在体外在突变体细胞系中引起增强的抗增生效应。
实例7
化合物44和依维莫司的协同作用减少突变体WSU-DLCL2细胞的处于S和G2/M期的细胞群并且减少野生型SU-DHL-5细胞的处于G1、S和G2/M期的细胞群。
WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19(数据未显示)细胞的预处理是使用化合物44(针对WSU和SU-DHL-5是500nM)，接着使用化合物44和依维莫司组合共处理(WSU：5nM，SU-DHL-5：0.75nM)。在图16的图A中，当使用单一药剂或组合治疗WSU-DLCL2细胞时，没有观察到细胞周期G1亚期方面的变化。在图B和C中，当使用该组合治疗WSU-DLCL2细胞时，分别观察到处于细胞周期的S期和G2/M期中细胞的协同时间依赖性减少。在图D、E和F中，对SU-DHL-5细胞上组合治疗48小时后分别观察到处于细胞周期的G1、S、G2/M期中的细胞的协同减少。
实例8
化合物44和依鲁替尼协同作用减少突变体WSU-DLCL2细胞与野生型SU-DHL-5细胞的处于G1、S和G2/M期的细胞群。
WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19(数据未显示)细胞的预处理是使用化合物44(WSU：500nM，SU-DHL-5：1000nM)，接着使用化合物44和依鲁替尼组合共处理(WSU：625nM，SU-DHL-5：2500nM)。在图17的图A、B、C中，相对于化合物44或依鲁替尼作为单一药剂，对WSU-DLCL2细胞组合治疗24小时后分别观察到处于细胞周期的G1、S、G2/M期中的细胞的协同减少。在图D、E、F中，相对于化合物44或依鲁替尼作为单一药剂，对SU-DHL-5细胞组合治疗后分别观察到处于细胞周期的G1、S、G2/M期中的细胞的协同时间依赖性减少。
实例9
化合物44和MK-2206协同作用减少突变体WSU-DLCL2细胞与野生型SU-DHL-5和OCI-LY19细胞的处于G1、S和G2/M期的细胞群。
WSU-DLCL2、SU-DHL-5和OCI-LY19细胞的预处理是使用化合物44(分别是2000nM、500nM和1000nM)，接着使用化合物44和Mk-2206(分别是400nM、250nM和2500nM)的组合共处理。在图18的图A中，当使用MK-2206组合治疗WSU-DLCL2细胞时观察到细胞周期的G1期的协同时间依赖性减少。在图B和C中，当组合治疗WSU-DLCL2细胞时，分别观察到处于细胞周期的S期和G2/M期的细胞的协同减少。在图D、E和F中，相对于单一药剂，对SU-DHL-5细胞上组合治疗48小时后分别观察到处于细胞周期的G1、S、G2/M期中的细胞的协同减少。在图G、H和I中，当组合治疗OCI-LY19细胞时，分别观察到处于细胞周期的G1、S和G2/M期中的细胞的协同时间依赖性减少。
使用化合物44与各个SOC或其它选择的药剂的组合针对野生型DLBCL细胞系和携带EZH2突变体的DLBCL细胞系进行的增生研究的结果显示在表5中。
表5.增生研究结果。
Figure BDA0004036739770000521
CR＝组合比例，CI＝组合指数
在分数效应以上的、0.5的CI范围
a-基于实验1，其它实验是6438与药物单独的最高浓度之间的IC50转变值，因为使用化合物44没有获得50％抑制
b-不能计算α值，因此报道了IC50转变
c-DOHH2数据，归一化至单个6438浓度而不是DMSO
d-利妥昔单抗的浓度是μg/mL
e-这些CI值与1不是显著地不同
用于增生实验的化合物的效力和用于每个细胞系的剂量范围显示在表6中。
表6.化合物效力和剂量范围。
Figure BDA0004036739770000531
a-利妥昔单抗的浓度是μg/mL
列出的IC50值是给药3天后计算的，除了特莱多，其给药是5天
化合物44IC50对于所有细胞系是7天后计算的，除了特莱多是处理11天后计算的引用参考
在本说明书中所引用的所有公开以及专利文件都通过引用以其全部内容结合在此，就像这样的公开或文件被确切地并且个别地指出通过引用被结合一样。公开和专利文件的引用不旨在为承认任何这些是相关的现有技术，也不构成对关于相同内容或日期的任何承认。本发明现在已经通过书面描述的方式进行了描述，本领域的技术人员将认识到本发明可以以各种实施例的方式来实施，并且在前面的描述和下面的实例是为了说明的目的，而不是限制后面的权利要求。
等同方案
可以按其他具体形式实施本发明而不背离本发明的精神或本质特征。因此，上述的实施例被认为在所有方面是用作说明的而不是对在此所描述的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书而不是通过上述的说明来指明的，并且在权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化均旨在涵盖于其中。

Claims (10)

1.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的EZH2抑制剂和治疗有效量的标准治疗药剂。
2.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予包括EZH2抑制剂和标准治疗药剂的、治疗有效量的组合。
3.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予包括EZH2抑制剂和标准治疗药剂的、治疗有效量的组合物。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述非霍奇金淋巴瘤是DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)或GCB(生发中心B细胞样)淋巴瘤。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症是EZH2野生型癌症。
7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为在H3K27处增加的三甲基化。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述淋巴瘤是EZH2突变体淋巴瘤。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述EZH2突变体淋巴瘤具有Y646、A682或A692突变。
10.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症是EZH2抑制剂抗性或难治性癌症。
CN202310008463.1A 2013-12-06 2014-12-08 用于治疗癌症的组合疗法 Pending CN116019921A (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361913063P 2013-12-06 2013-12-06
US61/913,063 2013-12-06
US201461934388P 2014-01-31 2014-01-31
US61/934,388 2014-01-31
US201461992881P 2014-05-13 2014-05-13
US61/992,881 2014-05-13
CN201480071510.6A CN105873592B (zh) 2013-12-06 2014-12-08 用于治疗癌症的组合疗法
PCT/US2014/069167 WO2015085325A1 (en) 2013-12-06 2014-12-08 Combination therapy for treating cancer

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480071510.6A Division CN105873592B (zh) 2013-12-06 2014-12-08 用于治疗癌症的组合疗法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116019921A true CN116019921A (zh) 2023-04-28

Family

ID=53274220

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480071510.6A Active CN105873592B (zh) 2013-12-06 2014-12-08 用于治疗癌症的组合疗法
CN202310008463.1A Pending CN116019921A (zh) 2013-12-06 2014-12-08 用于治疗癌症的组合疗法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480071510.6A Active CN105873592B (zh) 2013-12-06 2014-12-08 用于治疗癌症的组合疗法

Country Status (13)

Country Link
US (4) US20160303135A1 (zh)
EP (2) EP3076977B1 (zh)
JP (4) JP2016539134A (zh)
KR (3) KR20210117347A (zh)
CN (2) CN105873592B (zh)
AU (2) AU2014360078A1 (zh)
BR (1) BR112016012713A2 (zh)
CA (1) CA2931263A1 (zh)
EA (1) EA201691079A1 (zh)
ES (1) ES2863996T3 (zh)
IL (3) IL282741B2 (zh)
MX (1) MX2016007351A (zh)
WO (1) WO2015085325A1 (zh)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130102477A1 (en) 2010-06-23 2013-04-25 Ryan D. Morin Biomarkers for non-hodgkin lymphomas and uses thereof
US9175331B2 (en) * 2010-09-10 2015-11-03 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
JP6340361B2 (ja) 2012-04-13 2018-06-06 エピザイム，インコーポレイティド がんを処置するための組合せ治療
EP2934531A4 (en) * 2012-12-19 2016-06-15 Glaxosmithkline Llc COMBINATION
SG10201811128RA (en) 2014-06-17 2019-01-30 Epizyme Inc Ezh2 inhibitors for treating lymphoma
IL289947B2 (en) 2014-10-16 2024-06-01 Epizyme Inc A method for treating cancer
PL3220916T3 (pl) 2014-11-17 2023-08-14 Epizyme, Inc. Sposób leczenia raka n-((4,6-dimetylo-2-okso-1,2-dihydropirydyn-3-ylo)metylo)-5-(etylo(tetrahydro-2h-piran-4-ylo)amino)-4-metylo-4'-(morfolinometylo)-[1,1'-bifenylo]-3-karboksyamidem
SG11201708286PA (en) 2015-04-20 2017-11-29 Epizyme Inc Combination therapy for treating cancer
WO2016201328A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Epizyme, Inc. Ezh2 inhibitors for treating lymphoma
WO2017019721A2 (en) * 2015-07-28 2017-02-02 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for modulation of histone methyl modifying enzymes
WO2017035234A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Epizyme, Inc. Method for treating cancer
WO2017040190A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of (r)-n-((4-methoxy-6-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-2-methyl-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroethyl)piperidin-4-yl)ethyl)-1h-indole-3-carboxamide
CN108699046A (zh) * 2015-10-06 2018-10-23 Epizyme股份有限公司 用ezh2抑制剂治疗成神经管细胞瘤的方法
CN108697716A (zh) * 2015-12-07 2018-10-23 Epizyme股份有限公司 Ezh2抑制剂及其使用方法
AU2017211331A1 (en) 2016-01-29 2018-06-07 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
IL261721B (en) * 2016-03-15 2022-07-01 Oryzon Genomics Sa Combinations of lsd1 inhibitors for use in the treatment of solid tumors
CA3025933A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Epizyme, Inc. Use of ezh2 inhibitors for treating cancer
EP3471830A4 (en) 2016-06-17 2020-02-26 Epizyme Inc EZH2 INHIBITORS TO TREAT CANCER
WO2018183885A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
MY201580A (en) * 2017-05-18 2024-03-02 Jiangsu Hengrui Medicine Co Use of ezh2 inhibitor combined with btk inhibitor in preparing drug for treating tumor
JP2020522687A (ja) 2017-06-02 2020-07-30 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置するためのｅｚｈ２阻害剤の使用
CA3074720A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
CN109718377B (zh) * 2017-10-31 2021-03-26 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2021026395A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 The General Hospital Corporation Compounds, pharmaceutical compositions, and methods of their use in reversing cancer chemoresistance
CN112870366B (zh) * 2019-11-29 2023-01-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 Ezh2抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的新用途
US20210346525A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-11 The University Of Chicago Composition and methods for tumor imaging and treatment
WO2024106879A1 (ko) * 2022-11-17 2024-05-23 인제대학교 산학협력단 Ezh2 저해제 및 btk 억제제를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2024117840A1 (ko) 2022-12-01 2024-06-06 주식회사 엘지에너지솔루션 배터리 팩

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
RU2765155C2 (ru) 2010-09-10 2022-01-26 Эпизайм, Инк. Ингибиторы ezh2 человека и способы их применения
US9175331B2 (en) 2010-09-10 2015-11-03 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
WO2012118812A2 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
JO3438B1 (ar) 2011-04-13 2019-10-20 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
TW201733984A (zh) 2011-04-13 2017-10-01 雅酶股份有限公司 經取代之苯化合物
KR20140082742A (ko) 2011-09-30 2014-07-02 글락소스미스클라인 엘엘씨 암을 치료하는 방법
ES2718900T3 (es) 2012-03-12 2019-07-05 Epizyme Inc Inhibidores de EZH2 humana y métodos de uso de los mismos
JP6340361B2 (ja) * 2012-04-13 2018-06-06 エピザイム，インコーポレイティド がんを処置するための組合せ治療
ES2745016T3 (es) 2012-04-13 2020-02-27 Epizyme Inc Bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-L,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[L,1'-bifenil]-3-carboxamida para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular del sistema hematológico
WO2013173441A2 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Glaxosmithkline Llc Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
BR112015008487B1 (pt) 2012-10-15 2022-05-31 Epizyme, Inc Compostos de benzeno substituído, composição farmacêutica compreendendo os ditos compostos e uso terapêutico dos mesmos para tratar um distúrbio mediado por ezh2
PT2908823T (pt) 2012-10-15 2019-11-04 Epizyme Inc Métodos para tratamento do cancro
US20140120083A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-01 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers using pi3 kinase isoform modulators
DK2914296T4 (da) 2012-11-01 2022-01-03 Infinity Pharmaceuticals Inc Behandling af cancere under anvendelse af PI3-kinase-isoform-modulatorer
EP2935214B1 (en) 2012-12-21 2019-02-20 Epizyme, Inc. 1,4-pyridone compounds
WO2014100665A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. 1,4-pyridone bicyclic heteroaryl compounds
CA2903572A1 (en) 2013-03-15 2014-10-23 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
US9776996B2 (en) 2013-03-15 2017-10-03 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
AU2014273946B2 (en) 2013-05-30 2020-03-12 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers using PI3 kinase isoform modulators
US9624205B2 (en) 2013-07-19 2017-04-18 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
EP3022184B1 (en) 2013-07-19 2017-09-27 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
HUE063984T2 (hu) 2013-10-16 2024-02-28 Epizyme Inc Hidroklorid só forma az EZH2 gátlásához
US20160228447A1 (en) 2013-10-18 2016-08-11 Epizyme, Inc. Method of treating cancer
SG10201811128RA (en) 2014-06-17 2019-01-30 Epizyme Inc Ezh2 inhibitors for treating lymphoma
PL3220916T3 (pl) 2014-11-17 2023-08-14 Epizyme, Inc. Sposób leczenia raka n-((4,6-dimetylo-2-okso-1,2-dihydropirydyn-3-ylo)metylo)-5-(etylo(tetrahydro-2h-piran-4-ylo)amino)-4-metylo-4'-(morfolinometylo)-[1,1'-bifenylo]-3-karboksyamidem
SG11201708286PA (en) 2015-04-20 2017-11-29 Epizyme Inc Combination therapy for treating cancer
WO2016201328A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Epizyme, Inc. Ezh2 inhibitors for treating lymphoma

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220165809A (ko) 2022-12-15
IL282741B1 (en) 2023-09-01
EA201691079A1 (ru) 2017-03-31
US20220226336A1 (en) 2022-07-21
IL282741A (en) 2021-06-30
KR20160085365A (ko) 2016-07-15
IL245731A0 (en) 2016-07-31
MX2016007351A (es) 2017-02-13
US10463671B2 (en) 2019-11-05
WO2015085325A1 (en) 2015-06-11
US20160303135A1 (en) 2016-10-20
EP3076977B1 (en) 2021-03-03
AU2020202088A1 (en) 2020-04-09
CN105873592A (zh) 2016-08-17
AU2020202088B2 (en) 2022-04-28
JP2022017495A (ja) 2022-01-25
KR102473113B1 (ko) 2022-12-01
AU2014360078A1 (en) 2016-06-09
JP2020045350A (ja) 2020-03-26
JP2023139230A (ja) 2023-10-03
IL304851A (en) 2023-09-01
EP3888659A1 (en) 2021-10-06
JP7323592B2 (ja) 2023-08-08
CA2931263A1 (en) 2015-06-11
ES2863996T3 (es) 2021-10-13
EP3076977A1 (en) 2016-10-12
IL282741B2 (en) 2024-01-01
KR20210117347A (ko) 2021-09-28
EP3076977A4 (en) 2017-08-16
US20200113911A1 (en) 2020-04-16
JP2016539134A (ja) 2016-12-15
CN105873592B (zh) 2023-01-31
IL245731B (en) 2021-05-31
US20180280402A1 (en) 2018-10-04
BR112016012713A2 (pt) 2017-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7323592B2 (ja) 癌を治療するための併用療法
CN111373055B (zh) 用于癌症的诊断和治疗方法
EP3808349B1 (en) Compounds and methods for treating cancer
KR102613106B1 (ko) Ｂ―세포 악성종양의 치료를 위한 세르둘라티닙
Menon et al. Ligand modulation of a dinuclear platinum compound leads to mechanistic differences in cell cycle progression and arrest
EP3383396A2 (en) Cerdulatinib for treating hematological cancers
US20180214449A1 (en) Cancer therapy using jak inhibitor in combination with mapk inhibitors
EP4210704A1 (en) Pharmaceutical combination and tumor treatment
Liu et al. The mTOR inhibitor RAD001 sensitizes tumor cells to the cytotoxic effect of carboplatin in breast cancer in vitro
TW201722422A (zh) 用於治療癌症之合理組合療法
She et al. Identification of a Novel Oral Small-Molecule JAK1/2 Inhibitor and Its Potent Synergistic Drug Combinations Against Cervical Cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination