JP2016539134A - 癌を治療するための併用療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の阻害剤と、１つまたは複数の他の治療剤、特にプレドニゾンなどの抗癌剤とを含む組成物、ならびに癌の治療のためにそれを必要とする被検体に投与するための、併用療法の方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１３年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６１／９１３，０６３号明細書、２０１４年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／９３４，３８８号明細書、および２０１４年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／９２２，８８１号明細書の優先権および利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々の内容全体を参照により本明細書に援用する。

本発明は、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のモノからトリメチル化を触媒するＰＲＣ２複合体の触媒サブユニットであるヒトヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の阻害剤、および１つまたは複数の他の治療剤、特に抗癌剤を含む組成物、ならびに癌を治療するための併用療法の方法に関する。

癌の併用療法治療は、複数の手段により疾患を攻撃する利点が一部認知されているため、より一般的になりつつある。多くの有効な併用療法治療が過去数十年間にわたり確認されてきているが、癌に起因する毎年の死亡者数が継続して多いことを考慮すると、抗癌治療に使用するための有効な治療レジメンを突き止める必要性が依然として存在する。

本発明は、化合物４４（ＥＰＺ−６４３８、Ｅ７４３８としても知られる）
などのＥＺＨ２阻害剤が、現行の標準治療を含む種々の薬剤と併用すると、ＥＺＨ２突然変異の状態にかかわらず、特定の癌の治療に極めて有効であるという発見に少なくとも部分的に基づいている。ある種の実施形態では、癌はリンパ腫である。ある種の実施形態では、癌は、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）起原の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。ある種の実施形態では、リンパ腫はＥＺＨ２突然変異型リンパ腫である。ある種の実施形態では、リンパ腫はＥＺＨ２非突然変異型リンパ腫またはＥＺＨ２野生型リンパ腫である。本発明はまた、化合物４４などのＥＺＨ２阻害剤とプレドニゾン、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンなどのグルココルチコイド受容体アゴニスト（ＧＲａｇ）が協同して、癌における治療活性を劇的に増強するという発見に基づいている。化合物４４とプレドニゾロンの併用により、突然変異を有するＧＣＢ ＮＨＬ細胞のみからすべてのＧＣＢ ＮＨＬ細胞に、ＥＺＨ２阻害に感受性となる細胞の範囲が拡大される。

一態様では、本発明は、それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤および治療有効量の標準治療剤を投与することを含む方法を対象とする。

別の態様では、本発明は、それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤を含む併用の治療有効量を投与することを含む方法を対象とする。

本発明の別の態様は、それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤を含む治療有効量の組成物を投与することを含む方法を対象とする。

ある実施形態では、ＥＺＨ２突然変異型リンパ腫は、Ｙ６４６、Ａ６８２、またはＡ６９２の突然変異である。

いくつかの実施形態では、標準治療剤は、Ｒ−ＣＨＯＰ構成成分、ＢＣＬ阻害剤、およびＢＣＲ阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の化合物である。

いくつかの実施形態では、Ｒ−ＣＨＯＰは、ＣＨＯＰのＧＲａｇ構成成分であるプレドニゾロンまたはデキサメタゾンである。

いくつかの実施形態では、Ｒ−ＣＨＯＰはグルココルチコステロイド受容体アゴニストである。ある種の実施形態では、グルココルチコステロイド受容体アゴニストは、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンである。

いくつかの実施形態では、ドキソルビシンは、Ｒ−ＣＨＯＰから省略される。

いくつかの実施形態では、ＢＣＬ阻害剤は、ナビトクラックス、オバトクラックスまたはＡＢＴ−１９である。

いくつかの実施形態では、ＢＣＲ阻害剤は、リツキシマブ、ＡＫＴ阻害剤ＭＫ−２２０６、イデラリシブ、トラメチニブ、タマタニブ（ｔａｍａｔａｎｉｂ）、エベロリムスまたはイブルチニブである。

いくつかの実施形態では、ＢＣＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達カスケード阻害剤である。

いくつかの実施形態では、ＢＣＲ阻害剤は、リツキシマブ、ＭＫ−２２０６、イデラリシブ、トラメチニブ、タマタニブ、エベロリムス、ベルケイドまたはイブルチニブである。

いくつかの実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤は、同時にまたは逐次的に投与される。他の実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、標準治療剤の投与前に投与される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子が、患者においてアップレギュレートされている。ある種の実施形態では、アップレギュレートされた遺伝子は、セストリン、ＴＮＦおよびＧＩＬＺからなる群から選択される。他の実施形態では、アップレギュレートされた遺伝子は、グルココルチコイド標的遺伝子である。

いくつかの実施形態では、遺伝子のアップレギュレーションは、ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤の治療有効量を決定または調節するために使用される。

別の態様では、本発明は、治療のための患者を選択する方法であって、患者が、セストリン、ＴＮＦおよびＧＩＬＺからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現プロファイルに基づいて選択される方法を対象とする。

一態様では、本発明は、それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤および治療有効量の標準治療剤を投与することを含み、患者がセストリン、ＴＮＦまたはＧＩＬＺの発現をアップレギュレートしている方法を対象とする。

いくつかの実施形態では、癌は、ＥＺＨ２阻害剤抵抗性または難治性癌である。

いくつかの実施形態では、癌は、Ｈ３Ｋ２７におけるトリメチル化の増加を特徴とする。

本発明の一態様は、ＥＺＨ２阻害剤と、ＥＺＨ２突然変異を有する細胞を含む、ＥＺＨ２阻害剤抵抗性または難治性突然変異細胞の非感受性を元に戻すＧＲａｇとの併用を対象とする。

ある種の実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、化合物４４またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、および１つまたは複数の他の治療剤である。

本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

突然変異型ＥＺＨ２胚中心Ｂ細胞リンパ腫細胞株における、ＣＨＯＰ構成成分と化合物４４（Ｃｐｄ４４）による併用有益性を実証する一連のＦａ−ＣＩプロットである。化合物４４とドキソルビシンは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞では相乗的に作用し（図１Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞では相加効果をもたらす（図１Ｄ）。併用有益性は、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（図１Ｃ）およびＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞（図１Ｆ）において、マホスファミドで観察される。併用有益性はまた、両方のＥＺＨ２ Ｙ６４６突然変異細胞株：ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（図１Ｂ）およびＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞（図１Ｅ）において、ビンクリスチンで観察される。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２では、用量は、ドキソルビシンに対して０．１６〜２０ｎＭ、ビンクリスチンに対して０．０４〜５ｎＭ、マホスファミドに対して０．１５６〜１０μＭ、化合物４４に対して１５〜１０００ｎＭの範囲であった。ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞では、用量は、ドキソルビシンに対して０．５〜６０ｎＭ、ビンクリスチンに対して０．０１６〜２ｎＭ、マホスファミドに対して０．１５６〜１０μＭ、および化合物４４に対して１．５６〜１００ｎＭの範囲であった。細胞は、前処理モデルＡに従って処理し、データはＣａｌｃｕｓｙｎソフトウェアで分析した。 ＥＺＨ２突然変異型リンパ腫株において、グルココルチコイドアゴニストが化合物４４（Ｃｐｄ４４）の効力を増強することを実証する一連のプロットである。化合物４４の効力は、グルココルチコイドアゴニストと併用すると、劇的に増大する。前処理モデルＡに従って、２つのＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ突然変異型ＤＬＢＣＬ株にプレドニゾロン（図２Ａ、２Ｃ）またはデキサメタゾン（図２Ｂ、２Ｄ）を加えると、化合物４４のＩＣ_５０が用量依存的にシフトする。用量は、両方の細胞株において、プレドニゾロンに対して１５ｎＭ〜１０００ｎＭ、デキサメタゾンに対して１．５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲であった。化合物４４の用量は、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞では１５〜１０００ｎＭの範囲、ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞では１．５〜１００ｎＭの範囲であった。 ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２ ＥＺＨ２突然変異型（図３Ａ、３Ｂ）および野生型（図３Ｃ、３Ｄ）ＧＣＢリンパ腫細胞株それぞれにおける、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンと化合物４４（Ｃｐｄ４４）の併用の有益性を実証する一連の用量応答プロットである。化合物４４の用量は１５．６〜１０００ｎＭの範囲、プレドニゾロンの用量は７．８〜１０００ｎＭの範囲、デキサメタゾンの用量は０．８〜１００ｎＭの範囲であった（図３Ａおよび３Ｂ）。化合物４４の効力は、ＥＺＨ２突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞において、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンにより増大した（図３Ｃおよび３Ｄ）。化合物４４は、ＤＯＨＨ２ ＥＺＨ２野生型細胞において単剤として抗増殖効果を示さないため、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンの効力シフトを測定した。プレドニゾロンまたはデキサメタゾンの効力は、ＤＯＨＨ２細胞において、化合物４４の添加で増大した。 化合物４４（Ｃｐｄ４４）／グルココルチコイドアゴニストの併用により、ＥＺＨ２阻害剤に抵抗性の細胞株におけるＥＺＨ２阻害剤（ＥＺＨ２ｉ）非感受性が克服されることを実証する要約表である。全体的に、プレドニゾロンと化合物４４の併用により、ＥＺＨ２ｉ感受性細胞株だけでなく、試験したすべてのＧＣＢ細胞株において感受性が増大する。ＲＬ細胞を除いて、プレドニゾロンによるプレインキュベーション後の化合物４４が有効ではないので、薬物添加の順序が重要である。 化合物４４（Ｃｐｄ４４）と他の標的療法の併用によりＥＺＨ２突然変異型リンパ腫細胞株で観察された極めて強力な相乗作用を示す２つのプロットである。化合物４４をＢＣＬ２阻害剤ナビトクラックスと併用すると（図５Ａ）、またｍＴＯＲ阻害剤エベロリムスと併用すると（図５Ｂ）、極めて強力な相乗作用が観察される。ナビトクラックスに対する用量範囲は０．１６〜１０μＭ、エベロリムスに対しては０．０４〜５ｎＭ、化合物４４に対しては３１〜２０００ｎＭである。これらのデータは、前処理モデルＡで作成し、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェアで分析した。 化合物４４（Ｃｐｄ４４）と種々の薬物および／または薬物療法の併用からの結果の要約表である。化合物４４との併用有益性は、ＥＺＨ２突然変異型リンパ腫株において、試験したすべての薬物で得られた。グルココルチコイドアゴニストは、ＥＺＨ２野生型および突然変異型ＧＣＢリンパ腫株について、併用有益性を示した。 化合物４４（Ｃｐｄ４４）−ＣＨＯＰ併用が、いくつかのＥＺＨ２突然変異型リンパ腫異種移植モデルにおいて、単剤に比較して抗腫瘍活性の増強を示すことを実証する一連のプロットである。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を、方法に記載するように、化合物４４、ＣＨＯＰ、またその併用で２８日間治療した（図７Ａ）。平均腫瘍体積±ＳＥＭをプロットする。１５０ｍｇ／ｋｇ ＴＩＤおよび２２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤでの化合物４４の用量は両方とも、ビヒクル単独よりも腫瘍増殖阻害が統計的に顕著であった（＊ｐ値＜０．０５）。２２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤでの化合物４４にＣＨＯＰを加えた治療により、いずれの単剤のみよりも大きな腫瘍退縮が得られた（＊＊＊ビヒクルに対してｐ値＜０．００１）。統計は反復測定分散分析により算出した。ＳＵ−ＤＨＬ６（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｎ）異種移植片を、方法に記載するように、化合物４４、ＣＨＯＰ、またはその併用で２８日間処理した（図７Ｂ）。平均腫瘍体積±ＳＥＭを上部パネルにプロットする。ＣＨＯＰまたは単剤の化合物４４単独では腫瘍増殖に影響がなかったが、２２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤでの化合物４４にＣＨＯＰを加えて治療すると、２８日の治療期間中、腫瘍増殖の退縮がもたらされ、さらに投薬中止の３２日後でも腫瘍増殖遅延が維持された（＊ｐ値＜０．０００１）。６０日に達する生存曲線（下部パネル）により、化合物４４とＣＨＯＰの併用で治療した動物における有意な腫瘍増殖遅延が示される（＊＊ｐ値＜０．０５）。統計は両側ｔ検定により算出した。ＳＵＤＨＬ−１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片は、方法に記載するように、化合物４４、ＣＯＰ（ドキソルビシン構成成分を含まないＳＯＣ）、またはその併用で２８日間治療した（図７Ｃ）。平均腫瘍体積±ＳＥＭを上部パネルにプロットする。腫瘍増殖遅延試験における６０日に達するパーセント生存率を中央パネルにプロットする（注意：５００ｍｇ／ｋｇおよび２５０ｍｇ／ｋｇ＋ＣＯＰの生存曲線は重なっている）。平均腫瘍重量を下部パネルで比較しているが、群間で腫瘍重量に有意な差があることが示される（＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１）。 種々の細胞株を、化合物４４、プレドニゾロン、化合物４４とプレドニゾロンの併用、またはＤＭＳＯで処理した場合における、グルココルチコイド標的遺伝子セストリン１（ＳＥＳＮ１、図８Ａ）、ＴＮＦ（図８Ｂ）、およびＧＩＬＺ（図８Ｃ）の発現レベルの変化を示すパネルである。図８Ａ〜８Ｃで示すように、化合物４４またはプレドニゾロン単独に比較して、セストリン１、ＴＮＦ、およびＧＩＬＺの発現レベルの増大が併用処理後に観察された。 全体的なＨ３Ｋ２７のアセチル化およびトリメチル化がプレドニゾロンまたは併用処理により影響されないことを示すパネルである。用量漸増のプレドニゾロン、化合物４４（Ｃｐｄ４４）、一定用量のプレドニゾロンと化合物４４の併用で４日間、細胞を処理した。酸抽出したヒストンを、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３レベルについてＥＬＩＳＡにより分析した（図９Ａ）（プレドニゾロン単独、左パネル；化合物４４／プレドニゾロン併用、右パネル、ＩＣ_５０値を各グラフに挿入）。プレドニゾロン処理の場合、用量依存的な変化がこの化合物で観察されなかったので、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３値を棒グラフとして表す。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（図９Ｂ）、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞（図９Ｃ）またはＲＬ細胞（図９Ｄ）を、用量漸増のプレドニゾロン、化合物４４、または一定用量のプレドニゾロンと化合物４４の併用で４日間処理した。酸抽出したヒストンを、Ｈ３Ｋ２７アセチル化レベルについて、ウエスタンブロットにより分析した。 化合物４４またはプレドニゾロンによる単剤処理は、ＳＭＡＲＣＢ１タンパク質レベルに影響がないことを示すウエスタンブロットである。 図１１Ａおよび１１Ｄは、化合物４４とエベロリムスの併用有益性を実証するＦａ−ＣＩプロットである。図１１Ｂおよび１１Ｅは、化合物４４、エベロリムス、化合物４４とエベロリムスの併用またはＤＭＳＯで処理したＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞におけるアポトーシスを示すパネルである。図１１Ｃおよび１１Ｆは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の両方において、化合物４４単独に比較して、併用処理後に観察された細胞周期のＧ１期の変化を示すプロットである。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の両方において、化合物４４とエベロリムスの併用で強力な相乗効果が観察された（図１１Ａ、１１Ｄ）。 図１２Ａおよび１２Ｄは、化合物４４とイブルチニブの併用有益性を実証するＦａ−ＣＩプロットである。図１２Ｂおよび１２Ｅは、化合物４４、イブルチニブ、化合物４４とイブルチニブの併用またはＤＭＳＯで処理したＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞におけるアポトーシスを示すパネルである。図１２Ｃおよび１２Ｆは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の両方において、化合物４４単独に比較して、併用処理後に観察された細胞周期のＧ１期の変化を示すプロットである。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の両方において、化合物４４とイブルチニブの併用で強力な相乗効果が観察された（図１２Ａ、１２Ｄ）。 図１３Ａ、１３Ｄおよび１３Ｇは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞において、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用有益性を示すＦａ−ＣＩプロットである。図１３Ｂ、１３Ｅおよび１３Ｈは、化合物４４、ＭＫ−２２０６、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用またはＤＭＳＯで処理したＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞におけるアポトーシスを示すパネルである。図１３Ｃ、１３Ｆおよび１３Ｉは、３種の細胞株において、化合物４４単独に比較して、併用処理後に観察された細胞周期のＧ１期の変化を示すプロットである。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞において、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用で強力な相乗効果が観察された（図１３Ａ、１３Ｄおよび１３Ｇ）。 ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞を、化合物４４、イブルチニブ、ＭＫ−２２０６、化合物４４とイブルチニブの併用または化合物４４とＭＫ−２２０６の併用で処理した場合における、ＥＧＲ１、ＦＯＳ、ＴＣＬ１、ＡＩＣＤＡおよびＧＪＡ１の遺伝子発現の変化を示す棒グラフである。ＥＧＲ１（４０倍）およびＦＯＳ（４倍）のダウンレギュレーション、ならびにＡＩＣＤＡ（３倍）、ＴＣＬ１Ａ（５倍）およびＧＪＡ１（３倍）のアップレギュレーションが、単剤単独の処理で観察されたものよりも、化合物４４と第２の薬剤の併用で顕著に観察された（図１４Ａ〜１４Ｃ）。 びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の生物学に関係するシグナル伝達経路、およびシグナル伝達経路内の種々の化学療法剤の標的を示す図である。 図１６Ａおよび１６Ｄは、化合物４４、エベロリムス、化合物４４とエベロリムスの併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の処理後に観察された細胞周期のＧ１期の変化を示すプロットである。図１６Ｂおよび１６Ｅは、化合物４４、エベロリムス、化合物４４とエベロリムスの併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の処理後に観察された細胞周期のＳ期の変化を示すプロットである。図１６Ｃおよび１６Ｆは、化合物４４、エベロリムス、化合物４４とエベロリムスの併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の処理後に観察された細胞周期のＧ２／Ｍ期の変化を示すプロットである。細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期それぞれにおける細胞の相乗的な減少が、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞に対する併用処理後４８時間に見られる（図１６Ｄ〜１６Ｆ）。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を単剤または併用で処理した場合には、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ１期の変化は観察されなかった（図１６Ａ）。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を併用で処理した場合には、細胞周期のＳ期およびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な時間依存的減少が観察された（図１６Ｂ、１６Ｃ）。 図１７Ａおよび１７Ｄは、化合物４４、イブルチニブ、化合物４４とイブルチニブの併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の処理後に観察された細胞周期のＧ１期の変化を示すプロットである。図１７Ｂおよび１７Ｅは、化合物４４、イブルチニブ、化合物４４とイブルチニブの併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の処理後に観察された細胞周期のＳ期の変化を示すプロットである。図１７Ｃおよび１７Ｆは、化合物４４、イブルチニブ、化合物４４とイブルチニブの併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の処理後に観察された細胞周期のＧ２／Ｍ期の変化を示すプロットである。図１７Ａ〜１７Ｆは、単剤としての化合物４４またはイブルチニブに比較して、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の併用処理後２４時間における、細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な減少を示す。 図１８Ａ、１８Ｄおよび１８Ｇは、化合物４４、ＭＫ−２２０６、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞の処理後に観察された細胞周期のＧ１期の変化を示すプロットである。図１８Ｂ、１８Ｅおよび１８Ｈは、化合物４４、ＭＫ−２２０６、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞の処理後に観察された細胞周期のＳ期の変化を示すプロットである。図１８Ｃ、１８Ｆおよび１８Ｉは、化合物４４、ＭＫ−２２０６、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用およびＤＭＳＯによる、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞の処理後に観察された細胞周期のＧ２／Ｍ期の変化を示すプロットである。図１８Ａ〜１８Ｉは、単剤としての化合物４４またはＭＫ−２２０６に比較して、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の併用処理後、細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な減少を示す。 化合物４４、プレドニゾロン、化合物４４とプレドニゾロンの併用またはＤＭＳＯで処理したＥＺＨ２野生型（ＯＣＩ−ＬＹ１９、ＤＯＨＨ２）、ＥＺＨ２ Ｙ６４６感受性（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＳＵＤＨＬ１０）、およびＥＺＨ２ Ｙ６４６抵抗性（ＲＬ、ＳＵＤＨＬ）細胞株について、ＤＭＳＯ対照に対して規準化したグルココルチコイド受容体の発現レベルの変化を示す棒グラフである。倍率変化値は、ΔΔＣｔ法ならびに参照遺伝子としてＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨを使用して定量した。結果に示すように、グルココルチコイド受容体の発現レベルは、併用において、細胞株の間で共通して影響を受けなかった。 異種移植片を有するマウスにおいて、ＣＨＯＰレジームから１つまたはすべての化学療法構成成分を省略する効果を示すプロットである。図２０Ａは、化合物４４、ＣＯＰ（ドキソルビシン構成成分を含まない化学療法）またはそれらの併用で２８日間処理した、ＳＵＤＨＬ１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を有するマウスにおける腫瘍重量の変化を示すプロットである。図２０Ｂは、２用量の化合物４４、プレドニゾンまたはそれらの併用で２８日間処理した、ＳＵＤＨＬ１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を有するマウスにおける腫瘍体積の変化を示すプロットである。図２０Ｃは、化合物４４、プレドニゾンまたはそれらの併用で処理した、ＳＵＤＨＬ１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を有するマウスにおける体重の変化を示すプロットである（図２０Ｂを参照のこと）。最大耐用量の化合物４４または化合物４４／ＣＯＰ併用を投与したマウスは、６０日目に１００％の生存を示し、併用群は、化合物４４の最大耐用量を含む、他のすべての治療群と比べ最小の２８日目腫瘍重量を示した（図２０Ａ）。プレドニゾン単独投薬では、何ら顕著な抗腫瘍効果を誘導しなかった（図２０Ｂ）。以前の研究と一致して、化合物４４の投薬は、部分的な応答のみをもたらしたが、２サイクルのプレドニゾンレジメンとではない、プレドニゾンと化合物４４の併用投薬は、高用量の化合物４４単独で達成される可能な最大退縮を誘導した。

本発明は、化合物４４が、現行の標準治療を含む種々の薬剤と併用すると、ＥＺＨ２突然変異の状態にかかわらず、特定の癌の治療に有効であるという発見に少なくとも部分的に基づいている。ある種の実施形態では、癌はリンパ腫である。ある種の実施形態では、癌は、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）起原の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。ある種の実施形態では、リンパ腫はＥＺＨ２突然変異型リンパ腫である。ある種の実施形態では、リンパ腫はＥＺＨ２非突然変異型リンパ腫またはＥＺＨ２野生型リンパ腫である。

本発明のある種の態様では、ＥＺＨ２阻害剤は、下記式：
を有する化合物４４（ＥＰＺ−６４３８、Ｅ７４３８としても知られる）またはその薬学的に許容される塩である。

本発明は、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と他の抗癌剤を併用して特定の腫瘍を治療すると、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤および抗癌剤単独による腫瘍治療によって達成される結果よりも優れた結果を得ることができるという発見に基づいている。したがって、本発明は、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤および１つまたは複数の他の治療剤を含む組成物、ならびにその過程がヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態の調節により影響を受け得る疾患、たとえば癌を治療するためのその使用方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、化合物４４およびプレドニゾンを含む組成物を特徴とする。本発明はまた、癌、たとえば、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＣＬＢＬ）を治療するための、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と１つまたは複数の治療剤、たとえば化合物４４とプレドニゾンを含む併用療法のための方法を含む。具体的には、本発明の方法は、癌の治療もしくは予防または癌細胞増殖の阻害に有用である。

本発明の態様は、突然変異型ＥＺＨ２を発現する被検体に、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤および１つまたは複数の他の治療剤を投与することにより、被検体の癌または前癌性状態の症状を治療または緩和するための方法に関する。本発明の突然変異型ＥＺＨ２は、突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドまたは突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。ある種の実施形態では、突然変異型ＥＺＨ２は、その基質ポケットドメインに１つまたは複数の突然変異を含む。

本発明の別の態様は、突然変異型ＥＺＨ２または野生型ＥＺＨ２を発現する被検体に、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤および１つまたは複数の他の治療剤を投与することにより、被検体の癌または前癌性状態の症状を治療または緩和するための方法に関する。本発明の突然変異型ＥＺＨ２は、突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドまたは突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。ある種の実施形態では、突然変異型ＥＺＨ２は、その基質ポケットドメインに１つまたは複数の突然変異を含む。

別の態様では、本発明は、突然変異型ＥＺＨ２または野生型ＥＺＨ２を発現する被検体に、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤、たとえば化合物４４、および１つまたは複数のグルココルチコイド受容体アゴニスト、たとえばプレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン（ＧＲａｇ）を投与することにより、被検体の癌または前癌性状態の症状を治療または緩和するための方法に関する。本発明の突然変異型ＥＺＨ２は、突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドまたは突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。ある種の実施形態では、突然変異型ＥＺＨ２は、その基質ポケットドメインに１つまたは複数の突然変異を含む。

ヒトＥＺＨ２核酸およびポリペプチドは以前に記載されている。たとえば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８：３０−７［７４６アミノ酸］；Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ１５９１０［７４６アミノ酸；］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４５６およびＮＰ＿００４４４７（アイソフォームａ［７５１アミノ酸］）；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５２９９８およびＮＰ＿６９４５４３（アイソフォームｂ［７０７アミノ酸］）を参照されたい。これらのそれぞれは、その内容全体を参照により本明細書に援用する。

本出願の目的のために、ヒトＥＺＨ２のアミノ酸残基Ｙ６４１は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ１５９１０のＹ６４１であるかまたはそれに対応するチロシン残基を指すことを理解されたい。

さらに、本出願の目的のために、ヒトＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体、および同等にＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応するアミノ酸残基がチロシン以外のアミノ酸残基により置換されているヒトＥＺＨ２を指すことを理解されたい。

ある種の実施形態では、Ｒ−ＣＨＯＰは、ＣＨＯＰのＧＲａｇ構成成分であるプレドニゾロンまたはデキサメタゾンである。ある種の実施形態では、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達経路阻害剤は、リツキシマブ、ＡＫＴ阻害剤ＭＫ−２２０６、イデラリシブ、トラメチニブ、タマタニブ、エベロリムスまたはイブルチニブである。

本発明は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ ＢＣＲシグナル伝達経路の阻害剤、たとえば、イデラリシブ、ＭＫ−２２０６およびエベロリムスが、化合物４４と併用すると、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株およびＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞株において、極めて強力な相乗作用を誘導したという発見に部分的に基づいている。本発明はまた、化合物４４と、Ｂ細胞受容体経路の阻害剤、たとえばイブルチニブおよびタマタニブとの併用が、両方の突然変異細胞株において、極めて強力な相乗作用を示したという発見に部分的に基づいている。ある種の実施形態では、ＢＣＬ受容体阻害剤は、ナボチクラックス（ｎａｖｏｔｉｃｌａｘ）またはＡＢＴ−１９９である。

いくつかの実施形態では、癌は、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫または非ホジキンリンパ腫胚中心Ｂ細胞である。

いくつかの実施形態では、標準治療剤は、Ｒ−ＣＨＯＰ、ＢＣＬ阻害剤およびＢＣＲ阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の化合物である。

いくつかの実施形態では、Ｒ−ＣＨＯＰは、ＣＨＯＰのＧＲａｇ構成成分であるプレドニゾロンまたはデキサメタゾンである。

いくつかの実施形態では、ＢＣＲ阻害剤は、リツキシマブ、ＡＫＴ阻害剤ＭＫ−２２０６、イデラリシブ、トラメチニブ、タマタニブ、エベロリムスまたはイブルチニブである。

いくつかの実施形態では、癌はＥＺＨ２突然変異癌である。

いくつかの実施形態では、癌はＥＺＨ２阻害剤抵抗性または難治性癌である。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体のアミノ酸配列は、チロシン以外のアミノ酸残基による、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応する１個のアミノ酸残基の置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応する１個のアミノ酸残基のフェニルアラニン（Ｆ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体は、Ｙ６４１Ｆ突然変異体または同等にＹ６４１Ｆと本明細書で称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応する１個のアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体は、Ｙ６４１Ｈ突然変異体または同等にＹ６４１Ｈと本明細書で称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応する１個のアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体は、Ｙ６４１Ｎ突然変異体または同等にＹ６４１Ｎと本明細書で称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応する１個のアミノ酸残基のセリン（Ｓ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体は、Ｙ６４１Ｓ突然変異体または同等にＹ６４１Ｓと本明細書で称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応する１個のアミノ酸残基のシステイン（Ｃ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＹ６４１突然変異体は、Ｙ６４１Ｃ突然変異体または同等にＹ６４１Ｃと本明細書で称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＡ６７７突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＡ６７７に対応する１個のアミノ酸残基の非アラニンアミノ酸、好ましくはグリシン（Ｇ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＡ６７７突然変異体は、Ａ６７７突然変異体、および好ましくはＡ６７７Ｇ突然変異体または同等にＡ６７７Ｇと本明細書で称される。Ａ６７７は、Ａ６８２とも称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２のＡ６８７突然変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトＥＺＨ２のＡ６８７に対応する１個のアミノ酸残基の非アラニンアミノ酸、好ましくはバリン（Ｖ）への置換のみが野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２のＡ６８７突然変異体は、Ａ６８７突然変異体、および好ましくはＡ６８７Ｖ突然変異体または同等にＡ６８７Ｖと本明細書で称される。Ａ６８７は、Ａ６９２とも称される。

一実施形態では、ＥＺＨ２の突然変異体のアミノ酸配列は、その基質ポケットドメインの１つまたは複数のアミノ酸残基が野生型ヒトＥＺＨ２のアミノ酸配列と異なる。この実施形態によるＥＺＨ２の突然変異体は、本明細書でＥＺＨ２突然変異体と称される。

他の例示的な置換アミノ酸突然変異には、アミノ酸位置６７７、６８７または６４１での置換、たとえば、以下に限定されるものではないが、アミノ酸位置６７７での野生型残基アラニン（Ａ）のグリシン（Ｇ）への置換（Ａ６７７Ｇ）；アミノ酸位置６８７での野生型残基アラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）への置換（Ａ６８７Ｖ）；アミノ酸位置６４１での野生型残基チロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｙ６４１Ｆ）；アミノ酸位置６４１での野生型残基チロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）への置換（Ｙ６４１Ｈ）；アミノ酸位置６４１での野生型残基チロシン（Ｙ）のアスパラギン（Ｎ）への置換（Ｙ６４１Ｎ）；アミノ酸位置６４１での野生型残基チロシン（Ｙ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｙ６４１Ｓ）；またはアミノ酸位置６４１での野生型残基チロシン（Ｙ）のシステイン（Ｃ）への置換（Ｙ６４１Ｃ）が含まれる。Ｙ６４１は、Ｙ６４６とも称される。

ＥＺＨ２に対してヘテロ接合性の細胞は、野生型酵素によるＨ３−Ｋ２７ｍｅ１の効率的な形成、および突然変異型酵素形態による、この前駆細胞種のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２および特にＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への効率的なその後の移行により、悪性形質を示すと予測される。

本発明の別の態様は、被検体において、Ｈ３−Ｋ２７のトリメチル化Ｈ３−Ｋ２７への変換を阻害するための方法である。阻害としては、被検体における、非メチル化Ｈ３−Ｋ２７のモノメチル化Ｈ３−Ｋ２７への変換、モノメチル化Ｈ３−Ｋ２７のジメチル化Ｈ３−Ｋ２７への変換、ジメチル化Ｈ３−Ｋ２７のトリメチル化Ｈ３−Ｋ２７への変換、またはたとえば、モノメチル化Ｈ３−Ｋ２７のジメチル化Ｈ３−Ｋ２７への変換およびジメチル化Ｈ３−Ｋ２７のトリメチル化Ｈ３−Ｋ２７への変換を含むそれらの任意の組合せの阻害を挙げることができる。本明細書で使用する場合、非メチル化Ｈ３−Ｋ２７は、メチル基がリジン２７のアミノ基に共有結合していないヒストンＨ３を指す。本明細書で使用する場合、モノメチル化Ｈ３−Ｋ２７は、１個のメチル基がリジン２７のアミノ基に共有結合しているヒストンＨ３を指す。モノメチル化Ｈ３−Ｋ２７は、本明細書でＨ３−Ｋ２７ｍｅ１とも称される。本明細書で使用する場合、ジメチル化Ｈ３−Ｋ２７は、２個のメチル基がリジン２７のアミノ基に共有結合しているヒストンＨ３を指す。ジメチル化Ｈ３−Ｋ２７は、本明細書でＨ３−Ｋ２７ｍｅ２とも称される。本明細書で使用する場合、トリメチル化Ｈ３−Ｋ２７は、３個のメチル基がリジン２７のアミノ基に共有結合しているヒストンＨ３を指す。トリメチル化Ｈ３−Ｋ２７は、本明細書でＨ３−Ｋ２７ｍｅ３とも称される。本発明の組成物は、化合物４４および１つまたは複数の他の治療剤を含む。本発明の化合物および組成物は、同時に、逐次的に、または交互に投与するのに適した１つもしくは複数の他の治療剤または治療法との併用療法の一部として投与するのに適している。本発明の方法に適した他の化合物は、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２０２６４７３４号明細書に記載されている。

本発明のある種の態様では、ＥＺＨ２の阻害剤は、野生型ＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するよりも効率的に突然変異型ＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する場合に、突然変異型ＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を「選択的に阻害する」。たとえば、一実施形態では、選択的阻害剤は、野生型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０よりも少なくとも４０パーセント低い、突然変異型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０を有する。一実施形態では、選択的阻害剤は、野生型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０よりも少なくとも５０パーセント低い、突然変異型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０を有する。一実施形態では、選択的阻害剤は、野生型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０よりも少なくとも６０パーセント低い、突然変異型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０を有する。一実施形態では、選択的阻害剤は、野生型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０よりも少なくとも７０パーセント低い、突然変異型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０を有する。一実施形態では、選択的阻害剤は、野生型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０よりも少なくとも８０パーセント低い、突然変異型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０を有する。一実施形態では、選択的阻害剤は、野生型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０よりも少なくとも９０パーセント低い、突然変異型ＥＺＨ２に対するＩＣ５０を有する。

本発明のある種の態様では、阻害剤は、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換を阻害する。一実施形態では、阻害剤は、Ｈ３−Ｋ２７のトリメチル化を阻害すると言われる。Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換がＨ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換に先行するので、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換の阻害剤は、当然、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換も阻害する、すなわち、Ｈ３−Ｋ２７のトリメチル化を阻害する。阻害剤は、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換を阻害することなく、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換を阻害することも可能である。このタイプの阻害も、Ｈ３−Ｋ２７のジメチル化の阻害がないにもかかわらず、Ｈ３−Ｋ２７のトリメチル化の阻害をもたらすことになる。

一実施形態では、阻害剤は、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換およびＨ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換を阻害する。そのような阻害剤は、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換のみを直接阻害する場合がある。あるいは、そのような阻害剤は、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換およびＨ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換の両方を直接阻害する場合がある。

本発明のある種の態様では、阻害剤化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する。ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の阻害は、任意の好適な方法を使用して検出することができる。阻害は、たとえば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の速度から、またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の生成物により、測定することができる。

阻害は、適切な対照に比較して測定可能な阻害である。一実施形態では、阻害は、適切な対照に比較して少なくとも１０パーセントの阻害である。すなわち、阻害剤存在下での酵素活性の速度または生成物の量は、阻害剤非存在下での対応する速度または量の９０パーセント以下である。種々の他の実施形態では、阻害は、適切な対照に比較して、少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０または９５パーセントの阻害である。一実施形態では、阻害は、適切な対照に比較して少なくとも９９パーセントの阻害である。すなわち、阻害剤存在下での酵素活性の速度または生成物の量は、阻害剤非存在下での対応する速度または量の１パーセント以下である。

本発明の組成物は、ＥＺＨ２阻害剤もしくは化合物４４またはその薬学的に許容される塩と、１つもしくは複数の他の治療剤またはその薬学的に許容される塩とを含む。本発明は、ＥＺＨ２阻害剤もしくは化合物４４またはその薬学的に許容される塩と、１つもしくは複数の治療剤またはその薬学的に許容される塩とを、共通の製剤または別々の製剤として投与することを提供し、製剤の投与は、同時、逐次的、または交互である。ある種の実施形態では、他の治療剤は、本発明の組成物により治療されている疾患または状態を治療するのに有用であるとして、当該技術分野で認識されている薬剤であり得る。他の実施形態では、他の治療剤は、本発明の組成物により治療されている疾患または状態を治療するのに有用であるとして、当該技術分野で認識されていない薬剤であり得る。一態様では、他の治療剤は、本発明の組成物に有益な性状を付与する薬剤（たとえば、組成物の粘性に影響を与える薬剤）であり得る。本発明の組成物に対する有益な性状としては、これに限定されるものではないが、ＥＺＨ２阻害剤または化合物４４と１つまたは複数の他の治療剤との併用から生じる薬物動態的または薬力学的共同作用が挙げられる。たとえば、１つまたは複数の他の治療剤は、抗癌剤または化学療法剤であり得る。たとえば、１つまたは複数の他の治療剤は、グルココルチコイドであり得る。たとえば、１つまたは複数の他の治療剤は、プレドニゾン、プレドニゾロン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、マホスファミド、シスプラチン、ＡｒａＣ、エベロリムス、デシタビン、デキサメタゾン、またはそれらの機能的なアナログ、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物から選択することができる。別の態様では、他の治療剤は、プレドニゾンまたはその活性代謝物であるプレドニゾロンであり得る。

以下に示す治療剤は、例示を目的とするものであり、限定を意図するものではない。本発明は、以下のリストから選択される少なくとも１つの他の治療剤を含む。本発明は、本発明の組成物がその目的とする機能を発揮することができるように、２つ以上の他の治療剤、たとえば、２つ、３つ、４つまたは５つの他の治療剤を含むことができる。

別の実施形態では、他の治療剤は、アルキル化剤；抗生物質；代謝拮抗剤；解毒剤；インターフェロン；ポリクローナルまたはモノクローナル抗体；ＥＧＦＲ阻害剤；ＨＥＲ２阻害剤；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；ホルモン；有糸分裂阻害剤；ＭＴＯＲ阻害剤；多標的キナーゼ阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤；タキサンまたはタキサン誘導体、アロマターゼ阻害剤、アントラサイクリン、微小管標的薬、トポイソメラーゼ毒性薬、分子標的または酵素（たとえば、キナーゼまたはタンパク質メチルトランスフェラーゼ）の阻害剤、シチジンアナログ薬、あるいはｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｄｏｃｒｏｏｔ／ｃｄｇ／ｃｄｇ＿０．ａｓｐに収載されている任意の化学療法剤、抗新生物剤または抗増殖剤を含む群から選択される化学療法剤（抗新生物剤または抗増殖剤とも呼ばれる）である。

本発明は、疾患または癌の治療を必要とする被検体に、ＥＺＨ２阻害剤もしくは化合物４４またはその薬学的に許容される塩と１つまたは複数の他の治療剤とを含む組成物を投与する併用療法のための方法を提供する。この併用療法はまた、増殖を阻害するかまたは細胞死を誘導するために、癌細胞に対して施すことができる。一態様では、化合物４４またはその薬学的に許容される塩は、化合物４４またはその薬学的に許容される塩と１つまたは複数の他の治療剤とを含む本発明の組成物の投与後に投与される。一態様では、化合物４４またはその薬学的に許容される塩は、化合物４４またはその薬学的に許容される塩と１つまたは複数の他の治療剤とを含む本発明の組成物の投与前に投与される。一態様では、化合物４４またはその薬学的に許容される塩は、１つまたは複数の治療剤の投与後に投与され、そのため、他の治療剤は、単一の組成物または２つ以上の組成物で投与され、たとえば、同時に、逐次的にまたは交互に投与される。一態様では、化合物４４またはその薬学的に許容される塩は、１つまたは複数の治療剤の投与前に投与され、そのため、他の治療剤は、単一の組成物または２つ以上の組成物で投与され、たとえば、同時に、逐次的にまたは交互に投与される。

一実施形態では、本発明の組成物は、化合物４４またはその薬学的に許容される塩と、１つまたは複数の抗癌剤、たとえば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、オンコビンおよびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン）またはＲ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、オンコビン、プレドニゾンもしくはプレドニゾロン）とを含む。一実施形態では、本発明の組成物は、化合物４４またはその薬学的に許容される塩とプレドニゾンまたはプレドニゾロンとを含む。本発明の方法は、化合物４４の化合物またはその薬学的に許容される塩と抗癌剤とを投与する併用療法を含み、ここで、抗癌剤はＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰ、プレドニゾンまたはプレドニゾロンである。

ある種の実施形態では、「ＥＺＨ２阻害剤と標準治療剤とを含む併用」とは、共通製剤化されていない治療剤の投与を包含することを意図するものである。

ある種の実施形態では、「併用療法」は、各治療剤が異なる時点で投与される、これらの治療剤の逐次的な投与、ならびにこれらの治療剤またはこれらの治療剤の少なくとも２つの同時または実質的に同時の投与を包含することを意図する。同時投与は、たとえば、固定比率の各治療剤を含有する単一カプセル剤または治療剤の各々についての複数の単一カプセル剤を被検体に投与することによって達成することができる。各治療剤の逐次的または実質的に同時の投与は、以下に限定されるものではないが、経口経路、静注経路、筋肉内経路および粘膜組織による直接吸収を含む、任意の適切な経路により達成することができる。治療剤は、同じ経路によりまたは異なる経路により投与することができる。たとえば、選択された併用の最初の治療剤は静脈内注射により投与することができ、一方他の治療剤は経口投与することができる。あるいは、たとえば、治療剤をすべて経口投与することも、または静脈内注射により投与することもできる。治療剤はまた交互に投与してもよい。

本発明のある種の実施形態では、本発明で注目する併用療法は、疾患または癌の治療において相乗効果をもたらし得るものである。「相乗効果」は、治療剤の併用の効力が単独投与されたいずれの薬剤の効果の合計よりも大きい場合として定義される。相乗効果はまた、化合物または他の治療剤のいずれについても単剤として投与することによって達成することができない効果でもあり得る。相乗効果には、以下に限定されるものではないが、腫瘍サイズの縮小、腫瘍増殖の阻害または被検体の生存期間の延長による癌治療の効果が含まれる。相乗効果にはまた、癌細胞生存率の低下、癌細胞死の誘導および癌細胞増殖の阻害または遅延も含まれ得る。

本発明のある種の実施形態では、「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分および非薬物療法（たとえば、外科手術または放射線治療）とのさらなる併用における、上記の治療剤の投与も包含する。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、治療剤の併用と非薬物治療との共同作用からの有益な効果が達成される限り、非薬物治療は任意の好適な時期に行うことができる。たとえば、適合する症例では、非薬物治療が治療剤の投与のためにおそらく数日間または数週間も一時的に中断される場合でも依然として有益な効果が達成される。

別の態様では、本発明の組成物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物は放射線療法と併用して投与することができる。放射線療法はまた、本発明の組成物および複数薬剤療法の一部として本明細書に記載の他の化学療法剤と併用して施すことができる。

併用療法は、各々が別々に製剤化され投与される２つ以上の薬剤、たとえば、化合物４４および１つまたは複数の他の治療剤を投与することにより、あるいは単一製剤中の２つ以上の薬剤を投与することにより達成することができる。他の併用も併用療法に包含される。たとえば、２つの薬剤を一緒に製剤化し、第３の薬剤を含有する別の製剤と併用して投与することができる。併用療法における２つ以上の薬剤は、同時に投与することができるが、そうである必要はない。たとえば、第１の薬剤（または薬剤の併用）の投与を、分、時、日または週の単位で第２の薬剤（または薬剤の併用）の投与に先行させることができる。したがって、２つ以上の薬剤を、互いの数分以内に、または互いの１、２、３、６、９、１２、１５、１８もしくは２４時間以内に、または互いの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４日以内に、または互いの２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０週以内に投与することができる。いくつかの場合では、さらに長い間隔が可能である。多くの場合では、併用療法で使用される２つ以上の薬剤は、同時に患者の体内に存在することが望ましいが、そうである必要はない。

本発明はまた、本明細書に記載の疾患または状態を治療または予防する用量で、薬学的に好適なキャリアまたは賦形剤と混合された、化合物４４またはその薬学的に許容される塩と本明細書に開示された１つまたは複数の他の治療剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、他の治療剤または治療手段と併用して、同時に、逐次的にまたは交互に投与することができる。

本発明の組成物の混合物もまた、単一混合物としてまたは好適な製剤化された医薬組成物で患者に投与することができる。たとえば、本発明の一態様は、治療有効用量のＥＺＨ２阻害剤もしくは化合物４４またはその薬学的に許容される塩、水和物、エナンチオマーまたは立体異性体；１つまたは複数の他の治療剤、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物に関する。

「医薬組成物」は、被検体への投与に好適な形態で本発明の化合物を含む製剤である。化合物４４および本明細書に記載の１つまたは複数の他の治療剤は各々、個々にまたは活性成分の任意の組合せで複数の医薬組成物に製剤化することができる。したがって、１つまたは複数の投与経路を各医薬組成物の剤形に基づいて適切に選ぶことができる。あるいは、化合物４４および本明細書に記載の１つまたは複数の他の治療剤は、１つの医薬組成物として製剤化することができる。

一実施形態では、医薬組成物はバルクまたは単位剤形である。単位剤形は、たとえば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器の単一ポンプまたはバイアルなど種々の形態のいずれかである。単位用量の組成物における活性成分（たとえば、開示された化合物またはその塩、水和物、溶媒和物または異性体の製剤）の量は有効量であり、関連する個々の治療に応じて変化する。当業者であれば、患者の年齢および状態によって投薬量を日常的に変える必要があることもあることを理解するであろう。投薬量はまた投与経路によって異なる。経口、経肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、口腔内、舌下、胸膜内、髄腔内、鼻腔内および同種のものなど種々の経路を意図している。本発明の化合物の局所投与または経皮投与用の剤形として、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入薬が挙げられる。一実施形態では、活性化合物は、滅菌条件下で薬学的に許容されるキャリアと、必要とされる任意の防腐剤、バッファーまたは噴霧剤と混合される。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という語句とは、化合物、アニオン、カチオン、材料、組成物、キャリアおよび／または剤形が、適切な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を回避しつつ、合理的なベネフィット／リスク比に見合ってヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適であることをいう。

「薬学的に許容される賦形剤」は、医薬組成物の調製に有用であり、かつ一般に安全で無毒性であり、生物学的にもあるいは他の点でも望ましい賦形剤を意味し、動物用途のほか、ヒトの医薬用途に許容可能な賦形剤を含む。本明細書および特許請求の範囲に使用される「薬学的に許容される賦形剤」は、そうした賦形剤の１種および２種以上の両方を含む。

本発明の医薬組成物は、その目的の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例として、非経口投与、たとえば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（たとえば、吸入）、経皮投与（局所）、および経粘膜投与が挙げられる。非経口用途、皮内用途または皮下用途に使用される溶液または懸濁液として、以下の成分：無菌希釈液、たとえば食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌薬、たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸；バッファー、たとえばアセテート、シトレートまたはホスフェート、および張度調整剤、たとえば塩化ナトリウムまたはブドウ糖を挙げることができる。ｐＨは、酸または塩基、たとえば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたはマルチドーズバイアルに封入してもよい。

本発明の組成物は、化学療法治療に現在使用されるよく知られた方法の多くで被検体に投与することができる。たとえば、癌の治療では、本発明の化合物を腫瘍に直接注射しても、血流中もしくは体腔に注射しても、あるいは経口投与しても、あるいはパッチを用いて経皮適用してもよい。選択される用量は効果的な治療となるのに十分であるが、許容できない副作用を引き起こすほど高くないようにすべきである。病状の状況（たとえば、癌、前癌および同種のもの）および患者の健康については好ましくは、治療中および治療後相当期間、詳細にモニターすべきである。

「治療有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、特定された疾患または状態を治療、軽減または予防する、あるいは検出可能な治療効果または阻害効果を示す医薬剤の量をいう。効果は、当該技術分野において公知の任意のアッセイ方法により検出することができる。被検体の正確な有効量は、被検体の体重、大きさおよび健康；その状態の性質および程度；ならびに投与のために選択した治療法または治療法の併用によって異なる。ある状況に対する治療有効量は、臨床医の技能および判断の範囲内にある通常の実験により決定することができる。好ましい態様では、治療対象の疾患または状態は癌である。別の態様では、治療対象の疾患または状態は細胞増殖性障害である。

ある種の実施形態では、併用で使用される各医薬剤の治療有効量は、各薬剤単独による単独療法に比較して併用で使用される場合低くなる。そのように治療有効量が低くなると、治療レジメンの毒性が低くなり得るであろう。

いずれの化合物でも、治療有効量は、たとえば、腫瘍性細胞の細胞培養アッセイ、または動物モデル、通常ラット、マウス、ウサギ、イヌもしくはブタを用いて最初に推定することができる。動物モデルはさらに、適切な濃度範囲および投与経路を判定するのに使用してもよい。次いでこうした情報を使用して、ヒトの投与に有用な用量および経路を判定することができる。治療／予防有効性および毒性は、細胞培養または実験動物を対象とした標準的な薬学的手順、たとえば、ＥＤ_５０（集団の５０％で治療効果のある用量）およびＬＤ_５０（集団の５０％致死用量）により判定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療係数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比で表すことができる。好ましいのは、大きな治療係数を示す医薬組成物である。投薬量は、利用する剤形、患者の感受性および投与経路によってこの範囲内で変わってもよい。

投薬量および投与は、十分なレベルの活性剤を与えるか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮に入れてもよい因子として、病状の重症度、被検体の一般的な健康状態、被検体の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬剤併用、反応感受性、ならびに治療に対する忍容性／反応が挙げられる。長時間作用性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度によって３〜４日毎、毎週あるいは２週に１回投与してもよい。

本発明の活性化合物を含む医薬組成物は、一般に知られた方法で、たとえば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠製造プロセス、研和プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセスまたは凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用することができる調製物に加工しやすくする賦形剤および／または助剤を含む、１種もしくは複数種の薬学的に許容されるキャリアを用いて従来の方法で製剤化してもよい。言うまでもなく、適切な製剤は選択された投与経路によって異なる。

注射用途に好適な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および必要に応じて調製される無菌注射用溶液または分散液用の無菌粉末を含む。静脈内投与では、好適なキャリアとして、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、シリンジ操作が容易である程度の流動性があるべきである。組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの混入微生物の作用を防止しなければならない。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールならびに同種のもの）およびこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には、必要とされる粒度の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールおよび同種のものの使用により達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、多価アルコール、たとえばマニトールおよびソルビトール、ならびに塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の吸収の持続化は、組成物に吸収を遅らせる薬、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより行うことができる。

無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した１つの成分または成分の組み合わせと共に適切な溶媒に加え、続いて濾過滅菌を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙したものから必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を加えることにより調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥およびフリーズドライであり、これにより活性成分と任意の所望の追加成分との、前もって滅菌濾過した溶液から、活性成分と任意の所望の追加成分との粉末が得られる。

経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用の薬学的に許容されるキャリアを含む。経口組成物はゼラチンカプセルに封入しても、あるいは錠剤に圧縮してもよい。経口治療投与の目的上、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用してもよい。経口組成物はさらに、洗口剤として使用される液体キャリアを用いて調製してもよく、液体キャリア中の化合物は経口適用し、すすいで吐き出すかまたは飲み込む。薬学的に適合する結合剤および／または補助剤を組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤および同種のものは、性質の類似した以下の成分または化合物：バインダー、たとえば微結晶性セルロース、トラガントゴムまたはゼラチン；賦形剤、たとえばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、たとえばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ；滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、たとえばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、たとえばスクロースまたはサッカリン；または着香剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のいずれかを含んでもよい。

吸入による投与では、化合物は、好適な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものでもよい。経粘膜または経皮投与では、透過対象のバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。こうした浸透剤は一般に当該技術分野において公知であり、たとえば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与では、活性化合物を一般に当該技術分野において公知の軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤する。

活性化合物は、化合物の身体からの急速な排除を防ぐ薬学的に許容されるキャリア、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル化送達系などの放出制御製剤と共に調製してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用してもよい。こうした製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであろう。こうした材料はさらに、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品として入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的としたリポソームを含む）も、薬学的に許容されるキャリアとして使用することができる。これらは、たとえば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているような当業者に公知の方法に従い調製することができる。

投与のしやすさおよび投薬量の均一性のため、経口または非経口組成物を投薬単位剤形で製剤化すると特に有利である。投薬単位剤形とは、本明細書で使用する場合、単位投薬量として治療対象の被検体に適した物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望の治療効果を発揮するように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位剤形の規格は、活性化合物の特有の特徴および達成されるべき個々の治療効果により決定され、それらに直接左右される。

治療用途では、本明細書に記載のＥＺＨ２阻害剤化合物、本明細書に記載の他の治療剤、化合物４４と１つもしくは複数の他の治療剤とを含む組成物または本発明に従い使用される医薬組成物の投薬量は、選択した投薬量に影響を与える数ある要因の中でも、薬剤、レシピエント患者の年齢、体重および臨床状態、ならびに治療を行う臨床医または開業医の経験および判断によって異なる。一般に、用量は、腫瘍の増殖を遅延させる、そして好ましくは退縮させる、さらに好ましくは癌を完全に退縮させるのに十分であるべきである。投薬量は、単回投与、分割投与または連続投与で約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。好ましい態様では、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。一態様では、用量は約０．１ｍｇ／日〜約５０ｇ／日；約０．１ｍｇ／日〜約２５ｇ／日；約０．１ｍｇ／日〜約１０ｇ／日；約０．１ｍｇ〜約３ｇ／日；または約０．１ｍｇ〜約１ｇ／日の範囲であってもよい（投与はｋｇ単位の患者の体重、ｍ^２単位の体表面積および年齢に応じて調整してもよい）。医薬剤の有効量は、臨床医または他の適格な観察者により認められる改善が客観的に特定できる量である。たとえば、患者の腫瘍の退縮は、腫瘍の直径を基準に測定してもよい。腫瘍の直径の減少は退縮を示す。退縮はさらに、治療を中止した後に再発する腫瘍がないことによっても示される。本明細書で使用する場合、「投薬量効果的方法」という用語は、活性化合物の量が被検体または細胞で所望の生物学的作用を発揮することをいう。

医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パックまたはディスペンサーに含めてもよい。

本発明の組成物はさらに塩を形成することができる。本発明の組成物は、分子当たり２つ以上の塩、たとえば、モノ−、ジ−、トリ−を形成することができる。こうした形態もすべて、特許請求の範囲に記載されている発明の範囲内にあることを意図している。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物がその酸性塩または塩基性塩を作ることにより修飾された本発明の化合物の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例として、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩、および同種のものがあるが、これに限定されるものではない。薬学的に許容される塩は、たとえば、無毒性無機酸または有機酸から形成された親化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩を含む。たとえば、そうした従来の無毒性塩として、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、１，２−エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバム酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、サブ酢酸（ｓｕｂａｃｅｔｉｃ）、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸および一般に存在するアミン酸、たとえば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニン等から選択される無機酸および有機酸から得られるものがあるが、これに限定されるものではない。

薬学的に許容される塩の他の例として、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ムコン酸および同種のものが挙げられる。本発明はさらに、親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、たとえば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、またはアルミニウムイオンに置き換えられている場合、あるいは有機塩基、たとえばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンおよび同種のものと配位している場合に形成される塩を包含する。

薬学的に許容される塩への言及にはすべて、同じ塩の溶媒付加体（溶媒和物）が含まれることを理解すべきである。

組成物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、経口投与、経鼻投与、経皮投与、経肺投与、吸入投与、口腔内投与、舌下投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、直腸内投与、胸膜内投与、髄腔内投与および非経口投与される。一実施形態では、化合物は経口投与される。当業者であれば、特定の投与経路の利点を認識するであろう。

化合物を利用する投与レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療対象の状態の重症度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに利用される個々の化合物またはその塩など種々の因子に従い選択される。通常の知識を有する医師または獣医師であれば、当該状態の進行を予防、防止または停止するのに必要な薬剤の有効量を容易に判定し、処方することができる。

開示した本発明の化合物の製剤および投与のための技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）で確認することができる。一実施形態では、本明細書に記載の化合物およびその薬学的に許容される塩は、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈薬と組み合わせて医薬調製物に使用される。好適な薬学的に許容されるキャリアとして、不活性な固体充填剤または希釈薬、および無菌水溶液または有機溶液が挙げられる。本化合物は、本明細書に記載の範囲の所望の投薬量を与えるのに十分な量でそうした医薬組成物中に存在する。

本明細書に使用されるパーセンテージおよび比率はすべて、他に記載がない限り、重量による。本発明の他の特徴と利点は様々な例から明らかである。提示した例は、本発明を実施する際に有用な様々な要素および方法を説明するものである。こうした例は、特許請求の範囲に記載されている発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者であれば、本発明を実施するのに有用な他の要素および方法を特定し、利用することができる。

本発明は、ヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態の調節により、その過程がヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態の調節により影響を受け得る状態および疾患を治療するための組成物および方法であって、前記メチル化状態が、ＥＺＨ２の活性により少なくとも部分的に媒介される組成物および方法を提供する。ヒストンのメチル化状態の調節の結果、メチル化により活性化される標的遺伝子および／またはメチル化により抑制される標的遺伝子の発現レベルが影響され得る。この方法は、そうした治療を必要とする被検体に、治療有効量の本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む。

異常なヒストンメチル化が特定の癌および前癌性状態に関連することが見出されているという事実に少なくとも基づいて、被検体の突然変異型ＥＺＨ２を有する癌または前癌性状態を治療するための方法は、それを必要とする被験体に、メチル化を阻害する治療有効量の化合物を投与することを含む。一実施形態では、被検体の癌または前癌性状態を治療するための方法は、それを必要とする被験体に、非メチル化Ｈ３−Ｋ２７のモノメチル化Ｈ３−Ｋ２７（Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１）への変換を阻害する治療有効量の化合物を投与することを含む。一実施形態では、被検体の癌または前癌性状態を治療するための方法は、それを必要とする被験体に、モノメチル化Ｈ３−Ｋ２７（Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１）のジメチル化Ｈ３−Ｋ２７（Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ２）への変換を阻害する治療有効量の化合物を投与することを含む。一実施形態では、被検体の癌または前癌性状態を治療するための方法は、それを必要とする被験体に、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ２のトリメチル化Ｈ３−Ｋ２７（Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ３）への変換を阻害する治療有効量の化合物を投与することを含む。一実施形態では、被検体の癌または前癌性状態を治療するための方法は、それを必要とする被験体に、Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ１のＨ３−Ｋ２７ｍｅ２への変換およびＨ３−Ｋ２７ｍｅ２のＨ３−Ｋ２７ｍｅ３への変換の両方を阻害する治療有効量の化合物を投与することを含む。細胞のヒストンまたはタンパク質のメチル化レベルが全体的に増大することなく、メチル化の疾患特異的な増大が、重要なゲノム遺伝子座で生じ得ることに注目することは重要である。たとえば、重要な疾患関連遺伝子の異常な過剰メチル化が全体的なヒストンまたはタンパク質の低メチル化の背景に反して生じることが可能である。

メチル化のモジュレーターは、一般に、細胞増殖の調節のために使用することができる。たとえば、場合によっては、過剰な増殖は、メチル化を低下させる薬剤により低減することができるのに対して、不十分な増殖は、メチル化を増大させる薬剤により刺激することができる。したがって、治療することができる疾患には、良性の細胞増殖および悪性の細胞増殖（癌）など過剰増殖の疾患が含まれる。

ＥＺＨ２介在性のタンパク質メチル化が役割を果たす障害として、癌、細胞増殖性障害または前癌性状態があり得る。本発明はさらに、癌の治療に有用な薬物の調製のための、そのような治療を必要とする被検体に対する本発明の組成物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物の使用を提供することができる。治療することができる例示的な癌として、リンパ腫、たとえば、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、たとえば、ＧＣＢリンパ腫を挙げることができる。

一般に、メチル化モジュレーターである化合物は、一般に、細胞増殖の調節のために使用することができる。たとえば、場合によっては、過剰な増殖は、メチル化を低下させる薬剤により低減することができるのに対して、不十分な増殖は、メチル化を増大させる薬剤により刺激することができる。したがって、本発明の化合物により治療することができる疾患には、良性の細胞増殖および悪性の細胞増殖など過剰増殖の疾患が含まれる。

本明細書で使用する場合、「それを必要とする被検体」は、ＥＺＨ２在性のタンパク質メチル化が役割を果たす障害を有する被検体、または一般集団と比較してそうした障害を発症するリスクが高い被検体をいう。それを必要とする被検体は、前癌性状態を有していてもよい。好ましくは、それを必要とする被検体は癌を有する。「被検体」には哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、たとえば、任意の哺乳動物、たとえばヒト、霊長類、トリ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジまたはブタであってもよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

本発明の被検体は、癌または前癌性状態と診断されているか、それらの症状を有するか、またはそれらを発症するリスクのある任意のヒト被検体を含む。本発明の被験体は、突然変異型ＥＺＨ２を発現する任意のヒト被検体を含む。たとえば、突然変異型ＥＺＨ２は１つまたは複数の突然変異を含み、突然変異は、置換、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、欠失もしくは挿入、または本明細書に記載の任意の他のＥＺＨ２突然変異である。

それを必要とする被験体は難治性または抵抗性癌を有することがある。「難治性または抵抗性癌」は、治療に反応しない癌を意味する。癌は治療の初期に抵抗性がある場合も、または治療中に抵抗性になる場合もある。いくつかの実施形態では、それを必要とする被検体は、直近の療法による寛解後に癌が再発している。いくつかの実施形態では、それを必要とする被検体は、癌治療に有効な既知の療法をすべて受けて無効であった。いくつかの実施形態では、それを必要とする被検体は少なくとも１つの先行療法を受けていた。ある種の実施形態では、先行療法は単独療法である。ある種の実施形態では、先行療法は併用療法である。

いくつかの実施形態では、それを必要とする被検体は、以前の療法の結果として二次癌を有することがある。「二次癌」は、以前の発癌療法、たとえば化学療法によりあるいはその結果として発生する癌を意味する。

被検体はまた、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤または他の任意の治療剤に対して抵抗性を示すことがある。

本発明はまた、癌を有する被検体に対する併用療法を選択する方法を特徴とする。この方法は、被検体由来のサンプルにおいて、本明細書に記載の１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異を検出するステップ；および１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異の存在に基づいて、癌を治療するための併用療法を選択するステップを含む。一実施形態では、この療法は、被検体に本発明の組成物を投与することを含む。一実施形態では、この方法は、治療有効量の本発明の組成物を被検体に投与することをさらに含む。ＥＺＨ２突然変異は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して検出することができる。さらに多くの方法が、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１３００４０９０６号明細書に記載されている。

本明細書に記載の方法および使用は、被検体への本発明の組成物（たとえば、化合物４４またはその薬学的に許容される塩と１つまたは複数の治療剤とを含む組成物）の投与前および／または投与後に、それを必要とする被検体に由来するサンプル中に、本明細書に記載の１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異を検出するステップを含むことができる。試験サンプル中に本明細書に記載の１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異が存在すると、被検体が本発明の併用療法に感受性であることが示される。

本発明は、被検体における本明細書に記載の１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異の遺伝子スクリーニングにより、被検体のための個別化医療、治療および／または癌管理を提供する。たとえば、本発明は、併用療法に対する被検体の反応性を判定して、被検体が併用療法に感受性がある場合、被検体に本発明の組成物を投与することにより、それを必要とする被検体の癌の症状または前癌性状態を治療または緩和するための方法を提供する。反応性は、被検体からサンプルを採取し、本明細書に記載の１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異を検出することにより判定し、そうした本明細書に記載の１つまたは複数のＥＺＨ２突然変異が存在すると、被検体は本発明の組成物に感受性があることが示される。被検体の反応性が判定されたならば、治療有効量の組成物、たとえば、化合物４４またはその薬学的に許容される塩と１つまたは複数の治療剤とを含む組成物を投与することができる。組成物の治療有効量は、当業者が判定することができる。

本明細書で使用する場合、「反応性」という用語は、「反応性のある」、「感受性のある」および「感受性」と同義であり、本発明の組成物を投与されたときに被検体が治療反応を示す、たとえば、被検体の腫瘍細胞または腫瘍組織がアポトーシスおよび／もしくは壊死を起こし、かつ／または成長、分裂もしくは増殖の低下を示すことを意味する。この用語はまた、被検体が、本発明の組成物を投与されたときに一般集団と比較して、治療反応を示す、たとえば、被検体の腫瘍細胞または腫瘍組織がアポトーシスおよび／もしくは壊死を起こし、かつ／または成長、分裂もしくは増殖の低下を示す確率が高くなることまたは高いことを意味する。

「サンプル」は、被検体から得られた任意の生物学的サンプルを意味し、以下に限定されるものではないが、細胞、組織サンプル、体液（粘液、血液、血漿、血清、尿、唾液および精液があるが、これに限定されるものではない）、腫瘍細胞および腫瘍組織がある。好ましくは、サンプルは、骨髄、末梢血細胞、血液、血漿および血清から選択される。サンプルは、治療または検査中の被検体から得てもよい。あるいはサンプルは、当該技術分野における通常の業務に従い医師が採取してもよい。

本明細書で使用する場合、「細胞増殖性障害」という用語は、細胞の制御不能な増殖もしくは異常な増殖、または制御不能かつ異常な増殖により、癌性であることもあればそうでない場合もある望ましくない状態または疾患が発症し得る状態をいう。本発明の例示的な細胞増殖性障害は、細胞分裂が無秩序である種々の状態を包含する。例示的な細胞増殖性障害として、新生物、良性腫瘍、悪性腫瘍、前癌性状態、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍、被包性腫瘍、転移性腫瘍、液性腫瘍、充実性腫瘍、免疫学的腫瘍、血液系腫瘍、癌、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫および急速に分裂する細胞があるが、これに限定されるものではない。「急速に分裂する細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、同じ組織内の隣接するまたは並列する細胞において予想または観察される速度を上回るまたはそれより大きな速度で分裂する任意の細胞と定義される。
細胞増殖性障害は前癌または前癌性状態を含む。細胞増殖性障害は癌を含む。好ましくは、本明細書に規定される方法は癌の症状を治療または緩和するために使用される。「癌」という用語は、充実性腫瘍のほか、血液腫瘍および／または悪性腫瘍を含む。「前癌細胞」または「前癌性細胞」は、前癌または前癌性状態である細胞増殖性障害を発現している細胞である。「癌細胞」または「癌性細胞」は、癌である細胞増殖性障害を発現している細胞である。任意の再現可能な測定手段を用いて、癌細胞または前癌性細胞を同定することができる。癌細胞または前癌性細胞は、組織サンプル（たとえば、生検標本）の組織学的分類またはグレード分類により同定してもよい。癌細胞または前癌性細胞は、適切な分子マーカーの使用により同定してもよい。

治療できる癌は、ＤＮＡサイトメトリー、フローサイトメトリーまたはイメージサイトメトリーにより評価してもよい。治療できる癌は、細胞の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が細胞分裂の合成期（たとえば、細胞分裂のＳ期）にあるものとして型別にしてもよい。治療できる癌は、Ｓ期割合が低いまたはＳ期割合が高いものとして型別にしてもよい。

本明細書で使用する場合、「正常な細胞」は、「細胞増殖性障害」の一部として分類できない細胞である。正常な細胞には、望ましくない状態または疾患の発症に至る可能性がある制御不能な増殖もしくは異常な増殖、または制御不能かつ異常な増殖が見られない。好ましくは、正常な細胞は、正常に機能する細胞周期チェックポイント制御機構を有する。

本明細書で使用する場合、「細胞を接触させること」とは、化合物または他の組成物が細胞と直接接触している、あるいは細胞に所望の生物学的作用を起こすのに十分に接近している状態をいう。

本明細書で使用する場合、「候補化合物」とは、その化合物が細胞、組織、系、動物またはヒトにおいて研究者または臨床医が求めている所望の生物学的または医学的反応を惹起する可能性が高いかどうかを判定するため、１つまたは複数のインビトロまたはインビボでの生物学的アッセイで試験したことがあるあるいは試験する予定の本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物をいう。候補化合物は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝物、多形もしくは溶媒和物である。生物学的または医学的反応は、癌の治療であってもよい。生物学的または医学的反応は、細胞増殖性障害の治療または予防であってもよい。インビトロまたはインビボでの生物学的アッセイとして、以下に限定されるものではないが、酵素活性アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、インビトロ細胞生存率アッセイおよび本明細書に記載のアッセイを挙げることができる。

本明細書で使用する場合、「治療すること」または「治療する」は、疾患、状態または障害の対処を目的とした患者の管理およびケアをいい、疾患、状態もしくは障害の症状または合併症を緩和するため、あるいは疾患、状態もしくは障害を除去するため本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む。

本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物はまた、疾患、状態または障害を予防するために使用してもよい。本明細書で使用する場合、「予防すること」または「予防する」は、疾患、状態もしくは障害の症状または合併症の発症を減少または除去することをいう。

本明細書で使用する場合、「緩和する」という用語は、障害の徴候または症状の重症度を低下させるプロセスを記載することを意図している。重要な点として、徴候または症状は、除去することなく緩和することができる。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物を投与すると徴候または症状が除去されるが、しかしながら、除去は必須ではない。効果的な投薬量は徴候または症状の重症度を低下させると予想される。たとえば、複数の部位で起こり得る癌などの障害の徴候または症状は、複数の部位の少なくとも１つで癌の重症度が低下すると緩和される。

本明細書で使用する場合、「重症度」という用語は、癌が前癌性または良性状態から悪性状態に変化する可能性を記載することを意図している。あるいは、またはさらに、重症度は、たとえば、ＴＮＭ方式（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ（ＵＩＣＣ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）により認められた）により、あるいは他の当該技術分野において承認されている方法により癌の病期を記載することを意図している。癌の病期とは、原発腫瘍の位置、腫瘍の大きさ、腫瘍数およびリンパ節転移（癌のリンパ節への広がり）などの因子に基づく癌の程度または重症度をいう。あるいは、またはさらに、重症度は、当該技術分野において承認されている方法により腫瘍グレードを記載することを意図している（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。腫瘍グレードは、癌細胞が顕微鏡下でどのように異常に見えるか、そして腫瘍がいかに急速に増殖し広がる傾向があるかという観点から癌細胞を分類するのに使用するシステムである。腫瘍グレードを判定する際は、細胞の構造および増殖パターンなど多くの因子が考慮される。腫瘍グレードの判定に使用される具体的な因子は、各癌型によって異なる。重症度はまた、腫瘍細胞が同じ組織型の正常な細胞にどの程度類似しているかを示す、分化とも呼ばれる組織学的グレードもいう（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。さらに、重症度は、腫瘍細胞の核の大きさおよび形状と、分裂している腫瘍細胞の割合とを示す核グレードについてもいう（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。

本発明の別の態様では、重症度は、腫瘍が増殖因子をどの程度分泌したか、細胞外マトリックスをどの程度分解したか、どの程度血管新生化したか、隣接した組織への接着をどの程度失ったか、あるいはどの程度転移したかをいう。さらに重症度は、原発腫瘍が転移した部位の数も示す。最後に、重症度は、様々な型および部位の腫瘍の治療のしにくさを含む。たとえば、手術不能な腫瘍、複数の器官に到達しやすい癌（血液系および免疫系の腫瘍）、および伝統的な治療に最も抵抗性があるものが、最も重度と見なされる。これらの状況において、被検体の平均余命の延長および／または疼痛の低下、癌性細胞の比率の低下または細胞が１つの系に限定されること、ならびに癌の病期／腫瘍グレード／組織学的グレード／核グレードの改善は、癌の徴候または症状の緩和と見なされる。

本明細書で使用する場合、「症状」という用語は、疾患、疾病、障害または体内に適切でないものがあることの兆しと定義される。症状は、症状を経験している個体が感じあるいは気付くものであるが、他人は容易に気付くことができない。他人は、非医療専門家と定義される。

本明細書で使用する場合、「徴候」という用語も、体内に適切でないものがあることの兆しと定義される。ただし、徴候は、医師、看護師または他の医療専門家により確認することができるものと定義される。

癌は、ほとんどすべての徴候または症状を引き起こし得る疾患群である。徴候および症状は、癌がどこにあるか、癌の大きさ、および癌が近くの器官または構造にどの程度影響を与えるかによって異なる。癌が広がる（転移する）場合、症状は体の様々な部分で現れることがある。

癌を治療すると、腫瘍の大きさが小さくなることがある。腫瘍の大きさが小さくなることは、「腫瘍退縮」という場合もある。好ましくは、治療後、腫瘍の大きさは、治療前のその大きさと比較して５％以上縮小し；一層好ましくは、腫瘍の大きさは１０％以上縮小し；一層好ましくは２０％以上縮小し；一層好ましくは３０％以上縮小し；一層好ましくは４０％以上縮小し；なお一層好ましくは、５０％以上縮小し；最も好ましくは、７５％超縮小する。腫瘍の大きさは、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の大きさは、腫瘍の直径として測定してもよい。

癌を治療すると、腫瘍容積が縮小することがある。好ましくは、治療後、腫瘍容積は、治療前のその大きさと比較して５％以上縮小し；一層好ましくは、腫瘍容積は１０％以上縮小し；一層好ましくは２０％以上縮小し；一層好ましくは３０％以上縮小し；一層好ましくは４０％以上縮小し；なお一層好ましくは５０％以上縮小し；最も好ましくは７５％超縮小する。腫瘍容積は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。

癌を治療すると、腫瘍の数が減少する。好ましくは、治療後、腫瘍数は、治療前の数と比較して５％以上減少し；一層好ましくは、腫瘍数は１０％以上減少し；一層好ましくは２０％以上減少し；一層好ましくは３０％以上減少し；一層好ましくは４０％以上減少し；なお一層好ましくは５０％以上減少し；最も好ましくは７５％超減少する。腫瘍の数は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の数は、肉眼または特定の倍率で観察できる腫瘍をカウントすることにより測定することができる。好ましくは、特定の倍率は２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍または５０倍である。

癌を治療すると、原発腫瘍部位から離れた他の組織または器官における転移病変の数が減少することがある。好ましくは、治療後、転移病変の数は、治療前の数と比較して５％以上減少し；一層好ましくは、転移病変の数は１０％以上減少し；一層好ましくは２０％以上減少し；一層好ましくは３０％以上減少し；一層好ましくは４０％以上減少し；なお一層好ましくは５０％以上減少し；最も好ましくは７５％超減少する。転移病変の数は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。転移病変の数は、肉眼または特定の倍率で観察できる転移病変をカウントすることにより測定することができる。好ましくは、特定の倍率は２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍または５０倍である。

癌を治療すると、治療した被検体の集団の平均生存期間が、キャリアを単独投与した集団と比較して延長されることがある。好ましくは、平均生存期間は３０日を超えて；一層好ましくは６０日を超えて；一層好ましくは９０日を超えて；最も好ましくは１２０日を超えて延長される。集団の平均生存期間の延長は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の平均生存期間の延長は、たとえば、集団について活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。集団の平均生存期間の延長はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回治療の終了後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。

癌を治療すると、治療した被検体の集団の平均生存期間が、未治療被検体の集団と比較して延長されることがある。好ましくは、平均生存期間は３０日を超えて；一層好ましくは６０日を超えて；一層好ましくは９０日を超えて；最も好ましくは１２０日を超えて延長される。集団の平均生存期間の延長は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の平均生存期間の延長は、たとえば、集団について活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。集団の平均生存期間の延長はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回治療の終了後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。

癌を治療すると、治療した被検体の集団の平均生存期間が、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物ではない薬剤による単独療法を受けた集団と比較して延長されることがある。好ましくは、平均生存期間は３０日を超えて；一層好ましくは６０日を超えて；一層好ましくは９０日を超えて；最も好ましくは１２０日を超えて延長される。集団の平均生存期間の延長は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の平均生存期間の延長は、たとえば、集団について活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。集団の平均生存期間の延長はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回治療の終了後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。

癌を治療すると、治療した被検体の集団の死亡率がキャリアを単独投与した集団と比較して低下することがある。癌を治療すると、治療した被検体の集団の死亡率が未治療集団と比較して低下することがある。癌を治療すると、治療した被検体の集団の死亡率が、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物ではない薬剤による単独療法を受けた集団と比較して低下することがある。好ましくは、死亡率は２％超；一層好ましくは５％超；一層好ましくは１０％超；最も好ましくは２５％超低下する。治療した被検体の集団の死亡率の低下は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の死亡率の低下は、たとえば、集団について活性化合物による治療の開始後の単位時間当たりの疾患関連死亡の平均数を計算することにより測定してもよい。集団の死亡率の低下はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回治療の終了後の単位時間当たりの疾患関連死亡の平均数を計算することにより測定してもよい。

癌を治療すると、腫瘍の成長率が低下することがある。好ましくは、治療後、腫瘍の成長率は治療前の数と比較して少なくとも５％低下し；一層好ましくは、腫瘍の成長率は少なくとも１０％低下し；一層好ましくは少なくとも２０％低下し；一層好ましくは少なくとも３０％低下し；一層好ましくは少なくとも４０％低下し；一層好ましくは少なくとも５０％低下し；なお一層好ましくは少なくとも５０％低下し；最も好ましくは少なくとも７５％低下する。腫瘍の成長率は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の成長率は、単位時間当たり腫瘍直径の変化により測定してもよい。

癌を治療すると、腫瘍の再増殖が抑制されることがある。好ましくは、治療後、腫瘍の再増殖は５％未満であり；一層好ましくは、腫瘍の再増殖は１０％未満であり；一層好ましくは２０％未満であり；一層好ましくは３０％未満であり；一層好ましくは４０％未満であり；一層好ましくは５０％未満であり；なお一層好ましくは５０％未満であり；最も好ましくは７５％未満である。腫瘍の再増殖は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の再増殖は、たとえば、以前の腫瘍縮小後に、治療後生じた腫瘍の直径の増加を測定することにより測定してもよい。腫瘍の再増殖の抑制は、治療を中止した後に腫瘍が再発しないことにより示される。

細胞増殖性障害を治療または予防すると、細胞増殖率が低下することがある。好ましくは、治療後、細胞増殖率は少なくとも５％低下し；一層好ましくは少なくとも１０％低下し；一層好ましくは少なくとも２０％低下し；一層好ましくは少なくとも３０％低下し；一層好ましくは少なくとも４０％低下し；一層好ましくは少なくとも５０％低下し；なお一層好ましくは少なくとも５０％低下し；最も好ましくは少なくとも７５％低下する。細胞増殖率は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。細胞増殖率は、たとえば、組織サンプルにおいて単位時間当たりに分裂している細胞数を測定することにより測定してもよい。

細胞増殖性障害を治療または予防すると、増殖している細胞の比率が低下することがある。好ましくは、治療後、増殖している細胞の比率は少なくとも５％；一層好ましくは少なくとも１０％；一層好ましくは少なくとも２０％；一層好ましくは少なくとも３０％；一層好ましくは少なくとも４０％；一層好ましくは少なくとも５０％；なお一層好ましくは少なくとも５０％；最も好ましくは少なくとも７５％低下する。増殖している細胞の比率は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。好ましくは、増殖している細胞の比率は、たとえば組織サンプルにおいて分裂している細胞数を非分裂細胞の数と比較して定量することにより測定される。増殖している細胞の比率は、分裂指数と等価であり得る。

細胞増殖性障害を治療または予防すると、細胞の増殖部位または領域の大きさが小さくなることがある。好ましくは、治療後、細胞の増殖部位または領域の大きさは、治療前のその大きさと比較して少なくとも５％縮小し；一層好ましくは少なくとも１０％縮小し；一層好ましくは少なくとも２０％縮小し；一層好ましくは少なくとも３０％縮小し；一層好ましくは少なくとも４０％縮小し；一層好ましくは少なくとも５０％縮小し；なお一層好ましくは少なくとも５０％縮小し；最も好ましくは少なくとも７５％縮小する。細胞の増殖部位または領域の大きさは、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。細胞の増殖部位または領域の大きさは、細胞の増殖部位または領域の直径または幅として測定してもよい。

細胞増殖性障害を治療または予防すると、異常な外観もしくは形態を有する細胞の数または比率が低下することがある。好ましくは、治療後、異常な形態を有する細胞数は、治療前のその大きさと比較して少なくとも５％減少し；一層好ましくは少なくとも１０％減少し；一層好ましくは少なくとも２０％減少し；一層好ましくは少なくとも３０％減少し；一層好ましくは少なくとも４０％減少し；一層好ましくは少なくとも５０％減少し；なお一層好ましくは少なくとも５０％減少し；最も好ましくは少なくとも７５％減少する。異常な細胞外観または形態は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。異常な細胞形態は、たとえば倒立型培養顕微鏡を用いて顕微鏡観察により測定してもよい。異常な細胞形態は、核異型の形をとることがある。

本明細書で使用する場合、「選択的に」という用語は、ある集団において別の集団より高頻度で起こる傾向があることを意味する。比較される集団は細胞集団であってもよい。好ましくは、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、癌または前癌性細胞に選択的に作用するが、正常な細胞には作用しない。好ましくは、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、ある分子標的（たとえば、標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）を調節するが、別の分子標的（たとえば、非標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）をあまり調節しないように選択的に作用する。本発明はまた、酵素、たとえばタンパク質メチルトランスフェラーゼの活性を選択的に阻害するための方法を提供する。好ましくは、あるイベントが集団Ｂと比較して集団Ａで２倍を超える高い頻度で起こる場合、そのイベントは、集団Ｂに対して集団Ａにおいて選択的に起こる。あるイベントが集団Ａで５倍を超える高い頻度で起こる場合、そのイベントは選択的に起こる。あるイベントが集団Ｂと比較して集団Ａで１０倍を超える高い頻度で；一層好ましくは５０倍を超える；なお一層好ましくは１００倍を超える；最も好ましくは１０００倍を超える高い頻度で、集団Ａで起こる場合、そのイベントは選択的に起こる。たとえば、細胞死は、正常な細胞と比較して癌細胞で２倍を超える頻度で起こる場合、癌細胞で選択的に起こるといえると考えられる。

本発明の組成物、たとえば、化合物４４またはその薬学的に許容される塩および１つまたは複数の他の治療剤、たとえばプレドニゾンは、分子標的（たとえば、標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）の活性を調節することができる。調節とは、分子標的の活性を刺激または阻害することをいう。好ましくは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が、前記化合物が存在しないこと以外は同じ条件下の分子標的の活性と比較して分子標的の活性を少なくとも２倍刺激または阻害する場合、その化合物は分子標的の活性を調節する。一層好ましくは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が、前記化合物が存在しないこと以外は同じ条件下の分子標的の活性と比較して分子標的の活性を少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍刺激または阻害する場合、その化合物は分子標的の活性を調節する。分子標的の活性は、任意の再現可能な手段により測定することができる。分子標的の活性はインビトロで測定しても、あるいはインビボで測定してもよい。たとえば、分子標的の活性は酵素活性アッセイまたはＤＮＡ結合アッセイによりインビトロで測定してもよいし、あるいは、分子標的の活性はレポーター遺伝子の発現をアッセイすることによりインビボで測定してもよい。

本発明の組成物は、化合物の添加により分子標的の活性が、前記化合物が存在しないこと以外は同じ条件下の分子標的の活性と比較して１０％を超えて刺激または阻害されない場合、分子標的の活性をあまり調節しない。

本明細書で使用する場合、「アイソザイム選択的」という用語は、酵素の第２のアイソフォームと比較して酵素の第１のアイソフォームの優先的な阻害または刺激（たとえば、タンパク質メチルトランスフェラーゼアイソザイムβと比較してタンパク質メチルトランスフェラーゼアイソザイムαの優先的な阻害または刺激）を意味する。好ましくは、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、生物学的作用を得るのに必要な投薬量で最低４倍の差、好ましくは１０倍の差、一層好ましくは５０倍の差を示す。好ましくは、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、阻害範囲にわたりこの差を示し、この差の例としてＩＣ_５０、すなわち、目的の分子標的の５０％阻害が挙げられる。

本発明の組成物を細胞またはそれを必要とする被検体に投与すると、目的のタンパク質メチルトランスフェラーゼの活性が調節（すなわち、刺激または阻害）され得る。

本発明の化合物、たとえば、化合物４４または薬学的に許容される塩と１つまたは複数の他の治療剤、たとえばプレドニゾンとを含む組成物を、細胞またはそれを必要とする被検体に投与すると、細胞内標的（たとえば、基質）の活性が調節（すなわち、刺激または阻害）される。本発明の化合物を用いて、以下に限定されるものではないが、タンパク質メチルトラスフェラーゼなどいくつかの細胞内標的を調節することができる。

活性化とは、組成物（たとえば、タンパク質または核酸）を所望の生物学的機能を発揮するのに好適な状態に置くことをいう。活性化することができる組成物はまた、不活性状態も有する。活性化組成物は、阻害性の生物学的機能または刺激性の生物学的機能を有しても、あるいはその両方を有してもよい。上昇とは、組成物（たとえば、タンパク質または核酸）の所望の生物活性の増加をいう。上昇は、組成物の濃度の増加により起きてもよい。

本明細書で使用する場合、「細胞周期チェックポイント経路」とは、細胞周期チェックポイントの調節に関わる生化学的経路をいう。細胞周期チェックポイント経路は、細胞周期チェックポイントを含む１つまたは複数の機能に対して刺激作用もしくは阻害作用を有しても、あるいはその両方を有してもよい。細胞周期チェックポイント経路は、少なくとも２つの組成物、好ましくはタンパク質からなり、そのどちらも細胞周期チェックポイントの調節に寄与する。細胞周期チェックポイント経路は、細胞周期チェックポイント経路の１つまたは複数のメンバーの活性化により活性化され得る。好ましくは、細胞周期チェックポイント経路は生化学的シグナル伝達経路である。

本明細書で使用する場合、「細胞周期チェックポイント制御因子」とは、細胞周期チェックポイントの調節において少なくともある程度機能し得る組成物をいう。細胞周期チェックポイント制御因子は、細胞周期チェックポイントを含む１つまたは複数の機能に対して刺激作用もしくは阻害作用を有しても、あるいはその両方を有してもよい。細胞周期チェックポイント制御因子はタンパク質でも、あるいはタンパク質でなくてもよい。

癌または細胞増殖性障害を治療すると、細胞死が起こることがあり、好ましくは細胞死により、ある集団で細胞の数が少なくとも１０％減少する。一層好ましくは、細胞死は、少なくとも２０％の減少；一層好ましくは少なくとも３０％の減少；一層好ましくは少なくとも４０％の減少；一層好ましくは少なくとも５０％の減少；最も好ましくは少なくとも７５％の減少を意味する。集団における細胞数は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団における細胞数は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡および光学顕微鏡により測定してもよい。細胞死を測定する方法は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１００（５）：２６７４−８，２００３に示される通りである。一態様では、細胞死はアポトーシスにより起こる。

好ましくは、本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の有効量は、正常な細胞に対してあまり細胞毒性を示さない。治療有効量の化合物の投与により細胞死が正常な細胞の１０％より多く誘導されない場合、治療有効量の化合物は正常な細胞に対してあまり細胞毒性を示さない。治療有効量の化合物の投与により細胞死が正常な細胞の１０％より多く誘導されない場合、治療有効量の化合物は正常な細胞の生存率にあまり影響を与えない。一態様では、細胞死はアポトーシスにより起こる。

本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と細胞を接触させると、癌細胞の細胞死を選択的に誘導または活性化することがある。それを必要とする被検体に本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与すると、癌細胞の細胞死を選択的に誘導または活性化することがある。本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と細胞を接触させると、細胞増殖性障害に冒された１つまたは複数の細胞の細胞死を選択的に誘導することがある。好ましくは、それを必要とする被検体に本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与すると、細胞増殖性障害に冒された１つまたは複数の細胞の細胞死が選択的に誘導される。

本発明は、それを必要とする被験体に、本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することにより、癌を治療または予防する方法であって、本発明の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与すると、以下の１つまたは複数：細胞周期の１つまたは複数の期（たとえば、Ｇ１、Ｇ１／Ｓ、Ｇ２／Ｍ）への細胞の蓄積、または細胞老化の誘導、または腫瘍細胞分化の促進による癌細胞増殖の防止；正常細胞において相当量の細胞死を起こすことのない、細胞毒性、ネクローシスまたはアポトーシスによる癌細胞の細胞死の促進、動物における治療係数が少なくとも２の抗腫瘍活性がもたらされる方法に関する。本明細書で使用する場合、「治療係数」は最大耐量を有効用量で除した値である。

当業者は、本明細書で考察した公知の技術または等価な技術の詳細な説明に関する一般的な参考文献を参照してもよい。そうした文献として、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１８^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０）が挙げられる。さらにこれらの文献は、本発明の態様の製造または使用の際に参照してもよいことは、言うまでもない。

実施例１．
ＥＺＨ２阻害剤とグルココルチコイドとの相乗的な抗腫瘍活性
その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第８，４１０，０８８号明細書に記載されるように、化合物４４を合成した。

化合物４４（Ｃｐｄ４４）をＣＨＯＰのグルココルチコイド受容体アゴニスト（ＧＲａｇ）プレドニゾロンまたは他のＧＲａｇ、たとえばデキサメタゾンとまさに併用した場合に、劇的な相乗作用が観察された。ＣＨＯＰと併用した場合、化合物４４の抗増殖効果は大幅に増強されるが、この相乗作用の大部分は、ＣＨＯＰのＧＲａｇ構成成分であるプレドニゾロン（プレドニゾンの活性代謝物）に帰着させることができる。注目すべきことには、化合物４４とプレドニゾロンの併用により、突然変異を有するＧＣＢ ＮＨＬ細胞のみからすべてのＧＣＢ ＮＨＬ細胞に、ＥＺＨ２阻害に感受性となる細胞の範囲が拡大される。

２種のＥＺＨ２突然変異型細胞株、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２およびＳＵ−ＤＨＬ１０を、化合物４４で４日間前処理し、次いで、さらに３日間、化合物４４と個々のＣＨＯＰとの組合せで併用処理した（４＋３モデル）。マホスファミド（シクロホスファミドのアナログ）、ドキソルビシンおよびビンクリスチンはすべて、それ自体で突然変異細胞株の濃度依存的増殖阻害を示した。したがって、化合物４４と併用したこれらの薬物については併用指数（ＣＩ、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェアを使用して算出した）を得た。しかしながら、これらの細胞株は、プレドニゾロン（プレドニゾンの活性代謝物）単独に感受性を示さなかった。したがって、この場合には、ＣＩを判定することができず、その代りにプレドニゾロンの濃度反応曲線で見られた化合物４４のＩＣ_５０のシフトに基づいて、効力の増強を算出した。

化合物４４とマホスファミドの併用は、両方のＥＺＨ２突然変異型細胞株において、全体を通して相加的な併用有益性をもたらした（図１Ｃ、１Ｆ）。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞では、化合物４４とドキソルビシンの併用は、４＋３モデルにおいて相乗的に作用したが（図１Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ１０細胞ではこの併用は相加であった（図１Ｄ）。さらに化合物４４とビンクリスチンの併用は、両方のＥＺＨ２突然変異型細胞株で相加性を示した（図１Ｂ、１Ｅ）。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞をプレドニゾロンと化合物４４の併用で処理すると、化合物４４について、効力増大方向への９倍シフトが観察された。異なるＧＲａｇであるデキサメタゾンとの処理では、化合物４４のＩＣ_５０はさらに大きな１７倍のシフトになった（図２Ａ、２Ｂ）。化合物４４についての効力シフトの同様な傾向は、ＳＵ−ＤＨＬ１０細胞でも観察された（図２Ｃ、２Ｄ）。

化合物４４とＣＨＯＰの併用効果が、野生型ＥＺＨ２リンパ腫細胞株を化合物４４に感受性にさせ得るが否かを検討した。化合物４４単独処理では、ＥＺＨ２野生型リンパ腫株に増殖阻害を誘導しないので、個々のＣＨＯＰ構成成分の濃度反応曲線に基づいて、効力シフトを算出した。試験した４種のＣＨＯＰ構成成分のうち、ＧＲａｇと化合物４４の併用のみが、野生型ＧＣＢリンパ腫細胞株において効力シフトをもたらした。

次に、化合物４４とＣＨＯＰの併用効果が、ＥＺＨ２突然変異型および野生型細胞株であるＷＳＵ−ＤＬＣＬ２ ＥＺＨ２突然変異型（図３Ａ、３Ｂ）およびＤＯＨＨ２ ＥＺＨ２野生型（図３Ｃ、３Ｄ）ＧＣＢリンパ腫細胞株を化合物４４に感受性にさせ得るか否かを検討した。プレドニゾロンと化合物４４の併用によりＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を処理すると、化合物４４の活性が増強され（図３Ａ）、化合物４４のＩＣ_５０が最大で１／２４に減少した。異なるＧＲａｇであるデキサメタゾンとの処理では、化合物４４のＩＣ_５０はさらに大きく１／３０に減少した（図３Ｂ）。プレドニゾロンについて１μＭおよびデキサメタゾンについて１００ｎＭの生物学的に適切な濃度では、効力増強はそれぞれ７倍および１５倍であった。化合物４４は、ＤＯＨＨ２ ＥＺＨ２野生型細胞において単剤として抗増殖効果を示さないため（図３Ｃ、３Ｄ）、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンの効力シフトを測定した。興味深いことには、化合物４４を野生型ＧＣＢリンパ腫細胞株（ＤＯＨＨ２）で試験した場合、ＣＨＯＰのＧＲａｇ構成成分のみが、化合物４４の存在下で効力増強を示した（図３Ｃ、３Ｄ）。ＤＯＨＨ２細胞において、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンの効力は、化合物４４の添加で増大した（図３Ｃ、３Ｄ）。

ＥＺＨ２野生型および突然変異型ＧＣＢリンパ腫細胞株において、いずれの単剤に比較しても、ＧＲａｇとＥＺＨ２ｉの併用のみが劇的な抗増殖効果の増強を誘導したことを考慮して、化合物の処理期間および／または添加順序が感受性に影響を及ぼすか否かを判定した。また、細胞株パネルを、ＥＺＨ２野生型、ＥＺＨ２突然変異型、化合物４４感受性、およびＥＺＨ２突然変異型、化合物４４非感受性の細胞株を含むように拡張した（以前にＭｃＣａｂｅらにより報告されたもの、および未公開内部データ）。これまでの４＋３モデルでは、効力シフトは、化合物４４（ＥＺＨ２ Ｙ６４６（Ｙ６４１としても知られる）感受性細胞株において）またはプレドニゾロン（ＥＺＨ２野生型細胞株において）の曝露のいずれかに基づくものであった。この実験セットについては、一定濃度のプレドニゾロンにおける化合物４４のＩＣ_５０シフトを使用して、４＋３モデル、４日間もしくは７日間の併用処理、または４日間のプレドニゾロン前処理＋３日間の併用処理のいずれかで処理した細胞株における併用有益性を判定した。ＥＺＨ２突然変異型化合物４４感受性細胞株を４日間併用処理すると、化合物４４のＩＣ_５０が１／３０〜１／６０に低下することが観察され、４＋３処理スケジュールと同様な傾向が示された（表１）。同様の結果は、７日間併用処理および４＋３モデルでも観察された（表１）。ＥＺＨ２野生型ＧＣＢ細胞株では、４日後では測定可能な化合物４４のＩＣ_５０が得られないにもかかわらず、両方の細胞株において、プレドニゾロンとの併用処理の４日後では、増殖の低下および測定可能な化合物４４のＩＣ_５０が示された（表１）。ＥＺＨ２野生型ＧＣＢ細胞は、４＋３モデルおよび／または７日間併用処理スケジュールにも反応した（表１）。印象的なことには、ＥＺＨ２突然変異型化合物４４非感受性細胞株は、これも４日間処理後に測定可能な化合物４４のＩＣ_５０を示さないが、４日間併用処理により増殖の低下を示し、４＋３処理スケジュールによる併用および７日間併用処理に一層大きく反応した（表１）。細胞をプレドニゾロンで前処理し、次いで化合物４４とプレドニゾロンで併用処理した場合には、細胞株の１つしか併用有益性を示さず、薬物添加の順序が相乗作用にとって重要であることが示唆された（表１）。

これらの細胞株における、化合物４４とＧＲａｇの観察された併用有益性の原因となる可能な機序を評価するために、本出願者らは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞およびＲＬ細胞において、プレドニゾロン処理が、単独または化合物４４との併用による４日間処理後にＨ３Ｋ２７の全体的なメチル化およびアセチル化に影響を及ぼすか否かを判定した（２つの独立した実験）。単剤プレドニゾロンは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞またはＲＬ細胞では、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３レベルに影響を及ぼさなかったが、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞では、高用量でＨ３Ｋ２７Ｍｅ３レベルを増大させた（図９Ａ）。プレドニゾロン非感受性のＥＺＨ２突然変異体株と対照的に、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞がプレドニゾロンに高感受性であるため、プレドニゾロン用量を低くすることがＯＣＹ−ＬＹ１９細胞の処理に必要であった。いずれの細胞株においても、プレドニゾロンを含めても、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３阻害に対する化合物４４のＩＣ_５０に変化はなかった（図９Ａ）。同様に、全体的なＨ３Ｋ２７アセチル化レベルも、プレドニゾロン単独または化合物４４とプレドニゾロンの併用により影響を受けなかった（図９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄ）。

Ｈ３Ｋ２７アセチル化またはトリメチル化の全体的なレベルが影響を受けないことが見出されたので、ＧＲシグナル伝達経路の転写調節を検討した。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ１０細胞、ＲＬ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞およびＤＯＨＨ２細胞を、単一濃度の化合物４４、プレドニゾロンまたはそれらの併用で４日間処理し、グルココルチコイドシグナル伝達ＰＣＲアレイを使用して遺伝子発現を分析した（表４）。全体的に、すべての細胞株において、プレドニゾロンおよび併用処理の両方により、より多数の遺伝子がダウンレギュレートされ、遺伝子発現の活性化因子および抑制因子の両方としてのＧＲの役割が示された。ここで、ＧＲの活性化機能に焦点を合わせ、併用処理により細胞株パネルの中で相乗的なアップレギュレーションを示す３種の遺伝子について記載する。ｍＴＯＲシグナル伝達（ｒｅｆ）を阻害する推定上の腫瘍サプレッサーであるセストリン（ＳＥＳＮ１）を、併用療法により４種のＥＺＨ２突然変異型細胞株の間で共通して相乗的にアップレギュレートされる遺伝子として同定したが、ＥＺＨ２野生型細胞株ではそうではなかった（図８Ａおよび表２）。ＴＮＦ発現は、２種のＥＺＨ２突然変異型化合物４４非感受性細胞株の一方（ＳＵＤＨＬ４）においてまさに相乗的にアップレギュレートされ、他方のＥＺＨ２突然変異型化合物４４非感受性細胞株（ＲＬ）に対する傾向も同じ結果を示した（図８Ｂおよび表２）。ＴＳＣ２２Ｄ３／ＧＩＬＺの発現は、プレドニゾロンによりすべての細胞株でアップレギュレートされるが、ＥＺＨ２突然変異型化合物４４感受性細胞では併用処理によりまさに相乗的に増強される（図８Ｃおよび表２）。

ＥＺＨ２野生型（すなわち、ＯＣＩ−ＬＹ１９、ＤＯＨＨ２）、ＥＺＨ２ Ｙ６４６感受性（すなわち、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＳＵＤＨＬ１０）、およびＥＺＨ２ Ｙ６４６抵抗性（すなわち、ＲＬ、ＳＵＤＨＬ４）細胞株について、ＤＭＳＯ対照に規準化したグルココルチコイド受容体の発現レベルを、表示の化合物４４、プレドニゾロン、化合物４４とプレドニゾロンの併用またはＤＭＳＯによる処理後に測定した（２つの生物学的レプリケート、詳細については、方法材料および方法セクション５を参照のこと）。結果に示すように、グルココルチコイド受容体の発現レベルは、併用において、細胞株の間で共通して影響を受けなかった。（図１９）倍率変化値は、ΔΔＣｔ法ならびに参照遺伝子としてＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨを使用して定量した。

次いで、２つのさらなる異種移植片試験でＣＨＯＰレジームから１つまたはすべての化学療法構成成分を省略する効果を検討した。ＳＵＤＨＬ１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を有するマウスを、化合物４４、ＣＯＰ（ドキソルビシン構成成分を含まない化学療法）またはそれらの併用で２８日間処理した（図２０Ａ）。２８日目に安楽死させた８／１６匹のマウスの平均腫瘍重量を比較し、群間で腫瘍重量に有意差があることが示された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；両側ｔ検定）。最大耐用量の化合物４４または化合物４４／ＣＯＰ併用を投与したマウスは、６０日目に１００％の生存を示し、併用群は、化合物４４の最大耐用量を含む、他のすべての治療群と統計的に差がある（ｐ＜０．０５）、最小の２８日目腫瘍重量を示した（図２０Ａ）。

次いで、本出願者らは、２用量の化合物４４または２つの異なるスケジュールのプレドニゾン（Ｐｒｅｄ−１＝１〜５日目および２２〜２６日目に０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ×５のプレドニゾン；Ｐｒｅｄ−２＝０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ×２８のプレドニゾン）と共に、ＳＵＤＨＬ１０異種移植片モデルにおいて、化合物４４とプレドニゾンの２８日間併用投与を検討した。インビトロのデータから示唆されるように、プレドニゾン単独投与では、何ら有意な抗腫瘍効果が誘導されなかった（図２０Ｂ）。以前の研究と一致して、化合物４４の１２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（毎日２回）投薬は、部分的な応答のみをもたらしたが、２サイクルのプレドニゾンとではなく、０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤのプレドニゾンと化合物４４の併用投薬は、高用量の化合物４４単独で達成される可能な最大退縮を誘導した。投与したすべてのマウスの体重を、図２０Ｃに示す。

方法に記載のように、ＳＵＤＨＬ１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を有するマウスを、化合物４４、ＣＯＰ（ドキソルビシン構成成分を含まない化学療法）、またはそれらの併用で２８日間処理した。２８日目に安楽死させた８／１６匹のマウスの平均腫瘍重量を比較すると、群間で腫瘍重量に有意差があることが示された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；両側ｔ検定）。Ｂ）ＳＵＤＨＬ１０（ＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｆ）異種移植片を有するマウスを、２用量の化合物４４または２つの異なるスケジュールのプレドニゾン（Ｐｒｅｄ−１＝１〜５日目および２２〜２６日目に０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ×５のプレドニゾン；Ｐｒｅｄ−２＝０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ×２８のプレドニゾン）で２８日間処理した。両方の化合物はまた、示されるように併用で投与された。平均腫瘍体積±ＳＥＭ（ｎ＝１０）を上部パネルにプロットする。ＥＰＺ−６４３８を投与された群はすべて、統計的に有意な腫瘍増殖の退縮を示すが（ｐ＜０．０１、少なくともビヒクルまたは両方のスケジュールのプレドニゾン単剤に対して；反復測定分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定）、プレドニゾン単剤は、ビヒクルに比較して、何ら有意な抗腫瘍効果を誘発しなかった。

最後に、腫瘍増殖阻害を３つの異なるＥＺＨ２突然変異型リンパ腫異種移植片モデルで評価した。皮下にリンパ腫異種移植片を有するＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスに、化合物４４とＣＨＯＰまたはＣＯＰ（ドキソルビシンを含まないＣＨＯＰ）のいずれかの化学療法を併用投薬し、単剤治療と比較した。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２異種移植片を有するマウスでは、腫瘍増殖阻害は、使用されたすべての化合物４４の用量およびスケジュールで達成され、ＣＨＯＰ化学療法単独よりも良好であった（図７Ａ）。さらに、化合物４４およびＣＨＯＰの併用療法は、強固な抗腫瘍反応、およびいずれの単剤単独よりも（ＣＨＯＰおよび化合物４４それぞれについて４５％および７１％）有意に良好な（ｐ＜０．００１）腫瘍増殖阻害（９３％）を誘導した。すべての単回治療は耐容性があった；第１サイクル後に化合物４４／ＣＨＯＰ併用群に軽微な体重減少（１１．３％）があったが、その後次のサイクル前にはマウスは回復した。

ＳＵ−ＤＨＬ６異種移植片モデルでは、ＥＺＨ２阻害剤ＧＳＫ５０３を使用した、Ｂｅｇｕｅｌｉｎらにより以前に公表された結果とは対照的に、有意な腫瘍増殖阻害は、ＣＨＯＰ単独または化合物４４で観察されなかった（図７Ｂ、上部パネル）。印象的なことには、化合物４４／ＣＨＯＰの併用は腫瘍退縮をもたらした。投薬を２８日目に中止し、腫瘍増殖遅延について６０日目に達するまで観察した場合、この併用により、５８％のマウスに腫瘍がない状態の生存がもたらされた（図７Ｂ、下部パネル）。

ＣＨＯＰのドキソルビシン構成成分は、その心毒性のため、生涯累積投薬許容限度が５５０ｍｇ／ｍ^２未満になる。したがって、この構成成分を排除した化合物４４／化学療法レジメンの併用有益性を検討した。第３の試験では、ＳＵ−ＤＨＬ１０異種移植片を有するマウスを、用量漸増の化合物４４（ＢＩＤ）、ドキソルビシン不含化学療法レジメン（ＣＯＰ）、またはＣＯＰと化合物４４の併用で２８日間治療した。化合物４４のすべての用量およびＣＯＰについて、腫瘍増殖阻害が観察された（図７Ｃ、上部パネル）。２６６ｍｇ／ｋｇ、５３２ｍｇ／ｋｇおよびＣＯＰ／化合物４４併用の治療は、反復測定分散分析およびＤｕｎｎｅｔｔ事後検定により評価すると、ビヒクルとは統計的に差がある（ｐ＞０．００１）退縮をもたらし、化合物４４／ＣＯＰ併用群が最良総合効果を示した。２８日間投薬後、腫瘍量が最小のマウス亜群（１群当たり８匹のマウス）は、腫瘍増殖遅延エンドポイントの間、さらに投薬されなくとも生存し続けた。化合物４４で治療されたマウスについては、明白な用量依存的腫瘍増殖遅延の有益性があったが、ＣＯＰで治療された腫瘍は、化合物４４で治療されたものよりも速く進行した（図７Ｃ、中央パネル）。最大耐用量の化合物４４または化合物４４／ＣＯＰ併用で治療されたマウスは、６０日目に１００％の生存を示し、併用群は、化合物４４の最大耐用量を含む、他のすべての治療群と統計的に差がある（ｐ＞０．０５）、最小の最終腫瘍重量を示した（図７Ｃ、下部パネル）。

Ｂ細胞ＮＨＬのための標準治療は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンで構成される併用化学療法レジメンである。４０〜５０％の完全寛解率を達成することができる一方、相当な割合の患者が再発し、３年全生存率はわずか約３０％である。再発したリンパ腫は、広範囲の抗癌剤に対して抵抗性を示すことがあり、これは、これらの高悪性度の悪性腫瘍を管理するという、クリニックに厳しい課題を提起する。リンパ腫の薬物抵抗性の獲得は、腫瘍細胞の遺伝的多様性および不安定性により部分的に促進される。したがって、化学療法抵抗性のＮＨＬの治療に成功するには、Ｂ細胞ＮＨＬの種々のサブタイプに特異的な複数の経路を標的にする薬物の合理的な併用が必要になる。たとえば、活性化Ｂ細胞タイプのリンパ腫では、ＮＦｋＢ経路の構成的な活性化が療法抵抗性に関係しており、いくつかの新規の標的療法が、このサブタイプでは有望であることが示されている。

ポリコームなどのエピジェネティックなエフェクターも癌細胞化学療法抵抗性に関係している。ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の触媒サブユニットであるＥＺＨ２は、胚中心由来Ｂ細胞リンパ腫における重要な腫瘍形成駆動因子である。これらのより原始的なＢ細胞悪性腫瘍、特に、触媒活性が変化したＥＺＨ２突然変異体を発現する変異体は、増殖および生存のためにＥＺＨ２を必要とする。前臨床試験の結果によると、そのような遺伝的に明確な癌の治療のためにＥＺＨ２触媒阻害剤が極めて有望であると予測され、ＥＺＨ２阻害剤は化学療法抵抗性を低減する可能性もある。本明細書で示すデータから、臨床段階のＥＺＨ２阻害剤である化合物４４は、相加作用から相乗作用に至る範囲の種々の程度に、ＣＨＯＰの構成成分との併用有益性が示される。これらの併用効果は、具体的には胚中心起原のリンパ腫で見出され、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびビンクリスチンの場合には、ＥＺＨ２変異体を有する細胞に限定された。さらに、化合物４４をＣＨＯＰとインビボで併用投薬した場合に、リンパ腫細胞致死作用における顕著な相乗作用も見出された。これは、いずれの単剤も何ら顕著な抗腫瘍活性を示さなかったが、併用ではマウスの５０％超で長期の退縮が誘導されたＳＵ−ＤＨＬ６異種移植片モデルで特に間違いのないものであった。これから、ＥＺＨ２突然変異型リンパ腫の化学療法抵抗性における活性亢進のＥＺＨ２の潜在的な重要性が再確認される。ＣＨＯＰ構成成分の中で、プレドニゾンとの化合物４４の併用が最も強力な抗増殖活性を誘導し、この併用はまた、ＥＺＨ２の突然変異の状態にかかわらず、非感受性のＧＣＢリンパ腫細胞株をＥＺＨ２阻害に感受性にさせることができる可能性がある。さらに、化合物４４およびプレドニゾロンが一緒にまたは順序特定の方法で投薬される場合、この併用有益性はより明らかになり；こうして、ＥＺＨ２阻害剤で細胞をプライミングした後、ＧＲアゴニストにより処理すると、特に効果的であることが判明した。この驚くべき発見は、クリニックでのＥＺＨ２阻害剤の適用にとって潜在的に重要な意味を有する。第１に、広く使用されるＧＲａｇは、薬物誘導アレルギー反応を予防するために、また疼痛、悪心および嘔吐を緩和するために、抗腫瘍薬と併用投与されることが多く、造血悪性腫瘍にアポトーシスを誘導するその能力のために、この癌の治療に極めて重要である。他のＣＨＯＰ構成成分に比較して、ＧＲａｇは重篤な有害作用の誘導が最小である。さらに、ＳＵ−ＤＨＬ１０異種移植片モデルにおけるデータから示唆されるように、化合物４４との併用有益性を保持しながら、ＣＨＯＰレジームからドキソルビシンを排除する見込みがあれば、ドキソルビシンの用量制限的な心臓毒性の副作用を患者に与えずに済ますことができる可能性がある。最後に、前臨床試験から、単剤ＥＺＨ２阻害剤が、ＥＺＨ２突然変異体を有するリンパ腫のみに顕著な細胞致死を誘導することが示されており、このリンパ腫は、未だ対処されてなく臨床的必要性が高い、ある割合（２０％）のＧＣＢリンパ腫患者を象徴する。この結果から、ＧＲａｇ／ＥＺＨ２阻害剤の併用が、すべての胚中心由来Ｂ細胞リンパ腫において臨床的有用性を有し得ることが示される。

グルココルチコイド結合ＧＲ分子は核に移行し、細胞環境に応じて、転写活性化因子または抑制因子のいずれかとして作用することができる。ＧＲは、生産的な相互作用のためにヌクレオソームを常時サンプリングすることが示唆されており、クロマチン修飾酵素の目的は、ＧＲ、そのコファクターおよび基本転写機構のＤＮＡへの到達を制御することである。他の試験から、ＧＲはすでに存在する開いたクロマチン領域に結合することが多く、所与の細胞型のクロマチン構造は、ＧＲが組織特異的な様式で作用することができるように、組織化されることが示される。ＧＲ結合部位への到達可能性は、ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリングによりさらに高められ、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体がこの活性で重要な役割を果たす。特定の理論または特定の作用機序に拘束されたくはないが、ＥＺＨ２媒介のＨ３Ｋ２７の過剰トリメチル化により誘導される異常なクロマチン抑制により、そうでなければ到達可能なＧＲ結合部位の一部がブロックされ、正常なＧＲ媒介遺伝子誘導または抑制が干渉され得ることが考えられる。実際、すべてのＥＺＨ２突然変異型リンパ腫細胞株は、ＧＲａｇ処理に非感受性であるが、ＥＺＨ２野生型細胞では、濃度依存的な細胞致死作用が観察される。プレドニゾロンで前処理し、次いで化合物４４で処理すると、試験したほとんどすべての細胞株で相乗作用を誘導することができず、ＥＺＨ２阻害剤が誘導するクロマチンリモデリングがＧＲ作用の増強の律速段階である可能性が指摘される。さらに、ＰＲＣ２は、ＳＷＩ／ＳＮＦ機能と拮抗することが知られており、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のコアサブユニット−ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１ＡおよびＩＮＩ１−は、急性リンパ芽球Ｔ細胞白血病におけるプレドニゾロン抵抗性に関連している。ＩＮＩ１減少とＥＺＨ２過剰活性化の関連性がラブドイド腫瘍で確立されているので、ＳＷＩ／ＳＮＦ機能が亢進した後にＧＲのその結合部位への到達可能性を大きくする可能性のある、全体的なＩＮＩ１タンパク質レベルが、化合物４４またはプレドニゾロンに曝露された種々のリンパ腫細胞で増大するか否かを検討した。

ＧＲ経路遺伝子発現アレイにより、数種類のＧＣＢリンパ腫細胞（ＥＺＨ２野生型および突然変異体型の両方）を化合物４４、プレドニゾロンまたはそれらの併用で処理した後に、遺伝子発現が増大することも低下することも明らかになり、ＧＲの二重機能が確認された。すべてのＥＺＨ２突然変異型リンパ腫細胞において併用により相乗的にアップレギュレートされた唯一の遺伝子は、ＤＮＡ損傷および酸化ストレスに対する細胞応答で機能を有するＴＰ５３腫瘍サプレッサーであるＳＥＳＮ１であった。セストリンは、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化し、その結果ｍＴＯＲ経路の阻害をもたらすことにより細胞増殖を阻害する。したがって、ＳＥＳＮ１媒介のｍＴＯＲ経路阻害は、化合物４４処理後にＥＺＨ２突然変異型リンパ腫細胞にＧＲａｇ感受性を再導入する重要な機序になる可能性がある。

反対に、ＧＲａｇ／化合物４４の併用処理は、ＥＺＨ２阻害剤処理に抵抗性であると報告されているＥＺＨ２変異型リンパ腫細胞株（ＲＬ、ＳＵ−ＤＨＬ４）に細胞致死を誘導することもできる可能性がある。ＳＥＳＮ１は、これらの細胞株においても併用処理で誘導されるが、強力な炎症性サイトカインであるＴＮＦのさらなる相乗的なアップレギュレーションがＲＬ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞で特異的に観察された。ＴＮＦおよびグルココルチコイドは通常拮抗的に作用するので、この観察は驚くべきことのように見える。ＴＮＦは、その受容体ＴＮＦＲ−１を介してアポトーシスを誘導することができるが、主としてＮＦｋＢ経路を通して生存シグナルを伝達する能力も有する。したがって、化合物４４／プレドニゾロンの併用により誘導されるＴＮＦ発現の増大は、ＮＦｋＢ媒介転写のＧＲアゴニスト抑制の文脈において、アポトーシス方向にＴＮＦ作用をシフトさせる可能性がある。しかしながら、この機序が、化合物４４非感受性ＥＺＨ２突然変異型細胞に相乗的な細胞致死をもたらす理由は明らかではない。ＧＲａｇ抵抗性におけるＮＦｋＢ経路の負の調節因子の異常な抑制が重要である可能性およびそれを媒介するＥＺＨ２に役割がある可能性は、ＧＩＬＺが、併用により、６細胞株のうちの２細胞株で相乗的にアップレギュレートされるという観察によりさらに支持される。

方法
培地スループットアッセイ
リンパ腫細胞を、フラスコに播種し（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２およびＤＯＨＨ２について５０，０００細胞／ｍＬ、ＳＵ−ＤＨＬ１０について１０，０００細胞／ｍＬ、Ｔｏｌｅｄｏについて１００，０００細胞／ｍＬ）、Ｔｏｌｅｄｏアッセイのために、７用量の化合物４４またはＤＭＳＯで、４日間または６日間前処理した。次いで、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＤＯＨＨ２について５０，０００細胞／ｍＬ、ＳＵ−ＤＨＬ−１０について３０，０００細胞／ｍＬに細胞を再分割し、ＨＰ Ｄ３００デジタルディスペンサー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、化合物４４と目的の化合物で併用処理した。両方の薬物を段階的に２倍希釈し、プレートにわたり対角線上に一定の比となるマトリックスで混合し、最終的なＤＭＳＯ含量を０．１１％（ｖ／ｖ）とした。３日間の併用処理後（Ｔｏｌｅｄｏアッセイについては５日間）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＡＴＰ含量により細胞生存率を測定し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してルミネセンスを検出した。

相乗作用の定量化は、薬物併用に関するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法を使用して行った（参考文献１）。併用指数（ＣＩ）式は、相加作用（ＣＩ＝１）、相乗作用（ＣＩ＜１）および拮抗作用（ＣＩ＞１）に関する定量的定義を提供する。この式は、一定比の薬物併用からの分割効果（Ｆａ）を使用してＣＩ値を決定する。得られた（Ｆａ−ＣＩ）プロットには、９５％信頼区間で囲まれた、算出ＣＩ値が示される。これらのＦａ−ＣＩプロットは、ウィンドウズ（登録商標）ソフトウェアのＣａｌｃｕｓｙｎを使用して作成される（参考文献２）。信頼区間線も１未満である、１未満のＣＩ値は統計的に有意な相乗作用を示す。

一方の薬物のみが５０％を超える阻害を示す薬物併用の場合には、効力シフトを判定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して用量応答をプロットし、５０％または６０％の阻害濃度を用量応答曲線から内挿した。用量応答に対する信頼区間が重ならなかった場合、効力シフトは有意であると見なされた。

細胞株、化合物および処理の概要
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＳＵ−ＤＨＬ１０、ＲＬ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−ＬＹ１９およびＤＯＨＨ２は、以前に記載のものである（ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏ ２０１２）。併用試験については、本出願者らの懸濁細胞における増殖アッセイの修正版を、以前に記載のように使用した（Ｄａｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｌ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２０，１．Ｐｇ．５３−６５（２０１１）；Ｄａｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２１，１３，２５３３−２５４１（２０１３））。手短に言えば、０日目に、４日間にわたる直線的な対数増殖期を保証するような初期密度で、９６ウェルプレートに三つ組で細胞を播種した。化合物４４の用量曲線（１μＭの最大用量で開始する）、プレドニゾンの４日間ＩＣ５０の１／１０の濃度のプレドニゾロン（カタログ番号および製造業者）の単一用量、または化合物４４とプレドニゾンの併用で細胞を処理した。４日目に、ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターにおいて、Ｖｉａｃｏｕｎｔ試薬を使用して細胞をカウントし、さらなる３日間のために、生細胞数を用いて最初の密度に細胞を再播種した。化合物４４で前処理した細胞には、化合物４４のみを継続して施すか、または化合物４４とプレドニゾロン（一定用量）の併用を施し；プレドニゾロンで前処理した細胞には、プレドニゾロンを継続的に施すか、またはプレドニゾロンと化合物４４の併用を施し；４日間併用処理した細胞には、７日間を通して併用処理を継続した。

異種移植片試験
この試験における動物の取り扱い、世話および治療に関する手順はすべて、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）の手引きに従い、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ｏｆ ＣＲＬ Ｐｉｅｄｍｏｎｔ ａｎｄ Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒにより承認されたガイドラインに従って行なった。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ６細胞またはＳＵ−ＤＨＬ１０細胞を対数増殖期中期に回収し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５０％含むＰＢＳ中に再懸濁し、免疫無防備状態のマウスに注射した。各マウスに、１×１０７細胞（０．２ｍＬの細胞浮遊液）を右側腹部の皮下に注入し、腫瘍が所定のサイズに到達したならば、種々の用量の化合物４４を最大２８日間種々のスケジュールで経口投与し、かつ／またはＣＨＯＰ／ＣＯＰを以下のスケジュールで投与した：シクロホスファミドを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、ドキソルビシンおよびビンクリスチンを各々ボーラス尾静脈注射（ｉ．ｖ．）で投与し；各々を、ＳＵ−ＤＨＬ６試験では１日目および８日目に、またＷＳＵ−ＤＬＣＬ２およびＳＵ−ＤＨＬ１０の試験では１日目および２２日目に、１日１回投与した。プレドニゾンを、ＳＵ−ＤＨＬ６試験では１日目および８日目に開始し（（ｑｄ×５）×２、１日目、８日目）、またＷＳＵ−ＤＬＣＬ２およびＳＵ−ＤＨＬ１０の試験では１日目および２２日目に開始する（（ｑｄ×５）×２、１日目、２２日目）、５日間毎日投与の２サイクルでｐ．ｏ．投与した。各用量は、０．２ｍＬ／２０ｇマウスの容量（１０ｍＬ／ｋｇ）で送達し、最後に記録した個々の動物の体重に対して調節した。腫瘍測定および体重を、すべての試験について、１週に２回、２８日間収集した。ＳＵ−ＤＨＬ１０およびＳＵ−ＤＨＬ６の試験における腫瘍増殖遅延を判定するために、その新生物が２０００ｍｍ３のエンドポイント体積に到達したときか、または試験の最終日（６０日目）のいずれか最初に来た方で、各試験動物を安楽死させた。

定量的ＰＣＲ
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ１０細胞、ＲＬ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞およびＤＯＨＨ２細胞を、ＤＭＳＯ、１μＭの化合物４４（ＳＵ−ＤＨＬ１０は１００ｎＭの化合物４４で処理）、４日間ＩＣ_５０の１／１０濃度のプレドニゾロン用量、または薬物の併用で４日間並行して処理した。細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；７４１３４）を使用して、細胞ペレットから全ｍＲＮＡを抽出した。ＲＴ２ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＰＣＲアレイ（Ｑｉａｇｅｎ；ＰＡＨＳ−１５４ＺＥ−４）のために、ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；３３０４０１）によりｃＤＮＡを作製した。ＲＴ２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ；３３０５２１）と共にＶｉｉＡ ７ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）］を使用して、アレイＲＴ−ＰＣＲを行った。遺伝子発現をアレイのＢ２Ｍに規準化し、ΔΔＣｔ法を使用してＤＭＳＯに比較した倍率変化を算出した。アレイデータを検証するために、ＴａｑＭａｎプローブベースのｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢ；４４４４９６４）ならびにセストリン（ＡＢ；Ｈｓ００９０２７８７＿ｍ１）およびＴＮＦ（ＡＢ；Ｈｓ０１１１３６２４＿ｍ１）に対するＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用して行った。倍率変化をＲＰＬＰＯ（ＡＢ；４３３３７６１Ｆ）に対して規準化して、上記のように算出した。

ＥＬＩＳＡ
上記のように、ヒストンを腫瘍サンプルから抽出した。ヒストンをコーティング緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ＢＳＡ）中、当量濃度で調製して、０．５ｎｇ／μｌサンプルを得、サンプルまたは標準物質１００μｌを、２個の９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸ ＃３８８５）に二つ組で加えた。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、Ｂｉｏ Ｔｅｋプレート洗浄機上、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０；１０×ＰＢＳＴ、ＫＰＬ＃５１−１４−０２）でプレートを３回洗浄した。プレートを３００μｌ／ウェルの希釈剤（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０）でブロックし、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。すべての抗体を希釈剤で希釈した。１００μｌ／ウェルの抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（ＣＳＴ＃９７３３、５０％グリセロールストック１：１，０００）または抗全Ｈ３（Ａｂｃａｍ ａｂ１７９１、５０％グリセロール１：１０，０００）を各プレートに加えた。プレートを室温で９０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの抗Ｒｂ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７０７４）をＨ３Ｋ２７Ｍｅ３プレートに１：２，０００で、またＨ３プレートに１：６，０００で加え、室温で９０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。検出のために、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＴＭＢＳ）を加え、プレートを室温で５分間、暗所でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダーで読み取った。

実施例２．
化合物４４とエベロリムスは相乗的に作用して、ＥＺＨ２突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞のＧ１期における細胞周期停止および野生型ＥＺＨ２ ＳＵ−ＤＨ−Ｌ５細胞のアポトーシスを増強する
図１１のパネルＢおよびＥでは、各点は、初期および後期アポトーシスにゲートされた細胞のパーセントの平均を表す（アネキシンＶ陽性、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。パネルＣおよびＦでは、進行曲線上の点は、ＤＮＡ含量によりゲートされた細胞の平均パーセントを表す（ＰＩ陽性、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝２）。パネルＡでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を、４００：１の一定比にて、化合物４４とエベロリムスの併用で処理した。併用により、０．３４〜０．００３のＣＩ値を有する、極めて強力な相乗作用が誘導されることが示された。パネルＢでは、化合物４４（５００ｎＭ）、エベロリムス（５ｎＭ）または同濃度の併用で処理したＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞におけるアポトーシスレベルを評価した。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞においてアポトーシスの増大は見られなかった。パネルＣでは、細胞周期のＧ１期の顕著な増大が、化合物４４単独に比較して、併用処理後に観察された。パネルＤでは、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞を、４０００：３の一定比にて、併用で処理した。併用により、０．１３５〜０．００８のＣＩ値を有する極めて強力な相乗作用が誘導されることが示された。パネルＥでは、化合物４４単独に比較して、併用処理（５００ｎＭの化合物４４、０．７５ｎＭのエベロリムス）後に、アネキシン陽性細胞の顕著な増大が観察された（ｐ＜０．０００１）。パネルＦでは、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ１期の顕著な増大が併用処理後に観察された。

実施例３
化合物４４とイブルチニブは相乗的に作用して、ＥＺＨ２突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞および野生型ＥＺＨ２ ＳＵ−ＤＨ−Ｌ５細胞のアポトーシスを増強する
図１２のパネルＢおよびＥでは、各点は、初期および後期アポトーシスにゲートされた細胞のパーセントの平均を表す（アネキシンＶ陽性、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。パネルＣおよびＦでは、進行曲線上の点は、ＤＮＡ含量によりゲートされた細胞の平均パーセントを表す（ＰＩ陽性、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝２）。パネルＡでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を、４：５の一定比にて、化合物４４とイブルチニブの併用で処理した。これらの薬剤の併用により、０．３９〜０．１４の間のＣＩ値を有する強力な相乗作用が示される。パネルＢでは、化合物４４（５００ｎＭ）、イブロチニブ（６２５ｎＭ）または併用で処理したＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞におけるアポトーシスレベルを評価した。この併用により、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞におけるアポトーシスの相乗的な時間依存的増大が示された。パネルＣでは、細胞周期分析により、併用処理後に急激に増大する、Ｇ１期にあるＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞のパーセントの時間依存的増大が示された。パネルＤでは、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞を、化合物４４：イブルチニブの１：５の一定比で処理した。併用により、０．２２２〜０．００２のＣＩ値を有する、極めて強力な相乗作用が誘導された。パネルＥでは、化合物４４単独に比較して、化合物４４（１０００ｎＭ）とイブルチニブ（２５００ｎＭ）による併用処理後に、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞のアネキシン陽性染色が相乗的かつ時間依存的に増大する（ｐ＜０．０００１）。パネルＦでは、併用で処理したＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の細胞周期分析により、各薬剤単独に比較して、併用処理後のｓｕｂ−Ｇ１集団中の細胞の増加が明らかになった。

実施例４
化合物４４とＭＫ−２２０６は相乗的に作用して、ＥＺＨ２突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞および野生型ＥＺＨ２（ＳＵ−ＤＨ−Ｌ５およびＯＣＩ−ＬＹ−１９）細胞のアポトーシスを増強する
図１３のパネルＡでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を、４：１の一定比にて、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用で処理した。Ｆａ−ＣＩプロットにより、０．７７〜０．００５の間のＣＩ値を有する極めて強力な相乗作用が示される。パネルＢでは、化合物４４（２０００ｎＭ）とＭＫ−２２０６（４００ｎＭ）で併用処理すると、アネキシン陽性ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞のパーセントが時間依存的に増大する。パネルＣでは、細胞周期分析により、化合物４４単独に比較して、併用処理の１日後に急激に増大する、Ｇ１期にあるＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞のパーセントの増大が明らかになった（ｐ＜０．０００１）。パネルＤでは、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞を、化合物４４とＭＫ−２２０６の２：１の一定比で処理した。併用により、０．２７６〜０．００１のＣＩ値を有する、極めて強力な相乗作用が誘導された。パネルＥでは、ＳＵ−ＤＨＬ−５のアポトーシスレベルの評価により、化合物４４単独に比較して、併用処理（５００ｎＭの化合物４４と２５０ｎＭのＭＫ−２２０６）の２４時間後に、アネキシン陽性細胞の増加が明らかになった（ｐ＜０．０００１）。パネルＦでは、併用で処理したＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の細胞周期分析により、薬剤個々による処理に比較して、ｓｕｂ−Ｇ１集団中の細胞のパーセントの増大が示された。パネルＧでは、７１．４の１／α値を有する、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞における強力な相乗作用が、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用治療により観察された。パネルＨでは、化合物４４単独に比較して、併用（１０００ｎＭの化合物４４と２５００ｎＭのＭＫ−２２０６）で処理した場合に、アポトーシスの時間依存的な増大が示された（ｐ＜０．０００１）。パネルＩでは、併用で治療したＯＣＩ−ＬＹ１９細胞の細胞周期分析により、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の時間依存的な増加が明らかになった（ｐ＜０．０００１）。

実施例５
化合物４４とＢＣＲ経路阻害剤の併用による標的遺伝子の調節
図１４のパネルＡでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞において、化合物４４とイブルチニブの併用によるＥＧＲ１（４０倍）およびＦＯＳ（４倍）のダウンレギュレーションを単剤と比較する。パネルＢでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞において、化合物４４とＭＫ−２２０６の併用によるＡＩＣＤＡ（３倍）およびＴＣＬ１Ａ（５倍）のアップレギュレーションを単剤と比較する。パネルＣでは、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞において、化合物４４とイブルチニブの併用によるＧＪＡ１（３倍）のアップレギュレーションを単剤と比較する。統計解析の値は、二つ組または三つ組の平均±ＳＤである。ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

実施例６
胚中心Ｂ細胞株における、ＥＺＨ２阻害と、ＢＣＲシグナル伝達経路の調節、ＢＣＬ２阻害およびＧＲアゴニズムとの間の相乗的な相互作用
ＤＬＢＣＬ生物学に関係するシグナル伝達経路のキープレーヤーに関して、いくつかの相乗的な組合せがこの試験で明らかになった（図１５を参照のこと）。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードのノード、ＭＡＰＫカスケードのＭＥＫ１／２、ＳＹＫおよびＢＴＫなどのＢ細胞受容体経路のノードを標的にする阻害剤は、ＥＺＰ−６４３８と併用すると極めて強力な相乗作用を示し、ＥＺＨ２阻害の影響を、突然変異型ＥＺＨ２を有するＧＣＢ細胞株から野生型サブタイプのものにまで拡大する。ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の阻害剤であるオバトクラックス、ナビトクラックスおよびＡＢＴ−１９９は、化合物４４と併用すると相乗的な抗増殖活性を示した。グルココルチコイド受容体アゴニストであるプレドニゾロンおよびデキサメタゾンは、突然変異細胞株におけるＥＺＨ２阻害の劇的な増強を示し、ＥＺＨ２ｉに対して野生型を感受性にする。Ｒ−ＣＨＯＰにおいて化学療法薬と組み合わせる抗体であるリツキシマブは、ｃｄ−２０を標的にして、突然変異細胞株においてインビトロの抗増殖効果の増強を誘発する。

実施例７
化合物４４とエベロリムスは相乗的に作用して、突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞のＳおよびＧ２／Ｍ期ならびに野生型ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞のＧ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ期にある細胞集団を減少させる
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞（データを示さず）を、化合物４４（ＷＳＵおよびＳＵ−ＤＨＬ−５に対して５００ｎＭ）で前処理した後、化合物４４とエベロリムス（ＷＳＵ：５ｎＭ、ＳＵ−ＤＨＬ−５：０．７５ｎＭ）の組合せで併用処理した。図１６のパネルＡでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を単剤または併用で処理した場合に、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ１期の変化は見られない。パネルＢおよびＣでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を併用で処理した場合に、細胞周期のＳ期およびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な時間依存的減少が見られる。パネルＤ、ＥおよびＦでは、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な減少が、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞に対する併用処理後４８時間に見られる。

実施例８
化合物４４とイブルチニブは相乗的に作用して、突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞および野生型ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期にある細胞集団を減少させる
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞（データを示さず）を、化合物４４（ＷＳＵ：５００ｎＭ、ＳＵ−ＤＨＬ−５：１０００ｎＭ）で前処理した後、化合物４４とイブルチニブ（ＷＳＵ：６２５ｎＭ、ＳＵ−ＤＨＬ−５：２５００ｎＭ）の組合せで併用処理した。図１７のパネルＡ、ＢおよびＣでは、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な減少が、単剤としての化合物４４またはイブルチニブに比較して、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞の併用処理後２４時間に見られる。パネルＤ、ＥおよびＦでは、細胞周期のＧ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な時間依存的減少が、単剤としての化合物４４またはイブルチニブに比較して、ＳＵ−ＤＨＬ−５の併用処理後に見られる。

実施例９
化合物４４とＭＫ−２２０６は相乗的に作用して、突然変異型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞ならびに野生型ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期にある細胞集団を減少させる
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞を、化合物４４（それぞれ２０００ｎＭ、５００ｎＭおよび１０００ｎＭ）で前処理した後、化合物４４とＭＫ−２２０６（それぞれ４００ｎＭ、２５０ｎＭおよび２５００ｎＭ）の組合せで併用処理した。図１８のパネルＡでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞をＭＫ−２２０６との併用で処理した場合、細胞周期のＧ１期の相乗的な時間依存的減少が見られる。パネルＢおよびＣでは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を併用で処理した場合、細胞周期のＳおよびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な減少が見られる。パネルＤ、ＥおよびＦでは、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な減少が、単剤に比較して、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞の併用処理後４８時間に見られる。パネルＧ、ＨおよびＩでは、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞を併用で処理した場合、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期それぞれの細胞の相乗的な時間依存的減少が見られる。

個々のＳＯＣまたは野生型およびＥＺＨ２突然変異体を有するＤＬＢＣＬ細胞株に対する他の選択された薬剤と化合物４４の併用を使用する増殖試験の結果を表５に示す。

増殖アッセイで使用した化合物の効力および各細胞株で使用した用量を表６に示す。

参照による援用
本明細書に引用する刊行物および特許文書はすべて、そうした刊行物または文書を本明細書に援用するために具体的に個々に示しているかのように本明細書に援用する。刊行物および特許文書の引用は、いずれかが適当な従来技術であること認めることを意図するものではなく、その内容または日付について何ら承認することにならない。これまで本発明を書面による記載により説明してきたが、当業者であれば、本発明を種々の実施形態で実施することができること、および前述の記載および下記の例は説明を目的としたものであり、以下の特許請求の範囲の限定を目的としたものでないことを認識するであろう。

均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴を逸脱することなく他の特定の形態で実施することができる。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で本明細書に記載の本発明に関する限定ではなく、例示と見なすべきである。このため本発明の範囲は、明細書本文ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等範囲に属するすべての変更をすべてその範囲内に包含することを意図している。

Claims (27)

1. それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤および治療有効量の標準治療剤を投与することを含む方法。
2. それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤を含む併用の治療有効量を投与することを含む方法。
3. それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
4. 前記癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記非ホジキンリンパ腫が、ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）またはＧＣＢ（胚中心Ｂ細胞様）リンパ腫である、請求項４に記載の方法。
6. 前記癌がＥＺＨ２野生型癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記癌がＨ３Ｋ２７でのトリメチル化の増加を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記リンパ腫がＥＺＨ２突然変異型リンパ腫である、請求項５に記載の方法。
9. 前記ＥＺＨ２突然変異型リンパ腫が、Ｙ６４６、Ａ６８２またはＡ６９２の突然変異を有する、請求項８に記載の方法。
10. 前記癌がＥＺＨ２阻害剤抵抗性または難治性癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記標準治療剤が、Ｒ−ＣＨＯＰ構成成分、ＢＣＬ阻害剤、またはＢＣＲ阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記Ｒ−ＣＨＯＰが、グルココルチコステロイド受容体アゴニストである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記グルココルチコステロイド受容体アゴニストがプレドニゾロンまたはデキサメタゾンである、請求項１２に記載の方法。
14. ドキソルビシンがＲ−ＣＨＯＰから省略されている、請求項１１に記載の方法。
15. 前記ＢＣＬ阻害剤が、ナビトクラックス、オバトクラックスまたはＡＢＴ−１９９である、請求項１１に記載の方法。
16. 前記ＢＣＲ阻害剤が、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードの阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
17. 前記ＢＣＲ阻害剤が、リツキシマブ、ＭＫ−２２０６、イデラリシブ、トラメチニブ、タマタニブ、エベロリムス、ベルケイド、またはイブルチニブである、請求項１１に記載の方法。
18. 前記ＥＺＨ２阻害剤が下記式：
    
    を有する化合物４４またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記ＥＺＨ２阻害剤および標準治療剤が、同時にまたは逐次的に投与される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＥＺＨ２阻害剤が、標準治療剤の投与前に投与される、請求項１８に記載の方法。
21. 少なくとも１つの遺伝子が前記患者においてアップレギュレートされている、請求項１８に記載の方法。
22. 前記遺伝子が、セストリン、ＴＮＦおよびＧＩＬＺからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記遺伝子がグルココルチコイド標的遺伝子である、請求項２１に記載の方法。
24. 遺伝子のアップレギュレーションが、請求項１に記載のＥＺＨ２阻害剤の治療有効量を決定または調節するために使用される、請求項２１に記載の方法。
25. 遺伝子のアップレギュレーションが、請求項１の標準治療剤の治療有効量を決定または調節するために使用される、請求項２１に記載の方法。
26. 請求項１に記載の治療方法に対する患者を選択する方法であって、前記患者が、セストリン、ＴＮＦおよびＧＩＬＺからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現プロファイルに基づいて選択される方法。
27. 前記患者が、セストリン、ＴＮＦまたはＧＩＬＺの発現をアップレギュレートしている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療方法。