KR20240001703A - 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (usp22)의 억제제 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 그의 용도 - Google Patents

유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (usp22)의 억제제 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240001703A
KR20240001703A KR1020237039968A KR20237039968A KR20240001703A KR 20240001703 A KR20240001703 A KR 20240001703A KR 1020237039968 A KR1020237039968 A KR 1020237039968A KR 20237039968 A KR20237039968 A KR 20237039968A KR 20240001703 A KR20240001703 A KR 20240001703A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
usp22
nitrothiophen
ethan
cells
reg
Prior art date
Application number
KR1020237039968A
Other languages
English (en)
Inventor
데유 팡
엘레나 몬토티
밍 얀
베이쉬 가오
에이미 탕
휘핑 리우
Original Assignee
노쓰웨스턴유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노쓰웨스턴유니버시티 filed Critical 노쓰웨스턴유니버시티
Publication of KR20240001703A publication Critical patent/KR20240001703A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A61K31/10—Sulfides; Sulfoxides; Sulfones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4436—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 개시된다. 개시된 방법은 암을 포함하는 세포 증식과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, EC:3.4.19.12 활성, 또는 유비퀴틴의 C-말단 글리신에 의해 형성된 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 펩티드 및 이소펩티드 결합의 티올-의존적 가수분해를 특이적으로 억제하는 USP22의 억제제가 개시된다. 개시된 화합물은 또한 USP22 활성과 연관된 세포 증식성 질환 또는 장애의 치료를 위한 제약 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.

Description

유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 억제제 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 그의 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2021년 4월 23일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 63/201,330에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
연방정부 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 CA232347 및 CA220801 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 출원되고 있으며, .txt 형식의 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2022년 4월 25일에 생성된 명칭이 "702581_02132_ST25.txt"인 서열 목록을 함유하며, 18,669 바이트의 크기이다. 이 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야는 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 소분자 억제제 및 USP22 생물학적 활성과 연관된 질환 및 장애를 치료하는데 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 분야는 세포 증식성 질환 및 장애, 예컨대 암의 치료를 위한 제약 조성물로서 제제화될 수 있는 USP22의 펩티다제 활성의 소분자 억제제에 관한 것이다.
유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 발현은 모든 유형의 인간 암은 아니더라도, 많은 암에서 종종 증가된다. USP22는 부분적으로 종양 억제인자 p53 전사 활성을 감소시키고 세포 주기 진행을 촉진시키는 것을 통해 폐암 및 결장암에서 종양형성 및 진행에서 잠재적인 종양유전자로서 기능한다. 면역 세포에서 유전적 USP22 억제를 갖는 마우스는 폐암, 림프종, 흑색종, 및 결장암을 포함하는 다수의 동계 종양 모델을 사용하여 더 우수한 종양 거부를 갖는다. 이들 결과는, 한편으로는, 종양 세포에서의 USP22의 억제가 그들의 아폽토시스를 직접적으로 유도하고 세포 주기 진행을 차단할 수 있고, 다른 한편으로는, 면역 세포에서의 USP22 억제가 항종양 면역을 증진시킬 수 있기 때문에, USP22가 항종양 요법에서 이상적인 치료 표적임을 지시한다.
발명의 요약
유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 억제제 및 그의 질환 및 장애를 치료하기 위한 용도가 본원에 개시된다. 본 기술의 한 측면은 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22) 활성과 연관된 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, USP22의 생물학적 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 세포 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암, 위 암종, 췌장암, 흑색종, 림프종, 결장암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신경교종, 중피종, 신경모세포종, 외투 세포 림프종, 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 기술의 또 다른 측면은 Treg 세포 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 활성을 억제하는 방법으로서, USP22의 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 감염성 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 돌발성 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2) 감염을 갖는다.
본 기술의 또 다른 측면은 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)의 억제를 필요로 하는 대상체에서 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하는 방법으로서, USP22의 생물학적 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
개시된 방법에 대해, 치료제는 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 표 S1로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴이다.
본원에 기재된 치료제 및 적합한 제약 담체를 포함하는 제약 조성물. 일부 실시양태에서, 치료제는 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 USP22의 생물학적 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 USP22의 생물학적 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 Treg 세포 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)의 억제를 필요로 하는 대상체에서 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다.
도 1. 종양내 Treg 세포는 Usp22 및 Usp21의 증가된 mRNA 발현을 갖는다. A 내지 C, 대조군 마우스 비장, 및 종양-챌린지된 마우스 비장 및 종양 세포로부터의 YFP+ 분류된 Treg 세포의 mRNA 수준. 모든 mRNA 값은 비챌린지된 마우스 비장의 WT Treg 세포 수준에 비해 계산되었다. B16) Usp22: n=5 내지 6, Usp21: n=3 내지 5, Usp7: n=3 내지 5. LLC1) Usp22: n=5 내지 6, Usp21: n=3 내지 6, Usp7: n=3 내지 6. EG7) Usp22: n=4 내지 5, Usp21 n=3 내지 4, Usp7: n=3 내지 7. D, 동일한 환자로부터 단리된 암-인접한 건강한 폐 조직으로부터 회수된 Treg 세포에 비해 환자로부터의 인간 폐암 조직으로부터 단리된 CD4+CD25+CD127- Treg 세포에서의 Usp22, Usp21 및 Foxp3의 mRNA 수준. AHL: 인접한 건강한 폐; LTu: 폐 종양. Usp22: n=8, Usp21: n=3, FoxP3: n=11. E, 인간 폐암 환자로부터 단리된 Treg 세포에서의 Usp21 및 FoxP3의 mRNA 수준. AHL: 인접한 건강한 폐; LTu: 폐 종양 n=9. A 내지 C, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. D, 양측 대응표본 t-검정을 수행하여 Ltu 대 AHL에서의 FoxP3 및 Usp22의 통계적 유의성을 결정하였다. E, 선형 회귀를 Ltu 내의 Usp22 및 FoxP3 사이의 상관관계에 대해 계산하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 2: 종양 세포 분비된 TGF-β는 iTreg 세포에서 Usp22 및 Usp21 수준을 증가시킨다. A, 24시간 동안 T 세포 배지로 50/50으로 종양 세포 처리된 배지의 첨가에 비해 대조군 T 세포 배지에서의 iTreg 세포에서의 USP mRNA 수준. Usp22) 대조군: n=14, B16: n=10, LLC1: n=5, EG7: n=4. Usp21) 대조군: n=12, B16: n=8, LLC1: n=3, EG7: n=3. Usp7) 대조군: n=10, B16: n=7, LLC1: n=4, EG7: n=5 B, 24시간 동안 T 세포 배지로 50/50으로 종양 세포 처리된 배지의 첨가에 비해 대조군 T 세포 배지에서의 iTreg 세포에서의 USP 단백질 수준. C, 종양 세포 배지 (Usp22) 대조군에서의 TGF-β 억제제의 첨가를 갖는 iTreg 세포에서의 USP mRNA 수준: n=22, B16: n=15, B16+Inh: n=5, LLC1: n=10, LLC1+inh: n=5, EG7: n=7, EG7+inh: n=5. Usp21) 대조군: n=20, B16: n=13, B16+Inh: n=5, LLC1: n=8, LLC1+inh: n=4, EG7: n=7, EG7+inh: n=5. Usp7) 대조군: n=14, B16: n=10, B16+Inh: n=5, LLC1: n=8, LLC1+inh: n=3, EG7: n=8, EG7+inh: n=6. D, TGFb 억제 하에서의 Usp22 프로모터를 따른 SMAD2, SMAD3, 및 SMAD4 결합능. SMAD2: n=4 내지 5; SMAD3 n=3; SMAD4: n=3. A 내지 C, 모든 mRNA 값은 비처리된 WT iTreg 세포에 비해 계산되었다. A 내지 D, 다중 비교를 갖는 일반 일원 ANOVA를 수행하여 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 3: Usp22 및 Usp21은 TME에서 발견되는 환경적 및 대사 스트레스 하에서 nTreg 세포에서의 FOXP3 안정성을 위해 요구된다. 모든 mRNA 값은 비챌린지된 WT Treg 세포에 비해 계산되었다. A, 24시간 후 정상산소 (21% O2) 대 저산소 (1% O2) 조건에서의 nTreg USP mRNA 수준 (n=6 내지 13). B, 정상산소 (21% O2) 대 저산소 (1% O2) 조건에서 72시간 후 WT nTreg 세포에 비해 22KO nTreg 세포에서의 FOXP3 MFI 변화 (n=5). C, 24시간 동안 dMOG로의 처리 후의 nTreg USP mRNA 수준 (n=6). D, 정상 배지 (11mM 글루코스)에 비해 24시간 후 글루코스-제한된 (0.5mM) 조건에의 노출 후 nTreg 세포에서의 USP mRNA 수준 (n=7 내지 18). E, 48시간 후 대조군으로부터의 nTreg 세포 및 저 글루코스 조건 하에서 배양된 세포에서의 상대 FOXP3 MFI 변화 (n=3). F, 24시간 동안 아미노산 기아 하에서의 nTreg USP mRNA 수준 (n=5 내지 9). G, 48시간 후 정상 배지 조건 대 아미노산 기아에서 배양된 Usp22- 또는 Usp21-널(null) nTreg 세포에서의 FOXP3 MFI 안정성 (n=3). H, 24시간 동안 1μM 올리고마이신 A로의 처리 후의 nTreg USP mRNA 수준 (n=5 내지 7). I, 24시간 동안 250nM 토린(Torin)1로의 처리 후의 nTreg USP mRNA 수준 (n=5 내지 7). A, C 내지 D, F 및 H 내지 I, 다중 비교를 갖는 일반 일원 ANOVA를 수행하여 유의성을 결정하였다. B, E 및 G, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001
도 4: Treg 세포에서의 Usp22 및 Usp21의 소실은 FoxP3 발현 및 세포 기능을 차등적으로 손상시킨다. A, WT, 21KO, 22KO 및 dKO 마우스에서의 Usp22 및 Usp21 수준 (n=5 내지 8). 모든 mRNA 값은 WT Treg 세포에 비해 계산되었다. B, 2-개월 기간에 걸친 마우스 중량 (n=2 내지 9). C, CD44hiCD62Llo 발현에 의해 측정된 바와 같은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말초 활성화 (n=7 내지 9). D, WT 및 KO 동물의 비장 Treg 세포에서의 FOXP3 MFI의 대표적인 히스토그램 (좌측) 및 정량화 (우측) (n=6 내지 8). E, 21KO (n=2), 22KO (n=3), 및 dKO (n = 3) 대 WT (n=3) 마우스에서의 Treg 세포 시그니쳐 유전자의 열 지도 (*유의성은 P < 0.01 조정됨). F, 22KO, 21KO 및 dKO 사이의 DEG (adj. p<0.01)의 벤 다이어그램 (n=2 내지 3). G, Wt, 21KO, 22KO, 및 dKO 마우스의 RNA 시퀀싱으로부터 생성된 유전자 세트를 비교하는 분자 시그니쳐 데이터베이스에서의 홀마크 유전자 세트로부터의 유전자 세트 풍부화 분석 (오발견율, FDR<25%)으로부터의 정규화된 풍부화 점수 (n=2 내지 3). A 내지 C, 열 사이의 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. D, 열 사이의 다중 비교를 갖는 일원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 5: Treg 세포에서의 Usp21 및 Usp22의 결실은 상승작용하여 항종양 면역을 증진시킨다. A, WT, 21KO, 22KO 및 dKO 마우스의 옆구리에 피하로 주사된 B16 세포의 종양 성장 곡선 (n=13 내지 14). B, B16 챌린지된 마우스의 비장에서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 CD44hiCD62Llo에 의해 정의된 바와 같은 퍼센트 활성화 (n=5 내지 6). C, 말초 CD8+ T 세포의 퍼센트 IFN-γ 및 그란자임(Granzyme) B (GZMB) 생산 (n=3). D, WT에 비해 말초 Treg 세포의 FOXP3 MFI (n=7 내지 9). E, WT에 비해 말초 Treg 세포의 PD-1 MFI (n=3). F, WT에 비해 말초 Treg 세포의 GITR MFI (n=6 내지 8). G, WT에 비해 말초 Treg 세포의 LAG3 MFI (n=3). H, 종양 내의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 % 침윤의 대표적인 유동 세포계측법 플롯 및 그래프적 표시 (n=5 내지 6). I 내지 J, 종양내 CD8+ 및 CD4+세포의 백분율 IFN-γ 및 GZMB 생산 (n=5 내지 6). K, itTreg 세포에서의 WT에 비해 CD4+ 세포의 대표적인 FOXP3+ 백분율 (n=6). L, WT에 비해 종양 Treg 세포 내의 FOXP3 MFI의 대표적인 유동 플롯 (좌측) 및 정량적 표시 (n=6 내지 9). M, WT 및 dKO 마우스의 옆구리에 피하로 주사된 TGFβ shRNA 또는 스크램블 대조군 shRNA로 처리된 B16 세포의 종양 성장 곡선 (n=3 내지 4). A 내지 C, H 내지 J, 및 M 열 사이의 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. D 내지 G 및 K 및 L, 열 사이의 다중 비교를 갖는 일원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 6: Usp22 억제제 투여는 항종양 면역을 증진시킨다. A, 화합물 CS30 (Usp22i-S02)의 구조. B, 생체내에서 20mg/kg의 Usp22i-S02로의 처리 후 Treg 세포의 WT 및 22KO에서의 FOXP3 MFI (n=3). C, 대조군에 비해 20mg/kg의 Usp22i-S02로 처리된 마우스의 CD4+ 말초 세포의 FOXP3+CD25+ MFI의 대표적인 유동 세포계측법 플롯 (n=5). D, Usp22i-S02 투여시의 Foxp3 MFI의 그래프적 표시 (n=5). E, 100 μL의 오일에서, 제15일에 시작한 20mg/kg/회의 Usp22 억제제의 첨가의 존재 또는 부재 하에서 WT 마우스의 옆구리에 피하로 주사된 LLC1 세포의 종양 성장 곡선 (n=4). F 내지 G, 종양 내의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 % 침윤의 대표적인 유동 세포계측법 플롯 및 그래프적 표시 (n=4). H, itTreg Foxp3 MFI의 대표적인 히스토그램 플롯 및 그래프적 표시 (n=4). I, itTreg 억제성 마커의 MFI (n=3 내지 4). J, 대조군 및 Usp22-S02 처리된 마우스에서의 퍼센트 Foxp3+IFNg+ itTreg 세포 (n=3 내지 4). B, D 내지 E, G, H 내지 I 열 사이의 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. J, 독립표본 양측 T 검정을 수행하여 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 7: 종양내 Treg 세포는 증가된 Foxp3 및 활성화 마커를 갖는다. A, 비-종양 챌린지된 대조군 및 B16-, LLC1-, 및 EG7- 챌린지된 마우스로부터의 세포의 유동 세포계측법에 의한 대표적인 CD4+ FOXP3+ 백분율. B16: n=3 내지 4, EG7: n=2 내지 6, 및 LLC1: n=5 내지 6. B, 대조군 및 종양-챌린지된 마우스의 CD45+ CD4+ FOXP3+ (Treg) 세포의 종양 및 비장에서의 FOXP3 MFI의 대표적인 오버레이. C, 대조군 비장 및 종양-챌린지된 비장 및 종양 Treg 세포에서의 FOXP3 MFI의 정량화 (n=4 내지 11). D 내지 G, 비장으로부터 단리된 대조군 Treg 세포 및 B16, EG7, 또는 LLC1 챌린지된 동물로부터의 비장 및 종양 Treg 세포 하에서의 Treg 세포-연관된 마커의 MFI. CD25: n=4 내지 11; GITR: n=3 내지 11; CTLA-4: n=4 내지 11; PD-1: n=4 내지 11. 모든 MFI 값은 비-챌린지된 마우스 비장의 WT Treg 세포 수준에 비해 계산되었다. C 내지 G, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 8: TGF-β는 Treg 세포에서 Usp22 및 Usp21의 발현을 유도한다. A, 종양 조건화 배지 (TCM) 실험의 시각적 표시. B, 분극화 후 TGF-β 유도 하에서의 iTreg USP mRNA 수준. Usp22: n=18 내지 19; Usp21: n=7 내지 8; Usp7: 4 내지 5. C, TGF-β 억제제의 존재 및 부재 하에서의 TGF-β 하에서의 iTreg USP mRNA 수준. Usp22: n=3 내지 11; Usp21: n=8 내지 18; Usp7: 3 내지 8. D, TGF-β 유도로의 Treg FoxP3 mRNA 수준 (n=10). B 내지 D, 모든 mRNA 값은 WT 비처리된 iTreg 세포에 비해 계산되었다. E, B16, LLC1 및 EG7 종양 조건화 배지에서의 TGF-β 수준 (n=3). F 내지 H, 종양 조건화 배지에서의 USP 유도 및 TGF-β 수준 사이의 상관관계. Usp22: n=3 내지 10; Usp21: n=3 내지 8; Usp7: n=3 내지 6. I, 대조군 또는 TGF-β shRNA 처리된 B16 세포의 TGF-β mRNA 수준 (n=3). J, shRNA 처리된 B16 세포로 주사된 마우스로부터의 분류된 itTreg 세포에서의 Usp22의 mRNA 수준 (n=4). B, D, 및 I, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. C 및 E 그룹 사이의 다중 비교를 갖는 일반 일원 Anova를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 9: SMAD3 및 SMAD4는 Usp22 프로모터 상의 보존된 SBE에 결합하는 반면, Usp21은 비-정준 TGF-β 신호전달에 의해 상향조절된다. A, 타당한 SMAD 결합 요소 (SBE)로 오버레이된 Usp22 프로모터 영역 및 ChIP에 대해 생성된 프라이머의 배치. B 및 C, ChIP-qPCR을 사용한 Usp22 및 Usp21 프로모터 영역을 따른 SMAD2, SMAD3 및 SMAD4의 결합. Usp22: n=2 내지 7; Usp21: n=1 내지 2. D 내지 F, 5ng/μl의 TGF-β에서 분극화된 WT 및 Usp21-널 iTreg 세포에서의 Foxp3 MFI 및 백분율의 대표적인 유동 플롯 및 그래프적 표시 (n=3). G, TGF-β 비-정준 경로 p38 키나제 억제제 (p38i)의 존재 및 부재 하에서의 TGF-β 하에서의 iTreg Usp21 mRNA 수준 (n=4). E 및 F, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. G, 그룹 사이의 다중 비교를 갖는 일반 일원 Anova를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 10: USP22는 양성 피드백 루프에서 SMAD 단백질 안정화를 통해 TGF-β 신호전달을 상호간에 증진시킨다. A, USP22 WT 및 KO iTreg 세포에서의 SMAD2, SMAD3, 및 SMAD4의 대표적인 단백질 수준. B, USP22 WT 및 KO iTreg 세포에서의 SMAD2, SMAD3, 및 SMAD4의 mRNA 수준 (n=3). 모든 mRNA 값은 비챌린지된 WT iTreg 세포에 비해 계산되었다. 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. C, iTreg 세포 내의 SMAD 2, SMAD 3, 및 SMAD 4 단백질로의 USP22 내인성 IP. D 내지 F, SMAD2, SMAD3, 및 SMAD4로의 USP22의 293T 세포에서의 과발현 DUB 검정 IP. G, 2, 4 및 6시간 동안 시클로헥시미드 처리 하에서의 WT 및 KO iTreg 세포에서의 SMAD2 및 SMAD4 단백질 분해. H, 4시간에서 MG132 프로테아제 억제제의 존재 또는 부재 하에서의 시클로헥시미드 처리 하에서의 WT 및 KO iTreg 세포에서의 SMAD2 및 SMAD4 단백질 분해.
도 11: HIF-α 및 AMPK/mTOR 균형은 USP22 및 USP21을 통해 Treg 세포 FoxP3 안정성을 조정한다. 모든 mRNA 값은 비챌린지된 WT Treg 세포에 비해 계산되었다. A, 4시간 후 정상산소 및 저산소 조건에서의 iTreg USP mRNA 수준 (n=4 내지 5). B, 24시간 후 정상산소 및 저산소 조건에서의 iTreg USP 단백질 수준. C, Foxp3 MFI 수준의 안정성 검정 계산의 시각적 표시. %O2는 산소의 백분율이고, Glu는 글루코스이고, AA는 아미노산이다. 하나의 변수는 한 번에 변화되었고, 다른 것들은 기준선 대조군에서 유지되었다. D, 24시간 동안 DMOG로의 처리 후의 iTreg 세포 USP mRNA 수준 (n=6). E, 비처리된 nTreg에 비해 48시간 동안 DMOG로 처리된 nTreg 세포 Foxp3 MFI 변화 (n=9 내지 10). F, 비처리된 세포에 비해 저산소상태에서 72시간 후 iTreg의 Foxp3 MFI 변화 (n=3). G, 비처리된 iTreg 세포에 비해 72시간 동안 DMOG로 처리된 iTreg의 Foxp3 MFI 변화 (n=4) H, 24시간 후 저 글루코스 조건 하에서의 iTreg 세포 USP mRNA 수준 (n=3 내지 8). I, 24시간 후 저 글루코스 조건 하에서의 iTreg 세포 USP 단백질 수준. J, 완전 배지에 비해 72시간 후 iTreg Foxp3 MFI 변화 저 글루코스 조건 (n=7). K, 24시간 후 완전 배지에 비해 아미노산 기아에서의 iTreg 세포 USP mRNA 수준 (n=6). L, 비처리된 iTreg 세포에 비해 72시간 동안 아미노산 기아 하에서의 iTreg 세포의 Foxp3 MFI 변화 (n=6). M, 24시간 동안 1μM 올리고마이신으로의 처리 후의 iTreg 세포 USP mRNA 수준 (n=6). N, 24시간 동안 250nM 토린1로의 처리 후의 iTreg USP mRNA 수준 (n=5 내지 9). A, D, H, 및 K 내지 M, 그룹 사이의 다중 비교를 갖는 일반 일원 Anova를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. E 내지 G 및 J, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 12: Treg 세포에서의 Usp22 및 Usp21의 소실은 Treg 대사 경로를 차등적으로 변경시킨다. A, KO 및 WT 동물의 말초 기관에서의 T 및 B 세포 백분율 (n=5 내지 9). B, CD45+ 세포?의 말초 기관에서의 CD4 및 CD8 T 세포의 퍼센트 (n=4 내지 10). C 내지 E, U21KO (n=2), U22KO (n=3), 및 dKO (n = 3) 대 WT (n=3) 마우스에서의 대사 경로 (유의성은 * 조정된 P < 0.01에 의해 언급된다)의 열 지도. dKO 마우스에서 차등적 발현 (adj. p<0.01)에 기반하여 선택된 유전자. WT (n=5) nTreg 세포에 비해 21KO (n=5), 22KO (n=5) 및 dKO (n=4 내지 5)의 F, 기저 미토콘드리아 OCR 및 G, 기저 ECAR. A 내지 B, 열 사이의 시닥(Sidak) 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. F 내지 G, 열 사이의 터키(Tukey) 다중 비교를 갖는 일원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 13: Usp21-결실은 세포를 변경시킨다. A, 22KO 및 dKO 마우스의 RNA 시퀀싱으로부터 생성된 유전자 세트를 비교하는 분자 시그니쳐 데이터베이스에서의 홀마크 유전자 세트로부터의 유전자 세트 풍부화 분석 (오발견율, FDR<1%)으로부터의 정규화된 풍부화 점수 (n=3). B, CD4+Foxp3+ Treg 구획 내의 퍼센트 Ki67 양성 세포의 대표적인 그래프 (n=7). 열 사이의 터키 다중 비교를 갖는 일원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 14. 구조-기반 계층적 가상 스크리닝을 통한 Usp22-특이적 억제제의 개발 및 확인. A, 구조-기반 가상 스크리닝의 흐름도. B, USP22-m (스위스 모델(SWISS MODEL)을 사용하여 생성된 USP22 모델)의 전체 형태는 색상-코드 막대를 사용한 보존에 의해 색상화된 카툰에 의해 표시된다. USP22의 촉매 중심은 도킹 위치로서 정의되었다. C, PROCHEK 진행에 의해 생성된 USP22-m의 라마찬드란(Ramachandran) 플롯 통계 (좌측). UBP8 (PDB: 3MHS) 및 USP22-m에 비해 USP22-md (MD 최적화된 모델)에서의 촉매 중심 루프의 배치 (우측). D, USP22-md 구조의 포켓에서 녹색 스틱 결합에서 제시된 S02 (좌측). S02와 USP22-md의 수소 결합 및 소수성 접촉을 제시하는 리그플롯 (중간). 도킹에 의해 생성된, USP22-md의 결합 포켓에서의 S02 (녹색으로 제시됨)의 최고 순위화된 위치가 제시된다. E, MD 시뮬레이션 및 PBSA 계산 후 아미노산 잔기의 개별적인 에너지 기여. F 내지 G, USP22 모델에 대한 화합물 S02의 결합 자유 에너지.
도 15: Usp22i-S02는 Usp22-매개 Foxp3 탈유비퀴틴화를 중단시킨다. A, 다양한 용량의 Usp22i-S02로 처리된 WT 대 22KO iTreg 세포에서의 Foxp3 MFI 변화의 그래프적 표시 (n=3). B, Usp22 억제제 농도가 0 내지 20μg/mL로 증가함에 따라 iTreg 세포에서의 Foxp3 MFI 수준의 대표적인 히스토그램. C, 다양한 용량의 Usp22i-S02로 처리된 iTreg 세포의 세포 생존 (n=3). D, 10μg/mL Usp22i-S02로 처리된 WT 및 22KO 마우스에서의 FOXP3 및 USP22 단백질 수준. E 내지 F, 다양한 용량의 Usp22i-S02로 처리된 인간 Treg 세포의 Foxp3 MFI의 그래프적 및 대표적인 데이터 (n=3). G, 10μg/mL로의 Usp22i-S02로 처리된 WT, Usp21-널, 및 Usp22-널 Treg 세포에서의 Foxp3 MFI의 그래프적 표시 (n=3). H, 10μg/mL의 Usp22i-S02의 첨가의 존재 또는 부재 하에서의 시클로헥시미드 (10μg/mL) 처리된 iTreg 세포의 FOXP3 및 USP22 단백질 분해. I 내지 J, 증가하는 농도의 Usp22i-S02 하에서의 FOXP3으로의 USP22의 iTreg 세포에서의 내인성 DUB 검정 IP. K, Usp22 억제제 농도가 0 내지 20μg/mL로 증가함에 따라 iTreg 세포에서의 Foxp3 mRNA 수준 (n=3). L, 20μM MG132로 처리된 20μg/mL Usp22 억제제의 존재 또는 부재 하에서의 WT iTreg 세포에서의 FOXP3 및 USP22 수준. M, 10μg/mL의 Usp22i-S02의 첨가의 존재 또는 부재 하에서의 저 글루코스 조건에 정치된 WT 또는 Usp22-널 nTreg 세포 중 어느 하나에서의 Foxp3 MFI의 감소의 백분율의 그래프적 표시 (n=7 내지 8). N, 10μg/mL의 Usp22i-S02의 첨가의 존재 또는 부재 하에서의 저산소 또는 저 아미노산 조건에 정치된 WT nTreg 세포에서의 Foxp3 MFI의 감소의 백분율의 그래프적 표시 (n=3 내지 5). G, 그룹 내에서 비교하는 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. K, 대조군에 비해 열 사이의 던넷(Dunnet) 다중 비교를 갖는 일원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. M 내지 N, 열 사이의 시닥 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 16: Usp22i-S02는 나이브 마우스에 대해 거의 효과를 갖지 않지만, LLC1-챌린지된 마우스에서는 항-종양 면역을 증진시킨다. A, 치료의 과정에 걸친 Usp22i-S02 처리된 마우스 대 DMSO 처리된 대조군의 체중 (n=4). A 내지 F. 주사는 10mg/kg으로 연속적인 3일 동안 1일 2회였다 (n=4). B, DMSO 대조군에 비해 Usp22i-S02로 처리된 나이브 마우스에서의 세포 집단의 퍼센트 (n=3 내지 4). C, DMSO 대조군에 비해 Usp22i-S02로 처리된 나이브 마우스에서의 다양한 구획에서의 KI-67+ 세포의 퍼센트 (n=3 내지 4). D, DMSO 대조군에 비해 Usp22i-S02로 처리된 나이브 마우스에서의 CD45+ 세포 상에 게이팅된 T 세포 집단에서의 퍼센트 CD44hiCD62Llo (n=3). E, DMSO 대조군에 비해 Usp22i-S02로 처리된 나이브 마우스에서의 CD45+ 세포 상에 게이팅된 퍼센트 안넥신(Annexin)+PI+ T 세포 (n=4). F 내지 H, DMSO 대조군에 비해 Usp22i-S02로 처리된 나이브 마우스의 기관 독성 패널 (베트스캔(VetScan) VS2 포괄적 진단 로터(Comprehensive Diagnostic Rotor) 로트 1061AA2) (n=2 내지 3). I, 10mg/kg으로 Usp22i-S02로 처리된 WT 마우스에서의 피하로 주사된 LLC1의 성장 곡선 (n=5 내지 10). I 내지 Q, 주사는 10mg/kg으로 연속적인 5일 동안 1일 2회였다. J, I로부터의 제16일에서 절제된 종양의 중량 (n=10). K 내지 L, CD45+ 세포 상에 게이팅된 침윤 T 세포의 대표적인 유동 플롯 및 그래프적 표시 (n=5). M 내지 P, Usp22i-S02로 처리된 마우스로부터의 종양내 CD8+ T 세포의 특징규명 (n=3 내지 5). Q, 마우스로부터의 CD4+Foxp3+ 상에 게이팅된, Usp22i-S02 대 DMSO 대조군으로 처리된 마우스로부터의 종양내 Treg 세포의 퍼센트 (n=5). A 내지 E, I 및 L, 대조군에 비해 열 사이의 시닥 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. F 내지 H, J, 및 M 내지 Q, 양측 독립표본 t-검정을 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 17: Usp22i-S02는 시험관내에서 및 생체내에서 종양 성장을 억제한다. A, 24시간 동안 다양한 농도 하에서 Usp22i-S02로의 처리 후의 LLC1의 시험관내 카운트 (n=2). B, 24시간 동안 다양한 농도 하에서 Usp22i-S02로의 처리 후의 LLC1의 시험관내 생존율 (n=2). C, OD600을 통한 7일 동안 DMSO 처리된 대조군에 비해 10ug/ml의 Usp22i-S02로 처리된 LLC1 세포의 시험관내 상대 성장 (n=4). D, 종양 성장의 제15일에서 DMSO 대조군 주사에 비해 3일 동안 Usp22i-S02로 처리된 RAG-/- 마우스 내로의 100만개의 피하로 주사된 LLC1 세포의 성장 곡선 (n=4). C 내지 D, 대조군에 비해 열 사이의 시닥 다중 비교를 갖는 이원 ANOVA를 수행하여 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로서 제시된다. NS, 유의하지 않음. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 18: TME-특이적 인자는 잠재적으로 TGF-β 신호전달, HIF1a, AMPK, 및 mTOR 활성의 조정을 통해 Usp22 및 Usp21의 증가된 수준을 유도하여 Treg 세포가 종양 미세환경에서 보다 안정하게 되도록 할 수 있다.
유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 억제제 및 그의 질환 및 장애를 치료하기 위한 용도가 본원에 개시된다. 컴퓨터-기반 및 생물학적 접근법을 사용하여 소분자 특이적 억제제를 확인하였다. 실시예에서 입증된 바와 같이, USP22의 억제제로의 마우스 및 인간 둘 다의 조절 T 세포 (Treg)의 처리는 USP22의 기질인 FoxP3의 단백질 발현을 유의하게 감소시켰다. 대조적으로, 처리는 USP22-널 Treg에서 FoxP3 발현을 추가로 억제하지 않았으며, 이는 USP22의 억제제가 USP22의 고도로 특이적 억제제일 수 있음을 지시한다. 또한, 처리는 폐암 세포에서 USP22 활성을 억제하였고, 결과적으로 폐암 세포 성장을 억제하였다. 보다 중요하게는, 폐암-보유 마우스의 처리는 종양 질량을 크게 감소시켰다. 이들 결과는 USP22의 억제제가 항종양 요법에서 강력한 약물로서 사용될 수 있음을 지시한다. 또한, USP22의 억제가 Treg 억제성 기능을 감소시킨다는 사실은 또한 이들 억제제가 면역 결핍과 연관된 질환을 치료할 뿐만 아니라 감염성 질환, 예컨대 SARS-CoV2 감염을 퇴치하기 위한 면역 반응을 신장시키는데 사용되는 것을 허용한다.
본 발명은 하기 및 본 출원 전반에 걸쳐 제시된 바와 같은 몇몇 정의를 사용하여 본원에 기재된다.
정의
개시된 대상은 하기와 같이 정의 및 용어를 사용하여 추가로 기재될 수 있다. 본원에 사용된 정의 및 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다. 예를 들어, 용어 "치환기"는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, "1개 이상의 치환기"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약", "대략", "실질적으로", 및 "유의하게"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이고, 이들이 사용되는 맥락에 따라 다소 달라질 것이다. 그것이 사용되는 맥락을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하지 않은 상기 용어의 사용이 있는 경우, "약" 및 "대략"은 특정한 용어의 최대 플러스 또는 마이너스 10%를 의미할 것이고, "실질적으로" 및 "유의하게"는 특정한 용어의 플러스 또는 마이너스 10% 초과를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(include)" 및 "포함하는(including)"은 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)"과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 청구범위에 나열된 성분에 추가로 추가적인 성분의 포함을 허용하는 "개방된" 전이적 용어인 것으로 해석되어야 한다. 용어 "이루어지다" 및 "이루어진"은 청구범위에 나열된 성분 이외의 추가적인 성분의 포함을 허용하지 않는 "폐쇄된" 전이적 용어인 것으로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 부분적으로 폐쇄되고, 청구된 대상의 성질을 근본적으로 변경시키지 않는 추가적인 성분만의 포함을 허용하는 것으로 해석되어야 한다.
어구 "예컨대"는 "예를 들어, 포함하는"으로 해석되어야 한다. 더욱이, "예컨대"를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 및 모든 예시적인 언어의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 조명하기 위한 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 대한 제한을 제기하지 않는다.
더욱이, "A, B 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 관례를 이해할 것이라는 의미에서 의도된다 (예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께를 갖는 시스템을 포함할 것이지만, 이에 제한되지 않는다.). 2개 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접성 단어 및/또는 어구는, 설명에서든 도면에서든, 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나, 또는 둘 다의 용어를 포함할 가능성을 구상하는 것으로 이해되어야 함을 관련 기술분야 내의 통상의 기술자는 또한 이해할 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 'B 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 나열된 수를 포함하고, 범위 및 하위범위로 후속적으로 분해될 수 있는 범위를 지칭한다. 범위는 각각의 개별적인 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 구성원을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 6개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 6개의 구성원을 갖는 그룹을 지칭하는 등이다.
법조동사 "할 수 있다(may)"는 그 내에 함유된 몇몇 기재된 실시양태 또는 특색 중에서 1개 이상의 옵션 또는 선택의 바람직한 사용 또는 선택을 지칭한다. 그에 함유된 특정한 실시양태 또는 특색에 관하여 옵션 또는 선택이 개시되지 않는 경우, 법조동사 "할 수 있다"는 그에 함유된 기재된 실시양태 또는 특색의 측면을 제조하고 사용하는 방법에 관한 긍정적인 작용, 또는 그에 함유된 기재된 실시양태 또는 특색에 관한 구체적인 기술을 사용하는 확정적인 결정을 지칭한다. 이 후자의 맥락에서, 법조동사 "할 수 있다"는 조동사 "할 수 있다(can)"와 동일한 의미 및 함축을 갖는다.
본원에 이용된 바와 같이 "이를 필요로 하는 대상체"는 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22) 활성 및/또는 발현과 연관된 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 지칭할 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 USP22의 활성 및/또는 발현을 특징으로 하는 암을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 개시된 화합물, 제약 조성물, 및 방법은 USP22 활성 및/또는 발현과 연관된 질환 및 장애를 치료하는데 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 USP22의 생물학적 활성을 억제하는, 및/또는 암 세포의 전파를 억제하는 치료제를 투여함으로써 치료되는 암을 갖는 대상체를 포함할 수 있다.
개시된 화합물, 제약 조성물, 및 방법은 세포 증식성 질환 및 암과 같은 질환 및 장애를 포함할 수 있는 USP22 활성 및/또는 발현과 연관된 질환 및 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 개시된 화합물, 제약 조성물, 및 방법에 의한 치료를 위한 적합한 암은 폐암, 위 암종, 췌장암, 흑색종, 림프종, 결장암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신경교종, 중피종, 신경모세포종, 외투 세포 림프종, 및 급성 골수성 백혈병을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 감염의 치료를 필요로 하는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 감염은 바이러스 감염, 예컨대 코로나 바이러스에 의한 감염이다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 돌발성 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2) 및 COVID에 의한 감염에 대한 치료를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 감염에 대한 면역 반응을 증강시킬 것을 필요로 하는 대상체를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 돌발성 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2) 감염에 대한 면역 반응을 증강시킬 것을 필요로 하는 대상체를 지칭할 수 있다.
개시된 화합물, 제약 조성물, 및 방법은 감염, 및 돌발성 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2) 감염을 포함하는 호흡기 감염과 같은 질환 및 장애를 포함할 수 있는 USP22 활성 및/또는 발현과 연관된 질환 및 장애를 치료하는데 이용될 수 있다.
용어 "대상체"는 용어 "개체" 및 "환자"와 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 인간 및 비-인간 포유동물 대상체를 포함한다.
개시된 화합물은 USP22의 펩티다제 활성을 조정하는 것을 포함하는 USP22의 생물학적 활성을 조정하는데 이용될 수 있다. 용어 "조정하다"는 펩티다제 활성을 포함하는 USP22 생물학적 활성을 "억제하는" 것을 포함하도록 폭넓게 해석되어야 한다.
유비퀴틴 특이적 펩티다제 (USP22)는 유비퀴틴 카르복실-말단 히드롤라제 22라는 명칭에 의해서도 지칭되는 단백질을 지칭한다. USP22는 유비퀴틴의 C-말단 글리신에 의해 형성된 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 펩티드 및 이소펩티드 결합의 티올-의존적 가수분해를 촉매하는 것을 포함하는 효소 활성을 갖는 것으로 제시되었다. USP22는 효소 엔트리: EC 3.4.19.12를 갖는다. 본원에 개시된 화합물은 따라서 USP22의 활성 중 1종 이상을 억제할 수 있다.
인간 USP22는 2개의 이소형을 갖는 것으로 공지되어 있으며, 개시된 화합물은 이소형 1 및/또는 이소형 2의 1종 이상의 활성을 억제할 수 있다.
인간 USP22 이소형 1은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00001
Figure pct00002
이소형 2는 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00003
Figure pct00004
제약 조성물
본원에 개시된 조성물 및 방법에서 채용된 화합물은 제약 조성물로서 투여될 수 있고, 따라서, 화합물을 혼입하는 제약 조성물은 본원에 개시된 조성물의 실시양태인 것으로 간주된다. 이러한 조성물은 제약상 허용되는 임의의 물리적 형태를 취할 수 있고; 예시적으로, 이들은 경구로 투여되는 제약 조성물일 수 있다. 이러한 제약 조성물은 개시된 화합물의 유효량을 함유하며, 유효량은 투여될 화합물의 일일 용량과 관련된다. 각각의 투여 단위는 주어진 화합물의 일일 용량을 함유할 수 있거나, 또는 각각의 투여 단위는 일일 용량의 분획, 예컨대 용량의 1/2 또는 1/3을 함유할 수 있다. 각각의 투여 단위에 함유될 각각의 화합물의 양은, 부분적으로, 요법을 위해 선택되는 특정한 화합물의 신원 및 다른 인자, 예컨대 그것이 주어지는 적응증에 좌우될 수 있다. 본원에 개시된 제약 조성물은 널리 공지된 절차를 채용함으로써 환자에의 투여 후 활성 성분의 빠른, 지속된, 또는 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 따라 사용하기 위한 화합물은 단일 화합물 또는 화합물의 조합으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 생물학적 활성을 억제하는 화합물은 단일 화합물로서 또는 USP22의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 상이한 약리학적 활성을 갖는 또 다른 화합물과 조합으로 투여될 수 있다.
상기 지시된 바와 같이, 화합물의 제약상 허용되는 염은 구상되고, 또한 개시된 방법에 이용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 염"은 살아 있는 유기체에게 실질적으로 비-독성인 화합물의 염을 지칭한다. 전형적인 제약상 허용되는 염은 본원에 개시된 바와 같은 화합물과 제약상 허용되는 미네랄 또는 유기 산 또는 유기 또는 무기 염기의 반응에 의해 제조된 염을 포함한다. 이러한 염은 산 부가 및 염기 부가 염으로서 공지되어 있다. 본원에 개시된 바와 같은 대부분의 또는 모든 화합물은 염을 형성할 수 있고, 이들은 유리 산 또는 염기보다 더 용이하게 결정화되고 정제되기 때문에, 제약의 염 형태가 통상적으로 사용됨을 숙련된 독자는 인식할 것이다.
산 부가 염을 형성하는데 통상적으로 채용되는 산은 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 아이오드화수소산, 황산, 인산 등, 및 유기 산, 예컨대 p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 옥살산, p-브로모페닐술폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산 등을 포함할 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 염의 예는 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술페이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 브로마이드, 아이오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 히드로클로라이드, 디히드로클로라이드, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트-, 부틴-.1,4-디오에이트, 헥신-l,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, α-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 만델레이트 등을 포함할 수 있다.
염기 부가 염은 무기 염기로부터 유래된 것들, 예컨대 암모늄 또는 알칼리 또는 알칼리 토금속 히드록시드, 카르보네이트, 비카르보네이트 등을 포함한다. 이러한 염을 제조하는데 유용한 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 수산화칼슘, 탄산칼슘 등을 포함한다.
본원에 개시된 화합물의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정한 카운터-이온은, 전체로서의 염이 약리학상 허용되는 한, 및 카운터-이온이 전체로서의 염에 대해 목적하지 않는 품질에 기여하지 않는 한, 화합물의 활성에 중요하지 않을 수 있다. 목적하지 않는 품질은 바람직하지 않게 가용성 또는 독성을 포함할 수 있다.
화합물의 제약상 허용되는 에스테르 및 아미드는 또한 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 채용될 수 있다. 적합한 에스테르의 예는 알킬, 아릴, 및 아르알킬 에스테르, 예컨대 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 프로필 에스테르, 도데실 에스테르, 벤질 에스테르 등을 포함한다. 적합한 아미드의 예는 비치환된 아미드, 일치환된 아미드, 및 이치환된 아미드, 예컨대 메틸 아미드, 디메틸 아미드, 메틸 에틸 아미드 등을 포함한다.
또한, 본원에 개시된 방법은 화합물 또는 그의 염, 에스테르, 및/또는 아미드의 용매화물 형태를 사용하여 실시될 수 있다. 용매화물 형태는 에탄올 용매화물, 수화물 등을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 생물학적 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 이용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료함" 또는 "치료하는 것"은 각각 증상을 경감시키고/거나, 결과로 생긴 증상의 원인을 일시적 또는 영구적 기초로 제거하는 것, 및/또는 명명된 질환 또는 장애의 결과로 생긴 증상의 출현을 방지하거나 감속시키는 것 또는 그의 진행 또는 중증도를 반전시키는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 치료적 및 예방적 투여 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유효량"은 대상체에의 단일 또는 다중 용량 투여시, 진단 또는 치료 하의 대상체에서 목적하는 효과를 제공하는 화합물의 양 또는 용량을 지칭한다. 개시된 방법은 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 생물학적 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 개시된 화합물 (예를 들어, 제약 조성물에 존재하는 바와 같음)의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자로서 담당 진단자에 의해, 공지된 기술의 사용에 의해 및 유사한 상황 하에서 얻어진 결과를 관찰함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 투여되는 화합물의 유효량 또는 용량을 결정하는데 있어서, 다수의 인자, 예컨대 대상체의 종; 그의 크기, 연령, 및 일반적 건강; 관련된 질환 또는 장애의 관련성 또는 중증도의 정도; 개별적인 대상체의 반응; 투여되는 특정한 화합물; 투여의 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특징; 선택되는 용량 요법; 수반 의약의 사용; 및 다른 관련된 상황이 담당 진단자에 의해 고려될 수 있다.
전형적인 일일 용량은 본 치료 방법에 사용되는 각각의 화합물 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg (예컨대 약 0.05 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 및/또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg)을 함유할 수 있다.
조성물은 단위 투여 형태로 제제화될 수 있으며, 각각의 투여량은 개별적으로 또는 단일 단위 투여 형태로 각각의 화합물 약 1 내지 약 500 mg, 예컨대 약 5 내지 약 300 mg, 약 10 내지 약 100 mg, 및/또는 약 25 mg을 함유한다. 용어 "단위 투여 형태"는 환자에 대해 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 적합한 제약 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께, 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.
경구 투여는 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 채용되는 화합물을 투여하는 예시적인 경로이다. 다른 예시적인 투여의 경로는 경피(transdermal), 경피(percutaneous), 정맥내, 근육내, 비강내, 협측, 경막내, 뇌내, 또는 직장내 경로를 포함한다. 투여의 경로는 임의의 방식으로 달라질 수 있으며, 채용되는 화합물의 물리적 특성 및 대상체 및 간병인의 편의성에 의해 제한된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 적합한 제제는 하나 초과의 투여의 경로에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들어, 제제는 경막내 및 뇌내 투여 둘 다에 적합한 것일 수 있다. 대안적으로, 적합한 제제는 단지 하나의 투여의 경로에 적합한 것들, 뿐만 아니라 하나 이상의 투여의 경로에 적합하지만, 하나 이상의 다른 투여의 경로에는 적합하지 않은 것들을 포함한다. 예를 들어, 제제는 경구, 경피, 경피, 정맥내, 근육내, 비강내, 협측, 및/또는 경막내 투여에 적합하지만, 뇌내 투여에는 적합하지 않은 것일 수 있다.
불활성 성분 및 제약 조성물의 제제화의 방식은 통상적이다. 제약 과학에 사용되는 통상적인 제제화의 방법이 여기서 사용될 수 있다. 정제, 저작가능한 정제, 캡슐, 용액, 비경구 용액, 비강내 스프레이 또는 분말, 트로키, 좌제, 경피 패치, 및 현탁액을 포함하는 모든 통상적인 유형의 조성물이 사용될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 사용될 조성물의 목적하는 용량 및 유형에 따라, 총 약 0.5% 내지 약 50%의 화합물을 함유한다. 그러나, 화합물의 양은 "유효량", 즉, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 목적하는 용량을 제공하는 화합물의 양으로서 가장 잘 정의된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 채용되는 화합물의 활성은 조성물의 성질에 크게 좌우되지 않는 것으로 믿어지며, 따라서, 조성물은 주로 또는 단지 편의성 및 경제성을 위해 선택되고 제제화될 수 있다.
캡슐은 화합물을 적합한 희석제와 혼합하고, 적절한 양의 혼합물을 캡슐에 충전함으로써 제조된다. 통상적인 희석제는 불활성 분말화된 물질 (예컨대 전분), 분말화된 셀룰로스 (특히 결정질 및 미세결정질 셀룰로스), 당 (예컨대 프룩토스, 만니톨 및 수크로스), 곡분, 및 유사한 식용 분말을 포함한다.
정제는 직접 압축에 의해, 습윤 과립화에 의해, 또는 건조 과립화에 의해 제조된다. 그들의 제제는 통상적으로 (화합물 외에도) 희석제, 결합제, 윤활제, 및 붕해제를 혼입한다. 전형적인 희석제는 예를 들어, 다양한 유형의 전분, 락토스, 만니톨, 카올린, 인산칼슘 또는 황산칼슘, 무기 염 (예컨대 염화나트륨), 및 분말화된 당을 포함한다. 분말화된 셀룰로스 유도체는 또한 사용될 수 있다. 전형적인 정제 결합제는 전분, 젤라틴, 및 당 (예를 들어, 락토스, 프룩토스, 글루코스 등)과 같은 물질을 포함한다. 아카시아, 알기네이트, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하는 천연 및 합성 검은 또한 사용될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜, 에틸셀룰로스, 및 왁스는 또한 결합제로서 역할을 할 수 있다.
정제는 예를 들어, 향미 증진제 및 밀폐제로서 당으로 코팅될 수 있다. 화합물은 또한 다량의 맛이 좋은 물질, 예컨대 만니톨을 제제에 사용함으로써 저작가능한 정제로서 제제화될 수 있다. 즉시 용해되는 정제-유사 제제는 또한 예를 들어, 환자가 투여 형태를 소비하는 것을 보장하기 위해 및 일부 환자가 고체 물질을 삼키는데 있어서 경험하는 어려움을 회피하기 위해 채용될 수 있다.
윤활제는 정제 및 펀치가 금형에 점착되는 것을 방지하기 위해 정제 제제에 사용될 수 있다. 윤활제는 활석, 스테아르산마그네슘 및 스테아르산칼슘, 스테아르산, 및 수소화 식물성 오일과 같은 미끄러운 고체로부터 선택될 수 있다.
정제는 또한 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제는 젖는 경우 팽윤하여 정제를 파괴하고 화합물을 방출하는 물질이다. 이들은 전분, 점토, 셀룰로스, 알긴, 및 검을 포함한다. 추가의 예시로서, 옥수수 및 감자 전분, 메틸셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 우드 셀룰로스, 분말화된 천연 스폰지, 양이온-교환 수지, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 나트륨 라우릴 술페이트, 및 카르복시메틸셀룰로스가 사용될 수 있다.
조성물은 예를 들어, 활성 성분을 위의 강산 내용물로부터 보호하기 위해 장용 제제로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 고체 투여 형태를 산 환경에서 불용성이고 염기성 환경에서 가용성인 중합체의 필름으로 코팅함으로써 생성될 수 있다. 예시적인 필름은 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트를 포함한다.
경피 패치는 또한 화합물을 전달하는데 사용될 수 있다. 경피 패치는 화합물이 용해되거나 부분적으로 용해될 수지성 조성물; 및 조성물을 보호하고, 수지성 조성물을 피부와 접촉하게 유지하는 필름을 포함할 수 있다. 다른 보다 복잡한 패치 조성물, 예컨대 약물이 삼투 작용에 의해 펌핑되는 복수의 기공으로 천공된 막을 갖는 것들이 또한 사용될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 또한 인식할 바와 같이, 제제는 제제를 인간에의 투여에 적합하게 만드는 특성 (예를 들어, 순도)을 갖는 물질 (예를 들어, 활성 부형제, 담체 (예컨대 시클로덱스트린), 희석제 등)로 제조될 수 있다. 대안적으로, 제제는 제제를 비-인간 대상체에의 투여에 적합하지만, 인간에의 투여에는 적합하지 않게 만드는 순도 및/또는 다른 특성을 갖는 물질로 제조될 수 있다.
유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 억제제 그의 용도
유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22) 생물학적 활성과 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 또는 이를 발달시킬 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 화합물, 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 화합물 및 제약 조성물을 사용하는 방법이 개시된다. 개시된 화합물은 USP22의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 개시된 화합물 및 제약 조성물은 세포 증식성 질환 및 장애, 예컨대 암, 또는 질환 또는 장애와 연관된 감염, 예컨대 돌발성 급성 호흡기 증후군, 예컨대 SARS-CoV2일 수 있는 USP22 활성과 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 또는 이를 발달시킬 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22) 활성과 연관된 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 개시된 방법에서, 대상체는 USP22의 생물학적 활성을 억제하는 치료제의 유효량이 투여될 수 있다.
개시된 방법은 암을 포함할 수 있는 세포 증식성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 수행될 수 있다. 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 적합한 암은 폐암, 위 암종, 췌장암, 흑색종, 림프종, 결장암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신경교종, 중피종, 신경모세포종, 외투 세포 림프종, 및 급성 골수성 백혈병을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 폐암, 예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 피부암, 예를 들어, 흑색종을 치료하기 위해 수행될 수 있다.
개시된 방법에서, 이를 필요로 하는 대상체는 전형적으로 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 생물학적 활성을 억제하는 치료제가 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C.: 3.4.19.12)을 억제한다.
개시된 방법에 사용하기 위한 적합한 치료제는
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는
7-(디플루오로메틸)-N-(3,4-디메틸페닐)-5-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘3-카르복스아미드,
11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴,
2,7-비스(4-메톡시페닐) 9-옥소9H-플루오렌-2,7-디술포네이트,
6-(2,5-디메톡시페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보니트릴,
2,4-디메탄술포닐-8-메톡시5H,6H-벤조[h]퀴나졸린,
4,5-비스(4-메톡시페녹시)벤젠-1,2-디카르보니트릴,
9-[(3-메틸부트-2-엔-1-일)옥시]-7H푸로[3,2-g]크로멘-7-온,
N-(2-{[5-(에탄술포닐)-3-니트로티오펜-2-일]술파닐}페닐)아세트아미드,
1-[4-니트로-5-(피리딘-4-일술파닐)티오펜-2-일]에탄-1-온,
비스[(4-메톡시페닐)아미노]피라진2,3-디카르보니트릴,
5-{[(2,4-디메틸페닐)술포닐]아미노}-2-메틸-N-페닐나프토[1,2-b]푸란-3-카르복스아미드,
8-옥소테트라히드로팔마틴,
1-{5-[(4-클로로페닐)아미노]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
에틸 6-시아노-7-(4-메톡시페닐)-5-옥소-1-페닐-1,5-디히드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-카르복실레이트,
1-(5-{[(4-클로로페닐)메틸]술파닐}-4-니트로티오펜-2-일)에탄-1-온,
비스[(3-클로로페닐)아미노]피라진-2,3-디카르보니트릴,
1-{5-[(4-메톡시페닐)술파닐]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
4-(4-메톡시페닐)-2-메틸-5-옥소-5H-인데노[1,2-b]피리딘-3-카르보니트릴,
1-{5-[(2,3-디클로로페닐)술파닐]- 4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
1-(1H-벤즈이미다졸-2-일)에타논 (6-메틸-4-페닐-2-퀴나졸리닐) 히드라존,
1-{5-[(4-클로로페닐)술파닐]-4- 니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
크립토크리신,
2-아미노-4-(4-히드록시페닐)-5- 옥소-4H,5H-피라노[3,2-c] 크로멘-3-카르보니트릴,
알파-나프토플라바논, 및
에틸 2-(4-에톡시아닐리노)-5-[3- 메톡시-4-(2-프로피닐옥시) 벤질리덴]-4-옥소-4,5-디히드로-3- 티오펜카르복실레이트
로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이 투여된다.
개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 치료제는 다른 방식으로 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴로 지칭되는 화학식
Figure pct00009
을 갖는 화합물일 수 있다.
개시된 방법은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 활성을 억제하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법에서 대상체는 USP22의 활성을 억제하는 치료제의 유효량이 투여되고, 그에 의해 대상체에서 Treg 세포 활성을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 감염성 질환에 대한 대상체의 면역 반응을 증강시키기 위해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 돌발성 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2) 감염에 대한 면역 반응을 증강시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 감염성 질환에 대한 대상체의 면역 반응을 증강시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C.: 3.4.19.12)을 억제한다.
일부 실시양태에서, 감염성 질환에 대한 대상체의 면역 반응을 증강시키는 개시된 방법. 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 치료제는 본원에 기재된 임의의 화합물로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물일 수 있다.
또한 제약 조성물이 개시된다. 일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 화합물로부터 선택되는 화학식을 갖는 치료제의 유효량 및 적합한 제약 담체를 포함한다.
개시된 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 화합물로부터 선택되는 화합물의 유효량 및 적합한 제약 담체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴의 유효량 및 적합한 제약 담체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22)의 생물학적 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 Treg 세포 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 USP22의 생물학적 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 Treg 세포 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 예시적이며, 청구된 대상의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 종양 미세환경에서 Treg 적합성에 필수적인 탈유비퀴틴화 모듈의 확인
고도로 면역억제성 종양 미세환경 (TME)은 이펙터 T 세포의 항-종양 활성을 감소시키면서 T 조절 (Treg) 세포 안정성 및 기능에 호의적이다. 여기서, 본 발명자들은 종양내 Treg 적응을 촉진시키는 이전에 공지되지 않은 TME-특이적 세포 및 분자 메카니즘을 특징규명하였다. 본 발명자들은 TME 하에서 Treg 안정화에 있어서의 FOXP3 데유비퀴티나제인 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (Usp22) 및 21 (Usp21)의 중요한 역할을 밝혀내었다. 구체적으로, 상승된 TGF-β, 저산소상태, 및 영양분 부족을 포함하는 TME 스트레스인자는 Usp22 및 Usp21을 상향조절하여 HIF, AMPK 및 mTOR 활성의 변경에 반응하여 최적 Foxp3 발현을 유지한다. 둘 다의 USP의 동시 소실은 상승작용하여 Treg 대사 시그니쳐를 변경시키고, 억제 메카니즘을 손상시켜, 증진된 항-종양 활성을 발생시킨다. 마지막으로, 본 발명자들은 종양내 Treg 세포를 유의하게 감소시키고, 결과적으로 항-종양 면역을 증진시키는 최초의 Usp22-특이적 소분자 억제제를 개발하였다. 본 발명자들의 발견은 종양내 Treg 세포의 기능적 고유성의 기저를 이루는 새로운 메카니즘을 밝히고, TME에서 Treg 적응성을 억제하는 항종양 치료 표적으로서 Usp22를 확인한다.
종양은 성장, 침습, 및 전이의 독특한 특성을 갖는 것으로 오랫동안 인식되어 왔지만, 면역 인식 및 파괴를 회피하는 그들의 능력은 최근에 주의를 끌었다. 신생물 세포는 항-종양 면역 반응을 촉진시키는 충분한 항원성을 갖지만, 종양은 면역 억제성 매개인자 및 시토카인의 생산, 결함성 항원 제시, 및 면역 조절 세포, 예컨대 T 조절 (Treg) 세포의 동원을 포함하는 다양한 메카니즘을 통해 면역계를 회피한다 (1, 2). 더욱이, 종양에서 관찰되는 와해된 혈관계 및 증진된 증식 속도는 산소, 글루코스, 및 아미노산은 고갈되는 반면, 시토카인 및 락트산으로 풍부화된 적대적인 미세환경을 생성한다 (3). 전부는 아니지만, 많은 종양 미세환경 (TME)의 이러한 변경은 다양한 메카니즘을 통해 항-종양 면역 반응을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 이러한 TME-유래 압력은 종양내 (it)Treg 세포를 호의적으로 변경시켜, 이펙터 T (Teff) 세포의 항-종양 효과를 감소시키면서 고조된 생존 및 억제성 능력을 발생시킨다 (4 내지 7). 더욱이, itTreg 세포 자체는 전이를 돕는 것으로 공지되어 있으며, 그들의 증가된 수는 불량한 임상적 결과와 상관된다 (1, 6).
itTreg 세포의 정확한 조성, 및 이 집단의 대다수가 천연 (n)Treg 또는 종양-유도된 Treg 세포로 이루어지는지 여부는 공지되지 않은 채 남아 있으며, 종양 유형 사이에 상이할 수 있다 (8). 그러나, 둘 다의 집단은, 후성유전학적으로 별개이지만, TME에서 번성하고, 항-종양 면역을 약화시키는 것을 추가로 돕는다. 흥미롭게도, itTreg 세포는 Treg 세포 안정성 및 억제성 분자 기능을 증가시킴으로써 Treg 적합성을 증진시키도록 기능하는 계통-정의 Treg 전사 인자인 포크헤드 박스(Forkhead Box) P3 (FOXP3)의 상향조절된 발현을 나타낸다 (9, 10). 중요하게는, Foxp3 발현은 적절한 Treg 발달 및 기능에 필수적이다 (11). 그러나, 어떻게 및 어느 TME 인자가 Foxp3 발현을 상향조절하여 itTreg 억제성 기능을 강화시키는지의 기저를 이루는 분자 메카니즘은 공지되지 않은 채 남아 있다.
itTreg 세포의 존재는 항-종양 면역을 억제하는데 있어서 중추적인 역할을 하며, 현재 종양-표적화 면역요법을 위한 주요한 장애물이다. Treg-특이적 마커를 통한 Treg 고갈은 난제로 남아 있기 때문에 (12, 13), TME 내에서 Treg 억제성 능력을 증진시키는 특정한 경로는 itTreg 억제성 기능을 감소시키는 새로운 치료 표적을 위한 매력적인 후보이다. Foxp3은 Treg 신원 및 기능을 위해 특히 중요하지만, 완전한 억제가 가능성 있게는 유의한 자가면역을 유도할 것이기 때문에 이는 그의 표적화에 세심한 주의가 요구될 세포내 단백질이다 (11). 또한, FOXP3과 같은 전사 인자를 특이적으로 표적화하는 것은 기술적으로 난제로 남아 있다. 따라서, 우수한 치료제 후보는 TME에서 Foxp3의 발현 및 안정성을 특이적으로 제어하는 것들일 것이다.
Foxp3 발현 및 안정성은 전사에서 번역후 수준까지 조절될 수 있으며, 각각의 층은 Treg 세포의 안정성 및 전체적인 기능을 독립적으로 제어한다. 특히, Foxp3 조절 및 Treg 기능적 조정의 새롭게 인식된 층은 유비퀴틴화를 통한 것이다 (14, 15). E3 유비퀴틴 리가제를 통한 Foxp3 프로모터 및 보존된 비-코딩 DNA 서열 (CNS) 영역 상의 히스톤의 유비퀴틴화는 염색질 응축 및 Foxp3 전사의 결여를 발생시킨다 (16). 더욱이, FOXP3 단백질의 직접 유비퀴틴화는 프로테아좀 분해를 발생시킬 수 있다. 중요하게는, 유비퀴틴은 전사 수준에서 염색질을 개방하고, 단백질 수준에서 FOXP3을 안정화시키는 둘 다로 기능하는 탈유비퀴틴화 효소 (DUB)에 의해 이들 부위로부터 제거될 수 있다 (14). Foxp3 발현에 대한 E3 리가제 및 DUB 사이의 균형은 Treg 세포 내에서 Foxp3 수준을 조절하는 평형 상태를 발생시킨다. 본 발명자들 및 다른 사람들은 전사 및/또는 번역후 수준에서 FOXP3 탈유비퀴틴화의 직접 조정인자로서 유비퀴틴 특이적 펩티다제 (USP) 패밀리의 3가지 구성원을 발견하였다: Usp7, Usp21, 및 Usp22 (14, 17, 18). 그러나, 이들 데유비퀴티나제의 폭넓은 환경적 신호 및 세포적 조절은 공지되지 않은 채 남아 있다. 여기서, 본 발명자들은 USP-FOXP3 축에 대한 TME의 역할을 조사하고, 항종양 활성이 가능한 최초의 Usp22-특이적 억제제를 개발한다. 본 발명자들의 연구는 특이적 TME 인자가 FOXP3 데유비퀴티나제 Usp22 및 Usp21 (그러나 Usp7 발현은 그렇지 않음)을 선택적으로 유도하여 Treg 안정성 및 적응을 제어함을 확인하였다.
결과
itT reg 세포에서의 FoxP3 데유비퀴티나제의 선택적 상향조절
종양은 면역 세포 기능이 크게 변경되는 경우 적대적인 미세환경을 생성하기 때문에, 본 발명자들은 뮤린 itTreg 세포의 억제성 프로파일을 특징규명함으로써 시작하였다 (도 7). WT Foxp3YFP-cre (WT) 마우스 내로의 B16 흑색종, LLC1 루이스 폐 암종, 및 EG7 림프종의 피하 주사시, itTreg는 동일한 마우스 내의 비장 Treg 세포에 비해 뿐만 아니라 비-챌린지된 대조군 마우스에 대해 FOXP3+ 세포 및 FOXP3 단백질 수준 둘 다의 증가된 백분율을 나타내었다 (도 7A 내지 C). 더욱이, 각각의 종양 유형에서의 itTreg 세포는 CTLA-4 및 PD-1을 포함하는 다수의 공지된 Treg 억제성 마커의 증가된 표면 발현을 나타내었다 (도 S1D 내지 G). 이들 데이터는 itTreg 세포가 FOXP3 및 표면 억제 수용체의 상향조절을 통해 상승된 면역 억제성 기능을 가짐을 시사하며, 이는 인간 종양내 Treg 세포가 증진된 억제성 기능을 나타냄을 입증하는 이전의 연구와 일치한다 (4).
3가지 FOXP3-표적화 USP는 FOXP3 안정성을 유지하는 것을 돕기 때문에 (16 내지 18), 본 발명자들은 그들의 발현의 조정이 itTreg 세포에서 FOXP3 상향조절을 유도할 수 있다고 가설화하였다. 흥미롭게도, Usp22의 mRNA 수준은 동일한 마우스 또는 비-챌린지된 대조군으로부터 수거된 말초 Treg 세포에 비해 itTreg 세포 내에서 일관되게 증가되었지만, Usp7 mRNA 수준은 변하지 않았다. 대조적으로, Usp21 mRNA 수준은 단지 B16 챌린지 하에서만 증가되었으며, 이는 Treg 세포에서의 Usp21 상향조절이 단지 특정 TME 조건 하에서만 일어남을 시사한다 (도 1A 내지 C). 이들 데이터는 TME에서의 하나 또는 많은 인자가 Usp22 및 Usp21 전사 둘 다를 상향조절하여 FOXP3을 잠재적으로 안정화시켜, 안정화된 itTreg 기능을 초래함을 지시한다. 이 개념을 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 Usp22가 인접한 건강한 폐 조직 (AHL)에 비해 인간 종양 폐 조직 환자 샘플 (LTu)로부터 단리된 Treg 세포에서 상향조절됨을 추가로 확인하였다 (도 1D). 이 상향조절은 LTu 환자 샘플 내에서 FOXP3 상향조절과 강한 양성 상관관계를 나타내며, 이는 Usp22가 인간 종양에서 itTreg 세포에서의 Foxp3 발현을 촉진시킴을 시사한다 (도 1D 내지 E). 동계 폐암 모델로부터의 본 발명자들의 관찰과 유사하게, Usp21은 인간 폐 종양 itTreg 세포에서 증가되지 않았고, 이는 Foxp3과 유의하게 양성 상관관계를 갖지도 않았으며 (도 1D 및 F), 이는 Usp22가 적어도 폐암에서 종양 내의 Treg 세포에서 보다 우세한 USP임을 시사한다.
종양-유래 TGF-β는 T reg 세포에서 Usp22 및 Usp21을 선택적으로 유도한다
종양에 의해 분비되는 가용성 인자는 면역 세포 기능을 변경시키는 것으로 공지되어 있기 때문에 (19, 20), 본 발명자들은 itTreg 세포에서 Usp22 및 Usp21을 조절하는데 있어서의 TME-가용성 인자의 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 시험관내 유도된 (i)Treg 세포를 배양된 종양 세포로부터 수득된 배지 (종양 조건화 배지 또는 TCM)에 노출시켰다 (도 8A). 흥미롭게도, B16 및 LLC1로부터의 TCM (그러나 EG7 세포는 그렇지 않음)은 Usp22 및 Usp21 mRNA 수준을 증진시켰다 (도 2A). 대조적으로, Usp7의 수준은 변하지 않고 남아 있었으며, 이는 도 1에서의 결과를 개괄한다. mRNA 수준과 유사하게, USP22 및 USP21 단백질 수준은 LLC1 TCM과의 인큐베이션시 증가되었다 (도 2B). 일관되게, EG7 배양된 배지의 첨가는 단백질 수준에서 임의의 USP를 증진시킬 수 없었으며 (도 2B), 이는 특이적 종양 유형이 Treg 세포에서 Foxp3 데유비퀴티나제를 선택적으로 유도함을 지시한다.
많은 유형의 종양은 면역 반응을 약화시키고 전이를 촉진시키는 다량의 TGF-β를 분비한다 (21, 22). TGF-β가 iTreg 생성 및 안정성에 특히 중요하다는 사실과 함께 (23), 본 발명자들은 TGF-β가 Usp22 및 Usp21의 유도를 통해 itTreg 세포에서 Foxp3 발현을 증진시키는 것을 도울 수 있다고 추측하였다. 사실, TGF-β가 iTreg 세포의 배지에 첨가된 경우 둘 다의 Foxp3-표적화 USP의 mRNA 수준은 증가된 반면, Usp7은 이러한 증가를 나타내지 않았다 (도 8B). Usp22 및 Usp21 발현 둘 다의 증가는 TGF-β 억제제 (LY 3200882)의 첨가에 의해 크게 감소되었다 (도 8C). 중요하게는, Foxp3 mRNA의 수준은 Usp22 및 Usp21의 수준과 함께 상승하였으며 (도 8D), 이는 TGF-β가 Usp22 및 Usp21 유도를 통해 FoxP3 발현을 추가로 증진시킬 수 있음을 입증한다.
TGF-β가 TCM-유도된 Usp22 및 Usp21 상향조절에 연루되어 있는지를 추가로 결정하기 위해, 본 발명자들은 TGF-β 억제제를 상기 언급된 종양 세포주 각각으로부터의 TCM에 첨가하였다. 사실, TGF-β 억제제는 Usp22의 mRNA 증진을 완전히 감소시켰으며 (도 2C), 이는 TGF-β가 Usp22 발현을 증진시키는 B16 및 LLC1 TCM에서의 주요 인자임을 의미한다. 흥미롭게도, 억제제가 LLC1 TCM에 첨가된 경우 Usp21 수준은 또한 감소되었지만, B16 TCM 조건 하에서는 그렇지 않았다 (도 2C). 이 차이는 배지 내로 종양 세포주에 의해 분비된 TGF-β의 양에 기인할 수 있음이 가능하다. 사실, LLC1 세포는 B16 및 EG7 세포 둘 다보다 유의하게 더 많은 양의 TGF-β를 분비하였으며 (도 2SE), 이는 Usp22 및 Usp21 mRNA 발현의 관찰된 증가와 양성으로 상관된다 (도 8F 및 G). Usp7의 수준은 모든 처리 그룹 하에서 변하지 않고 남아 있었으며, 다양한 종양 유형에서 TGF-β의 증가하는 수준에 대한 상관관계를 나타내지 않았다 (도 2C 및 도 8B 내지 C 및 H). 따라서, 본 발명자들의 데이터는 TGF-β를 Treg 세포에서 Usp22 및 Usp21을 선택적으로 유도하는 중요한 가용성 인자로서 확인한다.
종양 유래 TGF-β가 TME 내에서 Usp22 및 Usp21을 적절하게 상향조절하는데 있어서 중요한지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 TGF-β를 결여한 B16 흑색종을 침윤하는 itTreg 세포에서의 Usp22 및 Usp21의 수준이 여전히 상향조절되는지 여부를 결정하였다. shRNA 넉다운은 B16 세포에서 TGF-β 발현을 크게 감소시켰다 (도 8I). 그러나, Usp22 수준은, 스크램블 shRNA로 처리된 종양에서의 그것들과 비교하여 TGF-β를 결여한 B16 흑색종으로부터의 itTreg에서 감소의 경향을 갖지만, 임의의 통계적 유의성을 달성하지 않았으며, 이는 종양 유래 TGF-β가 시험관내에서 Usp22 및 Usp21 둘 다를 유도하는데 충분하지만, 다른 TME 인자도 현재의 실험 설정에서 TGF-β 넉다운의 효과를 극복하는데 작용하고 있음을 지시한다.
TGF-β 신호전달은 독특한 경로를 통해 Usp22 및 Usp21을 상향조절한다
TGF-β가 Usp22 및 Usp21 전사에 대해 작용하는 메카니즘을 밝혀내기 위해, 본 발명자들은 먼저 SMAD-결합 요소 (SBE)에 특이적으로 결합하는 것을 통해 SMAD2, SMAD3 및 SMAD4를 포함하는 SMAD 전사 인자 (드로소필라(Drosophila) 단백질, 십이지마비에 대한 어머니 (Mad) 및 카에노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 단백질 Sma의 동족체)를 공동-활성화시키는 것을 통해 작용하는 정준 TGF-β 신호전달 경로를 조사하였다 (24, 25). 본 발명자들은 보존된 SBE의 서열에 대한 Usp22 및 Usp21 둘 다의 프로모터 영역을 따라 스캐닝하였다. Usp22 프로모터를 따라, 본 발명자들은 3가지 유망한 영역을 발견하였으며, 이에 대해 본 발명자들은 프라이머를 제조하고 SMAD 결합능을 분석하였다 (도 9A 및 B). 염색질 면역침전 (ChIP) 분석은 SMAD3 및 SMAD4 (그러나 SMAD2는 그렇지 않음)가 전사 시작 부위의 상류의 대략 300 및 1200 염기 쌍에서 Usp22 프로모터에 결합함을 검출하였다 (도 9B). 둘 다의 부위에서의 SMAD 결합은 TGF-β 억제제의 첨가시 제거되었으며, 이는 Usp22 프로모터에의 SMAD3 및 SMAD4 결합이 TGF-β 신호전달에 직접적으로 기인함을 입증한다 (도 2D). SMAD2는 Usp22 프로모터의 임의의 영역에 대해 결합능을 나타내지 않았으며 (도 2D; 도 9B); 이는 가능성 있게는 그의 직접 DNA 상호작용을 차단하는 입체 장해에 기인한다 (26).
본 발명자들은 최근에, Usp22-널 iTreg 세포가 높은 수준의 TGF-β로 정상적으로 분극화되지만, 준최적 분극화 조건은 WT iTreg 세포에 비해 FOXP3 MFI 및 백분율의 유의한 감소를 발생시켰음을 관찰하였다 (16). 이는 iTreg 분극화 내에서 TGF-β 신호전달을 영구화하는데 있어서의 Usp22의 중요한 기능을 시사한다. 사실, Usp22-널 iTreg 세포는 WT iTreg 세포에 비해 SMAD2 및 SMAD4 단백질 수준 둘 다의 유의한 결핍을 나타내고, 그들의 mRNA 수준에 있어서 차이는 없으며 (도 10A 및 B), 이는 Usp22가 단백질 수준에서 SMAD를 안정화시키는 것을 통해 TGF-β 신호전달 경로에 대한 양성 조절인자로서 기능함을 시사한다. 이 감소는 Usp22가 DUB이기 때문에, 가능하게는 Usp22 결실시 증진된 SMAD 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해에 기인한다. 사실, Usp22는 SMAD2 및 SMAD4 둘 다와 상호작용하고, 이들을 탈유비퀴틴화시킨다 (도 10C 내지 D 및 F). Usp22는 SMAD3과 상호작용하지만, 이는 SMAD3의 DUB로서 작용하지 않으며 (도 10C 및 E), 이는 그것이 SMAD2 및 SMAD4를 안정화시키는 것을 통해 특이적으로 작용함을 시사한다. 특히, USP22-널 iTreg 세포는 WT에 비해 시클로헥시미드 처리시 SMAD2 및 SMAD4의 증진된 분해를 나타내었으며, 이는 MG132 처리로의 프로테아좀 억제시 구제된다 (도 10G 및 H). 따라서, 본 발명자들의 데이터는 USP22가 SMAD2 및 SMAD4 단백질 안정화를 통해 TGF-β 신호전달을 상호간에 증진시키도록 기능함을 시사한다. 이 작용은 양성 피드백 루프를 통해 그 자신의 상향조절을 보장하며, itTreg 세포에서 Foxp3 발현을 추가로 보장한다.
Usp22와는 달리, Usp21 프로모터를 스캐닝한 경우 SBE는 발견되지 않았으며, 이는 TGF-β가 SMAD와 독립적으로 Usp21 발현을 유도함을 암시한다. 사실, 어느 영역도 임의의 시험된 SMAD 단백질의 결합능을 나타내지 않았으며, 이는 Usp21 발현이 정준 TGF-β 신호전달을 통해 유도되지 않음을 확인시켜 준다 (도 9C). 그러나, iTreg 세포에서의 Usp21의 결여는 시험관내에서 감소된 Foxp3 발현을 발생시키며, 이는 비-정준 TGF-β 신호전달이 Usp21 유도를 유도하고 Foxp3의 안정화를 발생시킬 기회를 남겨 둔다 (도 9D 내지 F). 사실, Smad-독립적 TGF-β 매개 MAP 키나제인 p38의 억제는 TGF-β-매개 Usp21 유도를 제한하였다 (도 9G). 함께, 이들 데이터는 Usp22 및 Usp21이 별개의 TGF-β 신호전달 경로를 통해 매개됨을 지시한다.
저산소상태는 T reg Usp22를 선택적으로 유도하며, 이는 Foxp3 발현을 뒷받침한다
종양 유래 TGF-β는 시험관내에서 Treg Usp22 및 Usp21을 상향조절하는데 중심적이지만, TGF-β 억제는 itTreg 세포에서 Usp22 상향조절을 제거하는데 불충분하였으며 (도 8I 내지 K), 이는 추가적인 TME 인자가 USP를 통한 itTreg 안정성 및 기능에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 종양 세포 분비된 인자 외에도, 종양-유도된 저산소상태는 반복적으로 FOXP3 안정성 및 Treg 세포 기능에 연루되었다 (27, 28). 고형 종양에서의 공지된 음성 예후적 인자 (3, 29)인 저산소상태는 Treg 세포 억제성 능력을 증가시키면서 T 세포 증식, 수용체 신호 전달, 및 이펙터 기능을 우선적으로 하향조절한다 (27, 30, 31). 따라서, 본 발명자들은 Treg 세포에서 USP 수준에 대한 저산소상태의 효과를 조사하였다. 놀랍게도, 단지 Usp22 발현만이 저산소 조건 하에서 mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 증진되었다 (도 3A 및 도 11A 및 B). 따라서, 본 발명자들은 Usp22가 TME에서 저산소 조건 하에서 FOXP3의 안정화제로서 기능할 수 있다고 추측하였으며, FOXP3 안정성 검정을 수행하였다 (도 11C). 사실, Usp22-결핍성 nTreg 세포는 저산소 조건 하에서 FOXP3 발현을 지속시키는 감소된 능력을 나타내었으며 (도 3B), 이는 Usp22가 TME 내에서 발견되는 저산소 조건 하에서 FOXP3 안정화를 위해 요구됨을 의미한다.
저산소 조건 하에서, 저산소상태 유도성 인자 α (HIF-α)는 안정화되어 저 산소 수준에 대한 세포 적응을 촉진시키는 전사 프로그램의 활성화를 발생시킨다 (32). HIF-α는 Usp22 프로모터 상에 2개의 기능적 결합 부위를 갖는 것으로 공지되어 있으며 (33), 이는 Usp22의 저산소 유도가 HIF-α-의존적일 수 있음을 시사한다. 사실, 저산소상태-독립적 HIF-α 활성화제인 디메틸옥살릴글리신 (dMOG)과의 인큐베이션은 nTreg 및 iTreg 세포 둘 다에서 Usp22 mRNA 수준을 증가시켰으며 (도 3C; 도 11D), 이는 저산소상태-유도된 Usp22 발현이 FoxP3 안정화에 관여함을 지시한다. 이를 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 Usp22-결핍성 nTreg 세포가 dMOG로의 처리 후 FOXP3의 감소된 안정성을 나타내었음을 추가로 제시하였으며, 이는 저산소 조건 하에서의 Usp22-의존적 FOXP3 안정화가 HIF-α 의존적임을 확인시켜 준다 (도 11E). 대조적으로, 이 FOXP3 안정화는 저산소 조건 하에서 또는 dMOG 처리로는 iTreg 세포에서 관찰되지 않았다 (도 11F 및 G). 이는 iTreg 세포에서 Foxp3 발현 안정화에 중추적인 실험 조건에 존재하는 TGF-β의 결여에 기인할 수 있다. 그와 무관하게, 이들 결과는 TME 내에서의 저산소상태-매개 Treg 세포 FOXP3 발현에서의 Usp22의 중요성을 입증한다.
TME에서의 대사 변경은 Usp22 및 Usp21을 유도하여 Foxp3 안정성을 촉진시킨다
산소 외에도, TME에서의 글루코스 수준은, 부분적으로 고도로 당분해적 Teff 세포의 글루코스 필요성과 경쟁하는 종양 세포에 의한 그의 증진된 흡수를 통해, 종종 감소된다 (34, 35). 반대로, FOXP3은 Treg 세포에서 당분해에 비해 산화적 인산화를 촉진시키며, 이는 잠재적으로 이들에게 TME 내에서의 기능적 이점을 제공한다 (5, 36, 37). 따라서, 본 발명자들은 영양분 박탈된 환경에서의 관찰된 Treg 세포 이점이 부분적으로 Foxp3 발현의 USP 매개 안정화의 결과로서 존재할 수 있다고 가설화하였다. 사실, Usp22 mRNA 및 단백질 수준은 글루코스 박탈시 Treg 세포에서 증가되었다 (도 3D 및 도 11H 및 I). 추가적으로, Usp22-결핍성 Treg 세포는 WT Treg 세포에 비해 글루코스 박탈 하에서 유의하게 더 낮은 FOXP3 유지를 가지며, 이는 Usp22가 글루코스-제한된 조건 하에서 FOXP3을 안정화시키도록 기능함을 입증한다 (도 3E 및 도 11J).
글루코스에 대한 경쟁과 함께, 종양 내의 아미노산의 부족은 또한 면역 세포 기능을 변경시킬 수 있다 (35). 중요하게는, 아미노산 기아는 Treg 세포 유도를 증진시키는 것으로 공지되어 있다 (38). 아미노산 기아 유도된 Foxp3 발현에서의 USP의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 Treg 세포를 아미노산을 결여한 배지에서 배양하였다. 사실, 아미노산 기아는 nTreg 및 iTreg 세포에서 Usp22 및 Usp21 (그러나 Usp7은 그렇지 않음)의 증가된 발현을 초래하였다 (도 3F; 도 11K). 더욱이, 아미노산 기아된 nTreg (그러나 iTreg는 그렇지 않음) 세포에서 FOXP3의 안정성은 Usp22 또는 Usp21의 결핍에 의해 감소된다 (도 3G; 도 11L). 글루코스 및 아미노산 둘 다가 고갈된 환경에서, 아데노신 모노포스페이트-활성화된 단백질 키나제 (AMPK)의 활성화는 세포 생존을 촉진시키는 산화적 대사를 상향조절하면서 동화작용적 대사를 억제하며 (39), 이는 AMPK 활성화가 Usp22 또는 Usp21 상향조절에 관여함을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 Treg 세포를 미토콘드리아 ATP 신타제의 억제제인 올리고마이신 A로 처리하고, USP mRNA 수준을 측정하였다. 사실, 올리고마이신 처리는 nTreg에서 Usp22 및 Usp21 (그러나 Usp7은 그렇지 않음) mRNA 수준을 둘 다 증가시켰으며 (도 3H), 이는 글루코스 박탈 및 후속 에너지 스트레스가 Treg 세포에서 Usp22 발현을 유도한다는 본 발명자들의 관찰을 추가로 뒷받침한다.
AMPK는 라파마이신 (mTOR) 신호전달의 포유동물 표적과 균형을 이루어 세포 대사 상태를 조절하도록 기능함이 널리 공지되어 있다 (39). 흥미롭게도, mTOR의 약리학적 억제는 또한 nTreg 세포에서 증가된 Usp22 및 Usp21 (그러나 Usp7은 그렇지 않음) 발현을 발생시켰다 (도 3I). 그러나, iTreg 세포에서, Usp21은 AMPK 활성화 또는 mTOR 억제시 mRNA 수준에서 상향조절되지 않았으며 (도 11M 및 N), 이는 반응의 세포-유형 특이성을 시사한다. 집합적으로, 이들 발견은 AMPK 및 mTOR 활성의 균형에 의해 결정된 바와 같은 전반적 대사 상태가 Treg 세포에서 Usp22, 및 보다 적은 정도로 Usp21을 통해 Foxp3 발현 및 안정성을 조정하도록 작용함을 시사한다.
itTreg 세포는 TME의 대사적으로 스트레스가 많은 조건에 보다 잘 적응하며, 이는 이들에게 Teff 세포에 비해 기능적 이점을 제공함이 제안되었다 (5, 19). 조합되어, 본 발명자들의 데이터는 미세환경의 변경이 잠재적으로 HIFα, AMPK, 및 mTOR 활성의 조정을 통해 Usp22 및 Usp21의 증가된 수준을 유도하여 종양 미세환경에서 Treg 안정성을 증진시킬 수 있음을 시사한다.
USP22 및 USP21은 별개의 경로를 통해 T reg 적합성을 조정한다
본 발명자들의 발견은 지금까지 Usp22, 및 보다 적은 정도로 Usp21이 다수의 경로를 통해 TME에서 FOXP3 발현 및 따라서 Treg 적합성을 유지하는데 있어서 중요함을 시사하였다. 생체내에서 그들의 조합된 기능성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 Usp21f/f 마우스를 Usp22f/fFoxP3YFPcre 단일 넉아웃 마우스와 교배시킴으로써 Treg-특이적 Usp22 및 Usp21 이중 넉아웃 (dKO) 마우스의 주를 생성하였다. 이 교배 전략은 본 발명자들에게 Usp22 (22KO), Usp21 (21KO), 및 dKO의 Treg-특이적 넉아웃을 제공하였으며, 이들 모두는 qPCR을 통해 확인되었다 (도 4A). Treg 세포에서 Usp22, Usp21 중 어느 하나, 또는 둘 다의 결실은 6-주령 마우스의 비장에서 B 또는 T 세포 중 어느 것의 빈도도 변경시키지 않았다 (도 12A 및 B). 중요하게는, 마우스는 생애의 초기에 유사한 중량을 나타내지만, 24주령까지 22KO 및 dKO 동물은 WT에 비해 크기에 있어서 일관되게 더 작다 (도 4B).
놀랍지 않게, 모든 3개의 KO 그룹은 연령에 따른 낮은 수준의 진행성 염증의 발달과 일치하게, 연령 매칭된 WT 마우스와 비교하여 CD44hiCD62Lo 활성화된 비장 Teff 세포의 유의한 증가를 나타내었다 (도 4C). 중요하게는, 단지 22KO 및 dKO 마우스만이 Foxp3 발현의 감소 및 Treg 세포-연관된 억제성 마커의 유의한 감소를 나타내었다 (도 4D 및 E). 이전의 연구는 21KO 마우스가 손상된 Foxp3 발현에 부차적인 Treg 세포 기능 및 수의 연령-관련된 손상을 발달시킴을 보고하였지만 (18), 본 발명자들의 8-주령 마우스는 Foxp3 발현의 변화를 나타내지 않았으며, 이는 Usp21-매개 Foxp3 안정화가 TME의 외부에서 불필요할 수 있음을 시사한다.
흥미롭게도, 전사 프로파일링은 WT 유전자 발현과 비교할 경우 보다 많은 Treg 세포 억제성 마커가 어느 하나의 단일 KO 동물에서보다 dKO 마우스에서 차등적으로 발현되었음을 밝혀내었으며 (도 4E), 이는 Treg 세포 안정성 및 기능에 대한 Usp22 및 Usp21의 소실 사이에 가능한 상승작용을 시사한다. 더욱이, 21KO 및 22KO 사이에 차등적으로 발현된 유전자 (DEG)는 상대적으로 뚜렷하였다 (도 4F). 둘 다의 단일 KO 마우스의 유전자 세트 풍부화 분석 (GSEA)은 많은 세포 주기 및 증식 경로, 예컨대 G2M 체크포인트 및 E2F 표적의 변화, 뿐만 아니라 산화적 인산화의 변화를 나타내었지만 (도 4G), 21KO 및 22KO 사이에 단지 총 32개의 중첩하는 차등적으로 발현된 유전자가 있었다 (도 4F). 중요하게는, dKO 동물로부터의 Treg 세포는 단일 KO 마우스 각각에서 발견되는 변화를 병합한 GSEA 및 벌크한 유전자 발현 시그니쳐를 나타내었으며, 이는 Usp22 및 Usp21 둘 다의 소실이 상승작용하여 Treg 세포 기능을 감소시킴을 시사한다 (도 4G).
본 발명자들은 Usp22 및 Usp21 둘 다가 TME에서 대사 변경에 의해 조절됨을 입증하였기 때문에, KO 동물 각각에서 다수의 대사 경로의 붕괴를 확인하는 것은 특히 흥미로웠다. 사실, dKO 마우스로부터의 Treg 세포는 지질 대사 프로세스, 1 탄소 대사, 및 리보솜 생물발생의 현저한 변화를 가졌다 (도 12C 내지 E). 흥미롭게도, Usp22-널 Treg 세포 (그러나 Usp21 결핍성 세포는 그렇지 않음)는 dKO Treg 세포에 대한 지질 대사 및 1-탄소 대사 둘 다의 유사한 변경을 나타내었다 (도 12C 및 D). 대조적으로, 21KO 및 dKO 마우스로부터의 Treg 세포는 리보솜 유전자 발현의 현저한 감소를 나타내었고, 이는 Usp22-널 Treg 세포에서는 확인되지 않았으며 (도 12E), 이는 Usp22 및 Usp21이 Treg 적합성을 조정하는 별개의 경로를 시사한다. 본 발명자들의 시험관내 대사 흐름 분석은, 21KO와는 달리, 22KO 및 dKO 둘 다가 증진된 미토콘드리아 산소 소비 (OCR) 및 세포외 산성화 비율 (ECAR)을 나타냄을 추가로 입증하였으며 (도 12F 및 G), 이는 Usp22가 조절 T 세포의 대사 상태를 조정하는데 있어서 필수적인 기능을 할 수 있음을 시사한다.
Usp21은 Treg 기능에 있어서 Foxp3-독립적 역할을 갖는 것으로 보였기 때문에, 본 발명자들은 dKO 표현형에 대한 Usp21의 기여를 결정하기 위해 22KO 및 dKO 마우스로부터의 DEG를 비교하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 세포 주기 경로 및 이펙터 분화 경로의 유의한 변화를 주목하였으며 (도 13A), 이는 Treg 구획에서 항상성의 소실을 시사한다. 사실, Ki67 염색은 WT Treg 세포와 비교하여 21KO 및 dKO Treg 세포 (그러나 22KO에서는 그렇지 않음)의 증식의 증가를 밝혀내었으며 (도 13B), 이는 통상적으로 고도로 억제성 이펙터 Treg가 기능적 유전자의 하향조절을 갖는 증가된 증식 능력을 가짐을 지시한다.
집합적으로, 이들 데이터는 Usp22 및 Usp21 둘 다가 비록 외견상 Treg 안정성 및 기능을 유지하는 고유한 경로를 통해서이지만 Treg 세포 대사를 조정함을 암시한다.
T reg 세포에서의 Usp22 및 Usp21 결실은 상승작용하여 항-종양 면역을 증진시킨다
생체내에서 종양 조건에서 Treg 세포 Usp22 및 Usp21의 중요성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 B16 흑색종 동계 종양 모델을 사용하였다. Usp22의 Treg-특이적 제거를 갖는 마우스는 Usp21의 결실에 비해 증가된 종양 거부를 나타내었다. 중요하게는, 그렇지만, Treg 세포에서 Usp22 및 Usp21 둘 다의 결합 결실을 보유하는 마우스는 가장 작은 종양을 성장시켰다 (도 5A). 추가적으로, dKO 및 22KO 동물은 비장에서 더 큰 비율의 이펙터 기억 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 나타내었다. 대조적으로, Treg 세포에서의 Usp21의 결실은 B16 종양 거부를 증진시키는데 불충분하였다 (도 5A). 일관되게, 21KO 마우스 시토카인 수준은 WT 마우스와 동등한 반면, 22KO 마우스는 CD8+ 그란자임 B (GZMB) 생산의 증가를 나타내었다. 특히, 종양-보유 dKO 마우스는 비장에서 인터페론-γ (IFN-γ) 및 GZMB 둘 다를 생산하는 CD8+ T 세포의 유의한 증가를 가졌고, 각각의 시토카인은 심지어 단일 KO 동물과 비교하여 증진되었다 (도 5C). 더욱이, 22KO 및 dKO 둘 다는 말초 Treg 세포에서 FOXP3 및 Treg 억제성 마커 MFI의 유의한 강하를 가졌으며, 이는 21KO Treg 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 5D 내지 G). 집합적으로, 이들 데이터는 Treg 세포에서의 Usp21 및 Usp22의 조합된 소실이 Usp21 또는 Usp22 단독의 개별적 소실에 비해 Teff 세포 효과의 증진된 활성화를 발생시킴을 시사한다.
종양 침윤 림프구의 추가의 분석은 dKO 마우스에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 빈도의 유의한 증가를 지시하였으며, dKO에서의 각각의 구획은 WT 마우스보다 IFN-γ 및 GZMB 둘 다의 보다 많은 양을 분비하였다 (도 5H 내지 J). 특히, dKO 마우스는 22KO 및 21KO 마우스 둘 다보다 유의하게 더 높은 수준의 Teff 세포 침윤을 가졌을 뿐만 아니라, 가장 높은 수준의 IFN-γ 분비를 가졌다. 비장 Treg 세포와 일치하게, 22KO 및 dKO 마우스에서 itTreg 세포는 WT 및 21KO에서보다 유의하게 더 낮은 Treg 침윤 및 FOXP3 MFI를 가졌다 (도 5K 및 L). Usp22 및 Usp21의 소실은 본 발명자들의 RNAseq 데이터에 의해 제시된 바와 같이, 많은 Treg 억제성 유전자를 하향조절하였기 때문에 (도 4E), 본 발명자들은 Usp22 및 Usp21 소실로 인한 Treg 취약성이 CD8 고갈후 항-종양 반응의 소실에 의해 제시된 세포독성 CD8+ T 세포 상의 Treg 억제를 완화시킴으로써 항-종양 면역을 영구화한다고 결론내린다 (도 5N).
USP22 단독의 소실은 유의한 항-종양 면역을 나타내었지만, Treg 세포에서 Usp22 및 Usp21 둘 다의 소실은 극적으로 증가된 시토카인 생산, 가장 높은 침윤 T 세포 수, 및 가장 작은 종양 크기를 갖는 dKO 마우스에 의해 문서화된 바와 같이, 보다 활발한 항-종양 반응을 나타내었다. 집합적으로, 이 데이터는 Usp21 및 Usp22가 TME에서 협력하여 Foxp3 발현 및 Treg 세포 기능을 유지함을 시사한다.
Usp22-특이적 소분자 억제제의 확인
Treg 세포에서 Usp22 외에도 Usp21의 결실은 항종양 면역을 증진시키지만, Usp22 결실 단독으로 종양 부담을 감소시키는데 충분하다. Usp22의 약리학적 억제가 Treg 기능을 조정할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 Usp22-특이적 억제제를 확인하는 것을 목표로 하였다. 시험관내 정제된 USP22 단백질은 촉매 활성을 결여하여 (40, 41), 고-처리량 스크리닝에 대한 곤란을 초래하는 것으로 제안되었다. 따라서, 본 발명자들은 컴퓨터-보조 약물 디자인 (CADD)을 사용하여 Usp22-특이적 소분자 억제제를 개발하였다 (도 14A). Usp22는 효모부터 인간까지 고도로 보존된 추정적 촉매 도메인 (Cys, His, 및 Asp)을 함유하기 때문에, 상동성 모델링 연구를 수행하여 구조-기반 가상 스크리닝에 사용하기 위한 인간 Usp22의 모델을 얻었다 (도 14B). Usp22의 3가지 확인된 구조적 모델 중, 효모 UBP8 구조 (PDB 코드 3MHS)가 스위스 모델 (Usp22-m)에 의한 Usp22 모델을 구축하기 위한 주형 단백질로서 선택되었다 (도 14C 및 D). 가장 낮은 잠재성으로 형태를 얻기 위해, Usp22-m의 구조를 분자 역학 시뮬레이션 및 그로맥스(Gromacs)5.15를 사용한 클러스터링 분석에 추가로 적용하고, Cys 185 및 His 479 사이의 거리를 USP22의 촉매 부위 (Usp22-md)의 위치에서 3.6 Å에서 4.8 Å으로 증가시켰다 (도 14C). 본 발명자들은 USP22의 예측된 아미노산 서열을 150개의 상동 전체 서열과 추가로 비교하였다. 보존 등급은 구조 상으로 맵핑되고, Cys 도메인이 고도로 보존되었음을 제시한다. 이 연구는 상동성 모델링의 정확성을 위한 기초를 제공할 뿐만 아니라, 약물 선택성 스크리닝을 위한 호의적인 조건을 제공한다.
이어서 본 발명자들은 리핀스키(Lipinski) 법칙 및 베버(Veber) 법칙 둘 다를 사용하여 스펙스(Specs) 데이터베이스를 통해 필터링하고, 본 발명자들의 Usp22 모델의 촉매 포켓에 결합하는 총 240K 화합물을 발견하였다. 이어서 본 발명자들은 MD 및 MM/PBSA 방법에 의한 도킹 친화도에 의해 순위화된 상위 100개의 화합물을 필터링하고, 25개의 화합물을 남겨 두었다 (표 1). 이 제한된 수의 화합물은 본 발명자들의 추가의 생물학적 스크리닝을 허용하였다. USP22 억제는 FOXP3 발현 수준의 극적인 감소를 초래하기 때문에, 본 발명자들은 25개의 화학물질 각각에 의한 USP22 억제 효능의 생물학적 확인을 위한 판독으로서 FOXP3 MFI 감소를 이용하였다. 표 1에 지시된 바와 같이, 화학물질 S02 (11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴)는 FOXP3 발현을 하향조절하는데 있어서 강한 효능을 나타내었다. 도 6A에 제시된 구조인 화합물 S02는 RMSD 궤적에 의해 제시된 USP22 촉매 도메인 포켓에서 안정하게 결합하였으며 (도 14E), 본 발명자들의 USP22-md 모델에 대한 강한 결합 에너지를 가졌다 (도 14F). 더욱이, Usp22의 각각의 잔기와의 S02 상호작용의 분석은 측쇄 음성 잔기 (Glu, Asp)가 억제제 및 단백질의 결합에 대해 호의적인 기여를 하지만, 양으로 하전된 잔기, 예컨대 Arg 및 Lys는 해로운 역할을 함을 지시하였다 (도 14G). 따라서, Usp22 억제제의 장래의 생성은 소수성 잔기 뿐만 아니라, 억제제, 및 결합 포켓의 표면 상의 하전되고 극성인 잔기 사이의 상호작용을 고려해야 한다.
Usp22i-S02는 항-종양 면역을 증진시키는데 있어서 큰 전임상적 효능을 보유한다
초기 스크리닝 후, 본 발명자들은 WT 및 Usp22-널 iTreg 세포 둘 다에서, 이제 Usp22i-S02로 별칭된 화합물 S02에 대한 시험관내 용량 반응 연구를 실행하였다 (도 15A 내지 C). 10μg/mL의 농도는 생존율에 대한 효과를 거의 갖지 않으면서 Usp22-널 iTreg 세포와 필적하는 Foxp3 MFI 및 단백질 수준의 감소를 나타내었으며, 이는 Foxp3을 안정화시키는데 있어서 Usp22 활성의 거의 완전한 억제를 지시한다 (도 15A 내지 D). 중요하게는, 인간 Treg 세포에의 저용량의 Usp22i-S02 투여는 세포 생존율에 대한 효과를 거의 갖지 않으면서 Foxp3 MFI를 유의하게 감소시켰으며, 이는 인간 세포에 대한 이 억제제의 적절성을 제시한다 (도 15E 및 F). 대조적으로, Usp22i-S02는 Usp21을 결여한 iTreg 세포에 대한 완전한 효과를 가지면서, 생체내에서 (도 6B) 및 시험관내에서 둘 다, Usp22를 이미 결여한 뮤린 Treg 세포에서 FOXP3 수준에 대한 최소 효과를 가졌다 (도 15A 및 G). 기능적으로, Usp22i-S02 투여는 iTreg 세포에서 Usp22 결실에 대한 유사한 효과를 가졌으며, 이는 시클로헥시미드 (CHX) 처리된 세포에서 증진된 FOXP3 분해, 증가된 FOXP3 유비퀴틴화, 및 감소된 Foxp3 전사를 발생시켰다 (도 15H 내지 K). 더욱이, Usp22i-S02-매개 FOXP3 분해는 MG132 프로테아제 억제에 의해 중단되었으며, 이는 Usp22i-S02가 FOXP3의 프로테아좀-특이적 분해를 증진시킴을 지시한다 (도 15L). 중요하게는, Usp22i-S02는 Usp22를 결여한 Treg 세포에서 Foxp3에 대한 효과를 갖지 않으면서, 글루코스 기아 하에서 Treg 세포에서 Foxp3 안정성을 유의하게 감소시켰다 (도 15M). 이 경향은 또한 저산소 및 아미노산 기아 조건 하에서도 나타났으며, 이는 Usp22i-S02가 TME 인자 하에서 Foxp3 안정성을 감소시킴을 지시한다 (도 15L). 따라서, 이들 결과는 Usp22i-S02가 Treg 세포에서 Foxp3 발현을 하향조절하는 강력한 USP22-특이적 소분자 억제제임을 지시한다.
잠재적인 면역치료제의 중요한 측면은 낮은 면역 독성과 쌍을 이룬 그의 항종양 기능성이다. 생체내에서 Usp22i-S02의 독성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 먼저 나이브 마우스에서 그의 효과를 결정하였다. 본 발명자들은 DMSO-처리된 대조군 마우스에 비해 처리된 마우스의 중량, B 세포 및 Teff 세포 백분율 및 증식, 및 Teff 세포 활성화의 변경이 거의 없음을 발견하였다 (도 16A 내지 D). Teff 세포와는 달리, Treg 세포 사멸은 유의하게 증가되었으며 (도 16E), 이는 Treg 백분율의 감소를 발생시켰다 (도 16B). 흥미롭게도, Treg 증식은 또한 증가되었으며 (도 16C), 이는 잠재적으로 도 14B에 제시된 바와 같이 종양 내의 기능이상적 Treg 집단을 지시한다. 중요하게는, WT 마우스에의 Usp22i-S02의 투여는 Treg 세포에서 Usp22의 유전적 결실을 모방하였으며, 이는 Usp22-KO 마우스에서 FOXP3 MFI에 대한 추가적인 감소 없이, Treg 세포 빈도의 임의의 변경 없이 비장 및 림프절로부터의 Treg 세포에서 FOXP3 MFI의 유의한 강하를 제시한다 (도 6B 내지 D). 더욱이, 종합적인 조직 패널은 대조군 DMSO 처리된 마우스로부터 기관 독성 차이를 나타내지 않았다 (도 16F 내지 H). 이들 데이터는 Usp22i-S02의 투여가 다른 면역 세포 유형 및 조직 독성에 대한 효과를 거의 갖지 않으면서 나이브 마우스에서 Treg-특이적 표현형을 발생시킴을 지시한다.
잠재적 치료제로서의 Usp22i-S02의 기능성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 억제제를 확립된 종양에 대해 시험하였다. 초기 LLC1 종양 확립 후, Usp22i-S02가 투여된 WT 마우스는 비처리된 마우스에 비해 현저한 종양 거부, 뿐만 아니라 Teff 세포 종양 침윤의 유의한 증가를 나타내었다 (도 6E 내지 G). 중요하게는, 종양내 (그러나 비장은 그렇지 않음) Foxp3+ Treg 백분율은 Usp22i-S02의 투여 후 유의하게 감소하였다 (도 6H). 더욱이, itTreg 세포는 더 낮은 수준의 GITR 및 PD-1을 가졌고, 또한 Treg 기능이상 및 취약성의 마커(42)인 IFN-γ의 유의하게 더 높은 수준을 발현하였으며, 이는 구체적으로 종양 내에서 Treg 세포에 대한 Usp22i-S02의 중요성을 시사한다 (도 6J). 종양 침윤 림프구의 추가의 분석을 종양 삽입 직후 처리된 마우스에 대해 수행하였다 (도 16I). 감소된 종양 부담 및 증가된 Teff 세포 침윤과 함께, 종양내 CD8+ T 세포는 비-처리된 마우스에 비해 CD44+ 세포의 증가 및 T-bet+, Blimp1+, 및 안넥신 V+ 세포의 감소를 가지면서, 덜 소진된 표현형을 나타내었다 (도 16H 내지 P). 중요하게는, 종양내 Foxp3+ Treg 백분율은 Usp22i-S02의 투여 후 유의하게 감소하였다 (도 16Q).
Usp22는 또한 중요한 종양유전자이기 때문에 (43, 44), 본 발명자들은 Usp22i-S02의 잠재적 이중-치료 기능에 흥미를 가졌다. 사실, 시험관내에서 LLC1 세포에의 Usp22i-S02의 투여는 감소된 종양 세포 카운트, 생존율, 및 성장을 발생시켰다 (도 17A 내지 C). 더욱이, 확립된 종양을 갖는 Rag-/- 마우스의 처리는 종양 세포 내재적 Usp22가 종양 성장에 요구된다는 이전의 관찰과 일치하게, 종양 성장의 작지만 통계적으로 유의한 감소를 발생시켰다 (도 17D)(45). 함께, 본 발명자들의 데이터는 TME 내에서 Treg 세포 안정성 및 적응에 있어서의 Usp22의 중요한 역할, 및 소분자 억제제로 Usp22를 특이적으로 표적화하는 것이 종양 및 면역 내재적 메카니즘 둘 다를 통해 항-종양 면역을 증진시킴을 제시한다.
논의
최근의 데이터는 영양분 및 산소가 고갈된 TME가 가능성 있게는 Teff 세포에 비해 Treg 세포에 대사 이점을 제공하여 면역억제성 미세환경을 추가로 촉진시킴을 시사한다. 그러나, Treg 세포 억제성 기능 및 적응을 강화시키는 TME-특이적 인자 및 그들의 세포 표적은 대개 확인되지 않은 채 남아 있다. 본 발명자들의 연구는 TME에서 Foxp3 안정성을 증진시키는 환경적으로 민감한 인자로서 Foxp3-특이적 DUB인 Usp22 및 Usp21의 이전에 인식되지 않은 역할을 예시한다. 본 발명자들은 Usp22 및 Usp21을 상향조절하여 궁극적으로 Foxp3을 안정화시키는 몇몇 TME 인자를 확인하였다: (1) 종양-분비된 TGF-β; (2) 저산소상태; (3) 글루코스-제한; 및 (4) 아미노산-박탈 (도 18). 본 발명자들의 발견은 itTreg 세포의 대사 및 기능적 고유성 뒤의 새로운 메카니즘을 밝히며, 이는 어떻게 이들 세포가 그들의 기능을 뒷받침하기 위해 환경적 신호에 반응하여 적응하는지에 대한 증거를 제공한다.
itTreg 세포는 보다 억제성이며 대개 높은 Foxp3 발현을 갖는다는 것이 널리 문서화되었기 때문에 (9, 10, 46), 본 발명자들은 먼저 다양한 뮤린 종양 모델에서 이들 발견을 확인하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 이들 모델에서 및 폐암 환자에서 itTreg 세포가 비-종양-거주 Treg 세포와 비교할 경우 Usp22, 및 때때로 Usp21을 상향조절함을 발견하였다. 더욱이, Usp22 상향조절은 인간 폐암 itTreg 세포에서 더 높은 Foxp3 발현과 상관되며, 이는 TME 인자가 이들 USP를 선택적으로 유도하여 Foxp3을 유비퀴틴-매개 분해로부터 보호하면서 동시에 Foxp3 전사를 촉진시킴을 시사한다. 본 발명자들이 인간 itTreg 세포에서 증가된 Usp22를 관찰하였다는 사실은 인간 종양 요법에 대한 이 경로의 적절성을 확대한다. Treg 세포에서 Usp7은 결장염의 모델에서 Foxp3 발현 및 Treg 억제성 기능을 제어하는 것으로 공지되어 있지만, 본 발명자들은 itTreg에서 Usp7 발현의 증가를 관찰하지 못했으며, 이는 Usp7이 주로 항상성 조건 동안 Treg 기능을 조절할 수 있음을 시사한다.
TGF-β는 iTreg 전환 및 안정성에 있어서 주요한 역할을 하며, 많은 종양 유형에 의해 폭넓게 분비된다. 본 발명자들은 종양 분비된 TGF-β가 정준 TGF-β 신호전달을 통해 Usp22를 상향조절하는데 충분함을 발견하였다. 더욱이, Usp22는 피드백 루프에 참여하여 그 자신 및 Foxp3을 SMAD 단백질 안정화를 통해 추가로 상향조절한다. Usp21은 정준 TGF-β 경로를 통해 기능하고 있지 않았지만, 비-정준 TGF-β JNK/P38 신호전달 경로는 작용하고 있을 수 있음이 가능하다 (47). TGF-β는 Foxp3 발현 및 안정성, 및 iTreg 기능에 폭넓게 연루되어 있기 때문에, 본 발명자들의 데이터는 이미 공지된 시스템에 새로운 수준의 복잡성을 더한다 (23, 48). 이들 신규한 메카니즘은 잠재적으로 대안적인 경로를 통해 Treg 세포 안정화를 보장하도록 기능하며, 이는 다양한 미세환경에서 그들의 억제성 능력을 유지하는 그들의 능력을 강화시킨다.
그러나, 종양-분비된 TGF-β는 USP를 상향조절할 수 있는 유일한 인자는 아닌데, 이는 EG7 TCM으로 처리된 Treg 세포가 EG7 종양으로부터 단리된 itTreg 세포에서 나타난 Usp22의 증가를 개괄할 수 없었기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 TME 내의 다른 환경적 인자가 또한 USP를 통한 Treg 안정화에 연루되어 있다고 가설화하였다. 저산소상태는 고형 종양의 주요한 특징이기 때문에 (3, 29), 본 발명자들은 어떻게 저 산소 조건이 Treg 세포에서 Usp22 수준에 영향을 미치는지를 조사하였다. 저산소상태는 Usp22를 HIF-의존적 방식으로 유도하였다. 또한, Usp22 결실시, 저산소 스트레스 하에서의 nTreg 세포는 안정한 FOXP3 발현을 지속할 수 없었다. 본 발명자들의 발견은 저산소 조건 하에서 nTreg 세포의 고조된 증식 및 억제성 능력을 입증한 이전의 데이터와 일치한다 (27). 이들 데이터는, Usp22 프로모터를 따른 2개의 기능화 HIF 결합 부위의 지식과 쌍을 이루어, 저산소상태가 FOXP3의 Usp22-의존적 안정화를 통해 Treg 억제성 기능을 증진시킬 수 있음을 암시한다 (33).
산소 이용률의 감소와 함께, TME 내에서 일어나는 영양분에 대한 경쟁은 면역 세포 성장, 생존, 및 기능에 영향을 미친다. 고전적으로, Treg 세포는 Teff 세포보다 당분해에 대해 유의하게 더 낮은 의존성을 갖는 것으로 생각되며, 이는 잠재적으로 또 다른 이점을 제공한다 (5, 34, 37). 본 발명자들의 데이터는 글루코스- 및 아미노산-박탈 하에서 FOXP3을 안정화시키도록 기능하는, 이 프로세스에서 중요한 매개인자로서 Usp22를 확인한다. 부분적으로 FOXP3의 증진된 안정성은 가능성 있게는 TME 내에서 글루코스 제한 하에서 일어나는 AMPK 활성화에 부차적인 것으로 보인다. 흥미롭게도, Treg 세포에서의 AMPK 활성화는 TME에서 Treg 생존을 추가로 증진시킬 수 있는 산화적 대사를 향한 이동에 의해 달성된다 (49). 본 발명자들은 AMPK 활성화가 Usp22 및 Usp21을 상향조절하는데 충분하며, 이는 에너지 스트레스 하에서 Treg 세포 기능을 위한 FOXP3 안정화에 있어서의 그들의 관여와 연루됨을 제시한다. 영양분 결핍을 통한 AMPK 신호전달의 촉진은 또한 T 세포 내에서 mTOR 활성을 억제한다 (35, 50). AMPK 및 mTOR 신호전달의 균형은 영양분 이용률에 대한 환경적 센서로서 기능하기 때문에, AMPK 활성화는 주로 mTOR 신호전달의 억제를 통해 Usp22 및 Usp21 발현을 증가시킨다는 것이 가능하다. 사실, mTOR 억제는 Treg 세포에서 Usp22 및 Usp21을 상향조절할 수 있었다.
면역 세포의 대사 상태는 그들의 세포 생존 및 기능을 위해 TME 내에서 매우 중요하다. Treg 세포는 저-산소, 저 영양분 환경에 적응할 수 있기 때문에, 이는 그들에게 Teff 세포에 비해 대사 이점을 제공한다. 중요하게는, FOXP3은 그것이 Treg 세포 내에서 산화적 인산화를 촉진시키는 것으로 공지되어 있기 때문에 이 프로세스에 필수적이다. 본 발명자들은 Usp22- 및 Usp21-결핍성 Treg 세포가 대사 유전자의 유의하게 변경된 발현 및 손상된 OCR 및 ECAR을 가짐을 제시한다. 또한, RNA 시퀀싱 분석은 Treg 세포에서의 Usp22 및 Usp21의 소실이 세포 성장 및 증식에 연관된 다수의 경로의 상향조절을 발생시켰음을 입증하였다. 집합적으로, 이들 데이터는 Usp22 및 Usp21이 부분적으로 Treg 세포 대사 프로그램을 조정하는 것을 통해 영양분-제한된 환경에서 Treg 세포 정지를 촉진시키도록 작동할 흥미로운 가능성을 제기한다. 함께, 본 발명자들의 데이터는 TME 내의 미세환경적 스트레스가 Treg USP 수준을 상향조절하며, 이는 이어서 FOXP3을 안정화시키도록 기능함을 지시한다. 증진된 FOXP3 안정성은 TME에 대한 Treg 세포 적응을 추가로 뒷받침하며; 따라서, 이는 TME에서 Treg 세포 신원, 대사 및 기능을 조절하는 중요한 환경-민감성 인자로서 Usp22 및 Usp21을 확인한다.
추가적으로, 본 발명자들 및 다른 사람들은 Usp22 및 Usp21 둘 다가 많은 암 유형, 예컨대 위 암종, 췌장암 및 흑색종에서 상향조절되며, 불량한 예후와 상관되었음을 입증하였다 (51, 52). Usp22는 종양형성 c-Myc 활성화를 촉진시킬 뿐만 아니라, p53의 종양 억제성 기능을 간접적으로 길항작용하는 반면, Usp21은 Fra1, FoxM1 및 Wnt를 포함하는 전사 인자의 그룹을 안정화시킴으로써 종양유전자로서 기능한다 (52 내지 54). 중요하게는, Usp22 및 Usp21은 또한 전사 (Usp22) 및 번역후 (둘 다) 수준에서 DUB 기능을 통해 Foxp3 발현을 유지하도록 기능한다. 이 이중성은 Usp22 및 Usp21을 종양 세포 내재적 및 면역억제성 경로 둘 다를 동시에 표적화할 수 있는 매우 매력적인 잠재적 치료제로 만든다. 사실, 그들의 조합된 소실은 Treg 종양-촉진 기능에서 가장 유의한 손상을 발생시켰으며, 이는 Usp22 및 Usp21이 TME에서 Treg 세포 적응 및 기능을 조정하는데 있어서 별개의 역할을 함을 시사한다.
그러나, Treg 세포에서의 Usp22의 소실은 Usp21의 소실에 비해 증진된 항-종양 면역을 발생시켰으며, 이는 itTreg 세포에서 Usp22의 우세함을 시사한다. 따라서, Usp22를 특이적으로 표적화하는 것은 Treg 세포가 TME 내에서 Teff에 비해 갖는 이점을 제거하는데 충분할 수 있다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 최초의 Usp22-특이적 억제제를 개발하고 시험하였다. 억제제의 투여는 itTreg 수의 극적인 감소를 발생시켜, 강한 생체내 항-종양 효과를 발생시켰다. 본 발명자들의 데이터는 Usp22가 표적화가능한 단백질이며, 억제제 Usp22i-S02가 종양 면역 요법에 포함될 잠재성을 가짐을 입증한다. 더욱이, 많은 현재의 치료제는 Teff 세포 기능을 촉진시키는데 초점을 맞추며, 따라서 현재의 요법과 함께 Usp22 억제의 추가는 상승작용적 효과를 통해 항-종양 면역을 추가로 증진시킬 수 있다.
물질 및 방법
종양 모델
EG7 림프종, LLC1 폐 암종, 및 B16-F10 흑색종 세포주는 북서부의 창(Zhang) 실험실에 의해 제공되었으며, 이전에 보고된 바와 같이 종양 모델을 위해 사용되었다 (14). 세포주를 10% FBS를 갖는 DMEM에서 배양하고, 룩아웃 미코플라스마(LookOut Mycoplasma) PCR 검출 키트 (시그마(Sigma), MP0035-1KT)를 사용하여 미코플라스마에 대해 시험하였다. 배양된 암 세포를 트립신화하고, PBS로 1회 세척하였다. LLC1 폐 암종 종양 세포를 8- 내지 10-주령 마우스의 우측 옆구리에 마우스당 1 x 106개의 종양 세포로, 및 B16 흑색종은 마우스당 5 x 104개의 종양 세포로 피하로 투여하였다. 종양을 3개의 직교 축 (x, y 및 z)을 따라 측정함으로써 2 내지 3일마다 측정하고, 종양 부피를 (xyz)/2로서 계산하였다. IRB에 의해 합의된 종양 크기 제한은 2 cm3였다.
시험관내 iT reg 세포 TCM 및 TGF-β 검정
이전에 생성된 iTreg 세포를 세척하고, 생존을 유지하기 위해 5 ng/ml의 IL-2를 함유하는 OPTImem 배지에서 7시간 동안 휴지시켰다. OPTImem을 사용하여 혈청에서 발견되는 임의의 TGF-β 오염을 회피하였다. 휴지 후, 세포를 20ng/ml TGF-β 또는 다양한 종양 세포 배지 (B16, LLC1, 및 EG7)의 첨가의 존재 또는 부재 하에서 IL-2를 함유하는 OPTImem에서 인큐베이션하였다. B16, EG7, 또는 LLC1 세포주를 16시간 동안 50% 전면생장률로 플레이팅함으로써 TCM을 얻었다. 이어서 TCM을 신선한 OPTImem과 50:50 혼합하고, iTreg 세포 상에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. TGF-β 억제제 LY 3200882 (메드 켐 익스프레스(Med Chem Express): 카탈로그 번호: HY-103021)를 지시된 경우 25μg/mL로 첨가하였다.
시험관내 T reg 세포 저산소상태 배양
nTreg 세포를 상기 기재된 바와 같이 단리하고, 37℃에서 정상산소 (21% O2) 또는 저산소 조건 (1%O2) 중 어느 하나에서 24시간 동안 배양하였다. 저산소상태를 (저산소상태 챔버 및 컴퍼니의 명칭)을 사용하여 유도하였다. T 세포 배지를 사용 전에 37℃에서 3시간 동안 정상산소상태 또는 저산소상태에서 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 수집하고, RNA를 상기 기재된 바와 같이 추출하였다. iTreg 세포에 대해, 세포를 단리하고, 상기 기재된 바와 같이 분극화하였다. 이어서, 세포를 optiMEM에서 밤새 휴지시키고, 이어서 정상산소 또는 저산소 조건 중 어느 하나에서 5ng/ml IL-2를 함유하는 optiMEM에 플레이팅하였다. optiMEM 배지를 사용 전에 37℃에서 정상산소상태 또는 저산소상태에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 정상산소상태 또는 저산소상태에서 72시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 저산소상태 안정성 검정을 수행하고, 이어서 수집하고, 유동 세포계측법을 위해 FOXP3에 대해 염색하였다.
글루코스 및 아미노산 제한 검정
nTreg 세포를 상기 기재된 바와 같이 단리하고, 웰당 1 x 105개의 세포로 24시간 동안 정상 T 세포 배지, 글루코스를 결여한 T 세포 배지 (써모 피셔(Thermo Fisher) 카탈로그# 11879020), 또는 투석된 FBS (GIBCO 카탈로그# A3382001)로 치환된 글루타민을 포함하는 아미노산을 결여한 T 세포 배지 (유에스 바이올로지칼(US Biological) 카탈로그# R9010-02) 중 어느 하나에서 배양하였다. T 세포 배지는 상기 기재된 바와 같이 2000U의 IL-2 및 CD3/CD28 비드와 함께 포함하였다. iTreg 세포를 단리하고, 상기 기재된 바와 같이 3일 동안 분극화하였다. 분극화 후, iTreg 세포를 정상 T 세포 배지 또는 글루코스 또는 아미노산을 결여한 T 세포 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서 nTreg 및 iTreg 세포 둘 다를 수집하고, RNA를 상기 기재된 바와 같이 추출하였다. 안정성 검정을 위해, 세포를 상기 기재된 바와 같이 48시간 동안 배양하고, 이어서 수집하고, 유동 세포계측법을 위해 FOXP3에 대해 염색하였다.
시험관내 억제제 검정
모든 nTreg 및 iTreg 세포를 상기 기재된 바와 같이 플레이팅하였다. DMOG (시그마 카탈로그 #D3695)를 관련된 실험에서 1mM로 24시간 동안 세포에 투여하였다. 올리고마이신 (시그마 카탈로그# 75351)을 관련된 실험에서 24시간 동안 세포의 배지에 1μM로 투여하였다. 토린 1 (밀리포어(Millipore) 카탈로그 #475991)을 24시간 동안 250 nM로 관련된 세포에 투여하였다. FOXP3 단백질 수준을 상기 기재된 억제제의 처리의 48시간 후 유동 세포계측법을 통해 평가하였다. Usp22i-S02의 시험관내 투여는 10ug/mL로였다.
Usp22i-S02 생체내 억제제 실험.
LLC1 세포를 6 내지 8-주령 C57BL/6 수컷 마우스 내로 이식하였다. 피하 주사를 주사당 1^6개의 세포를 사용하여 100 μL의 최종 부피로 마우스의 우측 옆구리에서 수행하였다. USP22i-S02를 LLC1 세포 주사의 날에 시작하여 5일 동안 1일 2회, 100 μL의 오일에서, 20mg/kg/회의 농도로 복강내로 (i.p) 주사하였다. 대조군 동물은 100 μL의 오일 단독을 받았다. 피하 종양 직경을 마우스 코호트에서의 임의의 종양이 그의 가장 큰 직경으로 2.5 cm에 도달할 때까지 캘리퍼스로 매일 측정하였다. 세포를 프로세싱하고, 상기 언급된 바와 같이 분석하였다.
통계 및 데이터 이용가능성
샘플 크기를 미리 결정하는데 통계적 방법은 사용하지 않았다. 실험은 무작위화되지 않았다. 조사자는 실험 및 결과 평가 동안 할당에 대해 맹검이 아니었다. 모든 통계적 분석은 그래프패드(GraphPad)로 산출하였으며, 각각의 실험에 사용된 시험은 도면 범례에 열거된다. 열 사이의 다중 비교를 갖는 ANOVA를 터키 검정으로 보정하여 통계적 유의성을 결정하였다. 양측 독립표본 t 검정을 웰치(Welch) 보정으로 수행하였다.
참고문헌:
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
결론
본 발명자들의 연구는 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴, 또는 USP22i-S02를 USP22-특이적 억제제로서 확인한다. 이 억제제는 (i) 그것이 Treg 억제성 기능을 억제하고, (ii) PD-L1의 종양 세포 발현을 억제하며, 이들 둘 다는 항종양 면역 반응을 증진시키기 때문에, 이상적인 항종양 치료 약물인 것으로 보인다. 또한, (iii) USP22i-S02는 USP22 억제를 통해 종양 세포 증식을 직접적으로 억제할 수 있다.
표
표 1. 화합물
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
표 2. 항체
Figure pct00026
Figure pct00027
표 3. 프라이머
Figure pct00028
Figure pct00029
SEQUENCE LISTING <110> Northwestern University Fang, Deyu Montauti, Elena Yan, Ming Gao, Biexue Tang, Amy Liu, Huiping <120> INHIBITORS OF UBIQUITIN SPECIFIC PEPTIDASE 22 (USP22) AND USES THEREOF FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS <130> 702581.02132 <150> 63/201,330 <151> 2021-04-23 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ser Arg Pro Glu Pro Glu Gly Glu Ala Met Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Pro Pro Gly Cys Ser His Leu Gly Ser Phe Lys Val Asp 20 25 30 Asn Trp Lys Gln Asn Leu Arg Ala Ile Tyr Gln Cys Phe Val Trp Ser 35 40 45 Gly Thr Ala Glu Ala Arg Lys Arg Lys Ala Lys Ser Cys Ile Cys His 50 55 60 Val Cys Gly Val His Leu Asn Arg Leu His Ser Cys Leu Tyr Cys Val 65 70 75 80 Phe Phe Gly Cys Phe Thr Lys Lys His Ile His Glu His Ala Lys Ala 85 90 95 Lys Arg His Asn Leu Ala Ile Asp Leu Met Tyr Gly Gly Ile Tyr Cys 100 105 110 Phe Leu Cys Gln Asp Tyr Ile Tyr Asp Lys Asp Met Glu Ile Ile Ala 115 120 125 Lys Glu Glu Gln Arg Lys Ala Trp Lys Met Gln Gly Val Gly Glu Lys 130 135 140 Phe Ser Thr Trp Glu Pro Thr Lys Arg Glu Leu Glu Leu Leu Lys His 145 150 155 160 Asn Pro Lys Arg Arg Lys Ile Thr Ser Asn Cys Thr Ile Gly Leu Arg 165 170 175 Gly Leu Ile Asn Leu Gly Asn Thr Cys Phe Met Asn Cys Ile Val Gln 180 185 190 Ala Leu Thr His Thr Pro Leu Leu Arg Asp Phe Phe Leu Ser Asp Arg 195 200 205 His Arg Cys Glu Met Gln Ser Pro Ser Ser Cys Leu Val Cys Glu Met 210 215 220 Ser Ser Leu Phe Gln Glu Phe Tyr Ser Gly His Arg Ser Pro His Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Lys Leu Leu His Leu Val Trp Thr His Ala Arg His Leu Ala 245 250 255 Gly Tyr Glu Gln Gln Asp Ala His Glu Phe Leu Ile Ala Ala Leu Asp 260 265 270 Val Leu His Arg His Cys Lys Gly Asp Asp Asn Gly Lys Lys Ala Asn 275 280 285 Asn Pro Asn His Cys Asn Cys Ile Ile Asp Gln Ile Phe Thr Gly Gly 290 295 300 Leu Gln Ser Asp Val Thr Cys Gln Val Cys His Gly Val Ser Thr Thr 305 310 315 320 Ile Asp Pro Phe Trp Asp Ile Ser Leu Asp Leu Pro Gly Ser Ser Thr 325 330 335 Pro Phe Trp Pro Leu Ser Pro Gly Ser Glu Gly Asn Val Val Asn Gly 340 345 350 Glu Ser His Val Ser Gly Thr Thr Thr Leu Thr Asp Cys Leu Arg Arg 355 360 365 Phe Thr Arg Pro Glu His Leu Gly Ser Ser Ala Lys Ile Lys Cys Ser 370 375 380 Gly Cys His Ser Tyr Gln Glu Ser Thr Lys Gln Leu Thr Met Lys Lys 385 390 395 400 Leu Pro Ile Val Ala Cys Phe His Leu Lys Arg Phe Glu His Ser Ala 405 410 415 Lys Leu Arg Arg Lys Ile Thr Thr Tyr Val Ser Phe Pro Leu Glu Leu 420 425 430 Asp Met Thr Pro Phe Met Ala Ser Ser Lys Glu Ser Arg Met Asn Gly 435 440 445 Gln Tyr Gln Gln Pro Thr Asp Ser Leu Asn Asn Asp Asn Lys Tyr Ser 450 455 460 Leu Phe Ala Val Val Asn His Gln Gly Thr Leu Glu Ser Gly His Tyr 465 470 475 480 Thr Ser Phe Ile Arg Gln His Lys Asp Gln Trp Phe Lys Cys Asp Asp 485 490 495 Ala Ile Ile Thr Lys Ala Ser Ile Lys Asp Val Leu Asp Ser Glu Gly 500 505 510 Tyr Leu Leu Phe Tyr His Lys Gln Phe Leu Glu Tyr Glu 515 520 525 <210> 2 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Pro Gly Trp Pro Ser Leu Ser Ala Gly Ser Arg Gln Glu Ala 1 5 10 15 Pro Gln Leu Ala Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Gln Ala Val Gly Arg Gln 20 25 30 Phe Gln Pro Arg Ala Thr Ala Leu Gln Gly Pro Ser Gln Ala Lys Ser 35 40 45 Cys Ile Cys His Val Cys Gly Val His Leu Asn Arg Leu His Ser Cys 50 55 60 Leu Tyr Cys Val Phe Phe Gly Cys Phe Thr Lys Lys His Ile His Glu 65 70 75 80 His Ala Lys Ala Lys Arg His Asn Leu Ala Ile Asp Leu Met Tyr Gly 85 90 95 Gly Ile Tyr Cys Phe Leu Cys Gln Asp Tyr Ile Tyr Asp Lys Asp Met 100 105 110 Glu Ile Ile Ala Lys Glu Glu Gln Arg Lys Ala Trp Lys Met Gln Gly 115 120 125 Val Gly Glu Lys Phe Ser Thr Trp Glu Pro Thr Lys Arg Glu Leu Glu 130 135 140 Leu Leu Lys His Asn Pro Lys Arg Arg Lys Ile Thr Ser Asn Cys Thr 145 150 155 160 Ile Gly Leu Arg Gly Leu Ile Asn Leu Gly Asn Thr Cys Phe Met Asn 165 170 175 Cys Ile Val Gln Ala Leu Thr His Thr Pro Leu Leu Arg Asp Phe Phe 180 185 190 Leu Ser Asp Arg His Arg Cys Glu Met Gln Ser Pro Ser Ser Cys Leu 195 200 205 Val Cys Glu Met Ser Ser Leu Phe Gln Glu Phe Tyr Ser Gly His Arg 210 215 220 Ser Pro His Ile Pro Tyr Lys Leu Leu His Leu Val Trp Thr His Ala 225 230 235 240 Arg His Leu Ala Gly Tyr Glu Gln Gln Asp Ala His Glu Phe Leu Ile 245 250 255 Ala Ala Leu Asp Val Leu His Arg His Cys Lys Gly Asp Asp Asn Gly 260 265 270 Lys Lys Ala Asn Asn Pro Asn His Cys Asn Cys Ile Ile Asp Gln Ile 275 280 285 Phe Thr Gly Gly Leu Gln Ser Asp Val Thr Cys Gln Val Cys His Gly 290 295 300 Val Ser Thr Thr Ile Asp Pro Phe Trp Asp Ile Ser Leu Asp Leu Pro 305 310 315 320 Gly Ser Ser Thr Pro Phe Trp Pro Leu Ser Pro Gly Ser Glu Gly Asn 325 330 335 Val Val Asn Gly Glu Ser His Val Ser Gly Thr Thr Thr Leu Thr Asp 340 345 350 Cys Leu Arg Arg Phe Thr Arg Pro Glu His Leu Gly Ser Ser Ala Lys 355 360 365 Ile Lys Cys Ser Gly Cys His Ser Tyr Gln Glu Ser Thr Lys Gln Leu 370 375 380 Thr Met Lys Lys Leu Pro Ile Val Ala Cys Phe His Leu Lys Arg Phe 385 390 395 400 Glu His Ser Ala Lys Leu Arg Arg Lys Ile Thr Thr Tyr Val Ser Phe 405 410 415 Pro Leu Glu Leu Asp Met Thr Pro Phe Met Ala Ser Ser Lys Glu Ser 420 425 430 Arg Met Asn Gly Gln Tyr Gln Gln Pro Thr Asp Ser Leu Asn Asn Asp 435 440 445 Asn Lys Tyr Ser Leu Phe Ala Val Val Asn His Gln Gly Thr Leu Glu 450 455 460 Ser Gly His Tyr Thr Ser Phe Ile Arg Gln His Lys Asp Gln Trp Phe 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asp Ala Ile Ile Thr Lys Ala Ser Ile Lys Asp Val Leu 485 490 495 Asp Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Phe Tyr His Lys Gln Phe Leu Glu Tyr 500 505 510 Glu <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp1F <400> 3 tgtattcttg ccacgcccaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp1R <400> 4 tcctagtgtg ggcgtttctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp2F <400> 5 attgcggtac ccaacacagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp2R <400> 6 gcgtctgcga gttctctgaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp3F <400> 7 ttcagagaac tcgcagacgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp3R <400> 8 gcgtgctgag gattgggtaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp4F <400> 9 ttacccaatc ctcagcacgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp4R <400> 10 attggtggtt tgccggtcta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp5F <400> 11 cttagaccgg caaaccacca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp5R <400> 12 ggctccagag aaaagccgaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp6F <400> 13 tcttagaccg gcaaaccacc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp6R <400> 14 tgtccgcggg aaaggataac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp7F <400> 15 tcccacctgt gttggattgc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp7R <400> 16 gggcttccca agacaatgac t 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp8F <400> 17 aagccaaggg cttcccaag 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp8R <400> 18 actcagggca tattgtgagg g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp9F <400> 19 tgtcggcaat ttttctcggc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22Chp9R <400> 20 cccatgatgt ggagcagtga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro1F <400> 21 tgcatcggct aggaatggtc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro1R <400> 22 accaatcagg tcaccaagcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro2F <400> 23 aggcttggtg acctgattgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro2R <400> 24 gcttgttccg cagattccac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro3F <400> 25 agctctcctc tgtcaagcct 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro3R <400> 26 aacgtagagc agcctcttgg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro4F <400> 27 agtggaagtc cccgatctga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro4R <400> 28 ggcgtagtcc ttcattggct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro5F <400> 29 agccaatgaa ggactacgcc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro5R <400> 30 cctccagggc tctacttgga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro6F <400> 31 cctggtagcc tgtggttctc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro6R <400> 32 ctccgcgttt tgcttgttca 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro7F <400> 33 ggatctcccc acccttaggt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21Pro7R <400> 34 ggaagcaaga gggatgcagt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- Usp7F <400> 35 aagtctcaag gttataggga 20 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- Usp7R <400> 36 ccatgcttgt ctgggtatag tgt 23 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21F <400> 37 tgcatgaaga acctgagttg a 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP21R <400> 38 acaggtccac aatcttgctg t 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22ex2 1F <400> 39 gcttcaaggt ggacaactgg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- USP22ex2 1R <400> 40 acatggcaga cacaggactt 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP22F 1 <400> 41 ggaaaatgca aggcgttgga g 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP22R_ 1 <400> 42 gtgcagttgg aggtgatctt t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP22F 2 <400> 43 ctttccccgt ttaccacgtt g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP22R_ 2 <400> 44 ctttccccgt ttaccacgtt g 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP21F 1 <400> 45 gccacccact ttgagacgta g 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP21R 1 <400> 46 tccgtatgct gaacagggta g 21 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP7F <400> 47 ccctccgtgt tttgtgcga 19 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- hUSP7R <400> 48 agaccatgac gtggaatcag a 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- h18S F <400> 49 gaggatgagg tggaacgtgt 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic- h18S R <400> 50 agaagtgacg cagccctcta 20

Claims (23)

  1. 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (USP22) 활성과 연관된 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, USP22의 생물학적 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환 또는 장애가 세포 증식성 질환 또는 장애인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 질환 또는 장애가 암인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 질환 또는 장애가 폐암, 위 암종, 췌장암, 흑색종, 림프종, 결장암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신경교종, 중피종, 신경모세포종, 외투 세포 림프종, 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 질환 또는 장애가 폐암인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 질환 또는 장애가 흑색종인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가
    7-(디플루오로메틸)-N-(3,4-디메틸페닐)-5-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘3-카르복스아미드,
    11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴,
    2,7-비스(4-메톡시페닐) 9-옥소9H-플루오렌-2,7-디술포네이트,
    6-(2,5-디메톡시페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보니트릴,
    2,4-디메탄술포닐-8-메톡시5H,6H-벤조[h]퀴나졸린,
    4,5-비스(4-메톡시페녹시)벤젠-1,2-디카르보니트릴,
    9-[(3-메틸부트-2-엔-1-일)옥시]-7H푸로[3,2-g]크로멘-7-온,
    N-(2-{[5-(에탄술포닐)-3-니트로티오펜-2-일]술파닐}페닐)아세트아미드,
    1-[4-니트로-5-(피리딘-4-일술파닐)티오펜-2-일]에탄-1-온,
    비스[(4-메톡시페닐)아미노]피라진2,3-디카르보니트릴,
    5-{[(2,4-디메틸페닐)술포닐]아미노}-2-메틸-N-페닐나프토[1,2-b]푸란-3-카르복스아미드,
    8-옥소테트라히드로팔마틴,
    1-{5-[(4-클로로페닐)아미노]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    에틸 6-시아노-7-(4-메톡시페닐)-5-옥소-1-페닐-1,5-디히드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-카르복실레이트,
    1-(5-{[(4-클로로페닐)메틸]술파닐}-4-니트로티오펜-2-일)에탄-1-온,
    비스[(3-클로로페닐)아미노]피라진-2,3-디카르보니트릴,
    1-{5-[(4-메톡시페닐)술파닐]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    4-(4-메톡시페닐)-2-메틸-5-옥소-5H-인데노[1,2-b]피리딘-3-카르보니트릴,
    1-{5-[(2,3-디클로로페닐)술파닐]- 4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    1-(1H-벤즈이미다졸-2-일)에타논 (6-메틸-4-페닐-2-퀴나졸리닐) 히드라존,
    1-{5-[(4-클로로페닐)술파닐]-4- 니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    크립토크리신,
    2-아미노-4-(4-히드록시페닐)-5- 옥소-4H,5H-피라노[3,2-c] 크로멘-3-카르보니트릴,
    알파-나프토플라바논, 및
    에틸 2-(4-에톡시아닐리노)-5-[3- 메톡시-4-(2-프로피닐옥시) 벤질리덴]-4-옥소-4,5-디히드로-3- 티오펜카르복실레이트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하는 것인 방법.
  10. Treg 세포 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 활성을 억제하는 방법으로서, USP22의 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 대상체가 감염성 질환을 갖는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 대상체가 돌발성 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV2) 감염을 갖는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가
    7-(디플루오로메틸)-N-(3,4-디메틸페닐)-5-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘3-카르복스아미드,
    11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴,
    2,7-비스(4-메톡시페닐) 9-옥소9H-플루오렌-2,7-디술포네이트,
    6-(2,5-디메톡시페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보니트릴,
    2,4-디메탄술포닐-8-메톡시5H,6H-벤조[h]퀴나졸린,
    4,5-비스(4-메톡시페녹시)벤젠-1,2-디카르보니트릴,
    9-[(3-메틸부트-2-엔-1-일)옥시]-7H푸로[3,2-g]크로멘-7-온,
    N-(2-{[5-(에탄술포닐)-3-니트로티오펜-2-일]술파닐}페닐)아세트아미드,
    1-[4-니트로-5-(피리딘-4-일술파닐)티오펜-2-일]에탄-1-온,
    비스[(4-메톡시페닐)아미노]피라진2,3-디카르보니트릴,
    5-{[(2,4-디메틸페닐)술포닐]아미노}-2-메틸-N-페닐나프토[1,2-b]푸란-3-카르복스아미드,
    8-옥소테트라히드로팔마틴,
    1-{5-[(4-클로로페닐)아미노]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    에틸 6-시아노-7-(4-메톡시페닐)-5-옥소-1-페닐-1,5-디히드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-카르복실레이트,
    1-(5-{[(4-클로로페닐)메틸]술파닐}-4-니트로티오펜-2-일)에탄-1-온,
    비스[(3-클로로페닐)아미노]피라진-2,3-디카르보니트릴,
    1-{5-[(4-메톡시페닐)술파닐]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    4-(4-메톡시페닐)-2-메틸-5-옥소-5H-인데노[1,2-b]피리딘-3-카르보니트릴,
    1-{5-[(2,3-디클로로페닐)술파닐]- 4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    1-(1H-벤즈이미다졸-2-일)에타논 (6-메틸-4-페닐-2-퀴나졸리닐) 히드라존,
    1-{5-[(4-클로로페닐)술파닐]-4- 니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    크립토크리신,
    2-아미노-4-(4-히드록시페닐)-5- 옥소-4H,5H-피라노[3,2-c] 크로멘-3-카르보니트릴,
    알파-나프토플라바논, 및
    에틸 2-(4-에톡시아닐리노)-5-[3- 메톡시-4-(2-프로피닐옥시) 벤질리덴]-4-옥소-4,5-디히드로-3- 티오펜카르복실레이트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴인 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하는 것인 방법.
  16. USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)의 억제를 필요로 하는 대상체에서 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하는 방법으로서, USP22의 생물학적 활성을 억제하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 치료제가
    7-(디플루오로메틸)-N-(3,4-디메틸페닐)-5-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘3-카르복스아미드,
    11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴,
    2,7-비스(4-메톡시페닐) 9-옥소9H-플루오렌-2,7-디술포네이트,
    6-(2,5-디메톡시페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보니트릴,
    2,4-디메탄술포닐-8-메톡시5H,6H-벤조[h]퀴나졸린,
    4,5-비스(4-메톡시페녹시)벤젠-1,2-디카르보니트릴,
    9-[(3-메틸부트-2-엔-1-일)옥시]-7H푸로[3,2-g]크로멘-7-온,
    N-(2-{[5-(에탄술포닐)-3-니트로티오펜-2-일]술파닐}페닐)아세트아미드,
    1-[4-니트로-5-(피리딘-4-일술파닐)티오펜-2-일]에탄-1-온,
    비스[(4-메톡시페닐)아미노]피라진2,3-디카르보니트릴,
    5-{[(2,4-디메틸페닐)술포닐]아미노}-2-메틸-N-페닐나프토[1,2-b]푸란-3-카르복스아미드,
    8-옥소테트라히드로팔마틴,
    1-{5-[(4-클로로페닐)아미노]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    에틸 6-시아노-7-(4-메톡시페닐)-5-옥소-1-페닐-1,5-디히드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-카르복실레이트,
    1-(5-{[(4-클로로페닐)메틸]술파닐}-4-니트로티오펜-2-일)에탄-1-온,
    비스[(3-클로로페닐)아미노]피라진-2,3-디카르보니트릴,
    1-{5-[(4-메톡시페닐)술파닐]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    4-(4-메톡시페닐)-2-메틸-5-옥소-5H-인데노[1,2-b]피리딘-3-카르보니트릴,
    1-{5-[(2,3-디클로로페닐)술파닐]- 4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    1-(1H-벤즈이미다졸-2-일)에타논 (6-메틸-4-페닐-2-퀴나졸리닐) 히드라존,
    1-{5-[(4-클로로페닐)술파닐]-4- 니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    크립토크리신,
    2-아미노-4-(4-히드록시페닐)-5- 옥소-4H,5H-피라노[3,2-c] 크로멘-3-카르보니트릴,
    알파-나프토플라바논, 및
    에틸 2-(4-에톡시아닐리노)-5-[3- 메톡시-4-(2-프로피닐옥시) 벤질리덴]-4-옥소-4,5-디히드로-3- 티오펜카르복실레이트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 치료제가 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴인 방법.
  19. (i) 치료제 및 (ii) 적합한 제약 담체를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 치료제는
    7-(디플루오로메틸)-N-(3,4-디메틸페닐)-5-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘3-카르복스아미드,
    11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴,
    2,7-비스(4-메톡시페닐) 9-옥소9H-플루오렌-2,7-디술포네이트,
    6-(2,5-디메톡시페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보니트릴,
    2,4-디메탄술포닐-8-메톡시5H,6H-벤조[h]퀴나졸린,
    4,5-비스(4-메톡시페녹시)벤젠-1,2-디카르보니트릴,
    9-[(3-메틸부트-2-엔-1-일)옥시]-7H푸로[3,2-g]크로멘-7-온,
    N-(2-{[5-(에탄술포닐)-3-니트로티오펜-2-일]술파닐}페닐)아세트아미드,
    1-[4-니트로-5-(피리딘-4-일술파닐)티오펜-2-일]에탄-1-온,
    비스[(4-메톡시페닐)아미노]피라진2,3-디카르보니트릴,
    5-{[(2,4-디메틸페닐)술포닐]아미노}-2-메틸-N-페닐나프토[1,2-b]푸란-3-카르복스아미드,
    8-옥소테트라히드로팔마틴,
    1-{5-[(4-클로로페닐)아미노]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    에틸 6-시아노-7-(4-메톡시페닐)-5-옥소-1-페닐-1,5-디히드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-카르복실레이트,
    1-(5-{[(4-클로로페닐)메틸]술파닐}-4-니트로티오펜-2-일)에탄-1-온,
    비스[(3-클로로페닐)아미노]피라진-2,3-디카르보니트릴,
    1-{5-[(4-메톡시페닐)술파닐]-4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    4-(4-메톡시페닐)-2-메틸-5-옥소-5H-인데노[1,2-b]피리딘-3-카르보니트릴,
    1-{5-[(2,3-디클로로페닐)술파닐]- 4-니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    1-(1H-벤즈이미다졸-2-일)에타논 (6-메틸-4-페닐-2-퀴나졸리닐) 히드라존,
    1-{5-[(4-클로로페닐)술파닐]-4- 니트로티오펜-2-일}에탄-1-온,
    크립토크리신,
    2-아미노-4-(4-히드록시페닐)-5- 옥소-4H,5H-피라노[3,2-c] 크로멘-3-카르보니트릴,
    알파-나프토플라바논, 및
    에틸 2-(4-에톡시아닐리노)-5-[3- 메톡시-4-(2-프로피닐옥시) 벤질리덴]-4-옥소-4,5-디히드로-3- 티오펜카르복실레이트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 화합물이 11-아닐리노-7,8,9,10-테트라히드로벤즈이미다조[1,2-b]이소퀴놀린-6-카르보니트릴인 제약 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 조성물이 USP22의 생물학적 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 USP22의 생물학적 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함하는 것인 제약 조성물.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 조성물이 Treg 세포 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에서 Treg 세포 활성을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함하는 것인 제약 조성물.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 조성물이 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)의 억제를 필요로 하는 대상체에서 USP22의 유비퀴틴 특이적 펩티다제 활성 (E.C. 3.4.19.12)을 억제하기 위한 화합물의 유효량을 포함하는 것인 제약 조성물.
KR1020237039968A 2021-04-23 2022-04-25 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (usp22)의 억제제 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 그의 용도 KR20240001703A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163201330P 2021-04-23 2021-04-23
US63/201,330 2021-04-23
PCT/US2022/026159 WO2022226402A1 (en) 2021-04-23 2022-04-25 Inhibitors of ubiquitin specific peptidase 22 (usp22) and uses thereof for treating diseases and disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240001703A true KR20240001703A (ko) 2024-01-03

Family

ID=83723225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237039968A KR20240001703A (ko) 2021-04-23 2022-04-25 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (usp22)의 억제제 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 그의 용도

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4326327A1 (ko)
JP (1) JP2024514958A (ko)
KR (1) KR20240001703A (ko)
CN (1) CN117597147A (ko)
CA (1) CA3216296A1 (ko)
WO (1) WO2022226402A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007230910A (ja) * 2006-03-01 2007-09-13 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd Ｖｅｇｆ産生の低減方法
KR101782532B1 (ko) * 2015-06-19 2017-10-11 서울대학교산학협력단 백지 추출물 또는 이로부터 분리된 퓨라노쿠마린을 함유하는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 코로나 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물
CN114053414A (zh) * 2021-12-31 2022-02-18 大连医科大学 一种黄酮类化合物usp22抑制剂在制备抗肿瘤免疫药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022226402A1 (en) 2022-10-27
EP4326327A1 (en) 2024-02-28
JP2024514958A (ja) 2024-04-03
CA3216296A1 (en) 2022-10-27
CN117597147A (zh) 2024-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021200113A1 (en) Methods for inhibiting tie2 kinase useful in the treatment of cancer
US11007174B2 (en) Pharmaceutical combination for the treatment of melanoma
US9682082B2 (en) Combinations of AKT and MEK inhibitor compounds, and methods of use
KR20220133258A (ko) 화합물 및 이의 용도
US9573899B2 (en) USP7 inhibitor compounds and methods of use
CN101222850A (zh) 治疗对药物有抗性的癌症的方法
TW201244716A (en) Combination of a phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitor and a mTOR inhibitor
WO2020132259A1 (en) Compositions and methods of treating cancers by administering a phenothiazine-related drug that activates protein phosphatase 2a (pp2a)
JP6373252B2 (ja) オーロラキナーゼ阻害薬を使用する癌の治療方法
WO2017117386A1 (en) Methods of treating cancer using network brakes
KR20240001703A (ko) 유비퀴틴 특이적 펩티다제 22 (usp22)의 억제제 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 그의 용도
KR20240051953A (ko) Pi3k 이소형 알파를 억제하는 화합물 및 암 치료 방법
TW201620548A (zh) 治療存有上游Ｗｎｔ途徑突變之大腸直腸癌的方法
US9566334B2 (en) Combinations of a PI3K/AKT inhibitor compound with an HER3/EGFR inhibitor compound and use thereof in the treatment of a hyperproliferative disorder
US11389434B2 (en) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of mast cell diseases
US20200101070A1 (en) Methods of treating cancer having an active wnt/beta-catenin pathway
KR101351682B1 (ko) 전신 비만세포증 치료용 조성물
TWI623315B (zh) ３－［（３－｛［４－（４－嗎啉基甲基）－１ｈ－吡咯－２－基］亞甲基｝－２－側氧基－２，３－二氫－１ｈ－吲哚－５－基）甲基］－１，３－噻唑啶－２，４－二酮及ｅｇｆｒ ｔｙｒ激酶抑制劑之新穎結合物
TW202202143A (zh) 使用cdk4/6及cdk2抑制劑共同治療以遏止腫瘤對cdk2抑制劑之適應性
TWI839690B (zh) 治療黑色素瘤的藥物組合的用途
NZ617243B2 (en) Combinations of akt and mek inhibitor compounds, and methods of use