KR101351682B1

KR101351682B1 - 전신 비만세포증 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101351682B1
Application number: KR1020087003987A
Authority: KR
Inventors: 피터 발렌트
Original assignee: 피터 발렌트
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2014-01-14
Also published as: JP5322639B2; WO2007010014A2; EP1909837B1; RU2008105823A; PT1909837E; CN101267837B; RU2429848C2; CA2615598A1; CA2615598C; ES2343542T3; US20090221550A1; AU2006271652B2; AU2006271652A1; KR20080039915A; US8076321B2; PL1909837T3; WO2007010014A3; JP2009501767A; ATE464911T1; EP1909837B8

Abstract

본 발명은 비만 세포-관련 증식성 질환 치료용 약물의 제조를 위한 티로신 포스페이트 억제제 AMN107과 PKC412의 조합물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비만 세포-관련 증식성 질환, 특히 침습성 SM (ASM) 및 비만 세포 백혈병 (MCL)을 비롯한 전신 비만세포증 (SM)에 대해 효과적인 티로신 포스페이트 억제제와 TK-억제제의 조합 치료에 관한 것이다.

전신 비만세포증, PKC412, AMN107, 이마티닙, 다사티닙, 2CdA

Description

전신 비만세포증 치료용 조성물 {COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF SYSTEMIC MASTOCYTOSIS}

본 발명은 전신 비만세포증 치료용 약물의 제조를 위한 티로신 키나제 억제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전신 비만세포증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

전신 비만세포증 (SM)은 무통성 SM (기관 기능의 손상의 흔적이 거의 또는 전혀 없음), 침습성 SM (기관 기능의 손상이 존재함), SM 관련된 혈액학적 비-비만 세포성 질환 (SM-AHNMD) 및 비만 세포 백혈병으로 분류될 수 있다. 성인 SM에서 임상적 제시는 이질적이며, 피부 질환 (통상적으로, 색소성 두드러기), 비만 세포 매개-방출 증상 (두통, 홍조, 현기증, 실신, 아나필락시스 등), 및 직접적 또는 간접적 기관 손상 (골 용해 병변, 골다공증 또는 골절로 인한 골 통증, 간비장비대증, 골수 관련 혈구 감소증)을 포함한다. 또한, SM 환자의 대략 20％가 유의하고, 종종 분리되어 있는 혈액 호산구 증가증을 나타낼 수 있다 (Tefferi and Pardanani 2004).

일반적으로, 비만 세포 백혈병은 생존기간이 수개월 정도이고, 현재까지 효과적인 치료법이 없는 불치병이다. 무통성 SM의 자연 경과는, 생존 기간 중앙값이 수십년 정도로 측정되고, 침습성 SM 및 SM-AHNMD로의 진행이 빈번하지 않아서 훨씬 더 양호하다. SM-AHNMD의 결과는 관련된 AHNMD에 의해 결정되고, AHNMD가 없는 SM보다 상당히 더 불량하다. AHNMD가 없는 무통성 및 침습성 SM 모두에서, 골수 비만 세포 및 호산구 함량의 증가, 혈청 알칼리 포스파타아제의 상승, 빈혈 및 간비장비대증은 불량한 예후와 관련되어 있다 (Tefferi and Pardanani 2004). FIP1L1-PDGFRα 유전자 융합과 관련된 SM을 앓는 환자를 글리벡(Gleevec)(등록상표)으로 치료한 경우, 완전한 조직학적, 임상적 관해가 달성되었다 (Pardanani 2003a, Pardanani 2003b).

<발명의 요약>

골수 신생물에 대한 몇몇 부상하는 치료 개념은 결정적인 티로신 키나제 (TK) 또는 하류 신호 전달 분자를 표적화하는 신규 약물에 기초한다.^1-5 전신 비만세포증 (SM)은 대부분의 환자에서 무통성 골수증식성 질환으로 거동하는 조혈 신생물이나, 침습성 질환 (본원에서 침습성 SM은 "ASM"으로 나타냄) 또는 심지어 백혈병, 예를 들어, 비만 세포 백혈병 (본원에서 "MCL"로 나타냄)으로도 나타날 수 있다.^6-11 ASM 및 MCL을 앓는 환자에 있어서, 통상적인 치료 요법에 대한 반응은 대부분의 경우에 불량하고, 그 예후는 매우 좋지 않다.^6-12 따라서, 신생물성 비만 세포 (MC)의 치료 요법의 신규 표적을 찾아내고, 이러한 환자들에 대한 새로운 치료 전략을 규정하기 위한 다수의 시도가 있어 왔다.^9-12

ASM 또는 MCL로 진단 받은 환자들을 비롯한 SM을 앓는 모든 환자의 대부분에서는, 신생물성 (비만) 세포에서 체성 c-KIT 점 돌연변이 D816V (Asp816Val)가 검출될 수 있다.^13-17 이러한 점 돌연변이는 KIT의 리간드-독립적 인산화와 활성화, 및 영향받은 세포의 자율적 분화 및 증식과 관련되어 있다.^17,18 이러한 구성적인 티로신 키나제 (TK)의 활성과의 연관성에 기초하여, D816V-돌연변이된 KIT의 변이체는 치료 요법의 주목할 만한 표적이다.^9-12,19

KIT D816V의 TK-활성을 억제할 적합한 약물을 동정하기 위해 최근 몇 년간 다수의 노력이 있어왔다.^9-12,19-24 임상 혈액 내과에서 널리 사용되는 TK 억제제인 이마티닙(imatinib) (STI571)이 야생형 (wt) KIT 또는 드물게 발생하는 F522C-돌연변이된 KIT의 변이체를 나타내는 신생물성 MC의 증식을 방해한다는 것이 최근에 밝혀졌다.^20-23 또한, 이 약물이 클론성 호산구 증가증 및 FIP1L1/PDGFRA 융합 유전자와 연관된 SM (만성 호산구성 백혈병과 연관된 SM, 본원에서 "SM-CEL"로 나타냄)을 앓는 환자의 신생물성 세포의 증식을 차단한다는 것이 밝혀졌다.^24-26 그러나, 이마티닙은 c-KIT 돌연변이 D816V²⁰ ^-22를 갖는 신생물성 MC의 증식을 억제하는 데는 실패하였으며, 이는 KIT D816V을 차단하여 SM에서 신생물성 MC의 증식을 차단하는 신규 TK 억제제를 추가로 찾을 필요를 지적해준다.

신규 TK-표적화 약물인 PKC412 및 AMN107는 D816V-KIT의 TK-활성을 방해하 고, 독시사이클린-유도 KIT-D816V의 발현을 나타내는 신생물성 인간 MC 및 Ba/F3 세포의 증식, 1차 신생물성 비만 세포의 증식, 및 c-KIT 돌연변이를 갖는 인간 MCL 세포주 HMC-1의 증식을 억제한다. PKC412는 50 내지 250 nM의 IC₅₀ 값을 갖고, KIT-D816V가 나타나거나 존재하지 않는 HMC-1 세포들 사이에서 차이를 나타내지 않는 뛰어난 약물임이 밝혀졌다. 대조적으로, AMN107은 KIT-D816V-음성 HMC-1 세포에 있어서 보다 강력한 효과를 나타낸다. 야생형 또는 D816V-돌연변이된 KIT를 나타내는 Ba/F3 세포에서 상응하는 결과가 얻어진다. HMC-1에 대한 PKC412 및 AMN107의 증식-억제 효과는 CD2 및 CD63의 아폽토시스(apoptosis) 및 하향조절의 유도와 관련되어 있다. PKC412는 HMC-1의 증식-억제를 일으키는데 있어서, AMN107, 이마티닙 및 클라드리빈(cladribine) (즉, 2CdA)과 협력하는 것으로 나타난다. 또한, PKC412가 HMC-1 세포의 증식 억제를 일으키는데 있어서 AMN107 및 클라드리빈 (2CdA)와 상승작용함을 밝힌다. PKC412와 AMN107는 함께, SM의 표적화 치료 요법에 대한 전도유망한 신규 작용제를 대표한다.

본 발명은 SM, 특히 발암성 c-KIT 돌연변이 D816V와 관련된 SM에 대해 효과적인 PKC412와 AMN107의 조합 치료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SM, 특히 침습성 SM (ASM) 및 비만 세포 백혈병 (MCL)을 비롯한 전신 비만세포증 (SM)에 대해 효과적인 PKC412와 TK-억제제의 조합 치료에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, SM, ASM 및 MCL은 특히 D816V를 비롯한 발암성 c-KIT 돌연변이와 관련되어 있다.

도 1A-D는 신생물성 세포의 KIT 인산화에 대한 TK 억제제의 효과를 도시한다. 도 1A,B: 대조군 배지 (대조군), 이마티닙 STI571 (1 μM), PKC412 (1 μM) 또는 AMN107 (1 μM)과 4시간 동안 인큐베이션한 후의 HMC-1.1 세포의 KIT 인산화 (도 1A) 및 HMC-1.2 세포의 KIT 인산화 (KIT D816V를 나타냄; 도 1B). 도 1C,D: 대조군 배지 (대조군), 이마티닙 (즉, STI571) (1 μM), PKC412 (1 μM) 또는 AMN107 (1 μM)과 4시간 동안 인큐베이션한 후의 Ton.Kit.wt 세포의 KIT 인산화 (도 1C) 및 Ton.Kit.D816V.27 세포의 KIT 인산화 (도 1D). 약물에 노출시키기 전에, Ton.Kit.wt 세포 및 Ton.Kit.D816V.27 세포를 독시사이클린 1 μg/ml 중에 24시간 동안 유지시켜 KIT의 발현을 유도한다. Ton.Kit.wt 클론의 경우에도 세포를 SCF (100 ng/ml, 4시간)에 노출시켜 KIT 인산화 (p-KIT)를 유도한다. 모든 세포에 있어서, 항-KIT mAb SR-1을 이용하여 면역침전을 수행한다. p-KIT 검출을 위해 항-포스포-mAb 4G10을 사용하고, 총 KIT 단백질의 검출을 위해 항-KIT mAb 1C1을 사용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행한다.

도 2A-D는 HMC-1 세포의 증식에 대한 PKC412, AMN107 및 이마티닙의 효과를 그래프로 도시한 것이다. 도 2A: HMC-1.2 세포의 ³H-티미딘 흡수에 대한 PKC412의 시간-의존적 효과. HMC-1.2 세포를 37℃, 5％ CO₂에서, 도에 나타낸 바와 같은 다양한 시간 동안 대조군 배지 또는 PKC412 (300 nM)와 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, ³H-티미딘 흡수를 분석한다. 결과를 대조군 (즉, 각 시점에서 대조군 배지의 ³H-티미딘 흡수)의 ％로 표현하며, 이는 세 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 도 2B-D: HMC-1 세포의 ³H-티미딘 흡수에 대한 TK 억제제의 투여량-의존적 효과. HMC-1.1 세포 (●-●) 및 HMC-1.2 세포 (■-■)를 37℃에서 48시간 동안 PKC412 (도 2B), AMN107 (도 2C) 또는 이마티닙 (도 2D)가 여러 농도로 존재하거나 존재하지 않는 (0) 대조군 배지에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, ³H-티미딘 흡수를 측정한다. 결과는 대조군의 ％ (0, 100％)로 표현하며, 최소 3개의 독립적인 실험 표본으로부터의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

도 3A-B는 Ton.Kit 세포의 ³H-티미딘 흡수에 대한 PKC412, AMN107 및 이마티닙의 효과를 그래프로 도시한 것이다. 도 3A: Ton.Kit.wt 세포를 대조군 배지 (빈 막대)에서 유지시키거나, 독시사이클린 (1 μg/ml) 및 SCF (검은 막대)를 첨가함으로써 활성화된 wt KIT를 발현하도록 유도한다. 두 조건에서, 세포를 48시간 동안 (37℃, 5％ CO₂) 대조군 배지 (Co)에 노출시키거나, 나타낸 바와 같이 여러 농도의 PKC412, AMN107 또는 이마티닙 (STI571)에 노출시킨다. 그런 다음, ³H-티미딘 흡수를 본원에 기술된 바와 같이 평가한다. 결과는 대조군 (Co)의 ％로 표현하며, 3개의 독립적인 실험 표본으로부터의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 도 3B: Ton.Kit.D816V.27 세포를 대조군 배지 (빈 막대)에서 유지시키거나, 독시사이클린 (1 μg/ml) (검은 막대)을 첨가하여 KIT D816V를 발현하도록 유도한 다음, 48시간 동안 (37℃, 5％ CO₂) 대조군 배지 (Co)에 노출시키거나, 나타낸 바와 같이 여러 농도의 PKC412, AMN107 또는 이마티닙 (STI571)에 노출시킨다. 그런 다음, ³H-티미딘 흡수를 측정한다. 결과는 대조군 (대조군 배지에 노출시킨 세포이며 본원에서 "Co"로 나타냄)의 ％로 표현하며, 3개의 독립적인 실험 표본으로부터의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

도 4는 D816V를 나타내는 1차 신생물성 (비만) 세포의 증식의 PKC412 하향조절을 그래프로 도시한 것이다. KIT D816V를 발현하는 1차 신생물성 골수 세포는 아급성(smouldering) 전신 비만세포증을 앓는 환자로부터 단리된다. 단리된 세포를 대조군 배지 (Co), 또는 나타낸 바와 같이 여러 농도의 PKC412, AMN107 및 이마티닙과 인큐베이션한다. ³H-티미딘 흡수를 측정하여 세포 증식을 정량화한다. 결과는 대조군 (여기서, Co는 100％)의 ％로 표현하며, 세 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 정상 bm 세포에서, PKC412의 효과는 나타나지 않았다 (도시하지 않음).

도 5A-F는 HMC-1 세포의 아폽토시스에 대한 TK 억제제의 효과를 그래프로 도시한 것이다. HMC-1.1 세포 (도 5A,C,E) 및 HMC-1.2 세포 (도 5B,D,F)를 37℃에서 24시간 동안, 도에 나타낸 바와 같이 여러 농도의 PKC412 (도 5A,B), AMN107 (도 5C,D) 또는 이마티닙 (도 5E,F)의 존재 또는 부재 (Co) 하에 배양한다. 그런 다음, 아폽토시스 세포의 ％를 광학현미경법으로 정량화한다. 결과는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

도 6A-D은 HMC-1 세포의 PKC412-유도된 아폽토시스의 전자 현미경 검사를 도 시한 것이다. HMC-1.2 세포를 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 (도 6A), PKC412 500 nM (도 6B) 또는 PKC412 900 nM (도 6C,D)와 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 수확하고 아폽토시스의 초미세구조적 징후에 대해 분석한다. 아폽토시스 세포가 대조군 배지로 유지시킨 배양물에서 거의 나타나지 않은 반면 (도 6A), PKC412 (도 6B-D)에서 배양된 HMC-1.2 세포는 세포 수축, 막 주름 형성(membrane ruffling), 액포 형성(vacuolization) 및 핵 크로마틴의 응축을 비롯한 아폽토시스의 징후를 높은 빈도로 나타내었다.

도 7은 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 (대조군), PKC412 (1 μM), AMN107 (1 μM) 또는 이마티닙 (1 μM)에 노출된 HMC-1.2 세포를 도시한 것이다. 이어서, 요오드화 프로피듐 (PI) / 아넥신 V-FITC를 조합한 염색으로 세포의 생존도 및 아폽토시스에 대해 조사한다.

도 8A-H는 터널(Tunel) 분석으로 평가한 HMC-1 세포의 아폽토시스를 도시한 것이다. HMC-1.1 세포 (도 8A-D) 및 HCM-1.2 세포 (도 8E-H)를 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 (도 8A,E), PKC412 1 μM (도 8B,F), AMN107 1 μM (도 8C,G) 또는 이마티닙 1 μM (도 8D,H)과 인큐베이션한다. 그런 다음, 세포를 수확하고, 터널 분석을 수행한다. 보이는 바와 같이, PKC412가 대부분의 HMC-1.1 및 HMC-1.2 세포에서 아폽토시스를 일으키는 반면, AMN107 및 이마티닙은 HNC-1.1 세포 (도 8C,D)에서만 강력한 아폽토시스-유도 효과를 나타내고, KIT D816V를 나타내는 HMC-1.2 세포 (도 8G,H)에서는 상기 효과를 나타내지 않았다.

도 9A-B는 HMC-1.2 세포에서 세포 표면 항원의 발현에 대한 TK 억제제의 효 과를 그래프로 도시한 것이다. 도 9A: HMC-1.2 세포를 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 (Co, 빈 막대), PKC412 1 μM (검은 막대), AMN107 1 μM (평행선 무늬 막대) 또는 이마티닙 (즉, STI571) 1 μM (회색 막대)에 노출시킨다. 결과는 대조군의 ％로 나타나며, 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 도 9B: HMC-1.2 세포에서 CD63 발현에 대한 PKC412의 투여량-의존적 효과. 세포를 37℃에서 24시간 동안, 도에 나타낸 바와 같이 여러 농도의 PKC 412와 인큐베이션한다. 그런 다음, 세포를 수확하고, 유식 세포분석법으로 CD63의 발현을 조사한다. 이 도면은 1회 실험으로부터의 전형적인 결과를 나타낸다. 보이는 바와 같이, PKC412는 투여량-의존적으로 CD63의 발현을 감소시킨다.

도 10A-J는 HMC-1 세포의 증식에 대한 상승작용적 약물 효과를 그래프로 도시한 것이다. KIT D816V를 나타내지 않는 HMC-1.1 세포 (도 10A-F) 및 KIT D816V를 나타내는 HMC-1.2 세포 (도 10G-J)를 37℃에서 48시간 동안 대조군 배지 (0) 또는 도에 나타낸 바와 같은 약물의 여러 조합 (고정 비율로)과 인큐베이션하여 협력적 항증식성 효과를 측정한다. 도 10A,C,E,G,I: 단일 약물 (도 10A: PKC412, ■-■; AMN107, ●-●; 도 10C: STI571, ■-■; AMN107, ●-●; 도 10E: STI571, ■-■; PKC412, ●-●; 도 10G: PKC412, ■-■; AMN107, ●-●; 도 10I: PKC412, ■-■; 2CdA, ●-●) 또는 약물 조합물 (▲-▲)과 인큐베이션한 후, ³H-티미딘의 흡수에 대하여 세포를 분석한다. 결과는 ³H-티미딘 흡수를 대조군 (배지 대조군, "0" 또는 "100％"로 나타냄)의 ％로 나타내며, 하나의 전형적인 실험으로부터 세 표본 의 평균 ± S.D.를 나타낸다 (각 약물 조합에 대한 둘 이상의 다른 실험에서 상응하는 결과가 얻어짐). 우측의 이미지 (도 10B,D,F,H,J)은, 차우(Chou) 및 탈라레이(Talalay)³⁹의 방법에 따라 캘큐신(calcusyn) 소프트웨어를 사용하여, 영향을 받은 각 분획에 대해 측정된 조합 지수 값을 나타낸다. 조합 지수 (CI) 값 1.0은 상가작용적 효과를 나타내고, 1.0 초과의 CI는 길항작용을 나타내며, 1.0 미만의 CI는 상승작용을 나타낸다.

도 11A-D는 신생물성 세포의 KIT 인산화에 대한 다사티닙(dasatinib)의 효과를 도시한 것이다. 도 11A,B는 대조군 배지 또는 여러 농도의 다사티닙과 4시간 동안 인큐베이션한 후의 HMC-1.1 세포 (도 11A) 및 HMC-1.2 세포 (KIT D816V를 나타냄) (도 11B)의 KIT의 티로신 인산화를 도시한다. 도 11C,D는 대조군 배지 (0) 또는 다사티닙 (10^-3 내지 10³ nM)과 4시간 동안 인큐베이션한 후의 독시사이클린-노출된 Ton.Kit.wt 세포 (도 11C) 및 Ton.Kit.D816V.27 세포 (도 11D)의 KIT-인산화를 도시한다. 약물에 노출시키기 전에, Ton.Kit.wt 세포 및 Ton.Kit.D816V.27 세포를 24시간 동안 대조군 배지 (대조군) 또는 독시사이클린에서 유지시켜 KIT의 발현을 유도하였다. Ton.Kit.wt의 경우에도, 세포를 SCF (100 ng/ml, 4시간)에 노출시켜 KIT 인산화 (p-KIT)를 유도하였다. 모든 세포에 있어서, 항-KIT mAb 1C1을 이용하여 면역침전을 수행하였다. p-KIT 검출을 위해 항-포스포-tyr-mAb 4G10을 이용하고, 총 KIT 단백질 (KIT)의 검출을 위해 항-KIT mAb 1C1을 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.

도 12A-F는 HMC-1 세포의 증식, 및 BaF/3 세포의 증식 및 클러스터 형성에 대한 다사티닙의 효과를 도시한 것이다. 도 12A는 HMC-1.1 세포 (■-■) 및 HMC-1.2 세포 (●-●)의 ³H-티미딘 흡수에 대한 다사티닙의 시간-의존적 효과를 도시한다. 37℃, 5％ CO₂에서 도에 나타낸 바와 같은 여러 시간 동안, HMC-1.1 세포는 다사티닙 10 nM과, HMC-1.2 세포는 다사티닙 1 μM과 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, ³H-티미딘 흡수를 측정하였다. 결과를 대조군 (= 대조군 배지에 유지시킨 세포의 ³H-티미딘 흡수)의 ％로 표현하며, 이는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 도 12B는 HMC-1.1 세포 (■-■) 및 HMC-1.2 세포 (●-●)의 ³H-티미딘 흡수에 대한 다사티닙의 투여량-의존적 효과를 나타낸다. 37℃에서 48시간 동안 여러 농도의 다사티닙의 존재 또는 부재 하에 대조군 배지에서 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, ³H-티미딘 흡수를 측정하였다. 결과를 대조군의 ％로 표현하며, 이는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.을 나타낸다. (도 12C) Ton.Kit.wt 세포의 증식에 대한 다사티닙의 효과. 세포를 다사티닙과의 인큐베이션 전 및 도중에 IL-3-함유 배지에서 유지시키거나 (●-●), IL-3 존재 하에 독시사이클린 (1 μg/ml)과 24시간 동안 사전 예비인큐베이션한 다음, IL-3이 없고 독시사이클린 및 SCF (100 ng/ml)를 함유하는 배지에서 여러 농도의 다사티닙과 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다 (■-■). 인큐베이션 후, 세포를 수확하고, ³H-티미딘 흡수 실험을 하였다. 결과를 대조군의 ％로 표현하며, 이는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. (도 12D) Ton.Kit.D816V 세포의 증식에 대한 다사티닙의 효과. 세포를 48시간 동안 (37℃), 독시사이클린 (1 μg/ml)의 존재 (■-■) 또는 부재 (●-●)하에 대조군 배지 (+IL-3) 및 여러 농도의 다사티닙 (도에 나타낸 바와 같음)과 인큐베이션하였다. 그런 다음, 트리판 블루 배제 시험으로 세포 생존도를 측정하였다. 결과를 대조군 (다사티닙 없음 = 100％)과 비교한 생존 세포 (트리판 블루 양성 세포의 ％로부터 계산함)의 ％로 표현하며, 이는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. (도 12E,F) Ton.Kit.D816V.27 세포의 KIT-D816V-유도된 클러스터 형성에 대한 다사티닙 (도 12E) 및 AMN107 (도 12F)의 효과. 도에 나타낸 바와 같이 여러 농도의 다사티닙 또는 AMN107의 존재 또는 부재 하에, 독시사이클린 중에서 (1 μg/ml) 또는 독시사이클린 없이 (Co) 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 도립 현미경으로 클러스터의 수를 계수하였다. 결과는 대조군 배지 (Co) 및 독시사이클린 (= 100％)에서 유지시킨 세포에 대한 클러스터 형성의 ％로 표현하며, 이는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

도 13은 다사티닙이 백혈병과 관련된 KIT D816V-양성 SM을 앓는 환자의 1차 신생물성 세포의 증식을 하향조절한다는 것을 도시한 것이다. 1차 신생물성 골수 세포는 AML과 관련된 KIT D816V-양성 ASM을 앓는 환자로부터 단리되었다. 단리된 세포를대조군 배지, 또는 도에 나타낸 바와 같은 여러 농도의 다사티닙 (●-●), PKC412 (■-■), AMN107 (▲-▲) 또는 이마티닙 (▼-▼)과 인큐베이션하였다. ³H-티미딘 흡수를 측정하여 세포 증식을 정량화하였다. 결과는 대조군 (대조군 배지에서 유지시킨 세포 = 100％)의 ％로 표현되며, 이는 세 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 정상 골수 세포에서, 적용된 TK 억제제의 효과는 나타나지 않았다 (도시하지 않음).

도 14A-C는 다사티닙이 HMC-1 세포의 아폽토시스를 유도함을 도시한다. (도 14A,B) 도에 나타낸 바와 같은 여러 농도의 다사티닙의 존재 또는 부재 (Co) 하에 HMC-1.1 세포 (도 14A) 및 HMC-1.2 세포 (도 14B)를 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 아폽토시스 세포의 ％를 광학현미경법으로 정량화하였다. 결과는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 별표는 p가 0.05 미만임을 나타낸다. (도 14C) HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 다사티닙-유도된 아폽토시스의 전자 현미경 검사. HMC-1 세포를 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 또는 다사티닙 (1 μM)과 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 수확하고 아폽토시스의 초미세구조적 징후에 대해 분석하였다. 아폽토시스 세포가 대조군 배지에서 유지시킨 배양물에서는 거의 나타나지 않은 반면, 다사티닙에서 배양된 대부분의 HMC-1 세포는, 세포 수축, 막 주름 형성, 액포 형성 및 핵 크로마틴의 응축을 비롯한 아폽토시스의 징후를 나타내었다. (도 14D,E) 터널 분석으로 평가된 다사티닙-유도된 HMC-1 세포의 아폽토시스. HMC-1.1 세포 (도 14D) 및 HMC-1.2 세포 (도 14E)를 37℃에서 24시간 동안, 도에 나타낸 바와 같이 대조군 배지, 여러 농도의 다사티닙 (도에 나 타냄) 또는 PKC412 (100 nM 및 1 μM)와 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 수확하고 터널 분석을 수행하였다. 보이는 바와 같이, 다사티닙은 HMC-1.1 및 HMC-1.2 세포에서 투여량-의존적인 아폽토시스를 일으켰다.

도 15A-F는 HMC-1 세포에서 세포 표면 항원의 발현에 대한 다사티닙의 효과를 나타낸다. HMC-1.1 세포 (도 15A) 및 HMC-1.2 세포 (도 15B)를 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 또는 여러 농도의 다사티닙 (도에 나타냄) 또는 PKC412 (1 μM)에 노출시켰다. 인큐베이션 후, CD-특이적 mAb를 이용한 유식 세포분석법으로, 여러 CD 항원의 발현에 대해 세포를 검사하였다. 도 15C-D는 평균 형광 강도 (MFI) 수준을 대조군 (= 100％)의 ％로 나타낸다. 결과는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 별표: p <0.05. (도 15E,F) 37℃에서 24시간 동안 대조군 배지, 여러 농도의 다사티닙 또는 PKC412 (1 μM)와 인큐베이션한 후의 HMC-1.1 세포 (도 15E) 및 HMC-1.2 세포 (도 15F)에서의 CD63의 발현. CD63 mAb CLB-gran12 (검은 선)를 사용하여 유식 세포분석법을 수행하였다. 파선은 이소형으로 매칭된(isotype-matched) 대조군 항체를 나타낸다.

도 16A-D는 HMC-1 세포의 증식에 대한 상승작용적 약물 효과를 나타낸다. HMC-1.1 세포 (도 16A-B) 및 KIT D816V를 나타내는 HMC-1.2 세포 (도 16C-D)를 37℃에서 48시간 동안 단일 약물 또는 여러 약물 조합 (고정된 비율로)과 인큐베이션한 다음 ³H-티미딘의 흡수를 측정하였다. (도 16A) HMC-1.1을 여러 농도의 다사티닙 (■-■) 또는 PKC412 (●-●), 또는 두 약물의 조합물 (▲-▲)과 인큐베이션하 였다. (도 16B) HMC-1.1을 여러 농도의 다사티닙 (●-●) 또는 이마티닙 (■-■), 또는 두 약물의 조합물 (▲-▲)과 인큐베이션하였다. (도 16C) HMC-1.2 세포를 여러 농도의 다사티닙 (■-■) 또는 PKC412 (●-●), 또는 두 약물의 조합물 (▲-▲)과 인큐베이션하였다. (도 16D) HMC-1.2 세포를 여러 농도의 다사티닙 (■-■) 또는 2CdA (●-●), 또는 두 약물의 조합물 (▲-▲)과 인큐베이션하였다. 결과는 하나의 전형적인 실험으로부터의 세 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 캘큐신 프로그램에 의해 평가된 바와 같이, 약물 상호작용 (도 16A-D)은 사실상 상승작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

도 17은 37℃에서 48시간 동안, 도에 나타낸 바와 같이 대조군 배지 또는 여러 농도의 다사티닙과 인큐베이션한 HMC-1.2 세포를 나타낸다. 그런 다음, ³H-티미딘의 흡수를 측정하였다. 결과는 대조군 (대조군 배지에 유지시킨 세포 = 100％)의 ％로 표현되며, 이는 세 독립적인 실험 표본의 평균 ± S.D.를 나타낸다.

본 발명이 해결하고자 하는 문제는 전신 비만세포증, 특히 발암성 c-KIT 돌연변이 D816V와 관련된 SM의 치료에 있어서, PKC412와 AMN107의 조합물을 사용하는 것이다.

침습성 SM 및 비만 세포 백혈병 (MCL)을 비롯한 전신 비만세포증 (SM)을 앓는 모든 환자의 대부분에서, 신생물성 세포는 발암성 c-KIT 돌연변이 D816V를 발현한다. 이러한 돌연변이는 KIT 수용체의 티로신 키나제 (TK)를 활성화시키므로, 이는 치료 요법의 주목할 만한 표적이다. 그러나, STI571 (이마티닙; 노바티스 파마(Novartis Pharma) AG)를 비롯한 이용가능한 TK-억제제의 대부분이 약리학적 농도에서 KIT D816V의 TK-활성을 차단하는데 실패한다. 본 발명자는 신규 TK-표적화 약물인 PKC412 및 AMN107 (노바티스)이 D816V-돌연변이된 KIT의 TK-활성을 차단하고, 독시사이클린에 의해 KIT D816V가 발현되는 Ba/F3 세포의 증식을 방해하며, 이러한 c-KIT 돌연변이를 발현하는 인간 비만 세포 백혈병 세포주 HMC-1의 증식을 방해한다는 증거를 제공한다. PKC412는 50 내지 200 nM의 IC₅₀ 값을 갖고, KIT D816V가 나타나거나 나타나지 않는 HMC-1 세포 사이에서 차이가 없는, 보다 강력한 작용제로 밝혀졌다. 대조적으로, AMN107은 HMC-1 세포에서 KIT D816V의 부재 하에서만 강력한 효과를 나타내었다 (KIT D816V-발현 HMC-1에 대한 IC₅₀인 1 내지 5 μM과 비교하여 IC₅₀이 5 내지 10 nM임). 야생형 또는 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 나타내는 Ba/F3 세포에서 상응하는 결과를 얻는다.

후속적으로, KIT D816V를 나타내는 SM을 앓는 환자의 골수로부터 얻은 1차 신생물성 MC에 대한 PKC412의 효과를 조사한다. 본 발명자의 세포주 데이터와 마찬가지로, PKC412은 상기 환자에서 투여량-의존적으로 신생물성 MC의 ³H-티미딘 흡수를 억제 (IC₅₀: 50 nM)하는 반면, AMN107 (0.1 내지 3 μM) 및 이마티닙 (1 μM)으로는 유의한 효과가 발견되지 않는다. HMC-1 세포에 대한 PKC412 및 AMN107의 증식-억제 효과는 포스포블로팅(phosphoblot) 실험에서의 KIT의 TK-억제, 및 통상적인 형태와 전자현미경법에 의해 평가된 아폽토시스의 유도와 관련되어 있다. 또한, PKC412는 HMC-1 세포에서 CD2 및 CD63 (SM에서 상향조절된 두 세포 표면 항원)의 발현을 하향조절하는 것으로 밝혀진다. 공동-인큐베이션 실험에서, PKC412는 KIT D816V를 갖는 HMC-1 세포 및 KIT D816V가 결여된 HMC-1 세포의 증식억제를 일으키는데 있어서 AMN107, 이마티닙 및 클라드리빈 (2CdA)과 상승작용을 하는 것으로 밝혀진다. 요약하여, 본 발명자의 데이터는 PKC412 및 AMN107가 단독으로, 그리고 서로 조합하여 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 발현하는 신생물성 비만 세포의 증식을 방해함을 나타낸다. 따라서, 두 약물은 침습성 SM 및 MCL을 앓는 환자의 표적 치료 요법에 대한 전도유망한 신규 약물로 고려될 수 있다.

따라서, 본 발명은 전신 비만세포증의 치료를 위한, 하기 화학식 II의 4-메틸-3-[[4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]-N-[5-(4-메틸-1H-이미다졸-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐]벤즈아미드 (이하 "AMN107"이라 칭함)와 조합한 하기 화학식 I의 N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-헥사히드로-10-메톡시-9-메틸-1-옥소-9,13-에폭시-1H,9H-디인돌로[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]피롤로[3,4-j][1,7]벤조디아조닌-11-일]-N-메틸벤즈아미드 (이하 "PKC412"라 칭함), 또는 둘 중 하나 또는 둘 모두의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

본원에 사용된 약어는 다르게 나타내지 않는다면, 바람직하게는 본원의 문맥상 하기 의미를 갖는다.

ASM 침습성 전신 비만세포증

bm 골수

클라드리빈 2-클로로데옥시아데노신

FCS 우태혈청(fetal calf serum)

IFNα 인터페론-알파

IP 면역침전

MCL 비만 세포 백혈병

PBS 포스페이트-완충 염수

PE 피코에리트린

rh 재조합 인간

RT 실온

SCF 줄기 세포 인자

SM 전신 비만세포증

SSM 아급성 전신 비만세포증

TK 티로신 키나제

wt 야생형

본원에 사용된 일반적인 용어는 다르게 나타내지 않는다면, 바람직하게는 본원의 문맥상 하기 의미를 갖는다.

화합물, 염 등에 복수형이 사용되는 경우, 이는 또한 단일 화합물, 염 등을 의미하는 것으로 받아들인다.

임의의 비대칭 탄소 원자는 (R)-, (S)- 또는 (R,S)-배위, 바람직하게는 (R)- 또는 (S)-배위로 존재할 수 있다. 따라서, 화합물은 이성질체의 혼합물 또는 순수한 이성질체, 바람직하게는 거울상이성질체-순수한 부분입체이성질체로 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 화학식 I과 화학식 II의 화합물의 가능한 호변이성질체에 관한 것이다.

염은 특히 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 제약상 허용되는 염이다. 화학식 I 및 화학식 II의 화합물은 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 화학식 I 및 화학식 II의 화합물은 단일 제형으로 조합되거나 개별 제형으로 조합될 수 있다.

이러한 염은, 예를 들어 염기성 질소 원자를 갖는 화학식 I 및/또는 화학식 II의 화합물로부터 바람직하게는 유기산 또는 무기산과의 산 부가염, 특히 제약상 허용되는 염으로 형성된다. 적합한 무기산에는, 예를 들어 할로겐 산, 예컨대 염산, 황산, 또는 인산이 있다. 적합한 유기산에는, 예를 들어 카르복실산, 포스폰산, 술폰산 또는 술팜산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아미노산, 예컨대 글루탐산 또는 아스파르트산, 말레산, 히드록시말레산, 메틸말레산, 시클로헥산카르복실산, 아다만탄카르복실산, 벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 만델산, 신남산, 메탄- 또는 에탄-술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 에탄-1,2-디술폰산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 1,5-나프탈렌-디술폰산, 도데실황산, 2, 3- 또는 4-메틸벤젠술폰산, 메틸황산, 에틸황산, N-시클로헥실술팜산, N-메틸-, N-에틸- 또는 N-프로필-술팜산, 또는 다른 유기 프로톤산, 예컨대 아스코르브산이 있다.

음으로 하전된 라디칼, 예컨대 카르복시 또는 술포의 존재 하에, 염은 또한 염기와의 반응으로 형성될 수 있고, 예를 들어 금속 또는 암모늄 염, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘 염, 또는 암모니아 또는 적합한 유기 아민, 예컨대 3급 모노아민, 예를 들어 트리에틸아민 또는 트리(2-히드록시에틸)아민과의 암모늄 염, 또는 헤테로시클릭 염기, 예를 들어 N-에틸-피페리딘 또는 N,N'-디메틸피페라진과의 염이 있다.

염기성 기 및 산성 기가 동일한 분자에 존재하면, 화학식 I 및/또는 화학식 II의 화합물은 또한 내부 염을 형성할 수 있다.

단리 및 정제 목적으로, 제약상 허용되지 않는 염, 예를 들어 피크레이트 또는 퍼클로레이트를 사용하는 것이 또한 가능하다. 치료적 용도를 위해서, 제약상 허용되는 염 또는 유리 화합물만이 사용되며 (제약 제제의 형태로 적용가능한 경우), 따라서 이들이 바람직하다.

유리 형태의 신규 화합물과, 중간체로 사용될 수 있는 염을 비롯한 그의 염 형태인 신규 화합물 간의 밀접한 관련성에 비추어 볼 때, 예를 들어 신규 화합물의 정제 또는 동정에서, 상기 및 하기의 유리 화합물에 대한 임의의 언급은 적절하게 편의상 상응하는 염까지도 지칭하는 것으로 이해해야 한다.

특허 출원 또는 학술 간행물이 인용되는 각각의 경우에, 최종 생성물, 제약 제제 및 청구항과 관련된 사항은 그 문헌을 언급함으로써 본원에 포함된다. 포함된 참고 문헌과 본원의 서술 간에 임의의 상이함이 있는 경우, 본원의 서술이 우선한다.

코드 번호, 유전자명 또는 상표명으로 식별되는 활성제의 구조는 표준 일람표 ["The Merck Index"] 또는 데이터베이스, 예를 들어 패이턴츠 인터내셔널(Patent International) (예를 들어, IMS 월드 퍼블리케이션즈 (IMS World Publications))로부터 획득할 수 있다. 그의 해당하는 내용은 본원에 포함된다.

본 발명에 이르러, 놀랍게도 AMN107과 PKC412의 조합물이 티로신 키나제 활성의 억제제로서, 특히 발암성 KIT-D816V-유도된 질환, 예컨대 전신 비만세포증의 치료 및 예방을 위한 유용한 치료적 특성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

상기 및 하기 사용된 KIT-D816V는, KIT 폴리펩티드의 816 잔기에서 아스파르트산을 코딩하는 핵산이 발린을 코딩하도록 돌연변이되어 있는 c-Kit 유전자의 돌연변이 생성물을 명시하는 것이다. 또한, KIT-D816V는 돌연변이된 발암성 c-KIT 유전자의 폴리펩티드 생성물을 지칭한다.

따라서, 본 발명은 발암성 c-KIT 돌연변이 D816V 유도된 전신 비만세포증, 또는 발암성 c-KIT 돌연변이 D816V 또는 티로신 키나제를 활성화시키는 유사한 돌연변이와 관련된 다른 질환의 치료용 약물의 제조를 위한 AMN107과 PKC412의 조합물의 용도에 관한 것이다.

전신 비만세포증 (SM)에는 무통증 SM, 침습성 SM, 및 SM 관련된 혈액학적 비-비만 세포성 질환 및 비만 세포 백혈병이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "비만세포증"은 전신 비만세포증, 예를 들어 비만세포종, 및 개 비만 세포 신생물에 관한 것이다. 비만세포증은 제한된 치료 옵션 및 일반적으로 나쁜 예후를 갖는 골수-증식성 장애이다. 비만세포증의 병인은 수용체 티로신 키나제 KIT의 구성적 활성화에 기인하였다. 다수의 비만세포증 환자에서, 통제되지 않는 KIT의 티로신 키나제 활성은 단백질의 코돈 816 내의 돌연변이 (D816V)로 인한 것이며, 이는 또한 시험관 내 및 생체 내에서, 이마티닙, 또는 글리벡(Gleevec(등록상표)(미국) Glivec(등록상표)(기타 국가))으로 시판중인 이마티닙 메실레이트에 대한 내성을 부여한다.

비만 세포는 본원에 언급된 알레르기성 장애의 1차 효과기(effector) 세포로서 중요한 역할을 한다. 비만 세포의 항원-특이적 IgE-매개된 탈과립화는 화학적 매개체 및 다중 사이토카인의 후속적 방출, 및 류코트리엔 합성을 일으킨다. 또한, 비만 세포는 다발성 경화증의 병인에 관여한다.

비만 세포 신생물은 인간 및 동물 모두에서 발생한다. 개에게서, 비만 세포 신생물은 비만세포종이라 불리며, 이 질환은 개 종양의 7％ 내지 21％를 차지하는 흔한 질환이다. 통상적으로 일시적이거나 무통성인 인간 비만세포증과, 예측불가능하게 거동하며 종종 침습성이고 전이성인 개 비만 세포 신생물 간의 구별이 이루어져야 한다. 예를 들어, 유일한 인간 비만세포종은 빈번하게 전이되지는 않으나, 대조적으로, 938마리의 개의 종양에 대한 46개 공개 보고서의 검토 후 호텐도르프와 니엘슨 (Hottendorf ＆ Nielsen) (1969)에 의해 추정된 바와 같이, 개 비만세포종의 50％는 악성형으로 거동한다.

비만세포증의 병인에서의 KIT 수용체의 관여는, KIT의 구성적 활성화를 일으키는 몇몇 돌연변이가 다수의 비만 세포주에서 검출되었다는 관찰에 의해 제안된다. 예를 들어, 포스포트랜스퍼라제 도메인 및 수용체 자동활성화에 있어서 Asp816에 대한 Val의 치환을 일으키는 인간 c-KIT의 점 돌연변이가 장기 인간 비만 세포 백혈병 세포주 (HMC-1), 및 2개의 설치류 비만 세포주의 상응하는 코돈에서 발생한다. 또한, 이 활성화 돌연변이는 인간 비만세포증의 일부 경우에 제자리에서 (in situ) 확인되었다. 2개의 다른 활성화 돌연변이, 즉 인간 HMC-1 비만 세포주에서 Val560Gly 치환, 및 FMA3이라 불리는 설치류 비만 세포주의 7개의 아미노산 결실 (Thr573-His579)이 KIT의 세포내 막주변 영역에서 발견되었다.

본 발명은 특히 전신 비만세포증 치료용 약물의 제조를 위한 AMN107과 PKC412의 조합물의 용도에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 전신 비만세포증의 치료가 필요한 포유동물에게 AMN107과 PKC412의 조합물, 또는 이들의 제약상 허용되는 염 또는 전구 약물의 조합물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 전신 비만세포증의 치료 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 전신 비만세포증의 치료가 필요한 포유동물에게 KIT-D816V 억제량의 AMN107과 PKC412의 조합물 또는 이들의 제약상 허용되는 염의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 전신 비만세포증을 앓는 포유동물, 특히 인간을 치료하는 방법을 제공한다.

본원의 설명에서, 용어 "치료"는 질환의 발현 위험이 있거나 질환이 발현된 것으로 의심되는 환자 및 질환 발현 환자의 치료를 비롯하여, 예방적 또는 방지적 치료 뿐만 아니라 치유적 또는 질환 억제적 치료 모두를 포함한다. 상기 용어는 추가로 상기 질환의 진행의 지연을 위한 치료를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "치유적"은 전신 비만세포증이 관련된 진행중인 증상 발현을 치료하는데 있어서의 유효성을 의미한다.

용어 "예방적"은 전신 비만세포증이 관련된 질환의 발병 또는 재발의 방지를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "진행의 지연"은 특히 치료할 질환의 예비 단계 또는 초기 단계인 환자 (예를 들어, 상응하는 질환의 사전-형태로 진단받거나, 예를 들어, 치료 중이거나 우발 증후로 인한 상태여서 해당하는 질환이 진행될 가능성이 높은 상태의 환자)에게 활성 화합물을 투여하는 것을 의미한다.

이러한 예견할 수 없는 범위의 특성은, AMN107과 PKC412의 조합물을 사용하는 것이 전신 비만세포증 치료용 의약을 제조하는데 특히 중요함을 의미한다.

이러한 효과는 특히 전신 비만세포증을 앓는 환자에 대해 임상적으로 적절할 수 있다.

AMN107과 PKC412의 조합물이 양호한 치료적 한계 및 기타 장점들로 전신 비만세포증의 치료에 특히 적합함을 증명하기 위해, 당업자에 공지된 방식으로 임상 시험을 수행할 수 있다.

전신 비만세포증을 억제하기 위해 사용할 AMN107과 PKC412의 조합물의 정확한 투여량은 숙주, 치료되는 질병의 성질 및 중증도, 투여 방식을 비롯한 여러 인자들에 따라 달라진다. AMN107과 PKC412의 조합물은 함께 또는 개별적으로, 임의의 경로로, 예컨대 경구로, 비경구로, 예를 들어, 복막내로, 정맥내로, 근육내로, 피하로, 종양내로, 또는 직장내로, 또는 장관내로 투여될 수 있다. AMN107과 PKC412의 조합물은 바람직하게는 1일 투여량 1 내지 300 mg/체중kg로, 또는 대부분의 큰 영장류에게는 1일 투여량 50 내지 5000 mg으로, 바람직하게는 500 내지 3000 mg으로 경구로 투여된다. 바람직한 1일 경구 투여량은 1 내지 75 mg/체중kg이거나, 대부분의 큰 영장류의 경우에 1일 투여량은 10 내지 2000 mg이며, 이 투여량은 단회 투여 또는 1일 2회 투여와 같은 다중 투여로 나누어서 투여된다.

AMN107과 조합하여 투여되는 PKC412의 정확한 투여량은 숙주, 치료되는 질병의 성질 및 중증도, 투여 방식을 비롯한 여러 인자들에 따라 달라진다. 그러나, 일반적으로 PKC412를 0.1 내지 10 mg/체중kg, 바람직하게는 1 내지 5 mg/체중kg의 1일 투여량으로 비경구로, 예를 들어, 복막내로, 정맥내로, 근육내로, 피하로, 종양내로, 또는 직장내로, 또는 장관내로, 예를 들어, 경구로, 바람직하게는 정맥내로 또는, 바람직하게는 경구로, 정맥내로 투여하는 경우 만족스러운 결과가 달성된다. 인간 시험에서, 총 투여량 225 mg/일이 예상되는 최대 내약 용량 (MTD)이다. 바람직한 정맥내 1일 투여량은 0.1 내지 10 mg/체중kg이거나, 대부분의 보다 큰 영장류에 대한 1일 투여량은 200 내지 300 mg이다. 전형적인 정맥내 투여량은 3 내지 5 mg/kg (주 3 내지 5회)이다.

가장 바람직하게는, PKC412는 1일 1회, 2회 또는 3회로 투여되는 약 250 mg/일 이하의 투여량, 특히 225 mg/일 이하의 투여량으로, 미세에멀젼, 연질 겔(soft gel) 또는 고체 분산체와 같은 투여 형태로 경구로 투여된다.

통상적으로, 소량을 초기에 투여하고, 치료 중인 숙주에 대한 최적의 투여량을 결정할 때까지 투여량을 점진적으로 상승시킨다. 투여량의 상한은 부작용에 의해 정해지며, 치료중인 숙주에 대한 시험에 의해 결정될 수 있다.

AMN107과 PKC412의 조합물은 독립적으로 또는 함께, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 다른 통상적 제약 아주반트와 조합될 수 있고, 정제, 캡슐, 캐플릿 등의 형태로 장관내로, 예를 들어 경구로 투여되거나, 또는 무균 주사 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구로, 예를 들어 복막내로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 상기 장관내 및 비경구 조성물은 통상적 수단으로 제조될 수 있다.

AMN107과 PKC412의 조합물은 단독으로 사용되거나 상기 병리학적 용도의 1종 이상의 다른 제약 활성 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 활성 화합물은 동일한 제약 제제 내로 조합되거나, 또는 조합물 파트너가 독립적으로 투여되거나 구분된 양의 조합물 파트너와 상이한 고정된 조합물을 사용하여 투여될 수 있는, 즉, 동시에 또는 다른 시점에 투여될 수 있다는 관점에서 조합된 제제 "부분품들의 키트"의 형태로 조합될 수 있다. 부분품들의 키트의 부분품은, 예를 들어 동시에 또는 시간순서로 번갈아서, 즉 상기 부분품들의 키트의 임의의 부분품에 대해 동일한 또는 다른 시간 간격으로 다른 시점에 투여될 수 있다. AMN107과 PKC412의 조합물과 조합하여 사용될 수 있는 화합물의 비제한적 예에는 세포독성 화학요법 약물, 예컨대 시토신 아라비노시드, 다우노루비신, 독소루비신, 시클로포스파미드, VP-16 또는 이마티닙 등이 있다. 추가로, 상기 AMN107과 PKC412의 조합물은 다른 신호 전달 억제제 또는 암유전자-표적화 약물과 조합될 수 있으며, 이 경우 유의한 상승작용이 예측된다.

본 발명은 추가로, 본원에 기술된 질환 및 질병의 치료를 위한 본원에 기술된 AMN107 및 PKC412와 이마티닙과의 조합물에 관한 것이다. 상기 조합의 투여는, 예를 들어 고정된 조합 제약 조성물 또는 제제의 형태로 동시에 실시되거나, 또는 순차적으로 또는 시차적으로 실시될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 투여 형태인 AMN107과 PKC412의 조합물, 및 글리벡(GLEEVEC(등록상표)(미국), GLIVEC(등록상표)(유럽))의 형태로 시판되는 이마티닙과의 조합물을, 이러한 투여 형태를 위해 고안된 투여량으로 투여하는 것이 현재는 바람직하다.

상기 조합물로의 전신 비만세포증의 치료는 질병의 중증도 또는 단계 및 환자의 모든 상태 등에 따라, 소위 1차 치료, 즉 임의의 선행 화학 요법 등이 없이 새로이 진단된 질환의 치료일 수 있거나, 또는 소위 2차 치료, 즉 이마티닙 또는 AMN107과 PKC412의 조합물로의 선행 치료 후의 상기 질환의 치료일 수 있다.

전신 비만세포증의 치료에 대한 AMN107과 PKC412의 조합물의 효능은 하기 실시예의 결과에 의해 예시된다. 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지, 어떠한 방법으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 임상 시험

혈액 및/또는 골수로부터 채취한 악성 세포의 c-KIT 전사 수준 및 c-kit의 돌연변이 상태에 대한 화합물 II의 효과를 평가하였다. SM은 변화된 키나제 활성으로 인한 것일 수 있다. c-Kit D816V와 관련된 SM 또한 KIT 유전자의 활성화 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 기준, 1 주기 15일, 1, 2, 3 주기 28일 및 이후의 세번째 주기마다, 시험 종료시에 c-KIT D816V 전사체에 대한 Q-RT-PCR. c-kit의 돌연변이 분석: 각각 하기 환자 집단의 세 개의 개별적인 군. SM 종료점: 치료 3개월 후 반응율.

실시예 2: AMN107과 PKC412의 조합물

본 시험에서, 본 발명자는 신규 TK 억제제인 PKC412⁵ 및 AMN107²⁷이 KIT D816V를 발현하는 신생물성 인간 MC 및 Ba/F3 세포의 증식을 매우 효과적으로 방해 한다는 것을 증명하였다. 이 점에 관하여, PKC412가 보다 강력한 화합물로 나타났다. 본 발명자는 또한 PKC412 및 AMN107이 KIT D816V가 발현되거나 발현되지 않는 HMC-1 세포의 증식 억제를 일으키는데 상승작용을 한다는 것을 증명하였다. 이러한 데이터는 PKC412 및 AMN107이 비만세포증의 치료를 위한 전도유망한 신규 표적화 약물일 수 있음을 나타낸다.

재료 및 방법

<시약>

TK 억제제인 이마티닙 (STI571), AMN107²⁷ 및 PKC412⁵를 노바티스 파마 AG (스위스 바젤 소재)로부터 얻었다. AMN107 및 PKC412의 원액을 디메틸 술폭시드 (DMSO) (독일 다름슈타트 소재 머크(Merck)) 중에 용해시켰다. 재조합 인간 (rh) 줄기 세포 인자 (SCF)를 스트라트만 바이오테크(Strathmann Biotech) (독일 하노버 소재)로부터, RPMI 1640 배지 및 우태혈청 (FCS)을 PAA 래브러터리즈(PAA laboratories) (오스트리아 파스칭 소재)로부터, L-글루타민 및 이스코프 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium) (IMDM)를 기브코 라이프 테크놀로지스(Gibco Life Technologies) (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)로부터, ³H-티미딘을 아머샴(Amersham) (영국 버킹엄셔 소재)으로부터, 요오드화 프로피듐을 시그마(Sigma) (미국 미주리주 세이트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 인터페론 알파 (IFNα)를 로슈(Roche) (스위스 바젤 소재)로부터, 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈, 본원에서 "2CdA"로 나타냄)을 얀센 실락(Janssen Cilag) (미국 뉴져 지주 타이터스빌 소재)으로부터, rh 인터류킨-4 (IL-4)를 페프로테크(Peprotech) (미국 뉴져지주 로키 힐 소재)로부터 얻었다. 피코에리트린 (PE)-표지된 단일 클론 항체 (mAb)인 IVTO85 (CD2), WM15 (CD13), YB5.B8 (CD117), N6B6.2 (CD164) 및 97A6 (CD203c)을 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) (미국 캘리포니아주 산 호세 소재)으로부터, PE-접합된 mAb CLB-gran12 (CD63)를 이뮤노테크(Immunotech) (프랑스 마르세이유 소재)로부터 구입하였다.

<C-KIT D816V가 발현되거나 발현되지 않는 HMC-1 세포>

비만 세포 백혈병을 앓는 환자로부터 생성된 인간 비만 세포주 HMC-1²⁸은 닥터. 제이. 에이치. 버터필드(Dr. J. H. Butterfield) (미국 미네소타주 로체스터 소재 마요 클리닉(Mayo Clinic))로부터 흔쾌히 제공받았다. HMC-1의 두 서브클론, 즉 c-KIT 돌연변이 D816V가 아닌 c-KIT 돌연변이 V560G를 갖는 HMC-1.1²⁰ 및 두 c-KIT 돌연변이 (즉, V560G 및 D816V)를 갖는 제2 서브클론인 HMC-1.2²⁰를 사용하였다. HMC-1 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 10％ FCS, L-글루타민 및 항생제를 보충한 IMDM에서 증식시켰다. HMC-1 세포를 4 내지 8주마다 최초 원액으로부터 재해동시키고, 매주 계대배양하였다. '표현형의 안정성'의 대조군으로서, HMC-1 세포를 i) 이염색성(metachromatic) 과립의 존재, ii) 표면 KIT의 발현, 및 iii) KIT 발현에 대한 IL-4의 하향조절 효과 (100 U/ml, 48시간)에 대해 주기적으로 확인하였다.²⁹ 이러한 대조군 실험은 각 실험 세트 전에 수행하였고, 원래 클론의 모든 특징을 나 타내는 HMC-1 세포²⁹만을 사용하였다.

wt c-KIT (Ton.Kit.wt) 또는 c-KIT D816V의 발현이 독시사이클린에 의해 유도되는 Ba/F3의 생성은 다른 문헌에 상세하게 기술되어 있다.³⁰ 요약하면, 역 tet-트랜스활성자³ ¹ ^,32를 발현하는 Ba/F3 세포를 전기 천공법에 의해 c-KIT D816V cDNA (또는 wt c-KIT cDNA, 모두 미국 뉴욕주 콜럼비아 대학의 닥터 제이. 비. 롱리(Dr. J. B. Longley)로부터 흔쾌히 제공받음)를 함유하는 pTRE2 벡터 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재 클론테크(Clontech)) 및 pTK-Hyg (클론테크)로 동시-형질감염시켰다. 전기 천공 후, 히그로마이신 중에서 배양하여 안정하게 형질감염된 세포를 선택하고, 제한 희석법(limiting dilution)으로 클로닝하였다. 본 연구에서, 서브클론 Ton.Kit.D816V.27을 모든 실험에 사용하였다. 상기 Ton.Kit.D816V 세포는 독시사이클린에 노출되면 낮은 증식률을 나타낸다.³⁰ 웨스턴 블로팅, 면역 세포 화학, PCR 및 제한효소 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석¹⁶으로 평가한 바와 같이, Ton.Kit.D816V.27 세포를 독시사이클린 (1 μg/ml)에 노출시킴으로써 12시간 내에 상기 세포에서 KIT D816V의 발현을 유도할 수 있다.³⁰

<1차 신생물성 비만 세포의 단리>

1차 골수(bm) MC를, 다발성 조혈계가 관여하고 MC- 및 비-MC-계 골수 세포에 서 c-KIT D816V이 검출되는 것을 특징으로 하는 SM의 독특한 하위변이체인 아급성 전신 비만세포증 (SSM)을 앓는 여성 환자 (54세)로부터 얻었다.^34-36 대조의 목적으로, 병기가 진행중인 악성 림프종 (bm 관련성 없음)을 앓는 환자로부터 얻은 bm을 분석하였다. 두 환자 모두 bm 천자 전에 고지 동의서를 제출하였다. bm 흡인물을 후 장골 능선으로부터 얻고, 보존제가 없는 헤파린을 함유하는 주사기에 수집하였다. 단핵 세포 (MNC)를 단리하기 위해 세포를 피콜(Ficoll) 상에 층상으로 깔았다. MNC 분획은 SSM을 앓는 환자에서는 5％의 MC를, 대조군 샘플 (정상 bm)에서는 1％ 미만의 MC를 함유하는 것으로 나타났다. 세포 생존도는 90％ 초과였다. SSM을 앓는 환자에서 bm MNC의 c-KIT 돌연변이 D816V가 존재하는지의 여부는 앞서 기술되어 있는 바와 같이, RT-PCR 및 RFLP 분석법을 사용하여 확인하였다.¹⁶

<웨스턴 블로팅에 의한 KIT 인산화의 분석>

wt KIT (Ton.Kit.wt) 또는 KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27)를 함유하는 HMC-1 세포 (10⁶/ml) 및 Ba/F3 세포 (10⁶/ml)를 37℃에서 4시간 동안 PKC412 (1 μM), AMN107 (1 μM), 이마티닙 (1 μM), 또는 대조군 배지와 인큐베이션하였다. 억제 약물에 노출시키기 전에, Ton.Kit.wt 세포 및 Ton.Kit.D816V.27 세포를 37℃에서 24시간 동안 독시사이클린 (1 μg/ml)과 인큐베이션하여 KIT의 발현을 유도하였다. Ton.Kit.wt 세포의 경우에, rhSCF (100 ng/ml)를 첨가하여 KIT 인산화를 유도하였다. 앞서 기술되어 있는 바와 같이 면역침전 (IP) 및 웨스턴 블로팅을 수행하였 다.³² 요약하면, 세포를 4℃에서 세척하고, 50 mM 트리스, 150 mM 염화나트륨 (NaCl), 1％ 노니데트(nonidet) P40 (NP-40), 0.25％ 데옥시콜산, 0.1％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 1 mM 에틸렌-디아민-테트라아세트산 (EDTA), 1 mM 플루오르화나트륨 (NaF), 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 1 mM 나트륨 오르토바나데이트 (Na₃VO₄)로 이루어진 RIPA 완충액 (세포 10⁸개 당 1 ml 완충액)에 재현탁시켰다. 프로테이나아제 억제제 칵테일 (로슈)로 보충한 RIPA 완충액에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 후 (5분 마다 격렬하게 볼텍싱함), 불용성 입자를 제거하기 위해 세포용해물을 원심분리하였다. IP를 위해, 1 x 10⁷ 세포로부터의 세포용해물을 IP-완충액 (50 mM 트리스-Cl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 100 mM NaF 및 1％ NP40) 중의 항-KIT 항체 SR1³⁷ (미국 워싱턴주 시애틀 소재 워싱턴 대학교의 닥터 브이. 브라우디(Dr. V. Broudy)로부터 흔쾌히 제공받음) 또는 항-KIT 항체 1C1³⁸ (독일 튀빙겐 대학교의 닥터. 하. -요트. 뷔링(Dr. H.-J. Buehring)으로부터 흔쾌히 제공받음), 및 단백질 G 세파로즈 비드 (아머샴)와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 IP 완충액 중에서 3회 세척하였다. 이어서, 세포용해물 및 면역침전물을 환원 조건하에 7.5％ SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 25 mM 트리스, 192 mM 글리신 및 20％ 메탄올을 함유하는 4℃의 완충액 중에서 니트로셀룰로오스 막 (프로트란(Protran), 미국 뉴햄프셔주 킨 소재 쉴라이허 앤드 슈엘(Schleicher ＆ Schuell))으로 옮겼다. 막을 5％ 블로킹 시약 (로슈) 중에서 1시간 동안 블로킹하고, 이어서 항-KIT 항체 1C1 또는 티로신-인산화 단백질에 대한 단일 클론 항체 4G10 (미국 뉴욕주 레이크 플래시드 소재 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology))과 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 항체 반응성을 양 항-마우스 IgG 항체, 루미겐(Lumigen) PS-3 검출 시약 (둘 모두 아머샴 제품) 및 CL-Xposure 필름 (미국 일리노이주 록퍼드 소재 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology))으로 시각화하였다.

<³H-티미딘 흡수의 측정>

증식-억제 약물 효과를 측정하기 위해, SCF-활성화된 wt KIT (Ton.Kit.wt) 또는 KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27)를 함유하는 HMC-1 세포 및 Ba/F3 세포를 37℃, 5％ CO₂ 하에서, 48시간 동안 96-웰 배양 플레이트 (PTT, 스위스 소재 트라사딩겐(Trasadingen)) 중에서 여러 농도의 PKC412 (100 pM 내지 10 μM), AMN107 (1 nM 내지 100 μM) 또는 이마티닙 (3 nM 내지 300 μM)과 인큐베이션하였다. 실험 중에, HMC-1 세포를 여러 시간 간격 (1, 12, 24, 36, 및 48시간)으로 PKC412 (300 nM)에 노출시켰다. 선택 실험에서, HMC-1 세포 (두 서브클론 모두)를 여러 농도의 IFNα (0.1 내지 500,000 U/ml) 또는 2CdA (0.005 내지 10 μg/ml)와 인큐베이션하였다. 1차 세포 (SSM을 앓는 환자로부터 얻은 bm 세포 및 대조군 bm 세포)를 48시간 동안 억제제 (PKC412, 50 내지 500 nM; AMN107, 100 nM 내지 30 μM; 이마티닙, 1 μM)의 존재 또는 부재 하에 배양하였다.

인큐베이션 후, ³H-티미딘 1 μCi를 각 웰에 첨가하고, 12시간 동안 (37℃) 유지시켰다. 이어서, 필터메이트(Filtermate) 196 수확기 (미국 코넥티커트주 메리든 소재 팩커드 바이오사이언스(Packard Bioscience))의 여과막 (팩커드 바이오사이언스) 상에서 세포를 수확하였다. 필터를 공기-건조하고, 결합된 방사성을 β-카운터 (탑-카운트(Top-Count) NXT, 팩커드 바이오사이언스)로 계수하였다.

별도의 세트의 실험에서, 신생물성 MC의 증식에 대한 약물 조합물의 효과 (상가작용 대 상승작용)를 시험하였다. 이러한 목적을 위해, HMC-1 세포 (두 서브클론 모두)를 고정된 약물 농도 비의 약물 (PKC412, AMN107, 이마티닙, IFNα, 2CdA)의 여러 조합물에 노출시켰다. 약물 상호작용 (상가작용 대 상승작용)을 상업적으로 이용가능한 소프트웨어 (캘큐신; 미국 미주리주 퍼거슨 소재 바이오소프트(Biosoft))를 이용하여 조합 지수값을 계산하여 결정하였다.³⁹ 모든 실험은 세 표본으로 수행하였다.

<통상적인 형태학과 전자현미경법에 의한 아폽토시스의 평가>

HMC-1 세포의 아폽토시스에 대한 TK-억제제의 효과를 형태학적 조사, 유식 세포분석법 및 전자현미경법으로 분석하였다. 전형적인 실험에서, HMC-1 세포를 6-웰 배양 플레이트 (PTT)에서 10％ FCS를 함유하는 IMDM 배지 중 여러 농도의 PKC412 (500 nM 내지 1 μM), AMN107 (50 nM 내지 10 μM), 이마티닙 (50 nM 내지 10 μM), 또는 대조군 배지와 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 아폽토시스 세포의 ％를 라이트-김사 염색 원심 도말법(Wright-Giemsa-stained cytospin preparation)으로 정량화하였다. 아폽토시스를 통상적인 세포형태학적 기준 (세포 수축, 크로마틴 구조의 응축)에 따라 정의하였다.⁴⁰

HMC-1 세포의 아폽토시스를 확증하기 위해, 25 ml 플라스틱 배양 플라스크 (PTT)에서 24시간 동안 PKC412 (500 nM, 900 nM 또는 1 μM), AMN107 (1 μM), 이마티닙 (1 μM), 또는 대조군 배지에 노출된 HMC-1 세포 (두 서브클론 모두)를 이용하여 기술된 바⁴¹ ^,42와 같이 전자현미경법을 수행하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 실온 (RT)에서 60분 동안 0.1 mol/L 나트륨 카코딜레이트 완충액 (pH 7.4) 중에서 완충된 2％ 파라포름알데히드, 2.5％ 글루타르알데히드 및 0.025％ CaCl₂ 중에서 고정시켰다. 이어서, 세포를 0.1 mol/L 나트륨 카코딜레이트 완충액 중에서 3회 세척하고, 2％ 한천 중에 현탁시키고, 원심분리하였다. 펠렛을 1.3％ OsO₄ (0.66 mol/L 콜리딘 중 완충시킴)로 후-고정시키고, '일괄적으로' 2％ 우라닐 아세테이트 및 나트륨 말레에이트 완충액 (pH 4.4) 중에서 실온에서 2시간 동안 염색하였다. 이어서, 펠렛을 세정하고, 알코올 계열로 탈수시키고, EPON 812 중에 임베딩시켰다(embedded). 초박절편 (85 nM)을 잘라내고, 금 격자 상에 위치시켰다. 절편을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트 중에서 대비시키고, JEOL 1200 EX II 투과 전자현미경 (일본 도쿄 소재 제올(JEOL))으로 관찰하였다. 통상적인 형태학적인 기준 (상기 참조)을 이용하여 아폽토시스 세포의 존재를 결정하였다.

<터널 분석 및 유식 세포분석법에 의한 아폽토시스의 평가>

PKC412 (1 μM), AMN107 (1 μM) 또는 이마티닙 (1 μM)에 24시간 동안 노출 된 HMC-1 세포의 아폽토시스를 확인하기 위해, 앞서 기술된 바와 같이 터널 (제자리 말단 트랜스퍼라제-매개된 dUTP-형광 닉 말단-표지(in situ Terminal transferase-mediated dUTP-fluorescene Nick End-Labeling)) 분석을 적용하였다.^43,44 요컨대, 처음에 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 세척하고, 0℃에서 15분 동안 pH 7.4의 1％ 포름알데히드 중에서 고정시켰다. 이어서, 세포를 1시간 동안 70％ 에탄올 (빙냉)로 처리하고, PBS 중에서 세척하고, 37℃에서 10분 동안 CoCl₂, DNA 데옥시-뉴클레오티딜-엑소트랜스퍼라제 및 비오틴-16-2'-데옥시-우리딘-5'-트리포스페이트 (제조자인, 독일 소재 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)의 지침에 따라 제조함)를 함유하는 말단 트랜스퍼라제 반응 용액 중에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척한 다음, 37℃에서 20분 동안 스트렙타비딘 플루오레세인(Streptavidin Fluorescein; 베링거 만하임) (10 μg/ml)과 인큐베이션하였다. 이어서, HMC-1 세포를 세척하고, 니콘 마이크로포트(Nikon Microphot)-FXA 형광현미경 (일본 도쿄 소재)으로 분석하였다.

아폽토시스 및 세포 생존도에 대한 유식 세포분석적 확인을 위해, 조합된 아넥신V/요오드화 프로피듐 염색을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 37℃에서 24시간 동안 PKC412 (0.5, 1 및 2.5 μM), AMN107 (0.5, 1 및 2.5 μM), 이마티닙 (0.5, 1 및 2.5 μM), 또는 대조군 배지에 HMC-1 세포를 노출시켰다. 그런 다음, 세포를 PBS 중에서 세척한 다음, HEPES (10 mM, pH 7.4), NaCl (140 mM) 및 CaCl₂ (2.5 mM)를 함유하는 결합 완충액 중의 아넥신V-APC (스위스 라우센 소재 알렉시스 바이오케미컬즈(Alexis Biochemicals))와 인큐베이션하였다. 그런 다음, 요오드화 프로피듐 (1 μg/ml)을 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하고, FACSCalibur (벡톤 디킨슨) 상에서 유식 세포분석법으로 분석하였다.

<HMC-1 세포 상의 활성화-연관 표면 항원의 발현의 평가>

KIT D816V를 갖는 HMC-1 세포 (HMC-1.2 세포)를 대조군 배지 또는 TK 억제제 (PKC412, 1 μM; AMN107, 1 μM; 이마티닙, 1 μM)를 보충한 배지에서 단시간 (24시간 동안) 배양 후, 상기 세포 상의 세포 표면 항원의 발현을 유식 세포분석법으로 확인하였다. 선택 실험에서, 여러 농도의 PKC412 (50, 100, 250, 500 및 1000 nM)를 적용하였다. 약물과 인큐베이션한 다음, HMC-1 세포를 세척하고, SM (정상 MC와 비교시)에서 신생물성 MC 상에 과발현되는 것으로 알려져 있고/거나 비만세포생성(mastopoiesis) (CD2, CD13, CD63, CD117, CD164, CD203c)의 초기 단계에서 발현되는 MC 항원에 대한 PE-접합된 항체를 이용하여 단색 유식 세포분석법을 실시하였다.^45-47 앞서 기술된 바와 같이 FACSan (벡톤 디킨슨) 상에서 유식 세포분석법을 수행하였다.²⁹

<통계적 분석>

HMC-1 세포를 억제제에 노출시킨 후의 증식율, 아폽토시스 및 표면 발현 수준 간의 차이의 유의성을 결정하기 위해, 종속 표본에 대해 스튜던트 t 테스트(student's t test)를 적용하였다. p가 0.05 미만인 경우 결과가 통계적으로 유의한 것으로 고려된다.

결과

<D816V-돌연변이된 KIT의 TK 활성에 대한 PKC412 및 AMN107의 효과>

IP 및 웨스턴 블로팅에 의해 평가된 바와 같이, PKC412 (1 μM)는 HMC-1.1 세포 (c-KIT 돌연변이 V560G를 나타내나 c-KIT 돌연변이 D816V를 나타내지는 않음) 및 V560G-돌연변이된 KIT의 변이체 및 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 포함하는 HMC-1.2 세포에서 KIT의 인산화를 감소시켰다 (도 1A 및 1B). 신규 TK 억제제 AMN107 (1 μM)은 HMC-1.1 세포의 KIT 인산화를 강력하게 감소시켰으나, 1 μM 농도에서 HMC-1.2 세포의 KIT 인산화에 대해서는 약한 효과만을 나타내었다. 유사하게, 이마티닙 (1 μM)는 HMC-1.1 세포의 KIT 인산화를 감소시켰으나, HMC-1.2 세포의 KIT 인산화를 억제하지는 않았다 (도 1A 및 1B). 다음 단계에서, 독시사이클린에 노출된 후, wt KIT (Ton.Kit.wt) 또는 KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27)를 나타내는 Ba/F3 세포에 대한 TK 억제제의 효과를 조사하였다. Ton.Kit.wt 세포에서, KIT는 SCF의 존재 하에 (부재 아님) 인산화되는 것으로 나타난 반면, Ton.Kit.D816V.27 세포에서 KIT는 구성적으로 인산화되는 것으로 밝혀졌다 (도 1C). 도 1C에서 도시된 바와 같이, 모든 3개 TK 억제제 (PKC412, AMN107, 이마티닙, 각 1 μM)는 Ton.Kit.wt 세포에서 KIT의 SCF-유도된 인산화를 감소시켰다. 대조적으로, PKC412 및 AMN107 (보다 낮은 정도로)만이 Ton.Kit.D816V-27 세포에서 KIT의 SCF-독립적 인산화를 감소시켰다. 이마티닙 (1 μM)은 이들 세포에서 KIT의 인산화에 대한 감지할만한 효과를 나타내지 않았다 (도 1D). 상기 데이터는 PKC412가 wt KIT, KIT V560G 및 KIT D816V의 TK 활성에 대한 신규의 강력한 억제제 이며, AMN107가 wt KIT 및 KIT V560G에 대한 신규의 강력한 억제제이고, KIT D816V의 (자동)인산화에 대한 약한 억제제임을 증명하였다.

<HMC-1 세포의 ³H-티미딘 흡수에 대한 TK-억제제의 효과>

실험 중에, HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 증식에 대한 PKC412, AMN107 및 이마티닙의 최대 억제 효과는 36 내지 48시간 후에 나타났다. 도 2A는 HMC-1.2 세포의 증식에 대한 PKC412 (300 nM)의 시간-의존적 효과를 나타낸다. 도 2B 및 2C에 나타낸 바와 같이, PKC412 및 AMN107는 투여량-의존적 방식으로 HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 ³H-티미딘 흡수를 방해하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 상기 두 서브클론에서 PKC412의 효과에 대한 IC₅₀은 동일한 범위 (50 내지 250 nM)인 것으로 나타났다 (도 2B). 대조적으로, 증식에 대한 AMN107의 효과의 IC₅₀값은 HMC-1.1 세포 (3 내지 10 nM)에서보다 HMC-1.2 세포 (1 내지 5 μM)에서 상당히 높았다 (도 2C). 예상한 바와 같이, 이마티닙은 약리학상 적절한 농도에서 HMC-1.1 세포 (IC₅₀: 10 내지 30 nM)에만 효과적인 반면, HMC-1.2 세포에 대한 이마티닙의 유의한 항증식성 효과는 나타나지 않음으로 (도 2D) 이전 데이터를 확증하였다.^20-22 c-KIT 돌연변이 V560G (c-KIT 돌연변이 D816V가 아님)를 나타내는 HMC-1.1 세포에 대한 세 약물의 증식-억제 효과를 비교한 경우, AMN107이 가장 강력한 (몰 농도 기준으로) 화합물이라는 흥미로운 결과가 나타났다 (도 2B-D).

도 3A에 나타난 바와 같이, 세 TK 억제제 모두 투여량-의존적 방식으로 독시사이클린-노출된 (KIT-발현) Ton.Kit.wt 세포의 SCF-의존성 증식을 방해하는 것으로 나타났다 (IC₅₀ 값: PKC412는 3 내지 30 nM, AMN107은 30 내지 300 nM, 이마티닙은 3 내지 30 nM). 대조적으로, Ton.Kit.D816V 세포에서, PKC412 (IC₅₀: 100 내지 300 nM) 및 AMN107 (IC₅₀: 1 내지 3 μM, 보다 낮은 정도로)만이 ³H-티미딘 흡수를 억제하는 것으로 나타난 반면, 시험한 투여량 범위에 걸쳐 이마티닙은 유의한 효과를 나타내지 않았다 (도 3B). 사용된 세 억제제는 독시사이클린의 부재 하에, 즉 KIT의 부재 하에 Ton.Kit.wt 세포 또는 Ton.Kit.D816V.27 세포의 증식을 방해하는 것으로 나타나지 않았다 (도 3A 및 3B). 추가의 대조군 실험에서, 독시사이클린 (1 μg/ml)과 TK 억제제 (이마티닙, PKC412, AMN107) 모두 대조군 (비-형질감염된) Ba/F3 세포에 대해 증식-억제 효과를 나타내지 않았다 (도시하지 않음).

전신 비만세포증에 대한 PKC412 및 AMN107의 항-증식성 효과를 재확인하기 위해, 골수 세포 (MC 와 비 MC-계통 세포) 대부분이 KIT D816V를 나타내는 SM의 특별한 하위변이체인 아급성 SM을 앓는 환자의 1차 신생물성 골수 (bm)-유래 MC의 반응을 시험하였다. 실제로, MC의 순도는 단지 4％이나, 이 표본의 골수 세포 대부분은 KIT D816V를 나타내었다. 이러한 신생물성 bm 세포에서, PKC412 및 AMN107은 투여량-의존적 방식으로 ³H-티미딘의 자발적인 흡수를 억제하는 것으로 밝혀진 반면, 이마티닙 (1 μM)으로는 유의한 효과가 나타나지 않았다 (도 4). 대조군 (정상 bm, 혈액학적 질환 없음) 표본에서, PKC412는 ³H-티미딘 흡수에 대해 효과를 나타내지 않았다 (도시하지 않음).

KIT D816V를 나타내거나 나타내지 않는 신생물성 인간 MC에 대한 PKC412 및 AMN107의 증식-억제 효과의 기초가 되는 기전을 연구하기 위해, 약물에 노출시킨 후 HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 아폽토시스의 형태학적, 생화학적 징후를 분석하였다. 상기 실험에서, PKC412는 HMC-1 두 서브클론 모두에서 투여량-의존적 방식으로 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (도 5A 및 5B). 또한, AMN107도 투여량-의존적 방식으로 HMC-1 두 서브클론 모두의 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌으나, 이 화합물의 효과는 HMC-1.2 세포에 비해 HMC-1.1 세포에서 더 뚜렷하다 (도 5D). 유사하게, 이마티닙이 HMC-1.1 세포의 아폽토시스를 일으키는 것으로 밝혀졌으나 (도 5E), HMC-1.2 세포에 대해서는 아무런 효과도 나타내지 않았다 (도 5F). HMC-1 세포에 대한 약물의 아폽토시스-유도 효과는 전자현미경법에 의해 확인할 수 있었다. 또한, 세 약물 모두 (각 1 μM) HMC-1.1 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀진 반면, HMC-1.2 세포에서는 PKC412 및 AMN107 (보다 낮은 정도로)만이 HMC-1.2 세포의 아폽토시스를 일으키는 것으로 나타났다. 도 6은 HMC-1.2 세포에 대한 PKC412 (1 μM, 24시간)의 아폽토시스 유도 효과를 나타낸다. 보이는 바와 같이, 대조군 배지에 유지시킨 세포 (도 6A)에 비해, PKC412에 노출된 HMC-1 세포의 대부분 (도 6B-D)이 전형적인 아폽토시스의 초미세구조적 징후를 나타내었다. 최종적으로, 조합된 아넥신V/요오드화 프로피듐 염색 및 유식 세포분석법 (도 7) 및 터널 분석 (도 8)에 의해 HMC-1 세포에서의 PKC412 및 AMN107의 아폽토시스-유도 효과를 증명할 수 있었다. 두 분석법에서, PKC412 (1 μM) 및 AMN107 (1 μM, 보다 낮은 정도로)이 HMC-1.2의 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀진 반면, 이마티닙은 효과를 나타내지 않았다 (도 7 및 8E-H). 대조적으로, HMC-1.1 세포에서는, 터널 분석에 의해 평가된 바와 같이 세 화합물 모두 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (도 8A-D).

상기 데이터는 HMC-1 세포에 대한 PKC412 및 AMN107의 증식-억제 효과가 아폽토시스의 유도와 관련된 것이라는 증거를 제공한다.

<PKC412는 HMC-1 세포 상의 활성화-연관 및 SM-관련 세포 표면 항원의 발현을 하향조절한다.>

SM에서 신생물성 MC 상에 전형적으로 (과)발현된 몇몇 세포 표면 항원은 신생물성 세포의 증식, 활성화, 또는 분포에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다.^45,46 이러한 분자들의 일부는 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체에 의해 직접 상향조절될 수 있다.³⁰ 따라서, PKC412, AMN107 또는 이마티닙이 HMC-1.2 세포의 세포 표면 항원의 발현에 영향을 미칠 것인지 알고자 하였다. 자극되지 않은 HMC-1.2 세포는 LFA-2 (CD2), 아미노펩티다아제-N (CD13), CD63, KIT (CD117), CD164 및 E-NPP3 (CD203c)를 발현하는 것으로 나타나 이전 데이터를 확증하였다.^45-47 HMC-1.2 세포를 PKC412와 인큐베이션하여 CD2, CD63 및 CD164의 발현이 유의하게 감소되었다 (p<0.05) (도 9A). 대조적으로, CD13 또는 CD203c의 발현에 대해서는 PKC412의 유의한 효과가 나타나지 않았다 (도 9A). KIT의 경우, PKC412 (AMN107 또는 이마티닙에도 노출시킴)에 노출시켰을 때 HMC-1.2 세포에 대한 KIT 발현의 약간의 감소가 발견되었으나, 그 효과는 유의하지 않았다 (p>0.05) (도 9A). CD2 및 CD63의 발현에 대한 PKC412의 효과는 투여량-의존적으로 나타났다. 도 9B는 HMC-1.2 세포 상의 CD63의 발현에 대한 여러 농도의 PKC412의 효과를 도시하였다. PKC412와 대조적으로, HMC-1.2 세포 상의 CD 항원의 발현에 대한 AMN107 또는 이마티닙의 유의한 효과는 나타나지 않았다 (도 9A).

<PKC412는 HMC-1 세포의 증식 억제를 일으키는데 있어서 다른 표적화-약물 및 통상적인 약물과 협력한다.>

³H-티미딘 흡수에 의해 평가된 바와 같이, PKC412는 HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 증식 억제를 일으키는데 있어서 AMN107과 협력하는 것으로 나타났다 (도 10; 표 1). HMC-1.1 세포의 경우, 약물 상호작용이 분명하게 상승작용적으로 나타난 반면, HMC-1.2 세포의 경우, 상호작용은 상승적으로 작용하기 보다는 상가적으로 작용하였다 (도 10; 표 1). 또한, 침습성 비만세포증을 치료하기 위해 주로 사용되는 약물인 PKC412 및 2CdA는 상승작용적 방식으로 HMC-1.1 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났고, 동일한 상승작용적 효과가 PKC412 및 이마티닙으로도 나타났다 (표 1). 그러나, HMC-1.2 세포의 증식에 대한 PKC412 및 2CdA의 상승작용적 효과는 분명하게 나타나지 않았다. 또한, AMN107 및 이마티닙은 HMC-1.1 세포에서만 상승작용적 억제 효과를 나타내었고 (도 10), KIT D816V를 갖는 HMC-1.2 세포에서는 나타내지 않았다 (표 1). PKC412와 인터페론-알파 (IFNα) 또는 AMN107과 IFNα를 조합한 경우, HMC-1 세포의 증식에 대한 상승작용적이거나 상가작용적인 효과는 나타나지 않았다 (표 1). 약물 상호작용의 개요를 표 1로 나타내었다.

표 1에 나타난 바와 같이, ³H-티미딘 흡수 분석법으로 HMC-1.1 세포 (우측 상단, 백색 네모) 및 HMC-1.2 세포 (좌측 하단, 회색 네모)의 증식에 대한 여러 약물 조합의 효과를 확인하였다. 각 약물 조합을 적어도 세 번의 독립적인 실험으로 시험하였다. 약물을 고정된 비율로 적용하고, 생성된 결과 (및 약물 상호작용의 유형)을 캘큐신 소프트웨어로 결정하였다. 스코어: +, 상승작용적 증식-억제 효과; +/-, 상가작용적 효과; -, 상가작용 미만 (길항작용적) 효과; n.t., 시험하지 않음.

논의

체성 c-KIT 돌연변이 D816V는, 결정적으로 (신생물성) MC의 증식과 관련되어 SM의 병인과도 관련된, KIT 수용체의 TK 도메인의 구성적 활성화를 초래하는 유전자 결함이다.^13-17 따라서, 최근의 시도는 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체의 TK 활성을 억제할 수 있어서 SM을 앓는 환자의 신생물성 MC의 증식을 억제할 수 있는 약리학적 화합물의 동정 및 개발에 초점을 맞추어 왔다.^9-12 본원에서는 TK 억제제인 PKC412 및 AMN107 (보다 낮은 정도로)이 KIT-D816V의 TK 활성 및 이러한 특수한 c-KIT 돌연변이를 갖는 신생물성 인간 MC의 증식을 억제한다는 것을 기술하였다. 또한, 두 약물 모두 서로 협력하며 신생물성 MC의 증식 억제를 일으키기 위해 사용되는 다른 표적화 약물 및 통상적인 약물과도 협력함을 나타내었다.

PKC412는 KDR, PDGFRA, FLT3 및 KIT를 비롯한 PKC 및 몇몇 TK의 신규 스타우로스포린-관련 억제제이다.⁵ 현행 연구에서, PKC412가 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 발현하는 신생물성 인간 MC 및 Ba/F3 세포의 증식을 방해함을 증명하였다. Ba/F3 세포와 관련하여, 본 발명자의 데이터는 그라우니(Growney) 등에 의한 결과와 일치한다.⁴⁸ 흥미롭게도, Ba/F3 세포에 대한 유효 투여량-범위는, KIT D816V를 갖는 HMC-1.2 세포에서 발견되는 것과 동일한 것으로 밝혀졌다. 또한, 흥미롭게도 HMC-1의 두 서브클론 (KIT D816V를 발현하거나 발현하지 않음)에 대한 PKC412의 효과에 대한 IC₅₀이 동일한 범위라는 것이 관찰되었다. 최종적으로, KIT D816V를 발현하는 1차 신생물성 인간 (비만) 세포에 대한 PKC412의 증식 억제 효과를 확인할 수 있었다. 질환의 아형에 독립적인 SM을 앓는 모든 환자의 다수에서 c-KIT 돌연변이 D816V가 검출되므로,^13-17 이러한 데이터는 상당히 중요하다. 실제로, 보고된 바에 의하면 PKC412가 KIT wt-발현 MC와 동일한 방식으로 KIT D816V-포함 인간 MC의 증식을 방해를 방해하는 최초의 TK-억제제인 것으로 보인다. 또한, 이 점과 관련하여 KIT D816V-양성 세포에 대한 PKC412의 억제 효과가 AMN107 및 이마티닙의 항증식성 활성을 현저하게 능가한다는 것 또한 주목할 만하다. 상기 관찰에 기초하여, PKC412는 (침습성) SM 또는 MCL를 앓는 환자의 임상 시험에 사용할 것을 고려하도록, 주목할 만한 신규 표적화 약물로 보여진다.

최근의 데이터는 AMN107이 가장 강력한 BCR/ABL TK 활성 억제제임을 시사한다.²⁷ 또한, AMN107이 야생형 KIT의 TK 활성을 억제한다는 것이 기술되어 있다.²⁷ 본 연구에서, AMN107이 c-KIT 돌연변이 V560G를 갖는 HMC-1 세포에 대해서는 강력한 효과를 나타내나, KIT V560G 및 KIT D816V 모두를 갖는 HMC-1 세포에 대해서는 약한 효과를 나타낸다는 것을 밝혔다. 유사하게, AMN107은 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 나타내는 Ba/F3 세포의 증식에 대해 약한 효과만을 나타내었다. 상기 데이터는, AMN107이 이마티닙에 비해 KIT D816V-양성 HMC-1 세포에 대한 억제 효과를 가지긴 하나, c-KIT 돌연변이 D816V는 (c-KIT 돌연변이 V560G는 아님) AMN107에 대한 상대적인 내성을 부여함을 시사한다. 또한, V560G-양성 세포에 대한 AMN107의 인상적인 항증식성 효과는 이 화합물이 위장관 기저 세포 종양 (GIST) (최근 c-KIT의 코돈 560에서의 돌연변이가 보고됨)에 대한 주목할 만한 선구적인 후보-약물일 수 있음을 시사한다.⁴⁹

최근 임상 혈액학 분야에서 전구-발암성 분자의 TK 활성을 표적화하는 다수의 약리학적 억제제가 개발되어 왔다.^5,12,19,27 (적절한 표적을 발현하는) 신생물성 세포에 대한 이러한 TK 억제제의 증식-억제 효과는 통상적으로 TK 활성의 감소 및 연속적인 아폽토시스와 관련되어 있다. 본 연구에서, 신생물성 인간 MC (HMC-1)에 대한 PKC412의 증식-억제 효과가 (돌연변이된) KIT의 TK 억제 및 아폽토시스와 관련되어 있음을 증명할 수 있었다. 실제로, PKC412가 HMC-1.1 세포 (KIT V560G를 발현하나 KIT D816V를 발현하지는 않음) 및 HMC-1.2 세포 (KIT V560G 및 KIT D816V를 발현함)의 아폽토시스를 유도함을 입증할 수 있었다. PKC412의 아폽토시스-유도 효과는 광학현미경법, 전자현미경법, 유식 세포분석법 및 터널 분석으로 증명가능하였다. 예측한 바와 같이, AMN107 및 이마티닙은 HMC-1.1 세포에 대한 아폽토시스-유도 효과를 유의하게 나타내었으나, HMC-1.2 세포에 대한 효과는 유의하게 나타내지 않았다.

다수의 세포 표면 항원은 신생물성 인간 MC 상에서 전형적으로 (과)발현된다. 이와 같이, 정상 MC에 대조적으로, SM을 앓는 환자의 신생물성 MC는 CD2 및 CD25를 발현한다.^45,46 또한, SM의 신생물성 MC에서 발현된 CD63 및 CD203c의 수준은 정상 MC와 비교하여 더 높다. CD63과 같은 몇몇 경우에 있어서, D816V-돌연변이된 KIT의 변이체는 직접적으로 표면 발현의 증진을 초래할 수 있다.³⁰ 따라서, PKC412에 의해 HMC-1 세포의 D816V-돌연변이된 KIT를 표적화하는 것이 'SM-관련' 표면 CD 항원의 발현을 감소시키는 것과 관련되어 있는지 알고자 하였다. 실험 결과는, PKC412가 KIT D816V를 나타내는 HMC-1.2 세포의 CD2, CD63 및 CD164의 발현을 하향조절한다는 것을 증명하였다. KIT 발현에 대한 PKC412 (및 AMN107)의 유의하지 않은 효과 또한 관찰되었다. 흥미롭게도, AMN107이 HMC-1.2 세포의 CD2 및 CD63의 발현을 억제하는데 실패하였음이 관찰되었다. 이는 아마도 PKC412의 효과와 비교한 경우, KIT D816V의 TK 활성에 대한 AMN107의 효과가 더 약하기 때문이다.

다수의 최근 데이터는 TK 억제제로 단일 제제를 사용하여 골수 신생물을 치료하는 것이 장기간의 질환을 조절하는데 불충분할 수 있음을 시사한다. 이는 (진행) CML에 이마티닙을 사용하는 것에 대해 기록되어 있고⁵⁰ ^,51, 또한 ASM 또는 MCL을 앓는 환자에도 적용될 수 있다.⁵² 후자의 환자에 있어서, 이는 특히 문제가 되는데, D816V 돌연변이가 이마티닙 및 AMN107 (보다 낮은 정도로)에 대해 KIT의 1차 (상대적인) 내성을 부여하기 때문이다. 내성을 극복하기 위해, 다수의 다른 약리학적 전략을 구상할 수 있다. 하나의 가능성은 약물-조합을 적용하는 것이다. 따라서, PKC412 및 AMN107이 HMC-1.1 및 HMC-1.2 세포에 대한 상승작용적 항증식성 효과를 나타낼 것인지 알고자 하였다. 실제로, 본 발명자의 데이터는 PKC412가 두 HMC-1 클론의 증식 억제를 일으키는데 있어서 이마티닙 및 AMN107과 협력함을 나타내었다. 또한, (침습성) SM을 앓는 환자의 생체내 신생물성 MC의 증식을 방해하는 것으로 기술되어 있는 약물인 PKC412 및 2CdA는 HMC-1.1- 및 HMC-1.2 세포의 증식에 대해 협력적 억제 효과를 나타내었다. 그러나, 흥미롭게도 상승작용적 약물 상호작용은 HMC-1.1 세포에서만 나타났고, HMC-1.2 세포에서는 나타나지 않았다. 이는 HMC-1.1 세포에 대한 AMN107과 이마티닙의 효과가 훨씬 뚜렷한 것에 비해, KIT TK 활성 및 D816V를 갖는 HMC-1.2 세포의 증식에 대한 공동-적용된 약물의 효과가 상대적으로 약하거나 (AMN107), 없는 (이마티닙) 것으로 설명될 수 있다. IFNα를 AMN107 또는 PKC412와 조합한 경우 협력적 약물 효과는 나타나지 않았다. PKC412 및 다른 (표적화) 약물로 구성된 약물 조합물이 ASM 또는 MCL을 앓는 환자에서 임상적 가치를 가지는 지는 알려지지 않은 채로 남아 있다.

SM을 앓는 환자의 생체내 신생물성 MC에 대해 기록된 항증식성 효과를 갖는 약물은 이제까지 소수만이 존재하며, 이러한 약물은 ASM 또는 MCL을 앓는 환자의 장기간 완전 관해를 일으킬 수 없다. 이 점과 관련하여 PKC412가 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 갖는 신생물성 인간 MC의 증식에 대한 가장 강력한 신규 억제제라는 개념은 특히 중요하다.

요약하면, PKC412 및 AMN107이 SM의 야생형 KIT 및 돌연변이된 KIT 변이체를 표적화하는 전도유망한 신규의 약물임을 증명하였다. 두 약물 각각이 돌연변이된 KIT의 변이체에 대한 독특한 효과를 갖는 구별된 약리학적 프로파일을 나타낼 수 있으나, 앞으로 ASM 또는 MCL을 앓는 환자를 치료하기 위한 가장 효과적이고 전도유망한 접근은 두 약물을 서로 조합하거나, 임상적으로 확립된 약물인 2CdA와 조합하는 것일 수 있다.

실시예 1 참고문헌

실시예 2: 다사티닙과 PKC412 의 조합물

침습성 SM 및 비만 세포 백혈병 (MCL)을 비롯한 전신 비만세포증 (SM)을 앓는 모든 환자의 대부분의 신생물성 세포는 D816V-돌연변이된 KIT의 변이체를 나타낸다. KIT-D816V는 구성적 티로신 키나제 (TK) 활성을 나타내며, 악성 세포-증식과 관련되어 있다. 따라서, KIT-D816V-표적 약물을 동정하기 위한 몇몇 시도가 있어왔다. TK-억제제인 다사티닙 (BMS-354825)이 야생형 (wt) KIT, 및 독시사이클린에 의해 KIT의 발현이 유도되는 Ba/F3 세포의 KIT-D816V의 TK-활성을 방해한다는 것을 발견하였다. 또한, 다사티닙이 Ba/F3 세포의 KIT D816V-유도된 클러스터 형성 및 세포의 생존도, 및 HMC-1.1 세포 (KIT-D816V-음성) 및 HMC-1.2 세포 (KIT-D816V-양성)의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 다사티닙의 효과는 투여량-의존적이며, KIT-D816V를 갖지 않는 세포와 비교하여 KIT-D816V를 갖는 세포에서 100 내지 1,000 배 더 높은 IC₅₀-값을 갖는다. HMC-1 세포에서의 다사티닙의 억제 효과는 아폽토시스 및 CD2- 및 CD63-발현의 감소와 관련된 것으로 밝혀졌다. 또한, 다사티닙이 증식-억제를 일으키는데 PKC412, AMN107, 이마티닙 및 2CdA와 협력하는 것으로 나타났다. HMC-1.1 세포에서, 적용된 모든 약물-상호작용은 상승작용적인 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, HMC-1.2에서는, "다사티닙+PKC412" 및 "다사티닙+2CdA" 조합만이 상승작용적 효과를 일으켰다. 따라서, 이러한 약물-조합은 침습성 SM 또는 MCL의 치료를 위한 흥미로운 약리학적 접근을 의미할 수 있다.

도입

수용체 티로신 키나제, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 또는 줄기 세포 인자 수용체 (SCFR, KIT)는 종종 통제되고, 조혈 신생물을 앓는 환자의 티로신 키나제 (TK)의 구성적 활성을 나타낸다.^1-5 따라서, 이러한 분자는 약물 요법을 위한 주목할 만한 표적임을 의미한다. 실제로, 과거 몇 년간, 몇몇 부상하는 치료 개념은 신생물성 골수 세포의 결정적인 TK를 표적화하는 신규 약물에 기초를 두어 왔다.^1-5

전신 비만세포증 (SM)은 하나 이상의 기관의 신생물성 비만 세포 (MC)의 비정상적인 증식 및 축적의 특성을 나타내는 골수 신생물이다. SM의 무통성 및 침습성 변이체가 기술되어 있다.^6-9 침습성 SM (ASM)을 앓는 환자 및 SM의 백혈구성 변이체, 즉 비만 세포 백혈병 (MCL)을 앓는 환자에 있어서, 통상적인 약물에 대한 반응은 불량하고, 그 예후는 매우 좋지 않다.^6-12 따라서, 신생물성 비만 세포 (MC)의 신규한 치료 표적을 동정하고, 각각의 치료 개념을 개발하기 위한 다수의 시도가 있어 왔다.^9-12

ASM 또는 MCL를 앓는 환자들을 비롯한 SM을 앓는 모든 환자의 대부분에서, KIT 돌연변이 D816V가 발견된다.^13-17 이 돌연변이는 KIT의 리간드-독립적인 인산화 및 세포의 자율적 증식과 관련되어 있다.^17,18 이러한 개념에 기초하여, D816V-돌연변이된 KIT의 변이체는 치료 요법의 주요 표적으로 인식되어 왔다.^9-12,19 따라서, KIT D816V의 인산화 및 신생물성 MC의 증식을 방해하는 TK-억제제를 동정하기 위한 다수의 노력이 있어 왔다.^9-12,19-24 BCR/ABL의 강력한 억제제인 이마티닙 (STI571)이 야생형 (wt) KIT 또는 드물게 발생하는 F522C-돌연변이된 KIT의 변이체를 나타내는 신생물성 MC의 증식을 방해한다는 것이 최근에 밝혀졌다.^20-23 또한, 이 약물이 SM이 공존하거나 공존하지 않는, FIP1L1/PDGFRA 융합 유전자를 갖는 만성 호산구성 백혈병을 앓는 환자의 신생물성 세포의 증식을 차단하는 것으로 밝혀졌다.^24-26 그러나, 이마티닙은 KIT D816V를 갖는 신생물성 MC의 증식을 억제하는 데는 실패하였다.^20-22 보다 최근에, PKC412²⁷가 KIT-D816V의 TK 활성을 방해하여, 신생물성 MC의 증식을 하향조절하는 것으로 나타났다.^28-30 또한, 신규 TK 억제제인 AMN107³¹이 상대적으로 높은 약물 농도에서 KIT-D816V를 나타내는 신생물성 세포의 증식을 방해하는 것으로 기술되어 있다.^30,32 그러나, 이러한 화합물의 대부분은 단일 약물로는 ASM 또는 MCL을 앓는 환자의 장기간 완전 관해를 일으킬 수 없다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 이러한 약물 중 몇몇은 wt KIT를 나타내는 MC에 대해서만 작용하며, KIT-D816V를 갖는 MC의 증식을 억제하지 않는다. 따라서, 신규 KIT-표적화 TK 억제제를 추가로 찾고, 협력적 약물-효과를 시험하는 것이 중요하다. 약물-조합과 관련하여, 최근에 PKC412 및 AMN107이 HMC-1 세포의 협력적 증식-억제 효과를 일으킨다는 것을 증명하였다.³⁰ 그러나, 이러한 약물 조합이 KIT-D816V를 갖지 않는 HMC-1 세포에서 상승작용적 억제 효과를 일으키는 반면, KIT-D816V를 발현하는 HMC-1.2 세포에서는 상승작용적 효과가 관찰되지 않았다.³⁰ 또한, 다른 약물도 KIT-D816V를 나타내는 비만 세포에서 상승작용적 억제 효과를 나타내는데 실패하였다.³⁰

다사티닙 (BMS-354825)은 src 키나제 및 KIT를 비롯한 몇몇 TK의 신규 억제제이다.^33,34 또한, 다사티닙은 KIT-D816V의 인산화 및 신생물성 MC의 증식을 억제하는 것으로 기술되어 있다.^34,35 최근의 연구에서, 다사티닙이 생존, 클러스터 형성, 및 CD2 및 CD63의 발현을 비롯한 신생물성 세포의 KIT-D816V-의존적 질환-관련 기능의 일부를 차단함을 나타내었다. 또한, 본 발명자의 데이터는 다사티닙이 HMC-1.2 세포의 증식 억제를 일으키는데 있어서 PKC412 및 2CdA와 상승작용함을 나타낸다. 본 발명자가 알고 있는 바로는, 이는 KIT-D816V를 갖는 MC에 대해 상승작용적인 것으로 기술된 TK 억제제의 최초의 조합이다. 또한, 본 발명자의 데이터는 다사티닙이 단독으로 또는 다른 약물과 조합하여 ASM 또는 MCL을 앓는 환자의 치료를 위해 전도유망한 제제일 수 있음을 시사한다.

재료 및 방법

<시약>

다사티닙 (BMS-354825)³³은 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb) (미국 뉴져지주 뉴브런즈윅 소재)으로부터 제공받았고, 이마티닙 (STI571), AMN107,³¹ 및 PKC412²⁷는 노바티스 파마 AG (스위스 바젤 소재)로부터 제공받았다. 다사티닙, AMN107 및 PKC412의 원액을 디메틸-술폭시드 (DMSO) (독일 다름슈타트 소재 머크) 중에 용해시켜 준비하였다. 재조합 인간 (rh) 줄기 세포 인자 (SCF)는 스트라트만 바이오테크 (독일 하노버 소재)로부터, RPMI 1640 배지 및 우태혈청 (FCS)은 PAA 래브러터리즈 (오스트리아 파스칭 소재)로부터, L-글루타민 및 이스코프 변형 둘베코 배지 (IMDM)는 기브코 라이프 테크놀로지스 (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)로부터, ³H-티미딘은 아머샴 (영국 버킹엄셔 소재)으로부터, 2-클로로-데옥시아데노신 (클라드리빈=2CdA)은 시그마 (미국 미주리주 세이트 루이스 소재)로부터, rh 인터류킨-4 (IL-4)는 페프로테크 (미국 뉴져지주 로키 힐 소재)로부터 구입하였다. PE-표지된 단일 클론 항체 (mAb) RPA-2.10 (CD2), WM15 (CD13), YB5.B8 (CD117), N6B6.2 (CD164), 및 MOPC-21 (mIgG1) 및 G155-178 (mIgG2a)를 벡톤 디킨슨 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재)으로부터, PE-접합된 mAb CLB-gran12 (CD63)를 이뮤노테크 (프랑스 마르세이유 소재)로부터 구입하였다. PE-표지된 mAb인 VIM5 (CD87)는 닥터. 오토 마이딕(Dr. Otto Majdic) (오스트리아 비엔나 의과대학 면역학 연구소)으로부터 흔쾌히 제공받았다.

MCL을 앓는 환자로부터 생성된 인간 비만 세포주 HMC-1³⁶ 은 닥터. 제이. 에이치. 버터필드 (미국 미네소타주 로체스터 소재 마요 클리닉)로부터 흔쾌히 제공받았다. HMC-1의 두 서브클론, 즉 KIT V560G를 갖고 KIT 돌연변이 D816V를 갖지 않는 HMC-1.1²⁰ 및 두 KIT 돌연변이 (즉, V560G 및 D816V)를 갖는 제2 서브클론인 HMC-1.2²⁰를 사용하였다. HMC-1 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 10％ FCS, L-글루타민, 알파-티오클리세롤 (시그마) 및 항생제를 보충한 IMDM에서 증식시켰다. 세포를 4 내지 8주마다 최초 원액으로부터 재해동시키고, 매주 계대배양하였다. HMC-1 세포를 i) 이염색성 과립의 존재, ii) KIT의 발현, 및 iii) KIT 발현에 대한 IL-4의 하향조절 효과 (100 U/ml, 48시간)에 대해 주기적으로 확인하였다.³⁷

wt c-KIT (Ton.Kit.wt) 또는 c-KIT D816V의 발현이 독시사이클린에 의해 유도되는 Ba/F3의 생성은 앞서 기술되어 있다.^30,38 요약하면, 역 tet-트랜스활성자³⁹ ^,40를 발현하는 Ba/F3 세포를 전기 천공법에 의해 KIT D816V cDNA (또는 wt c-KIT cDNA, 모두 미국 뉴욕주 콜럼비아 대학의 닥터 제이. 비. 롱리로부터 흔쾌히 제공받음)를 함유하는 pTRE2 벡터 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재 클론테크) 및 pTK-Hyg (클론테크)로 동시-형질감염시켰다. 히그로마이신 중에서 배양하여 안정하게 형질감염된 세포를 선택하고, 제한 희석법으로 클로닝하였다. 본 연구에서, 모든 실험에는 서브클론 Ton.Kit.D816V.27³⁸이 사용되었다. 이 세포를 독시사이클린 (1 μg/ml)에 노출 (12시간 이내)시킴으로써 KIT-D816V의 발현을 유도할 수 있다.³⁸

<1차 신생물성 세포의 단리>

1차 골수 (bm) 세포를 KIT D816V-양성 ASM 및 관련된 AML을 앓는 한 환자, 및 정상 bm을 갖는 한 환자로부터 얻었다. bm 흡인물 샘플을 보존제가 없는 헤파린을 함유하는 주사기에 수집하였다. 단핵 세포 (MNC)를 단리하기 위해 세포를 피콜 상에 층상으로 깔았다. 두 경우에 세포 생존도는 90％ 초과였다. ASM-AML을 앓는 환자에서, 단리된 MNC는 90％ 초과 미분화 세포를 함유하는 것으로 나타났다. 두 환자 모두 bm 천자 또는 혈액 제공 전에 서면 고지 동의서를 제출하였다. 이 연구는 지역 임상시험심의위원회 (local institutional review board)에 의해 승인되었고, 헬싱키 선언에 따라 수행되었다.

<웨스턴 블로팅에 의한 KIT 인산화의 분석>

wt KIT (Ton.Kit.wt) 또는 KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27)를 함유하는 HMC-1 세포 (10⁶/ml) 및 Ton.Kit.D816V.27 세포 (10⁶/ml)를 37℃에서 4시간 동안 다사티닙 (1 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM), PKC412 (1 μM), AMN107 (1 μM), 이마티닙 (1 μM), 또는 대조군 배지와 인큐베이션하였다. 억제 약물에 노출시키기 전에, Ton.Kit.wt 세포 및 Ton.Kit.D816V.27 세포를 37℃에서 24시간 동안 독시사이클린 (1 μg/ml)과 인큐베이션하여 KIT의 발현을 유도하였다. Ton.Kit.wt 세포의 경우에, rhSCF (100 ng/ml)를 첨가하여 KIT 인산화를 유도하였다. 사전에 기술되어 있는 바와 같이 면역침전 (IP) 및 웨스턴 블로팅을 수행하였다.^30,40 요약하면, 세포를 4℃에서 세척하고, 50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1％ 노니데트 P40 (NP-40), 0.25％ 데옥시콜산, 0.1％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 1 mM 에틸렌-디아민-테트라아세트산 (EDTA), 1 mM NaF, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 1 mM Na₃VO₄를 함유하는 RIPA 완충액 (세포 10⁸개 당 1 ml 완충액)에 재현탁시켰다. 프로테이나아제 억제제 칵테일 (로슈)로 보충한 RIPA 완충액에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 후, 세포용해물을 원심분리하였다. IP를 위해, 10⁷개 세포로부터의 세포용해물을 IP-완충액 (50 mM 트리스-Cl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 100 mM NaF 및 1％ NP-40) 중의 항-KIT 항체 1C1 (독일 튀빙겐 대학교의 닥터. 하. -요트. 뷔링으로부터 흔쾌히 제공받음)⁴³ 및 단백질 G 세파로즈 비드 (아머샴)와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 IP 완충액 중에서 3회 세척하였다. 세포용해물 및 면역침전물을 환원 조건하에 7.5％ SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 25 mM 트리스, 192 mM 글리신 및 20％ 메탄올을 함유하는 4℃의 완충액 중에서 니트로셀룰로오스 막 (프로트란, 미국 뉴햄프셔주 킨 소재 쉴라이허 앤드 슈엘)으로 옮겼다. 막을 5％ 블로킹 시약 (로슈) 중에서 1시간 동안 블로킹하고, 이어서 항-KIT 항체 1C1 또는 항-포스포-단백질 mAb 4G10 (미국 뉴욕주 레이크 플래시드 소재 업스테이트 바이오테크놀로지)과 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 항체 반응성을 양 항-마우스 IgG 항체, 루미겐 PS-3 검출 시약 (둘 모두 아머샴 제품) 및 CL-Xposure 필름 (미국 일리노이주 록퍼드 소재 피어스 바이오테크놀로지)으로 시각화하였다.

<TON.KIT.D816V.27 세포의 증식과 기능에 대한 약물 효과의 평가>

Ton.Kit.D816V.27 세포를 독시사이클린 (1 μg/ml), 및 여러 농도의 다사티닙 또는 AMN107과 37℃에서 24 내지 48시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 트리판 블루 배제 시험으로 세포 생존도를 결정하였다. 클러스터 형성을 도립 현미경으로 분석하였다. 이전 연구들은 Ton.Kit.D816V.27의 KIT-D816V의 발현이 유의한 클러스터 형성과 관련되어 있고, PKC412 (이마티닙은 아님)가 Ton.Kit.D816V.27 세포의 클러스터 형성을 하향조절한다는 것을 증명하였다.³⁸ 본 연구에서는, Ton.Kit.D816V.27 세포의 클러스터 형성에 대한 다사티닙 (1 pM 내지 1 μM) 및 AMN107의 효과를 분석하였다. 또한, 대조의 목적으로, PKC412 및 이마티닙의 효과를 시험하였다. 클러스터 형성은 광학 현미경법 (고 효율 필드(high power field=HPF) 당 클러스터로 계수함)으로 결정하고, 대조군 (=약물 없이 독시사이클린 단독 = 100％)의 ％로 표현하였다. 모든 실험은 세 표본으로 수행하였다.

<³H-티미딘 흡수의 측정>

증식-억제 약물 효과를 측정하기 위해, HMC-1 세포를 37℃, 48시간 동안 96-웰 배양 플레이트 (PTT, 스위스 소재 트라사딩겐) 중에서 다양한 농도의 다사티닙 (100 fM 내지 10 μM), PKC412 (100 pM 내지 10 μM), AMN107 (1 nM 내지 100 μM) 또는 이마티닙 (3 nM 내지 300 μM)과 인큐베이션하였다. 실험 중에, HMC-1 세포를 12, 24, 36 또는 48시간 동안 다사티닙 (HMC-1.1: 10 nM; HMC-1.2: 1 μM)에 노출시켰다. 선택 실험에서, HMC-1 세포를 여러 농도의 2CdA (0.005 내지 10 μg/ml)와 인큐베이션하였다. 1차 세포 (ASM-AML을 앓는 환자로부터 얻은 bm 세포 및 대조군 bm 세포)를 48시간 동안 대조군 배지, 다사티닙 (100 pM 내지 10 μM), PKC412 (100 pM 내지 10 μM), AMN107 (100 pM 내지 10 μM), 또는 이마티닙 (100 pM 내지 10 μM)과 배양하였다. 인큐베이션 후, ³H-티미딘 1 μCi를 첨가하였다 (37℃, 12시간). 이어서, 필터메이트 196 수확기 (미국 코넥티커트주 메리든 소재 팩커드 바이오사이언스)의 여과막 (팩커드 바이오사이언스) 상에서 세포를 수확하였다. 필터를 공기-건조하고, 결합된 방사성을 β-카운터 (탑-카운트 NXT, 팩커드 바이오사이언스)로 계수하였다. 세포 증식에 대한 잠재적인 상가작용적 또는 상승작용적 약물-효과를 결정하기 위해, HMC-1 세포 (두 서브클론 모두)를 여러 약물 (다사티닙, PKC412, AMN107, 이마티닙, 2CdA)의 조합에 고정된 약물-농도 비율로 노출시켰다. 약물 상호작용 (상가작용, 상승작용)을 캘큐신 소프트웨어 (캘큐신; 미국 미주리주 퍼거슨 소재 바이오소프트)를 이용하여 조합 지수 (CI) 값을 계산하여 결정하였다.⁴⁴ 1의 CI 값은 상가작용적 효과를 나타내고, 1 미만의 CI 값은 상승작용적 약물 효과를 나타낸다. 모든 실험은 세 표본으로 수행하였다.

아폽토시스에 대한 TK-억제제의 효과를 형태학적 조사, 유식 세포분석법 및 전자현미경법으로 분석하였다. 전형적인 실험에서, HMC-1 세포를 6-웰 배양 플레이트 (PTT)에서 10％ FCS를 함유하는 IMDM 배지 중 여러 농도의 다사티닙 (1 pM 내지 1 μM) 또는 대조군 배지와 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 아폽토시스 세포의 ％를 라이트-김사 염색 원심 도말법으로 정량화하였다. 아폽토시스를 통상적인 세포형태학적 기준에 따라 정의하였다.⁴⁵ HMC-1 세포의 아폽토시스를 확증하기 위해, 24시간 동안 다사티닙 (1 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM), PKC412 (1 μM), 또는 대조군 배지에 노출된 HMC-1 세포 (두 서브클론 모두)를 이용하여 기술된 바⁴⁶ ^, ⁴⁷와 같이 전자현미경법을 수행하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 1시간 동안 0.1 mol/L 나트륨 카코딜레이트 완충액 (pH 7.4) 중에서 완충된 2％ 파라포름알데히드, 2.5％ 글루타르알데히드 및 0.025％ CaCl₂에 고정시켰다. 이어서, 세포를 세척하고, 2％ 한천 중에 현탁시키고, 원심분리하였다. 펠렛을 1.3％ OsO₄ (0.66 mol/L 콜리딘 중 완충시킴)로 후-고정시키고, '일괄적으로' 2％ 우라닐 아세테이트 및 나트륨 말레에이트 완충액 (pH 4.4) 중에서 2시간 동안 염색하였다. 이어서, 펠렛을 세정하고, 알코올 계열로 탈수시키고, EPON 812 중에 임베딩시켰다. 초박절편을 잘라내고, 금 격자 상에 위치시켰다. 절편을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트 중에서 대비시키고, JEOL 1200 EX II 투과 전자현미경 (일본 도쿄 소재 제올)으로 관찰하였다.

<터널 분석에 의한 아폽토시스의 평가>

다사티닙 (1 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM) 또는 PKC412 (100 nM, 1 μM)에 노출된 HMC-1 세포의 아폽토시스를 확인하기 위해, 제조자의 지침에 따라 "제자리 세포 사멸 검출 키트 플루오레세인" (독일 만하임 소재 로슈 진단)을 이용하여 터널 (제자리 말단 트랜스퍼라제-매개된 dUTP-형광 닉 말단-표지) 분석을 수행하였다. 요컨대, 세포를 원심분리시키고, 실온에서 60분 동안 pH 7.4의 PBS 중의 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 세척한 다음, 0.1％ 트리톤 X-100 및 0.1 ％ 나트륨 시트레이트로 투과시켰다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 60분 동안 37℃에서, CoCl₂, 말단 데옥시-뉴클레오티딜트랜스퍼라제 및 형광 표지된 dUTP를 함유하는 말단-트랜스퍼라제 반응-용액 중에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 니콘 이클립스(Eclipse) E 800 형광현미경 (일본 도쿄 소재)으로 분석하였다.

<HMC-1 세포 상의 활성화-연관 표면 항원의 발현의 평가>

37℃에서 24시간 동안 대조군 배지 또는 TK 억제제 (다사티닙, 1 pM 내지 5 μM; PKC412, 1 μM)로 보충한 배지에서 배양한 후 HMC-1 세포 (두 서브클론 모두) 상의 세포 표면 항원의 발현을 유식 세포분석법으로 결정하였다. 약물과 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 신생물성 MC에서 오발현 (선택적으로)되는 것으로 알려진 결정 인자를 비롯한 몇몇 MC 분화 항원에 대한 PE-접합된 항체를 이용하여 단색 유식 세포분석법을 실시하였다.^48-51 분석된 마커는 CD2, CD13, CD63, CD87, CD117, 및 CD164였다. 기술되어 있는 바와 같이 FACScan (벡톤 디킨슨) 상에서 유식 세포분석법을 수행하였다.^30,37,51

<통계적 분석>

HMC-1 세포를 억제제에 노출시킨 후의 증식율, 아폽토시스 및 표면 발현 수준 간의 차이의 유의성을 결정하기 위해, 종속 표본에 대해 스튜던트 t 테스트를 적용하였다. p가 0.05 미만인 경우 결과가 통계적으로 유의한 것으로 고려된다.

결과

<KIT-D816V의 TK 활성에 대한 다사티닙의 효과>

IP 및 웨스턴 블로팅에 의해 평가된 바와 같이, 다사티닙 (1 nM 내지 1 μM)은 HMC-1.1 세포 (KIT 돌연변이 V560G를 발현하나 KIT 돌연변이 D816V를 발현하지는 않음)의 KIT의 인산화를 감소시켰다 (도 11A). 두 돌연변이 (KIT-V560G 및 KIT-D816V)를 갖는 HMC-1.2 세포에서, 다사티닙은 1 μM의 농도에서 KIT의 인산화를 감소시켰으나, 보다 낮은 농도에서는 KIT의 인산화를 방해하지 않았다 (도 11B). 다음 단계에서, 독시사이클린에 노출된 후, wt KIT (Ton.Kit.wt) 또는 KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27)를 발현하는 Ba/F3 세포에 대한 다사티닙의 효과를 시험하였다. Ton.Kit.wt 세포에서, KIT는 SCF의 존재 하에 인산화되는 것으로 나타난 반면, Ton.Kit.D816V.27 세포에서 KIT는 구성적으로 인산화되는 것으로 밝혀졌다. 도 11C에 도시된 바와 같이, 다사티닙 (10 nM 내지 1 μM)은 Ton.Kit.wt 세포에서 KIT의 SCF-유도된 인산화를 감소시켰다. 대조적으로, Ton.Kit.D816V.27 세포에서 (독시사이클린에 노출된 후 KIT-D816V 발현함), 다사티닙은 0.1 내지 1 μM 농도에서 KIT의 인산화를 감소시켰으나, 더 낮은 농도에서 KIT-인산화를 감소시키는데 실패하였다 (도 11D).

<HMC-1 세포의 ³H-티미딘 흡수에 대한 TK-억제제의 효과>

실험 중에, HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 증식에 대한 다사티닙의 최대 억제 효과는 36 내지 48시간 후에 나타났다. 도 12A는 이러한 세포의 증식에 대한 다사티닙 (HMC-1.1 세포에 대해 10 nM; HMC-1.2 세포에 대해 1 μM)의 시간-의존적인 효과를 도시한다. 도 12B에 도시한 바와 같이, 다사티닙은 투여량-의존적 방식으로 HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포의 ³H-티미딘 흡수를 방해하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, HMC-1.2 세포에 대한 다사티닙의 효과에 대한 IC₅₀ (200 내지 500 nM)은 HMC-1.1 세포에 대해 획득된 IC₅₀ 값 (1 nM)과 비교하여 상당히 높았다 (도 12B; 도 17). 그럼에도 불구하고, 다사티닙이 이마티닙 (대등하게 시험하였음)과 비교하여 몰 농도 기준으로 보다 효과적으로 HMC-1.2 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 표 2는 HMC-1.1 세포 및 HMC-1.2 세포에 적용된 TK 억제제의 효과에 대해 획득된 IC₅₀ 값의 요약을 나타낸다. 이마티닙, AMN107 및 PKC412의 효과와 관련하여, 이러한 데이터는 이전의 결과를 확증하였다.³⁰

다사티닙은 투여량-의존적 방식으로 독시사이클린-노출된 (KIT-발현) Ton.Kit.wt 세포의 SCF-의존성 증식을 방해하는 것으로 나타났다 (IC₅₀: 1 nM 내지 10 nM) (도 12C). 또한, Ton.Kit.D816V.27 세포에서, 다사티닙은 증식 및 세포 생존도를 억제하는 것으로 나타났다 (도 12D). 다사티닙은 독시사이클린의 부재 하에, 즉 KIT의 부재 하에 Ton.Kit.wt 세포의 증식을 방해하지 않았다 (도 12C). 유사하게, 다사티닙은 KIT D816V의 부재 하에 (- 독시사이클린) Ton.Kit.D816V.27 세포에서 주요 증식 억제 효과를 일으키지 않았다 (도 12D). 또한, 추가의 대조 실험에서, 독시사이클린 (1 μg/ml)은 비-형질감염된 Ba/F3 세포에 대한 증식-억제 효과를 나타내지 않았다 (도시하지 않음).

<TON.KIT.D816V.27 세포에서 KIT-D816V-의존적 클러스터 형성에 대한 다사티닙 및 AMN107의 효과>

앞서, KIT-D186V가 비만 세포 분화 뿐만 아니라 Ba/F3 세포의 클러스터 형성을 유도한다는 것을 나타내었으며, 이는 비만 세포의 클러스터 형성이 SM의 1차적인 발견이자 주요 질환-기준이므로 특히 중요하다.³⁸ 또한, PKC412가 Ton.Kit.D816V.27 세포의 독시사이클린/KIT-D816V-유도된 클러스터 형성을 하향조절한다는 것이 기술되어 있다.³⁸ 본 연구에서, 다사티닙 (100 nM 내지 1 μM) 및 AMN107 (200 nM 내지 1 μM) (보다 낮은 정도로)이 투여량-의존적 방식으로, Ba/F3 세포의 KIT-D816V-의존적 클러스터 형성을 방해한다는 것이 밝혀졌다 (도 12E 및 12F).

<다사티닙은 관련된 AML과 KIT D816V-양성 SM을 앓는 환자의 1차 신생물성 세포의 증식을 방해한다.>

SM에 있어서, 다사티닙의 항-증식성 약물 효과를 확인하기 위해, AML과 관련된 KIT D816V-양성 ASM을 앓는 환자의 1차 신생물성 세포를 조사하였다. 이 환자에 있어서, 다사티닙 (IC₅₀: 0.3 내지 1.0 nM) 및 PKC412 (IC₅₀: 10 내지 30 nM)가 투여량-의존적 방식으로 백혈구성 세포의 자발적인 증식 (³H-티미딘의 흡수)을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, AMN107이 증식-억제 효과 (100 내지 300 nM)를 나타낸 반면, 이마티닙 (IC₅₀ > 1.0 μM)은 이 환자의 신생물성 세포의 증식을 방해하지 않았다 (도 13). 대조군 샘플, 즉 정상 bm 세포에서, 시험한 다사티닙과 다른 억제제는 ³H-티미딘 흡수에 대한 효과를 나타내지 않았다 (도시하지 않음).

<다사티닙은 HMC-1 세포의 아폽토시스를 유도한다.>

다사티닙의 증식-억제 효과의 기초가 되는 기전을 연구하기 위해, 약물에 노출시킨 후 HMC-1 세포의 아폽토시스의 형태학적, 생화학적 징후를 분석하였다. 광학현미경법으로 평가된 바와 같이, 다사티닙은 HMC-1 두 서브클론 모두에서 아폽토시스를 유도 (즉, 아폽토시스 세포의 수를 증가시킴)하는 것으로 밝혀졌다 (도 14A 및 14B). PKC412는 대조군으로 적용되었으며, 역시 HMC-1 두 서브클론 모두에서 아폽토시스를 유도하는 반면, 이마티닙은 HMC-1.1 세포에서 아폽토시스를 유도하나, HMC-1.2 세포에 대해 아무런 효과를 나타내지 않았다 (도시하지 않음). HMC-1 세포에 대한 다사티닙의 아폽토시스-유도 효과를 전자현미경법으로 확인하였다. 실제로, 다사티닙은 1 μM의 농도에서 HMC-1.1 세포와 HMC-1.2 세포 모두에서 아폽토시스를 유도하였다 (도 14C). 최종적으로, 터널 분석으로 HMC-1 세포에 있어서 다사티닙의 아폽토시스-유도 효과를 증명할 수 있었다 (도 14D 및 14E). 상기 분석에서, 다사티닙이 HMC-1.1 세포의 아폽토시스를 1 내지 1,000 nM 사이의 농도에서 유도하고, HMC-1.2 세포의 아폽토시스를 100 내지 1,000 nM의 농도에서 유도하는 것으로 나타났다. PKC412 (1 μM)를 대조군으로 대등하게 조작하였으며, 역시 두 세포주에서 아폽토시스를 유도하였다 (도 14D 및 14E). 대조적으로, 이마티닙 (1 μM)은 HMC-1.1 세포에서만 아폽토시스를 유도하였고, HMC-1.2 세포에 대해서는 아무런 효과를 나타내지 않음으로 (도시하지 않음) 기존의 데이터를 확증하였다.³⁰

<다사티닙은 HMC-1 세포 상의 활성화-연관 세포 표면 항원의 발현을 하향조절한다.>

CD2 또는 CD63와 같은 몇몇 세포 표면 항원은 SM에서 신생물성 MC 상에 전형적으로 (과)발현된다.^48-50 흥미롭게도, 이러한 분자들의 일부는 KIT D816V-의존적 방식으로³ ⁸ 신생물성 MC에서 발현될 수 있고/거나 인간 비만 세포 발생의 초기 단계에서 발현된다.⁵¹ 따라서, 다사티닙이 HMC-1 세포의 이러한 표면 항원의 발현에 영향을 미치는지를 조사하였다. 자극되지 않은 HMC-1.1 세포는 CD13, CD63, CD87, CD117 및 CD164를 발현하는 것으로 밝혀졌고, HMC-1.2 세포는 CD2, CD13, CD63, CD87, CD117 및 CD164를 발현하는 것으로 밝혀져 기존의 데이터를 확증하였다.^30,38,50 HMC-1.1 세포를 다사티닙과 인큐베이션시킴으로 CD13, CD63, CD87 및 CD117의 발현에 유의한 감소가 일어났다 (p<0.05) (도 15C). HMC-1.2 세포에서, 다사티닙은 CD2, CD63 및 CD87의 발현을 유의하게 감소시켰으나 (p<0.05), CD13, CD117 또는 CD164의 발현을 유의하게 감소시키지 않았다 (도 15D). 유식 세포분석법 실험에서 다사티닙의 하향조절 효과는 CD63에 대해 도 15E (HMC-1.1) 및 도 15D (HMC-1.2)로 예시되어 있다.

<다사티닙은 HMC-1 세포의 증식 억제를 일으키는데 있어서 다른 TK 억제제 및 2CdA와 협력한다.>

³H-티미딘 흡수에 의해 평가된 바와 같이, 다사티닙은 HMC-1 세포의 증식 억제를 일으키는데 있어서 PKC412, AMN107, 이마티닙 및 2CdA와 협력하는 것으로 나타났다 (표 3, 도 16). HMC-1.1 세포에서, 시험한 모든 약물 상호작용은 사실상 상승작용적인 것으로 나타났다 (도 16A 및 16B). 대조적으로, HMC-1.2 세포에서는, '다사티닙과 PKC412' 및 '다사티닙과 2CdA'의 조합만이 분명한 상승작용을 일으킨 반면 (도 16C 및 16D), 다른 약물 조합은 세포 증식에 대하여 상승작용적 증식-억제 효과보다는 상가작용적 효과를 나타내었다 (표 3). 표 3에 나타낸 바와 같이, ³H-티미딘의 흡수를 측정하여, HMC-1.2 세포의 증식 (상단 네모; 회색) 및 HMC-1.1 세포 (하단 네모; 암회색)에 대한 협력적 약물 효과를 결정하였다. 협력적 약물 효과는 캘큐신 소프트웨어로 계산하였다.

논의

SM을 앓는 환자에 있어서, MC의 인자-독립적 자율 증식 및 축적은 모든 질환-변이체에 공통적인 특징이다. 체성 KIT 돌연변이 D816V는 KIT의 구성적 활성화 및 세포의 자율적 증식을 일으키는 것으로 고려되는 SM-관련 결함이다.^13-17 따라서, 최근에는 KIT-D816V의 TK 활성을 억제하여 신생물성 세포의 증식/축적을 억제하는 약리학적 화합물을 동정하기 위한 시도가 있어 왔다.^9-12 본원에서는 신규 TK 억제제인 다사티닙이 KIT-D816V의 TK 활성 및 신생물성 세포의 몇몇 KIT D816V-의존적 질환-관련 기능을 차단한다는 것을 기술하였다. 또한, 다사티닙이 PKC412, 및 신생물성 MC의 증식 억제를 일으키기 위해 사용되는 다른 표적화 약물 및 통상적인 약물과 상승작용함을 증명하였다.

BMS-354825로도 알려진 다사티닙은 BCR/ABL 및 KIT를 비롯한 몇몇 TK에 대해 상당한 효과를 나타내고, 몇몇 src 키나제에 대한 상당한 활성을 나타내는 신규 TK 억제제이다.^33-35 그의 'TK-표적화' 활성에 기초하여, 최근에 다사티닙은, 여러 골수 신생물의 신생물성 세포의 증식을 억제할 수 있는 항신생물성 제제로 고려되어 왔다.^33-35 본 연구에서, 다사티닙이 SM-관련 종양단백질 KIT-D816V의 TK 활성을 방해하고, KIT 돌연변이를 갖는 인간 MC의 시험관내 증식을 억제한다는 것을 증명하였으며, 이는 기존의 발표들을 확증한다.^34,35 또한, 다사티닙이 Ba/F3 세포의 KIT-D816V-의존적 클러스터 형성 및 HMC-1.2 세포의 CD2 및 CD63 발현을 방해한다는 것을 밝혔다. 따라서, 다사티닙은 (SM)-관련 몇몇 질환 및 신생물성 MC의 KIT-D816V-의존적 기능을 차단한다. 증식-억제와 관련하여, 흥미롭게도 wt KIT 또는 KIT G560V에 대한 다사티닙의 효과가 KIT D816V에서 나타난 효과와 비교하여 보다 현저함이 관찰되었다. 최근에 AMN107 및 이마티닙으로도 유사함이 관찰되었다.³⁰ 그러나, KIT 돌연변이 D816V가 이마티닙에 대한 거의 완벽한 내성을 갖는 반면, 다른 두 TK 억제제, 즉 AMN107 및 다사티닙은 KIT D816V에 대한 상당한 활성을 갖으며, 몰 농도 기준으로 AMN107에 비해 다사티닙에 대해 획득된 IC₅₀ 값이 더 낮은데, 이는 다른 약물-표적 상호작용에 의한 것이거나, 다사티닙이 KIT TK 활성 뿐만 아니라 src 키나제 같은 다른 잠재적인 표적을 방해한다는 사실로 설명될 수 있다. 흥미롭게도, HMC-1.2 세포에 대한 증식-억제 효과는 약리학적 농도에서 일어남이 관찰되었고, 이는 이전의 발표들을 확증하였다.^34,35

대부분의 경우에, TK 억제제는 연속적인 아폽토시스로 TK-의존적 세포 증식을 차단하여 증식-억제제로서 작용한다.^30,35 유사하게, 다사티닙의 경우에, HMC-1 세포의 증식 억제가 TK 활성의 감소와 관련되어 있고, 아폽토시스의 징후를 동반함을 증명할 수 있었다. 다사티닙의 아폽토시스-유도 효과는 광학현미경법, 전자현미경법, 터널 분석으로 증명가능하다. 예측한 바와 같이, 다사티닙은 HMC-1.2 세포보다 HMC-1.1 세포에 대해 보다 강력한 아폽토시스-유도 효과를 나타내었으며, 이는 최근 발표된 결과들과 일치한다.³⁵

SM의 핵심적인 특징 및 주요 WHO 기준은 내장 기관에서 MC의 클러스터 형성이다.^41,42 최근에 KIT D816V가 비만 세포 분화를 유도할 뿐 아니라, Ba/F3 세포의 클러스터 형성을 유도한다는 것을 증명하였다.³⁸ 따라서, MC 클러스터 형성은 SM의 병인에 있어서 초기 단계이자 가장 중요한 단계이다. 본 연구에서, 다사티닙 및 AMN107이 Ba/F3 세포의 KIT D816V-유도된 클러스터 형성을 방해함을 증명할 수 있었다. 이러한 관찰 결과는 상기 약물의 특이적 작용 및 효과에 대한 추가 증거를 제공한다.

몇몇 세포 표면 막 항원은 신생물성 MC 상에서 전형적으로 (과)발현된다.^48-50 이와 같이, 정상 MC에 대조적으로, SM의 신생물성 MC는 CD2 및 CD25를 발현한다.^48-50 또한, CD63과 같은 몇몇 세포 표면 분자들은 정상 MC에 비해 신생물성 MC에서 과발현된다.⁴⁹ 몇몇 경우에 있어서 (예컨대, CD63), CD 분자의 발현은 KIT-D816V-의존적일 수 있다.³⁸ 따라서, 다사티닙으로 KIT D816V를 표적화하는 것이 상기 CD 항원의 발현을 감소시키는 것과 관련되어 있는지 알고자 하였다. 본 연구의 결과는, 다사티닙이 HMC-1.2 세포 (KIT D816V를 나타냄)의 CD2, CD63 및 CD87 발현을 하향조절하는 반면, CD13, CD117=KIT 또는 CD164의 발현을 유의하게 억제하지 않는 것으로 밝혀졌음을 나타낸다. 대조적으로, HMC-1.1 세포에서, 다사티닙은 CD13 및 KIT의 발현 또한 하향조절하는 것으로 밝혀졌다. 다사티닙에 대한 HMC-1 두 서브클론의 상이한 민감도 (IC₅₀)가 이러한 모순에 대한 한가지 설명이 될 것이다. 다른 가능성은 HMC-1.2 세포의 CD13 및 KIT가 약물-유도된 조절에 대해 일반적으로 감수성이 없다는 것일 것이다. 이러한 가설은, 상기 PKC412에 대한 IC₅₀ 값이 HMC-1 두 서브클론에서 동일하더라도, CD13 및 KIT가 PKC412와의 인큐베이션 후에도 동일한 수준으로 발현된다는 관찰에 의해 지지될 것이다.

다수의 최근 데이터는 TK 억제제로 단일 제제를 사용하여 골수 신생물을 치료하는 것이 장기간의 질환을 조절하는데 불충분할 수 있음을 시사한다. 이는 이마티닙 및 진행 CML에 대해 입증되어 있고⁵¹ ^,52, 또한 ASM 또는 MCL을 앓는 환자에도 적용될 수 있다.²⁹ 따라서, 상기 환자 대부분에서, 약물 내성이 발견된다. 내성을 극복하기 위해, 다수의 약리학적 전략을 구상할 수 있다. 하나의 합리적인 접근은 약물-조합물을 투여하는 것일 수 있다.

앞선 연구에서, PKC412, AMN107 및 2CdA가 HMC-1 세포에서 강력한 협력적 약물 효과를 나타냄을 밝혔다.³⁰ 그러나, KIT D816V를 갖지 않는 HMC-1.1 세포에서 대부분의 약물 조합으로 상승작용적 효과가 나타난 반면, KIT D816V를 갖는 HMC-1.2 세포에서는 상승작용적 약물 상호작용이 나타나지 않았다 (상가작용만 나타남). 따라서, 단일 제제로 KIT D816V를 갖는 비만 세포에 대한 강력한 효과를 나타내는 다사티닙을 KIT D816V의 다른 강력한 억제제와 조합하는 경우, 상기 세포에 상승작용적 효과를 일으킬 수 있는지 알고자 하였다. 실제로, 결과는 다사티닙과 PKC412, 및 다사티닙과 ASM 및 MCL을 치료하기 위해 사용되는 2CdA⁵⁴가 상승작용적 방식으로 HMC-1.2 세포의 증식을 억제함을 증명하였다. 본 발명자가 아는 바로는, 이는 KIT D816V를 갖는 신생물성 MC의 증식에 대한 상승작용적 효과를 일으키는 최초의 조합이다.

요약하면, 다사티닙 및 PKC412가 ASM 및 MCL의 치료를 위한 가장 전도유망한 표적화 약물임을 증명하였다. 본 발명자의 데이터에 기초하여, ASM 또는 MCL을 앓는 환자의 치료 요법을 개선하기 위해 상기 약물의 조합, 및 상기 약물과 2CdA 사이의 조합의 투여를 고려하는 것이 합리적으로 보인다.

실시예 2 참고문헌

Claims

하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염과 조합하여 포함하는, 전신 비만세포증을 치료하거나 예방하기 위한 제약 조성물.

<화학식 I>

<화학식 II>
제1항에 있어서, 전신 비만세포증이 이마티닙에 내성을 갖는 것인 제약 조성물.
제1항에 있어서, 전신 비만세포증이 발암성 KIT-D816V 돌연변이와 관련된 것인 제약 조성물.
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