ES2343542T3

ES2343542T3 - Composiciones para tratamiento de mastocitosis sistemica.

Info

Publication number: ES2343542T3
Application number: ES06764231T
Authority: ES
Inventors: Peter Valent
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2010-08-03
Anticipated expiration: 2026-07-19
Also published as: DE602006013826D1; JP5322639B2; WO2007010014A2; KR101351682B1; US20090221550A1; PT1909837E; CN101267837B; EP1909837B8; EP1909837A2; CA2615598C; BRPI0613863A2; AU2006271652B2; RU2008105823A; JP2009501767A; ATE464911T1; KR20080039915A; EP1909837B1; CN101267837A; AU2006271652A1; CA2615598A1

Abstract

Un compuesto de la fórmula (I): **(Ver fórmula)** en combinación con un compuesto de la fórmula (II): **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en el tratamiento o prevención de mastocitosis sistémica.

Description

Composiciones para tratamiento de mastocitosis sistémica.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el uso de inhibidores de tirosina cinasa para la preparación de un fármaco para el tratamiento de mastocitosis sistémica. La presente invención también se relaciona con una combinación para uso en el tratamiento de mastocitosis sistémica.

Antecedente de la invención

La mastocitosis sistémica (SM) se puede clasificar en SM inactiva (poca o ninguna evidencia de función de órgano deteriorada), SM activa (presencia de función de órgano deteriorada), enfermedades hematológicas de células diferentes a mastocitos asociadas con SM (SM-AHNMD) y leucemia de mastocitos. La presentación clínica en adultos de la SM es heterogénea e incluye enfermedad de la piel (usualmente urticaria pigmentosa), síntomas de liberación de mediador de mastocito (cefalea, sofoco, mareo leve, síncope, anafilaxis, etc.), y daño de órgano directo o indirecto (dolor óseo a partir de lesiones óseas líticas, osteoporosis o fracturas óseas, hepatosplenomegalia, citopenia de afectación de la médula ósea). Adicionalmente, alrededor del 20% de los pacientes con SM pueden presentar eosinofilia sanguínea significativa y algunas veces aislada (Tefferi and Pardanani 2004).

En general, la leucemia de mastocitos es una enfermedad terminal con supervivencia medida en meses y sin terapia efectiva a la fecha. La historia natural del la SM inactiva es mucho mejor con la supervivencia media medida en décadas y la progresión no frecuente a SM-AHNMD y SM activa. El resultado en SM-AHNMD se determina por el AHNMD asociado y es significativamente peor que el de la SM sin AHNMD. En ambas SM inactiva y activa sin AHNMD, se incrementan los mastocitos de médula ósea y el contenido de eosinofilos, se eleva la fosfatasa alcalina en el suero, la anemia, y se ha asociado la hepatosplenomegalía con pronóstico pobre (Tefferi nad Pardanani 2004). Se han logrado remisiones clínicas e histológicas completas en pacientes con SM asociada con la fusión de gen FIP1L1-PDGFR\alpha cuando se trata con Gleevec® (Pardanani 2003a, Pardanani 2003b).

La WO 2005/049032 describe el uso de midostaurina, valatinib y nilotinib como única terapia para el tratamiento de una enfermedad dependiente de KIT y en particular una enfermedad dependiente de KIT que es resistente a tratamiento con imatinib.

Resumen de la invención

Varios conceptos emergentes de tratamiento para neoplasmas mieloides se basan en los fármacos novedosos que objetivan las cinasas tirosina (TK) críticas o las moléculas de señalización en la dirección.^{1-5} La mastocitosis sistémica (SM) es un neoplasma hematopoiético que se comporta como una enfermedad mieloproliferativa inactiva en la mayoría de pacientes, pero también se puede presentar como una enfermedad activa (SM activa se denomina aquí como "ASM") o aún como una leucemia, por ejemplo, leucemia de mastocitos (denominada aquí como "MCL").^{6-11} En pacientes con ASM y MCL, la respuesta a terapia convencional es pobre en la mayoría de casos, y el pronóstico es grave.^{6-12} Por lo tanto, se ha realizado un número de intentos para identificar los objetivos novedosos de la terapia en mastocitos neoplásicos (MC) y para definir nuevas estrategias de tratamiento para estos pacientes.^{9-12}

En la mayoría de todos los pacientes con SM que incluyen aquellos que se diagnostican por tener ASM o MCL, la mutación de punto D816V c- KIT somática (Asp816Val) es detectable en células neoplásicas (mastocitos).^{13-17} Esta mutación de punto se asocia con fosforilación independiente de ligando y activación de KIT, y diferenciación autónoma y proliferación de las células afectadas.^{17,18} En base a esta asociación con actividad de cinasa tirosina (TK), la variante mutada D816V de KIT es un objetivo atractivo de terapia.^{9-12,19}

Se han realizado un número de esfuerzos en años recientes para identificar los fármacos adecuados que podrían inhibir la actividad de TK de KIT D816V.^{9-12,19-24} Se ha encontrado recientemente que el inhibidor de TK imatinib (STI571) que es ampliamente utilizado en la hematología clínica, contrarresta con la proliferación de MC neoplásicos que exhiben el KIT natural (wt) o la variante mutada F522C de KIT que ocurre raramente.^{20-23} Adicionalmente, se encuentra que este fármaco bloquea la proliferación de células neoplásicas en pacientes que tienen SM asociada con eosinofilia clónica y un gen de fusión FIP1L1/PDGFRA (SM con leucemia eosinófila crónica asociada, denominada aquí como "SM-CEL").^{24-26} Sin embargo, el imatinib falla al inhibir la proliferación de MC neoplásicos alojando la mutación c-KIT D816V^{20-22} que apunta a la necesidad clara de búsqueda adicional de inhibidores de TK novedosos que bloqueen el KIT D816V y así la proliferación de MC neoplásicos MC en SM.

Los fármacos que objetivan TK novedosos PKC412 y AMN 107 contraactúan con la actividad de TK de D816V-KIT y e inhiben la proliferación de MC humanos neoplásicos y células Ba/F3 con expresión de KIT-D816V inducible por doxiciclina, la proliferación de mastocitos neoplásicos primarios, y proliferación de estirpe HMC-1MLC humana, que aloja esta mutación c-KIT. Se encuentra que el PKC412 es un fármaco superior con valores IC_{50} de 50-250 nM y sin diferencias observadas entre las células HMC-1 exhibiting o lacking KIT-D816V. En contraste, el AMN 107 exhibe efectos más potentes en células negativas HMC-1 KIT-D816V. Se obtienen los resultados correspondientes con células Ba/F3 que exhiben KIT natural o mutado D816V. Los efectos inhibidores de crecimiento de PKC412 y AMN107 en HMC-1 se asocian con inducción de apoptosis y regulación por descenso de CD2 y CD63. Se encuentra que el PKC412 coopera con AMN107, imatinib, y cladribina (es decir, 2CdA) en la producción de la inhibición de crecimiento en HMC-1. También mostramos que el PKC412 hace sinergia con AMN 107 y cladribina (2CdA) en la producción de inhibición de crecimiento en células HMC-1. Juntos, el PKC412 y el AMN107 representan agentes novedosos prometedores para objetivar terapia de SM.

Esta invención se dirige a un tratamiento de combinación de PKC412 y AMN 107 que es efectivo contra SM, especialmente SM asociada con la mutación c-KIT D816V oncogénica. Esta invención también se dirige a un tratamiento de combinación de PKC412 y un inhibidor de TK que es efectivo contra SM, especialmente mastocitosis sistémica (SM) que incluye SM activa (ASM) y leucemia de mastocitos (MCL). En una realización preferida, el SM, ASM y MCL se asocian con la mutación c-KIT oncogénica, que incluyen especialmente D816V.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A-D es una representación de los efectos de los inhibidores TK sobre la fosforilación KIT en células neoplásicas. FIG. 1A,B: Fosforilación KIT en células HMC-1.1 (FIG. 1A) y células HMC-1.2 (que exhiben KIT D816V; FIG. 1B) después de incubación en medio de control (Control), imatinib STI571 (1 \muM), PKC412 (1 \muM), o AMN107 (1 \muM) durante 4 horas. FIG. 1C,D: fosforilación KIT en células Ton.Kit.wt (FIG. 1C) y células Ton.Kit.D816V.27 (FIG. 1D) después de incubación en medio de control (Control), imatinib (es decir, STI571) (1 \muM), PKC412 (1 \muM), o AMN 107 (1 \muM) durante 4 horas. Antes de exposición a fármaco, las células Ton.Kit.wt y células Ton.Kit.D816V.27 se mantienen en doxiciclina, 1 \mug/ml durante 24 horas para inducir la expresión de KIT. En el caso del clon Ton.Kit.wt, las células también se exponen a SCF (100 ng/ml, 4 horas) para inducir fosforilación KIT (p- KIT). En todas las células, la inmunoprecipitación se conduce utilizando el anti-KIT mAb SR-1. La inmunotransferencia Western se desarrolla utilizando anti-fosfo-mAb 4G 10 para detección p-KIT y el anti-KIT mAb 1C1 para detección de proteína KIT total.

La Figura 2A-D es una representación gráfica de los efectos de PKC412, AMN107, e imatinib sobre la proliferación de células HMC-1. FIG. 2A: Efectos que dependen del tiempo de PKC412 en captación de ^{3}H- timidina en células HMC-1.2. Las células HMC-1.2 se incuban con medio de control o PKC412 (300 nM) a 37ºC y 5% de CO_{2} durante varios periodos según se indica. Después de incubación, se analiza la captación de ^{3}H- timidina. Los resultados se expresan como porcentaje de control (es decir, captación de ^{3}H- timidina en medio de control en cada punto de tiempo) y representan la media \pm D.E. de triplicados. La FIG. 2B-D: Efectos dependientes de dosis de inhibidores TK sobre la captación de ^{3}H- timidina en células HMC-1. Las células HMC-1.1 (\bullet-\bullet) y células HMC-1.2 (\sqbullet-\sqbullet) se incuban en medio de control en la ausencia (0) o presencia de varias concentraciones de cualquier PKC412 (FIG. 2B), AMN107 (FIG. 2C), o imatinib (FIG. 2D) a 37ºC durante 48 horas. Después de incubación, se mide la captación de ^{3}H- timidina. Los resultados se expresan como porcentaje de control (0, 100%) y representan la media \pm D.E. de por lo menos 3 experimentos independientes.

La Figura 3A-B es una representación gráfica de los efectos de PKC412, AMN 107, e imatinib sobre la captación de ^{3}H- timidina en células Ton.Kit. FIG. 3A: células Ton.Kit.wt se mantienen en medio de control (barras blancas) o se inducen para expresar wt KIT activado al agregar doxiciclina (1 \mug/ml) y SCF (barras negras). En ambas condiciones, las células se exponen a cualquier medio de control (Co) o varias concentraciones de PKC412, AMN107, o imatinib (STI571), según se indica, durante 48 horas (37ºC, 5% de CO_{2}). Después de esto, la captación de ^{3}H- timidina se evalúa según se describe en el texto. Los resultados se expresan como porcentaje de control (Co) y representan la media \pm D.E. de tres experimentos independientes. La FIG. 3B: células Ton.Kit.D816V.27 se mantienen en medio de control (barras abiertas) o se inducen para expresar KIT D816V al agregar doxiciclina (1 \mug/ml) (barras negras), y luego se exponen a cualquier medio de control (Co) o varias concentraciones de PKC412, AMN107, o imatinib (STI571), según se indica, durante 48 horas (37ºC, 5% de CO_{2}). Después de esto, se determina la captación de ^{3}H- timidina. Los resultados se expresan como porcentaje de control (células expuestas a medio de control, denominado aquí como "Co") y representan la media \pm D.E. de tres experimentos independientes.

La Figura 4 es una representación gráfica de regulación por descenso PKC412 de la proliferación de células neoplásicas primarias (mastocitos) que exhiben D816V. Las células de médula ósea neoplásicas primarias que expresan KIT D816V se aíslan de pacientes con mastocitosis sistémica quiescente. Las células aisladas se incuban en medio de control (Co) o con varias concentraciones de PKC412, AMN107, e imatinib según se indica. La proliferación celular se cuantifica al medir la captación de ^{3}H- timidina. Los resultados se expresan como porcentaje de control (en donde Co se iguala al 100%) y representan la media \pm D.E. por triplicado. En células mo normales, no se ven efectos de PKC412 (no mostrado).

La Figura 5A-F es una representación gráfica de los efectos de inhibidores TK sobre la apoptosis de células HMC-1. Las células EMC-1. (FIG. 5A, C, E) y células HMC-1.2 (FIG. 5B, D, F) se cultivan en la ausencia (Co) o presencia de varias concentraciones de PKC412 (FIG. 5A,B), AMN107 (FIG. 5C,D), o imatinib (FIG. 5E,F) según se indica a 37ºC durante 24 horas. Después de esto, los porcentajes de células apoptósicas se cuantifican mediante microscopio de luz. Los resultados representan la media \pm D.E. de tres experimentos independientes.

La Figura 6A-D es una representación de examen microscópico de electrón de apoptosos inducida por PKC412 en células HMC-1. Las células HMC-1.2 se incuban con medio de control (FIG. 6A), PKC412, 500 nM (FIG. 6B), o PKC412, 900 nM (FIG. 6C,D) a 37ºC durante 24 horas. Luego, las células se cosechan y se analizan para signos ultraestructurales de apoptosis. Aunque las células apoptósicas raramente se ven en los cultivos mantenidos con medio de control (FIG. 6A), las células HMC-1.2 cultivadas en PKC412 (FIG. 6B-D) frecuentemente exhiben signos de apoptosis que incluyen encogimiento celular, agitación de membrana, vacuolización, y condensación de la cromatina nuclear.

La Figura 7 es una representación de células HMC-1.2 expuestas a medio de control (Control), PKC412 (1 \muM), AMN107 (1 \muM), o imatinib (1 \muM) a 37ºC durante 24 horas. Luego, las células se examinan para viabilidad y apoptosis mediante yoduro de propidio combinado (PI)/teñido de Annexina V-FITC.

La Figura 8A-H es una representación de la apoptosis en células HMC-1 evaluadas mediante el ensayo Tunel. Las células HMC-1.1 (FIG. 8A-D) y células HCM-1.2 (FIG. 8E-H) se incuban en medio de control (FIG. 8A,E), PKC412, 1 \muM (FIG. 8B,F), AMN107, 1 \muM (FIG. 8C,G), o imatinib, 1 \muM (FIG. 8D,H) a 37ºC durante 24 horas. Después de esto, las células se cosechan y se someten a ensayo de Tunel. Cuando es visible, el PKC412 produce apoptosis en la mayoría de las células HMC-1.1 y HMC-1.2, mientras que el AMN107 e imatinib muestran potentes efectos que inducen apoptosis solo en células HNC-1.1 (FIG. 8C,D), pero no en células HMC-1.2 que exhiben KIT D816V (FIG. 8G,H).

La Figura 9A-B es una representación gráfica de los efectos de inhibidores TK sobre la expresión de antígenos de superficie celular en células HMC-1.2. La FIG. 9A: Las células HMC-1.2 se exponen a medio de control (Co, barras abiertas), PKC412, 1 \muM (barras negras), AMN107, 1 \muM (barras rayadas), o imatinib (es decir, STI571), 1 \muM (barras grises) a 37ºC durante 24 horas. Los resultados muestran el porcentaje de control y representan la media \pm D.E. de 3 experimentos independientes. FIG. 9B: Efecto dependiente de dosis de PKC412 sobre la expresión de CD63 en células HMC-1.2. Las células se incuban con varias concentraciones de PKC412 según se indica a 37ºC durante 24 horas. Después de esto, las células se cosechan y se examinan para expresión de CD63 mediante citometría de flujo. La Figura muestra un resultado típico de un experimento. Cuando es visible, el PKC412 dependiente de dosis disminuye la expresión de CD63.

La Figura 10A-J es una representación gráfica de los efectos sinérgicos del fármaco sobre la proliferación de células HMG1. Las células HMC-1.1 que carecen de KIT D816V (FIG. 10A-F) y las células HMC-1.2 que exhiben KIT D816V (FIG. 10G-J) se incuban con medio de control (0) o varias combinaciones de fármacos (en proporción fija) según se indica, a 37ºC durante 48 horas para determinar los efectos antiproliferativos cooperativos. FIG. 10A,C,B,G,I: Después de incubación con fármacos únicos (FIG. 10A: PKC412, \sqbullet-\sqbullet; ANN107, \bullet-\bullet; FIG. 10C: STI571, \sqbullet-\sqbullet; AMN107, \bullet-\bullet; FIG. 10E: S1T571, \sqbullet-\sqbullet; PKC412, \bullet-\bullet; FIG. 10G: PKC412, \sqbullet-\sqbullet; AMN107, \bullet-\bullet; FIG. 10I: PKC412, \sqbullet-\sqbullet; 2CdA, \bullet-\bullet) o combinaciones de fármaco (\ding{115}-\ding{115}), las células se analizan para captación de ^{3}H-timidina. Los resultados muestran la captación de ^{3}H- timidina como porcentaje de control (medio de control, denominado como "0" o as "100%") y representan la media \pm D.E. por triplicado de un experimento típico (se obtienen los resultados correspondientes en por lo menos otros 2 experimentos para cada combinación de fármaco). Las imágenes a la derecha (FIG. 10B,D,F,H,J) muestran los valores de índice de combinación determinados para cada fracción afectada de acuerdo con el método de Chou and Talalay^{39} utilizando el software calcusyn. Un valor del índice de combinación (CI) 1.0 indica un efecto aditivo, un CI mayor de 1.0 indica antagonismo, y un CI de menos de 1.0 indica sinergismo.

La Figura 11A-D es una representación de los efectos de dasatinib sobre la fosforilación KIT en células neoplásicas. Las FIGS. 11A,B representan la fosforilación de tirosina de KIT en células HMC-1.1 (FIG. 11A) y células HMC-1.2 (que exhiben KIT D816V) (FIG. 11 B) después de incubación en medio de control o varias concentraciones de dasatinib durante 4 horas. Las FIGS. 11C,D representan fosforilación KIT en células Ton.Kit.wt expuestas a doxicicuna (FIG.11C) y las células Ton.Kit.D816V.27 (FIG. 11D) después de incubación en medio de control (0) o dasatinib (10^{-3} - 16^{3} nM) durante 4 horas. Antes de exposición a fármaco, las células Ton.Kit.wt y células Ton.Kit.D816V.27 se mantienen en medio de control (control), o en doxiciclina durante 24 horas para inducir la expresión de KIT. En el caso de Ton.Kit.wt, las células también se exponen a SCF (100 ng/ml, 4 horas) para inducir fosforilación KIT (p-KIT). En todas las células, se conduce inmunoprecipitación utilizando el anti-KIT mAb 1C1. La inmunotransferencia Western se desarrolla utilizando el anti-fosfo-tyr-mAb 4G10 para detección p-KIT y el anti-KIT mAb 1C1 para detección de proteína KIT total (KIT).

La Figura 12F representa los efectos de AMN107 sobre la formulación de clúster inducida por KIT-D816V en células Ton. Kit.D816V.27. Las células se incuban sin doxiciclina (Co) o en doxiciclina (1 \mug/ml) en la ausencia o presencia de varias concentraciones de dasatinib o AMN107 según se indica durante 24 horas. Después de incubación, los números de clústeres se cuentan bajo un microscopio invertido, los resultados se expresan como porcentaje de formación de clúster comparada para mantener bobinas en medio de control (Co) y doxiciclina (= 100%) y representan la media D.E. de 3 experimentos independientes.

La Figura 13 es una representación de que el dasatinib regula por descenso la proliferación de células neoplásicas primarias en un paciente con SM positiva KIT D816V con leucemia asociada. Las células de médula ósea neoplásicas primarias se aíslan de un paciente con ASM positiva KIT D816V asociada con AMI. Las células aisladas se incuban en medio de control o en varias concentraciones de dasatinib (\bullet-\bullet), PKC412 (\sqbullet-\sqbullet), AMN107 (\ding{115}-\ding{115}), o imatinib (\ding{116}-\ding{116}), según se indica. La proliferación celular se cuantifica al medir captación de ^{3}H- timidina. Los resultados se expresan como porcentaje de control (las células se mantienen en medio de control 100%) y representan la media \pm D.E., por triplicado. En las células de médula ósea normales, no se observan efectos de los inhibidores de TK aplicados (no mostrado).

Descripción detallada

El problema a ser resuelto por la presente invención es el uso de una combinación de PKC412 y AMN 107 en el tratamiento de mastocitosis sistémica, especialmente SM asociada con la mutación c-KIT D816V oncogénica.

En la mayoría de todos los pacientes con mastocitosis sistémica (SM), que incluye SM activa y leucemia de mastocitos (MCL), las células neoplásicas expresan la mutación c-KIT D816v oncogénica. Esta mutación activa la cinasa tirosina (TK) del receptor KIT, que así representa un objetivo atractivo de terapia. Sin embargo, la mayor parte de los inhibidores de TK disponibles que incluyen S1T571 (imatinib; Novartis Pharma AG), fallan en bloquear la actividad de TK de KIT D816V a concentraciones farmacológicas. Proporcionamos evidencia de que los fármacos que objetivan TK novedosos PKC412 y AMN107 (Novartis) bloquean la actividad de TK de KIT mutado D816V y contraactúan con la proliferación de células Ba/F3 con expresión de KIT D816V inducida por doxiciclina así como también la proliferación de estirpe celular de leucemia de mastocitos humana HMC-1 que expresa esta mutación c-KIT. Se encuentra que el PKC412 es el agente más patente con valores IC_{50} de 50-200 nM y sin diferencias observadas entre células HMC-1 que exhiben o que carecen de KIT D816V. En contraste, el AMN107 exhibe efectos potentes solo en la ausencia de KIT D816V en células HMC-1 (IC_{50} 5-10 nM comparado con HMC-1 que expresa KIT D816V: IC_{50} 1-5 \muM). Se obtienen los resultados correspondiente con células Ba/F3 (que exhiben variante natural mutada D816V de KIT.

Posteriormente, se examina el efecto de PKC412 sobre MC neoplásicos primarios obtenidos de la médula ósea de un paciente con SM que exhibe KIT D816V. En línea con nuestros datos de estirpe celular, la captación de ^{3}H- timidina inhibida dependiente de dosis PKC412 en MC neoplásicos (IC_{50}: 50 nM) en este paciente, aunque no se encuentran efectos significativos arc con AMN107 (0.1-3 \muM) e imatinib (1\muM). Los efectos inhibidores de crecimiento de PKC412 y AMN107 en células HMC-1 se asocian con inhibición TK de KIT en experimentos fosfoblot, y con inducción de apoptosis según se evalúa mediante morfología convencional y mediante microscopia por electrón. Adicionalmente, se encuentra que el PKC412 regula por descenso la expresión de CD2 y CD63 (dos antígenos de superficie celular regulados por ascenso en SM) en células HMC-1. En los experimentos de coincubación, se encuentra en el PKC412 hace sinergia con AMN107, imatinib, y cladribina (2CdA) en la producción de inhibición de crecimiento en células HMC-1 que alojan KIT D816V así como también en células HMC-1 que carecen de KIT D816V. En resumen, nuestros datos demuestran que el PKC412 y AMN107 solos y en combinación contractuán con laproliferación de mastocitos neoplásicos que expresan la variante mutada D816V de KIT. Se pueden considerar ambos fármacos por lo tanto como agentes prometedores novedosos para objetivar la terapia en pacientes con SM activa y MCL.

Por lo tanto, la presente invención se relaciona con el uso de N-[(9S, 10R, 11R, 13R)-2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh: 3',2',1'-im]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (I) (aquí adelante: "PKC412"):

1

en combinación con 4-Metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-N-[5-(4-metil-1H-imidazol-1-il)-3-
(trifluorometil) fenil] benzamida de la fórmula (II) (aquí adelante. "AMN107"):

2

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera o ambos, para tratamiento de mastocitosis sistémica.

Las abreviaturas utilizadas aquí preferiblemente están dentro del contexto los siguientes significados dentro de esta descripción, a menos que se indique otra cosa:

ASM: mastocitosis sistémica activa

Bm: médula ósea

Cladribina: 2-clorodeoxiadenosina

FCS: suero de becerro fetal

IFN\alpha: interferón-alfa

IP: inmunoprecipitación

MCL: leucemia de mastocitos

PBS: solución salina amortiguada con fosfato

PE: ficoeritrina

Rh: humano recombinante

TA: temperatura ambiente

SCF: factor de citoblasto

SM: mastocitosis sistémica

SSM: mastocitosis sistémica quiescente

TK: cinasa tirosina

Wt: natural

Los términos generales utilizados aquí preferiblemente están dentro del contexto de esta descripción los siguientes significados, a menos que se indique otra cosa:

Cuando se utiliza la forma plural para los compuestos, sales, y similares, esta se toma por significar también un único compuesto, sal, o similar.

Pueden estar presentes cualesquier átomos de carbono asimétrico en la configuración (R)-, (S)- o (R,S), preferiblemente en la configuración (R)- o (S)-. Los compuestos pueden así estar presentes como mezclas de isómeros o como isómeros puros, preferiblemente como enantiómeros - diastereómeros puros.

La invención también se relaciona con tautómeros posibles de los compuestos de la fórmula I y fórmula II.

Las sales son especialmente las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la fórmula I y fórmula II. Los compuestos de la fórmula I y fórmula II se puede administrar secuencialmente o concurrentemente. Los compuestos de la fórmula I y fórmula II se pueden combinar en una única formulación o esta en formulaciones separadas.

Se forman tales sales, por ejemplo, como sales de adición ácida, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, de los compuestos de la fórmula I y/o fórmula II con un átomo de nitrógeno básico, especialmente las sales farmacéuticamente aceptables. Los ácidos inorgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos de halógeno, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos carboxílico, fosfónico, sulfónico o sulfámico, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azaleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tales como ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metano- o etano-sulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 1,5-naftaleno-disulfónico, ácido dodecilsulfúrico, ácido 2-, 3- o 4-metilbencenosulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metil-, N-etil- o N-propil-sulfámico, u otros ácidos protónicos orgánicos, tales como ácido ascórbico.

En la presencia de radicales cargados negativamente, tales como carboxi o sulfo, las sales se pueden formar con bases, por ejemplo sales de metal o amonio, tales como sales de metal alcalino o metal alcalinotérreo, por ejemplo sales de sodio, potasio, magnesio o calcio, o sales de amonio con amoniaco o aminas orgánicas adecuadas, tales como monoaminas terciarias, por ejemplo trietilamina o tri(2-hidroxietil)amina, o bases heterocíclicas, por ejemplo N-etil-piperidina o N,N'-dimetilpiperazina,

Cuando un grupo básico y un grupo ácido están presentes en la misma molécula, un compuesto de la fórmula I y/o fórmula II puede también formar sales internas.

Para propósitos de aislamiento o purificación también es posible utilizar sales no aceptables farmacéuticamente, por ejemplo picratos o percloratos. Para uso terapéutico, solo se emplean sales farmacéuticamente aceptables o compuestos libres (cuando sea aplicable en la forma de preparaciones farmacéuticas), y por lo tanto se prefieren estas.

En vista de la relación cercana entre los compuestos novedoso en la forma libre y aquellos en la forma de sus sales, que incluyen aquellas sales que se pueden utilizar como intermedios, por ejemplo en la purificación o identificación de los compuestos novedosos, cualquier referencia a los compuestos libres aquí anteriormente y aquí adelante se debe entender como la referencia también a las correspondientes sales, según sea apropiado y conveniente.

La estructura de los agentes identificados mediante números de código, nombres genéricos o comerciales se pueden tomar de la actual edición del compendio estándar "El Índice de Merck" o de las bases de datos, por ejemplo Patentes Internacionales (por ejemplo Publicaciones Mundiales IMS).

Se ha encontrado sorprendentemente que la combinación de AMN 107 y PKC412 posee propiedades terapéuticas, que se presenta particularmente útil como un inhibidor de actividad de cinasa tirosina y especialmente para rl tratamiento y profilaxis de enfermedades que incluyen KIT-D816V oncogénicas tales como mastocitosis sistémica.

El KIT-D816V, como se utiliza aquí anteriormente y aquí adelante, es la designación del producto de mutación del gen c-Kit en donde el ácido nucleico que codifica el ácido aspártico en el residuo 816 del polipéptido KIT se muta para codificar una valina. KIT-D816V también se refiere al producto de polipéptido del gen c-KIT oncogénico mutado.

La presente invención se relaciona así con el uso de la combinación de AMN107 y PKC412 para la preparación de un fármaco para el tratamiento de mastocitosis sistémica inducida por mutación c-KIT D816V oncogénica, u otras enfermedades asociadas con la mutación c-KIT D816V oncogénica o mutaciones similares que activan la cinasa tirosina.

La mastocitosis sistémica (SM) incluye SM inactiva, SM activa, y enfermedades hematológicas de células diferentes a mastocitos asociadas a SM y leucemia de mastocitos.

El término "mastocitosis" como se utiliza aquí, se relaciona con mastocitosis sistémica, por ejemplo mastocitoma, y también con neoplasmas de mastocitos caninos. La mastocitosis es un trastorno mieloproliferativo con opciones de tratamiento limitadas y generalmente un pronóstico pobre. La patogenia de mastocitosis se ha atribuido a la activación constitutiva del receptor de cinasa tirosina KIT. En una gran mayoría de pacientes con mastocitosis, la actividad de cinasa tirosina desregulada de KIT se debe a una mutación dentro del codón 816 de la proteína (D816V) que también confiere existencia a imatinib o mesilato de imatinib, el más reciente se comercializa como Gleevec® en los Estados Unidos o Glivec® en sí mismo, in vitro e in vivo.

Los mastocitos cumplen una función importante como las células efectoras primarias en los trastornos alérgicos mencionados aquí. La desgranulación mediada por antígeno específico IgE de mastocitos conduce a la liberación posterior de mediadores químicos y citocinas múltiples a la síntesis de leucotrienos. Adicionalmente, los mastocitos están involucrados en la patogenia de esclerosis múltiple.

Los neoplasmas de mastocitos ocurren tanto en humanos como en animales. En los perros, los neoplasmas de mastocitos se denopminan mastocitomas, y la enfermedad es común, representando el 7%-21% de tumores caninos. Se debe hacer una distinción entre la mastocitosis humana, que es usualmente transitoria o inactiva, y la neoplasia de mastocito canina, que se comporta de forma impredecible y es a menudo activa y metastásica. Por ejemplo, los mastocitomas solitarios humanos no hacen a menudo metástasis; en contraste, el 50% de los mastocitomas caninos se comportan en una forma maligna, según se estima por Hottendorf & Nielsen (1969) después de revisión de 46 informes publicados de tumores en 938 perros.

La participación del receptor KIT en la patogenia de mastocitosis sugerida por la observación de varias mutaciones que resultan en la activación constitutiva de KIT se han detectado en un número de estirpes de mastocitos. Por ejemplo, una mutación de punto en c-KIT humano, que origina la sustitución de Val por Asp816 en el dominio de fosfotransferasa y autoactivación del receptor, ocurre en una leucemia de estirpe de mastocitos humana a largo plazo (HMC-1) y en el codón correspondiente en dos estirpes de mastocitos de roedores. Más aún, se ha identificado esta mutación activante in situ en algunos casos de mastocitosis humana. Se han encontrado otras dos mutaciones activantes en la región de yuxtamembrana intracelular de KIT, es decir, la sustitución Val560Gly en la estirpe de mastocitos HMC-1 humana,
y una eliminación de aminoácido siete (Thr573-His579) en una línea de mastocitos de roedor denominada FMA3.

La presente invención tiene que ver particularmente con el uso de la combinación de AMN107 y PKC412 para la preparación de un fármaco para el tratamiento de mastocitosis sistémica.

En otra realización, la invención actual proporciona un método para tratar mastocitosis sistémica que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de AMN 107 y PKC412, o sales farmacéuticamente aceptables o profármacos de los mismos.

Preferiblemente la invención actual proporciona un método para tratar mamíferos, especialmente humanos, que sufren de mastocitosis sistémica que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad de la combinación que inhibe KIT-D816V de AMN107 y PKC412 o sales farmacéuticamente aceptables los mismos.

En la presente descripción, el término "tratamiento" incluye ambos tratamientos profiláctico o preventivo así como también curativo o tratamiento supresivo de la enfermedad, que incluye el tratamiento de pacientes en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que contraen la enfermedad así como también pacientes enfermos. Este término incluye adicionalmente el tratamiento para el retraso de la progresión de la enfermedad.

El término "curativo" como se utiliza aquí significa eficacia en el tratamiento de los episodios crecientes que involucran mastocitosis sistémica.

El término "profiláctico" significa la prevención del inicio o recurrencia de las enfermedades que involucran mastocitosis sistémica.

El término "retraso de la progresión" como se utiliza aquí significa la administración de el compuesto activo a pacientes que están en una pre-etapa o fase temprana de la enfermedad a ser tratada, en la cual los pacientes por ejemplo se diagnostican con una pre-forma de la enfermedad correspondiente o en la cual pacientes están en una condición, por ejemplo durante un tratamiento médico o una condición que resulta de un accidente, bajo lo cual se desarrollará similarmente una enfermedad correspondiente.

Este rango imprevisible de propiedades significa que el uso de la combinación de AMN107 y PKC412 es de particular interés para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mastocitosis sistémica.

Este efecto puede especialmente ser clínicamente apropiado para pacientes con mastocitosis sistémica.

Para demostrar que la combinación de AMN107 y PKC412 es particularmente adecuada para el tratamiento de mastocitosis sistémica con buen margen terapéutico y otras ventajas, se llevan a cabo ensayos clínicos en una forma conocida por la persona experta.

La dosificación precisa de la combinación de AMN107 y PKC412 a ser empleada para inhibir mastocitosis sistémica depende de varios factores que incluyen el anfitrión, la naturaleza y la severidad de la afección que se trata, el modo de administración. La combinación de AMN107 y PKC412 se puede administrar ya sea conjunta o independientemente mediante cualquier ruta, que incluye oralmente, parenteralmente, por ejemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intratumoralmente, o rectalmente, o entéricamente. Preferiblemente la combinación de AMN107 y PKC412 se administra oralmente, preferiblemente en una dosificación diaria de 1-300 mg/kg de peso corporal o, para primates más grandes, una dosificación diaria de 50-5000, preferiblemente 500-3000 mg. Una dosificación diaria oral preferida es 1-75 mg/kg de peso corporal o, para primates más grandes, una dosificación diaria de 10-2000 mg, se administra como una única dosis o dividida en múltiples dosis, tales como dos veces de dosificación diaria.

La dosificación precisa de PKC412 administrada en combinación con AMN107 depende de varios factores que incluyen el anfitrión, la naturaleza y la severidad de la afección que se trata, el modo de administración. Sin embargo, en general, se alcanzan resultados satisfactorios cuando se administra PKC412 parenteralmente, por ejemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intratumoralmente, o rectalmente, o entéricamente, por ejemplo, oralmente, preferiblemente intravenosamente o, preferiblemente oralmente, intravenosamente a una dosificación diaria de 0.1 a 10 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 1 a 5 mg/kg de peso corporal. En los ensayos humanos una dosis total de 225 mg/día es más presumiblemente la Dosis Tolerada Máxima (MTD). Una dosificación diaria intravenosa preferida es 0.1 a 10 mg/kg de peso corporal o, para primates más grandes, una dosificación diaria de 200-300 mg. una dosificación intravenosa típica es 3 a 5 mg/kg, tres a cinco veces en una semana.

Más preferiblemente, el PKC412 se administra oralmente, mediante formas de dosificación tales como microemulsiones, geles suaves o dispersiones sólidas en dosificaciones hasta de aproximadamente 250 mg/día, en particular 225 mg/día, administrada una vez, dos veces o tres veces diariamente.

Usualmente, una pequeña dosis se administra inicialmente y la dosificación se incrementa gradualmente hasta que se determina la dosificación óptima para el anfitrión bajo tratamiento. El límite superior de dosificación es aquel impuesto por los efectos colaterales y se puede determinar por ensayo del anfitrión a ser tratado.

Las combinaciones de AMN 107 y PKC412 se pueden combinar, independientemente o juntas, con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros adyuvantes farmacéuticos convencionales y administrar entéricamente, por ejemplo oralmente, en la forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos oblongos, etc. o parenteralmente, por ejemplo, intraperitonealmente o intravenosamente, en la forma de soluciones o suspensiones inyectables estériles. Las composiciones enteral y parenteral se pueden preparar mediante medios convencionales.

La combinación de AMN107 y PKC412 se puede utilizar sola o combinada con por lo menos otro compuesto farmacéuticamente activo para uso en las patologías. Estos compuestos activos se pueden combinar en la misma preparación farmacéutica o en la forma de preparaciones combinadas "equipo de partes" en el sentido en los patrones de combinación se pueden dosificar independientemente o mediante uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades destacadas de los patrones de combinación, es decir, simultáneamente o en diferentes puntos de tiempo. Las partes de el equipo de partes se puede luego, por ejemplo, administrar simultáneamente o por etapas cronológicamente, que es en diferentes puntos de tiempo y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del equipo de partes. Ejemplos no limitantes de los compuestos que se pueden citar para uso en combinación con la combinación de AMN 107 y PKC412 son fármacos para quimioterapia citotóxica, tales como citosina arabinosida, daunorubicina, doxorubicina, ciclofosfamida, VP-16, o imatinib etc. Adicionalmente, la combinación de AMN107 y PKC412 se puede combinar con otros inhibidores de transducción de señal u otros fármacos que objetivan el oncogén con la expectativa de que podría resultar sinergia significativa.

La invención adicionalmente pertenece a la combinación de AMN107 y PKC412 como se describe aquí con imatinib para el tratamiento de las enfermedades y afecciones descritas aquí. La administración de tal una combinación se puede efectuar al mismo tiempo, por ejemplo en la forma de una composición o preparación farmacéutica combinada, fija, o secuencialmente o escalonada. La administración de la combinación de AMN 107 y PKC412 en una forma de dosificación como se describe aquí y de imatinib en su forma comercial de GLEEVEC® en los Estados Unidos (GLIVEC® en Europa) y se prefiere concurrentemente con las dosificaciones previstas para estas formas de dosificación.

El tratamiento de mastocitosis sistémica con la anterior combinación se puede denominar tratamiento de primera línea, es decir, el tratamiento de una enfermedad diagnosticada recientemente sin ninguna quimioterapia precedente o similares, o también se puede denominar tratamiento de segunda línea, es decir, el tratamiento de la enfermedad después de tratamiento precedente con imatinib o la combinación de AMN 107 y PKC412, dependiendo de la severidad o estado de la enfermedad así como también la afección completa del paciente etc.

La eficacia de la combinación de AMN107 y PKC412 para el tratamiento de mastocitosis sistémica se ilustra por los resultados de los ejemplos. Estos ejemplos ilustran la invención sin en ninguna forma limitar su alcance.

Ejemplos Ejemplo 1 Estudio clínico

El efecto del compuesto (II) los niveles de transcriptos c-KIT y el estado de la mutación del c-KIT en células malignas se toma de la sangre y de la médula ósea y se evalúa. La SM puede resultar como la actividad quinasa alterada. La SM asociada con el c-KIT D816V también puede resultar de una mutación de activación en el gen KIT. El Q-RT-PCR para el transcripto c-KIT D816V a valores iniciales, el ciclo 1 día 15, ciclo 1 día 2, 3 día 28 y cada tercer ciclo y posteriores, fin del estudio. Análisis de mutación del c-KIT: Tres grupos separados, cada uno con las siguientes poblaciones de pacientes: Revaloración SM: tasa de respuesta después de 3 meses de terapia.

Ejemplo 2 Combinación de AMN107 y PKC412

En el estudio actual, mostramos que los inhibidores TK PKC412^{5} y AMN 107^{27} contrarrestan el crecimiento de células MC y Ba/F3 humanas neoplásicas que expresan bastante eficientemente el KIT D816V. El PKC412 parece ser el compuesto más potente en este aspecto. También mostramos que el PKC412 y el AMN 107 sinergizan en la producción de la inhibición del crecimiento de células HMC-1 que expresan o que carecen el KIT D816V. Estos datos muestran que el PKC412 y el AMN 107 pueden ser fármacos dirigidos promisorios novedosos para el tratamiento de mastocitosis.

Materiales y métodos Reactivos

Los inhibidores TK imatinib (STI571), AMN107^{27}, y PKC412^{5} se obtienen de Novartis Pharma AG (Basilea, Suiza). Las soluciones madre de AMN107 y PKC412 se preparan al disolver en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Merck, Darmstadt, Alemania). El factor de células madre (SCF) humano recombinante (rh) de Strathmann Biotech (Hannover, Alemania), medio RPMI 1640 y suero de becerro fetal (FCS) de PAA laboratorios (Pasching, Austria), L-glutamina y medio modificado de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) de Gibco Life Technologies (Gaithersburg, MD), 3H-timidina de Amersham (Buckinghamshire, UK), yoduro de propidio de Sigma (St. Louis, MO). Se obtiene Interferón alfa (IFN\alpha) de Roche (Basilea, Suiza), 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, denotado aquí como "2CdA") de Janssen Cilag (Titusville, NJ), e interleucina rh-4 (IL-4) de Peprotech (Rocky Hill, NJ). Los anticuerpos monoclonales (mAbs) etiquetados con ficoeritrina (PE) IVTO85 (CD2), WM15 (CD13), YB5.B8 (CD117), N6B6.2 (CD164), y 97A6 (CD203c) se compran de Becton Dickinson (San José, CA), y el mAb PE conjugado CLB-gran12 (CD63) de Immunotech (Marsella, Francia).

Células HMC-1 que expresan o que carecen del c-KIT D816V

Estirpes de mastocitos humanos HMC-1^{28} generados de un paciente con leucemia de mastocitos, fueron amablemente suministradas por el Dr. J. H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN). Se utilizan dos subclones de HMC-1, a saber HMC-1.1 que cosecha la mutación c-KIT V560G pero no la mutación c-KIT D816V^{20}, y un segundo subclón, HMC-1.2, que cosechan ambos las mutaciones c-KIT, es decir V560G y D816V.^{20}. Se hacen crecer células HMC-1 en IMDM complementado con 10% FCS, L-glutamina, y antibióticos a 37ºC y 5% CO_{2}. Las células HMC-1 se redescongelan a partir de solución madre original cada 4 a 8 semanas y se pasan semanalmente. Como control de `estabilidad fenotípica, se revisan periódicamente las células HMC-1 para i) la presencia de gránulos metacromáticos, ii) expresión de superficie KIT, y iii) efecto de regulación descendente del IL-4 (100 U/ml, 48 horas) en la expresión^{29} del KIT. Se hacen estos experimentos de control antes de cada conjunto de experimentos, y solo se utilizan las células HMC-1 que presentan todas las características del clon^{29}.

Células BA/F3 se utilizan con expresión inducible de WT c-KIT o c-KIT D816V

La generación de células BA/F3 con la expresión inducible por doxiciclina de wt c-KIT (Ton. Kit. wt) o c-KIT D816V se describe en detalle en otra parte^{30}. En resumen, las células BA/F3 expresan el transactivador tet inverso^{31, 32} se co-transfectan con el vector pTRE2 (Clontech, Palo Alto, CA) que contiene el cADN c-KIT D816V (o wt c-KIT cADN, ambos suministrados amablemente por el Dr. J. B. Longley, Columbia University, New York, USA) y pTK-Hyg (Clontech) por electroporación. Después de la electroporación, las células transfectadas amablemente se seleccionan al hacerlas crecer en higromicina, y se clonan al imitar la dilución. En el presente estudio, el subclon Ton.Kit.D816V.27 se utiliza en todos los experimentos. Estas células Ton.Kit.D816V presentan una baja velocidad de crecimiento después de la exposición al doxiciclina^{30}. Como se evalúa por transferencia Western, la inmunocitoquimica, PCR, y análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), la expresión del KIT D816V se puede introducir en células Ton.Kit.D816V.27 dentro de 12 horas y luego de exposición a doxiciclina (1 \mug/ml) ^{30}.

Aislamiento de mastocitos neoplásicos primarios

Se obtiene MC médula ósea (mo) primaria de un paciente femenino (de edad 54) con mastocitosis sistémica patente mastocitosis sistémica larvada, una subvariante distinta de SM caracterizada por la participación de múltiples linajes hematopoiéticos y la detección de c-K1T D816V en células mieloides de linaje MC y no MC ^{34-36}. Para propósitos de control, la mo obtenida de un paciente que sufre de linfoma maligno (sin participación de mo) quienes se sometieron a ensayo, se analizan. Ambos pacientes subieron con sentimiento informado antes de función de la mo. La mo aspira se obtiene de la cresta iliaca posterior y se recolecta en jeringas que contienen heparina libre de conservantes. Las células se colocan en capas sobre Ficoll para aislar las células mononucleares (MNC). Se encuentra que las fracciones MNC contienen 5% de MC en los pacientes con SSM, y menos de 1% en la muestra de control (mo normal). La viabilidad es >90%. La presencia de mutación c-KIT D816V en mo MNC en el paciente con SSM que se confirma mediante RT-PCR y se desarrollan las RFLP como se menciono anteriormente^{16}.

Análisis de fosforilización kit mediante inmunotransferencia Western

Células HMC-1 (10^{6}/ml) y Ba/F3 (10^{6}/ml) que contienen wt KIT (Ton. Kit. wt) o KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27) se incuban con PKC412 (1 \muM), AMN107 (1 \muM), imatinib (1 \muM), o medio de control a 37ºC durante 4 horas. Antes de la exposición a los fármacos inhibidores, se incuban células Ton.Kit.D816V.27 con doxiciclina (1 \mug/ml) a 37ºC durante 24 horas para inducir expresión de KIT. en caso de las células Ton. Kit. wt, la fosforilación KIT se induce al agregar rhSCF (100 ng/ml). Se desarrolla inmunoprecipitation (IP) e inmunotransferencia Western como se describió previamente^{32}. En resumen, se lavan las células a 4ºC y se resuspenden en amortiguador RIPA (amortiguador 1ml por 10^{8} células) que consisten de 50 mM Tris, 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), 1% nonidet P40 (NP-40), 0.25% de ácido desoxicólico, 0.1% de sulfato de dodecilo de sodio (SDS), 1 mM de ácido etileno-diaminetetraacético (EDTA), 1 mM de fluoruro de sodio (NaF), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF) y 1 mM de ortovanadato de sodio (Na_{3}VO_{4}). Después de incubación en amortiguadores RIPA complementado con coctel inhibidor de proteinasa (Roche) durante 30 minutos a 4ºC (centrifugado vigorosamente cada 5 minutos), se centrifugan los lisatos para remover partículas insolubles. Para IP, los lisatos de 1 x 10^{7} células se incuban con anticuerpo anti-KIT SR1^{37} (amablemente suministrada por el Dr. V. Broudy, Universidad de Washington, Seattle, WA) o con el anticuerpo anti-KIT IC1^{38} (amablemente suministrada por el Dr. H. J. Bühring, Universidad de Tübingen, Alemania) y módulos Sefarosa de proteínas G (Amersham) en amortiguador IP (50 mM Tris-Cl, pH 7.4, 150 mM de NaCl, 100 mM NaF, y 1% NP40) a 4ºC durante la noche. Luego, los glóbulos se lavan 3 veces en amortiguador IP. Los lisatos y los inmunoprecipitados se separan luego bajo condiciones de reducción mediante electroforesis de gel de policrilamida SDS al 7.5% y se transfieren a una membrana de microcelulosa (Protran, Schleicher & Schuell, Keene, NH) en amortiguador que contiene 25 mM Tris, 192 mM de glicina, y 20% de metanol a 4ºC. Luego se bloquean las membranas durante 1 hora en 5% de reactivo de bloqueo (Roche) y luego se incuban con anticuerpo anti-KIT 1C1 o con el anticuerpo monoclonal 4G 10 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) dirigido contra proteínas tirosinas fosforiladas, a 4ºC durante la noche. La reactividad del anticuerpo se hace visible mediante anticuerpo IgG antiratón de oveja y reactivo de detección PS-3 Lumingen (ambos de Amersham), y una película de exposición CL-X (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Medición de captación de ^{3}H-timidina

Para determinar, el efecto del fármaco y la inhibición de crecimiento, se incuban células HMC-1 y células Ba/F3 que contienen SCF activado wt KIT (Ton. Kit. wt) o KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27) con varias concentraciones de PKC412 (100 \muM -10\muM), AMN107 (1 nM - 100 \muM), o imatinib (3 nM - 300 \muM) en placas de cultivo de 96 pozos (PTT, Trasadingen, Suiza) a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 48 horas. En los experimentos de evolución en el tiempo, HMC-1 a PKC412 (300 nM) durante varios periodos (1, 12, 24, 36, y 48 horas). En experimentos seleccionados, se incuban células HMC-1 (ambos subclones) con varias concentraciones de IFN\alpha (0.1- 500,000 U/ml) o 2CdA (0.005 - 10 \mug/ml). Las células primarias (células mo de un paciente con SSM y células mo de control) se cultivan en la presencia o ausencia de inhibidores (PKC412, 50-500 nM; AMN107, 100 nM-30 \muM; imatinib, 1 \muM) durante 48 horas.

Después de incubación, se agrega 1 \muCi de ^{3}H-timidina a cada pozo y se mantiene durante 12 horas (37ºC). Luego, se cosechan las células en membranas de filtro (Packard Bioscience, Meriden, CT) en un cosechador Filtermate 196 (Packard Bioscience). Los filtros se secan al aire y se cuenta la radioactividad unida en un contador \beta (Top-Count NXT, Packard Bioscience).

En un conjunto separado de experimentos, se determinan los efectos de las combinaciones fármaco (aditivo versus sinérgico) en el crecimiento de MC neoplásico. Para este propósito, se exponen células HMC-1 (ambos subclones) a varias combinaciones de fármacos (PKC412, AMN107, imatinib, IFN\alpha, 2CdA) en una relación fija de concentraciones de fármacos. La interacción de fármacos (aditivo versus sinérgico) se determina al calcular la combinación de valores índice utilizando un software disponible comercialmente (Calcusyn; Biosoft, Ferguson, MO) ^{39}. Todos los experimentos se desarrollan por triplicado.

Evaluación de apoptosis mediante microscopio de electrones y morfología convencional

Los efectos de los inhibidores TK en apoptosis en células HMC-1 se analizan mediante examen morfológico, citometría de flujo y microscopio de electrones. En experimentos típicos, se incuban células HMC-1 con varias concentraciones de PKC412 (500 nM - 1 \muM), AMN107 (50 nM - 10 \muM), imatinib (50 nM -10 \muM) o medio de control en placas de cultivo de 6 pozos (PTT) en medio IMDM que contiene 10% de FCS a 37ºC durante 24 horas. El porcentaje de células apoptósicas se cuantifica en preparaciones de citospin teñidas Wright-Giemsa. La apoptosis se define de acuerdo con el criterio citomorfológico convencional (encogimiento de célula, condensación o estructura de cromatina) ^{40}.

Para confirmar la apoptosis en células HMC-1, se realiza examen con microscopio electrónico como se describe^{41, 42} utilizando células HMC-1 (ambas subclones) expuestas a PKC412 (500 nM, 900 nM, o 1 \muM), AMN107 (1 \muM), imatinib (1 \muM), o medio de control en frascos de cultivo plástico 25 ml (PTT) durante 24 horas. Después de incubación, se lavan las células y se fijan en 2% de paraformaldehído, 2.5% de glutaraldehído, y 0.025% de CaCl_{2} amortiguado en 0.1 mol/L de amortiguador de cacodilato de sodio (pH 7.4) a temperatura ambiente (RT) durante 60 minutos. Luego, se lavan las células 3 veces en 0.1 mol/L de amortiguador de cacodilato de sodio, se suspende en 2% de agar, y se centrifuga. Los glóbulos se fijan posteriormente con 1.3% de OsO4 (amortiguado en 0.66 mol/L colidina) y se tiñen "en bloque" en 2% de amortiguador de maleato de sodio y acetato de uranilo (pH 4.4) durante 2 horas a RT. Luego, se enjuagan los glóbulos, se deshidratan en serie de alcohol, y se embeben en EPON 812. Se cortan secciones ultra delgadas (85 nM) y se colocan en rejillas de oro. Las secciones se contrastan en acetato de uranilo y citrato de plomo, y se ven en un microscopio de electrones de transmisión JEOL 1200 EX II (JEOL, Tokyo, Japan). Se determina la presencia de células apoptósicas utilizando el criterio morfológico convencional (ver arriba).

Evaluación de apoptosis mediante ensayo de túnel y citometría de flujo

Para confirmar apoptosis en células HMC-1 se exponen a PKC412 (1 \muM), AMN107 (1 \muM), o imatinib (1 \muM) durante 24 horas, se aplica un ensayo de Tunel (etiquetado de extremo Nick de fluorescencia dUTP mediada por transferasa de Terminal) se aplica como se describió previamente^{43, 44}. En resumen, se lavan primero las células en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) se fija en 1% de formaldehido a pH 7.4 a 0ºC durante 15 minutos. Luego, se tartan las celulas con 70% de etanol (enfriada con hielo) durante 1 hora, se lava con PBS, y se incuba en solución de reacción de transferasa terminal que contiene CoCl_{2}, desoxi-nucleotidil-exotransferasa de ADN, y biotin-16-2'-desoxi-uridina-5'-trifosfato (preparada de acuerdo a las instrucciones del fabricante Boehringer Mannheim, Alemania) a 37ºC durante 10 minutos. Después de incubación, se lavan las células y luego se incuban con Fluoresceína Estreptavidina (Boehringer Mannheim) (10 \mug/ml) a 37ºC durante 20 minutos. Luego se lavan las celulas HMC-1 y se analizan con un microscopio de fluorescencia Nikon Microphot-FXA (Tokio, Japón).

Para determinación de citometría de flujo de la apoptosis y viabilidad celular, se desarrolla teñido de yoduro de propidio/anexina V combinada. Para este propósito, se exponen células HMC-1 a PKC412 (0.5, 1, y 2.5 \muM), AMN107 (0.5, 1, y 2.5 \muM), imatinib (0.5, 1, y 2.5 \muM), o medio de control a 37ºC durante 24 horas. Después de esto, se lavan las células en PBS y luego se incuban con anexina V-APC (Alexis Biochemicals, Lausen, Suiza) en amortiguador de unión que contiene HEPES (10 mM, pH 7.4), NaCl (140 mM), y CaCl_{2} (2.5 mM). Después de esto, se agrega yoduro de propidio (1 \mug/ml). Luego se lavan las células y se analizan por citometría de flujo en un FACSCalibur (Becton Dickinson).

Evaluación de la expresión por antígeno de superficie ligados a la superficie en células HMC-1

Se determina la expresión de un antígeno de superficie celular en células HMC-1 que llevan el KIT D816V (células HMC-1.2) mediante citometría de flujo después de cultivo de corto plazo (durante 24 horas) en medio de control o medio complementado con inhibidores TK (PKC 412, 1\muM, AMN107, 1 \muM; imatinib, 1\muM). En experimentos de selección, varias concentraciones de PKC412 (50, 100, 250, 500 y 1000 nM) se aplica. Después de incubar fármacos, que lavan las células HMC-1 y que someten a citometría de flujo de color único utilizando anticuerpos PE-conjugados contra antígenos MC conocidos por ser expresados mediante un neoplásico en (C normal) o se expresan una tapa de mastopoyesis (CD2, CD13, CD63, CD117, CD164, CD203c). ^{45-47}. Se desarrolla citometría de flujo en un FACSan (Becton Dickinson) como se describió previamente.^{29}

Análisis estático

Para determinar la significancia en las diferencias entre los índices de proliferación, la apoptosis, y los niveles de presión de superficie después de exposición de células HMC-1 a inhibidores, se aplica la prueba T de student para muestras dependientes. Los resultados se consideran estadísticamente significativos cuando p es < 0.05.

Resultados Efectos de PKC412 y AMN107 en actividad TK del KIT mutado D816V

Según se evalúa por IP e inmunotransferencia Western, el PKC412 (1 \muM) reduce la fosforilación en un Kit en células HMC-1.1 (que presenta la mutación c-KIT V560G pero no la mutación c-KIT D-816V) así como también en células HMC-1.2 que cosechan el V560G mutado así como también la variante D816V mutada del KIT (figura 1 A y 1B).el inhibidor TK novedoso AMN107 (1\mu) reduce fuertemente la fosforilación en KIT en células HMC-1.1, pero solo muestran un efecto débil en la fosforilación KIT en células HMC-1.2 en 1\mu. De manera similar, el imatinib (1\mu) reduce la fosforilación de KIT en células HMC-1.1, pero no inhiben la fosforilación KIT en células HMC-1.2 (figuras 1 A y 1B). En una siguiente etapa, examinamos los efectos de los inhibidores TK en células Ba/F3 que exhiben wt KIT (Ton.KIT) o KIT D816V (Ton.Kit D816V) Ton.Kit.D816V.27 después de exposición a doxiciclina. En células Ton. Kit. Wt el KIT parece estar fosforilado en la presencia, pero no en la ausencia) de SCS mientras que el KIT se encuentra que se fosforila constitutivamente en células Ton. Kit. D816V.27 (figura 1C). Como es visible en la figura 1 C todos los inhibidores 3TK (PKC412, ANM107, Imatinib, cada uno (1\muM)) reducen la fosforilación por SCF del KIT en células Ton. KIT. Wt. Por contraste, solo el PKC 412, y a un menor grado el AMN107, reducen la fosforilación independiente del SCF del KIT en células Ton. Kit. D816V-27. El Imatinib (1\muM) no muestra afecto detectable en la fosforilación del KIT en estas células (figura 1D). Estos datos muestran que el PKC412 es un potente inhibidor novedoso de la actividad TK del wt KIT, KIT V560G, y KIT D816V, y que el AMN107 es un potente inhibidor novedoso del wt KIT y el KIT V560G, y un inhibidor más débil de la (auto) fosforilación del KIT
D816V.

Efectos de inhibidores TK en la captación de ^{3}H-itimidina en células HMC-1

En experimentos de evolución de tiempo, los efectos inhibidores máximos del PKC412, AMN107 e Imatinib en el crecimiento de células HMC-1.1 y células HMC-1.2 se ve después de 36-48 horas. La figura 2A muestra el efecto dependiente del tiempo del PKC412 (300 nM) sobre el crecimiento de células HMC-1.2. Como se muestra en la figura 2B y 2C, el PKC412 y el AMN107 se encuentra que contra restan la captación de ^{3}H timidina en células HMC-1.1 y células HMC-1.2 en una forma dependiente de la dosis. De manera interesante, el IC_{50} para los efectos del PKC412 en estos 2 subclones parece estar en el mismo rango (50-250 en nM) (figura 2B). En contraste los valores IC_{50} para los efectos del AMN107 sobre la proliferación son significativamente mayores en células HMC-1.2 (1-5 \muM) comparados a los encontrados en células HMC-1.1 (3-10 nM) (figura 2C). Como se espera el Imatinib solo es efectivo en concentraciones farmacológicamente importantes en células HMC-1.1 (Ic_{50}: 10-30 nM), aunque no tiene efectos antiproliferativos significativos del Imatinib en las células HMC 1.2 (figura 2D) que confirman los datos anteriores^{20-22}. Una observación interesante, es que el AMN 107 es el compuesto más potente (sobre una base molar) cuando se comparan los efectos inhibidores del crecimiento de los 3 fármacos el células HMC-1.1 que exhiben la mutación c-KIT V560G (pero no la mutación c-KIT D816V) (figuras 2B-D).

Efectos de inhibidores TK en el crecimiento de células BA/F3 que expresan WT KIT o KIT D816V

Como se muestra en la figura 3 A se encuentra que todos los inhibidores 3TK contrarrestan el crecimiento del SFC de células doxiciclina expuestas de células Ton. Kit.D816V.27 (que expresan KIT) expuestas a doxiciclina en una forma dependiente de dosis con valor IC_{50} de 3-30nM para PKC412, 30-300nM para AMN107, 30-30nM para Imatinib. Por contraste.

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Como se muestra en la figura 3A, se encuentra que todos los inhibidores 3 TK contrarrestan el crecimiento dependiente del SCF células doxiciclinas expuestas de células Ton. Kit. Wt (que expresan KIT) expuestas a doxiciclina en una forma dependiente de dosis con valores IC50 de 3-30 nM para PKC412, 30-300 nM para AMN107, y 3-30 nM para imatinib. Por contraste, en células Ton. Kit. D816V, solo el PKC412 (IC50: 100-300 nM), y a un menor grado AMN107 (IC50: 1-3 \muM) se encuentra que inhiben la incorporación de ^{3}H-timidina, mientras que no se tiene efecto significativo con imatinib sobre el rango de dosis probado (Figura 3B). Ninguno de los tres inhibidores utilizado se encuentra que contrarresta el crecimiento de las células Ton.Kit.wt o Ton.Kit.D816V.27 en ausencia de doxiciclina, es decir en la ausencia de KIT (Figura 3A y 3B). En experimentos de control adicionales, ni la doxiciclina (1 \mug/ml), ni los inhibidores TK (imatinib, PKC412, AMN107), muestran efectos inhibidores de crecimiento en células Ba/F3 de control (no transfectadas) (no mostradas).

PKC412 y AMN107 contrarrestan el crecimiento de células (mastocitos) neoplásicas principales que expresan KIT D816V

Para confirmar los efectos anti-proliferativos de PKC412 y AMN107 en mastocitos sistémicos, examinamos la respuesta de la médula ósea neoplásica principal (mo) derivada MC en un paciente con mieloma discente SM, una subvariante de SM en la que la mayoría de células mieloides (MC así como también células de linaje no MC) presentan KIT D816V. De hecho, aunque la pureza del MC es de solo 4%, la mayor parte de las células mieloides en esta muestra presentan KIT D816V. En estas células mo neoplásicas, el PKC412 y el AMN107 se encuentra que inhiben la captación espontanea del ^{3}H-timidina en una forma dependiente de la dosis, mientras que no se ve efecto significativo con imatinib (1 \muM) (Figura 4). En la muestra de control (mo normal, sin enfermedad hematológica), el PKC412 no muestra efecto en la captación del ^{3}H-timidina (no mostrado).

PKC412 y AMN107 inducen apoptosis en células HMC-1

Para explorar los mecanismos que subyacen alrededor a los efectos inhibidores de crecimiento del PKC412 y AMN107 en MC humano neoplásico que exhibe o que le falta KIT D816V, analizamos los síntomas morfológicos y bioquímicos de la apoptosis en células HMC-1.1 y células HMC-1.2 después de exposición a fármaco. En estos experimentos, se encuentra que el PKC412 induce la apoptosis en subclones HMC-1 en una forma dependiente de dosis (Figura 5A y 5B). También se encuentra que el AMN107 induce la apoptosis en subclones HMC-1 en una forma dependiente de dosis, pero el efecto de este compuesto es mucho más pronunciado en células HMC-1.1 (Figura 5C) comparado con aquella encontrada en células HMC-1.2 (Figura 5D). De manera similar, se encuentra que imatinib produce apoptosis en células HMC-1.1 (Figura 5E), pero no muestra efecto en células HMC-1.2 (Figura 5F). Los efectos que inducen la apoptosis de los fármacos, en las células HMC-1 se pueden confirmar mediante microscopio electrónico. De nuevo, todos los fármacos (cada de 1 \muM) se encuentra que induce la apoptosis en células HMC-1.1, mientras que en células HMC-1.2, solo el PKC412 y a un menor grado de AMN107, se encuentra que inducen apoptosis en células HMC-1.2. Figura 6 muestra el efecto inductor de la apoptosis del PKC412 (1 \muM, 24 horas) en células HMC-1.2. Como es visible, muchas de las células HMC-1 expuestas a PKC412 (Figura 6B-D) exhiben síntomas ultra estructurales típicos de la apoptosis comparado con células que se mantienen en medio de control (Figura 6A). Finalmente, somos capaces de demostrar los efectos apoptosis del PKC412 y AMN107 en células HMC-1 mediante teñido de yoduro de propidio/anexinaV combinada y citometría de flujo (Figura 7) así como también un ensayo de Tunel (Figura 8). En ambos ensayos, el PKC412 (1 \muM) y a un menor grado AMN107 (1 \muM) se encuentra que induce apoptosis en HMC-1.2, mientras que el imatinib no muestra efectos (Figuras 7 y 8E-H). Por contraste, las células HMC-1.1, todos los 3 componentes encontrados inducen apoptosis como se evalúa mediante ensayo de Tunel (Figura 8A-D).

Estos datos proporcionan evidencia de que los efectos inhibidores de crecimiento de PKC412 y AMN107 sobre células HMC-1 se asocian con inducción de apoptosis.

Expresión de PKC412 regulada descendentemente de antígenos de superficie celular relacionados con SM y ligados a activación sobre células HMC-1

Varios antígenos de superficie celular que se (sobre)expresan típicamente en neoplásicos en SM pueden cumplir una función en la proliferación, activación, o distribución de células neoplásicas.^{45,46} Algunas de estas moléculas se puede regular en forma descendente directamente por la variante mutada D816V de KIT.^{30} Por lo tanto preguntamos si el PKC412, AMN107, o imatinib, podría influenciar la expresión de antígenos de superficie celular sobre las células HMC-1.2. Se encuentra que las células HMC-1.2 no estimuladas expresan LFA-2 (CD2), aminopeptidasa-N (CD13), CD63, KIT (CD117), CD 164, y E-NPP3 (CD203c) que confirman los datos previos.^{45-47} La incubación de células HMC-1.2 con PKC412 resulta en una disminución significativa en la expresión de CD2, CD63, y CD164 (p<0.05) (Figura 9A). En contraste, no se observan efectos significativos de PKC412 sobre la expresión de CD13 o CD203c (Figura 9A). En el caso de KIT, una disminución leve de la expresión en células HMC-1.2 se encuentra luego de exposición a PKC412 (así como también en exposición a AMN107 o imatinib), pero el efecto no es significativo (p>0.05) (Figura 9A). Se encuentra que los efectos de PKC412 sobre la expresión de CD2 y CD63 son dependientes de dosis. La Figura 9B muestra los efectos de varias concentraciones de PKC412 sobre la expresión de CD63 en células HMC-1.2. En contraste con PKC412, no se observan efectos significativos de AMN107 o imatinib en la expresión de antígenos CD en células HMC-1.2 (Figura 9A).

El PKC412 coopera con otros fármacos objetivados y convencionales en la producción de inhibición de crecimiento en células HMC-1

Según la evaluación de la incorporación de ^{3}H-timidina, se encuentra que el PKC412 coopera con el AMN107 en producción de inhibición de crecimiento en células HMC-1.1 y HMC-1.2 (Figura 10; Tabla 1). En el caso de células HMC-1.1, se encuentra que la interacción de fármaco es claramente sinérgica, mientras que en las células HMC-1.2, las interacciones son aditivas en lugar de sinérgicas (Figura 10; Tabla 1). Adicionalmente, se encuentra que el PKC412 y 2CdA, fármacos utilizados exitosamente para tratar mastocitosis activa, inhiben la proliferación de las células HMC-1.1 en una forma sinérgica, y se observa el mismo efecto sinérgico con el PKC412 e imatinib (Tabla 1). De nuevo, sin embargo, no se observa efecto sinérgico claro del PKC412 y 2CdA sobre la proliferación de las células HMC-1.2. También, el AMN 107 e imatinib producen efectos inhibidores sinérgicos solo en células HMC-1.1 (Figura 10), pero no en células HMC-1.2 que llevan KIT D816V (Tabla 1). No se observan efectos sinérgicos o aditivos sobre la proliferación de las células HMC-1 cuando se combina con PKC412 e interferón-alfa (IFNa) o AMN107 y IFN\alpha (Tabla 1). Se muestra un resumen de las interacciones de fármaco en la Tabla 1.

Interacciones de fármaco en células HMN 1-1 y células HMN 1-2

3

Como se muestra en la Tabla 1, se determinan los efectos de varias combinaciones de fármaco sobre la proliferación de las células HMC-1.1 (Superior derecha, cuadrados blancos) y células HMC-1.2 (inferior izquierda, cuadrados grises) mediante ensayo de incorporación de 3H-timidina. Se prueba cada combinación de fármaco en por lo menos tres experimentos independientes. Se aplican los fármacos en una proporción fija y se determinan los efectos resultantes (y el tipo de interacción de fármaco) mediante el software calcusyn. Clasificación: +, efecto inhibidor de crecimiento sinérgico; +/-, efecto aditivo; -, menos que el efecto aditivo (antagonístico), n.t., no probado.

Discusión

La mutación c-KIT D816V somática es un defecto genético que conduce a la activación constitutiva del dominio TK del receptor KIT que está involucrado críticamente en la proliferación de MC (neoplásicos) y así en la patogenia de SM.^{13-17} Por lo tanto, hallazgos recientes se han enfocado en la identificación y desarrollo de los compuestos farmacológicos que pueden inhibir la actividad de TK de la variante mutada D816V de KIT y por lo tanto pueden inhibir la proliferación de MC neoplásicos en pacientes con SM.^{9-12} Describimos aquí que el inhibidor de TK PKC412, y en un menor grado el AMN107, inhiben la actividad de TK de KTT-D816V así como también la proliferación de MC humanos neoplásicos que llevan esta mutación c-KIT particular. Adicionalmente, demostramos que ambos fármacos cooperan uno con el otro así como también con otros fármacos objetivados y convencionales en la producción de inhibición de crecimiento en MC neoplásicos.

El PKC412 es un inhibidor relacionado con estaurosporina novedoso de PKC y de varios TKs que incluyen KDR, PDGFRA, FLT3, y KIT.^{5} En el estudio actual, mostramos que el PKC412 contrarresta la proliferación de MC humanos neoplásicos y células Ba/F3 que expresan la variante mutada D816V de KIT. Con respecto a las células Ba/F3, nuestros datos están en línea con los resultados de Growney et al.^{48} De forma interesante, se encuentra que el rango de dosis efectivo para las células Ba/F3 es el mismo como aquel encontrado en células HMC-1.2 que llevan KIT D816V. Otra observación interesante es que el IC_{50} para los efectos de PKC412 en los dos subclones de HMC-1 (que expresan o que carecen de KIT D816V) parece estar en el mismo rango. Finalmente, somos capaces de confirmar los efectos inhibidores del crecimiento del PKC412 para células (mastocitos) neoplásicas primarias que expresan KIT D816V. Debido a que la mutación c-KIT D816V es detectable en una mayoría de todos los pacientes con SM independiente del subtipo de la enfermedad,^{13-17} estos datos son de considerable importancia. De hecho, el PKC412 parece ser el primer inhibidor de TK según se dice contrarresta la proliferación de MC humanos que producen KIT D816V en la misma forma como los MC que expresan KIT wt. También cabe notar a este respecto, que los efectos inhibidores de PKC412 sobre las células positivas a KIT D816V claramente exceden las actividades antiproliferativas del AMN107 e imatinib. Con base en estas observaciones, el PKC412 parece ser un fármaco objetivado atractivo a ser considerado para el uso en ensayos clínicos en pacientes con SM (activo) o MCL.

Los datos recientes sugieren que el AMN 107 es un inhibidor más potente de la actividad de TK BCR/ABL.^{27} También se ha descrito que el AMN107 inhibe la actividad de TK del KIT natural.^{27} En el presente estudio, encontramos que el AMN107 ejerce potentes efectos en las células HMC-1 que llevan la mutación c-KIT V560G, pero exhiben solo efectos débiles en las células HMC-1 que alojan ambos KIT V560G y KIT D816V. En forma similar, el AMN107 muestra solo efectos débiles en la proliferación de células Ba/F3 que expresan la variante mutada D816V de KIT. Estos datos sugieren que la mutación c-KIT D816V pero no la mutación c-KIT V560G, confiere resistencia relativa contra el AMN107, aunque el AMN107 todavía retiene efectos inhibidores en células HMC-1 positivas a KIT D816V en comparación con imatinib. Los efectos antiproliferativos impresionantes del AMN107 sobre células positivas a V560G también sugiere que este compuesto puede ser un fármaco candidato líder atractivo para tumores de célula estromal gastrointestinales (GISTs), en los que se han reportado recientemente mutaciones en el codón 560 del c-KIT.^{49}

Se ha desarrollado recientemente un número de inhibidores farmacológicos que objetivan la actividad de TK de moléculas prooncogénicas en hematología clínica.^{5,12,19,27} Los efectos inhibidores de crecimiento de estos inhibidores TK en células neoplásicas (que expresan el objetivo apropiado) se asocian usualmente con pérdida de actividad de TK y con apoptosis consecutiva. En el presente estudio, somos capaces de demostrar que los efectos inhibidores de crecimiento de PKC412 en MC humanos neoplásicos (HMC- 1) se asocia con la inhibición de TK de KIT (mutado) así como también con apoptosis. De hecho, somos capaces de demostrar que el PKC412 induce apoptosis en células HMC-1.1 (que expresan KIT V560G pero no KIT D816V) así como también en células HMC-1.1 (que expresan KIT V560G y KIT D816V). El efecto que induce la apoptosis de PKC412 es demostrable por microscopía electrónica y de luz así como también mediante citometría de flujo y en un ensayo Tunel. Como era de esperar, el AMN107 e imatinib muestran efectos que inducen apoptos significativos en células HMC-1.1, pero no exhiben efectos significativos en células HMC-1.2.

Se (sobre)expresa típicamente un número de antígenos de superficie celular en MC humanos neoplásicos. Igualmente, en contraste con MC normal, MC neoplásicos en pacientes con SM que expresa CD2 y CD25.^{45,46} Adicionalmente, los niveles de CD63 y CD203c expresados en MC neoplásicos en SM son mayores en comparación con MC normal. En varis casos tal como el del CD63, la variante mutada D816V de KIT puede dar lugar directamente a la expresión de superficie mejorada.^{30} Por lo tanto estamos interesados en conocer si la objetivación del KIT mutado D816V en células HMC-1 mediante PKC412 se asocia con una disminución en la expresión de antígenos CD de superficie "relacionados con SM". Los resultados de nuestros experimentos muestran que el PKC412 regula en forma descendente la expresión de CD2, CD63, y CD 164 en células HMC-1.2 que exhiben KIT D816V. También se observa un efecto insignificante aunque ligero de PKC412 (así como también de AMN107) sobre la expresión KIT. Una observación interesante es que el AMN107 falla al suprimir la expresión de CD2 y CD63 en células HMC-1.2. Esto es probablemente debido al efecto más débil de este compuesto sobre la actividad de TK de KIT D816V cuando se compara con el efecto de PKC412.

Un número de datos recientes sugiere que el tratamiento de neoplasias mieloides con inhibidores de TK como agentes únicos puede ser insuficiente para controlar la enfermedad durante periodos prolongados. Se ha documentado para el uso de imatinib en (avanzado) CML^{50,51}, y también se puede aplicar para pacientes con ASM o MCL.^{52} en estos últimos pacientes, esto es un problema particular ya que la mutación D816V confiere una resistencia primaria (relativa) del KIT contra imatinib y, en un menor grado, resistencia relativa contra AMN107. Para superar la resistencia, se pueden contemplar un número de estrategias farmacológicas diferentes. Una posibilidad es aplicar combinaciones de fármaco. Nosotros por lo tanto estamos interesados en saber si el PKC412 y AMN107 podrían exhibir efectos antiproliferativos sinérgicos sobre las células HMC-1.1 y HMC-1.2. De hecho, nuestros datos demuestran que el PKC412 coopera con imatinib y AMN107 en la producción de inhibición de crecimiento en ambos clones HMC-1. Adicionalmente, el PKC412 y 2CdA, un fármaco que se ha descrito por contrarrestar la proliferación de MC neoplásicos in vivo en pacientes con SM (activo), muestra efectos inhibidores en la proliferación de células HMC-1.1- y HMC-1.2. Sin embargo, interesantemente, se encuentra que las interacciones de fármaco son solo sinérgicas en células HMC- 1, pero no en las células HMC-1.2. Esto se puede explicar por los efectos relativamente débiles (AMN107) o ausentes (imatinib) de los fármacos coaplicados sobre la actividad KIT TK y así la proliferación de las células HMC- 1.2 que llevan D816V en comparación con loes efectos mucho más pronunciados de los mismos fármacos sobre las células HMC-1.1. No se observan efectos de fármacos cooperativos cuando se combina IFNa con AMN107 o PKC412. Si se desconoce las combinaciones de fármaco que consisten de PKC412 y otros fármacos (objetivados) será de valor clínico en pacientes con ASM o MCL.

Así, hasta ahora, solo se han presentado unos pocos agentes con efectos antiproliferativos documentados en MC neoplásicos in vivo en pacientes con SM, y ninguno de estos fármacos produce remisiones completas de larga duración en pacientes con ASM o MCL. La noción de que el PKC412 es un inhibidor novedoso más potente del crecimiento de MC humanos neoplásicos que llevan la variante mutada D816V de KIT es de particular interés a este respecto.

En resumen, mostramos que el PKC412 y AMN107 son fármacos prometedores novedosos que objetivan el KIT natural y variantes mutadas de KIT en SM. Considerando que cada uno de los dos fármacos puede exhibir un perfil farmacológico distinto con efectos únicos sobre las variantes mutadas de KIT, un método prometedor y más efectivo puede ser combinar ambos fármacos uno con el otro o con el fármaco establecido clínicamente 2CdA para tratar pacientes con ASM o MCL en el futuro.

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Claims

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```
1. Un compuesto de la fórmula (I):

4

en combinación con un compuesto de la fórmula (II):

5

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en el tratamiento o prevención de mastocitosis sistémica.
2. La combinación para uso en el tratamiento o prevención de mastocitosis sistémica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mastocitosis sistémica tiene resistencia a imatinib.
3. La combinación para uso en el tratamiento o prevención de mastocitosis sistémica de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la mastocitosis sistémica se asocia con la mutación KIT-D816V oncogénica.
4. Uso de un compuesto de la fórmula (I):

6

en combinación con un compuesto de la fórmula (II):

7

o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mastocitosis sistémica.
```
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```
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4 en donde la mastocitosis sistémica se asocia con la mutación KIT-D816V oncogénica.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la mastocitosis sistémica tiene resistencia a imatinib.