JP2024012493A - 消化管間質腫瘍の治療のための併用療法 - Google Patents

消化管間質腫瘍の治療のための併用療法 Download PDF

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Abstract

【課題】１または複数のｃ－ＫＩＴ突然変異を伴う腫瘍を治療する方法を提供する。【解決手段】１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用することを含む、方法とする。好ましくは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤（ＭＥＫ阻害剤）、および有効量の細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤（ＥＲＫ阻害剤）からなる群から選択される、方法である。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１月３１日に出願された米国特許出願第６２／６２４，４４８号に対する優先権を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ－ＫＩＴ（ＫＩＴ、ＣＤ１１７、および幹細胞因子受容体としても知られる）は、ＩＩＩ型受容体として作用する１４５ｋＤａの膜貫通型チロシンキナーゼタンパク質である。染色体４ｑ１１－２１に位置するｃ－ＫＩＴ癌原遺伝子は、ｃ－ＫＩＴ受容体をコードし、そのリガンドは幹細胞因子（ＳＣＦ、造血幹細胞因子、ｋｉｔリガンド、肥満細胞増殖因子）である。受容体はチロシンプロテインキナーゼ活性を有し、リガンドＳＣＦの結合は、ｃ－ＫＩＴの自己リン酸化、およびホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）などの基質とのその会合を導く。タンパク質チロシンキナーゼによるチロシンリン酸化は、細胞シグナル伝達において特に重要であり、増殖、生存、分化、アポトーシス、付着、侵襲および遊走などの主要な細胞内プロセスのためのシグナルを媒介することができる。
ｃ－ＫＩＴ発現および活性の役割は、急性白血病および消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）などの血液腫瘍および固形腫瘍で研究されてきた。大部分のＧＩＳＴは、密接に関連するＲＴＫである、ｃ－ＫＩＴ（ＧＩＳＴのうちの７５～８０％）またはＰＤＧＦＲα（非ｃ－ＫＩＴ突然変異型ＧＩＳＴのうちの８％）をコードする遺伝子において一次活性化突然変異を伴い、またｃ－ＫＩＴ遺伝子の機能突然変異の獲得および構造的リン酸化ｃ－ＫＩＴの発現は、多くのＧＩＳＴにおいて見られる。ＧＩＳＴを引き起こすｃ－ＫＩＴ一次突然変異の大部分は、エクソン１１によってコードされたタンパク質の膜近傍（ＪＭ）の領域に影響を及ぼし、インフレーム欠失もしくは挿入、またはミスセンス突然変異（すなわち、Ｖ５６０Ｄ）からなる。ｃ－ＫＩＴのエクソン１１突然変異は、ＧＩＳＴの約６５％において一次突然変異として特定されてきた。このようなＪＭドメイン突然変異は、ｃ－ＫＩＴキナーゼの自己抑制機序を乱し、ＧＩＳＴの恒常的キナーゼ活性および細胞形質転換事象の原因につながる。ＧＩＳＴを引き起こす他のｃ－ＫＩＴ一次突然変異は、エクソン９（ＡＹ５０１－５０２重複／挿入、８％）、エクソン１３（突然変異、１％）、およびエクソン１７（突然変異、１％）に位置する。
悪性腫瘍におけるｃ－ＫＩＴ発現の臨床的重要性は、特異的にチロシンキナーゼ受容体を阻害するものである、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブメシル酸塩、ＳＴＩ５７１（シグナル伝達阻害剤番号５７１）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ社、スイス国バーゼル）を用いた試験で実証された。さらに、臨床的に関連性のあるブレイクスルーは、概して従来の化学療法に対して耐性を示すと見なされる一群の腫瘍であるＧＩＳＴにおけるこの化合物の抗腫瘍効果の所見であった。しかしながら、ｃ－ＫＩＴの阻害剤、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）でのＧＩＳＴの第一線の治療後に主要な応答が見られ、転移性および／または手術不能のＧＩＳＴを患う相当数の患者がＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）による治療の恩恵を享受する一方で、完全な腫瘍の寛解は稀であり、患者のうち約５０％が治療の２年以内に疾患再発を経験している。ｃ－ＫＩＴ阻害剤イマチニブとＭＥＫキナーゼ阻害剤ＭＥＫ１６２との併用により、いずれかの単剤での治療と比較して、様々なＧＩＳＴ癌細胞株においてインビトロでの増殖抑制およびインビボでの腫瘍後退の増加をもたらすこともまた報告されている。
ＧＩＳＴはほとんどの場合、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）耐性を示すようになり、そし
てｃ－ＫＩＴ二次突然変異を標的とする分子標的小分子療法は、とらえどころのないままとなる。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）またはＳｕｔｅｎｔ（登録商標）による治療後に再発したＧＩＳＴ患者は、未だｃ－ＫＩＴ突然変異によって引き起こされる疾患を有する。これら二次突然変異は、ＪＭ領域の一次突然変異と同じ対立遺伝子上で発生し、したがって、元の一次突然変異よりもさらにより侵襲的な活性化された形態のｃ－ＫＩＴを表す。ＧＩＳＴにおいて特定されたｃ－ＫＩＴのこれら二次突然変異は、後天的な薬剤耐性につながる。二次突然変異は、ＡＴＰ結合ポケット（エクソン１３、すなわちＫ６４２Ｅ、Ｖ６５４Ａ；エクソン１４、すなわちＴ６７０Ｉ）、および活性化ループ（エクソン１７、すなわちＮ８２２Ｋ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８２０Ａ；エクソン１８ Ａ８２９Ｐ）において見られる。これらの様々なｃ－ＫＩＴ二次突然変異は、以下のとおり報告されてきた：スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ（商標）、ファイザー社）は、この文脈においては特にｃ－ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲαである、複数のＲＴＫの阻害剤であり、特定のイマチニブ耐性ｃ－ＫＩＴ突然変異体、例えばＡＴＰ結合性ポケット突然変異体Ｖ６５４ＡおよびＴ６７０Ｉ等に対して有効であることが示されてきた。特定のＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）耐性突然変異体は、スニチニブに対しても耐性があり、例えばエクソン１７によってコードされるｃ－ＫＩＴ触媒ドメインの活性化ループに位置する、Ｄ８１６ＨおよびＤ８１６Ｖ等である。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）耐性に由来する進行後の平均生存期間は、比較的短いままである。
個々の患者内で、複雑な、複数のｃ－ＫＩＴ二次突然変異が生じて変化することが実証されており、こうしたｃ－ＫＩＴの突然変異状態の変化は、各患者内の様々な進行する転移から得られた生検サンプルによって実証されている。個々の患者内での複雑なｃ－ＫＩＴ変異性の異質性は、ｃ－ＫＩＴの一次突然変異および二次突然変異の広範囲にわたって有効であるｃ－ＫＩＴキナーゼ阻害剤を特定するための満たされていない医療の需要を強調するものである。さらに、単に細胞障害性であることと対立するものとして、ｃ－ＫＩＴ媒介性のＧＩＳＴに対して細胞傷害性または細胞破壊的であり、また疾患の寛解および／または疾患再発の減少を結果的にもたらす治療法を特定することが要望されている。
本開示は、ｃ－ＫＩＴ阻害剤の化合物Ａまたはｃ－ＫＩＴ阻害剤の化合物Ｂの、ＭＡＰＫＡＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤との併用に向けられる。本明細書では、ＭＡＰＫＡＰ経路は、キナーゼＲＡＦ→ＭＥＫ→ＥＲＫを介したシグナル伝達として規定する。ｃ－ＫＩＴ阻害剤の化合物Ａまたは化合物Ｂの、トラメチニブを含むＭＥＫ阻害剤、ウリキセルチニブを含むＥＲＫ阻害剤、またはＬＹ３００９１２０を含むＲＡＦ阻害剤との併用が、イマチニブとＭＥＫ阻害剤との併用と比較してまたは化合物Ａ、イマチニブもしくはＭＥＫ阻害剤による単剤治療と比較して、ＧＩＳＴ細胞の細胞死、アポトーシスもしくは長期の細胞静止、インビボにおけるＧＩＳＴ腫瘍後退の増強、またはコロニー形成アッセイにおけるＧＩＳＴ細胞の根絶を導く、ということが予期せずに実証された。さらに、ｃ－ＫＩＴ阻害剤の化合物ＡのＭＥＫ阻害剤との併用が、ＭＥＫ阻害剤と組み合わせたイマチニブに対して耐性を示すＧＩＳＴ癌細胞株の細胞死またはアポトーシス、および根絶の増強を導くことが実証された。ＧＩＳＴ細胞におけるコロニー増殖試験では、化合物Ａは、ＭＥＫ阻害剤と組み合わせたイマチニブと比較して、ＭＥＫ阻害剤との併用で優れた相乗作用を呈した。本開示は、部分的に、本明細書に記載される化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を使用した、患者における腫瘍を治療する方法に関する。
例えば、それを必要とする患者における１または複数のｃ－ＫＩＴ突然変異を伴う腫瘍を治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩、および有効量のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤（ＭＥＫ阻害剤）および／
または有効量の細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤（ＥＲＫ阻害剤）を投与することを含む。
本開示はまた、イマチニブ耐性の患者における固形腫瘍を治療する方法を提供するものであって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブおよびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＥＫ阻害剤またはＥＲＫ阻害剤を投与することとを含むものであって、固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、神経膠芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される。
それを必要とする患者における、イマチニブ耐性の消化管間質腫瘍またはイマチニブ耐性のメラノーマを治療する方法もまた、本明細書において意図され、これは、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブ、およびウリキセルチニブからなる群から選択される、有効量の ＭＥＫまたはＥＲＫ阻害剤を投与することとを含む。
本開示はまた、それを必要とする患者における固形腫瘍を治療する方法を提供するものであって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブおよびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＥＫ阻害剤またはＥＲＫ阻害剤を投与することとを含むものであって、固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、神経膠芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される。
それを必要とする患者における、消化管間質腫瘍またはメラノーマを治療する方法もまた、本明細書において意図され、これは、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブ、およびウリキセルチニブからなる群から選択される、有効量のＭＥＫまたはＥＲＫ阻害剤を投与することとを含む。
さらに、本明細書においては、それを必要とする患者における固形腫瘍を治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、有効量のＲＡＦ阻害剤を投与することとを含む上記方法が意図される。
図１Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図１Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｅｄ）（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図１Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる４８時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図１Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる４８時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図１Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞において、化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図１Ｆは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図１Ｇは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図１Ｈは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図２Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図２Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図２Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図２Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図２Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図２Ｆは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図３Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図３Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図３Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図３Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図３Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図３Ｆは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図４Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図４Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図４Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図４Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図４Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図４Ｆは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図５Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図５Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図５Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図５Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図５Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図５Ｆは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図６Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図６Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図６Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図６Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（
Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図６Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図６Ｆは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図７Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物ＡおよびＥＲＫ阻害剤ウリキセルチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図７Ｂは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図であり、併用指数プロットは、ｙ軸を併用指数（ＣＩ）およびｘ軸を作用率（Ｆａ）としてグラフにした相乗作用を示している。
図７Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２４時間にわたる様々な処置後のカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図７Ｄは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２４時間にわたる様々な処置に関する併用指数法に基づく相乗作用のマトリクス図である。
図８Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ９日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。
図８Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図８Ｃは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ（ＩＭ）、およびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。
図８Ｄは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。
図９Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。
図９Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図９Ｃは、代表的培養プレートの画像を示し、化合物Ｂおよびトラメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数を示す。
図１０Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびビニメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１０Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびビニメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１０Ｃは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびビニメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１１Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびビニメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１１Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびビニメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１１Ｃは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびビニメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１２Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびコビメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１２Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびコビメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１２Ｃは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａ、イマチニブ、およびコビメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１３Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびコビメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１３Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびコビメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１３Ｃは、代表的培養プレートの画像を示し、化合物Ｂおよびコビメチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１４Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物ＡおよびＥＲＫ阻害剤ウリキセルチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。
図１４Ｂは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。
図１４Ｃは、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２週間にわたる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。右上のパネルは、回復のさらに１０日後の代表的培養プレートを示す。
図１５は、代表的培養プレートの画像、ならびに化合物Ｂおよびウリキセルチニブによる２週間にわたる様々な処置の後に計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。
図１６Ａは、ベクター対照またはＮ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における化合物Ａおよびトラメチニブによる４８時間にわたる様々な処置からのカスパーゼ活性のグラフ表示を示す。
図１６Ｂは、化合物Ａ、イマチニブ、およびトラメチニブによる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後の、ベクター対照（図１６Ｂ．１）またはＮ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄ（図１６Ｂ．２）を形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニーの代表的培養プレートの画像を示す。
図１６Ｃは、化合物Ａ、イマチニブ、およびトラメチニブによる様々な処置とそれに次ぐ１０日の回復期間の後に計数した、ベクター対照（図１６Ｃ．１）またはＮ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄ（図１６Ｃ．２）を形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。
図１６Ｄは、化合物Ａおよびトラメチニブによる様々な処置とそれに次ぐ延長した２１
日の回復期間の後の、Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニーの代表的培養プレートの画像を示す。
図１７Ａは、イマチニブ（左パネル）または化合物Ａ（右パネル）のいずれかによる単剤処置が後に続く、飽和突然変異誘発における、Ｔ６７０Ｉ、Ｋ８０７Ｅ、またはＤ８１６Ｖでのｃ－ＫＩＴ二次突然変異のＢａ／Ｆ３ Ｖ５６０Ｄ ＫＩＴ細胞増殖、または、さらなる非ｃ－ＫＩＴ抵抗性機序を合わせた元のｃ－ＫＩＴ Ｖ５６０Ｄ突然変異のみを保持する細胞増殖、のグラフ表示である。
図１７Ｂは、イマチニブとトラメチニブ（左パネル）または化合物Ａとトラメチニブ（右パネル）のいずれかによる併用処置が後に続く、飽和突然変異誘発における、Ｔ６７０Ｉ、Ｋ８０７Ｅ、またはＤ８１６Ｖでのｃ－ＫＩＴ二次突然変異のＢａ／Ｆ３ Ｖ５６０Ｄ ＫＩＴ細胞増殖、または、さらなる非ｃ－ＫＩＴ抵抗性機序を合わせた元のｃ－ＫＩＴ Ｖ５６０Ｄ突然変異のみを保持する細胞増殖、のグラフ表示である。
図１８Ａは、単剤の化合物Ａ、単剤のトラメチニブ、または化合物Ａおよびトラメチニブの併用での処置後のＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片腫瘍増殖のグラフ表示を提供する。
図１８Ｂは、図１８Ａからのグラフ表示の引伸ばしであり、単剤の化合物Ａ、単剤のトラメチニブ、または化合物Ａおよびトラメチニブの併用での処置後の腫瘍後退に対する効果の回復を示す。
〔00087〕１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ
－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素（化合物Ａ）と、例えばトラメチニブであるＭＡＰＫＡＰキナーゼ経路阻害剤との併用が、予期せずに、相乗作用を発揮して、ＧＩＳＴ細胞の細胞死、アポトーシス、または長期の細胞静止を導き、腫瘍細胞の根絶を誘発し、腫瘍の後退を誘発し、腫瘍の体積を減少させ、腫瘍の再増殖を阻害し、および／または、添付の実施例においてＭＥＫ阻害剤と組み合わせたイマチニブに耐性を示すＧＩＳＴ癌細胞株の細胞死、アポトーシスまたは細胞静止もしくは根絶の増強を導くことがわかった。加えて、本明細書に開示される併用療法は、単に細胞増殖抑制性であることと対立するものとして、細胞致死性であるようである。
いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、多くのｃ－ＫＩＴ阻害剤は、ＧＩＳＴで観察された顕著なエクソン１１突然変異などの、ｃ－ＫＩＴの特定の突然変異体の形態のみを阻害すると考えられる。ｃ－ＫＩＴの他の突然変異体形態は多くのｃ－ＫＩＴ阻害剤に対して耐性を示し、またこれらはｃ－ＫＩＴ阻害剤での治療に対して耐性を示す腫瘍を与える、エクソン１３、１４、１７および１８における二次突然変異として生じることがよくある。本開示は、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩として本明細書に開示されるｃ－ＫＩＴ阻害剤を用いて、ｃ－ＫＩＴおよびＭＡＰＫＡＰ経路キナーゼの両方を阻害することによって、ＧＩＳＴ等の例えばｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍である腫瘍を治療する方法を提供する。驚くべきことに、化合物Ａおよび化合物Ｂ（およびその薬学的に許容可能な塩）は、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、またはＲＡＦ阻害剤と共に相乗作用を発揮し、ＧＩＳＴ細胞の細胞死、アポトーシス、または 長期の細胞静止を導き、検出限界まで腫瘍細胞の根絶を誘発し、腫瘍の体積を減少させ、腫瘍の再増殖を阻害し、および／または、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤と組み合わせて、イマチニブに耐性を示すＧＩＳＴ癌細胞株の、細胞死、アポトーシス、細胞静止または検出限界まで根絶の増強を導く。化合物Ａは、ｃ－ＫＩＴ耐性
突然変異を含有するＧＩＳＴ細胞において、ＭＥＫ阻害と組み合わせたイマチニブと比較して、ＭＥＫ阻害との併用で優れた効力および相乗作用を示す。さらに、ＭＥＫ阻害と組み合わせた化合物Ａの、効力および相乗作用のレベル、ならびにＧＩＳＴ腫瘍細胞の長期の細胞静止または根絶の程度は、イマチニブに感受性であることがわかっている細胞株に対してさえも、ＭＥＫ阻害と組み合わせたイマチニブのそれよりも優れている。再びいかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、化合物Ａは、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞内において、ＢＣＲＰ排出ポンプを含む薬物排出ポンプの阻害を含む機序を介する可能性がある、ＧＩＳＴ細胞において、イマチニブを含めた先のｃ－ＫＩＴ阻害剤よりも、より幅広い範囲のｃ－ＫＩＴの突然変異形態を阻害することができると考えられる。イマチニブは、ＢＣＲＰ排出ポンプの基質であり、この排出ポンプが存在する腫瘍細胞内の細胞内濃度の低下を導く（Ｅｅｃｈｏｕｔｅ，Ｋ，ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５，１７，４０６－１５）。ＧＩＳＴ腫瘍は、評価したＧＩＳＴ患者腫瘍のうちの９３％（４２／４５）において、ＢＣＲＰ排出ポンプの過剰発現があることが実証されている（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５，３３，５８）。化合物Ａは、ＢＣＲＰ排出トランスポーターの強力な阻害剤であり、ＩＣ５０値は４０ｎＭを示す。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、長期の細胞静止の誘発、細胞死の誘発、腫瘍細胞のアポトーシスの誘発、腫瘍細胞の根絶の誘発、腫瘍後退の誘発、腫瘍の体積の減少、腫瘍の再増殖の阻害、または、耐性腫瘍細胞の増殖の阻害をする方法を提供するものであって、当該方法は、それを必要とする患者に対して、有効量の、（ｉ）１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素もしくはその薬学的に許容可能な塩、または、１－（５－（７－アミノ－１－エチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル）－４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－３－フェニル尿素もしくはその薬学的に許容可能な塩；および（ｉｉ）例えばＭＥＫ阻害剤のトラメチニブ、ビニメチニブもしくはコビメチニブ、ＥＲＫ阻害剤のウリキセルチニブ、またはＲＡＦ阻害剤である、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤、を投与することを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、腫瘍は、例えばｃ－ＫＩＴ媒介性ＧＩＳＴまたはメラノーマである、ｃ－ＫＩＴ媒介性固形腫瘍である。定義
〔00090〕本明細書において使用される場合、化合物Ａおよび化合物Ｂとは、１－［４
－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、および１－（５－（７－アミノ－１－エチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル）－４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－３－フェニル尿素をそれぞれ指す。化合物Ａおよび化合物Ｂの薬学的に許容可能な塩、互変異性体、水和物、および溶媒和物も本開示において意図される。化合物Ａおよび化合物Ｂの構造を以下に示す：

１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素（化合物Ａ）

１－（５－（７－アミノ－１－エチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル）－４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－３－フェニル尿素（化合物Ｂ）
化合物Ａおよび化合物Ｂの製造方法は、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる米国特許第８４６１１７９Ｂ１号に開示されている。
ここで例示的な方法および材料を説明する。明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈から別段に明示されない限り、単数形は複数形も含む。別段に規定しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。
本開示全体を通して、様々な特許、特許出願、および公開公報が参照される。これら特許、特許出願および公開公報の開示はその全体が、本開示の日付において当業者に公知である当技術の状況をさらに詳細に記述するために、参照により本開示に組み込まれる。それら特許、特許出願および公開公報と本開示との間に何らかの不一致がある場合には、本開示が優先されることとなる。
簡便のため、本明細書、実施例および特許請求の範囲に採用される特定の語を、ここにまとめる。別段に規定しない限り、本開示で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本開示において提示される群または語に対して提示される最初の定義は、別段に示さない限り、本開示全体を通じて当該群または語に対して個々に、または別の群の一部として適用される。
〔00095〕「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」としては、ヒトまたは家
畜における使用に許容可能であるとして、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に承認された任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、調味料（ｆｌａｖｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒または乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容可能な塩」としては、酸付加塩が挙げられる。
「薬学的に許容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的な有効性および特性を保持する塩を指し、それらは生物的に望ましくないものでもなく、またはそれ以外の望ましくないものでもなく、そして例えば、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および例えば限定されないが、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、
ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などの有機酸で形成される。
「医薬組成物」とは、本明細書に記載の化合物、例えば化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩、と、生物学的に活性な化合物の、例えばヒトである哺乳動物への送達に関して、当技術において概して許容可能である媒体との製剤を指す。そのような媒体としては、それらのためのすべての薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤が挙げられる。
例えばＭＥＫ阻害剤と組み合わせた化合物Ａである、本開示の併用療法での「治療を必要とする」対象または患者には、例えばＧＩＳＴ患者である、有益な治療結果を達成するために本明細書に開示される組合せで治療することが可能である疾患および／または症状を有する患者が含まれる。有益な転帰としては、客観的反応、無憎悪生存期間の増加、生存期間の増加、長期の安定病態、および／または症状の重篤度の低下もしくは症状の発現の遅延が挙げられる。特定の実施形態では、治療を必要とする患者は、腫瘍増殖または腫瘍進行に悩まされており、患者は肺腺癌、肺扁平上皮癌、グリア芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、メラノーマ、または消化管間質腫瘍に悩まされているが、これらに限定されない。
〔00100〕本明細書に開示される化合物または他の治療薬と関連して使用する場合、「
有効量」の語は、疾患または障害を治療または予防するために有用である、例えば化合物ＡまたはＭＥＫ阻害剤である、単独または併用での、ある量の治療薬を指す。併用療法で使用する治療薬の有効量は、もう一方の薬剤が存在しない状態での治療薬の一方または両方の量が、疾患または障害を治療または予防するのに有効でなくても、併用療法で使用するときに疾患または障害の治療または予防に有用であるような各治療薬の量である。特定の実施形態では、有効量は、ＧＩＳＴ細胞の長期の細胞静止、細胞致死性のＧＩＳＴ細胞死滅、ＧＩＳＴ細胞のアポトーシス、ＧＩＳＴ細胞の根絶、ＧＩＳＴの後退、ＧＩＳＴ腫瘍体積の減少、ＧＩＳＴの再増殖の阻害をもたらし、および／または、ＭＥＫ阻害剤と組み合わせたイマチニブに耐性を示すＧＩＳＴ癌細胞株の、長期の細胞静止、細胞死、アポトーシス、または検出限界までの根絶を導き、および／または、治療をしない場合と比較して、この化合物で治療した症状について有益な臨床結果を導く量である。「有効量」は、投与の形態、疾患または障害の特定の位置、ならびに対象の年齢、体重および全体的な健康に応じて変更可能である。投与する化合物の量は、疾患または症状の程度、重篤度および種類、所望される治療の量、ならびに医薬製剤の放出特性に依存するであろう。また、対象の健康状態、大きさ、重量、年齢、性別および薬剤に対する耐性にも依存するであろう。典型的には、化合物は、望ましい治療効果を実現するのに充分な期間、投与する。
「治療」、「治療する」および「治療すること」の語は、ＧＩＳＴ細胞の長期の細胞静止を誘発すること、細胞致死性のＧＩＳＴ細胞死滅を誘発すること、ＧＩＳＴ細胞のアポトーシスを誘発すること、５倍での実体的顕微鏡検査により決定されるような視覚的検出限界までのＧＩＳＴ腫瘍細胞の根絶を誘発すること、患者におけるＧＩＳＴ腫瘍の後退を引き起こすこと、ＧＩＳＴ腫瘍体積を減少すること、ＧＩＳＴの再増殖を阻害すること、および／または例えば１もしくは複数の症状を緩和、遅延または後退させる本明細書にお
いて開示する併用療法を施すこと等である、所与の治療において耐性ＧＩＳＴ細胞の増殖を阻害すること、ならびに、実際にＧＩＳＴを除去できなかったとしてもＧＩＳＴの後退を誘発することという意図により「癌」を患う患者における介入の全範囲を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、治療には、例えばＧＩＳＴである疾患または障害を、完全に除去することが含まれる。治療することは、障害を治癒、改善、または少なくとも部分的に緩和させることであってもよい。
本明細書で規定される「癌」とは、周囲の組織に浸潤する能力を有し、転移（他の臓器に拡散する）するものであり、また最終的には、もし治療しなければ患者に死をもたらし得る新生物を指す。特定の実施形態では、癌は固形腫瘍であり得る。
本明細書で使用される場合、「腫瘍」とは腫瘤を指す。これは、良性（概して無害）または悪性（癌性）の増殖を指す場合もある語である。悪性の増殖は、実質臓器または骨髄が起源であり得る。
本明細書に規定される「腫瘍増殖」は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のゲノム変異によって生じる腫瘤の増殖を指し、これはｃ－ＫＩＴタンパク質の発現および／または活性を変化させ得る。
〔00105〕本明細書に規定される「腫瘍進行」とは、例えばＧＩＳＴである既存のｃ－
ＫＩＴ依存性の腫瘍の増殖を指し、この場合において既存の腫瘤のこうした増殖は、治療に対して耐性を示すｃ－ＫＩＴのさらなるゲノム改変によって生じ得る。
本明細書に規定されるような、「腫瘍後退」、「完全寛解」および「部分奏効」は、ＲＥＣＩＳＴ １．１またはＣｈｏｉの基準により決定されるような重量または体積によって決定される腫瘍サイズの減少を指す。
既存のｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍、例えばｃ－ＫＩＴ媒介性ＧＩＳＴの根絶は、インビトロの評価については、５倍での実体的顕微鏡検査により決定されるような検出限界までの腫瘍の「完全な細胞致死性の細胞死滅」として規定され、または、前臨床もしくは臨床条件下で腫瘍の再増殖の可能性なしでのインビボの前臨床もしくは臨床の評価については、ＲＥＣＩＳＴ １．１またはＣｈｏｉの基準で決定されるような完全寛解として規定される。したがって、「ｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍の根絶」は、ｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍のすべての細胞が、ｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍の再増殖の可能性なしに検出限界まで死滅または除去されることを示す。
本明細書で使用される場合、「腫瘍再増殖」とは、例えばＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）またはＳｕｔｅｎｔ（登録商標）である治療の後に、予め増殖を停止または後退した腫瘍が増殖することを指す。特定の実施形態では、腫瘍の再増殖は、腫瘍細胞内のｃ－Ｋｉｔ二次突然変異の導入に起因して発生する。他の実施形態では、腫瘍の再増殖は、ＭＥＫキナーゼを介したシグナル伝達を含むＭＡＰＫＡＰシグナル伝達経路の活性化を含むがこれに限定されない、異なるシグナル伝達経路の活性化または突然変異に起因して発生する。
本明細書で使用される場合、「細胞静止（ｃｅｌｌ ｓｔａｓｉｓ）」は、分裂を停止して、休眠中の非複製的な状態のままである細胞を指す。
〔00110〕本明細書で使用される場合、「アポトーシス」は、プログラム細胞死を指す
。組織学的方法および組織化学的方法によって検出可能なアポトーシスの特徴には、細胞収縮、膜透過性の増加、核および細胞質の凝縮、核ＤＮＡのオリゴヌクレオソーム断片への分解切断（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）、ならびにマクロファージによっ
て吸収および除去されるアポトーシス小体の最終的な形成が含まれる。アポトーシスは主に，アスパラギン酸特異的セリンプロテアーゼであるカスパーゼによって媒介される。アポトーシスは、例えばＤＮＡ損傷もしくは増殖因子の除去である、様々な条件に応じた本質的な遺伝子プログラミングを介して誘発可能であり、またはアポトーシスは、照射による細胞ＤＮＡの損傷、および癌治療に使用されるいくつかの細胞障害性薬剤等である外因によって誘発することができる。それは、自然発生的な因子（例えば、サイトカイン）によって、および一部の薬剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤）によって、抑制することが可能である。アポトーシスは典型的には、悪性細胞において発生せず、または悪性細胞において損なわれる。特定の実施形態では、アポトーシスは、切断されて活性化されたカスパーゼ３およびカスパーゼ７における増加によって決定されるプログラム細胞死を指す。
「併用療法」は、例えば化合物ＡおよびＭＥＫ阻害剤である２以上の治療薬の患者への投与を含む治療である。２以上の治療薬は、同時に、例えば、別個の医薬組成物中でまたは同じ医薬組成物中で、送達されてもよく、または２以上の治療薬は、異なる時点で送達されてもよい。例えば、２以上の治療薬は同時にまたは重複する時間の間に送達されてもよく、および／または、１つの治療薬を、その他の治療薬の前または後に送達してもよい。化合物ＡなどのＫＩＴ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の併用を伴う治療は、両方の薬剤での同時治療の期間が先行する、または当該期間がその後に続く、いずれかの単剤での治療を含んでいてもよい。しかしながら、一部の期間中に、有効量の２以上の治療薬が患者の体内に存在することが意図される。
「ＭＡＰＫＡＰ経路阻害剤」は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤である。この経路の阻害剤には、ＲＡＳ阻害剤、ＲＡＦ阻害剤（例えば、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、ＬＹ３００９１２０）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブ）、およびＥＲＫ阻害剤（例えば、ウリキセルチニブ）が含まれる。「ＭＡＰＫＡＰ経路阻害剤」および「ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤の語は、本明細書では区別無く使用される。
治療方法
本明細書に記載される化合物および組成物は、それを必要とする患者の腫瘍を治療するために使用できる。例えば、それを必要とする患者における１または複数のｃ－ＫＩＴ突然変異を伴う腫瘍を治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩と、有効量の１または複数のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤とを投与することを含む上記方法を提供する。一実施形態においては、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤（ＭＥＫ阻害剤）、および有効量の細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤（ＥＲＫ阻害剤）からなる群から選択される。
ｃ－ＫＩＴ突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン９、エクソン１１、エクソン１３、またはエクソン１７における一次突然変異であり得る。別の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ突然変異は欠失突然変異である。
〔00115〕さらに、腫瘍は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子における１または複数の耐性二次突然変
異を伴い得る。いくつかの実施形態において、耐性二次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子におけるエクソン１３、エクソン１４、エクソン１７、またはエクソン１８にある。いくつかの実施形態において、耐性二次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子におけるエクソン１７にある。いくつかの実施形態においては、耐性二次突然変異は、コドン８１６におけるアスパラギン酸の置換、またはコドン８２２におけるアスパラギンの置換である。いくつかの実施形態においては、耐性二次突然変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｅ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８
２０Ａ、Ｔ６７０Ｉ、またはＮ８２２Ｖのうちの１つである。いくつかの実施形態においては、耐性二次突然変異は、イマチニブ、スニチブもしくはレゴラフェニブ、またはその薬学的に許容可能な塩の、患者への先の投与後に取得された。
こうした開示する方法は、腫瘍がｃ－ＫＩＴ二次突然変異を伴うかどうかを判断することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、腫瘍にｃ－ＫＩＴ二次突然変異を伴うかどうかを判断することは、腫瘍試料から抽出されたＤＮＡにおける突然変異を特定することを含む。いくつかの実施形態においては、腫瘍にｃ－ＫＩＴ二次突然変異を伴うかどうかを判断することは、血中腫瘍ＤＮＡにおける突然変異を特定することを含む。別の実施形態では、腫瘍はイマチニブメシル酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、またはレゴラフェニブでの治療に対して耐性を示した。
さらに、腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、グリア芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍はメラノーマである。いくつかの実施形態では、腫瘍はＧＩＳＴである。
この方法は、患者に対して、癌標的治療薬、癌標的生物製剤、免疫チェックポイント阻害剤、および／または化学療法剤を投与することをさらに含み得る。方法はまた、患者に対して、ＲＡＦ阻害剤を投与することをさらに含んでもよい。
別の実施形態では、１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩、およびＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤は、実質的に同時に、または連続的に投与される。
〔00120〕この開示の方法におけるＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ、セルメチニブ、コ
ビメチニブ、およびビニメチニブからなる群から選択することが可能である。いくつかの実施形態においては、ＭＥＫ阻害剤はビニメチニブである。いくつかの実施形態においては、ＭＥＫ阻害剤はトラメチニブである。いくつかの実施形態においては、ＥＲＫ阻害剤は、ウリキセルチニブ、ＳＣＨ７７２９８４、およびＬＹ３２１４９９６からなる群から選択される。
こうした開示の方法に従って２週間以上投与することにより、患者が腫瘍体積の少なくとも３０％の部分的減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療により、腫瘍体積の完全な減少をもたらす。
開示の方法は、腫瘍または腫瘍細胞がｃ－ＫＩＴ遺伝子の一次突然変異を含むかどうかを判断することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、一次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１１にある。いくつかの実施形態において、一次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン９にある。いくつかの実施形態においては、一次突然変異は、欠失突然変異である。いくつかの実施形態においては、一次突然変異は、Ｖ５６０Ｄである。他の実施形態では、１または複数のさらなる二次的突然変異であるｃ－ＫＩＴ突然変異が存在する。
本開示により、イマチニブ耐性の患者の固形腫瘍を治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブおよびウリキセルチニブからなる群から選択され
る有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含む上記方法も提供し、固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、神経膠芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、この方法は、ＲＡＦ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、ＲＡＦ阻害剤は、汎ＲＡＦ阻害剤である。
本明細書においては、それを必要とする患者におけるイマチニブ耐性の消化管間質腫瘍またはイマチニブ耐性のメラノーマを治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブ、およびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含む上記方法も提供する。
〔00125〕いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍がｃ－ＫＩＴ遺伝子の突然変異を伴
うか否かを判断することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１７にある。いくつかの実施形態においては、ｃ－ＫＩＴ突然変異は、コドン８１６におけるアスパラギン酸の置換、またはコドン８２２におけるアスパラギンの置換である。いくつかの実施形態においては、突然変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｅ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８２０Ａ、Ｔ６７０Ｉ、またはＮ８２２Ｖのうちの１つである。
さらに、それを必要とする患者における固形腫瘍を治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、有効量のＲＡＦ阻害剤を投与することとを含む上記方法を提供する。
このような開示の方法では、固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、ＧＩＳＴ、およびメラノーマからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態においては、固形腫瘍は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子の１または複数の突然変異を伴う。
さらに、ＲＡＦ阻害剤は汎ＲＡＦ阻害剤であり得る。別の実施形態では、ＲＡＦ阻害剤はダブラフェニブ、ベムラフェニブ、またはＬＹ３００９１２０である。
本開示により、それを必要とする患者の固形腫瘍を治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブおよびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含む上記方法も提供し、固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、神経膠芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、この方法は、ＲＡＦ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、ＲＡＦ阻害剤は、汎ＲＡＦ阻害剤である。
〔00130〕本明細書においては、それを必要とする患者における消化管間質腫瘍または
メラノーマを治療する方法であって、患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニ
ブ、およびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含む上記方法も提供する。
いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍がｃ－ＫＩＴ遺伝子の突然変異を伴うか否かを判断することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１７にある。いくつかの実施形態においては、ｃ－ＫＩＴ突然変異は、コドン８１６におけるアスパラギン酸の置換、またはコドン８２２におけるアスパラギンの置換である。いくつかの実施形態においては、突然変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｅ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８２０Ａ、Ｔ６７０Ｉ、またはＮ８２２Ｖのうちの１つである。
一実施形態では、本開示は、例えばＧＩＳＴである、患者における腫瘍、任意にｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に対して、有効量の化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を、例えばトラメチニブである有効量のＭＥＫ阻害剤と組み合わせて、投与することを含む上記方法を提供する。関連する実施形態では、本開示は、例えばＧＩＳＴである、患者における腫瘍、任意にｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に対して、有効量の化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩を、例えばトラメチニブである有効量のＭＥＫ阻害剤と組み合わせて、投与することを含む上記方法を提供する。
特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の静止を誘発すること、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞を死滅させること、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発すること、例えばＧＩＳＴ細胞の、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発すること、例えばＧＩＳＴの後退である腫瘍細胞の後退を誘発すること、例えばＧＩＳＴ腫瘍体積である腫瘍体積を減少させること、例えばＧＩＳＴの再増殖である腫瘍の再増殖を阻害すること、に関する方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の静止を誘発する方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞を死滅させる方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発する方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴの後退である腫瘍後退を誘発する方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴ腫瘍体積である腫瘍体積を減少させる方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えばＧＩＳＴの再増殖である腫瘍の再増殖を阻害する方法を含む。別の特定の実施形態では、これら方法は、例えば薬剤耐性ＧＩＳＴ細胞である、薬剤耐性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を含む。特定の実施形態においては、この方法は、対象における、例えばＧＩＳＴである、検出限界まで腫瘍を根絶する方法を包含する。本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、患者における腫瘍増殖または腫瘍進行は、ｃ－ＫＩＴ過剰発現、ｃ－ＫＩＴの構造的リン酸化、ｃ－ＫＩＴ活性の増加、発癌性ｃ－ＫＩＴミスセンス突然変異、発癌性欠失ｃ－ＫＩＴ突然変異、発癌性ヌクレオチド重複／挿入、ｃ－ＫＩＴ融合タンパク質につながる発癌性ｃ－ＫＩＴ遺伝子再配列、ｃ－ＫＩＴ遺伝子内インフレーム欠失、および／または発癌性ｃ－ＫＩＴ遺伝子増幅により引き起こされる。一実施形態では、腫瘍増殖または腫瘍進行は、ｃ－ＫＩＴの構造的なリン酸化によって引き起こされる。特定の実施形態では、腫瘍は、本明細書に開示される、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異および／またはｃ－ＫＩＴ二次突然変異のうちの１または複数を含む。別の特定の実施形態では、腫瘍は、ＲＡＦ、ＭＥＫまたはＥＲＫキナーゼ活性化に関与するＭＡＰＫＡＰ経路を介したシグナル伝達による腫瘍増殖を引き起こすｃ－ＫＩＴ以外の遺伝子における１または複数の突然変異を含む。
本明細書に記載される方法が、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩による、ま
たは化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩による治療を指す場合、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のうちの１つのみを必要とすることを意味する。しかしながら、これらの方法は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩、および化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の両方を、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤またはＲＡＦ阻害剤と組み合わせて、患者に対して投与することを包含することが理解される。さらに、化合物ＡをＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤またはＲＡＦ阻害剤と組み合わせて対象に投与すると、一部の量の化合物Ａがインビボで化合物Ｂに代謝されること、ならびに、化合物Ａおよび化合物Ｂのインビボでの混合物がまた、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤またはＲＡＦ阻害剤と組み合わせて対象を効果的に治療するために用いることができることが理解される。
〔00135〕本開示の方法および組成物に従って使用され得る例示的なＭＥＫ阻害剤とし
ては、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、およびビニメチニブが挙げられるがこれらに限定されない。
本開示の方法および組成物に従って使用され得る例示的なＥＲＫ阻害剤としては、ウリキセルチニブ、ＳＣＨ７７２９８４、ＬＹ３２１４９９６、ラボキセルチニブ、およびＶＸ－１１ｅが挙げられるがこれらに限定されない。
本開示の方法および組成物に従って使用され得る例示的なＲＡＦ阻害剤としては、ＬＹ３００９１２０、ダブラフェニブ、およびベムラフェニブが挙げられるがこれらに限定されない。
一実施形態においては、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とを、例えばＧＩＳＴであるｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍を患う患者に対して投与する。別の実施形態においては、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とを、例えばＧＩＳＴであるｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍を患う患者に対して投与する。
関連する実施形態においては、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とを、例えばＧＩＳＴを有する患者である腫瘍を患う患者に対して投与するものであり、腫瘍の増殖または腫瘍進行は、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異および／またはｃ－ＫＩＴ二次突然変異によって引き起こされる。別の実施形態においては、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とを、例えばＧＩＳＴを有する患者である腫瘍を患う患者に対して投与するものであり、腫瘍の増殖または腫瘍進行は、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異および／またはｃ－ＫＩＴ二次突然変異によって引き起こされる。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異は、エクソン１１突然変異（例えば、５７塩基対エクソン１１欠失）である。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異はエクソン９のＡ～Ｙ５０２～５０３の重複である。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異はエクソン１３突然変異である。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ一次活性化突然変異はエクソン１７突然変異である。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ二次突然変異は、本明細書で開示されている任意の耐性突然変異であり、例えば、Ｔ６７０Ｉ突然変異またはＤ８１６Ｅ突然変異である。特定の実施形態では、複数のｃ－ＫＩＴ二次耐性突然変異が、対象において同時に存在する。
〔00140〕特定の実施形態においては、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と、
例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とを、癌患者に対して投与する。特定の実施形態においては、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とを、癌患者に対して投与する。本明細書に開示される方法のいずれかの特定
の実施形態では、腫瘍または癌は肺腺癌、肺扁平上皮癌、グリア芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、メラノーマ、または消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である。一実施形態では、癌はメラノーマである。別の実施形態では、腫瘍または癌は消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である。これら方法のいずれかの特定の実施形態では、腫瘍または癌は、例えばｃ－ＫＩＴ媒介性ＧＩＳＴまたはメラノーマである、ｃ－ＫＩＴ媒介性癌である。
化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩の、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤との併用による治療は、ＭＥＫ阻害剤を投与することと重複する期間の前、当該期間の後、当該期間と同時にまたは当該期間中に、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩を投与することを包含する。化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩、または例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤のうちのいずれかについての有効量は、例えば腫瘍を治療または予防するためである同じ目的のために、これら薬剤のいずれかをそれそのもので用いる場合と比較して、本明細書で開示する併用で用いる場合に様々であり得ることが理解される。特定の実施形態においては、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩の有効量は、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤との併用療法として投与された場合、単剤療法として、例えばＧＩＳＴを治療または予防するために投与する場合と比べて、より少ない量である。特定の実施形態においては、例えばＧＩＳＴを治療または予防するために、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩との併用療法で投与した場合、または化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩との併用療法で投与した場合、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤の有効量は、より少ない量である。
本明細書に開示される方法のいずれかは、治療しようとする腫瘍が１または複数のｃ－ＫＩＴ遺伝子突然変異を伴うかを判断することを、さらに含み得る。こうした判断は、患者から得られた、例えば腫瘍試料、血液試料、または血漿試料である生体試料中の遺伝子突然変異の存在を判断するための通例の方法によってなされ得る。さらに、こうした判断は、実施されたテストの結果をレビューして、患者から得られた、例えば腫瘍試料、血液試料、または血漿試料である生体試料中の１または複数のｃ－ＫＩＴ遺伝子突然変異の存在を判断することによってなされ得る。本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態においては、これら方法は、腫瘍が１つまたは複数のｃ－ＫＩＴ遺伝子突然変異を伴うものとして特定されている患者に対して実行される。ｃ－ＫＩＴ遺伝子突然変異は、本明細書に特に記載されたもののうちのいずれかを含むが、これに限定されない。
本明細書に開示される方法のいずれかの様々な態様では、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤と組み合わせて、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の細胞静止を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の死滅を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の後退を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の重量または体積を減少させ、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の再増殖を阻害する。本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤と組み合わせて、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の細胞静止を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の死滅を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の後退を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の重量または体積を減少させ、例えば薬剤耐性ＧＩＳＴである薬剤耐性腫瘍において例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の再増殖を阻害する。本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様
では、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ患者である治療されている患者において検出限界まで腫瘍を根絶する。腫瘍細胞の静止、腫瘍細胞死、腫瘍細胞のアポトーシス、腫瘍後退、腫瘍重量または体積、腫瘍再増殖、耐性腫瘍細胞の増殖および腫瘍の根絶の量を測定または決定する方法は当技術分野で公知であり、また本明細書に記載される任意の方法を含む。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とが、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみによりまたは例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤がｃ－ＫＩＴ阻害剤イマチニブとの併用により、治療されるかまたは治療されないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍のタイプの腫瘍細胞の静止、細胞死滅またはアポトーシスの量と比較して、例えばＧＩＳＴ細胞である、腫瘍細胞静止、腫瘍細胞の死滅または腫瘍細胞のアポトーシスの量の増加をもたらす。例えば、細胞の静止、細胞死滅またはアポトーシスは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、増大し得る。特定の実施形態では、アポトーシスの量は、腫瘍細胞のカスパーゼ活性を測定することによって決定する。
〔00145〕特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその
薬学的に許容可能な塩、またはその化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とが、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみにより治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプの腫瘍もしくは同じ腫瘍の、例えば重量または質量であるサイズと比較して、腫瘍後退の増加または腫瘍サイズもしくは体積の減少（例えば、ＧＩＳＴ）をもたらす。例えば、腫瘍重量または体積は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、減少し得る。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、またはその化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とが、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみにより治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍の増殖または再増殖の量と比較してより大幅に、例えばＧＩＳＴの増殖もしくは再増殖である腫瘍の増殖または再増殖の量を阻害する。例えば、腫瘍増殖または再増殖は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、阻害され得る。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能なその塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤とが、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみによりまたは例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤および例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤の併用により、治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプもしくは同じ腫瘍の耐性腫瘍細胞の増殖の量と比較して、より大幅に、例えば耐性ＧＩＳＴ細胞である耐性腫瘍細胞の増
殖を阻害する。例えば、耐性腫瘍細胞の増殖の量または数は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、阻害され得る。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞は、例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤、および／または例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤による治療に対して、耐性がある。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞はｃ－ＫＩＴ二次突然変異を含む。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ二次突然変異は、以下のｃ－ＫＩＴのアミノ酸残基のうちのいずれかの突然変異である：Ｖ６５４、Ｎ６５５、Ｔ６７０、Ｌ７８３、Ｄ８１６、Ｄ８２０、Ｎ８２２、Ｙ８２３、Ａ８２９、および／またはＴ８４７であり、添付の図に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むがこれに限定されない。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞は、活性化ＭＡＰＫＡＰキナーゼ経路を含み、特定の実施形態では、それらは例えばＮ－ＲＡＳまたはＫ－ＲＡＳ遺伝子であるＲＡＳ遺伝子、フィブロブラスト増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）遺伝子、および／またはニューロフィブロミン－１（ＮＦ１）遺伝子における突然変異における突然変異を含む。特定の実施形態では、突然変異は、Ｎ－ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異である。
特定の実施形態においては、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかの併用による治療が、例えばＧＩＳＴである、検出限界までの腫瘍の根絶をもたらす。特定の実施形態では、腫瘍の根絶は、検出限界まで患者において検出可能な腫瘍がもはや存在しないことを意味する。特定の実施形態では、本明細書に開示される併用療法による、例えばＧＩＳＴである腫瘍の根絶の後、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、患者において検出可能な腫瘍が存在しない。腫瘍の根絶は、光放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＴスキャン、ｃ－ＫＩＴ突然変異を含有する血中無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が存在しないこと、対象の血管系内に存在する血中腫瘍細胞（ＣＴＣ）が存在しないこと、または対象の循環血液の血管系内の癌細胞バイオマーカーが存在しないこと、によって判断できる。
本明細書に開示される方法のいずれかの様々な態様では、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤と組み合わせて、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の細胞静止を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の死滅を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の後退を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の重量または体積を減少させ、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の再増殖を阻害する。本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤と組み合わせて、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の細胞静止を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の死滅を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の後退を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の重量または体積を減少させ、例えば薬剤耐性ＧＩＳＴである薬剤耐性腫瘍において例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の再増殖を阻害する。本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ患者である治療されている患者において検出限界まで腫瘍を根絶する。腫瘍細胞の静止、腫瘍細胞死、腫瘍細胞のアポトーシス、腫瘍後退、腫瘍重量または体積、腫瘍再増殖、耐性腫瘍細胞の増殖および腫瘍の根絶の量を測定または決定する方法は当技術分野で公知であり、また本明細書に記載される任意の方法を含む。
〔00150〕特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその
薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤とが、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみによりまたは例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤のｃ－ＫＩＴ阻害剤イマチニブとの併用により、治療されるかまたは治療されないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍のタイプの腫瘍細胞の静止、細胞死滅またはアポトーシスの量と比較して、例えばＧＩＳＴ細胞である、腫瘍細胞静止、腫瘍細胞の死滅または腫瘍細胞のアポトーシスの量の増加をもたらす。例えば、細胞の静止、細胞死滅またはアポトーシスは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、増大し得る。特定の実施形態では、アポトーシスの量は、腫瘍細胞のカスパーゼ活性を測定することによって決定する。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、またはその化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤とが、例えばイマチニブであるＥＲＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみにより治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプもしくは同じ腫瘍の、例えば重量または体積である腫瘍のサイズと比較して、腫瘍の後退の増加、または腫瘍のサイズまたは体積の減少（例えば、ＧＩＳＴ）をもたらす。例えば、腫瘍重量または体積は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、減少し得る。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、またはその化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤とが、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみにより、治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプもしくは同じ腫瘍の増殖または再増殖の量と比較してより大幅に、例えばＧＩＳＴの増殖または再増殖である腫瘍の増殖または再増殖の量を阻害する。例えば、腫瘍増殖または再増殖は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、阻害され得る。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤とが、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみによりまたは例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤および例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤の併用により、治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプもしくは同じ腫瘍の耐性腫瘍細胞の増殖の量と比較して、より大幅に、例えば耐性ＧＩＳＴ細胞である耐性腫瘍細胞の増殖を阻害する。例えば、耐性腫瘍細胞の増殖の量または数は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、阻害され得る。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞は、例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤、および／または例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤による治療に対して、耐性がある。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞はｃ－ＫＩＴ二次突然変異を含む。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ二次突然変異は、以下のｃ－ＫＩＴのアミノ酸残基のうちのいず
れかの突然変異である：Ｖ６５４、Ｎ６５５、Ｔ６７０、Ｌ７８３、Ｄ８１６、Ｄ８２０、Ｎ８２２、Ｙ８２３、Ａ８２９、および／またはＴ８４７であり、添付の図に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むがこれに限定されない。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞は、活性化ＭＡＰＫＡＰキナーゼ経路を含み、特定の実施形態では、それらは例えばＮ－ＲＡＳまたはＫ－ＲＡＳ遺伝子であるＲＡＳ遺伝子、フィブロブラスト増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）遺伝子、および／またはニューロフィブロミン－１（ＮＦ１）遺伝子における突然変異における突然変異を含む。特定の実施形態では、突然変異は、Ｎ－ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異である。
特定の実施形態においては、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかの併用による治療が、例えばＧＩＳＴである、検出限界までの腫瘍の根絶をもたらす。特定の実施形態では、腫瘍の根絶は、検出限界まで患者において検出可能な腫瘍がもはや存在しないことを意味する。特定の実施形態では、本明細書に開示される併用療法による、例えばＧＩＳＴである腫瘍の根絶の後、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、患者において検出可能な腫瘍が存在しない。腫瘍の根絶は、光放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＴスキャン、ｃ－ＫＩＴ突然変異を含有する血中無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が存在しないこと、対象の血管系内に存在する血中腫瘍細胞（ＣＴＣ）が存在しないこと、または対象の循環血液の血管系内の癌細胞バイオマーカーが存在しないこと、によって判断できる。
〔00155〕本明細書に開示される方法のいずれかの様々な態様では、例えばダブラフェ
ニブであるＲＡＦ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩による治療が、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の細胞静止を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の死滅を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の後退を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の重量または体積を減少させ、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の再増殖を阻害する。本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の長期の細胞静止を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞の死滅を誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、例えばＧＩＳＴ細胞である、検出限界までの腫瘍細胞の根絶を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の後退を誘発し、例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の重量または体積を減少させ、例えば薬剤耐性ＧＩＳＴである薬剤耐性腫瘍において例えばＧＩＳＴ腫瘍である腫瘍の再増殖を阻害する。本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤と組み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかによる治療が、例えばＧＩＳＴ患者である治療されている患者において検出限界まで腫瘍を根絶する。腫瘍細胞の静止、腫瘍細胞死、腫瘍細胞のアポトーシス、腫瘍後退、腫瘍重量または体積、腫瘍再増殖、耐性腫瘍細胞の増殖および腫瘍の根絶の量を測定または決定する方法は当技術分野で公知であり、また本明細書に記載される任意の方法を含む。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤とが、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみによりまたは例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤のｃ－ＫＩＴ阻害剤イマチニブとの併用により、治療されるかまたは治療さ
れないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍のタイプの腫瘍細胞の滞留、細胞死滅またはアポトーシスの量と比較して、例えばＧＩＳＴ細胞である、腫瘍細胞滞留、腫瘍細胞の死滅または腫瘍細胞のアポトーシスの量の増加をもたらす。例えば、細胞の静止、細胞死滅またはアポトーシスは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、増大し得る。特定の実施形態では、アポトーシスの量は、腫瘍細胞のカスパーゼ活性を測定することによって決定する。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤とが、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみにより治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍の、例えば重量または体積である腫瘍のサイズと比較して、腫瘍の後退の増加、または腫瘍のサイズまたは体積の減少（例えば、ＧＩＳＴ）をもたらす。例えば、腫瘍重量または体積は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、減少し得る。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩；と、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤とが、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみにより治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍の増殖または再増殖の量と比較して、より大幅に、例えばＧＩＳＴの増殖もしくは再増殖である腫瘍の増殖または再増殖の量を阻害する。例えば、腫瘍増殖または再増殖は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、阻害され得る。
特定の実施形態では、以下の併用による治療である：化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能なその塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩と；例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤とが、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤のみによりまたは例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤のみによりまたは例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤および例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤の併用により、治療されるかまたは治療されていないかのいずれかである同じタイプのもしくは同じ腫瘍の耐性腫瘍細胞の増殖の量と比較して、より大幅に、例えば耐性ＧＩＳＴ細胞である耐性腫瘍細胞の増殖を阻害する。例えば、耐性腫瘍細胞の増殖の量または数は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、阻害され得る。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞は、例えばイマチニブであるｃ－ＫＩＴ阻害剤、および／または例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤による治療に対して、耐性がある。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞はｃ－ＫＩＴ二次突然変異を含む。特定の実施形態では、ｃ－ＫＩＴ二次突然変異は、以下のｃ－ＫＩＴのアミノ酸残基のうちのいずれかの突然変異である：Ｖ６５４、Ｎ６５５、Ｔ６７０、Ｌ７８３、Ｄ８１６、Ｄ８２０、Ｎ８２２、Ｙ８２３、Ａ８２９、および／またはＴ８４７であり、添付の図に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むがこれに限定されない。特定の実施形態では、耐性腫瘍細胞は、活性化ＭＡＰＫＡＰキナーゼ経路を含み、特定の実施形態では、それらは例えばＮ－ＲＡＳまたはＫ－ＲＡＳ遺伝子であるＲＡＳ遺伝子、フィブロブラスト増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）遺伝子、および／またはニューロフィブロミン－１（ＮＦ１）遺伝子における突
然変異における突然変異を含む。特定の実施形態では、突然変異は、Ｎ－ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異である。
〔00160〕特定の実施形態においては、例えばダブラフェニブであるＲＡＦ阻害剤と組
み合わせた、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかの併用による治療が、例えばＧＩＳＴである、検出限界までの腫瘍の根絶をもたらす。特定の実施形態では、腫瘍の根絶は、検出限界まで患者において検出可能な腫瘍がもはや存在しないことを意味する。特定の実施形態では、本明細書に開示される併用療法による、例えばＧＩＳＴである腫瘍の根絶の後、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、患者において検出可能な腫瘍が存在しない。腫瘍の根絶は、光放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＴスキャン、ｃ－ＫＩＴ突然変異を含有する血中無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が存在しないこと、対象の血管系内に存在する血中腫瘍細胞（ＣＴＣ）が存在しないこと、または対象の循環血液の血管系内の癌細胞バイオマーカーが存在しないこと、によって判断できる。
本開示は、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩と、例えばＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤もしくはＲＡＦ阻害剤である１または複数のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤との投与を伴う併用療法を記載する。本明細書に記載される併用療法は、それそのものによって、または１または複数の追加的治療薬（例えば、以下に記載する１または複数の追加的治療薬）とさらに組み合わせて、使用することができる。例えば、化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩、または化合物Ｂもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかと、ＭＥＫ阻害剤とは、癌標的治療薬、癌標的生物剤、免疫チェックポイント阻害剤、または化学療法剤と共に投与することができる。別の実施形態では、化合物Ａまたは化合物ＢおよびＭＥＫ阻害剤は、その他の治療薬なしで投与される。治療薬は、併用療法において本明細書に記載される別の治療薬と一緒に、または当該治療薬と連続して投与することができる。
併用療法は、２以上の治療薬を投与することであって、それら治療薬の各々は別個に処方されて投与されることによってか、または単一の製剤中の２以上の治療薬を投与することによって、実現することができる。他の併用もまた、併用療法に包含される。併用療法における２以上の治療薬は同時に投与されることができるが、必須ではない。例えば、第一の薬剤（または薬剤の併用）の投与は、数分、数時間、数日、または数週間だけ、第二の薬剤（または薬剤の併用）の投与に先行することができる。ゆえに２以上の薬剤は、互いに数分以内に投与されるか、または互いに１、２、３、６、９、１２、１５、１８、または２４時間以内に投与されるか、または互いに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４日以内に投与されるか、または互いに２、３、４、５、６、７、８、９週間以内もしくはそれ以上の週以内に投与することができる。一部の場合においては、さらに長い間隔も可能である。多くの場合において、併用療法で使用される２以上の薬剤は、同時に患者の身体内に存在することが望ましいが、必須ではない。
併用療法は、異なる順序での構成薬剤を使用した併用で使用される１または複数の薬剤の２回以上の投与を含むこともできる。例えば薬剤Ｘと薬剤Ｙとを併用で使用する場合には、それらを任意の組合せで１回または複数回、連続的に投与することができ、例えばＸ－Ｙ－Ｘ、Ｘ－Ｘ－Ｙ、Ｙ－Ｘ－Ｙ、Ｙ－Ｙ－Ｘ、Ｘ－Ｘ－Ｙ－Ｙなどの順序である。
本開示に従って投与され得る１または複数の追加的治療薬としては、細胞障害性薬剤，シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロン、タモキシフェン、５－フルオロウラシル、メトトレキサート、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロナファリブ、チピファルニブ、４－（（５
－（（４－（３－クロロフェニル）－３－オキソピペラジン－１－イル）メチル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）メチル）ベンゾニトリル塩酸塩、（Ｒ）－１－（（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メチル）－３－ベンジル－４－（チオフェン－２－イルスルホニル）－２，３，４，５－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾジアゼピン－７－カルボニトリル、セツキシマブ、イマチニブ、インターフェロンアルファ－２ｂ、ペグ化インターフェロンアルファ－２ｂ、アロマターゼ併用、ゲムシタビン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｎｅ）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、フルダラビンリン酸塩、ロイコボリン、オキサリプラチン、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、テニポシド１７α－エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、テストラクトン、メゲストロール酢酸塩、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、１７α－ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロン酢酸塩、ロイプロリド酢酸塩、フルタミド、トレミフェンクエン酸塩、ゴセレリン酢酸塩、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール、ビノレルビン、アナストラゾール、レトロゾール、カペシタビン、ラロキシフェン、ドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）、ヘキサメチルメラミン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ボルテゾミブ、イブリツモマブチウキセタン、三酸化ヒ素、ポルフィマーナトリウム、セツキシマブ、チオＴＥＰＡ、アルトレタミン、フルベストラント、エキセメスタン、リツキシマブ、アレムツズマブ、デキサメタゾン、ビカルタミド、クロラムブシル、およびバルルビシンが挙げられるが、これに限定されない。
〔00165〕投与することが可能である１または複数の追加的治療薬としては、限定する
ことなく、ＡＫＴ阻害剤、アルキル化剤、オールトランスレチノイン酸、抗アンドロゲン、アザシチジン、ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ－ＸＬ阻害剤、ＢＣＲ－ＡＢＬ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＢＴＫ／ＬＣＫ／ＬＹＮ阻害剤、ＣＤＫ１／２／４／６／７／９阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、ＣＢＰ／ｐ３００阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、グルココルチコイド受容体アゴニスト、ＨＤＭ２阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＩＫＫβ阻害剤、免疫調節薬剤（ＩＭｉＤ）、インゲノール、ＩＴＫ阻害剤、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２／ＪＡＫ３／ＴＹＫ２阻害剤、ＭＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、二重ＰＩ３キナーゼ／ＭＴＯＲ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プロテインキナーゼＣアゴニスト、ＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦＲ２阻害剤、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤、デシタビン、および抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を挙げることができる。
特定の実施形態では、追加的治療薬は、例えばイピリムマブおよびトレメリムマブであるがこれに限定されないＣＴＬＡ４阻害剤、例えばペムブロリツマブおよびニボルマブであるがこれに限定されないＰＤ１阻害剤、例えばアテゾリツマブ（以前のＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（以前のＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ、ＰＤＲ００１であるがこれに限定されないＰＤＬ１阻害剤、例えばウレルマブおよびＰＦ－０５０８２５６６であるがこれに限定されない４ １ＢＢまたは４ １ＢＢリガンド阻害剤、例えばＭＥＤＩ６４６９であるがこれに限定されないＯＸ４０リガンドアゴニスト、例えばＴＲＸ５１８であるがこれに限定されないＧＩＴＲ薬剤、例えばバルリルマブであるがこれに限定さ
れないＣＤ２７阻害剤、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＴＬ１Ａ阻害剤、例えばＣＰ－８７０８９３であるがこれに限定されないＣＤ４０アゴニスト、ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴまたはＬＴＡまたはＢＴＬＡまたはＣＤ１６０阻害剤、例えばＢＭＳ－９８６０１６であるがこれに限定されないＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、Ｓｉｇｌｅｃｓ阻害剤、ＩＣＯＳまたはＩＣＯＳリガンドアゴニスト、例えばＭＧＡ２７１であるがこれに限定されないＢ７
Ｈ３阻害剤、Ｂ７ Ｈ４阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＨＨＬＡ２またはＴＭＩＧＤ２阻害剤、ＢＴＮＬ２阻害剤を含むブチロフィリンの阻害剤、ＣＤ２４４またはＣＤ４８阻害剤、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲファミリーメンバーの阻害剤、例えばリリルマブであるがこれに限定されないＫＩＲ阻害剤、ＩＬＴおよびＬＩＲの阻害剤、例えばＩＰＨ２２０１であるがこれに限定されないＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ａ阻害剤、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ阻害剤、ＣＤ２４４阻害剤、例えばエマクツツマブ、カビラリツマブ、ペキシダルチニブ、ＡＲＲＹ３８２、ＢＬＺ９４５であるがこれに限定されないＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＩＮＣＢ０２４３６０であるがこれに限定されないＩＤＯ阻害剤、サリドマイド、レナリドマイド、例えばガルニセルチブであるがこれに限定されないＴＧＦβ阻害剤、アデノシン、またはＣＤ３９またはＣＤ７３阻害剤、例えばウロクプルマブおよび（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｒ，１７Ｒ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ，２９Ｓ，３４ａＳ）－Ｎ－（（Ｓ）－１－アミノ－５－グアニジノ－１－オキソペンタン－２－イル）－２６，２９－ビス（４－アミノブチル）－１７－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－フルオロベンズアミド）－５－グアニジノペンタンアミド）－５－グアニジノペンタンアミド）－３－（ナフタレン－２－イル）プロパンアミド）－６－（３－グアニジノプロピル）－３，２０－ビス（４－ヒドロキシベンジル）－１，４，７，１０，１８，２１，２４，２７，３０－ノナオキソ－９，２３－ビス（３－ウレイドプロピル）トリアコンタヒドロ－１Ｈ，１６Ｈ－ピロール［２，１－ｐ］［１，２］ジチア［５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９］ノナアザシクロドトリアコンチン（ｎｏｎａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｔｒｉａｃｏｎｔｉｎｅ）－１２－カルボキサミド ＢＫＴ１４０であるがこれに限定されないＣＸＣＲ４またはＣＸＣＬ１２阻害剤、例えばバビツキシマブであるがこれに限定されないホスファチジルセリン阻害剤、例えばＣＣ－９０００２であるがこれに限定されないＳＩＲＰＡまたはＣＤ４７、例えばベバシツマブであるがこれに限定されないＶＥＧＦ阻害剤、および、例えばＭＮＲＰ１６８５Ａであるがこれに限定されないニューロピリン阻害剤、からなる群から選択される免疫調節薬である。
医薬組成物
本開示の態様は、本明細書に開示される化合物の併用、またはこうした化合物および薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤もしくは担体を含む１もしくは複数の医薬組成物、の投与を含む治療方法を対象とする。特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩のいずれかおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む第一の医薬組成物と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤、例えばＬＹ３００９１２０であるＲＡＦ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む第二の医薬組成物とを投与することに関与する。特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む第一の医薬組成物と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤、例えばＬＹ３００９１２０であるＲＡＦ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む第二の医薬組成物とを投与することに関与する。特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を投与することに関与する。特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばトラメチニブであるＭＥＫ阻害剤と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体とを含む
医薬組成物を投与することに関与する。
特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を投与することに関与する。特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばウリキセルチニブであるＥＲＫ阻害剤と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を投与することに関与する。
特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばＬＹ３００９１２０であるＲＡＦ阻害剤と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を投与することに関与する。特定の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩と、例えばＬＹ３００１２９０であるＲＡＦ阻害剤と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を投与することに関与する。
〔00170〕本明細書に記載される化合物の医薬組成物の使用において、薬学的に許容可
能な担体は固体または液体のいずれかであり得る。固体形態としては、粉剤、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤、および座薬が挙げられる。粉剤および錠剤は、約５～約９５パーセントの活性成分から構成されてもよい。適切な固体担体は当技術で公知であり、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトースがある。錠剤、粉剤、カシェ剤およびカプセル剤は、経口投与に適した固形剤型として使用可能である。薬学的に許容可能な担体の例、および様々な組成物の製造方法の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡ．Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見ることができる。
液体形態製剤としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。例えば、非経口注射用には水または水－プロピレングリコール溶液、または経口の溶液、懸濁液およびエマルジョン用には甘味剤および乳白剤の添加がある。液体形態製剤としては、鼻腔内投与用の溶液も挙げられる。
特に注射可能な、液体の組成物は、例えば溶解、分散などにより調製可能である。例えば、開示される化合物は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセリン、エタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒に溶解されるか、または混合され、それによって注射可能な等張溶液または懸濁液が形成される。アルブミン、カイロミクロン粒子、または血清タンパク質などのタンパク質を使用して、開示される化合物を可溶化することができる。
非経口注射投与は概して、皮下、筋肉内、または静脈内の注射および点滴に使用される。注射剤は、溶液もしくは懸濁液、または注射前に液体に溶解させることに適した固体の形態のいずれかとして従来的な形態で調製可能である。
吸入に適したエアロゾル製剤もまた使用され得る。これら製剤は、溶液、および粉末形態の固体を含んでもよく、それらは例えば窒素である不活性圧縮ガスなどの薬学的に許容可能な担体と組み合わせる場合がある。
〔00175〕また、使用に関して、経口投与または非経口投与のいずれかのための液体形
態製剤に、使用直前に変えることを意図した固体形態製剤も意図される。そのような液体
形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。
用量
いくつかの実施形態においては、治療プロトコルのために、化合物Ａまたは化合物Ｂ（またはその薬学的に許容可能な塩）が、例えばＭＥＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ）と組み合わせて使用される場合、２つの治療薬は一緒に投与してもよく、または「二重レジメン」であって、２つの治療薬を別個に投薬および投与する二重レジメンで投与してもよい。化合物ＡまたはＢ（またはその薬学的に許容可能な塩）とＭＥＫ阻害剤とが別個に投薬される場合、治療を必要とする対象に投与される化合物Ａまたは化合物Ｂ（またはその薬学的に許容可能な塩）の典型的な用量は、典型的には約５ｍｇ／日～約５０００ｍｇ／日であり、他の実施形態では約５０ｍｇ／日～約１０００ｍｇ／日である。他の用量は、約１０ｍｍｏｌから最大で約２５０ｍｍｏｌ／日、約２０ｍｍｏｌ～約７０ｍｍｏｌ／日、または約３０ｍｍｏｌ～約６０ｍｍｏｌ／日であってもよい。開示の化合物の有効投与量は、示される効果に関して使用される場合、症状の治療に必要とされる本開示化合物を約０．５ｍｇ～約５０００ｍｇの範囲とする。インビボまたはインビトロでの使用のための組成物は、約０．５、５、２０、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、２５００、３５００、または５０００ｍｇの開示の化合物を含有することができ、または、用量の列記中のある量から別の量の範囲で開示の化合物を含有することができる。経口投与に関し、典型的な推奨される１日の投与レジメンは、単一用量で、または２～４に分割した用量で、約１ｍｇ／日～約５００ｍｇ／日または１ｍｇ／日～２００ｍｇ／日の範囲とすることが可能である。一実施形態においては、典型的な１日の経口用量レジメンは１５０ｍｇである。
特定の実施形態においては、ＭＥＫ阻害剤の用量は、先に開示した用量および／または食品医薬品局による使用のために承認された用量と一致する。他の実施形態においては、ＭＥＫ阻害剤の用量は、先に承認された用量未満であり、例えば承認された用量の約２０％、約５０％、または約８０％である。特定の実施形態においては、トラメチニブの用量は、１日に、約．５ｍｇ～２０ｍｇを経口で、例えば１日に約１ｍｇ、または１日に約２ｍｇである。特定の実施形態においては、コビメチニブの用量は、１日に、約１０ｍｇ～２００ｍｇで、例えば１日に約３０ｍｇ、または約６０ｍｇである。特定の実施形態においては、ビニメチニブの用量は、１日に約１０ｍｇ～２００ｍｇを２回、例えば１日に約２５ｍｇまたは約４５ｍｇを２回である。特定の実施形態においては、セルメチニブの用量は、１日に約１０ｍｇ～２００ｍｇで、例えば１日に約３０ｍｇまたは約７５ｍｇを２回である。
本明細書に記載の化合物および／またはその薬学的に許容可能な塩ならびに他の治療薬の投与の量および回数は、患者の年齢、症状および大きさ、ならびに治療される症状の重篤度などの因子を考慮し、担当医の判断に従い調整されることとなる。
本開示の化合物（例えば、化合物Ａまたは化合物Ｂ（およびその薬学的に許容可能な塩）、ＭＥＫ阻害剤、および他の治療薬）は、任意の適切な経路によって投与され得る。化合物は、カプセル剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、糖衣錠、液剤、ゲル、シロップ、スラリーなどで、経口で（例えば食事で）投与可能である。組成物を封入する（硬質ゼラチンまたはシクロデキストラン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒａｎ）のコーティング内になど）ための方法は、当技術で公知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８６）。化合物は、医薬組成物の一部として許容可能な医薬担体と併せて対象に対して投与可能である。医薬組成物の剤型は、選択される投与経路に従って変化することとなる。適切な医薬担体は、化合物と相互作用しない不活性成分を含み得る。担体は生体適合性であり
、すなわち非毒性、非炎症性、非免疫原性であり、投与部位で他の望ましくない反応を発生させない。
〔00180〕例示的な医薬組成物は、本明細書に記載の化合物と、薬学的に許容可能な担
体であって、例えばａ）例えば精製水、例えば水素化された、もしくは部分的に水素化された植物油またはそれらの混合物であるトリグリセリド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、例えばＥＰＡもしくはＤＨＡである魚油もしくはそれらのエステル、もしくはトリグリセリドもしくはその混合物、オメガ－３脂肪酸もしくはその誘導体、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、ナトリウム、サッカリン、グルコースおよび／またはグリシンである希釈剤；ｂ）例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび／またはポリエチレングリコールである潤滑剤、錠剤用でもある；ｃ）例えばケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、炭酸マグネシウム、例えばグルコースまたはベータ－ラクトースなどの天然糖類、トウモロコシ甘味料、例えばアカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然ゴムおよび合成ゴム、ワックスおよび／またはポリビニルピロリドンである結合剤、もし所望であれば；ｄ）例えばデンプン、アガー、メチルセルロース、ベントナイト、キサンタンガム、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物である崩壊剤；ｅ）吸収剤、着色剤、香味剤および甘味剤；ｆ）例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｌａｂｒａｓｏｌ、ＨＰＭＣ、ＤＯＳＳ、Ｃａｐｒｏｙｌ ９０９、Ｌａｂｒａｆａｃ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｐｅｃｅｏｌ、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ、ＣＡＰＭＵＬ ＭＣＭ、ＣＡＰＭＵＬ ＰＧ－１２、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ、ビタミンＥ ＴＧＰＳまたは他の許容可能な乳化剤である、乳化剤または分散剤；および／またはｇ）例えばシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００である、化合物の吸収を強化する薬剤、等である上記担体とを含む錠剤およびゼラチンカプセルである。
固定された用量として調製される場合、かかる配合剤は、本明細書に記載されるまたは当業者に公知の、用量範囲内で本明細書に記載の化合物を採用する。
本明細書に記載の化合物（例えば、化合物Ａおよび化合物Ｂ、およびＭＥＫ阻害剤を含むＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤）は、医薬組成物で使用することが意図されているため、当業者であれば、実質的に純粋な形態で、例えば少なくとも６０％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも８５％純粋、および少なくとも９８％純粋（ｗ／ｗ）でそれらが提供可能であることを理解するであろう。医薬製剤は、単位剤型であってもよい。そのような製剤では、例えば本明細書に記載される望ましい目的を実現する有効量などである適切な量の化合物Ａまたは化合物Ｂを含有する適切な大きさとした単位用量に分割して調製される。
化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩のいずれかを、ＭＥＫ阻害剤またはＥＲＫ阻害剤またはＲＡＦ阻害剤と組み合わせた併用によるｃ－ＫＩＴ媒介性腫瘍細胞の治療が、予期せずに、相乗的に、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することが見出された。さらに、この併用療法は、他のｃ－ＫＩＴ阻害剤および／またはＭＥＫ、ＥＲＫもしくはＲＡＦ阻害剤に対する耐性を与える二次突然変異を伴う腫瘍細胞を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する。さらに、本明細書に開示される併用療法は、薬剤併用治療下でない急速な腫瘍再増殖に対立するものとして、腫瘍細胞の静止に長期的な効果を有するように見えた。さらに、本明細書に開示される併用療法は、単に細胞質効果に対立するものとして、腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を有するように見えた。さらに、本明細書に開示される併用療法は、最
大２１日の薬剤を含まない回復期間を含む併用療法の除去後に腫瘍細胞コロニー増殖なしに、検出限界までＧＩＳＴ腫瘍細胞を根絶するように見えた。この予期せぬ発見の特定には、本明細書に記載されるアッセイを含めて、生化学アッセイおよび細胞アッセイにおいて行った。
本開示は、以下の実施例によってさらに説明するが、それらは、本明細書に記載される具体的な手順に対する範囲または趣旨において本開示を限定するものとはみなされないものとする。実施例は、特定の実施形態を説明するために提示されるものであり、またそれにより本開示の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。さらに本開示の趣旨、および／または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、当業者に示唆され得る様々な他の実施形態、変形物および均等物に対して策がもたれ得ることを理解されたい。
実施例１．トラメチニブとの化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
〔00185〕化合物Ａおよびトラメチニブによる併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１（５７ｂｐ
エクソン１１欠失）イマチニブ感受性細胞、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉ）イマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発することを実証するために、試験を実施した。ウェル当たり１０，０００個のＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥまたはＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉの細胞を播種した９６ウェルプレートでアッセイを行った。細胞を様々な濃度で、ビヒクル対照、化合物Ａ、トラメチニブ、またはその組合せで処置し、細胞を、薬剤処置の存在下で２４時間および４８時間、成長させた。アポトーシスは、カスパーゼ３／７活性を測定することにより評価した。
図１Ａおよび１Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図１Ｂおよび１Ｄは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（１９８４）ならびにＣｈｏｕおよびＭａｒｔｉｎのコンピュータソフトウェア（２００５）により記述される、併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。ＣＩ＜１は、相乗作用を示し、ＣＩ＝１は、相加作用を示し、またＣＩ＞１は、拮抗作用を示す。化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間（図１Ａ、Ｂ）および４８時間（図１Ｃ、Ｄ）の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図１Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図１Ｆは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（１９８４）ならびにＣｈｏｕおよびＭａｒｔｉｎのコンピュータソフトウェア（２００５）により記述される、併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。ＣＩ＜１は、相乗作用を示し、ＣＩ＝１は、相加作用を示し、またＣＩ＞１は、拮抗作用を示す。化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図１Ｇは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図１Ｈは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（１９８４）ならびにＣｈｏｕおよびＭａｒｔｉｎのコンピュータソフトウェア（２００５）により記述される、併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。ＣＩ＜１は、相乗作用を示し、ＣＩ＝１は、相加作用を示し、またＣＩ＞１は、拮抗作用を示す。化合物Ａおよびトラメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩ
ＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例２．トラメチニブとの化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
図２Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図２Ｂは、化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間の併用処置である実施例１に記載するような相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットであり（図２Ａ、Ｂ）、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用を示した。
〔00190〕図２Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞の様々な処置か
らのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図２Ｄは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図２Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図２Ｆは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびトラメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例３．ビニメチニブとの化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
図３Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図３Ｂは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットを示す。化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間（図３Ａ、３Ｂ）の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図３Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図３Ｄは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図３Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図３Ｆは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ａおよびビニメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例４．ビニメチニブとの化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
〔00195〕図４Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ
活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図４Ｂは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（１９８４）により記述される、併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間（図４Ａ、Ｂ）の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図４Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図４Ｄは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図４Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図４Ｆは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびビニメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例５．コビメチニブとの化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１イマチニブ感受性細胞、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
図５Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図５Ｂは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットを示す。化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間（図５Ａ、５Ｂ）の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図５Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図５Ｄは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
〔00200〕図５Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置か
らのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図５Ｆは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ａおよびコビメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例６．コビメチニブとの化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
図６Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図６Ｂは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間（図６Ａ、６Ｂ）の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図６Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパ
ーゼ活性を示すグラフ表示である。図６Ｄは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
図６Ｅは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置からのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図６Ｆは、相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ｂおよびコビメチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例７．ウリキセルチニブ（ＢＶＤ－５２３）との化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
図７Ａは、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の様々な処置に対して決定されたカスパーゼ活性の相対的割合（１００％で設定されたビヒクル対照と比較した）を示すグラフ表示である。図７Ｂは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットを示す。化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２４時間（図７Ａ、７Ｂ）の併用処置では、より高い濃度で、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する強い相乗作用を示した。
〔00205〕図７Ｃは、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞の様々な処置か
らのカスパーゼ活性を示すグラフ表示である。図７Ｄは、実施例１に記載される併用指数（ＣＩ）法に基づく相乗作用のマトリクス図および併用指数プロットである。化合物Ａおよびウリキセルチニブによる２４時間の併用処置により、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞のアポトーシスを誘発する強い相乗作用が示された。
実施例８．ウリキセルチニブ（Ｂｖｄ－５２３）との化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物Ｂおよびウリキセルチニブの併用に関する相乗作用を示し得る。
実施例９．ＳＣＨ７７２９８４との化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物ＡおよびＳＣＨ７７２９８４の併用に関する相乗作用を示し得る。
実施例１０．ＳＣＨ７７２９８４との化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物ＢおよびＳＣＨ７７２９８
４の併用に関する相乗作用を示し得る。
実施例１１．ＬＹ３００９１２０との化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物ＡおよびＬＹ３００９１２０の併用に関する相乗作用を示し得る。
実施例１２．ＬＹ３００９１２０との化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
〔00210〕カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳ
Ｔ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物ＢおよびＬＹ３００９１２０の併用に関する相乗作用を示し得る。
実施例１３．ダブラフェニブとの化合物Ａの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物Ａおよびダブラフェニブの併用に関する相乗作用を示し得る。
．
実施例１４．ダブラフェニブとの化合物Ｂの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する
カスパーゼ活性の相乗作用の図および併用指数プロットを使用して、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞におけるアポトーシスを誘発する際に、化合物Ｂおよびダブラフェニブの併用に関する相乗作用を示し得る。
実施例１５．併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉ）のイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
化合物Ａおよびトラメチニブによる併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１（５７ｂｐエクソン１１欠失）イマチニブ感受性細胞、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅイマチニブ耐性細胞およびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉイマチニブ耐性細胞における細胞増殖を予防することを実証するために、試験を実施した。ウェル当たり１００個の細胞を播種した６ウェルプレートでアッセイを行った。細胞を、様々な濃度でのビヒクル対照、化合物Ａ、トラメチニブ、イマチニブ（ＩＭ）またはその組合せにより処置し、細胞を２週間培養した。処置後、薬剤を洗浄し、細胞を通常培地で１～３週間培養した。増殖した細胞コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。
図８Ａは、代表的培養プレートの画像、ならびに様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。ＧＩＳＴ Ｔ１細胞は、単剤としてのイマチニブおよび化合物Ａに対して感受性である。単剤としてのイマチニブおよび化合物Ａの各々は、ビヒクル対照の２３～３０％までのＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖のほぼ同様の減少を示す
ということに留意されたい。５０ｎＭの化合物Ａおよび５０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのトラメチニブによる２週間の併用処置により、予期せずに、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後９日間でコロニーは検出されなかった（図８Ａの矢印で示す）。対照的に、１００ｎＭのイマチニブおよび５０ｎＭまたは１００ｎＭのトラメチニブのいずれかの２週間の併用処置は、併用処置除去後９日間で、完全な腫瘍細胞の静止または根絶を導かなかった。
〔00215〕図８Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩ
ＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブ（５００ｎＭ）および化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）の各々は、ビヒクル対照の約６１～７２％までのコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能のほぼ同様の欠如を示すということに留意されたい（図８Ｂ）。化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）およびトラメチニブ（１００ｎＭ）による２週間の併用治療により、化合物Ａ（１００ｎＭ）によるほぼ完全な細胞静止、１０日の回復後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、トラメチニブ（１００ｎＭ）および化合物Ａ（２５０ｎＭ）の併用によるＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞における完全な細胞静止またはコロニー増殖の根絶が導かれ（図８Ｂの矢印を参照）、一方で、イマチニブ（５００ｎＭ）およびトラメチニブ（５０ｎＭまたは１００ｎＭ）による２週間の併用処置では、完全な細胞静止または腫瘍細胞の根絶は導かれなかった（図８Ｂのグラフ参照）。これは、薬剤なしで追加で１０日間、細胞を培養した場合に顕著であり、約２０～２５のコロニーが増殖した。図８Ｃは、化合物Ａの濃度を２５ｎＭ、５０ｎＭ、または１００ｎＭまでさらに減少させて、５０ｎＭのトラメチニブと組み合わせて評価した場合の代表的培養プレートの画像を示す。腫瘍コロニーの増殖の５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの完全な腫瘍細胞の静止または根絶は、１０日の回復後に、トラメチニブと組み合わせた１００ｎＭの化合物Ａで達成され（図８Ｃの矢印を参照）、ほぼ完全な腫瘍細胞の静止または概ねの根絶（ビヒクル対照の１％）は、トラメチニブと組み合わせた５０ｎＭの化合物Ａで達成され（図８Ｃの矢印を参照）、また有意な腫瘍細胞の静止または死滅が、２５ｎＭの化合物Ａで達成された（ビヒクル対照の１１％）。対照的に、５０ｎＭのトラメチニブとの１００ｎＭのイマチニブの併用は、腫瘍コロニーの増殖を根絶せず、１０日の回復後に穏やかな腫瘍細胞の静止または死滅を達成した（ビヒクル対照の６０％）。
図８Ｄは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブ（５００ｎＭ）および化合物Ａ（２５０ｎＭまたは５００ｎＭ）の各々は、ビヒクル対照の約４４～４９％までのＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー増殖のほぼ同様の減少を示すということに留意されたい。２５０ｎＭまたは５００ｎＭの化合物Ａによる、５０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのトラメチニブと組み合わせた２週間の処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図８Ｄの矢印で示す）。対照的に、５００ｎＭのイマチニブによる５０ｎＭまたは１００ｎＭのトラメチニブのいずれかと組み合わせた２週間の処置は、併用処置除去後９日間で、完全な腫瘍細胞の静止または腫瘍細胞の根絶を導かなかった。
実施例１６．化合物Ｂのトラメチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
実施例８で説明した実験は、３種のＧＩＳＴ細胞株における化合物Ｂおよびトラメチニブによる併用処置でも実施された。
図９Ａは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。ＧＩＳＴ Ｔ１細胞は単剤として化合物Ｂに感受性であり、ビヒクル対照と比較してＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の４２～５４％の減少を示した。５０ｎＭまたは１００ｎＭの化合物Ｂおよび５０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのトラメチニブによる２週間の併用処置により、コロニー増殖がほぼ無い有意な細胞静止が導かれ、一方で、２５０ｎＭの化合物Ａの５０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのトラメチニブとの併用処置では、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図９Ａの矢印で示す）。合計２０日間の延長された長期の回復後でも、コロニーの増殖は予防された。
図９Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）が、ビヒクル対照の約５９～８４％であるコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能を示すということに留意されたい（図９Ｂ）。化合物Ｂ（２５０ｎＭ）およびトラメチニブ（５０ｎＭ）でのまたは化合物Ｂ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）およびトラメチニブ（１００ｎＭ）での２週間の併用処置により、１０日の回復後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるようなＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞における＞９０％の細胞静止またはコロニー増殖の根絶が導かれ（図９Ｂの矢印を参照）、２０日の延長された長期間の後であっても、化合物Ｂ（２５０ｎＭ）による処置は、トラメチニブ（１００ｎＭ）との併用で、細胞静止または細胞死滅を維持した。
〔00220〕図９Ｃは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩ
ＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）が、ビヒクル対照の約７５～７８％までＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー増殖を示すということに留意されたい。１００ｎＭまたは２５０ｎＭいずれかの化合物Ｂによる、５０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのトラメチニブと組み合わせた２週間の処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図９Ｃの矢印で示す）。増殖の阻害は、薬剤なしでの延長された２０日間の後であっても維持された。
実施例１７．化合物Ａのビニメチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
化合物Ａおよびビニメチニブの併用処置が、実施例１５に説明されているように３種のＧＩＳＴ細胞株におけるコロニー増殖を予防することを実証するために、試験を実施した。
図１０Ａは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブおよび化合物Ａの各々は、ビヒクル対照の３６～４１％までのＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖のほぼ同様の減少を示すということに留意されたい。１００ｎＭまたは２５０ｎＭの化合物Ａおよび５００ｎＭ、１ｕＭ、２ｕＭまたは３ｕＭのいずれかのビニメチニブとの２週間の併用処置を評価した。化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）のビニメチニブ（２ｕＭまたは３ｕＭ）の併用により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１０Ａの矢印で示す）。対照的に、５００ｎＭのイマチニ
ブおよび５００ｎＭ、１ｕＭ、２ｕｍまたは３ｕＭのいずれかのビニメチニブの２週間の併用処置は、併用処置除去後１０日間で、完全な腫瘍細胞静止または根絶をもたらさなかった。効果は、薬剤のない延長された期間のインキュベーション後により明らかであって、イマチニブでは約１０～１５のコロニーが視認されて、化合物Ａではコロニー増殖は観察されなかった。
図１０Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブ（５００ｎＭ）および化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）の各々は、ビヒクル対照の約６０～９５％であるコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能の欠如を示すということに留意されたい（図１０Ｂ）。化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）およびビニメチニブ（５００ｎＭ、１ｕＭ、２ｕＭまたは３ｕＭ）との２週間の併用処置を評価した。化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）のビニメチニブ（３ｕＭ）との併用により、回復の１０日後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞における完全な細胞静止またはコロニー増殖の根絶が導かれ（図１０Ｂの矢印を参照）、一方で、イマチニブ（５００ｎＭ）およびビニメチニブ（５００ｎＭ、１ｕＭ、２ｕＭまたは３ｕＭ）による２週間の併用処置では、完全な細胞静止または腫瘍細胞の根絶は導かれなかった。効果は、延長された期間のインキュベーション後により明らかであり、イマチニブによる処置では完全な阻害は導かれず、一方で、化合物Ａでは、２０日後であっても、細胞静止または細胞死滅が維持された。
図１０Ｃは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉ）のコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブ（５００ｎＭ）はコロニーの減少を何も示さず、一方で、単剤としての化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）は、ビヒクル対照の約７８～８９％までコロニー増殖の用量依存的減少を示すということに留意されたい。１ｕＭ、２ｕＭまたは３ｕＭのビニメチニブと組み合わせた２５０ｎＭの化合物Ａによる２週間の処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１０Ｃの矢印で示す）。３ｕＭのビニメチニブと組み合わせた１００ｎＭの化合物Ａによる２週間の処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１０Ｃの矢印で示す）。細胞静止は、薬剤除去後の延長された２０日の期間後であっても維持された。対照的に、５００ｎＭのイマチニブによる５００ｎＭ、１ｕＭ、２ｕＭまたは３ｕＭのいずれかのビニメチニブと組み合わせた２週間の処置は、併用処置除去後１０日間で、完全な腫瘍細胞の静止または腫瘍細胞の根絶を導かなかった。
実施例１８．化合物Ｂのビニメチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
〔00225〕化合物Ｂおよびビニメチニブの併用処置が、実施例１５に説明されているよ
うに３種のＧＩＳＴ細胞株におけるコロニー増殖を予防することを実証するために、試験を実施した。
図１１Ａは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての各濃度の化合物Ｂは、ビヒクル対照の２７～３１％のまでのＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖のほぼ同様の減少を示すということに留意されたい。２５０ｎＭの化合物Ｂおよび２ｕＭまたは３ｕＭのビニメチニブによる２
週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されず（図１１Ａの矢印で示す）、また２０日の延長された長期の回復期間の後であってもＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の有意な細胞静止または細胞死滅は維持された（図１１Ａの上方右パネル）。１００ｎＭの化合物Ｂおよび３ｕＭのビニメチニブによる２週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１１Ａの矢印で示す）。
図１１Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）は、ビヒクル対照の約７４～８３％のコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能のほぼ同様の欠如を示すということに留意されたい（図１１Ｂ）。１００ｎＭまたは２５０ｎＭの化合物Ｂおよび２ｕＭまたは３ｕＭのいずれかのビニメチニブによる２週間の併用処置におより、回復の１０日後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞における完全な細胞静止またはコロニー増殖の根絶を導いた（図１１Ｂの矢印を参照）。細胞静止は、より高い濃度の化合物Ｂで、延長された２０日の期間後であっても維持された。
図１１Ｃは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）は、ビヒクル対照の約７２～７８％までのＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の減少を示したことに留意されたい。１００ｎＭまたは２５０ｎＭのいずれかの化合物Ｂおよび３ｕＭのビニメチニブによる２週間の処置により、予期せずに、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１１Ｃの矢印で示す）。２５０ｎＭの化合物Ｂおよび２ｕＭのビニメチニブによる２週間の処置により、予期せずに、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１１Ｃの矢印で示す）。細胞静止は、薬剤除去後の延長された２０日の期間後であっても維持された。
実施例１９．化合物Ａのコビメチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
化合物Ａおよびコビメチニブの併用処置が、実施例１５に説明されているように３種のＧＩＳＴ細胞株におけるコロニー増殖を予防することを実証するために、試験を実施した。
〔00230〕図１２Ａは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧ
ＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブおよび化合物Ａの各々は、ビヒクル対照の１８～２３％までのＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖のほぼ同様の減少を示すということに留意されたい。２５０ｎＭの化合物Ａおよび１００ｎＭ、２００ｎＭまたは５００ｎＭのいずれかのコビメチニブによる２週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１２Ａの矢印で示す）。１００ｎＭの化合物Ａおよび５００ｎＭのコビメチニブによる２週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるよう
な検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１２Ａの矢印で示す）。対照的に、５００ｎＭのイマチニブおよび１００ｎＭ、２００ｎＭまたは５００ｎＭのコビメチニブによる２週間の併用処置では、併用処置除去後１０日間で、完全な腫瘍細胞静止または根絶を導かなかった。
効果は、延長された期間のインキュベーション後により明らかであり、５００ｎＭのイマチニブで約１０～１５のコロニーが増殖し、また５００ｎＭの化合物Ａおよび５００ｎＭのコビメチニブではコロニーの増殖は観察されなかった。
図１２Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としてのイマチニブ（５００ｎＭ）および化合物Ａ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）の各々は、ビヒクル対照の約６５～７４％のコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能のほぼ同様の欠如を示すということに留意されたい（図１２Ｂ）。化合物Ａ（２５０ｎＭ）およびコビメチニブ（１００ｎＭ、２００ｎＭまたは５００ｎＭ）による２週間の併用処置により、回復の１０日後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞における完全な細胞静止またはコロニー増殖の根絶が導かれ（図１２Ｂの矢印を参照）、一方で、イマチニブ（５００ｎＭ）およびコビメチニブ（１００ｎＭ、２００ｎＭまたは５００ｎＭ）による２週間の併用処置では、完全な細胞静止または腫瘍細胞の根絶は導かれなかった。効果は、延長された期間のインキュベーション後により明らかであり、イマチニブによる処置では完全な阻害は導かれず、一方で、化合物Ａでは、薬剤の除去後２０日後であっても、有意な細胞静止または細胞死滅の維持が見られた。
図１２Ｃは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。５０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかの化合物Ａの、コビメチニブ（２００ｎＭまたは５００ｎＭ）と組み合わせた２週間の処置により、予期せずに、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるようなＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の＞９９％の阻害が導かれた（図１２Ｃの矢印で示す）。細胞静止は、薬剤除去後の延長された２０日の期間後であっても維持された。対照的に、５００ｎＭのイマチニブによる最大５００ｎＭのコビメチニブと組み合わせた２週間の処置は、併用処置除去後１０日間で、頑健な細胞の静止または細胞の根絶を導かなかった。
実施例２０．化合物Ｂのコビメチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
化合物Ｂおよびコビメチニブの併用処置が、実施例１５に説明されているように３種のＧＩＳＴ細胞株におけるコロニー増殖を予防することを実証するために、試験を実施した。
〔00235〕図１３Ａは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧ
ＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂは、ビヒクル対照の４２～５４％までのＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖のほぼ同様の減少を示すということに留意されたい。５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭの化合物Ｂおよび２００ｎＭまたは５００ｎＭのいずれかのコビメチニブによる２週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全なもしくはほぼ完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１３Ａの矢印で示す）。１００ｎＭまたは２５０ｎＭの化合物Ｂおよび２００ｎＭまたは５００ｎＭのいずれかのコビメチニブによる２週間の併用処置に
より、２０日の延長された長期の回復期間後であっても、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞の有意な細胞静止または細胞死滅が維持された。
図１３Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）が、ビヒクル対照の約５８～８４％のコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能が欠如していることを示すということに留意されたい（図１３Ｂ）。５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭの化合物Ｂおよび２００ｎＭまたは５００ｎＭのいずれかのコビメチニブによる２週間の併用処置により、１０日の回復後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるようなＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞におけるコロニー増殖の＞９０の阻害を導いた（図１３Ｂの矢印を参照）。細胞静止は、より高い濃度での化合物Ｂで、２０日の延長された期間の後であっても有意に維持された。
図１３Ｃは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）は、ビヒクル対照の約７５～７８％までのＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の減少を示したことに留意されたい。５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭのいずれかの化合物Ｂおよび２００ｎＭまたは５００ｎＭのコビメチニブによる２週間の処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１３Ｃの矢印で示す）。細胞静止は、薬剤除去後の延長された２０日の期間後であっても維持された。
実施例２１．化合物Ａのウリキセルチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６ＥおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
化合物Ａおよびウリキセルチニブの併用処置が、実施例１５に説明されているように３種のＧＩＳＴ細胞株におけるコロニー増殖を予防することを実証するために、試験を実施した。
図１４Ａは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１のコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ａは、ビヒクル対照の３７～４１％までのＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖のほぼ同様の減少を示すということに留意されたい。５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭの 化合物Ａおよび１ｕＭ、２ｕＭまたは３ｕＭのいずれかのウリキセルチニブによる２週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるようなＧＩＳＴ Ｔ１コロニー増殖の顕著な減少が導かれた（図１４Ａの矢印に示す）。
〔00240〕図１４Ｂは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧ
ＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ａ（５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）は、ビヒクル対照の約８１～９３％のコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能のほぼ同様の欠如を示すということに留意されたい（図１４Ｂ）。化合物Ａ（２５０ｎＭ）およびウリキセルチニブ（２ｕＭまたは３ｕＭ）による２週間の併用処置が、回復の１０日後に、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅ細胞における完全な細胞静止またはコロニー増殖の根絶を導いた（図１４Ｂの矢印を参照）。
図１４Ｃは、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０Ｉのコロニー数のグラフ表示を示す。１００ｎＭまたは２５０ｎＭのいずれ
かの化合物Ａおよびウリキセルチニブ（２ｕＭまたは３ｕＭ）による２週間の処置により、予期せずに、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｔ６７０Ｉコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１４Ｃの矢印で示す）。細胞静止は、薬剤除去後の延長された２０日の期間後であっても維持された。
実施例２２．化合物Ｂのウリキセルチニブとの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
図１５は、代表的培養プレートの画像、および様々な処置から計数したＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのコロニー数のグラフ表示を示す。単剤としての化合物Ｂ（５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭ）は、ビヒクル対照の約５２～９５％のコロニー増殖を伴い、ＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅの細胞破壊的な効能のほぼ同様の欠如を示すということに留意されたい（図１５）。化合物Ｂ（２５０ｎＭ）およびウリキセルチニブ（３ｕＭ）による２週間の併用処置により、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全な細胞静止またはＧＩＳＴ Ｔ１／Ｄ８１６Ｅコロニー増殖の根絶を導き、併用処置除去後１０日間でコロニーは検出されなかった（図１５の矢印で示す）。
実施例２３．化合物ＡおよびＥＲＫ阻害剤ＳＣＨ７７２９８４の併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
実施例１５に概説したプロトコルを用いて、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０ＩおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニーの増殖を予防する際に、化合物ＡおよびＳＣＨ７７２９８４の併用に関して相乗作用を示すことができる。
実施例２４．化合物ＢおよびＥＲＫ阻害剤ＳＣＨ７７２９８４の併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
実施例１５に概説したプロトコルを用いて、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０ＩおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニーの増殖を予防する際に、化合物ＢおよびＳＣＨ７７２９８４の併用に関して相乗作用を示すことができる。
実施例２５．化合物ＡおよびＲＡＦ阻害剤ＬＹ３００９１２０の併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
〔00245〕実施例１５に概説したプロトコルを用いて、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ
１／Ｔ６７０ＩおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニーの増殖を予防する際に、化合物ＡおよびＬＹ３００９１２０の併用に関して相乗作用を示すことができる。
実施例２６．化合物ＢおよびＲＡＦ阻害剤ＬＹ３００９１２０の併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
実施例１５に概説したプロトコルを用いて、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０ＩおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニーの増殖を予防する際に、化合物ＢおよびＬＹ３００９１２０の併用に関して相乗作用を示すことができる。
実施例２７．化合物ＡおよびＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
実施例１５に概説したプロトコルを用いて、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０ＩおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニーの増殖を予防する際に、化合物Ａおよびダブラフェニブの併用に関して相乗作用を示すことができ
る。
実施例２８．化合物ＢおよびＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブの併用処置が、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニー増殖を予防する
実施例１５に概説したプロトコルを用いて、ＧＩＳＴ－Ｔ１、ＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｔ６７０ＩおよびＧＩＳＴ－Ｔ１／Ｄ８１６Ｅのイマチニブ耐性細胞におけるコロニーの増殖を予防する際に、化合物Ｂおよびダブラフェニブの併用に関して相乗作用を示すことができる。
実施例２９．併用処置が、Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発する
化合物Ａおよびトラメチニブの併用処置が、空のベクター対照（ＥＶ）および突然変異体Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスを誘発することを実証する試験を実施した。ベクター対照またはＮ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞に関して、ウェル当たり１０，０００個の細胞を播種した９６ウェルプレートでアッセイを行った。細胞を様々な濃度で、ビヒクル対照、化合物Ａ、トラメチニブ、またはその組合せで処置し、細胞を４８時間増殖させた。アポトーシスは、カスパーゼ３／７活性を測定することにより評価した。
〔00250〕図１６Ａは、様々な処置後のカスパーゼ活性測定のグラフ表示を提供する。
５０ｎＭの化合物Ａおよびトラメチニブ（５０ｎＭまたは１００ｎＭ）による４８時間の併用処置により、単剤の化合物Ａまたはトラメチニブのいずれかで処置された細胞と比較して、突然変異体Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるアポトーシスの増加を誘発した。
実施例３０．併用処置が、Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるコロニー増殖を予防する
化合物Ａおよびトラメチニブの併用処置が、空のベクター対照および突然変異体Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞における耐性コロニー増殖を予防することを実証する試験を実施した。ウェル当たり１００個の細胞を播種した６ウェルプレートでアッセイを行った。細胞を、ビヒクル対照、５０ｎＭの化合物Ａ、５０ｎＭまたは１００ｎＭのトラメチニブ、またはその組合せにより処置し、細胞を２週間培養した。同じ実験で、細胞をビヒクル対照、１００ｎＭのイマチニブ、５０ｎＭまたは１００ｎＭのトラメチニブ、またはその組合せで処置した。２週間後、薬剤を洗浄し、細胞を通常培地で１～３週間培養した。コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。
図１６Ｂは、代表的培養プレートの画像を示し、また図１６Ｃは、様々な処置後に計数されたベクター対照（図１６Ｂ．１）および突然変異体Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄ（図１６Ｂ．２）を形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１コロニーの数のグラフ表示を示す。ベクター対照およびＮ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ Ｔ－１細胞におけるコロニー増殖の定量化を図１６Ｃ．１および図１６Ｃ．２にそれぞれ示す。１００ｎＭのイマチニブおよび５０ｎＭトラメチニブによる併用処置により、コロニーの増殖が生じ（ビヒクル対照の３５％）、また１００ｎＭのイマチニブの１００ｎＭのトラメチニブとの併用でも、コロニー増殖が生じた（ビヒクルの１９％）。対照的に、トラメチニブとの化合物Ａの併用によって、予期せずに、イマチニブとの併用と比較して、優れた細胞静止または細胞死滅が生じた。５０ｎＭの化合物Ａおよび５０ｎＭのトラメチニブによる２週間の併用処置により、ほぼ完全な細胞静止または細胞死滅を導き（ビヒクル対照の２％）、また５０ｎＭの化合物Ａの１００ｎＭのトラメチニブとの併用が、１０日の薬物洗浄および回復の後で、５倍での実体的顕微鏡検査により視覚化されるような検出限界までの、完全（ビヒクル対照のコロニー増殖の０％）な細胞静止または細胞死滅を導いた（図１６Ｃ．２の矢印を参
照）。
図１６Ｄは、延長した薬剤を含まない回復期間の後に計数された突然変異体Ｎ－ｒａｓ
Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１コロニーの数の代表的培養プレートの画像を示す。１００ｎＭの化合物Ａおよび５０ｎＭまたは１００ｎＭのトラメチニブによる２週間の併用処置により、２１日の延長された長期回復期間の後に、Ｎ－ｒａｓ Ｇ１２Ｄを形質移入したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞におけるコロニー増殖のほぼ完全な阻害を導いた。
実施例３２．併用処置が、薬剤耐性ＧＩＳＴ細胞のコロニー増殖を予防する
発癌性ＫＩＴ Ｖ５６０Ｄ突然変異体により形質移入したＢａ／Ｆ３細胞において、飽和突然変異誘発試験を行った。１８時間にわたり、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＥＮＵ）でＤＮＡニッキングを誘発し、ランダムにＫＩＴ遺伝子または他の遺伝子において追加的な突然変異を生成した。ウェル当たり１００個の細胞を播種した６ウェルプレートでアッセイを行った。ＥＮＵの洗浄後、ウェルを、１０ｎＭのトラメチニブ、２５ｎＭもしくは１００ｎＭもしくは２５０ｎＭの化合物Ａ、または２５ｎＭ、１００ｎＭ、もしくは２５０ｎＭの化合物Ａの１０ｎＭのトラメチニブとの併用と組み合わせた１００ｎＭまたは２５０ｎＭまたは５００ｎＭのイマチニブ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭまたは５００ｎＭのイマチニブと共にインキュベートした。薬剤処置に対する耐性を示すウェルは、Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖を示した。これら細胞をＰＣＲおよびＫＩＴ遺伝子のシーケンシングにかけて、ＥＮＵ処置により誘発された耐性二次突然変異の存在を判断した。
〔00255〕図１７Ａは、イマチニブに対して耐性を示すＢａ／Ｆ３コロニーの増殖を示
すグラフ表示である。Ｔ６７０Ｉ、Ｋ８０７Ｅ、および／またはＤ８１６Ｖのイマチニブ耐性のＫＩＴ二次突然変異体は、単剤としての１００ｎＭ、２５０ｎＭ、または５００ｎＭのイマチニブに曝露されたＢａ／Ｆ３細胞中のゲノムＤＮＡのＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングによって特定された（図１７Ａ、左パネル）。図１７Ａ（右パネル）は、化合物Ａを用いたＢａ／Ｆ３細胞の飽和突然変異誘発試験のグラフ表示である。２５ｎＭ、１００ｎＭまたは２５０ｎＭの化合物Ａでの単剤処置は、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングによって決定されるような新しい耐性二次突然変異の増殖を何も導かなかった。元のＶ５６０Ｄ（親）ＫＩＴ突然変異体を含有するＢａ／Ｆ３細胞のみが、化合物Ａへの曝露後に増殖することを示し、おそらく、ＫＩＴ以外の遺伝子での突然変異を反映している（図１７Ａ、右パネル）。図１７Ｂは、トラメチニブの存在下でのイマチニブまたはトラメチニブの存在下での化合物Ａでの、Ｂａ／Ｆ３細胞コロニー増殖を示すグラフ表示である。１０ｎＭのトラメチニブとの２５０ｎＭまたは５００ｎＭのイマチニブの併用では、新しい耐性二次突然変異の増殖を何も導かなかったが、元のＫＩＴ Ｖ５６０Ｄ（親）細胞の増殖は導き、おそらくＫＩＴ以外の遺伝子における突然変異を反映している（図１７Ｂ、左パネル）。有意には、トラメチニブとのイマチニブの併用試験と対照的に、１０ｎＭのトラメチニブとの２５、１００、または２５０ｎＭの化合物Ａの併用が、任意のウェルの目視検査により決定されるような検出限界までの細胞増殖を何も伴わない、完全な細胞静止または細胞死滅を導いた（図１７Ｂ、右パネル）。
実施例３３．トラメチニブと組み合わせた化合物Ａのインビボ異種移植試験
ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植モデルは、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のすべての法律、規制およびガイドライン、ＭＩ ＢｉｏｒｅｓｅａｒｃｈのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ＡＮＤ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（米国ミシガン州アナーバー）の承認、ＡＡＡＬＡＣ認定施設の承認に従って実施された。すべてのマウスは、随意に食餌および水を与えた。すべてのマウスは、少なくとも１日１回臨床徴候について観察した。Ｅｎｖｉｇｏ社の雌ヌードマウス（ＨｓｄＣｒｌ：無胸腺ヌード－ＮＵ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ、６～７週齢）の右腋窩のすぐ下に、同量のマトリゲルを混合したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中の５００万個の細胞を、２７ゲージ針およびシリンジで皮下接種した。腫瘍量が１０日平均１１７
ｍｍ３に達したとき、マウスは無作為に各群に割り当てられ、すべての群の平均腫瘍量が、試験母集団に対して全体の平均腫瘍量の１０％以内となるようにした。群は、１０～２７日目に以下の処置を行った：ビヒクル対照の食餌（ｎ＝１０）；化合物Ａを、化合物Ａが約１００ｍｇ／ｋｇ／日を達成するようにマウスの食餌に処方した（ｎ＝１０）；または化合物Ａを、化合物Ａが約２５ｍｇ／ｋｇ／日を達成するようにマウスの食餌に処方した（ｎ＝１０）、トラメチニブを０．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで経口投与して、ビヒクル対照の食餌を与えた（ｎ＝１０）、トラメチニブを０．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで経口投与して、化合物Ａを処方した食餌を与えた（約１００ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａでの処置を達成する）（ｎ＝１０）、または、トラメチニブを０．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで経口投与し、化合物Ａを処方した食餌を与えた（約２５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａでの処置を達成する（ｎ＝１０）。２７日目に、全ての動物を対照の食餌にし、腫瘍再増殖を観察した。腫瘍体積および体重は、週に３回測定した。腫瘍量（ｍｇ）は、式：腫瘍量（ｍｇ＝ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２によるカリパス測定から推定された。
図１８Ａおよび１８Ｂは、ビヒクル対照と比較して腫瘍増殖の阻害を示すグラフ表示である。図１８Ｂは、図１８Ａと同じデータであるが、化合物Ａまたは化合物Ａ／トラメチニブで処理したコホートの間での相違を示すために拡大した。トラメチニブを用いた処置は、ビヒクル対照と比較してわずかな腫瘍増殖阻害を導いた。高用量の化合物Ａ（約１００ｍｇ／ｋｇ／日）では、６／１０匹のマウスが完全腫瘍後退となり、残りの４／１０匹のマウスは投与期間中に部分的に腫瘍後退となった。低用量の化合物Ａ（約２５ｍｇ／ｋｇ／日）では、２／１０匹のマウスが完全な腫瘍後退となり、６／１０匹は部分的に腫瘍後退となった。トラメチニブと組み合わせた高用量の化合物Ａ（約１００ｍｇ／ｋｇ／日）では、１０／１０匹のマウスが、投与期間中に完全な腫瘍後退となった。トラメチニブと組み合わせた低用量の化合物Ａ（約２５ｍｇ／ｋｇ／日）では、５／１０匹のマウスが完全な腫瘍後退となり、また５／１０匹は部分的に腫瘍後退となった。さらに、投与期間の後、化合物Ａで処置されたすべてのコホートは、ビヒクル対照の最初の腫瘍増殖よりも遅い腫瘍再増殖となり、６６日目の試験終了までの腫瘍細胞増殖に対する長期的な効果を示している。高用量の化合物Ａ（約１００ｍｇ／ｋｇ／日）では、１／１０匹のマウスは試験終了時に部分的な腫瘍後退のままであった。低用量の化合物Ａ（約２５ｍｇ／ｋｇ／日）では、２／１０匹のマウスは試験終了時に部分的な腫瘍後退のままであった。トラメチニブと組み合わせた高用量の化合物Ａ（約１００ｍｇ／ｋｇ／日）では、１／１０匹のマウスは完全腫瘍後退のままであり、また４／１０匹のマウスは、試験終了時に部分的な腫瘍後退のままであった。トラメチニブと組み合わせた低用量の化合物Ａ（約２５ｍｇ／ｋｇ／日）では、２／１０匹のマウスは試験終了時に部分的な腫瘍後退のままであった。これらデータは、化合物Ａとトラメチニブとの併用が細胞死を誘発し、および／または、投与後少なくとも４０日間の長い細胞静止を完成することを示している。
実施例３４．化合物Ａは、ＢＣＲＰ排出トランスポーターの強力な阻害剤である
化合物ＡでのＢＣＲＰ薬物排出トランスポーターの阻害を調べるために、低浸透性プローブ基質およびＡＴＰ存在下でＢＣＲＰ発現細胞で調製されたインサイドアウト膜小胞を用いて、小胞輸送阻害アッセイを行った。プローブ基質のトランスポーター含有小胞への取り込みを改変する化合物Ａの可能性が測定された。
ヒトの排出トランスポーターＢＣＲＰによる化合物Ａのインビトロ相互作用ポテンシャルを、小胞輸送阻害アッセイで、７つの濃度で調査した。化合物ＡはＢＣＲＰのプローブ基質の輸送を有効に阻害し、ここで試験された最低濃度（０．０４μＭ）において、４４％の阻害が観察された。ＩＣ５０値はおよそ０．０４μＭであると推定された。
均等物
〔00260〕当業者であれば、本開示に具体的に記載される特定の実施形態に対する多数
の均等を、通例の実験程度のものにより、認識することができ、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (56)

  1. それを必要とする患者における１または複数のｃ－ＫＩＴ突然変異を伴う腫瘍を治療する方法であって、前記患者に対して：
    有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩と、
    有効量の１または複数のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤とを投与することを含む、方法。
  2. 前記ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤（ＭＥＫ阻害剤）、および有効量の細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤（ＥＲＫ阻害剤）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｃ－ＫＩＴ突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン９、エクソン１１、エクソン１３、またはエクソン１７における一次突然変異である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記腫瘍は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子における１または複数の耐性二次突然変異を伴う、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記耐性二次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１３、エクソン１４、エクソン１７またはエクソン１８にある、請求項４に記載の方法。
  6. 前記耐性二次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１７にある、請求項５に記載の方法。
  7. ｃ－ＫＩＴ突然変異は、欠失突然変異である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記耐性二次突然変異は、コドン８１６におけるアスパラギン酸の置換、またはコドン８２２におけるアスパラギンの置換である、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記耐性二次突然変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｅ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８２０Ａ、Ｔ６７０Ｉ、またはＮ８２２Ｖのうちの１つである、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記耐性二次突然変異は、Ｖ６５４ＡまたはＴ６７０Ｉのうちの１つである、請求項４から５のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記耐性二次突然変異は、イマチニブ、スニチニブもしくはレゴラフェニブ、またはその薬学的に許容可能な塩の、患者への先の投与後に取得された、請求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 腫瘍がｃ－ＫＩＴ二次突然変異を伴うかどうかを判断することをさらに含む、請求項４から１１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 腫瘍がｃ－ＫＩＴ二次突然変異を伴うかどうかを判断することは、腫瘍試料から抽出されたＤＮＡにおける突然変異を特定することを含む、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 腫瘍がｃ－ＫＩＴ二次突然変異を伴うかどうかを判断することは、血中腫瘍ＤＮＡにおける突然変異を特定することを含む、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 腫瘍は、イマチニブメシル酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、またはレゴラフェニブに耐性を示した、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、グリア芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記腫瘍はメラノーマである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記腫瘍はＧＩＳＴである、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記患者に対して、癌標的治療薬、癌標的生物製剤、免疫チェックポイント阻害剤、免疫調節薬および／または化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＲＡＦ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩と、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤とを、実質的に同時に、または連続的に投与する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、およびビニメチニブからなる群から選択される、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ＭＥＫ阻害剤は、ビニメチニブである、請求項２から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブである、請求項２から２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＥＲＫ阻害剤は、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）、ＳＣＨ７７２９８４、およびＬＹ３２１４９９６からなる群から選択される、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
  26. ２週間以上投与すると、患者は、腫瘍体積の少なくとも３０％の部分的な減少となる、請求項２から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記治療が、腫瘍体積の完全な減少をもたらす、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 腫瘍または腫瘍細胞がｃ－ＫＩＴ遺伝子の一次突然変異を含むかどうかを判断することをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 一次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１１にある、請求項２８に記載の方法。
  30. 一次突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン９にある、請求項２８に記載の方法。
  31. 一次突然変異は、欠失突然変異である、請求項２８から３０のいずれかに記載の方法。
  32. 一次突然変異はＶ５６０Ｄである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. １または複数の追加的な二次突然変異であるｃ－ＫＩＴ突然変異が存在する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. イマチニブ耐性の患者における固形腫瘍を治療する方法であって、
    患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、前記患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブおよびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含むものであって、前記固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、神経膠芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される、方法。
  35. ＲＡＦ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＲＡＦ阻害剤は、汎ＲＡＦ阻害剤である、請求項３５に記載の方法。
  37. それを必要とする患者における、イマチニブ耐性の消化管間質腫瘍またはイマチニブ耐性のメラノーマを治療する方法であって、
    患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、
    前記患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブ、及びウリキセルチニブからなる群から選択される、有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含む、方法。
  38. 腫瘍がｃ－ＫＩＴ遺伝子の突然変異を伴うか否かを判断することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１７にある、請求項３８に記載の方法。
  40. ｃ－ＫＩＴ突然変異は、コドン８１６におけるアスパラギン酸の置換、またはコドン８２２におけるアスパラギンの置換である、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 突然変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｅ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８２０Ａ、Ｔ６７０Ｉ、またはＮ８２２Ｖのうちの１つである、請求項３８または３９に記載の方法。
  42. 突然変異は、エクソン１３のＶ６５４Ａ突然変異またはエクソン１４のＴ６７０Ｉ突然変異である、請求項３８に記載の方法。
  43. それを必要とする患者における固形腫瘍を治療する方法であって、
    患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフ
    ェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、
    前記患者に対して、有効量のＲＡＦ阻害剤を投与することとを含む、方法。
  44. 前記固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、ＧＩＳＴ、およびメラノーマからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記固形腫瘍が、ｃ－ＫＩＴ遺伝子の１または複数の突然変異を伴う、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. ＲＡＦ阻害剤は、汎ＲＡＦ阻害剤である、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. ＲＡＦ阻害剤は、ダブラフェニブまたはＬＹ３００９１２０である、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. それを必要とする患者における固形腫瘍を治療する方法であって、
    患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、前記患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブおよびウリキセルチニブからなる群から選択される有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含むものであって、前記固形腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、神経膠芽腫、小児グリオーマ、星状細胞腫、肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、およびメラノーマからなる群から選択される、方法。
  49. ＲＡＦ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  50. ＲＡＦ阻害剤は、汎ＲＡＦ阻害剤である、請求項４９に記載の方法。
  51. それを必要とする患者における、消化管間質腫瘍またはメラノーマを治療する方法であって、
    患者に対して、有効量の１－［４－ブロモ－５－［１－エチル－７－（メチルアミノ）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－１，６－ナフチリジン－３－イル］－２－フルオロフェニル］－３－フェニル尿素、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することと、
    前記患者に対して、トラメチニブ、ビニメチニブ、コビメチニブ、及びウリキセルチニブからなる群から選択される、有効量のＭＡＰＫＡＰキナーゼ阻害剤を投与することとを含む、方法。
  52. 腫瘍がｃ－ＫＩＴ遺伝子の突然変異を伴うか否かを判断することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 突然変異は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子のエクソン１７にある、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ｃ－ＫＩＴ突然変異は、コドン８１６におけるアスパラギン酸の置換、またはコドン８２２におけるアスパラギンの置換である、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 突然変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｅ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８２０Ａ、Ｔ６７０Ｉ、またはＮ８２２Ｖのうちの１つである、請求項５２または５３に記載の方法。
  56. 突然変異は、エクソン１３のＶ６５４Ａ突然変異またはエクソン１４のＴ６７０Ｉ突然
    変異である、請求項５２に記載の方法。
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