CN101222850A - 治疗对药物有抗性的癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
治疗对药物有抗性的癌症的方法,该方法包括:给需要其的患者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中患者是患有对药物有抗性的癌症的癌症患者,其中式I化合物如本申请中所定义。
Description
发明领域
概括而言,本发明涉及治疗癌症的方法。更具体而言,本发明涉及用于治疗对药物有抗性的癌症和患有对药物有抗性的癌症的患者的方法和4-氨基取代的喹啉酮苯并咪唑基化合物如4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮化合物以及包含这类化合物的药物制剂。
发明背景
多种化合物和组合物已经被报道具有对抗一种或多种血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGF-RTK)的活性。实例包括喹啉衍生物如WO98/13350中所述的喹啉衍生物、氨基烟酰胺衍生物(例如参见WO01/55114)、反义化合物(例如参见WO 01/52904)、模拟肽(peptidomimetics)(例如参见WO 01/52875)、喹唑啉衍生物(例如参见美国专利6,258,951)、单克隆抗体(例如参见EP 1 086 705 A1)、多种5,10,15,20-四芳基-卟啉和5,10,15-三芳基-corroles(例如参见WO 00/27379)、杂环烷烃磺酸和烷烃羧酸衍生物(例如参见DE19841985)、羟吲哚基喹唑啉衍生物(例如参见WO99/10349)、1,4-二氮杂蒽(anthracine)衍生物(例如参见美国专利5,763,441)和噌啉衍生物(例如参见WO 97/34876)以及多种吲唑化合物(例如参见WO01/02369和WO 01/53268)。
多篇参考文献中公开了4-羟基喹诺酮和4-羟基喹啉衍生物的合成。例如,Ukrainets等人已经公开了3-(苯并咪唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉的合成。Ukrainets,I.等人,Tetrahedron Lett.42,7747-7748(1995);Ukrainets,I.等人,Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii,2,239-241(1992)。Ukrainets还已经公开了其它4-羟基喹诺酮和硫类似物如1H-2-氧代-3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基喹啉的合成、抗惊厥和抗甲状腺活性。Ukrainets,I.等人,Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii,1,105-108(1993);Ukrainets,I.等人,Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii,8,1105-1108(1993);Ukrainets,I.等人,Chem.Heterocyclic Comp.33,600-604,(1997)。
WO 97/48694中公开了多种喹啉衍生物的合成。公开了这些化合物能够与核激素受体结合并且可用于刺激成骨细胞增殖和骨生长。还公开了这些化合物可用于治疗或预防与核激素受体家族有关的疾病。
WO 92/18483中公开了其中喹啉的苯环被含硫基团取代的多种喹啉衍生物。公开了这些化合物可用于药物制剂和用作药物。
已经公开了喹诺酮和香豆素衍生物在与医药和药物制剂无关的多种应用中具有用途。描述制备用于可光聚合的组合物或发光性质的喹诺酮衍生物的参考文献包括:Okamoto等人的美国专利5,801,212、JP 8-29973、JP7-43896、JP 6-9952、JP 63-258903、EP 797376和DE 23 63 459。
近来,参考文献如WO 02/22598和WO 2004/043389中已经公开了多种被取代的喹啉酮化合物,包括喹啉酮苯并咪唑基化合物和4-氨基取代的喹啉酮苯并咪唑基化合物、例如4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮。公开了这些化合物可抑制VEGF-RTKs。这些化合物还在公开的美国专利申请U.S.2002/0107392和U.S.2003/0028018以及美国专利6,605,617、6,774,237和6,762,194中被公开。近来,WO 02/18383、U.S.2002/0103230和美国专利6,756,383中已经公开了与苯并咪唑基喹啉酮有关的杂环化合物。于2003年8月19日提交并且要求以下临时申请各自的优先权的WO 2004/018419和U.S.2004/0092535中公开了其它这类化合物以及这类化合物在抑制丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶中的新用途:于2002年8月23日提交的美国临时申请60/405,729、于2002年11月13日提交的美国临时申请60/426,107、于2002年11月13日提交的美国临时申请60/426,226、于2002年11月13日提交的美国临时申请60/426,282、于2002年11月21日提交的美国临时申请60/428,210、于2003年4月3日提交的美国临时申请60/460,327、于2003年4月3日提交的美国临时申请、于2003年4月3日提交的美国临时申请60/460,493、于2003年6月16日提交的美国临时申请60/478,916和于2003年7月1日提交的美国临时申请60/484,048。于2004年11月5日提交的以下专利申请中还公开了其它化合物、它们的合成方法、其乳酸盐及其用途:美国专利申请10/983,174、美国专利申请10/982,757和美国专利申请10/982,5423。本段中的文件各自整体引入本文作为参考并用于所有目的,如同本文阐述了其全文一样。
近来已经发现了可用于治疗癌症的多种新化合物。例如,Gleevec(甲磺酸伊马替尼)是近来在多种不同癌症中已经显示出显著活性的化合物。于2001年5月Gleevec首次对慢性髓性白血病(CML)患者而言是可获得的。根据Novartis网站,Gleevec被指示可用于治疗新诊断的患有慢性期费城染色体阳性(Ph+)CML的成人患者。随访是有限的。Gleevec还被指示可用于治疗在α干扰素治疗失败后的原始细胞危象期、加速期或慢性期pH+CML患者。Gleevec还被指示可用于治疗在干细胞移植后疾病已经复发或者对α干扰素治疗有抗性的pH+慢性期CML儿科患者。Gleevec已经被批准用于患有其它癌症如胃肠道间质瘤(GIST)的患者。例如,FDA于2002年2月1日批准了Novartis将Gleevec用于治疗患有KIT(CD117)阳性的不能切除和/或转移的恶性GIST的患者。
目前正在对在治疗癌症中的效能进行测定的其它新的实验性药物包括BAY43-9006(索拉非尼(sorafenib))和Brostallicin。美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了BAY 43-9006为用于治疗肾细胞癌的罕用药状态。正在对BAY 43-9006用于治疗转移性肾细胞癌(肾癌的晚期形式)进行评价。在欧盟,欧洲药品局(EMEA)罕用药品委员会(COMP)已经准许了类似的称号。BAY 43-9006是新的RAF激酶和VEGFR抑制剂,其通过兼有以下两种抗癌活性而用于预防肿瘤生长:抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤血管发生。Brostallicin(PNU-166196)是在结构上与偏端霉素A有关的合成的α-溴代丙烯酸第二代DNA小沟结合物,其目前在欧洲和美国处于II期试验。与其它小沟结合物相比,该化合物在临床前模型中显示出了广泛的抗肿瘤活性,并且在体外显著降低了在人造血祖细胞中的骨髓毒性。在常规抗肿瘤剂的细胞毒性不受影响或被降低的条件下,Brostallicin在对美法仑耐药的L1210鼠白血病细胞中比在亲本品系中显示的活性高3倍(IC50分别为0.46和1.45ng/mL)。
尽管在开发治疗癌症的药物组合物方面已经取得了显著的进步,但是仍然需要治疗癌症的新方法。特别需要可用于治疗对药物有抗性的癌症和患有对药物有抗性的癌症的患者的药物组合物和用于制备药物组合物的化合物。还需要可以与已知的抗癌剂联合施用于患有对药物有抗性的癌症的患者的药物组合物和化合物。
发明概述
本发明提供了治疗癌症的方法、治疗对药物有抗性的癌症的方法以及用于在受治疗者如患有对药物有抗性的癌症的那些受治疗者中治疗癌症的药盒和治疗组合物。
一方面,本发明提供了治疗对药物有抗性的癌症的方法。该方法包括给需要其的受治疗者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物。在一些实施方案中,受治疗者是患有对药物有抗性的癌症的癌症患者。式I化合物具有下式结构:
其中:
R1、R2、R3和R4可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR10基团、-NR11R12基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基;
R5、R6、R7和R8可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR13基团、-NR14R15基团、-SR16基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R10和R13可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R11和R14可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;
R12和R15可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;并且
R16选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基。
另一方面,本发明提供了治疗癌症的方法。该方法包括给需要其的受治疗者施用选自甲磺酸伊马替尼(Gleevec)、BAY43-9006、Brostallicin、来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(erlotinib)(Tarceva)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib、贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab和/或利妥昔单抗的抗癌药以及式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物。式I化合物具有上述的结构和变量。
另一方面,本发明提供了药盒和治疗组合物。药盒和治疗组合物包括抗癌药和式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物。治疗组合物包括作为组合制剂用于同时、分别或依次使用来治疗患有对药物有抗性的癌症的受治疗者的抗癌药和式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物。式I化合物具有上述的结构和变量。
另一方面,本发明提供了在受治疗者中抑制激酶的方法。该方法包括给需要其的受治疗者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物。式I化合物具有上述的结构和变量,受治疗者是癌症患者,并且激酶包含突变的看门残基(gatekeeper residue)。
本发明的另外的目的、特征和优点从以下详述中将是显而易见的。
附图简述
图1是显示SCID-beige小鼠在静脉内注射KMS-11-luc细胞后采用IVIS显像系统(Xenogen)得到的全身生物发光成像(BLI)的扫描图。
图2显示,用KMS-11-luc细胞注射并用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(20mg/kg/日)处置的SCID-BEIGE小鼠显示出的平均光子计数显著低于用载体处置的那些。
图3是SCID-beige小鼠在静脉内注射KMS-11-luc细胞后采用IVIS显像系统(Xenogen)得到的全身BLI的扫描图。左侧的BLI是用载体处置的小鼠的BLI,右侧的BLI是用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物,20mg/kg/日)处置的小鼠的BLI。
图4比较了静脉内注射KMS-11-luc细胞、然后用载体(菱形)或用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(三角形,20mg/kg/日)处置的SCID-beige小鼠的存活百分率。
图5-7表明4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)调节FLT3靶标表达,并证明了对抗MV4;11和RS4;11细胞的抗增殖作用。在图5中,将MV4;11(▲)或RS4;11(在FLT3配体的存在下)(■)与化合物1的系列稀释液孵育。在72小时孵育期后,通过MTS测定法测定了细胞成活力。使用非线性回归计算了EC50值。将血清饥饿的MV4;11(ITD)(在图6中)或RS4;11(WT)(在图7中)细胞与浓度增加的化合物1孵育3小时,然后将细胞溶解。如所示的那样,将RS4;11细胞用FLT3配体(100ng/ml)刺激15分钟。将全细胞溶解产物用抗人FLT3抗体进行免疫沉淀,通过SDS-PAGE进行解析。用抗磷酸酪氨酸抗体探测了免疫印迹(上泳道)。脱去膜,用抗FLT3再次进行了探测,以证明FLT3的装载相同(下泳道)。使用密度测定法将pFLT3的变化报告为基线(未经处置)的百分数。
图8和9表明,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)剂量依赖性地抑制MV4;11细胞中FLT3介导的ERK和STAT5磷酸化。将MV4;11细胞(血清饥饿的)与多种浓度的化合物1孵育3小时,通过蛋白质印迹法检测了细胞内的pERK(图8),使用流式细胞仪测定了pSTAT5(图9)。使用密度测定法将pERK或pSTAT5的变化报告为基线(未经处置)的百分数。
图10表明,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)在体外抑制由MV4;11细胞产生的自分泌VEGF生成。将在含有10%FBS的培养基中培养的MV4;11 AML细胞在使用或不使用0.001、0.01、0.1、0.5和1μM化合物1的情况下孵育48小时。分析上层液的人VEGF水平(针对细胞蛋白含量进行标准化)。
图11表明,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)在SCID-NOD小鼠中抑制肿瘤异种移植物中FLT3和STAT5的磷酸化。将皮下带有MV4;11肿瘤(300mm3;n=3只小鼠/组)的SCID-NOD小鼠用载体或10mg/kg化合物1处置5天。在第5天于给药后4、8、24和48小时将肿瘤切除,粉碎,立即快速冷冻(-70℃)。对于pFLT3或pSTAT5调节:将肿瘤溶解产物用抗人FLT3或抗STAT5抗体进行了免疫沉淀,通过SDS-PAGE进行解析。用适宜的抗磷酸酪氨酸抗体探测免疫印迹(上泳道)。脱去膜,用抗FLT3或抗STAT5再次进行探测,以测定作为装载对照的总FLT3或STAT5蛋白(下泳道)。各泳道代表单独的肿瘤。
图12-16表明了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)在SCID-NOD小鼠中在人MV4;11或RS4;11白血病肿瘤的皮下异种移植物模型中的抗肿瘤活性。将(图12)MV4;11或(图13)RS4;11细胞皮下植入到SCID-NOD小鼠(n=10只小鼠/组)的右胁腹中。在MV4;11研究中,当肿瘤为~300mm3时,口服施用载体(◇)或以1(●)、5(▲)或30(■)mg/kg/日的剂量口服施用化合物1,共计15天。在RS4;11研究中,当肿瘤为~300mm3时,口服施用载体(◇)或以10(▲)、30(■)、100(◆)或150(●)mg/kg/日的剂量口服施用化合物1,共计8天。(图14)化合物1的每天、间断和周期性给药方案对MV4;11肿瘤的效能的影响。以30mg/kg的剂量每天(■)、隔日/q.o.d.(●)或周期性进行7天给药/7天停药(X)口服施用化合物1。(图15)化合物1引起大MV4;11肿瘤消退。MV4;11皮下肿瘤(n=10只小鼠/组)在300(▲)、500(■)或1000(●)mm3进行分类。测得用载体(◆)处置的肿瘤的最大肿瘤体积为2000mm3(在图16中仅显示至1000mm3)。以30mg/kg/日的剂量口服施用化合物1(第一个周期)。50天后停止给药,此后监测响应的耐久性。(图16)将用30mg/kg/日×50天预处置后复发的MV4;11肿瘤用30mg/kg/日的剂量再次进行处置(第二个周期)。AD组,数据被表示为平均肿瘤体积±SE(n=10只小鼠/组),E组说明了各小鼠的肿瘤体积(n=10)。
图17-19表明了在用30mg/kg 4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)处置的SCID-NOD小鼠中MV4;11或RS4;11肿瘤的肿瘤细胞凋亡/坏死和其细胞增殖的抑制。(图17)早期的MV4;11肿瘤对30mg/kg化合物1处置有响应。将皮下带有MV4;11肿瘤的SCID-NOD小鼠(n=3-5只/组)用载体(a-e)或30mg/kg/日的化合物1(f-j)处置5天。在第2-5天将肿瘤切除。将石蜡包埋的肿瘤用苏木精和伊红(a,f-第1天)染色或者用Ki67(b,g-第5天)、pERK(c,h第5天)、被切割的胱天蛋白酶-3(d,i-第5天)或PARP(e,j-第5天)(含苏木精复染剂)进行免疫染色。图17说明了来自n=3个经处置肿瘤各自的代表性切片。(图18)用30mg/kg化合物1处置后的RS4;11肿瘤的免疫组织化学。将RS4;11肿瘤(n=3-5只/组)用载体(a-c)或30mg/kg/日的化合物1(d-f)处置。在第9天将肿瘤切除。将石蜡包埋的肿瘤用苏木精和伊红(a,d)染色或者用Ki67(b,e)或pERK(c,f)进行免疫染色。图18说明了来自n=3个经处置肿瘤各自的代表性切片。(图19)将皮下带有MV4;11肿瘤的SCID-NOD小鼠(n=3-5只/组)用载体或30mg/kg/日的化合物1处置。在第15天将用载体处置的肿瘤切除,在第89天将用化合物1处置的肿瘤切除(50天给予日剂量的化合物1+39天不进行处置)。将石蜡包埋的肿瘤用苏木精和伊红染色或者用Ki67(含苏木精复染剂)进行免疫染色。(a)载体(H&E,第15天);(b)载体(Ki67,第15天);(c)化合物1,部分响应(H&E,第89天);(d)化合物1,部分响应(Ki67,第89天)和(e)化合物1,完全响应(H&E,第89天)。c、d中的箭头指向分散在坏死/瘢痕组织中的活细胞区域。图19说明了来自n=3-5个经处置肿瘤的代表性切片。所采用的图像的放大倍数被标明在图上。
图20和21表明,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)可延长带有静脉内MV4;11细胞的SCID-NOD小鼠的存活。将MV4;11(1×107个细胞,静脉内)静脉内植入到受照射的SCID-NOD小鼠中。在第23天开始处置,包括从第23-98天口服载体(◆)或者每天(▲)或按照预定的7天给药/7天停药(■)给予20mg/kg的化合物1。将产生后肢麻痹或健康状况差的早期体征的小鼠处以安乐死。图20说明了Kaplan-Meier存活百分率对时间的图(n=10-12只小鼠/组)。(图21)静脉内接种MV4;11细胞后BM的流式细胞评价或组织病理学评价。处置包括载体(a-c)或20mg/kg/日的化合物1(d-f;第23-98天)。在第51天(a-d)或第167天(e,f)收集股骨,分离BM,使用流式细胞仪分析人MV4;11细胞%(a,d)。将BM细胞用抗人HLAA、B,C-FITC(将人MHC-I上的表位染色,实线)或同型-对照抗体(虚线)染色。进行适宜的门控(gating)和抗人HLA-A,B,C(标记)正染色后,鉴别了植入细胞百分率。将用载体处置(第51天)或化合物1处置(第167天)的小鼠的BM标本用H&E(b,e)进行组织化学染色,或者用可将小鼠BM中人MV4;11细胞染色的抗人线粒体抗体(c,f)进行免疫染色。放大倍数为400×;箭头指向被鉴别的MV4;11细胞(b,c)。
图22显示了本发明的化合物是如何选择性地抑制III、IV和V类受体酪氨酸激酶的(还参见4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮对抗多种RTKs的活性的表)。
图23a和23b是将肿瘤体积作为用载体和用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置的天数的函数而制得的图。这些图表明,用化合物1进行的处置可在90-100%具有大的已确定的结肠异种移植物的动物中引起消退和/或疾病稳定(当肿瘤达到500mm3(23a)或1000mm3(23b)时,每天用化合物1对裸小鼠中的KM12L4A人结肠肿瘤异种移植物进行给药)。
图24是用化合物1(CHIR258)处置的患有对伊马替尼有抗性的GIST的人类女性患者的扫描PET-CT图。
图25a和25b是平均Cmax(ng/mL)对剂量和平均AUC(0,t最后(ng*h/mL))的图,这些图表明,当施用化合物1时,血浆暴露(plasma exposure)按比例增加。
图26是蛋白质印迹的扫描图,该图表明,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮可抑制外周血白细胞(PBL)中的基础ERK磷酸化。阳性对照样品是来自正常供体的血细胞,处置与临床样品相同。
发明详述
本发明提供了治疗癌症的方法、治疗对药物有抗性的癌症的方法以及用于在受治疗者如患有对药物有抗性的癌症的那些受治疗者中治疗癌症的药盒和治疗组合物。这些化合物可用作受体酪氨酸激酶的拮抗剂,更特别地,可用作PDGFRα和PDGFRβ、bFGF和/或VEGF-RTK功能的抑制剂。这些化合物还对其它酪氨酸激酶以及多种丝氨酸/苏氨酸激酶具有有效的活性。本文提供的化合物可以被配制成可用于例如如下用途的药物制剂:治疗需要VEGF-RTK抑制剂的患者,尤其是用于减少毛细血管增殖的组合物和方法,以及治疗癌症、特别是对药物有抗性的癌症。
在本申请通篇使用了以下缩写和定义:
“AML”是代表急性髓性白血病的缩写。
“ALS”是代表肌萎缩性侧索硬化的缩写。
“AD”是代表阿尔茨海默病的缩写。
“APP”是代表淀粉样前体蛋白的缩写。
“ASCT”是代表自体干细胞移植的缩写。
“BM”是代表骨髓的缩写。
“bFGF”是代表碱性成纤维细胞生长因子的缩写。
“FGFR1”,还称为bFGFR,是代表与成纤维细胞生长因子FGF相互作用的酪氨酸激酶的缩写。
“Cdc2”是代表细胞分裂周期2的缩写。
“Cdk2”是代表细胞周期蛋白依赖性激酶2的缩写。
“Cdk4”是代表细胞周期蛋白依赖性激酶4的缩写。
“Chk1”是代表限制点激酶1(checkpoint kinase1)的缩写。
“CK1ε”是代表酪蛋白激酶1(ε)的丝氨酸/苏氨酸激酶。
“c-ABL”是代表最初从埃布尔森(Abelson)白血病病毒中分离的癌基因产物的酪氨酸激酶的缩写。
“C-Kit”还称为干细胞因子受体或肥大细胞生长因子受体。
“FGF”是代表与FGFR1相互作用的成纤维细胞生长因子的缩写。
“FGFR3”是代表通常在多发性骨髓瘤型癌症中表达的酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体3的缩写。
“Flk-1”是代表胎儿肝脏酪氨酸激酶1的缩写,其还称为激酶-嵌入结构域酪氨酸激酶或KDR(人),还称为血管内皮生长因子受体-2或VEGFR2(KDR(人),Flk-1(小鼠))。
“FLT-1”是代表fms样酪氨酸激酶-1的缩写,其还称为血管内皮生长因子受体-1或VEGFR1。
“FLT-3”是代表fms样酪氨酸激酶-3的缩写,其还称为干细胞酪氨酸激酶I(STKI)。
“FLT-4”是代表fms样酪氨酸激酶-4的缩写,其还称为VEGFR3。
“Fyn”是代表与SRC、FGR、YES有关的FYN癌基因激酶的缩写。
“GSK-3”是代表糖原合成酶激酶3的缩写。
“PAR-1”是代表还称为散乱联合激酶(disheveled associated kinase)的激酶的缩写,其还称为HDAK。
“Lck”是代表淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶的缩写。
“MEK1”是代表在由Raf-MEK1-ERK组成的组件中、在MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)信号转导途径中的丝氨酸苏氨酸激酶的缩写。MEK1可使ERK(细胞外调节激酶)磷酸化。
“MM”是代表多发性骨髓瘤的缩写。
“NEK-2”是代表NIM-A相关性激酶的缩写。
“NIM-A”是代表有丝分裂中的never的缩写。
“PDGF”是代表血小板衍生生长因子的缩写。PDGF可与酪氨酸激酶PDGFRα和PDGFRβ相互作用。
“Rsk2”是代表核糖体S6激酶2的缩写。
“Raf”是MAPK信号转导途径中的丝氨酸/苏氨酸激酶。
“RTK”是代表受体酪氨酸激酶的缩写。
“Tie-2”是代表具有Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶的缩写。
“VEGF”是代表血管内皮生长因子的缩写。
“VEGF-RTK”是代表血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶的缩写。
通常,某种元素如氢或H的称谓意欲包括该元素的所有同位素。例如,如果R基团被定义为包括氢或H,则其还包括氘和氚。
短语“未取代的烷基”指不合杂原子的烷基。因此,该短语包括直链烷基,例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。该短语还包括直链烷基的支链异构体,包括但不限于以举例方式提供的以下基团:-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)及其它。该短语还包括环状烷基,例如环烷基,如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基,并且这些环可被如上定义的直链和支链烷基取代。该短语还包括多环烷基,例如但不限于金刚烷基、降冰片基(norbornyl)和二环[2.2.2]辛基,并且这些环可被如上定义的直链和支链烷基取代。因此,短语未取代的烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。未取代的烷基可以与母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子键合。优选的未取代的烷基包括具有1至20个碳原子的直链和支链烷基以及环状烷基。更优选的这类未取代的烷基具有1至10个碳原子,而甚至更优选的这类基团具有1至5个碳原子。最优选的未取代的烷基包括具有1至4个或1至3个碳原子的直链和支链烷基,并且包括甲基、乙基、丙基和-CH(CH3)2。
短语“取代的烷基”指其中一条或多条与碳或氢连接的键被与非氢和非碳原子连接的键所替换的如上定义的未取代的烷基,所述的非氢和非碳原子例如但不限于:卤化物中的卤素原子,如F、Cl、Br和I;基团如羟基、烷氧基、芳氧基和酯基团中的氧原子;基团如巯基、烷基和芳基硫醚基、磺基、磺酰基和亚砜基中的硫原子;基团如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、二酰亚胺和烯胺中的氮原子;基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子;以及多种其它基团中的其它杂原子。取代的烷基还包括其中一条或多条与碳或氢原子连接的键被与杂原子连接的键所替换的基团,所述的杂原子例如有:羰基、羧基、和酯基中的氧;基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮。除了其它之外,优选的取代的烷基包括其中一条或多条与碳或氢原子连接的键被一条或多条与氟原子连接的键所替换的烷基。取代的烷基的一个实例是三氟甲基和含有三氟甲基的其它烷基。其它烷基包括其中一条或多条与碳或氢原子连接的键被与氧原子连接的键所替换的那些,由此取代的烷基含有羟基、烷氧基、芳氧基或杂环基氧基。其它烷基还包括具有胺基、烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、(烷基)(芳基)胺基、二芳基胺基、杂环基胺基、(烷基)(杂环基)胺基、(芳基)(杂环基)胺基或二杂环基胺基的烷基。
短语“未取代的芳基”指不含杂原子的芳基。因此,通过举例的方式,该短语包括但不限于诸如苯基、联苯基、蒽基和萘基的基团。尽管短语“未取代的芳基”包括含有稠环的基团如萘,但是其不包括具有与环成员之一键合的其它基团、例如烷基或卤代基的芳基,因为诸如甲苯基的芳基在本文中被认为是如下所述的取代的芳基。优选的未取代的芳基是苯基。在一些实施方案中,未取代的芳基具有6至14个碳原子。未取代的芳基可以与母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子键合。
短语“取代的芳基”相对于未取代的芳基所具有的含义与取代的烷基相对于未取代的烷基所具有的含义相同。但是,取代的芳基还包括其中芳香碳之一与上述的非碳或非氢原子之一键合的芳基,并且还包括其中芳基的一个或多个芳香碳与如本文定义的取代或未取代的烷基、链烯基或炔基键合的芳基。这包括其中芳基的两个碳原子与烷基、链烯基或炔基的两个原子键合以限定稠环系统(例如二氢萘基或四氢萘基)的成键排列。因此,短语“取代的芳基”包括但不限于例如甲苯基和羟基苯基等等的基团。
短语“未取代的链烯基”指直链和支链以及环状基团,例如对于如上定义的未取代的烷基所述的那些,除了在两个碳原子之间存在至少一条双键。实例包括但不限于乙烯基、-CH=C(H)(CH3)、-CH=C(CH3)2、-C(CH3)=C(H)2、-C(CH3)=C(H)(CH3)、-C(CH2CH3)=CH2、环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、丁二烯基、戊二烯基和己二烯基等等。在一些实施方案中,未取代的链烯基具有2至8个碳原子。
短语“取代的链烯基”相对于未取代的链烯基所具有的含义与取代的烷基相对于未取代的烷基所具有的含义相同。取代的链烯基包括其中非碳或非氢原子与和另一个碳双键键合的碳所键合的链烯基以及其中非碳或非氢原子之一与不参与和另一个碳连接的双键的碳所键合的那些。
短语“未取代的炔基”指直链和支链基团,例如对于如上定义的未取代的烷基所述的那些,除了在两个碳原子之间存在至少一条三键。实例包括但不限于-C≡C(H)、-C≡C(CH3)、-C≡C(CH2CH3)、-C(H2)C≡C(H)、-C(H)2C≡C(CH3)和-C(H)2C≡C(CH2CH3)等等。在一些实施方案中,未取代的炔基具有2至8个碳原子。
短语“取代的炔基”相对于未取代的炔基所具有的含义与取代的烷基相对于未取代的烷基所具有的含义相同。取代的炔基包括其中非碳或非氢原子与和另一个碳三键键合的碳所键合的炔基以及其中非碳或非氢原子与不参与和另一个碳连接的三键的碳所键合的那些。
短语“未取代的杂环基”既指芳香族又指非芳香族环化合物,包括含有3个或更多个环成员的单环、二环和多环化合物,其中一个或多个环成员是杂原子、例如但不限于N、O和S,例如但不限于奎宁环基(quinuclidyl)。尽管短语“未取代的杂环基”包括稠合杂环、例如苯并咪唑基,但是其不包括具有与环成员之一键合的其它基团、例如烷基或卤代基的杂环基,因为诸如2-甲基苯并咪唑基的化合物是取代的杂环基。杂环基的实例包括但不限于:含有1至4个氮原子的不饱和3至8元环,例如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(例如4H-1,2,4-三唑基、1H-1,2,3-三唑基、2H-1,2,3-三唑基等)、四唑基(例如1H-四唑基、2H四唑基等);含有1至4个氮原子的饱和3至8元环,例如但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基;含有1至4个氮原子的稠合不饱和杂环基团,例如但不限于吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基;含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和3至8元环,例如但不限于唑基、异唑基、二唑基(例如1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,5-二唑基等);含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的饱和3至8元环,例如但不限于吗啉基;含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和稠合杂环基团,例如苯并唑基、苯并二唑基、苯并嗪基(例如2H-1,4-苯并嗪基等);含有1至3个硫原子和1至3个氮原子的不饱和3至8元环,例如但不限于噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(例如1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等);含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的饱和3至8元环,例如但不限于thiazolodinyl;含有1至2个硫原子的饱和和不饱和3至8元环,例如但不限于噻吩基、dihydrodithiinyl(二氢二硫杂环己二烯基)、dihydrodithionyl、四氢噻吩、四氢噻喃;含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的不饱和稠合杂环,例如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(例如2H-1,4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(例如2H-3,4-二氢苯并噻嗪基等);含有氧原子的不饱和3至8元环,例如但不限于呋喃基;含有1至2个氧原子的不饱和稠合杂环,例如苯并二氧杂环戊烯基(例如1,3-苯并二氧杂环戊烯基等);含有氧原子和1至2个硫原子的不饱和3至8元环,例如但不限于dihydrooxathiinyl(二氢氧杂硫杂环己二烯基);含有1至2个氧原子和1至2个硫原子的饱和3至8元环,例如1,4-氧硫杂环己烷;含有1至2个硫原子的不饱和稠环,例如苯并噻吩基、benzodithiinyl(苯并二硫杂环己二烯基);以及含有氧原子和1至2个氧原子的不饱和稠合杂环,例如benzoxathiinyl(苯并氧杂硫杂环己二烯基)。杂环基还包括其中环中一个或多个S原子与一个或两个氧原子双键键合的上述的那些(亚砜和砜)。例如,杂环基包括四氢噻吩氧化物和四氢噻吩1,1-二氧化物。优选的杂环基含有5或6个环成员。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、噻吩、硫吗啉、其中硫吗啉的S原子与一个或多个O原子键合的硫吗啉、吡咯、高哌嗪、唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、唑、奎宁环、噻唑、异唑、呋喃和四氢呋喃。
短语“取代的杂环基”指其中一个或多个环成员与非氢原子键合的如上定义的未取代的杂环基,所述的非氢原子例如以上对取代的烷基和取代的芳基中所述。实例包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、N-烷基哌嗪基如1-甲基哌嗪基、哌嗪-N-氧化物、N-烷基哌嗪N-氧化物、2-苯氧基-噻吩和2-氯吡啶基等等。此外,取代的杂环基还包括其中与非氢原子连接的键是与碳原子连接的键的杂环基,所述的碳原子是取代和未取代的芳基、取代和未取代的芳烷基或未取代的杂环基的一部分。实例包括但不限于1-苄基哌啶基、3-苯基硫代吗啉基、3-(吡咯烷-1-基)-吡咯烷基和4-(哌啶-1-基)-哌啶基。诸如N-烷基取代的哌嗪基团如N-甲基哌嗪、取代的吗啉基团以及哌嗪N-氧化物基团如哌嗪N-氧化物和N-烷基哌嗪N-氧化物的基团是一些取代的杂环基的实例。诸如取代的哌嗪基团、例如N-烷基取代的哌嗪基团如N-甲基哌嗪等、取代的吗啉基团、哌嗪N-氧化物基团和N-烷基哌嗪N-氧化物基团的基团是尤其适合作为R6或R7基团的一些取代的杂环基的实例。
短语“未取代的杂环基烷基”指其中未取代烷基的与氢连接的键或与碳连接的键被与如上定义的杂环基连接的键所替换的如上定义的未取代的烷基。例如,甲基(-CH3)是未取代的烷基。如果甲基的氢原子被与杂环基连接的键所替换,例如如果甲基的碳与吡啶的碳2(与吡啶的N键合的碳之一)或者与吡啶的碳3或4键合,则该化合物是未取代的杂环基烷基。
短语“取代的杂环基烷基”相对于未取代的杂环基烷基所具有的含义与取代的芳烷基相对于未取代的芳烷基所具有的含义相同。但是,取代的杂环基烷基还包括其中非氢原子与杂环基烷基的杂环基中的杂原子键合的基团,所述的杂原子例如但不限于哌啶基烷基的哌啶环中的氮原子。此外,取代的杂环基烷基还包括其中该基团的烷基部分的与碳连接的键或与氢连接的键被与取代和未取代的芳基或取代和未取代的芳烷基连接的键所替换的基团。实例包括但不限于苯基-(哌啶-1-基)-甲基和苯基-(吗啉-4-基)-甲基。
短语“未取代的烷氧基”指其中与氢原子连接的键被与另外如上定义的未取代的烷基的碳原子连接的键所替换的羟基(-OH)。
短语“取代的烷氧基”指其中与氢原子连接的键被与另外如上定义的取代的烷基的碳原子连接的键所替换的羟基(-OH)。
短语“未取代的杂环基氧基”指其中与氢原子连接的键被与另外如上定义的未取代的杂环基的环原子连接的键所替换的羟基(-OH)。
短语“取代的杂环基氧基”指其中与氢原子连接的键被与另外如上定义的取代的杂环基的环原子连接的键所替换的羟基(-OH)。
短语“未取代的芳氧基烷基”指其中与碳连接的键或与氢连接的键被与氧原子(与如上定义的未取代的芳基键合)连接的键所替换的如上定义的未取代的烷基。
短语“取代的芳氧基烷基”指这样的如上定义的未取代的芳氧基烷基:其中与芳氧基烷基的烷基的碳或氢基团连接的键与如上对于取代的烷基所述的非碳和非氢原子键合,或者其中芳氧基烷基的芳基是如上定义的取代的芳基。
短语“未取代的杂环基氧基烷基”指其中与碳连接的键或与氢连接的键被与氧原子(与如上定义的未取代的杂环基键合)连接的键所替换的如上定义的未取代的烷基。
短语“取代的杂环基氧基烷基”指这样的如上定义的未取代的杂环基氧基烷基:其中与杂环基氧基烷基的烷基的碳或氢基团连接的键与如上对于取代的烷基所述的非碳和非氢原子键合,或者其中杂环基氧基烷基的杂环基是如上定义的取代的杂环基。
短语“未取代的杂环基烷氧基”指这样的如上定义的未取代的烷基:其中与碳连接的键或与氢连接的键被与氧原子(其与母体化合物键合)连接的键所替换以及其中未取代的烷基的另一条与碳连接的键或与氢连接的键与如上定义的未取代的杂环基键合。
短语“取代的杂环基烷氧基”指这样的如上定义的未取代的杂环基烷氧基:其中与杂环基烷氧基的烷基的碳或氢基团连接的键与如上对于取代的烷基所述的非碳和非氢原子键合,或者其中杂环基烷氧基的杂环基是如上定义的取代的杂环基。此外,取代的杂环基烷氧基还包括其中与该基团的烷基部分连接的碳键或氢键(即与氢连接的键)可以被一个或多个另外的取代和未取代的杂环所取代的基团。实例包括但不限于吡啶-2-基吗啉-4-基甲基和2-吡啶-3-基-2-吗啉-4-基乙基。
短语“未取代的烷氧基烷基”指其中与碳连接的键或与氢连接的键被与氧原子(其与如上定义的未取代的烷基键合)连接的键所替换的如上定义的未取代的烷基。
短语“取代的烷氧基烷基”指其中与烷氧基烷基的烷基和/或烷氧基的碳或氢基团连接的键与如上对于取代的烷基所述的非碳和非氢原子键合的如上定义的未取代的烷氧基烷基。
对于羟基、胺基和巯基而言,术语“被保护”指采用保护基团进行保护以避免发生不希望的反应的这些官能团的形式,所述的保护基团是本领域技术人员已知的,例如在“有机合成中的保护基团”(Protective Groups inOrganic Synthesis)(Greene,T.W.;Wuts,P.G.M.,John Wiley & Sons,New York,NY,(第3版,1999))中提出的那些,并且可以使用其中提出的方法来加入或除去。被保护的羟基的实例包括但不限于:甲硅烷基醚,例如通过使羟基与试剂、例如但不限于叔丁基二甲基-氯硅烷、三甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷进行反应而得到的那些;取代的甲基醚和乙基醚,例如但不限于甲氧基甲基醚、甲硫甲基醚、苄氧基甲基醚、叔丁氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、1-乙氧基乙基醚、烯丙基醚、苄基醚;酯,例如但不限于苯甲酰基甲酸酯、甲酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。被保护的胺基的实例包括但不限于:酰胺,例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯甲酰胺;二酰亚胺,例如苯邻二甲酰亚胺和二硫代琥珀酰亚胺;及其它。被保护的巯基的实例包括但不限于:硫醚,例如S-苄基硫醚和S-4-吡啶甲基硫醚;取代的S-甲基衍生物,例如半硫代、二硫代和氨基硫代缩醛;及其它。
“可药用盐”包括与无机碱、有机碱、无机酸、有机酸或者碱性或酸性氨基酸形成的盐。作为无机碱的盐,本发明例如包括:碱金属,例如钠或钾;碱土金属,例如钙和镁或铝;以及氨。作为有机碱的盐,本发明例如包括三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。作为无机酸的盐,本发明例如包括盐酸、硼酸、硝酸、硫酸和磷酸。作为有机酸的盐,本发明例如包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、乳酸、枸橼酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。作为碱性氨基酸的盐,本发明例如包括精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。酸性氨基酸例如包括门冬氨酸和谷氨酸。
一方面,本发明提供了治疗对药物有抗性的癌症的方法。该方法包括给需要其的受治疗者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物。在这类方法中,受治疗者是患有对药物有抗性的癌症的癌症患者,并且式I化合物具有下式结构:
其中:
R1、R2、R3和R4可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR10基团、-NR11R12基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基;
R5、R6、R7和R8可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR13基团、-NR14R15基团、-SR16基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R10和R13可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R11和R14可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;
R12和R15可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;并且
R16选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基。
在治疗对药物有抗性的癌症的方法的一些实施方案中,给受治疗者施周式II化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式II化合物具有下式结构并且R7是取代或未取代的杂环基:
在一些这类实施方案中,R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。在这些实施方案中的一些中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。在一些这类实施方案中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
在治疗对药物有抗性的癌症的方法的一些实施方案中,给受治疗者施用式III化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式III化合物具有下式结构:
本发明还提供了治疗癌症的方法。该方法包括给需要其的受治疗者施用选自Gleevec、BAY43-9006、Brostallicin、来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib、贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab和/或利妥昔单抗的抗癌药以及式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式I化合物具有以上对治疗对药物有抗性的癌症的方法所表明的结构和性质。式I、II和III的化合物可用于治疗难以用一种或多种这些抗癌药治疗的癌症患者。式I、II和III的化合物可用于治疗患有难以用一种或多种这些抗癌药治疗或者对它们有抗性的癌症的癌症患者。
在治疗癌症的方法的一项实施方案中,给受治疗者施用式II化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式II化合物具有以上所示的式的结构并且R7是取代或未取代的杂环基。在一些这类实施方案中,R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。在这些实施方案中的一些中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。在一些这类实施方案中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
在治疗癌症的方法的一项实施方案中,给受治疗者施用式III化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式III化合物具有以上所示的式的结构。
在治疗癌症的方法的一些实施方案中,在已经将抗癌药施用于受治疗者之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。在其它实施方案中,在已经将抗癌药施用于受治疗者之前,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。在其它实施方案中,在将至少某种抗癌药施用于受治疗者的同时,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
在一些实施方案中,在施用化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物之后,在该受治疗者中可获得稳定的疾病状态和/或出现肿瘤尺寸减小。
另一方面,本发明提供了治疗组合物和药盒。这类组合物和药盒包括抗癌药和式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物。这类治疗组合物和药盒可以包括作为组合制剂用于同时、分别或依次使用来治疗患有对药物有抗性的癌症的受治疗者的组分。式I具有与以上对治疗对药物有抗性的癌症的方法中所述相同的结构和性质。在一些实施方案中,药盒和治疗组合物中包括的抗癌药是除癌症对其有抗性的药物以外的抗癌药。在其它实施方案中,药盒和治疗组合物中包括的抗癌药是癌症对其有抗性的抗癌药。例如,如果患者对Gleevec耐药,则除了抗癌药如Iressa外,药盒或组合物还可以包括一种或多种式I、II和/或III的化合物。或者,如果患者对Gleevec耐药,则药盒或组合物可以包括一种或多种式I、II和/或III的化合物以及Gleevec。包括Gleevec的目的是:直到将药物施用于患者时才可以知道患者中的耐药性。此外,在治疗过程中还可以发生对某种药物的耐药性。除了本发明的化合物外,药盒还可以包括一种、两种、三种或更多种不同的抗癌药。
在药盒和治疗组合物的一些实施方案中,式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物是式II化合物、式II化合物的互变异构体、式II化合物的盐、式II化合物的互变异构体的盐或其混合物,其中式II化合物具有以上所示的式的结构并且R7是取代或未取代的杂环基。在一些这类实施方案中,R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。在这些实施方案中的一些中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。在一些这类实施方案中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
在药盒和治疗组合物的一些实施方案中,式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物是式III化合物、式III化合物的互变异构体、式III化合物的盐、式III化合物的互变异构体的盐或其混合物,其中式III化合物具有以上所示的式的结构。
在治疗组合物和药盒的一些实施方案中,抗癌药和化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物作为单一的组合物而被提供。在其它实施方案中,抗癌药和化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物作为药盒的各部分而被单独提供。
本发明还提供了在受治疗者中抑制激酶的方法。该方法包括给需要其的受治疗者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中受治疗者是癌症患者并且激酶包含突变的看门残基,其中式I化合物具有以上对治疗对药物有抗性的癌症的方法所表明的结构和性质。
在抑制激酶的方法的一项实施方案中,给受治疗者施用式II化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式II化合物具有以上所示的式的结构并且R7是取代或未取代的杂环基。在一些这类实施方案中,R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。在这些实施方案中的一些中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。在一些这类实施方案中,R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
在抑制激酶的方法的一项实施方案中,给受治疗者施用式III化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式III化合物具有以上所示的式的结构。
在抑制激酶的方法的一项实施方案中,激酶是胞质酪氨酸激酶(cytoplasmic tyrosine kinase)或者是受体酪氨酸激酶。在一些实施方案中,激酶选自ABL、KIT、PDGFRa、EGFR或FLT3。在一些这类实施方案中,激酶是ABL(T315I)。在其它这类实施方案中,激酶是FLT3(D835Y)。在其它这类实施方案中,激酶是EGFR。
在抑制激酶的方法的一些实施方案中,癌症对甲磺酸伊马替尼(Gleevec)、BAY43-9006、Brostallicin、来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(gefitinib)(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体有抗性。在一些实施方案中,癌症患者的癌症选自胃肠道间质瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌或嗜酸细胞过多综合征(HES)。
本发明还提供了治疗患有与pERK过表达有关的癌症的受治疗者的方法。该方法包括测定患者中的内源性pERK水平和给患者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物。在一些这类实施方案中,内源性pERK水平的测定在施用之前进行。在这类实施方案中,可以进行该测定以确定需要该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物的患者。在其它实施方案中,内源性pERK水平的测定在施用之后进行。在这类实施方案中,可以进行该测定以确定在患者中施用该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物的效能。在一些实施方案中,式I化合物是式II化合物或式III化合物、其盐、其互变异构体的盐、其混合物或包含这些中一种的药物组合物。
在治疗患有与pERK过表达有关的癌症的受治疗者的方法的一些实施方案中,患者中内源性pERK水平的测定包括萃取含有外周血白细胞的血液和通过蛋白质印迹法和/或流式细胞测定法来测定内源性pERK水平。在一些实施方案中,受治疗者中的pERK水平升高。在其它这类实施方案中,受治疗者中的pERK水平被稳定或降低。
在一些实施方案中,R1选自H、Cl、Br、F或I。在一些这类实施方案中,R1是F。在一些实施方案中,R2、R3和R4均是H。在一些这类实施方案中,R1是F并且R2、R3和R4各自是H。
在其它实施方案中,R6或R7中至少一个是取代或未取代的杂环基。在一些这类实施方案中,R6或R7中之一是杂环基,且R6或R7中另一个是H。在一些实施方案中,R6或R7中之一是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的杂环基。在一些这类实施方案中,R6或R7中之一是N-烷基哌嗪基、例如N-甲基哌嗪基等,在一些这类实施方案中,R6或R7中另一个是H。
在多项实施方案中,化合物的乳酸盐被施用于受治疗者或者被包括在本发明的药盒或治疗组合物中。
在多项实施方案中,癌症对Gleevec有抗性。在其它实施方案中,在已经将Gleevec施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对Gleevec有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
在多项实施方案中,癌症对BAY43-9006有抗性。在其它实施方案中,在已经将BAY43-9006施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对BAY43-9006有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
在多项实施方案中,癌症对Brostallicin有抗性。在其它实施方案中,在已经将Brostallicin施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对Brostallicin有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
在多项实施方案中,癌症对以下抗癌药之一有抗性,或者本发明的化合物、盐、互变异构体、混合物或药物组合物与以下抗癌药之一组合使用,这些抗癌药各自单独是优选的:来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体(mAb)、例如但不限于贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab或利妥昔单抗。曲妥单抗(Herceptin)也可以与本发明的化合物组合使用。
可以用本发明的方法、组合物和药盒来治疗多种癌症。在一些实施方案中,癌症是实体癌、例如实体肿瘤,其在一些实施方案中是耐药的。在其它实施方案中,癌症是“液体”癌或血液癌。在其它实施方案中,癌症是胃肠道间质瘤(GIST)。在其它实施方案中,癌症是急性髓性白血病。在其它实施方案中,癌症是慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤或肾细胞癌。在其它实施方案中,癌症选自前列腺癌、肾癌、胃肠道间质瘤、肉瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、腮腺癌、胃癌、黑素瘤、食管癌、NET(鼻窦(=sinonasal))癌、结肠癌、卵巢癌或肝癌,其在一些实施方案中是耐药的。可以根据本发明治疗的其它癌症的名单包括但不限于胃肠道间质瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌或嗜酸细胞过多综合征(HES)。
在包括杂环基在内的多种基团中,杂环基可以以多种方式连接。例如,在-OCH2(CH2)q(杂环基)基团(其中q选自0、1、2、3或4)中,杂环基可以通过不同环成员与-OCH2(CH2)q(杂环基)的-OCH2(CH2)q基团的亚甲基与碳连接的键合。以其中q是1且杂环基是四氢呋喃的非限制性实例进行举例,基团可以通过对应于以下两种结构的式-OCH2CH2(四氢呋喃基)来表示:
其中结构IV表示可以称为-OCH2CH2(2-四氢呋喃基)基团的基团,结构V表示可以称为-OCH2CH2(3-四氢呋喃基)基团的基团。当杂环基是含N杂环、例如但不限于哌啶、哌嗪、吗啉或吡咯烷时,该杂环可以通过含N杂环的环中的环碳原子或氮原子与亚甲基与碳连接的键合。这两种情况均是优选的。对于-OCH2(CH2)q(杂环基)基团,当杂环基是哌啶且q是2时,以下结构是可能的并且是优选的:
结构VI是-O(CH2)3(N-哌啶基)或-O(CH2)3(1-哌啶基)基团的实例。结构VII是-O(CH2)3-(2-哌啶基)基团的实例。结构VIII是-O(CH2)3(3-哌啶基)基团的实例。结构IX是-O(CH2)3(4-哌啶基)基团的实例。对于-OCH2(CH2)q(杂环基)基团,当杂环基是哌嗪且q是1时,以下结构是可能的并且是优选的:
结构X是-O(CH2)2(2-哌嗪基)基团的实例,结构XI是-O(CH2)2(1-哌嗪基)或-O(CH2)2(N-哌嗪基)基团的实例。对于-OCH2(CH2)q(杂环基)基团,当杂环基是吗啉且q是1时,以下结构是可能的并且是优选的:
结构XII是-O(CH2)2(3-吗啉基)基团的实例,结构XIII是-O(CH2)2(4-吗啉基)或-O(CH2)2(N-吗啉基)基团的实例,结构XIV是-O(CH2)2(2-吗啉基)基团的实例。应当观察到,当基团是吡咯烷且q是1时,可得到的结构包括-O(CH2)2(1-吡咯烷基)或-O(CH2)2(N-吡咯烷基)、-O(CH2)2(2-吡咯烷基)和-O(CH2)2(3-吡咯烷基)。
流程图1描述了合成苯并咪唑基喹啉酮化合物的一种示例性合成途径,并且不应当理解为以任意方式限制本发明。
流程图1
流程图2描述了合成本发明的化合物的另一种方法,并且不以任何方式限制本发明。本领域技术人员将理解,选择取代或未取代的二氨基苯和取代或未取代的氨基苯甲腈可合成各种不同的化合物。本领域技术人员还将知道,对于最后的环化反应,某些基团可能需要采用标准保护基团进行保护。这种非常通用的合成途径可使具有式III的多种化合物通过高度汇聚的和有效的合成途径而易于制备。
流程图2
采用随后的实施例部分所述的和以下文献中公开的方法易于合成结构I的化合物:美国专利6,605,617、公开的美国专利申请2004/0092535、美国专利申请10/983,174、公开的美国专利申请2004/0220196、美国专利申请10/982,757和美国专利申请10/982,543,这些文献各自整体引入本文作为参考并用于所有目的,如同本文阐述了其全文一样。
结构I的化合物、这些化合物的互变异构体、这些化合物的可药用盐、互变异构体的可药用盐及其混合物可以用于制备可以用于本文所述的目的的药物,并且可以用于治疗如本文所述的多种生物学病症。本发明的化合物、其盐、互变异构体、互变异构体的盐及其混合物可特别用于治疗患有对一种或多种其它抗癌药如Gleevec、BAY43-9006和Brostallicin有抗性的癌症的患者。
药物制剂可以包括任意上述实施方案的任意化合物、互变异构体或盐以及可药用的载体如本文所述的那些。这类制剂还可以包括不同的抗癌药、例如但不限于Gleevec、BAY43-9006或Brostallicin。
本发明还提供了可以通过将本发明的一种或多种化合物或其可药用的盐、互变异构体或其混合物与可药用的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合来制备的组合物,以治疗或改善与转移(metastacized)瘤有关的紊乱。本发明的组合物可以用于制备用于治疗如本文所述的转移瘤的制剂。这类组合物可以是例如颗粒剂、粉末、片剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬剂或溶液剂的形式。本组合物可以被配制以用于多种施用途径,例如通过口服施用、通过鼻施用、通过直肠施用、皮下注射、静脉内注射、肌内注射或腹膜内注射。以下剂型以举例的方式给出,并且不应当理解为限制本发明。
对于口服、口腔和舌下施用而言,粉末、混悬剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、软胶囊和胶囊形片剂作为固体剂型是可接受的。这些剂型可以例如通过将本发明的一种或多种化合物、其可药用的盐、互变异构体或其混合物与至少一种添加剂如淀粉或其它添加剂混合来制备。适宜的添加剂有蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、右旋糖酐、淀粉、琼脂、藻酸盐、壳多糖、壳聚糖、果胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成的聚合物或者甘油酯。口服剂型可以任选含有帮助施用的其它成分,例如:惰性稀释剂,或润滑剂如硬脂酸镁,或防腐剂如尼泊金或山梨酸,或抗氧化剂如维生素C、维生素E或半胱氨酸,崩解剂,粘合剂,增稠剂,缓冲剂,甜味剂,矫味剂或芳香剂。可以用本领域已知的适宜的包衣材料将片剂和丸剂进行进一步处理。
用于口服施用的液体剂型可以是可以含有惰性稀释剂如水的可药用的乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和溶液剂的形式。可以使用无菌液体、例如但不限于油、水、醇和这些的组合将药物制剂和药物制备成液体混悬剂或溶液剂。可以加入在药学上适于口服或胃肠道外施用的表面活性剂、助悬剂、乳化剂。
如上提到的,混悬剂可以包括油。这类油包括但不限于花生油、芝麻油、棉子油、玉米油和橄榄油。混悬剂还可以含有脂肪酸酯,例如油酸乙酯、十四酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。混悬制剂可以包括醇,例如但不限于乙醇、异丙醇、十六醇、甘油和丙二醇。在混悬制剂中还可以使用醚、例如但不限于聚(乙二醇)、石油碳氢化合物如矿物油和凡士林以及水。
对于鼻施用,药物制剂和药物可以是含有适宜的溶剂和任选的其它化合物、例如但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合的喷雾剂或气雾剂。气雾剂的抛射剂可以包括压缩空气、氮气、二氧化碳或基于碳氢化合物的低沸点溶剂。
可注射的剂型通常包括可以使用适宜的分散剂或润湿剂和助悬剂来制备的水性混悬液和油性混悬液。可注射的形式可以是溶液相或者是用溶剂或稀释剂制备的混悬液的形式。可接受的溶剂或溶媒包括灭菌水、林格氏溶液或等张盐水溶液。或者,可以采用无菌油作为溶剂或助悬剂。优选油或脂肪酸是非挥发性的,包括天然或合成的油、脂肪酸、甘油一酯、二酯或三酯。
对于注射,药物制剂和/或药物可以是适于用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的实例包括但不限于冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对于注射,制剂可以任选含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。
对于直肠施用,药物制剂和药物可以是在肠、乙状结肠曲和/或直肠中释放化合物的栓剂、软膏剂、灌肠剂、片剂或乳膏剂的形式。直肠栓剂可通过将本发明的一种或多种化合物或者该化合物的可药用的盐或互变异构体与可接受的载体如可可脂或聚乙二醇混合来制备,所述的载体在通常的贮存温度下以固相存在,而在适于在体内、例如在直肠内释放药物的那些温度下以液相存在。在制备软明胶型和栓剂制剂中还可以采用油。在制备混悬剂中可以采用水、盐水、葡萄糖水溶液和有关的糖水溶液以及甘油,所述的混悬剂还可以含有助悬剂,例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素以及缓冲剂和防腐剂。
除了上述的那些代表性的剂型外,可药用的赋形剂和载体通常也是本领域技术人员已知的,因此它们被包括在本发明中。这类赋形剂和载体例如在“Remingtons Pharmaceutical Sciences”(Mack出版公司,新泽西(1991))中有描述,该参考文献整体被引入本文作为参考并用于所有目的,如同本文阐述了其全文一样。
本发明的制剂可以被设计成如下所述的短效、速释、长效和缓释制剂。因此,药物制剂还可以被配制成用于控释或缓释的制剂。
本组合物还可以例如包含胶束或脂质体或者一些其它被包囊的形式,或者可以以延长释放的形式来施用以提供长时间的贮存和/或传递作用。因此,药物制剂和药物可以被压制成小丸或圆柱体,并且可以作为贮库注射剂或作为植入剂如支架通过肌内或皮下植入。这些植入剂可以采用已知的惰性材料,例如硅酮和生物可降解的聚合物。
可以根据疾病的状态、受治疗者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、剂量间隔、施用途径、排泄速率和药物的组合来调整特定的剂量。任意含有有效量的以上剂型完全在常规实验的范围之内,因此它们完全在本发明的范围之内。
治疗有效剂量可以根据施用途径和剂型而改变。本发明的优选的化合物是显示出高治疗指数的制剂。治疗指数是毒性作用和治疗作用之间的剂量比,其可以表示为LD50和ED50之间的比。LD50是致50%群体死亡的剂量,ED50是在50%群体中治疗有效的剂量。LD50和ED50可通过标准的药学方法在动物细胞培养物或实验动物中进行测定。
在本发明的上下文中的“治疗”表示减轻与紊乱或疾病有关的症状或者使那些症状的进一步发展或恶化停止或者阻止或预防疾病或紊乱。例如,在治疗患有转移的血液肿瘤的患者的背景下,成功的治疗可以包括减少供养肿瘤或病变组织的毛细血管的增殖、减轻与癌性生长或肿瘤、毛细血管增殖或病变组织有关的症状、使毛细血管的增殖停止或者使疾病如癌症的发展或癌性细胞的生长停止。治疗还可以包括与其它治疗组合施用本发明的药物制剂。例如,本发明的化合物和药物制剂可以在手术操作和/或放射治疗之前、期间或之后施用。本发明的化合物还可以与其它抗癌药、例如但不限于Gleevec、BAY43-9006和Brostallicin以及用于反义和基因治疗的药物联合施用。适宜的组合可以由肿瘤学和医学领域的技术人员来确定。
如在癌症治疗中所用的“稳定的疾病状态”表示癌症的生长停止。这通常可以使用扫描法、例如如附图中所示的正电子发射断层扫描(PET)而看到。
根据本发明的药物制剂和药物包括结构I的化合物或者其互变异构体、盐或其混合物以及可药用的载体。因此,本发明的化合物可以用于制备药物和药物制剂。这类药物和药物制剂可以用于本文所述的治疗方法。
本发明的化合物和制剂特别适用于组合治疗,因为当与抗癌药、例如但不限于喜树碱、多柔比星、顺铂、伊立替康(CPT-11)、烷化剂、拓扑异构酶I和II抑制剂以及放射治疗组合使用时,它们已经表明显示出了协同作用。此外,本发明的化合物还可以与抗癌药如Gleevec、BAY43-9006和Brostallicin组合使用,并且可以在患有对这些抗癌药有抗性的癌症的癌症患者中发现特别的用途。因此,本发明提供了包括结构I的化合物和其互变异构体、盐和/或其混合物以及抗癌药的药物制剂。本发明还提供了化合物、互变异构体、盐和/或混合物在制备这类制剂和药物中的用途以及化合物在治疗癌症患者中的用途。
在一些实施方案中,本发明提供了治疗组合物,其包含抗癌药和本发明的任意实施方案的化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物,作为组合制剂用于同时、分别或依次使用来治疗患者如癌症患者。在一些这类实施方案中,患者是对至少一种抗癌药如Gleevec、BAY43-9006或Brostallicin耐药的癌症患者。在一些这类实施方案中,抗癌药和化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物作为单一的组合物被提供。在其它这类实施方案中,抗癌药和化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物作为药盒的各部分被单独提供。这类药盒还可以包括使用说明书。
本发明的化合物可以用于治疗多种受治疗者。适宜的受治疗者包括动物,例如哺乳动物和人。适宜的哺乳动物包括但不限于:灵长类,例如但不限于狐猴、猿和猴;啮齿类,例如大鼠、小鼠和豚鼠;家兔和野兔;牛;马;猪;山羊;绵羊;有袋动物;和肉食动物,例如猫科、犬科和熊科。在一些实施方案中,受治疗者或患者是人。在其它实施方案中,受治疗者或患者是啮齿动物,例如小鼠或大鼠。在一些实施方案中,受治疗者或患者是除人以外的动物,在一些这类实施方案中,受治疗者或患者是除人以外的哺乳动物。
实施例
在实施例中使用以下缩写:
EtOH: 乙醇
H2O: 水
HCl: 盐酸
HPLC: 高效液相色谱法
KHMDS: 双(三甲基甲硅烷基)氨基钾
LiHMDS:双(三甲基甲硅烷基)氨基锂
NaHMDS:双(三甲基甲硅烷基)氨基钠
NaOH: 氢氧化钠
N2: 氮气
TBME: 叔丁基甲基醚
THF: 四氢呋喃
使用ACD Name 5.07版软件(2001年11月14日)(可由AdvancedChemistry Development公司得到)、ChemInnovation NamExpert+NomenclatorTM商标软件(可由ChemInnovation Software公司得到)以及可在ChemOfficeUltra软件包7.0版(可由CambridgeSoft公司(剑桥,MA)得到)中得到的AutoNom 2.2版提供了实施例化合物的命名。使用标准IUPAC命名法命名了一些化合物和原料。
各种原料可以由商业来源获得,并且可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。
实施例1
5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺的合成
方法A
将5-氯-2-硝基苯胺(500g,2.898mol)和1-甲基哌嗪(871g,8.693mol)置于装配有冷凝器并用N2清洗的2000mL烧瓶中。将该烧瓶置于100℃的油浴中,加热直至如通过HPLC测得5-氯-2-硝基苯胺完全反应(一般过夜)。在HPLC确定了5-氯-2-硝基苯胺消失后,在机械搅拌下将反应混合物直接倒入(仍然温热)2500mL室温水中。将所得混合物搅拌直至其达到室温,然后将其过滤。将由此得到的黄色固体加入到1000mL水中,搅拌30分钟。将所得混合物过滤,将所得固体用TBME(500mL,2×)洗涤,然后使用橡皮障(rubberdam)将其真空干燥1小时。将所得固体转移到干燥盘中,在真空干燥箱中于50℃干燥至恒重,得到670g(97.8%)黄色粉末状的标题化合物。
方法B
将5-氯-2-硝基苯胺(308.2g,1.79mol)加入到装配有顶部搅拌器、冷凝器、气体入口、加料漏斗和温度计探针的4颈5000mL圆底烧瓶中。然后将该烧瓶用N2清洗。在搅拌下将1-甲基哌嗪(758.1g,840mL,7.57mol)和200标准强度(proof)的乙醇(508mL)加入到该反应烧瓶中。将该烧瓶再次用N2清洗,将反应物保持在N2下。将该烧瓶在加热套中加热至内部温度为97℃(+/-5℃),在该温度下保持直至如通过HPLC测得反应完全(一般约40小时)。反应完全后,停止加热,在搅拌下将反应物冷却至内部温度为约20℃至25℃,将反应物搅拌2至3小时。将5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺的晶种(0.20g,0.85mmol)加入到该反应混合物中,除非沉淀已经发生。历经约1小时将水(2,450mL)加入到该搅拌的反应混合物中,同时内部温度保持在约20℃至30℃的温度范围内。水加入完成后,于20℃至30℃将所得混合物搅拌约1小时。然后将所得混合物过滤,将烧瓶和滤饼用水(3×2.56L)洗涤。在真空干燥箱中于约50℃将金黄色固态产物真空干燥至恒重,得到416g(产率98.6%)。
方法C
将5-氯-2-硝基苯胺(401g,2.32mol)加入到装配有顶部搅拌器、冷凝器、气体入口、加料漏斗和温度计探针的4颈12L圆底烧瓶中。然后将该烧瓶用N2清洗。在搅拌下将1-甲基哌嗪(977g,1.08L,9.75mol)和100%乙醇(650mL)加入到该反应烧瓶中。将该烧瓶再次用N2清洗,将反应物保持在N2下。将该烧瓶在加热套中加热至内部温度为97℃(+/-5℃),在该温度下保持直至如通过HPLC测得反应完全(一般约40小时)。反应完全后,停止加热,在搅拌下将反应物冷却至内部温度为约80℃,历经1小时通过加料漏斗将水(3.15L)加入到该混合物中,同时内部温度保持在82℃(+/-3℃)。水加入完成后,停止加热,历经不少于4小时的时间使反应混合物冷却至内部温度为20-25℃。然后在20-30℃的内部温度下将反应混合物另外搅拌1小时。然后将所得混合物过滤,将烧瓶和滤饼用水(1×1L)、50%乙醇(1×1L)和95%乙醇(1×1L)洗涤。将金黄色固态产物置于干燥盘中,在真空干燥箱中于约50℃将其真空干燥至恒重,得到546g(产率99%)。
实施例2
[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯的合成
方法A
将5000mL、4颈烧瓶装配上搅拌器、温度计、冷凝器和气体入口/出口。向装配的烧瓶中加入265.7g(1.12mol.1.0当量)5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺和2125mL 200标准强度的EtOH。将所得溶液用N2清洗15分钟。然后,加入20.0g 5%Pd/C(50%H2O w/w)。于40-50℃(内部温度)将反应物剧烈搅拌,同时将H2通入该混合物中。通过HPLC每小时监测一次反应物中5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺是否消失。一般的反应时间为6小时。
在所有的5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺已经从反应物中消失后,将溶液用N2清洗15分钟。然后,加入440.0g(2.25mol)作为固体的3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐。于40-50℃(内部温度)将反应物搅拌直至反应完全。通过HPLC跟踪监测反应物中二氨基化合物是否消失。一般的反应时间为1-2小时。反应完全后,将其冷却至室温,通过硅藻土过滤材料的垫过滤。将硅藻土过滤材料用无水EtOH(2×250mL)洗涤,在减压下将滤液浓缩,得到稠厚的褐色/橙色油状物。将所得油状物加入到850mL 0.37%HCl溶液中。然后一次加入固体NaOH(25g),形成沉淀物。将所得混合物搅拌1小时,然后过滤。将固体用H2O(2×400mL)洗涤,在真空干燥箱中于50℃干燥,得到251.7g(74.1%)淡黄色粉末状的[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯。
方法B
将5000mL、4颈套层烧瓶装配上机械搅拌器、冷凝器、温度计探针、气体入口和油鼓泡器(bubbler)。向装配的烧瓶中加入300g(1.27mol)5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺和2400mL 200标准强度的EtOH(反应可以并且已经用95%乙醇进行,对于该反应不是必须使用200标准强度的乙醇)。将所得溶液搅拌,用N2清洗15分钟。然后,将22.7g 5%Pd/C(50%H2O w/w)加入到该反应烧瓶中。将反应容器用N2清洗15分钟。用N2清洗后,通过使H2保持缓慢而恒定的流速通过烧瓶,而将反应容器用H2清洗。于45-55℃(内部温度)将反应物搅拌,同时将H2通入混合物直至如通过HPLC测得5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺被消耗完全。一般的反应时间为6小时。
在所有的5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺已经从反应物中消失后,将溶液用N2清洗15分钟。二胺中间体对空气敏感,因此小心避免与空气接触。历经约30分钟将500g(2.56mol)3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐加入到该反应混合物中。于45-55℃(内部温度)在N2下将反应物搅拌直至如通过HPLC测得二胺被消耗完全。一般的反应时间为约2小时。反应完全后,将反应物通过硅藻土垫趁温过滤。然后将反应烧瓶和硅藻土用200标准强度的EtOH(3×285mL)洗涤。在5000mL烧瓶中合并滤液,在真空下除去约3300mL乙醇,得到橙色油状物。将水(530mL)、然后将1M HCL(350mL)加入到所得油状物中,将所得混合物搅拌。将所得溶液剧烈搅拌,同时在将内部温度保持在约25-30℃下历经约20分钟加入30%NaOH(200mL),期间使pH在9至10之间。将所得混悬液搅拌约4小时,同时内部温度保持在约20-25℃。将所得混合物过滤,将滤饼用H2O(3×300mL)洗涤。在真空干燥箱中于50℃将收集的固体真空干燥至恒重,得到345.9g(90.1%)淡黄色粉末状的[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯。在供选的后处理操作中,合并滤液,在真空下除去乙醇直至至少约90%已经被除去。然后将pH为中性的水加入到所得油状物中,将溶液冷却至约0℃。然后在迅速搅拌下缓慢加入20%NaOH水溶液,使pH达到9.2(用pH计读数)。然后按照上述的方法将所得混合物过滤和干燥。这种供选的后处理操作得到了浅褐色至浅黄色产物,其产率高达97%。
实施例3
减少[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯的水含量的方法
将先前已经进行后处理并干燥至水含量为约8-9%H2O的[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(120.7克)置于2000mL圆底烧瓶中,将其溶解于无水乙醇(500mL)中。使用旋转蒸发器在加热下将该琥珀色溶液浓缩至稠厚的油状物,直至除去所有溶剂。将该操作重复2次。将由此得到的稠厚的油状物放置在烧瓶中,置于真空干燥箱中,于50℃加热过夜。Karl Fisher分析结果表明水含量为5.25%。通过该方法所得的降低的水含量使实施例4的操作中的产率增加。其它溶剂如甲苯和THF可以代替乙醇用于该干燥处理。
实施例4
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的合成
方法A
在装配有冷凝器、机械搅拌器、温度计探针并用氩气清洗的5000mL烧瓶中,将[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(250g,820mmol)(按照上述方法用乙醇干燥)溶解于THF(3800mL)中。将2-氨基-6-氟-苄腈(95.3g,700mmol)加入到该溶液中,将内部温度升至40℃。当所有固体已经溶解并且溶液温度已经达到40℃时,历经5分钟加入固体KHMDS(376.2g,1890mmol)。当钾碱加入完成时,得到非均质的黄色溶液,内部温度已经升至62℃。60分钟后,内部温度降回至40℃,通过HPLC测得反应完全(没有原料或未环化的中间体存在)。然后通过将其倒入H2O(6000mL)中并将所得混合物搅拌直至其已经达到室温而将稠厚的反应混合物淬灭。然后将混合物过滤,将滤垫用水(1000mL 2×)洗涤。将鲜黄色固体置于干燥盘中,在真空干燥箱中于50℃干燥过夜,得到155.3g(47.9%)所需的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
方法B
将5000mL、4颈套层烧瓶装配上蒸馏器、温度探针、N2气入口、加料漏斗和机械搅拌器。将[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(173.0g,570mmol)加入到该反应器中,将该反应器用N2清洗15分钟。然后在搅拌下将无水THF(2600mL)加入到该烧瓶中。在所有固体已经溶解后,通过蒸馏(真空或大气压,较高的温度有助于除去水)除去溶剂,必要时可加热。在1000mL溶剂已经被除去后,停止蒸馏,将反应物用N2清洗。然后将1000mL无水THF加入到该反应容器中,当所有固体溶解时,再次进行蒸馏(真空或大气压)直至另外1000mL溶剂已经被除去。将加入无水THF和除去溶剂的过程重复至少4次(在第4次蒸馏时,60%溶剂被除去,而不是如在前3次蒸馏中的仅40%),然后取出1mL样品用于Karl Fischer分析,以测定水含量。如果分析表明样品含有少于0.20%的水,则按照下一段中所述的方法继续反应。但是,如果分析表明样品含有多于0.20%的水,则继续上述的干燥过程直至水含量低于0.20%。
在使用上一段中所述的方法使水含量低于或等于约0.20%后,将蒸馏器用回流冷凝器替换,向反应物中加入2-氨基-6-氟-苄腈(66.2g,470mmol)(在一些方法中使用0.95当量)。然后将反应物加热至内部温度为38-42℃。当内部温度已经达到38-42℃时,历经5分钟通过加料漏斗将KHMDS溶液(1313g,1.32mol,20%KHMDS,在THF中)加入到该反应物中,在加入过程中将内部温度保持在约38-50℃。当钾碱加入完成时,将反应物搅拌3.5至4.5小时(在一些实施例中,将其搅拌30至60分钟,在该时间内反应可以完全),同时内部温度保持在38-42℃。然后取出反应物样品,通过HPLC进行分析。如果反应不完全,则历经5分钟将另外的KHMDS溶液加入到烧瓶中,于38-42℃将反应物搅拌45-60分钟(如下确定KHMDS溶液的加入量:如果IPC比<3.50,则加入125mL;如果10.0≥IPC比≥3.50,则加入56mL;如果20.0≥IPC比≥10,则加入30mL)。IPC比等于对应于4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮)的面积除以对应于未环化中间体的面积。反应完全(IPC比>20)后,将反应器冷却至内部温度为25-30℃,历经15分钟将水(350mL)加入到该反应器中,同时内部温度保持在25-35℃(在另一种供选方法中,反应在40℃下进行,在5分钟内加入水。较快的淬灭可降低随时间形成的杂质的量)。然后将回流冷凝器用蒸馏器替换,通过蒸馏(真空或大气压)除去溶剂,必要时可加热。在1500mL溶剂已经被除去后,停止蒸馏,将反应物用N2清洗。然后将水(1660mL)加入到该反应烧瓶中,同时内部温度保持在20-30℃。然后于20-30℃将该反应混合物搅拌30分钟,然后将其冷却至内部温度为5-10℃,然后搅拌1小时。将所得混悬液过滤,将烧瓶和滤饼用水(3×650mL)洗涤。在真空干燥箱中于50℃将由此得到的固体真空干燥至恒重,得到103.9g(产率42.6%)黄色粉末状的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
方法C
将[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(608g,2.01mol)(干燥品)和2-氨基-6-氟-苄腈(274g,2.01mol)加入到装在加热套上并装配有冷凝器、机械搅拌器、气体入口和温度探针的4颈12L烧瓶中。将该反应容器用N2清洗,将甲苯(7.7L)加入到该反应混合物中,同时将其搅拌。将该反应容器再次用N2清洗,并保持在N2下。将该混合物的内部温度升高直至温度达到63℃(+/-3℃)。将该混合物的内部温度保持在63℃(+/-3℃),同时在减压(380+/-10托(torr),蒸馏头t=40℃(+/-10℃))下将约2.6L甲苯从烧瓶中蒸溜出(使用Karl Fischer分析检测混合物中的水含量。如果水含量高于0.03%,则另外加入2.6L甲苯,重复蒸溜。重复该过程直至水含量低于0.03%)。在水含量低于0.03%后,停止加热,在N2下将反应物冷却至内部温度为17-19℃。然后在N2下以使该反应物的内部温度保持在20℃以下的速度将在THF中的叔丁醇钾(20%,在THF中;3.39kg,6.04moles叔丁醇钾)加入到该反应物中。叔丁醇钾加入完成后,在低于20℃的内部温度下将反应物搅拌30分钟。然后将温度升至25℃,将反应物搅拌至少1小时。然后将温度升至30℃,将反应物搅拌至少30分钟。然后使用HPLC检测原料的消耗以监测反应(一般在2-3小时内,两种原料均被消耗完全(面积%HPLC小于0.5%))。如果2小时后反应不完全,则另外每次加入0.05当量叔丁醇钾,直至HPLC表明反应完全时该过程方完成。反应完全后,将650mL水加入到该搅拌的反应混合物中。然后将反应物温热至内部温度为50℃,在减压下将THF从反应混合物中蒸馏掉(约3L体积)。然后使用加料漏斗将水(2.6L)逐滴加入到反应混合物中。然后将该混合物冷却至室温,搅拌至少1小时。然后将该混合物过滤,将滤饼用水(1.2L)、70%乙醇(1.2L)和95%乙醇(1.2L)洗涤。将鲜黄色固体置于干燥盘中,在真空干燥箱中于50℃干燥至恒重,得到674g(85.4%)所需的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
实施例5
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的纯化
将装配有冷凝器、温度探针、N2气入口和机械搅拌器的3000mL 4颈烧瓶置于加热套中。然后向该烧瓶中加入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(101.0g,0.26mol),将黄色固体混悬于95%乙醇(1000mL)中,搅拌。在一些情况下,使用8∶1的溶剂比。然后在搅拌下历经约1小时将该混悬液加热至轻微回流(温度为约76℃)。然后将该反应物搅拌45-75分钟,同时回流。这时,从烧瓶移去热源,使混悬液冷却至温度为25-30℃。然后将该混悬液过滤,将滤垫用水(2×500mL)洗涤。然后将黄色固体置于干燥盘中,在真空干燥箱中于50℃干燥至恒重(一般为16小时),得到97.2g(96.2%)黄色粉末状的纯化产物。
实施例6
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮乳酸盐的制备
将3000mL、4颈套层烧瓶装配上冷凝器、温度探针、N2气入口和机械搅拌器。将该反应容器用N2清洗至少15分钟,然后加入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(484g,1.23mol)。制备D,L-乳酸(243.3g,1.72mol单体-见下一段)、水(339mL)和乙醇(1211mL)的溶液,然后将其加入到反应烧瓶中。以中等速度开始搅拌,将反应物加热至内部温度为68-72℃。于68-72℃将反应物的内部温度保持15-45分钟,然后停止加热。将所得混合物通过10-20微米玻璃料(frit)过滤,在12L烧瓶中收集滤液。将该12L烧瓶装配上内部温度探针、回流冷凝器、加料漏斗、气体入口出口和顶部搅拌器。然后将滤液以中等速度搅拌,加热回流(内部温度为约78℃)。在保持轻微回流的同时,历经约20分钟将乙醇(3,596mL)加入到该烧瓶中。然后在15-25分钟内将该反应烧瓶冷却至内部温度范围为约64-70℃,将该温度保持约30分钟。检查反应器内是否有晶体。如果没有晶体,则将4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮乳酸盐的晶体(484mg,0.1mole%)加入到烧瓶中,于64-70℃将该反应物搅拌30分钟,然后再次检查烧瓶内是否有晶体。一旦存在晶体,则将搅拌降低至低速,于64-70℃将该反应物另外搅拌90分钟。然后历经约2小时将该反应物冷却至约0℃,将所得混合物通过25-50微米烧结(fritted)滤器过滤。将反应器用乙醇(484mL)洗涤,搅拌直至内部温度为约0℃。使用冷乙醇洗涤滤饼,将该步骤重复2次。在真空干燥箱中于50℃将收集的固体真空干燥至恒重,得到510.7g(85.7%)晶状的黄色4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮乳酸盐。在过滤过程中一般使用橡皮障或惰性条件。虽然干燥的固体没有显示出非常强的吸湿性,但是湿滤饼易于吸水而变粘。注意避免湿滤饼与大气长时间接触。
市售的乳酸通常含有约8-12%w/w的水,并且除了单体乳酸外还含有二聚体和三聚体。乳酸二聚体与单体的摩尔比通常为约1.0∶4.7。商品级乳酸可以用于前段中所述的方法,因为单乳酸盐优先从反应混合物中沉淀出。代谢物的鉴别
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(化合物1)的两种代谢物已经在来自如本文引用的文献中所述的2周毒理学研究的汇合(pooled)大鼠血浆中被鉴别和表征。两种被鉴别的代谢物是以下所示的哌嗪N-氧化物化合物(化合物2)和N-脱甲基化化合物(化合物3)。
化合物2
化合物3
化合物1-3的IC50
使用以下对化合物1-3提出的方法测定了多种蛋白酪氨酸激酶的激酶活性,从而提供了下表所示的IC50值。
表.化合物1-3的IC50
化合物 | IC50(μM) | |||||
VEGFR flt | VEGFR flk1 | bFGFR | PDGFR | Flt3 | c-kit | |
化合物1 | 0.010 | 0.013 | 0.008 | 0.027 | 0.0001 | 0.0015 |
化合物2 | 0.004 | 0.009 | 0.005 | 0.010 | 0.0004 | 0.0002 |
化合物3 | 0.019 | 0.012 | 0.019 | 0.037 | 0.0001 | 0.0002 |
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-4-氧化哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物2)和4-氨基-5-氟-3-(6-哌嗪-1-基-1H-苯并咪唑-2-基)喹啉-2(1H)-酮(化合物3)的合成
为了证实鉴别的化合物1的代谢物的结构,独立地合成了代谢物。
按照以下流程图中所示的方法合成了化合物2(化合物1的N-氧化物代谢物)。将化合物1在乙醇、二甲基乙酰胺和过氧化氢的混合物中加热。反应完成后,过滤分离化合物2,用乙醇洗涤。如果需要的话,可以通过柱色谱法将产物进一步纯化。
按照以下流程图中所示的方法合成了化合物3(化合物1的N-脱甲基化代谢物)。将5-氯-2-硝基苯胺用哌嗪处理,得到4,随后用丁氧羰基(Boc)基团将其保护,得到5。将硝基还原,然后与3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯缩合,得到6。使用六甲基二硅基胺基钾作为碱,使6与6-氟氨基苯甲腈缩合,得到7。将7粗品用HCl水溶液处理,纯化后得到所需的黄色/褐色固态代谢物。
测定方法
丝氨酸/苏氨酸激酶
通过提供用于磷酸化的ATP和含有丝氨酸或苏氨酸氨基酸残基的适宜的肽或蛋白以及测定磷酸酯部分向丝氨酸或苏氨酸残基的转移,从而测定了多种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶的激酶活性。以下文献公开了多种式I、II和III的化合物的合成和测定活性:美国专利6,605,617、公开的美国专利申请2004/0092535、于2004年11月5日提交美国专利申请10/983,174和公开的美国专利申请2004/0220196,这些文献全部整体引入本文作为参考并用于所有目的,如同本文具体阐述了其一样。使用杆状病毒表达系统(InVitrogen)在Sf9昆虫细胞中表达含有GSK-3、RSK-2、PAR-1、NEK-2和CHK1酶的激酶结构域的重组蛋白,通过Glu抗体相互作用(对于Glu-表位标记的构建物)或通过金属离子色谱法(对于His6(SEQ ID NO:1)标记的构建物)对其进行纯化。使用杆状病毒表达系统将Cdc2(GST融合构建物)和细胞周期蛋白B在Sf9昆虫细胞中进行共表达。重组的活性Cdk2/细胞周期蛋白A可市售得到,其购自Upstate Biotechnology。市售得到了用于测定的纯化的Cdc2酶,其可以购自New England Bio Labs。对于各测定,将受试化合物在DMSO中进行系列稀释,然后与适宜的激酶反应缓冲液+5-10nM 33P γ-标记的ATP混合。加入激酶蛋白和适宜的生物素化肽底物,产生150μL的终体积。于室温将反应物孵育3-4小时,然后通过转移到含有100μL终止反应缓冲液的链霉抗生物素覆盖的白色微量滴定板(Thermo Labsystems)中使其终止。终止反应缓冲液包括50mM未标记的ATP和30mM EDTA。孵育1小时后,将链霉抗生物素板用PBS洗涤,向每孔中加入200μL Microscint 20闪烁液。将板密封,使用TopCount计数。采用非线性回归、使用XL Fit数据分析软件计算了50%抑制的各化合物的浓度(IC50)。
反应缓冲液含有30mM Tris-HCl2pH7.5、10mM MgCl2、2mM DTT、4mM EDTA、25mM β-磷酸甘油、5mM MnCl2、0.01%BSA/PBS、0.5μM肽底物和1μM未标记的ATP。使用了27nM的GSK-3酶、5nM的CHK1、1nM的Cdc2、5nM的Cdk2和0.044单位/mL的Rsk2。对于GSK-3测定,使用了生物素-CREB肽(生物素-SGSGKRREILSRRP(pS)YR-NH2(SEQ ID NO:4))。对于CHK1测定,使用了生物素-Cdc25c肽(生物素-[AHX]SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR[CONH2](SEQ ID NO:5))。对于Cdc2和Cdk2测定,使用了生物素-组蛋白H1肽([lc生物素]GGGGPKTPKKAKKL[CONH2](SEQ ID NO:6))。在Rsk2测定中,使用了生物素-p70肽、15mM MgCl2、1mM DTT、5mM EDTA、2.7μM PKC抑制剂肽和2.7μM PKA抑制剂肽。
酪氨酸激酶
通过提供用于磷酸化的ATP和含有酪氨酸氨基酸残基的适宜的肽或蛋白以及测定磷酸酯部分向酪氨酸残基的转移,从而测定了多种蛋白酪氨酸激酶的激酶活性。使用杆状病毒表达系统(InVitrogen)在Sf9昆虫细胞中表达了对应于FLT-1(VEGFR1)、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2、PDGFRα、PDGFRβ和FGFR1受体的胞质结构域的重组蛋白,可以通过Glu抗体相互作用(对于Glu-表位标记的构建物)或通过金属离子色谱法(对于His6(SEQID NO:1)标记的构建物)对其进行纯化。对于各测定,将受试化合物在DMSO中进行系列稀释,然后与适宜的激酶反应缓冲液+ATP混合。加入激酶蛋白和适宜的生物素化肽底物,产生50-100μL的终体积,于室温将反应物孵育1-3小时,然后通过加入25-50μL 45mM EDTA、50mM Hepes pH7.5使其终止。将终止的反应混合物(75μL)转移到链霉抗生物素覆盖的微量滴定板(Boehringer Mannheim)中,孵育1小时。用DELFIA时间分辨荧光系统(Wallac或PE Biosciences)、使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66(进行了如下更改:DELFIA测定缓冲液补充有1mM MgCl2以用于稀释抗体)测定了磷酸化肽产物。在Wallac 1232DELFIA荧光计或PE Victor II多重信号读数器上读取时间分辨荧光。采用非线性回归、使用XL Fit数据分析软件计算了50%抑制的各化合物的浓度(IC50)。
在50mM Hepes pH7.0、2mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM NaF、1mMDTT、1mg/mL BSA、2μM ATP和0.20-0.50μM相应的生物素化肽底物中测定了FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR3、Tie-2和FGFR1激酶。分别以0.1μg/mL、0.05μg/mL或0.1μg/mL加入FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2和FGFR1激酶。对于PDGFR激酶测定,除了将ATP和肽底物的浓度替换为1.4μM ATP和0.25μM生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO:2)肽底物外,使用了具有与上述相同的缓冲液条件的120μg/mL酶。
重组和活性酪氨酸激酶Fyn和Lck可市售得到,其购自UpstateBiotechnology。对于各测定,将受试化合物在DMSO中进行系列稀释,然后与适宜的激酶反应缓冲液+10nM 33P γ-标记的ATP混合。加入激酶蛋白和适宜的生物素化肽底物,产生150μL的终体积。于室温将反应物孵育3-4小时,然后通过转移到含有100μL终止反应缓冲液的链霉抗生物素覆盖的白色微量滴定板(Thermo Labsystems)中使其终止,终止反应缓冲液包括100mM EDTA和50μM未标记的ATP。孵育1小时后,将链霉抗生物素板用PBS洗涤,向每孔中加入200μL Microscint 20闪烁液。将板密封,使用TopCount计数。采用非线性回归、使用XL Fit数据分析软件计算了50%抑制的各化合物的浓度(IC50)。
用于Fyn、Lck和c-ABL的激酶反应缓冲液含有50mM Tris-HCl pH7.5、15mM MgCl2、30mM MnCl2、2mM DTT、2mM EDTA、25mM β-磷酸甘油、0.01%BSA/PBS、0.5μM适宜的肽底物(用于Fyn和Lck的生物素化Src肽底物:生物素-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2(SEQ ID NO:3))、1μM未标记的ATP和1nM激酶。
通过提供用于磷酸化的ATP和含有酪氨酸氨基酸残基的肽或蛋白以及测定磷酸酯部分向酪氨酸残基的转移,从而测定了c-Kit和FLT-3的激酶活性。购得对应于c-Kit和FLT-3受体的胞质结构域的重组蛋白(Proquinase)。对于测定,将示例性化合物、例如4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮在DMSO中稀释,然后与下述的激酶反应缓冲液+ATP混合。加入激酶蛋白(c-Kit或FLT-3)和生物素化肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO:2)),产生100μL的终体积。于室温将这些反应物孵育2小时,然后通过加入50μL 45mM EDTA、50mMHEPES pH7.5使其终止。将终止的反应混合物(75μL)转移到链霉抗生物素覆盖的微量滴定板(Boehringer Mannheim)中,孵育1小时。用DELPHIA时间分辨荧光系统(Wallac或PE Biosciences)、使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66(进行了如下更改:DELFIA测定缓冲液补充有1mM MgCl2以用于稀释抗体)测定了磷酸化肽产物。在Wallac 1232 DELFIA荧光计或PEVictor II多重信号读数器上测定了时间分辨荧光值。采用非线性回归、使用XL Fit数据分析软件计算了50%抑制的各化合物的浓度(IC50)。
在50mM Hepes pH7.5、1mM NaF、2mM MgCl2、10mM MnCl2和1mg/mL BSA、8μM ATP和1μM相应的生物素化肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO:2))中测定了FLT-3和c-Kit激酶。以2nM测定了FLT-3和c-Kit激酶的浓度。
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮在临
床前多发性骨髓瘤模型中的效能的实时和全面成像评价
多发性骨髓瘤(MM)为特征是造血骨髓中的浆细胞克隆扩充的B-细胞瘤,尽管采用了常规的高剂量化学治疗,但是由于内在的和后天获得的耐药性的发展,其仍然是致命的血液恶性病。已经表明,其中MM细胞优先归巢和生长的骨髓微环境在发展MM对常规和新的治疗的耐药性方面起着决定性作用。因此,不仅靶向于MM细胞而且还靶向于MM细胞-骨髓微环境相互作用的分子靶向物质为治疗MM提供了可能的机会。在理解MM的分子病理学方面的近期进展已经为治疗这种疾病提供了新的治疗靶标。异位表达和失控的FGFR-3在约15%由t(4;14)染色体易位引起的MM患者中发生并且可导致显著的临床预后不良,其已经成为MM的引人注目的治疗靶标。
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)是靶向于包括VEGFR-2和PDGFR(在激酶测定中,IC50为~20nM)以及FGFR-3(在激酶测定中,IC50为~5nM)在内的多种受体酪氨酸激酶的小分子抑制剂。已经表明,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮可在体外在FGFR-3突变的MM细胞中抑制FGFR-3自磷酸化和细胞增殖(S.Trudel等人;Blood;印刷中)。为了评价4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮的抗骨髓瘤效能,开发了体内临床前MM模型,其中,在尾静脉内注射表达用荧光素酶构建物稳定转染的突变FGFR-3(Y373C)的人KMS-11-luc细胞后发展了多器官MM损害。采用生物发光成像(BLI)非侵袭性地监测了KMS-11-lucMM肿瘤在体内的生长和转移。通过BLI、采用该模型,成功地获得了转移病灶的早期检测和连续全面监测生长。早在第26天时就发现几乎所有注射了KMS-11-luc肿中瘤细胞的动物发生了MM损害,其主要位于脊柱、颅骨和骨盆中,导致在该模型中频繁发生麻痹。研究了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮在这种静脉内注射的体内KMS-11-luc MM模型中的抗骨髓瘤效能,发现以20mg/kg剂量(被证明体内抑制KMS-11-luc肿瘤中的ERK磷酸化的剂量)每天口服施用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮显著抑制KMS-11肿瘤的生长,如通过连续BLI成像所检测的那样。此外,与载体处置相比,4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮的抗肿瘤生长活性还导致动物存活率的显著提高。这些研究为4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮在MM患者中的临床试验提供了进一步的临床前基础,并且保证了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮在与常规或其它分子靶向物质的组合治疗中在这种KMS-11-luc体内模型中的进一步评价。
方法
从Jackson实验室(Bar Harbor,ME)获得一群共18只雌性(约8周龄)免疫缺陷的SCID-beige小鼠,将其在隔离设施中在无菌滤盖笼中圈养,具有12小时光照/黑暗循环。所有实验均在国际实验动物管理评估和认证协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal CareInternational)认证的设施中并按照机构动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)以及“实验动物管理与使用指南”(the Guide for The Care and Use of Laboratory Animals)(国家研究委员会)的所有指导进行。将带有FGFR-3突变体(Y373C)的KMS-11-luc MM细胞在Iscove氏培养基+10%FBS+L-谷氨酰胺中培养,在1∶2至1∶4的范围内每周传过2次。通过静脉内注射入尾静脉以10×106个细胞/100μL HBSS/小鼠将细胞植入。在细胞植入的当天以3GY(3.2分钟)照射小鼠。在注射KOM 11-luc细胞后48小时,动物开始接受20mg/kg 4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮或载体(每组n=9)的每日口服处置。使用包括安装在不漏光相机盒中的高敏感度冷(cooled)CCD照相机的IVIS成像系统(Xenogen)得到生物发光图像(BLI)。在第8天和其后每周一次获得如通过光子/秒定量的生物发光信号的图像和测定。每周监测两次动物体重,每天记录临床观察。按照动物管理规则和指南(animal careregulation and guidelines),如果小鼠麻痹或其生活质量受到严重损害,则通过吸入CO2处死这些小鼠。
结果
在将KMS-11-luc细胞静脉内注射入SCID-beige小鼠后第8天,全身成像表明细胞生长的发展和可能的MM损害主要位于骨骼外区域,包括肺、肝和脾。在第41天和第48天之间,在大多数小鼠中清楚地观察到了典型的弥漫性多骨骼损害、包括颅骨、骨盆和脊柱,如在图1的BLI图像中所看到的那样,这与导致按照方案处死小鼠的后肢麻痹有关。
在这种体内模型中,在KMS-11-luc中检测了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮的抗骨髓瘤效能。在注射KMS-11-luc细胞后48小时,小鼠开始以20mg/kg接受58的每天口服处置。按照每周基本方案在各动物中对光子计数进行了全面和连续的监测。4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置组中的平均光子计数被证明显著低于载体处置组,如图2所示。这可以通过比较来自用载体处置的注射了KMS-11-luc的小鼠和用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置的注射了KMS-11-luc的小鼠的全身BLI图像而容易地观察到,如图3所示。
与用载体处置的小鼠相比存活时间的显著增加很好地反映了在用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置的小鼠中光子计数的减少。在第91天,在用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置的那些小鼠中,9只动物中有5只仍然存活并具有全面健康的状况。相比而言,在第50天左右,载体处置组中的大部分动物被处死。此外,对于该研究的长期进行,用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置的小鼠对这种处置的耐受良好。由于用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮处置的小鼠的存活时间有明显提高,所以出于实际考虑,在第91天停止了研究。
在公开的美国专利申请2004/0092535以及美国专利申请10/983,174、美国专利申请2004/0220196和美国专利6,605,617中提出了关于用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮来抑制激酶、通常是抑制FGFR3和治疗包括多发性骨髓瘤在内的癌症的多项研究。因此,这些文献各自整体引入本文作为参考并用于所有目的,如同本文阐述了其全文一样。
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮
(化合物1)在人AML的实验肿瘤异种移植物模型中的活性
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮化合物1)是新的口服有活性的多靶向小分子,其显示出对抗参与内皮和肿瘤细胞增殖的FLT3激酶以及III、IV和V类RTKs的有效活性。考虑到FLT3突变在急性髓性白血病(AML)中的关联,将化合物1对具有不同FLT3突变状态的两种人白血病细胞系(MV4;11 FLT3 ITD对比于RS4;11 FLT3 WT)进行了测定。化合物1对抗MV4;11的抗增殖活性比对抗RS4;11的抗增殖活性高~24倍,表明其可更有效地抑制组成性激活的FLT3。化合物1对MV4;11细胞中受体磷酸化和下游信号传导(STAT5和ERK/MAPK)的剂量依赖性的调节证实了分子作用机制。在化合物1的生物学活性剂量时实现了MV4;11肿瘤中pFLT3、pERK的靶调节。在皮下和BM移植物移入白血病异种移植物模型中证明了肿瘤消退和AML细胞从骨髓(BM)中根除。肿瘤响应的特征为细胞增殖减少以及活性胱天蛋白酶-3和被切割的PARP的免疫组织化学染色呈阳性,其表明细胞死亡是通过细胞凋亡介导的。这些数据支持了化合物1在AML中的临床评价。
细胞系
人MV4;11(FLT3 ITD)和RS4;11(FLT3 WT)白血病细胞由美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)(Rockville,MD)24-26获得。将MV4;11细胞在补充有10%胎牛血清(FBS,Gibco LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的Iscoves改良的Dulbecco培养基(IMBM)中培育,所述的培养基含有4mM L-谷氨酰胺、5ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,R&D Systems,Minneapolis,MN)以及1%青霉素和链霉素。将RS4;11在含有10%FBS、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES(pH7.4)的RPMI-1640培养基中培育。将细胞作为混悬培养物进行培育,在37℃和5%CO2的潮湿氛围中维持。
激酶测定
在8μM ATP和化合物1的系列稀释液的存在下,用2nM FLT3酶(Upstate Biotechnology,Charlottesville,VA)进行了体外FLT3激酶测定。将终浓度为1μM的磷酸化肽底物与铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体(PT66)(Perkin Elmer Life Sciences,Boston,MA)孵育。使用时间分辨荧光检测铕。使用非线性回归计算了IC50。
增殖测定
将细胞铺在96孔微量滴定板中(10,000个细胞/孔),加入化合物1的系列稀释液。将RS4;11细胞用FLT3配体(100ng/ml,R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激。在孵育期(72小时,于37℃)结束时,通过MTS测定法(Promega,Madison,WI)测定了细胞成活力。使用非线性回归计算了EC50值,并将其定义为经处置的细胞对比于未经处置的对照细胞的吸光度减少50%所需的浓度。
免疫沉淀和蛋白质印迹分析
对于体外实验,将MV4;11和RS4;11细胞用化合物1处置3小时。与化合物1孵育后,将RS4;11细胞用FLT3配体(100ng/mL)刺激15分钟。与药物孵育后,收集细胞,用冰冷的PBS洗涤,用含有蛋白酶抑制剂(RocheMolecular Biochemicals,Indianapolis,IN)和磷酸酶抑制剂(Sigma,St.Louis,MO)的RIPA缓冲液(1%Nonidet P-40、0.5%去氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠,在1×磷酸盐缓冲盐水pH7.2中)溶解。对于体内靶标调节分析,将切除的肿瘤快速冷冻,粉碎,于-70℃保存,然后用150mM NaCl、1.5mMMgCl2、50mM Hepes pH7.5、10%甘油、1.0%Triton X-100、1mM EGTA、50mM NaF、1mM Na3VO4、2mM Pefabloc(Roche)和完全蛋白酶抑制剂合剂(Roche)溶解。使用BCA测定法(Bio-Rad,Hercules,CA)测定了溶解产物的蛋白含量。用针对pERK的小鼠抗体(1∶1000,Cell Signaling,Beverly,MA)对pERK进行蛋白质印迹分析,于4℃孵育过夜。通过用抗总ERK的抗体(Cell Signaling)再次探测而评价了总ERK水平。然后于室温将膜与1∶5000辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)孵育1小时。对于检测FLT3的免疫沉淀,于4℃将等量的蛋白(对于STAT5为500μg;对于FLT3为1000μg)与抗人FLT3或STAT5的抗体(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)孵育过夜,于4℃与蛋白A-琼脂糖孵育2小时。通过用抗磷酸酪氨酸抗体(抗pFLT3抗体来自Cell Signaling,抗pSTAT5抗体来自Upstate)探测而测定了FLT3或STAT5的磷酸化。使用增强型化学发光(ECL;Amersham Biosciences,Buckinghamshire,英格兰)检测了蛋白,在暴露于柯达胶片后进行了显像。进行了扫描密度测定法以定量带强度。为了验证负荷相同,将印迹剥下,用针对抗FLT3(Santa CruzBiotechnology)或抗STAT5(BD Biosciences)的抗体分别再次探测,以测定总FLT3或STAT5蛋白。将pFLT3、pERK或pSTAT5的量对总FLT3、ERK或STAT5蛋白水平进行标准化,并与载体或未经处置的对照进行了比较。
流式细胞测定
在血清饥饿条件(在OptiMEM培养基中过夜)下将MV4;11细胞用化合物1处置3小时。为了检测pSTAT5,将细胞用1%甲醛固定,用90%冰冷的甲醇透化。将透化的细胞(0.5-1×106个)与抗pSTAT5抗体(Cell Signaling)孵育30分钟。相同浓度的纯化的兔IgG(Oncogene,San Diego,CA)用作同型对照。二级抗体为结合有PE的羊F(ab’)2抗兔IgG(Jackson Immunoresearch)。于4℃在暗处保存样品,然后使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA)进行了分析。使用CellQuest软件(Becton Dickinson)对pSTAT5染色测定了平均荧光强度(MFI),特异性MFI是与同型对照抗体的MFI的差值。
为了处置来自小鼠MV4;11移植物移入模型的骨髓(BM)细胞,将股骨用冷盐水清洗,将红血细胞用FACS溶解缓冲液(Becton Dickinson)溶解。通过用抗人HLA-A,B,C-FITC(对比于同型匹配的抗体-FITC对照)(BDPharmingen)染色测定了小鼠BM中人白血病细胞的移植物移入百分率。
VEGF ELISA
将MV4;11细胞在含有10%FBS的具有各浓度(0-1μM)化合物1的培养基中培养48小时。离心后收集上层液,通过ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)测定了VEGF水平。使用BIO-RAD蛋白测定法(Hercules,CA)测定了蛋白浓度,并将结果对蛋白浓度进行标准化。
体内效能研究
雌性SCID-NOD小鼠(4-6周龄,18-22g)由Charles River(Wilmington,MA)获得,在研究开始之前使其在无病原体的室中适应1周。动物随意接受无菌的啮齿动物食物和水,并在具有12小时光照/黑暗循环的无菌滤盖笼中圈养。所有实验均在国际实验动物管理评估和认证协会的指导下进行。
皮下模型
将MV4;11和RS4;11细胞由SCID-NOD小鼠中的皮下(s.c.)肿瘤进行传代。将细胞(5×106个细胞/小鼠)用50%Matrigel(Becton Dickinson)重构,将其皮下植入到SCID-NOD小鼠的右胁腹中。当肿瘤为200-1000mm3时,按照具体的研究设计中描述的方法开始处置。将小鼠随意分组(对于效能研究一般为10只小鼠/组,对于药效动力学(PD)研究一般为3-5只小鼠/组)。通过口服管饲以溶液施用化合物1。每周评价肿瘤体积和体重2-3次。使用下式将肿瘤的测径器测定转化为平均肿瘤体积:1/2(长度×[宽度]2)。将肿瘤生长抑制(TGI)百分率与用载体处置的小鼠进行比较。响应率被定义为与处置开始时的肿瘤体积相比的完全响应CR(没有可触摸的肿瘤)或部分响应PR(缩减50-99%)。
静脉内骨髓(BM)移植物移入模型
将SCID-NOD小鼠照射(3Gy),然后尾静脉注射在0.2mL盐水中的1×107个MV4;11细胞。在细胞接种后3周,开始化合物1或载体处置。每天监测小鼠,当小鼠濒死或有后肢活动性丧失的早期征兆时,将其处以安乐死。将经处置小鼠的生存期增加(ILS)计算为:对比于经载体处置的小鼠,中数存活时间(MST)的增加的百分率。
体内靶标调节
SCID-NOD小鼠(n=3只小鼠/组)中的MV4;11皮下肿瘤达到300mm3,以10mg/kg口服施用包括载体或化合物1的处置,共计5天。为了表征化合物1的PD性质,在化合物1给药后的不同时间(N=3只小鼠/时间点)收集肿瘤样品。
免疫组织化学
于室温将切除的肿瘤置于10%中性缓冲福尔马林中过夜,将其转移到70%乙醇中,使用Thermo Electron Excelsior组织处理机(Pittsburgh,PA)进行处理以用于石蜡包埋。将骨(股骨)样品脱钙(ProtocolTM,FisherDiagnostics,Middletown,VA)。将石蜡块切成4μm厚度,置于带正电荷的载玻片上。使用Discovery自动玻片机(Ventana Medical Systems,Tucson,AZ)将组织染色。在加压蒸汽器中将载玻片用枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)处理,以重新获得抗原用于Ki-67、pERK和PARP染色,通过Ventana试剂CC1重新获得了胱天蛋白酶-3。所用的一级抗体为Ki-67(1∶750稀释,NovoCastraLaboratories,UK)、pERK(1∶100稀释,Biosource,Camarillo,CA)、抗人线粒体(1∶200,Chemicon,Temecula,CA)、切割的胱天蛋白酶-3(1∶200,CellSignaling)和切割的PARP(1∶100,Biosource)。二级抗体为1∶100稀释的羊抗兔F(ab′)2生物素化抗体(Jackson ImmunoResearch)。将载玻片用苏木精复染,盖上盖玻片。还使用苏木精和伊红染色评价了一般组织形态学。
统计分析
使用Microsoft Excel(Redmond,WA)进行了线性回归。使用Student氏t-检验测定了两个处置组间的统计学显著性。使用单向方差分析法(ANOVA)进行了多重比较,使用Student-Newman Keul氏检验(SigmaStat,San Rafael,CA)进行了比较不同处置平均值的后检验(post-tests)。对于存活研究,使用指数系列检定测定了不同治疗组对比载体组的存活曲线之间的显著性(Prism,San Diego,CA)。在研究结束时具有正常健康状况的、被处死的小鼠被认为是长期存活者,并在该分析中删除。在p<0.05时,差异被认为在统计学上是显著的。
结果
化合物1显示出对FLT3激酶活性的有效抑制
使用具有如上所述的纯化酶的ATP-竞争性结合测定法测定了化合物1对抗不同组RTKs的特异性。发现化合物1以纳摩尔活性而高度有效地对抗FLT3(1nM)、对抗c-KIT(2nM)、VEGFR1/2/3(10nM)、FGFR1/3(8nM)、PDGFRβ(27nM)和CSF-1R(36nM)(见下表)。为了证实对抗III、IV和V类RTKs的选择性,将化合物1对抗P13K/Akt和MAPK(K)途径中的其它激酶进行了测定,发现化合物1具有可忽略不计的活性(IC50>10μM)(见下表)。
表.4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮对多种RTKs的活性
RTK | IC50(μM) |
FLT3 | <0.001 |
c-KIT | 0.002 |
CSF-1R | 0.036 |
FGFR1 | 0.008 |
FGFR3 | 0.009 |
VEGFR1/Flt1 | 0.01 |
VEGFR2/Flk1 | 0.013 |
VEGFR3/Flt4 | 0.008 |
PDGFRβ | 0.027 |
PDGFRα | 0.21 |
INSR | 2 |
EGFR1 | 2 |
c-MET | >3 |
EphA2 | 4 |
TIE2 | 4 |
IGFR1,HER2,PI-3K.Akt1/3,Raf,ERK-1/2,MEK,p38-α,β,γ | >10 |
在如上所述的纯化酶和ATP的存在下,用化合物1的多种稀释液进行了用于制定上表的体外RTK测定。将磷酸化的肽底物(1μM)与铕标记的抗磷酸特异性抗体孵育,使用时间分辨荧光检测了铕。
化合物1对MV4;11(FLT3ITD)细胞的有效的抗增殖作用
为了确定FLT3的抑制是否在体外转化为了生长抑制,使用MTS测定法测定了化合物1对抗MV4;11和RS4;11细胞的活性(图5)。化合物1以剂量依赖性方式有效地抑制了MV4;11细胞的增殖,其EC50=13nM。尽管使用RS4;11细胞观察到了对增殖的类似的浓度依赖性作用,但是它们对化合物1的敏感性降低了约24倍(EC50=315nM)。还测定了化合物1对FLT3ITD突变细胞MOLM13和MOLM14的抗增殖作用,其EC50浓度与使用MV4;11所观察到的那些类似(EC50~6nM)(数据未显示)。这些数据表明化合物1对FLT3ITD和WT白血病细胞均具有活性,并且组成性活性受体对抑制更敏感(图5)。
化合物1对白血病细胞中FLT3介导的信号传导的体外作用
研究了化合物1对两种人白血病细胞系MV4;11和RS4;11的体外细胞活性,同时对比了FLT3突变状态(使用RT-PCR进行了证实,数据未显示)。MV4;11细胞在FLT3受体中具有内部衔接重复突变(ITD),导致FLT3被组成性激活。Levis M.等人,Blood,99:3885-3891(2002);O′Farrell A.M.等人,Blood,101:3597-3605(2003)。这种激活导致FLT3在无外源性配体刺激时自磷酸化(图6,泳道1)。将除去血清的MV4;11细胞用化合物1处置3小时,通过分析其磷酸化状态测定了对FLT3受体激活的直接作用。MV4;11细胞与浓度增加的化合物1的接触以剂量依赖性方式有效地抑制了pFLT3,其EC50为1-10nM(图6)。
虽然FLT3ITDs普遍存在于约20%AML患者的母细胞中,但是大部分急性白血病表达WT FLT3。还研究了在外源性FLT3配体(100ng/ml,15分钟)激活FLT3受体磷酸化(图7,泳道1对比于2)后化合物1对白血病RS4;11细胞的作用(FLT3 WT)(图7)。化合物1降低了RS4;11细胞中的pFLT3水平(图7)。但是,比较而言,调节WT FLT3比调节ITD需要更高的浓度。在浓度>0.5μM时获得了完全抑制(图6和7)。
化合物1调节ERK和STAT5——FLT3抑制的下游靶标
为了进一步表征化合物1对FLT3抑制的作用,研究了FLT3的下游靶标、即STAT5和ERK的调节,这些下游靶标是细胞存活和增殖中的关键蛋白。将MV4;11细胞用浓度增加的化合物1处置3小时,通过流式细胞术和蛋白质印迹处理,以检测pERK和p-STAT5(图8和9)。在MV4;11细胞中,由于有活性的FLT3信号传导,因此细胞具有高基线水平的pERK和pSTAT5(图8和9)。化合物1以剂量依赖性方式抑制了ERK(图8)和STAT5(图9)的磷酸化。在浓度>0.1μM时观察到了pERK和pSTAT5的显著抑制(>50%)(流式细胞术和蛋白质印迹)。与FLT3配体刺激的RS4;11细胞相比,化合物1对pERK和pSTAT5的抑制作用在MV4;11中更有效(数据未显示)。
化合物1在体外抑制MC4;11细胞中自分泌VEGF产生
为了说明化合物1在体外对VEGF产生的作用,对MV4;11培养物上层液进行了ELISA(图10)。在这些实验中,将MV4;11细胞在含有10%FBS的具有浓度增加(0-1μM)的化合物1的培养基中培养48小时。在没有药物处置时,MV4;11细胞可分泌大量的VEGF(180pg/ml),而化合物1以剂量依赖性方式抑制了VEGF的产生,其EC50在0.001和0.01μM之间,在浓度>0.5μM时可完全抑制(图10)。
化合物1在体内调节FLT3信号传导
为了研究在体内的靶标调节,给带有MV4;11肿瘤的小鼠(达到300-500mm3)施用化合物1(10mg/kg/日)或载体,共计5天。在所选的时间点后收集肿瘤,将其匀化,通过IP/蛋白质印迹对pFLT3和pSTAT5水平进行分析。早在用单剂量(数据未显示)或多剂量的化合物1给药后4小时就观察到了pFLT3和pSTAT5水平有显著降低(图11),而对总FLT3或STAT5蛋白没有影响(图11)。相对于基线,FLT3和STAT5的磷酸化均有降低,在给药后8小时达到了~90%的最大抑制,并保持被抑制24小时(~85%抑制)。在给药后48小时,磷酸-FLT3返回靠近基线水平,而p-STAT5仍然被抑制(~60%抑制)(图4)。还观察到了pERK水平的降低,表明阻断了下游FLT3信号传导(数据未显示)。
体内效能研究
化合物1在体内对MC4;11和RS4;11肿瘤的剂量响应作用
为了确定化合物1的体外作用是否与体内肿瘤生长抑制有关,研究了化合物1在SCID-NOD小鼠中对抗MV4;11或RS4;11肿瘤异种移植物的效能。将肿瘤细胞皮下植入到小鼠中,当肿瘤为200-300mm3时开始化合物1处置。在剂量-响应效能研究中,对于MV4;11肿瘤,以1-30mg/kg/日的剂量范围口服施用化合物1,对于RS4;11肿瘤,以10-150mg/kg/日的剂量范围口服施用化合物1。
化合物1高度有效地对抗MV4;11肿瘤,显示出了良好的剂量-响应作用,在剂量>5mg/kg/日时显著抑制肿瘤生长(图12)。30mg/kg/日的剂量引起了肿瘤消退(9/10肿瘤有响应),该肿瘤消退既包括部分响应又包括完全响应(1个CR,8个PR)。以1mg/kg/日的剂量给药2周后观察到了中度的肿瘤生长抑制(23%),其在该模型中被鉴别为最小统计学有效剂量(p<0.01,对比于载体)。在带有RS4;11肿瘤的小鼠中,用化合物1进行的处置引起了肿瘤生长抑制,但是没有观察到消退(图13)。与RS4;11肿瘤相比,化合物1对MV4;11肿瘤的抑制作用更强,这可以通过各模型中各自的最小有效剂量来表明(第8天:100mg/kg/日,48%TGI,p<0.01,对抗RS4;11肿瘤;对比于:1mg/kg/日,23%TGI,p<0.01,对抗MV4;11肿瘤)。
化合物1的交替给药方案同样有效
还研究了化合物1的间断和周期给药对MV4;11异种移植物肿瘤的作用(图14)。以30mg/kg每天、隔日(q.o.d.)或周期性地7天给药、然后7天停药共计2个周期口服施用化合物1(图14)。与每天给药类似,在药物处置时期内,间断给药方案引起了显著的肿瘤消退(>94%TGI)。所有三种方案引起了相同的抗肿瘤活性(第29天,p>0.05),使用q.o.d.(6个PR)和7天给药/7天停药(9个PR)所观察到的响应数目与使用每天处置(1个CR,9个PR)所观察到的那些类似。
化合物1有效地对抗大MV4;11肿瘤
还研究了化合物1对不同尺寸:300、500或1000mm3的大MV4;11肿瘤的作用。用化合物1(30mg/kg/日)进行的处置在所有MV4;11肿瘤中均引起了显著的消退,这与在处置开始时的初始肿瘤大小无关(图15)。在药物治疗的3-5天内,肿瘤消退是明显的。所有被治疗的肿瘤均有响应(n=27),其中,15%完全响应,70%部分响应。剩余的15%为轻微响应或保持稳定。50天后停止给药。在50天的处置过程中,肿瘤没有再生长,表明没有发生对化合物1的耐药性。还研究了响应在治疗停止后的耐久性。在化合物1给药停止后,一个CR和约50%PRs可持续40天。在研究的第90天(在给药停止后40天),开始用30mg/kg/日的化合物1对10个再生长(至600-2000mm3)的肿瘤再次进行处置,继续60天。所有肿瘤对化合物1的第二个周期均有响应(2个CR,8个PR),这清楚地表明肿瘤对化合物1没有耐药性(图16)。
体内生物学活性的组织学评价
除了肿瘤体积和靶标调节终点外,还使用了免疫组织化学读数作为药物活性的指示(图17-19)。在1或5个剂量后在MV4;11肿瘤中研究了化合物1施用(30mg/kg/日)的短暂作用(图17)。使用H&E染色进行的形态学评价表明用载体处置的肿瘤包含MV4;11肿瘤细胞,具有显著的细胞过多,表明有髓样增生(图17-a)。用Ki67强烈染色的肿瘤细胞表明肿瘤由高度增殖的细胞组成(图17-b)。通过给药后24小时,用化合物1处置的肿瘤表明致密浓集的细胞减少了,并且包含凋亡/坏死细胞的稀疏区域(第1天,图17-a对比于f)。在5个剂量后,细胞凋亡/坏死的区域更显著,并且无活力肿瘤的区域显著,这与Ki67染色减少一致(图17-g)。由pERK的免疫组织化学染色证实了在体内的靶标调节。在5天给药期间,在用化合物1处置的肿瘤中磷酸化ERK被显著降低了,这证实了肿瘤中pERK的蛋白质印迹分析(图17-c对比于h)。化合物1引起了细胞凋亡,这可由与用载体处置的对照相比在第5天时肿瘤中激活的胱天蛋白酶-3(图17-d对比于i)和被切割的PARP(图17-e对比于j)的染色增加得以证实。在用化合物1(30mg/kg/日)处置的RS4;11肿瘤中细胞和增殖减少以及pERK减少的类似作用是明显的(图18)。
还研究了被定义为部分响应(图19-c,d)或完全响应(图19-e)的肿瘤的组织学。完全响应者完全没有MV4;11肿瘤细胞,表明仅有坏死和/或瘢痕组织的残余物(图19-e)。在部分响应中,在肿瘤的周围观察到了Ki67-阳性增殖肿瘤细胞袋(图19-a,c对比于b,d)。
化合物1延长带有播散性人白血病细胞的小鼠的存活时间
在MV4;11白血病模型中测定了化合物1的效能,在该模型中将细胞接种到受照射的SCID-NOD小鼠的尾静脉中(图20)。在该模型中,MV4;11细胞播散到骨髓(BM)中,在病理学上模拟与人白血病类似的疾病型式。在第1天将MV4;11细胞注射到小鼠中,在MV4;11细胞植入BM中后第23天开始化合物1的处置(20mg/kg,每天或7天给药/7天停药,n=10-12只/组)。由于肿瘤细胞浸润到BM中,因此对照(用载体处置的)小鼠一般可发生后肢麻痹,中位存活时间(MST)为51天(图20)。在存活研究中,与用载体处置的对照(MST=51天)相比,每天用化合物1处置(第23-100天)显著延缓了疾病发展的时间(MST=134天)(p<0.0001),表明生存期增加(ILS)为163%(图20)。引人注目的是,在每天用化合物1处置下,4只小鼠为长期存活者(MST>160天)。使用组织学分析和流式细胞术定量了在BM中MV4;11细胞的移植物移入%(图21)。在流式细胞分析中,使用在人MHCI上与表位结合的抗人HLA-A,B,C抗体在小鼠BM中鉴别了人MV4;11细胞。在用载体处置的小鼠中,约2-19%的总的被分离BM细胞由植入的MV4;11细胞组成(第51天,图21-a)。使用抗人线粒体的抗体进行的免疫组织化学也证实了这一点,该抗体可将MV4;11细胞染色,从而鉴别小鼠BM基质中的人细胞(图21-b,c)。与载体处置相比,经25天每天给予化合物1(20mg/kg)显著减少了白血病负荷(<1%MV4;11细胞,在BM中)(图21-a对比于d)。有趣的是,在用化合物1处置后,存活的小鼠在免疫组织化学上表明在BM中没有肿瘤细胞的迹象(如在第167天没有抗人线粒体阳性的细胞),这些存活的小鼠被定义为“治愈”(图21-e,f)。周期性给予化合物1(7天给药/7天停药,5个周期)也显著增加了存活时间(MST=118天,131%ILS对比于载体,p=0.0001),但是不象每天方案那样有效(p=0.007,图20和21)。
讨论
靶向于参与肿瘤细胞增殖的异常细胞内激酶信号传导途径可以阻断细胞过程并抑制肿瘤生长。这已经通过批准了两种小分子靶向剂进行了举例:用于CML(Bcr-Abl)和胃肠道间质瘤(c-KIT)的伊马替尼(Gleevec)和用于耐药的晚期或转移性非小细胞肺癌(EGFR)的吉非替尼(Irressa)。Druker B.J.Oncogene,21:8541-8546(2002);Giaccone G.Clin Cancer Res.10:4233S-4237S(20041)。两种化合物均靶向于肿瘤细胞中的特异性分子缺陷,该成功已经推动了对包括FLT315,20-23在内的其它致癌激酶的分子靶向治疗研究。FLT3基因中的突变是AML中最常见的基因改变,其中近35%的患者具有激活突变。已经表明FLT3突变可引起临床预后不良,由此提示FLT3可作为AML的治疗靶标。Thiede C.等人,Blood,99:4326-4335(2002);Schnittger S,等人,Blood,2002;100:59-66(2002)。
化合物1是以纳摩尔效力对抗参与肿瘤增殖和血管生成的III、IV和v类RTKs的多靶激酶抑制剂。生物化学激酶测定表明化合物1具有对抗FLT3的有效活性(IC50为1nM)。化合物1在两种白血病细胞系中的活性通过对比FLT3状态:MV4;11(FLT3 ITD)和RS4;11(FLT3 WT)进行了表征。化合物1表明可以以剂量依赖性方式减少FLT3磷酸化,从而证实了在细胞中的分子活性。化合物1在体外阻断了促有丝分裂的MAPK和STAT5途径中随后的下游信号分子,这两种途径均是细胞增殖途径中的关键调节者。有趣的是,在MV4;11中对FLT3靶标调节的活性比在RS4;11细胞中更显著,如同化合物1在细胞毒性/增殖测定中的作用那样。对于其它FLT3抑制剂,已经报道了对抗FLT3-ITD和野生型FLT3的类似的差异作用。可以推断,FLT3 ITD MV4;11细胞具有促进细胞增殖的组成性活性信号(Ras,STAT5),并且与FLT3 WT(RS4;11)细胞不同,后者可以不依赖于FLT3激活而维持生长和/或可以依赖其它致癌途径。Minami Y.等人,Blood,102:2969-2975(2003);Kiyoi H.等人,Oncogene,21:2555-2563(2002);Spiekermann K.等人,Clin Cancer Res.9:2140-2150(2003)。
来自体内研究的结果已经表明,化合物1具有对抗实体瘤和白血病播散性BM模型的有效活性。使用PD终点描述了化合物1在临床前模型中的分子活性,以研究靶标调节的程度和持续时间。化合物1表明可显著地向下调节MV4;11肿瘤中的pFLT3和pERK。在单剂量或多剂量施用化合物1后4小时观察到了靶标调节(pFLT3),并且其可在肿瘤中持续达24小时。生物效应由肿瘤组织病理学也是明显的,在肿瘤组织病理学中,在药物治疗的1-2天内观察到了肿瘤中pERK、增殖和细胞凋亡响应的减少。在MV4;11的实体瘤异种移植物中,在药物治疗期间肿瘤消退也是明显的。有可能化合物1在MV4;11模型中的有效抑制作用可以由直接抑制FLT3以及抑制其它RTKs所引起。数据(RT-PCR,未显示)表明,MV4;11细胞还表达VEGFR1、cKIT、PDGFRβ、FGFR1、CSF-1R 32,所有RTKs均被化合物1有效抑制。化合物1具有对抗VEGF1/2/3激酶的<10nM的活性,数据清楚地表明化合物1可以在MV4;11体外培养物中抑制自分泌VEGF水平。在体内由肿瘤细胞或肿瘤基质细胞(包括内皮细胞)分泌的VEGF或FGF的自分泌或旁分泌抑制可以抑制这些细胞的增殖和存活。Ferrara N.等人,Nat Med.,9:669-676(2003);Compagni A.等人,Cancer Res.60:7163-7169(2000);Carmeliet P.Nat Med.,9:653-660(2003)。化合物1在实体瘤中的另外的活性可以由其对抗PDGFRβ的有效作用、通过影响血管生成过程中周细胞募集和血管成熟所引起。Carmeliet P.Nat Med.9:653-660(2003);Ostman A.CytokineGrowth Factor Rev.,15:275-286(2004)。在AML BM模型中,我们证明了化合物1提高了小鼠的存活并且在一些小鼠中根除了疾病。这代表了化合物1通过直接的抗增殖作用或对可以在母细胞存活中发挥作用的骨髓血管生成的调节来根除循环母细胞和BM疾病两者的潜能。Carow C.E.等人,Blood,87:1089-1096(1996);Drexler H.G.Leukemia,10:588-599(1996)。
根据化合物1的药理学和靶标抑制,研究了化合物1的间断和周期性给药方案。化合物1的交替给药方案表明其具有与化合物1的每天给药相似的活性,这表明在临床中可能采取灵活的给药方案。化合物1的多剂量能够持续抑制肿瘤的生长,并且发现在治疗停止后任意复发的肿瘤对用药物再治疗同样敏感。如果在临床环境中转化,则这些发现是相关的,因为尽管继续治疗,但一些AML患者已经显示对用激酶抑制剂进行的治疗会复发。Fiedler W.等人,Blood,(2004);Cools J.等人,Cancer Res.64:6385-6389(2004)。多种机制,包括代谢或细胞外流(通过表达药物转运蛋白如P-糖蛋白)或者在酶活性部位的ATP结合结构域中发生突变(干扰药物结合),已经表明与对激酶抑制剂的耐药性有关。Bagrintseva K.等人,Blood,103:2266-2275(2004);Grundler R.等人,Blood,102:646-651(2003)。化合物1不是P-GP底物,在药物治疗的整个过程中持久的响应可以提示:可用化合物1来避免耐药性的发生。
用于AML的FLT3抑制剂(SU11248 PKC412、CEP-701、MLN518)的临床研究仍然处于早期。O′Farrell A.M.等人,Clin.Cancer Res.9:5465-5476(2003);Fiedler W.等人,Blood,(2004);Stone R.M.等人,AnnHematol.83 Suppl 1:S89-90(2004);Smith B.D.等人,Blood,103:3669-3676(2004);DeAngelo D.J.等人,Blood,102:65a(2003)。选择单一药物治疗还没有产生显著的响应,FLT3抑制剂在AML中的未来临床研究可取决于将这些物质与细胞毒药物或其它分子靶向物质组合。此处对化合物1(对已知在AML的发病机制中起作用的RTKs具有另外活性的有效的FLT3抑制剂)所报道的数据保证了其临床评价。
在患者中对抗对药物有抗性的癌症的活性
式I、II和III的化合物、例如4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(化合物1)具有对抗肿瘤细胞以及供应肿瘤的血管的形成和维持的直接活性。这些化合物还已经在多种血管生成肿瘤和转移瘤动物模型中显示出了口服活性。如图22中所示,化合物1可选择性抑制III、IV和V类RTKs(还可见具有IC50值的表)。将化合物1施用于具有大的已建立的KM12L4A人结肠肿瘤异种移植物的裸小鼠在90-100%所治疗的动物中提供了消退和/或疾病稳定(见图23)。
进行了I期剂量递增的多中心开放标记研究,以评价化合物1在患有晚期实体恶性病的受治疗者中的安全性、药代动力学和药效动力学。这些研究的另外的主要目的包括:provil在患有晚期实体瘤的受治疗者中,1)确定最大耐受剂量(MTD);2)确认剂量限制性毒性(DLT);和3)评价安全性。研究的次要目的包括:在血浆、外周血淋巴细胞、尿和肿瘤细胞中1)评价药代动力学;2)评价药效动力学;3)为未来研究推荐剂量和方案;和4)确定抗肿瘤活性的证据(RECIST)。
以下提出了关于该研究的详情:
给药方案包括:
-单次每天给药,7天给药/7天停药,重复(剂量25-100mg)
-剂量≥100mg,一个周期的7天给药/7天停药,然后继续每天给药剂量递增:
-每组3-4名患者,剂量加倍直至>2级毒性;然后修改Fibonacci方案纳入标准:
·组织学上或细胞学上被证实的实体瘤,其对标准治疗有抗性或者对这些实体瘤不存在治愈性的标准治疗
·年龄>18岁
·ECOG体力状态0-1
·血红蛋白≥8.0gm/dL;嗜中性粒细胞≥1,500/mm3;血小板≥75,000/mm3
·肌酐≤1.5×正常值的上限(ULN);胆红素≤1.5×ULN;碱性磷酸酶≤5×ULN;天冬氨酸转氨酶(AST)≤2.5×ULN(肝AST≤5×ULN除外);淀粉酶≤ULN
·签署知情同意书
·上次给予抗瘤治疗(激素治疗除外)>21天
排除标准:
·颅内水肿、颅内转移或硬膜外疾病
·临床上显著的心脏病(NYHA III或IV类):先前存在心律失常;充血性心力衰竭;心肌病;QTc间隔>450msec(男性)和>470msec(女性)或者>G2LVEF(通过MUGA或超声心动图)
·具有临床上显著的外周血管病征兆的糖尿病(需要长期给药)
·既往心包炎;在先前12个月内有临床上显著的胸腔积液,或需要>2
次干预/月的复发性腹水
·吸收不良综合征或未被控制的GI毒性(>G2的恶心、腹泻、呕吐)。任意病因的既往急性或慢性胰腺炎
·在先前12个月内有既往肝内或肝外胆管梗阻,或需要胆管支架的恶性梗阻病史,除非没有既往的支架梗阻或阻断而被稳定治疗
DLT/MTD的定义:
·G4中性白细胞减少症<5天或发热性中性白细胞减少症;G4血小板减少
·G4疲劳,或在ECOG体力状态中二点下降
·G3或更高级别的恶心和/或呕吐,尽管使用了足够/最大的医学干预和/或预防
·G3或更高级别的非血液毒性(疲劳除外)
·G2或更高级别的临床上显著的心脏毒性(例如,静息EF降至40%≤50%或短轴缩短率降至15%≤24%;心肌肌钙蛋白T/l≥0.05ng/Ml)
MTD:在其之下>2/6的患者发生DLT的剂量水平
患者特征:
患者特征
受治疗者数目(05年4月22): 25
年龄中值(范围): 57(30-72)
性别: 男性 14
女性 11
ECOG PS: 0 12
1 7
以前的化学治疗方案(数目) 0-3 8
4-6 4
>6 2
肿瘤类型 前列腺肿瘤 5
肾脏肿瘤 3
GIST 2
肉瘤 2
结肠直肠肿瘤 1
乳腺肿瘤 1
腮腺肿瘤 1
胃肿瘤 2
黑素瘤 2
食管肿瘤 2
NET(鼻窦)肿瘤 1
结肠肿瘤 1
卵巢肿瘤 1
肝脏肿瘤 1
剂量水平:
剂量水平 | 患者数目 | DLT(在第1个周期内发生) |
25mg50mg75mg100mg(7天给药/7天停药)100mg(继续)125mg(继续)* | 344464 | 00001(G3高血压)0 |
*招收进行中
大于或等于G2的与药物有关的临床不良事件:
AE | 25 | 50 | 75 | 100 | 100cont. | 总数 |
疲劳贫血N&V/腹泻头痛厌食LVEF减少高血压** | 33(2G3)1(1G3)2 | 112(2G3)3(1G3) | 121 | 21 | 112(1G3) | 54(2G3)7(3G3)4(1G3)222(1G3) |
**DLT
已经观察到了化合物1的抗肿瘤活性的证据,因为7/22(32%)患者在其首次评价中具有稳定的疾病(SD)。此外,还已经报道了4名患者的SD长于4个月,这4名患者包括患有腮腺肿瘤的患者(长于7个月)和对Gleevec有耐受性的GIST患者(长于6个月)。图24是患有对Gleevec有抗性的GIST的患者的扫描PET-CT图,该图表明,与停药治疗相比,在用化合物1治疗期间摄取显著减少,这提示了化合物1具有治疗作用。以下提出了关于该患者和治疗方案的进一步信息:女性患者,被诊断为患有胃肠道间质瘤(GIST)。患者先前已经进行了如下治疗:
药物 剂量 注释
Gleevec 总每日剂量为200至800mg
BAY43-9006 400mg,每天2次 进行性疾病
Brostallicin 18mg,每天1次
Gleevec 100mg,隔日 对药物有抗性的
Brostallicin 12.8mg,每天1次
根据如上提出的2004年6月2日方案的纳入和排除标准,该患者被招收入本研究。
化合物1的治疗记录:
剂量 频率 方案
75mg 每天1次 治疗7天进行/7天停止
100mg 每天1次 治疗7天进行/7天停止
该患者接受了9,625mg的总剂量(见附表)。当用化合物1治疗(完成了8个周期)时,该患者达到了稳定的疾病(SD)。
如图25中所示,在患者中,血浆暴露(plasma exposure)随化合物1的剂量而按比例增加。100mg剂量组中的血浆暴露接近临床前效能已经被指明的范围。
使用外周血白细胞(PDL)作为替代组织在实体瘤患者中进行了确定化合物1的生物学活性的药效动力学(PD)标记物的研究,在实体瘤患者中,靶组织的达到受到限制。原理和测定法研究:
·ERK磷酸化是被很好描述的RTK激活的下游作用,化合物1调节肿瘤和内皮细胞中的ERK磷酸化。
·为了确定化合物1是否影响PBL中ERK的激活,将来自正常供者的血液在活体外用化合物1进行处置。没有加入具有PMA或PHA的外源性刺激。
·在将PBL与化合物1孵育后,通过蛋白质印迹和流式细胞测定法观察到了内源性pERK的剂量依赖性抑制(见图26),提示该测定法可以用于临床试验以表明化合物1正在调节其靶标。
将化合物1对包括已经发现对Gleevec和其它激酶抑制剂耐药的ABL(T315I)的突变形式在内的一组激酶进行了测定。参见Shah,N.P.Science,305,第399页(2004)和LaRosse,Cancer Res.67,第7149-7153页(2002)。ABL中的T315残基称为“看门残基”,其位于ABL结构中的疏水口袋内。在已经对某些激酶抑制剂复发的患者、例如已经变得对某些化学治疗剂如Gleevec、Iressa、Tarceva和其它化学治疗剂有耐药性的患者中常发现该残基以及该残基在其它激酶、例如但不限于Flt-3、KIT、PDGFRa、EGFR等中的类似位置。因此,对于已经变得对这些药物有耐药性的这些患者而言,在医学上需要供选的治疗策略。已经发现化合物1可抑制ABL的T315I突变体,其IC50值为0.0184微摩尔,相比而言,Gleevec的IC50值>10微摩尔,SU11248的IC50值为0.371微摩尔。ABL是胞质酪氨酸激酶。因此,本发明的化合物具有抑制突变的激酶、包括受体酪氨酸激酶和胞质酪氨酸激酶的能力。式I、II和III的化合物可以作为供选的治疗或与其它抗癌药的共同治疗用于在ABL中具有这种突变的患者。还已经测定了化合物1对抗FLT3(D835Y)的突变形式。该残基常在患有血液恶性病的患者中进行突变。参见Yamamoto,Y.Blood,97,2434(2001)。因此,式I、II和III的化合物如化合物1还可以用于治疗具有这种突变的患者。近来,已经报道了EGFR中的看门残基在用吉非替尼(Iressa)治疗的肺癌患者中发生了突变。参见Pao W.,PLos Med.2(3):e73(2005)。将化合物1对抗“看门残基”中发生突变的其它激酶进行了测定。化合物1可用于治疗具有这些突变的癌症患者。下表显示了与Gleevec和SU11248相比较的化合物1的IC50值。
激酶 | 注释 | IC50值(微摩尔) | ||
化合物1 | Gleevec | SU11248 | ||
Abl_T315I | 突变ABL | 0.0184 | >10 | 0.371 |
Alk | 3.7 | >10 | 0.603 | |
Aurora_A | 0.162 | 5.24 | 0.287 | |
Blk | 0.036 | 0.475 | 0.203 | |
CamKll_α | 4.54 | >10 | 2.89 | |
Cdk7_细胞周期蛋白H_MAT1 | 0.622 | 6.3 | 0.0343 | |
Ck1_δ | 6.05 | 5.48 | 0.0497 | |
Ck1_γ_2 | >10 | >10 | 4.51 | |
Ck2 | >10 | 0.488 | >10 | |
cRaf | >10 | 4.18 | >10 | |
Erk1 | >10 | >10 | >10 | |
Flt3_D835Y | <0.001000000 | <0.001000000 | <0.001000000 | |
Hck | 0.259 | 1.8 | 1.17 | |
Hyl | 9 | >10 | >10 | |
JNK2_α_2 | >10 | >10 | >10 | |
MLCK | 3.63 | >10 | 0.304 | |
PAK2 | >10 | >10 | >10 | |
PAK4 | 7.94 | >10 | 9.25 | |
PHKG2 | 8.11 | >10 | 0.535 | |
Pim1 | >10 | >10 | ||
PKC_θ | >10 | >10 | >10 | |
PKCe | >10 | >10 | >10 | |
Ron | >10 | >10 | >10 | |
ROS | >10 | >10 | >10 | |
Syk | 5.47 | >10 | >10 | |
TAK1 | 0.0359 | >10 | 0.0373 | |
TRKC | 0.00923 | 0.227 | 0.14 | |
TSSK1 | 0.982 | >10 | 0.401 | |
ZAP70 | >10 | >10 | >10 | |
CABL_CR/1//IC50(uM) | wtABL | 0.652 | 0.428 | 2.95 |
FLT3_CR/1//IC50(uM) | 0.000085 | 1.26 | 0.000219 | |
Abl_T315I | 突变ABL | 0.0184 | >10 | 0.371 |
使用以下方法完成了测定ABL(T315I)的IC50的试验。在25μL的终反应体积中,将Abl(T315I)(h)(5-10mU)与8mM MOPS pH7.0、0.2mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO:7)、10mM乙酸镁和33P γ-标记的ATP(比活性约为500cpm/pmol,酌情浓缩)孵育。通过加入MgATP混合物引发反应。于室温孵育40分钟后,通过加入5μL 3%磷酸溶液终止反应。然后将10μL反应物在P30滤垫上点样,在75mM磷酸中洗涤3次达5分钟,在甲醇中洗涤1次,然后干燥,进行闪烁计数。
按照以上和本文引用的参考文献中所述的方法制得其它式I化合物,例如式II和式III的化合物。使用以上对4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮所述的方法学进行了使用这些化合物的研究。这些研究将表明,这些化合物还可用于在小鼠、人和其它哺乳动物受治疗者中治疗包括对药物有抗性的癌症在内的癌症,并且可以用于与本文所述的抗癌药组合。
应当理解,根据本发明的有机化合物可以显示出互变异构现象。尽管本说明书内的化学结构一次仅可以表示一种可能的互变异构形式,但是应当理解,本发明囊括了所绘结构的任意互变异构形式。例如,具有式IIIB的化合物与一种互变异构体(互变异构体IIIBa)显示如下:
互变异构体IIIBa
具有式IIIB的化合物的其它互变异构体(互变异构体IIIIBb和互变异构体IIIIBc)显示如下:
互变异构体IIIIBb
互变异构体IIIIBc
以上引用的专利、专利申请和期刊文章的内容各自整体引入本文作为参考并用于所有目的,如同本文阐述了其全文一样。
可以理解,本发明并不受限于用于说明的本文提出的实施方案,而包括如在以下权利要求的范围之内的其所有这些形式。
Claims (72)
1.治疗对药物有抗性的癌症的方法,该方法包括:给需要其的受治疗者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中受治疗者是患有对药物有抗性的癌症的癌症患者并且式I化合物具有下式结构:
其中:
R1、R2、R3和R4可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR10基团、-NR11R12基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基;
R5、R6、R7和R8可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR13基团、-NR14R15基团、-SR16基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R10和R13可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R11和R14可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;
R12和R15可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;并且
R16选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基。
2.权利要求1的方法,其中给受治疗者施用式II化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式II化合物具有下式结构并且R7是取代或未取代的杂环基:
3.权利要求2的方法,其中R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。
4.权利要求3的方法,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。
5.权利要求3的方法,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
7.权利要求1-6中任一项的方法,其中将化合物的乳酸盐施用于受治疗者。
8.权利要求1-7中任一项的方法,其中癌症对甲磺酸伊马替尼(Gleevec)有抗性。
9.权利要求1-7中任一项的方法,其中在已经将甲磺酸伊马替尼(Gleevec)施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对甲磺酸伊马替尼(Gleevec)有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
10.权利要求1-7中任一项的方法,其中癌症对BAY43-9006有抗性。
11.权利要求1-7中任一项的方法,其中在已经将BAY43-9006施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对BAY43-9006有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
12.权利要求1-7中任一项的方法,其中癌症对Brostallicin有抗性。
13.权利要求1-7中任一项的方法,其中在已经将Brostallicin施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对Brostallicin有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
14.权利要求1-13中任一项的方法,其中癌症是胃肠道间质瘤(GIST)。
15.权利要求1-13中任一项的方法,其中癌症是急性髓性白血病。
16.权利要求1-13中任一项的方法,其中癌症选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤或肾细胞癌。
17.治疗癌症的方法,该方法包括:给需要其的受治疗者施用选自甲磺酸伊马替尼(Gleevec)、BAY43-9006、Brostallicin、来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib、贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab和/或利妥昔单抗的抗癌药以及式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中式I化合物具有下式结构:
其中:
R1、R2、R3和R4可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR10基团、-NR11R12基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基;
R5、R6、R7和R8可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR13基团、-NR14R15基团、-SR16基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R10和R13可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R11和R14可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;
R12和R15可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;并且
R16选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基。
19.权利要求18的方法,其中R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。
20.权利要求19的方法,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。
21.权利要求19的方法,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
23.权利要求17-22中任一项的方法,其中将化合物的乳酸盐施用于受治疗者。
24.权利要求17-23中任一项的方法,其中在已经将抗癌药施用于受治疗者之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
25.权利要求17-23中任一项的方法,其中在已经将抗癌药施用于受治疗者之前,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
26.权利要求17-23中任一项的方法,其中在将至少某种抗癌药施用于受治疗者的同时,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
27.权利要求17-26中任一项的方法,其中抗癌药是甲磺酸伊马替尼(Gleevec)。
28.权利要求17-26中任一项的方法,其中抗癌药是BAY43-9006。
29.权利要求17-26中任一项的方法,其中抗癌药是Brostallicin。
30.权利要求17-29中任一项的方法,其中癌症是胃肠道间质瘤(GIST)。
31.权利要求17-29中任一项的方法,其中癌症是急性髓性白血病。
32.权利要求17-29中任一项的方法,其中癌症选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤或肾细胞癌。
33.权利要求1-32中任一项的方法,其中在施用化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物之后,在受治疗者中获得稳定的疾病状态或肿瘤尺寸减小。
34.治疗组合物,该治疗组合物包含作为组合制剂用于同时、分别或依次使用来治疗患有对药物有抗性的癌症的受治疗者的抗癌药和式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物,其中式I化合物具有下式结构:
其中:
R1、R2、R3和R4可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR10基团、-NR11R12基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基;
R5、R6、R7和R8可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR13基团、-NR14R15基团、-SR16基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R10和R13可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R11和R14可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;
R12和R15可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;并且
R16选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基。
36.权利要求35的治疗组合物,其中R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。
37.权利要求36的治疗组合物,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。
38.权利要求36的治疗组合物,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
40.权利要求34-39中任一项的治疗组合物,其中治疗组合物包含化合物的乳酸盐。
41.权利要求34-40中任一项的治疗组合物,其中抗癌药和化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物作为单一的组合物被提供。
42.权利要求34-40中任一项的治疗组合物,其中抗癌药和化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物作为药盒的各部分被单独提供。
43.权利要求34-42中任一项的治疗组合物,其中抗癌药是甲磺酸伊马替尼(Gleevec)。
44.权利要求34-42中任一项的治疗组合物,其中抗癌药是BAY43-9006。
45.权利要求34-42中任一项的治疗组合物,其中抗癌药是Brostallicin。
46.权利要求34-45中任一项的治疗组合物,其中对药物有抗性的癌症是胃肠道间质瘤(GIST)。
47.权利要求34-45中任一项的治疗组合物,其中对药物有抗性的癌症是急性髓性白血病。
48.权利要求34-45中任一项的治疗组合物,其中对药物有抗性的癌症选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤或肾细胞癌。
48.权利要求1-13或17-29中任一项的方法或者权利要求34-45中任一项的治疗组合物,其中对药物有抗性的癌症是实体癌。
49.权利要求1-13或17-29中任一项的方法或者权利要求34-45中任一项的治疗组合物,其中对药物有抗性的癌症选自前列腺癌、肾癌、胃肠道间质瘤、肉瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、腮腺癌、胃癌、黑素瘤、食管癌、NET(鼻窦)癌、结肠癌、卵巢癌或肝癌。
50.权利要求1-33中任一项的方法或者权利要求34-49中任一项的治疗组合物,其中受治疗者是人类癌症患者。
51.权利要求1-7中任一项的方法,其中癌症对来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体有抗性。
52.权利要求1-7中任一项的方法,其中癌症对贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab或利妥昔单抗有抗性。
53.权利要求1-7中任一项的方法,其中在已经将来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
54.权利要求1-7中任一项的方法,其中在已经将贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab或利妥昔单抗施用于受治疗者并且已经发现该受治疗者中的癌症对贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab或利妥昔单抗有抗性之后,将化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐、其混合物或药物组合物施用于该受治疗者。
55.权利要求17-26中任一项的方法,其中抗癌药选自来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib、贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab或利妥昔单抗。
56.权利要求34-42中任一项的治疗组合物,其中抗癌药选自来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体。
57.权利要求34-42中任一项的治疗组合物,其中抗癌药选自贝伐单抗(Avastin)、pertuzumab或利妥昔单抗。
58.在受治疗者中抑制激酶的方法,该方法包括:给需要其的受治疗者施用式I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、互变异构体的盐、其混合物或者包含该化合物、该化合物的互变异构体、盐、互变异构体的盐或其混合物的药物组合物,其中受治疗者是癌症患者且激酶包含突变的看门残基,并且式I化合物具有下式结构:
其中:
R1、R2、R3和R4可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR10基团、-NR11R12基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基;
R5、R6、R7和R8可以相同或不同并且独立地选自H、Cl、Br、F、I、-OR13基团、-NR14R15基团、-SR16基团、取代或未取代的伯-、仲-或叔-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R10和R13可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的烷氧基烷基、取代或未取代的芳氧基烷基或者取代或未取代的杂环基氧基烷基;
R11和R14可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;
R12和R15可以相同或不同并且独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基;并且
R16选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂环基。
60.权利要求59的方法,其中R7是选自取代或未取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基的取代或未取代的杂环基。
61.权利要求60的方法,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基。
62.权利要求60的方法,其中R7是取代或未取代的N-烷基哌嗪基并且N-烷基哌嗪基的烷基包含1至4个碳原子。
64.权利要求58-63中任一项的方法,其中将化合物的乳酸盐施用于受治疗者。
65.权利要求58-64中任一项的方法,其中激酶是胞质酪氨酸激酶或者是受体酪氨酸激酶。
66.权利要求58-65中任一项的方法,其中激酶是ABL、KIT、PDGFRa、EGFR或FLT3。
67.权利要求66中任一项的方法,其中激酶是ABL(T315I)。
68.权利要求66中任一项的方法,其中激酶是FLT3(D835Y)。
69.权利要求66中任一项的方法,其中激酶是EGFR。
70.权利要求58-69中任一项的方法,其中癌症对甲磺酸伊马替尼(Gleevec)、BAY43-9006、Brostallicin、来那度胺(Revlimid)、沙利度胺(Thalomid)、多西他赛(Taxotere)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、vatalinib(PTK-787)、VEGF-trap、fenretidine、bortezomib或一般的单克隆抗体有抗性。
71.权利要求58-70中任一项的方法,其中癌症选自胃肠道间质瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌或嗜酸细胞过多综合征(HES)。
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