CN101641097A - 黑素瘤的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括将结构(I)化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、互变异构体的药学上可接受的盐或其混合物给药至个体。所述化合物、互变异构体、所述化合物的盐、互变异构体的盐或其混合物可以用于制备治疗转移癌的药物。变量A具有本文中所定义的含义。
Description
技术领域
本发明广泛涉及用于治疗个体中的黑素瘤的方法和组合物。更具体来讲，本发明涉及化合物例如4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮及其互变异构体、盐和混合物在治疗黑素瘤中的用途以及在制备治疗黑素瘤的药物中的用途。
背景技术
毛细血管能够到达人体的几乎所有组织，并向组织供给氧气和营养，并移除废弃物。在通常情况下，位于毛细血管内层的内皮细胞不分裂，因此，在成年人中毛细血管在数目或大小上通常不增加。但是在某些正常情况下，例如当组织损伤时或在月经周期的某些期间，毛细血管开始快速增殖。这种从已经存在的血管生成新的毛细血管的过程称为血管发生或新血管生成。参见Folkman，J.Scientific American 275，150-154(1996)。在伤口愈合期间的血管发生是成人期的病理生理性新血管生成的实例。在伤口愈合期间，额外的毛细血管提供氧气和营养供给，促进肉芽组织并有助于废物移除。在愈合过程结束后，毛细血管正常地退化。Lymboussaki，A.“在胚胎、成体和肿瘤中的血管内皮生长因子和它们的受体(VascularEndothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos，Adults，andin Tumors)”学位论文，赫尔辛基大学(University of Helsinki)，分子/癌症生物学实验室和病理系(Molecular/Cancer Biology Laboratory andDepartment of Pathology)，Haartman Institute，(1999)。
血管发生还在癌细胞的生长中起重要作用。已知一旦癌细胞的巢达到某一尺寸(大约直径1-2mm)，由于扩散不足以向癌细胞提供足够的氧气和营养，癌细胞必须发展血液供给，以使肿瘤长得更大。因此，预期抑制血管发生可阻止癌细胞的生长。
受体酪氨酸激酶(RTKs)是调节发育细胞生长和分化、成人组织重塑和再生的跨膜多肽。Mustonen，T.等人，J.Cell Biology 129，895-898(1995)；van der Geer，P.等人Ann Rev.Cell Biol.10，251-337(1994)。已知称为生长因子或细胞因子的多肽配体激活RTKs。信号RTKs涉及配体结合和致使其二聚化的受体外部结构域的构象改变。Lymboussaki，A.“在胚胎、成体和肿瘤中的血管内皮生长因子和它们的受体(Vascular EndothelialGrowth Factors and their Receptors in Embryos，Adults，and in Tumors)”学位论文，赫尔辛基大学(University of Helsinki)，分子/癌症生物学实验室和病理系(Molecular/Cancer Biology Laboratory and Department ofPathology)，Haartman Institute，(1999)；Ullrich，A.等人，Cell 61，203-212(1990)。配体与RTK的结合导致在特定酪氨酸残基处发生受体转磷酸化，随后激活用于磷酸化细胞质底物的催化结构域。同前出处(Id.)。
RTKs的两个亚家族对血管内皮具有特异性。这些包括血管内皮生长因子(VEGF)亚家族和Tie受体亚家族。V类RTKs包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR(人)、Flk-1(小鼠))和VEGFR3(FLT-4)。Shibuya，M.等人，Oncogene 5，519-525(1990)；Terman，B.等人，Oncogene 6，1677-1683(1991)；Aprelikova，O.等人，Cancer Res.52，746-748(1992)。
癌症是与驱动肿瘤细胞增殖的多重遗传缺陷有关的疾病。因此，同时抑制多重细胞信号通路的策略可以导致更有利的治疗结果。RTK过表达和/或活化突变通常存在于肿瘤细胞中，并与肿瘤生长相关。Blume-Jensen，P和Hunter，T.，“Oncogenic Kinase Signaling，”Nature，411，第355-65页(2001)；Carmeliet，P.，“Manipulating Angiogenesis in Medicine，”J.Intern.Med.，255，第538-61页(2004)。大多数RTKs包含胞外域(与配体结合有关)和胞内激酶域，胞内激酶域介导自身磷酸化、下游信号分子的募集，触发信号传导事件的级联。有超过30种RTKs与癌症有关，例如III型(PDGFR、CSF-1R、FLT3和c-KIT)、IV型(FGFR1-4)和V型(VEGFR1-3)RTKs。
黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤，黑素细胞产生皮肤色素即黑色素。黑素瘤通常出现在皮肤中，但可能发生于粘膜表面或在体中可以发现黑素细胞的任何地方。黑素瘤可以根据它们的特征性外观和行为分类为：1)浅表扩散性黑素瘤(SSM)，2)节结性恶性黑素瘤(NM)，3)肢端雀斑样痣性(lentiginous)黑素瘤(ALM)，4)雀斑样痣性恶性黑素瘤(LMM)和5)粘膜雀斑样痣性黑素瘤(MLM)。SSM是最常见类型的黑素瘤，并通常表现为在数种颜色的皮肤上的黑色、平的或稍微隆起的标记。在其早期辐射期，该癌症通过表皮扩张，治疗预后是良好的。一旦SSM进入垂直生长期，它扩展到真皮和下面的结构中，并变得更加危险和难以治愈。NM是最具侵袭性的黑素瘤，快速发生并同时向上和向内生长。它通常表现为皮肤上的均匀的黑色结节，但是也可能是其它颜色的。ALM是另一种侵袭型的黑素瘤，其更通常发生在黑肤色的患者中。它可以是棕色、黑色或杂色的，并可以是平的或节结性的。LMM是最不常见的黑素瘤，通常发生在老人的鼻子和面颊上。其损害是平的，可以是黄褐色、棕色、黑色或其它颜色的，并可以长到相当大(3cm-6cm)。LMM扩展缓慢并不易于转移。MLM与ALM的外观相似，并发生在各种粘膜部位，包括口腔、食道、肛门、阴道和结膜。当黑素瘤保持在局部时，可以手术切除它，治愈率通常是良好的。但是，一旦黑素瘤转移超出原始病灶，进入例如淋巴系统和更远的部位例如中枢神经系统、肝或肺，它变得非常难以治疗。在2006年，在美国，据估计产生了超过62,000个黑素瘤新病例，并且超过7,900位患者死于黑素瘤。
各种吲哚基取代的化合物最近已公开在WO 01/29025、WO 01/62251和WO 01/62252中，各种苯并咪唑基化合物最近已公开在WO 01/28993中。据报道这些化合物能够抑制、调控和/或调节受体型和非受体酪氨酸激酶的信号传导。一些公开的化合物包含键合至吲哚基或苯并咪唑基基团的喹啉酮片断。
4-羟基喹啉酮和4-羟基喹啉衍生物的合成公开在许多参考文献中，这些文献以其全部内容引入作为参考，用于所有目的，就如完全在文中描述那样。例如Ukrainets等人已经公开了3-(苯并咪唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉的合成。Ukrainets，I.等人，Tet.Lett.42，7747-7748(1995)；Ukrainets，I.等人，Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii，2，239-241(1992)。Ukrainets还公开了其它4-羟基喹啉酮类和硫代类似物例如1H-2-氧代-3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基喹啉的合成、抗惊厥和抗甲状腺活性。Ukrainets，I.等人，Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii，1，105-108(1993)；Ukrainets，I.等人，Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii，8，1105-1108(1993)；Ukrainets，I.等人，Chem.Heterocyclic Comp.33，600-604，(1997)。
各种喹啉衍生物的合成公开在WO 97/48694中。据公开这些化合物能够结合至核激素受体并可用于刺激成骨细胞增殖和骨生长。这些化合物还被公开可用于治疗或预防与核激素受体家族相关的疾病。
其中喹啉的苯环被硫基团取代的各种喹啉衍生物公开在WO 92/18483中。这些化合物被公开可用于药物制剂和用作药物。
喹诺酮和香豆素衍生物已被公开在多种与药物和药物制剂不相关的应用方面具有用途。描述用于光聚合组合物或用于发光性质的喹诺酮衍生物的制备的文献包括：U.S.专利号5,801,212，Okamoto等人；JP 8-29973；JP 7-43896；JP 6-9952；JP 63-258903；EP 797376；和DE 23 63 459，将它们都以全部内容引入作为参考，用于所有目的，就如完全在文中描述那样。
用于抑制血管发生和血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶并用于抑制其它酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶的各种喹啉酮苯并咪唑化合物包括4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮或其互变异构体公开在下面的文献中，将它们都以全部内容引入文中作为参考，用于所有目的，就如完全在文中描述那样：U.S.专利号6,605,617；U.S.专利号6,756,383；提交的U.S.专利申请号10/116,117(公开在2003年2月6日，US 2003/0028018)；U.S.专利申请号10/644,055(公开在2004年5月13日，U.S.专利申请公开号2004/0092535)；U.S.专利申请号10/983,174；U.S.专利申请号10/706,328(公开在2004年9月4日，2004/0220196)；U.S.专利申请号10/982,757(公开在2005年6月3日，2005/0137399)；和U.S.专利申请号10/982,543(公开在2005年9月22日，2005/0209247)。
尽管最近在治疗肿瘤和癌症的方法方面取得进步，但仍十分需要治疗癌症的新方法，特别是治疗黑素瘤的新方法和组合物。
发明内容
本发明提供治疗黑素瘤特别是转移的黑素瘤的方法。本发明还提供化合物、其互变异构体、其盐和其混合物在用于治疗黑素瘤的药物制剂和药物中的用途。
一方面，本发明提供治疗个体例如人黑素瘤患者中的黑素瘤的方法。所述黑素瘤可以是皮肤黑素瘤或皮肤外的黑素瘤。在一些实施方案中，提供治疗转移的黑素瘤的方法。所述方法包括将有效量的结构I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、互变异构体的药学上可接受的盐或其混合物给药至个体。结构I具有下式结构：
其中，
A是具有以下结构之一的基团：
其中，
R1选自H或含有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团。
在本发明方法的各种实施方案中，将本文所公开的化合物给药后，个体中的黑素瘤的生长被抑制，疾病消退或被稳定，或者给药后在个体中减小黑素瘤的尺寸和/或程度(extent)。
在一些实施方案中，R1是甲基基团，结构I的化合物具有结构IA：
结构IA化合物在文中还称为“化合物1”、“TKI258”或4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
在一些实施方案中，R1是氢，结构I化合物具有结构IB：
结构IB化合物在文中还称为“化合物2”或4-氨基-5-氟-3-[6-(哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
在一些实施方案中，R1是甲基基团，结构I的化合物具有结构IC：
结构IC化合物在文中还称为“化合物3”或4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-4-氧哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
在一些实施方案中，所述化合物是结构I、IA、IB或IC的化合物，并将所述化合物或互变异构体的乳酸盐给药至个体。
在一些实施方案中，黑素瘤表达野生型或突变型成纤维细胞生长因子受体1、2、3和/或4。在其它实施方案中，黑素瘤表达野生型或突变型c-Kit。在另外的实施方案中，黑素瘤表达成纤维细胞生长因子受体1和2、1和3、1和4、2和3、2和4、3和4，或者1、2和3，或者1、2、3和4。在某些可以按照文中所公开的方法治疗的黑素瘤中，表达一种或多种野生型或突变型FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。某些可以用文中所公开的方法治疗的黑素瘤表达野生型或突变型c-Kit。在另外的实施方案中，黑素瘤表达野生型Raf、突变型Raf、野生型Ras、突变型Ras、野生型c-Kit和/或突变型c-Kit蛋白。
多种不同类型的黑素瘤可以用本发明的方法治疗，包括例如浅表扩散性黑素瘤、节结性恶性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、雀斑样痣性恶性黑素瘤和粘膜雀斑样痣性黑素瘤。原发性黑素瘤还可以是皮肤的或皮肤外的。皮肤外的原发性恶性黑素瘤包括眼黑素瘤和软组织的透明细胞肉瘤。其它适应征包括罕见黑素瘤或其中可能牵涉相关的RTK靶点的癌前期病变。本发明方法还可用于治疗已经转移的黑素瘤。
治疗黑素瘤的方法还包括将一种或多种治疗黑素瘤的抗癌药物与本文所述的化合物一起给药。例如，治疗黑素瘤尤其是转移性黑素瘤的抗癌药物可以选自烷化抗癌药例如达卡巴嗪、替莫唑胺、氮芥；和亚硝基脲类例如卡莫司汀、洛莫司汀和福莫司汀；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；长春花生物碱类，例如长春碱；拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康；沙立度胺；抗癌抗生素，例如链佐星和放线菌素D；或铂抗癌药，例如顺铂和卡铂。本发明的化合物可以加到多化学治疗方案例如Dartmouth方案、CVD(顺铂、长春碱和达卡巴嗪)和BOLD(博来霉素、长春新碱、洛莫司汀和达卡巴嗪)中。在一些实施方案中，抗癌药选自干扰素类，例如但不限于干扰素α-2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化的干扰素类例如聚乙二醇化的干扰素α-2b。白细胞介素类例如白细胞介素-2也可以与本文所公开的化合物联合使用。
在本文所述的治疗黑素瘤的方法中，化合物的治疗有效量可以为约0.25mg/kg至约30mg/kg个体体重。在一些实施方案中，化合物的治疗有效量可以为约0.5mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约25mg/kg、约1mg/kg至约15mg/kg或者约1或2mg/kg至约10mg/kg。在其它实施方案中，给药至个体的化合物的量为约25至约1500mg/天，并优选约100或200mg/天至约500或600mg/天。
在一些实施方案中，本文所述的治疗黑素瘤的方法还包括给药式I、IA、IB或IC化合物，作为治疗周期的部分。治疗周期包括给药期(期间将式I、IA、IB或IC化合物规律地给予个体)和假期(期间不给药化合物)。例如，治疗周期可以包括：每天给药一定量的式I化合物，给药7、14、21或28天，随后7或14天不给药化合物。在一些实施方案中，治疗周期包括每天给药一定量的化合物，给药7天，随后7天不给药化合物。治疗周期可以重复一次或多次，例如两次、四次或六次，以提供疗程。更具体来讲，疗程指一段时间，在该段时间个体接受通过本发明方法进行的黑素瘤治疗。因此，疗程可以指在期间个体接受每天剂量或间歇剂量的本文所公开的化合物的时间期限，以及延长到一个或多个治疗周期的时间期限。另外，在治疗周期的给药期，化合物可以每天给药一次、两次、三次或四次。在其它实施方案中，所述方法还包括在疗程期间给药所述量的化合物，每天或每隔一天给药一次、两次、三次或四次。
因此，本发明还提供治疗黑素瘤的方法，该方法包括将具有式I、IA、IB或IC结构的化合物、其药学上可接受的盐、其互变异构体或互变异构体的药学上可接受的盐给药至患有癌症的个体，其中在第一个治疗周期中给药的化合物的量是每天25mg，给药的化合物的量随着之后的每一治疗周期增加，直到每天1500mg化合物给药至个体或在个体中观察到剂量限制性毒性。在此类方法中，通常，给药的化合物的量在第一个治疗周期后的每一个后来的治疗周期都加倍。例如第一个治疗周期可以包括以25mg/天给药至个体，在随后的治疗周期可以包括以50mg/天给药至个体。在一些实施方案中，治疗周期包括每天给药相同量的化合物，给药7天，随后7天不给药化合物。
一方面，本发明提供结构I、IA、IB和/或IC的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、互变异构体的药学上可接受的盐或其混合物在制备用于本发明任何方法的任何实施方案的药物或药物制剂中的用途。
另一方面，本发明提供包含容器的药盒(kit)，所述容器包含结构I、IA、IB和/或IC的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、互变异构体的药学上可接受的盐或其混合物。药盒可以包含用于治疗黑素瘤的另外的化合物。药盒还可以包含用于指导实现本发明的任何方法的书面说明书。在一些实施方案中，书面说明书可以作为与药盒的容器分离的纸质文件被包含，而在其它实施方案中，书面说明书可以写在附着在药盒的容器上的标签上。
根据下面的详细说明和附图，本发明的其它目的、特征和优点是显而易见的。
附图说明
图1显示通过蛋白质印迹(Western blot)鉴定黑素瘤细胞的FGFR1-4表达。
图2化合物1在bFGF-驱动的基质胶塞测定(matrigel plug assay)中表现出有效的抗血管形成活性。
图3是显示在A375M(B-Raf突变)人黑素瘤异种移植物模型中化合物1对平均肿瘤体积的显著抗肿瘤作用的图。
图4是显示在CHL-1(野生型B-Raf)人黑素瘤异种移植物模型中化合物1对平均肿瘤体积的显著抗肿瘤作用的图。
图5是显示在nu/nu小鼠中在黑素瘤A375M(BRaf突变)模型中化合物1、卡铂和紫杉醇的联合治疗对平均肿瘤体积的显著抗肿瘤作用的图。
图6是显示在雌性Nu/Nu小鼠中每天给药化合物1和/或每周给药卡铂和紫杉醇对抗CHL-1黑素瘤肿瘤的对平均肿瘤体积的显著抗肿瘤作用的图。
发明详述
本发明提供治疗黑素瘤特别是转移的黑素瘤的方法。本发明还提供化合物(例如结构I、IA、IB和IC化合物)、其互变异构体、盐和混合物在制备用于治疗黑素瘤的药物或药物制剂中的用途。尽管不希望受理论约束，但认为公开的化合物在治疗黑素瘤中的令人惊奇的效果是由所述化合物的双重活性导致的。认为发明的化合物通过抑制黑素瘤细胞表达一种或多种FGF受体以及通过阻断VEGFR、FGFR和PDGFRβ而抑制与黑素瘤相关的血管发生发挥对黑素瘤的抗肿瘤作用。本文公开的化合物还可以对野生型或突变型Raf或Ras基因型的黑素瘤有效。
在整个本申请中使用下列缩写和定义：
“bFGF”是代表碱性成纤维细胞生长因子的缩写。
“C-Kit”还称作干细胞因子受体或肥大细胞生长因子受体。
“CSF-1R”是集落刺激因子1受体的缩写。
“FGF”是与FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4相互作用的成纤维细胞生长因子的缩写。
“FGFR1”也称为bFGFR，是代表与成纤维细胞生长因子FGF相互作用的酪氨酸激酶的缩写。相关的受体酪氨酸激酶包括FGFR2、FGFR3和FGFR4。这些激酶中的一种或多种通常在黑素瘤中表达(参见实施例)。
“Flk-1”是代表胎肝酪氨酸激酶1的缩写，也称作激酶-插入域酪氨酸激酶或KDR(人)，也称作血管内皮生长因子受体-2或VEGFR2(KDR(人)、Flk-1(小鼠))。
“FLT-1”是代表fms-样酪氨酸激酶-1的缩写，也称作血管内皮生长因子受体-1或VEGFR1。
“FLT-3”是代表fms-样酪氨酸激酶-3的缩写，也称作干细胞酪氨酸激酶I(STKI)。
“FLT-4”是代表fms-样酪氨酸激酶-4的缩写，也称作VEGFR3。
“MIA”代表黑素瘤抑制活性。如本文所用，MIA蛋白质涉及可在GenBank数据库公开获得的登录号NP_006524的12kDa可溶蛋白(由GenBank登录号NM_006533所列的cDNA编码)和哺乳动物类似物或其包含MIA蛋白的至少十个连续残基的片断。已表明MIA蛋白通过结合至纤维连接蛋白和层粘连蛋白与黑素瘤细胞从细胞外基质分离相关，从而阻止细胞-基质相互作用(Brockez L.等人，Br.J.Dermatol.143：256268(2000))。在治疗之前和之后测得的MIA蛋白的存在或浓度可以用于确定哺乳动物个体对采用黑素瘤抑制剂的治疗的响应。
“MEK1”是代表在由Raf-MEK1-ERK形成的模块中的MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)信号传导通路中的丝氨酸苏氨酸激酶的缩写。MEK1磷酸化ERK(胞外调节激酶)。
“PDGF”是代表血小板衍生生长因子的缩写。PDGF与酪氨酸激酶PDGFRα和PDGFRβ相互作用。
“Raf”是MAPK信号传导通路中的丝氨酸/苏氨酸激酶。
“RTK”是代表受体酪氨酸激酶的缩写。
“Tie-2”是代表具有Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶的缩写。
“VEGF”是代表血管内皮生长因子的缩写。
“VEGF-RTK”是代表血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶的缩写。
通常，提到某种元素例如氢或H时，也意指包括该元素的所有同位素。例如，如果结构I化合物上的基团被漏掉(left off)或显示为H，则这意指包括氢或H、氘和氚。
短语“含有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团”指不含有杂原子并包含1-6个碳原子的非环的烷基基团。因此，该短语包括直链烷基基团例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。该短语还包括直链烷基基团的支链异构体，包括但不限于：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2C(CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2等。在一些实施方案中，烷基基团包括含有1-6个碳原子的直链和支链烷基基团。在其它实施方案中，烷基基团含有1-4个碳原子。在另外的实施方案中，烷基基团是含有1-2个碳原子的直链烷基基团(甲基或乙基基团)。在另外的实施方案中，烷基基团只含有1个碳原子并且是甲基基团(-CH3)。
“药学上可接受的盐”包括与无机碱、有机碱、无机酸、有机酸或者碱性或酸性氨基酸成的盐。对于无机碱的盐，本发明包括例如碱金属例如钠或钾盐；碱土金属例如钙、镁或铝盐；和铵盐。对于有机碱的盐，本发明包括例如与三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺形成的盐。无机酸的盐包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸的盐。对于有机酸的盐，本发明包括例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的盐。对于碱性氨基酸的盐，本发明包括例如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的盐。酸性氨基酸盐包括例如天冬氨酸和谷氨酸的盐。
结构I的化合物可采用下面实施例部分描述的和公开在下面文献中的方法容易地合成，所述文献各以其全部内容引入本文，并用于所有目的，就如在本文完整叙述那样：U.S.专利号6,605,617、U.S.专利申请号10/644,055(作为U.S.2004/0092535公开)、U.S.专利申请号10/983,174(作为U.S.2005/0261307公开)、U.S.专利申请号10/726,328(作为U.S.2004/0220196公开)、U.S.专利申请号10/982,757(作为U.S.20050137399公开、U.S.专利申请号10/982,543(作为U.S.2005/209247公开)和PCT专利申请号PCT/US2006/019349(作为WO 2006/125130公开)。
结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、互变异构体的药学上可接受的盐和其混合物可以用于制备药物和药物制剂。此类药物和药物制剂可以用于本文所述的治疗方法。
药物制剂可以包含任何上述实施方案的任何化合物、互变异构体或盐以及药学上可接受的载体例如本文所述的那些载体。
本发明还提供治疗或缓解与转移的肿瘤有关的病症的组合物，其可以通过将一种或多种本发明化合物、或其药学上可接受的盐互变异构体或其混合物与药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合来制备。
本发明的组合物可以用于制备用于治疗本文所述的转移的肿瘤的制剂。此类组合物可以例如为颗粒剂、散剂、片剂、胶囊、糖浆剂、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬剂或溶液剂形式。本发明组合物可以配制用于各种给药途径，例如通过口服给药、通过鼻腔给药、通过直肠给药、皮下注射、静脉内注射、肌内注射或腹膜内注射。通过举例给出下列剂型，但不应解释为限制本发明。
对于口服、颊(buccal)和舌下给药，散剂、混悬剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和胶囊形片剂(caplets)是可接受的固体剂型。这些可以例如通过将一种或多种本发明化合物、药学上可接受的盐、互变异构体或其混合物与至少一种添加剂例如淀粉或其它添加剂混合来制备。适当的添加剂是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、海藻酸盐、甲壳质、脱乙酰壳多糖、果胶类、黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成的聚合物或甘油酯类。任选地，口服剂型可以含有其它助于给药的成分，例如无活性的稀释剂或润滑剂例如硬脂酸镁；或防腐剂例如对羟基苯甲酸酯或山梨酸；或抗氧化剂例如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸；崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂或芳香剂。片剂和丸剂可以用本领域已知的适当包衣材料进一步处理。
用于口服给药的液体剂型可以为药学上可接受的乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和溶液剂的形式，其可以含有无活性的稀释剂例如水。药物制剂和药物可以采用无菌液体例如但不限于油、水、醇和它们的组合制备为液体混悬剂或溶液剂。对于口服或胃肠外给药，可以加入药学上适当的表面活性剂、助悬剂、乳化剂。
如上所述，混悬剂可以包含油。所述油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。混悬剂制剂还可以含有脂肪酸的酯，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化的脂肪酸甘油酯。混悬剂制剂可以包含醇，例如但不限于乙醇、异丙醇、十六醇、甘油和丙二醇。在混悬剂制剂中还可以使用醚类例如但不限于聚(乙二醇)、石油烃类例如矿物油和矿脂；和水。
对于鼻腔给药，药物制剂和药物可以是含有适当溶剂和任选的其它化合物例如但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些物质的组合的喷雾剂或气雾剂。用于气雾剂的抛射剂可以包括压缩的空气、氮气、二氧化碳或基于低沸溶剂的烃。
可注射的剂型通常包括水性混悬剂或油性混悬剂，其可以采用适当的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。可注射形式可以在溶液相中，或为混悬液形式，其用溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或溶媒包括无菌水、林格(Ringer)溶液或等渗的盐水溶液。或者，无菌的油可以用作溶液或助悬剂。优选地，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成的油、脂肪酸、甘油单-、二-或三-酯类。
对于注射剂而言，药物制剂和/或药物可以为适于用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的实例包括但不限于冷冻干燥的、旋转干燥的或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或粒子。对于注射剂而言，制剂可以任选地包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些物质的组合。
对于直肠给药，药物制剂和药物可以为将化合物释放进肠、乙状结肠曲和/或直肠的栓剂、软膏剂、灌肠剂、片剂或乳膏剂。直肠栓剂通过将一种或多种本发明化合物、或该化合物的药学上可接受的盐或互变异构体与可接受的溶媒例如可可脂或聚乙二醇(其在正常贮存温度下以固相存在，并且在适于释放药物到体内例如直肠内的那些温度下以液相存在)混合来制备。油还可以用于软明胶型制剂和栓剂的制备中。水、盐水、葡萄糖水溶液和有关的糖溶液以及甘油类可以用于混悬剂制剂的制备中，所述混悬剂制剂还可以含有助悬剂例如果胶类、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素以及缓冲剂和防腐剂。
除了上面所述的那些代表性剂型外，药学上可接受的赋形剂和载体对于本领域技术人员而言是众所周知的，并因此包括在本发明中。此类赋形剂和载体描述在例如“Remingtons Pharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)，将其以全部内容引入本文作为参考用于各种目的，就如将其在本文完全叙述那样。
本发明的制剂可以被设计为如下面所述的短效、快速释放、长效和持续释放的。因此，药物制剂还可以配制用于控制释放或缓释。
本发明的组合物还可以包括例如微胶粒或脂质体或一些其它包囊的形式，或可以以延长释放形式给药以提供延长的贮存和/或递送效果。因此，药物制剂和药物可以被压制为小丸(pellets)或圆柱体，并作为贮库注射剂或和作为植入物例如支架剂(stents)植入肌内或皮下。此类植入物可以应用已知的惰性材料例如硅酮类和生物可降解的聚合物。
具体剂量可以根据疾病的情况、个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、剂量间隔、给药途径、排泄速率和药物的组合进行调整。含有有效量的任何上述剂型很好地落入例行试验的范围内，因此很好地落在本发明的范围内。
治疗有效剂量可以根据给药的途径和剂型而变化。优选的本发明的化合物是具有高治疗指数的制剂。治疗指数是毒性和治疗效果之间的剂量比例，其可以表示为LD50和ED50之间的比例。LD50致使50％的群体死亡的剂量，ED50是对50％的群体具有治疗效果的剂量。LD50和ED50通过标准药学方法在动物细胞培养物或实验动物中测定。
在本发明中，“治疗”意指减轻与病症或疾病相关的症状，或者抑制、停止或逆转那些症状的进一步进展或恶化，或阻止或预防疾病或病症。此外，在本发明中，“治疗”意指抑制皮肤的、皮下的或内脏的黑素瘤的生长，减小皮肤的、皮下的或内脏的黑素瘤的尺寸，减少皮肤的、皮下的或内脏的损害数目，或减小皮肤的、皮下的或内脏的损害的尺寸。此外，在本发明中，“治疗”意指疾病响应的生物标记的改变，例如黑素瘤抑制活性蛋白的循环水平的降低。例如在治疗患有黑素瘤的患者的语境中，成功的治疗可以包括供给黑素瘤或患病组织的毛细血管的增殖的降低，与黑素瘤、毛细血管增殖或患病组织的癌性生长相关的症状的减轻，或者抑制或停止毛细血管增殖，或者抑制或停止黑素瘤的进展或者黑素瘤细胞的生长或转移，或黑素瘤的消退或者部分或完全缓解、疾病稳定，或黑素瘤患者的总存活数增加。
治疗还可以包括施用本发明的药物制剂以及其它疗法。例如，本发明的化合物和药物制剂可以在手术方法和/或放射疗法之前、期间或之后施用。本发明化合物还可以与用于治疗黑素瘤的其它抗癌药物一起施用。抗癌药物意指被本领域技术人员例如肿瘤科医生或其它医师用于治疗恶性肿瘤和癌性生长的那些药物。因此，抗癌药物和本文公开的化合物(例如结构I、IA、IB和IC化合物)可以同时、分别或依次给药。适当的组合和给药方案可以由肿瘤学和医学领域的技术人员确定。
本发明的化合物和制剂特别适合用于联合治疗，由于当与抗癌药物例如紫杉烷类、亚硝基脲类、铂化合物、烷化剂、拓扑异构酶I和II抑制剂、长春花生物碱、抗癌抗生素、干扰素类、白细胞介素-2和放射治疗联合应用时，它们已经显示出或预期可展示出相加作用或超过相加的作用或协同作用。因此，一方面，本发明提供包含结构I化合物和其互变异构体、盐和/或混合物以及抗癌药物的药物制剂。所述组合可以分别包装或一起包装在药盒中用于同时、分别或依次施用。本发明还提供化合物、互变异构体、盐和/或混合物在制备此类制剂和药物中的用途。
另一方面，本发明提供了治疗转移的黑素瘤的方法。该方法包括将一种或多种抗癌药物施用至有其需要的个体，所述抗癌药物选自：达卡巴嗪(DITC-DOME)、替莫唑胺(TEMODAR)、卡莫司汀(BCNU，BICNU)、洛莫司汀(CCNU，CEENU)、福莫司汀、紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、长春碱(VELBAN)、伊立替康(CAMPTOSAR)、沙立度胺(THALIDOMID)、链佐星(ZANOSAR)、放线菌素D(COSMEGEN)、氮芥(MUSTARGEN)、顺铂(PLATINOL-AQ)、卡铂(PARAPLATIN)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)、索拉非尼(BAY43-9006，NEXAVAR)、舒尼替尼(sutent)(SU1248，AVASTIN)或厄洛替尼(TARCEVA)。本发明的化合物可以加至多化学治疗方案例如Dartmouth方案、CVD(顺铂、长春碱和达卡巴嗪)和BOLD(博来霉素、长春新碱、洛莫司汀和达卡巴嗪)中。适于与本文公开的化合物联合使用的其它化疗剂包括在Lens和Eisen，Expert OpinPharmacother，2003 4(12)：2205-2211中公开的那些。在一些实施方案中，抗癌药物选自干扰素类例如但不限于干扰素α-2a、干扰素α-2b(INTRON-A)、聚乙二醇化的干扰素类例如聚乙二醇化的干扰素α-2b。白细胞介素类例如白细胞介素-2(阿地白介素)也可以与本文公开的化合物联合使用。
本发明的化合物可以用于治疗各种个体。适当的个体包括动物例如哺乳动物和人。适当的哺乳动物包括但不限于：灵长类例如但不限于狐猴、猿和猴；啮齿类例如大鼠、小鼠和豚鼠；兔子和野兔；牛；马；猪；山羊；绵羊；有袋类动物；和肉食动物例如猫科动物、犬科动物和熊类。在一些实施方案中，个体或患者是人。在其它实施方案中，个体或患者是啮齿动物例如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，个体或患者是是除人以外的动物，并且在一些此类实施方案中，个体或患者是是除人以外的哺乳动物。
应当理解，本发明中使用的有机化合物可能存在互变异构现象。由于本说明书中的化学结构只能表示可能的互变异构形式之一，所以应当理解本发明包括所画结构的任何互变异构形式。例如结构IA在下面以一种互变异构体(互变异构体Ia)显示：
结构IA的其它互变异构体，互变异构体Ib和互变异构体Ic如下所示：
通过参考下面的实施例将更容易理解如上一般描述的本发明，提供下面的实施例用于举例说明，而不用于限制本发明。
实施例
关于下面化学术语的以下缩写用于整个申请中：
ATP：三磷酸腺苷
Boc： N-叔丁氧基羰基
BSA： 牛血清白蛋白
DMSO： 二甲基亚砜
DTT： DL-二硫苏糖醇
DMEM： Dulbecco改良的Eagle培养基
ED50： 在50％的群体中治疗有效的剂量
EDTA： 乙二胺四乙酸
EGTA： 乙二醇四乙酸
EtOH： 乙醇
FBS： 胎牛血清
Hepes： 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HPLC： 高效液相色谱
IC50值：引起测得活性50％降低的抑制剂浓度
KHMDS： 双(三甲基甲硅烷基)氨基钾
LC/MS： 液相色谱/质谱
MOPS： 3-(N-吗啉代)-丙磺酸
PBS： 磷酸盐缓冲液
PMSF： 苯基甲磺酰氟
RIPA： 细胞溶解缓冲液，其含有例如50mM Tris-HCl(pH
7.4)、150mM NaCl、1mM PMSF、1mM EDTA、5
μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮抑酶肽、1％Triton x-100、
1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS
SDS： 十二烷基硫酸钠
TBME： 叔丁基甲基醚
THF： 四氢呋喃
Tris： 2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1，3-二醇
化合物的纯化和鉴定
本发明的化合物通过高效液相色谱(HPLC)进行鉴定，所述HPLC采用带有2690分离模块(Milford，Massachusetts)的Waters Millenium色谱系统。分析柱是Alltima C-18反相，4.6×250mm，得自Alltech(Deerfield，Illinois)。使用梯度洗脱，通常从5％乙腈/95％水开始，在40分钟内渐进至100％乙腈。所有溶剂含有0.1％三氟乙酸(TFA)。化合物用紫外光(UV)吸收在220或254nm处检测。HPLC溶剂来自Burdick and Jackson(Muskegan，Michigan)或Fisher Scientific(Pittsburg，Pennsylvania)。在一些情况中，采用玻璃或塑料背衬的硅胶板例如Baker-Flex Silica Gel 1B2-F软薄板通过薄层色谱(TLC)评价纯度。TLC结果可在紫外光下或应用公知的碘蒸气和其它各种染色技术可视地检测。
质谱分析在两种LCMS之一上进行：Waters System(Alliance HTHPLC和Micromass ZQ质谱仪；柱：Eclipse XDB-C18，2.1×50mm；溶剂系统：含有0.05％TFA的5-95％乙腈的水溶液；流速0.8mL/分钟；分子量范围150-850；锥电压20V；柱温40℃)或Hewlett Packard System(Series 1100 HPLC；柱：Eclipse XDB-C18，2.1×50mm；溶剂系统：含有0.05％TFA的1-95％乙腈的水溶液；流速0.4mL/分钟；分子量范围150-850；锥电压50V；柱温30℃)。所有的质量以质子化的母离子的质量报告。
GCMS分析在Hewlet Packard仪器(带有质量选择检测器5973的HP6890 Series气相色谱；进样体积：1μL；初柱温：50℃；终柱温：250℃；斜坡时间(Ramp time)：20分钟；气体流速：1mL/分钟；柱：5％苯基甲基硅氧烷，Model#HP 190915-443，尺寸：30.0m×25μm×0.25μm)上进行。
使用Flash 40色谱系统和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville，Virginia)或者使用采用C-18反相柱的HPCL进行制备分离。用于Flash 40Biotage系统的典型溶剂是二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、己烷和三乙胺。用于反相HPLC的典型溶剂是含有0.1％三氟乙酸的各种浓度的乙腈和水。
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的合成
A.5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺的合成
方法A
将5-氯-2-硝基苯胺(500g，2.898mol)和1-甲基哌嗪(871g，8.693mol)置于2000mL的装配有冷凝器并用N2冲洗的烧瓶中。将该烧瓶置于100℃的油浴中并加热，直到通过HPLC测定5-氯-2-硝基苯胺完全反应(通常过夜)。在HPLC确定5-氯-2-硝基苯胺消失后，在机械搅拌下将反应混合物直接倒入(仍然温热)2500mL的室温水中。将得到的混合物搅拌直到其达到室温，然后将其过滤。将如此得到的黄色固体加至1000mL水中，并搅拌30分钟。将得到的混合物过滤，并将得到的固体用TBME(500mL，2X)洗涤，然后采用橡胶塞(rubber dam)在真空下干燥1小时。将得到的固体转移至干燥盘中，并在真空干燥箱中在50℃下干燥至恒重，得到670g(97.8％)的标题化合物，为黄色粉末。
方法B
将5-氯-2-硝基苯胺(308.2g，1.79mol)加至装有顶式(overhead)搅拌器、冷凝器、气体入口、加料漏斗和温度计探头的4-颈5000mL圆底烧瓶中。然后将烧瓶用N2冲洗。在搅拌下，将1-甲基哌嗪(758.1g，840mL，7.57mol)和无水乙醇(508mL)加至反应烧瓶中。再用N2冲洗烧瓶，并将反应物保持在N2下。将烧瓶在加热套中加热至97℃(+/-5℃)的内温，并保持该温度，直到通过HPLC测定反应完全(通常约40小时)。反应完全后，不再加热，在搅拌下将反应物冷却至约20℃至25℃的内温，将反应物搅拌2-3小时。将5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺的晶种(0.20g，0.85mmol)加至反应混合物中，除非已经出现沉淀物。历经约1小时，将水(2,450mL)加至搅拌的反应混合物中，同时将内温维持在约20℃至30℃的温度下。加完水后，将得到的混合物在20℃-30℃的温度下搅拌约1小时。然后将得到的混合物过滤，并用水(3×2.56L)洗涤烧瓶和滤饼。在真空干燥箱中在真空、约50℃条件下将金黄色固体产物干燥至416g的恒重(98.6％收率)。
方法C
将5-氯-2-硝基苯胺(401g，2.32mol)加至装有顶式搅拌器、冷凝器、气体入口、加料漏斗和温度计探头的4-颈12L圆底烧瓶中。然后将烧瓶用N2冲洗。在搅拌下，将1-甲基哌嗪(977g，1.08L，9.75mol)和100％乙醇(650mL)加至反应烧瓶中。将烧瓶再次用N2冲洗，并将反应物保持在N2下。将烧瓶在加热套中加热至97℃(+/-5℃)的内温，并保持该温度，直到通过HPLC测定反应完全(通常约40小时)。反应完成后，不再加热，在搅拌下将反应物冷却至约80℃的内温，历经1小时，通过加料漏斗将水(3.15L)加至混合物中，同时使内温保持在82℃(+/-3℃)。加完水后，停止加热，并在不少于4小时的时间内，将反应混合物冷却至20-25℃的内温。然后再将反应混合物在20-30℃搅拌1小时。然后将得到的混合物过滤，并将烧瓶和滤饼用水(1×1L)、50％乙醇(1×1L)和95％乙醇(1×1L)洗涤。将金黄色固体产物置于干燥盘中，并在真空干燥箱中在真空、约50℃条件下干燥至546g的恒重(99％收率)。
B.[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯的合成
方法A
将5000mL的4-颈烧瓶装配搅拌器、温度计、冷凝器和气体入口/出口。向已装配的烧瓶中加入265.7g(1.12mol.1.0eq(当量))的5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺和2125mL的无水EtOH。将得到的溶液用N2冲洗15分钟。然后，加入20.0g 5％Pd/C(50％H2O w/w)。将反应物在40-50℃(内温)下剧烈搅拌，同时将H2鼓泡通入混合物中。用HPLC每小时监测反应，检测5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺的消失。典型的反应时间是6小时。
在所有的5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺从反应物中消失后，将溶液用N2冲洗15分钟。然后加入为固体的440.0g(2.25mol)3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐。将反应物在40-50℃(内温)下搅拌，直到反应完全。通过用HPLC跟踪二氨基化合物的消失，监测反应。典型的反应时间是1-2小时。反应完全后，将其冷却至室温，并通过硅藻土过滤材料的垫层过滤。将硅藻土过滤材料用无水EtOH(2×250mL)洗涤，将滤液在减压下浓缩，得到浓的棕色/橙色油状物。将得到的油状物溶解在850mL 0.37％HCl溶液中。然后一次性加入固体NaOH(25g)，形成沉淀。将得到的混合物搅拌1小时，然后过滤。将固体用H2O(2×400mL)洗涤，在真空干燥箱中在50℃干燥，得到251.7g(74.1％)[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯，为浅黄色粉末。
方法B
将5000mL的4-颈加套烧瓶装配机械搅拌器、冷凝器、温度探头、气体进口和油起泡器。向已装配的烧瓶加入300g(1.27mol)5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺和2400mL无水EtOH(反应可以用95％乙醇进行并已经用95％乙醇进行过，对于该反应使用无水乙醇不是必需的)。将得到的溶液搅拌并用N2冲洗15分钟。然后，将22.7g 5％Pd/C(50％H2O w/w)加至反应烧瓶中。将反应容器用N2冲洗15分钟。用N2冲洗后，通过维持缓慢但恒定流速的H2通过烧瓶，用H2冲洗反应容器。将反应物在45-55℃(内温)下搅拌，同时使H2鼓泡通入混合物中，直到用HPLC测定5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺完全消耗。典型的反应时间是6小时。
所有的5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺从反应物中消失后，将溶液用N2冲洗15分钟。该二胺中间体是空气敏感的，所以必须小心以避免其暴露于空气中。经约30分钟时间，将500g(2.56mol)3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐加入到反应混合物中。将反应物在N2、45-55℃(内温)下搅拌，直到用HPLC测定该二胺完全消耗。典型的反应时间是约2小时。反应完全后，趁温热将反应物通过硅藻土垫层过滤。然后将反应烧瓶和硅藻土用无水EtOH(3×285mL)洗涤。将滤液合并在5000mL烧瓶中，在真空下除去约3300mL乙醇，得到橙色油状物。将水(530mL)和1M HCL(350mL)依次加至得到的油状物中，将得到的混合物搅拌。将得到的溶液剧烈搅拌，同时在保持内温约25-30℃条件下，经约20分钟时间加入30％NaOH(200mL)，使pH升至9-10。将得到的混悬液搅拌约4小时，同时将内温维持在约20-25℃。将得到的混合物过滤，并将滤饼用H2O(3×300mL)洗涤。将收集的固体在真空干燥箱中在50℃、真空条件下干燥至恒重，得到345.9g(90.1％)[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯，为浅黄色粉末。在另一种后处理方法中，合并滤液，并在真空下除去乙醇，直到至少约90％被除去。然后将中性pH的水加至得到的油状物中，并将溶液冷却至约0℃。然后在快速搅拌下缓慢地加入20％NaOH水溶液，将pH调到高达9.2(用pH计读数)。然后将得到的混合物过滤并如上所述那样干燥。该种后处理方法提供淡褐色至浅黄色的产物，收率高达97％。
降低[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯的含水量的方法
将之前已经后处理并干燥至约8-9％H2O的含水量的[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(120.7克)置于2000mL圆底烧瓶中，并溶解于无水乙醇(500mL)中。用旋转蒸发仪在加热下将琥珀色溶液浓缩至稠的油状物，直到除去所有溶剂。将该过程再重复两次。将如此得到的稠的油状物置于烧瓶中，并置于在50℃加热下的真空干燥箱中过夜。KarlFisher分析结果显示含水量为5.25％。通过该方法获得的降低的含水量使下面实施例的方法中的收率增加。对于该干燥方法，可以用其它溶剂例如甲苯和THF替换乙醇。
C.4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的合成
方法A
将[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(250g，820mmol)(如上所述用乙醇干燥的)溶解在5000mL烧瓶中的THF(3800mL)中，所述烧瓶装配有冷凝器、机械搅拌器、温度探头并用氩气冲洗。将2-氨基-6-氟-苄腈(95.3g，700mmol)加至该溶液中，将内温升至40℃。当所有固体溶解时，溶液温度已经达到40℃，历经5分钟加入固体KHMDS(376.2g，1890mmol)。当加完该钾碱时，得到非均匀的黄色溶液，并且内温升至62℃。60分钟后，内温降回40℃，用HPLC测定反应完全(没有原料或未环化的中间体存在)。然后通过将其倒入H2O(6000mL)中，将稠的反应混合物淬灭，并搅拌得到的混合物，直到它达到室温。然后将混合物过滤，并将滤垫用水(1000mL 2X)洗涤。将亮黄色的固体置于干燥盘中，并在真空干燥箱中在50℃干燥过夜，得到155.3g(47.9％)期望的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
方法B
将5000mL 4-颈加套的烧瓶装配蒸馏装置、温度探头、N2气体进口、加料漏斗和机械搅拌器。将[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(173.0g，570mmol)加入该反应器中，将反应器用N2冲洗15分钟。然后在搅拌下加入干燥THF(2600mL)。所有固体溶解后，通过蒸馏(真空或大气压(更高的温度有助于除去水))除去溶剂(根据需要加热)。除去1000mL溶剂后，停止蒸馏，并将反应物用N2冲洗。然后将1000mL干燥THF加至反应容器中，当所有固体溶解后，再次进行蒸馏(真空或大气压)，直到再除去1000mL溶剂。这种加入干燥THF并除去溶剂的过程重复至少4次(在第4次蒸馏时，除去60％的溶剂，而不是像前3次蒸馏那样只除去40％)，此后，取出1mL样品用于Karl Fischer分析以测定含水量。如果分析显示样品含有少于0.20％的水，则将反应如下段所述那样继续进行。但是，如果分析显示超过0.20％的水，则继续进行如上所述的干燥过程，直到实现含水量少于0.20％。
在采用上段中所述的方法实现少于或约0.20％的含水量后，将蒸馏装置用回流冷凝器替换，并向反应物中加入2-氨基-6-氟-苄腈(66.2g，470mmol)(在某些方法中使用0.95当量)。然后将反应物加热至38-42℃的内温。当内温达到38-42℃时，历经5分钟，通过加料漏斗将KHMDS溶液(1313g，1.32mol，20％KHMDS在THF中)加至反应物中，在加料期间保持内温为约38-50℃。加入所述钾碱后，将反应物搅拌3.5-4.5小时(在某些实施例中，搅拌30-60分钟，并且反应在该时间内完成)，同时将内温维持在38-42℃。然后取出反应物样品，并用HPLC分析。如果反应未完全，历经5分钟将另外的KHMDS溶液加至烧瓶中，并将反应物在38-42℃下搅拌45-60分钟(加入的KHMDS溶液的量如下确定：如果IPC比率＜3.50，则加入125mL；如果10.0≥IPC比率≥3.50，则加入56mL；如果20.0≥IPC比率≥10，则加入30mL。IPC比率等于4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮)的相应面积除以未环化的中间体的相应面积)。一旦反应完全(IPC比率＞20)，将反应器冷却至25-30℃的内温，历经15分钟，将水(350mL)加入到反应器中，同时保持内温为25-30℃(或者，在40℃下进行反应，在5分钟内加入水。更快的淬灭减少随时间推移而形成的杂质的量)。然后将回流冷凝器用蒸馏装置替换，通过蒸馏(真空或大气压)除去溶剂(根据所需加热)。除去1500mL溶剂后，停止蒸馏，并将反应物用N2冲洗。然后将水(1660mL)加至反应烧瓶中，同时将内温维持在20-30℃。然后将反应混合物在20-30℃搅拌30分钟，然后将其冷却至5-10℃的内温，然后搅拌1小时。将得到的混悬液过滤，并将烧瓶和滤饼用水(3×650mL)洗涤。将如此得到的固体在真空干燥箱中在真空、50℃条件下干燥至恒重，得到103.9g(42.6％收率)4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮，为黄色粉末。
方法C
将[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(608g，2.01mol)(干燥的)和2-氨基-6-氟-苄腈(274g，2.01mol)加入到4-颈12L烧瓶中，所述烧瓶在加热套上并装配有冷凝器、机械搅拌器、气体进口和温度探头。将反应容器用N2冲洗，在搅拌下将甲苯(7.7L)加入到反应混合物中。将反应容器再次用N2冲洗，并保持在N2下。升高混合物的内温，直到达到63℃(+/-3℃)。将混合物的内温保持在63℃(+/-3℃)，在减压下(380+/-10托，蒸馏头温度＝40℃(+/-10℃))从烧瓶中蒸馏出大约2.6L甲苯(KarlFischer分析用于检测混合物中的含水量。如果含水量超过0.03％，则再加入2.6L甲苯并再次蒸馏。重复该方法直到实现含水量少于0.03％)。达到含水量少于0.03％后，停止加热，在N2气氛下将反应物冷却至17-19℃的内温。然后在N2气氛下以使反应的内温保持低于20℃的速度，将在THF中的叔丁醇钾(20％在THF中；3.39kg，6.04摩尔叔丁醇钾)加入到反应物中。加完叔丁醇钾后，将反应物在小于20℃的内温下搅拌30分钟。然后将温度升至25℃，并将反应物搅拌至少1小时。然后将温度升至30℃，并将反应物搅拌至少30分钟。然后采用HPLC检测原料的消耗，从而监测反应的完成(通常2-3小时，两种原料都耗尽(通过HPLC的面积％表明少于0.5％))。如果2小时后未反应完全，一次性加入另外0.05当量的叔丁醇钾，直到HPLC表明反应完全，才停止该过程。反应完全后，将650mL水加至搅拌的反应混合物中。然后将反应升至50℃的内温，并在减压下从反应混合物中蒸馏去THF(约3L，按体积计)。然后用加料漏斗将水(2.6L)滴加加至反应混合物中。然后将混合物冷却至室温，并搅拌至少1小时。然后将混合物过滤，并将滤饼用水(1.2L)、70％乙醇(1.2L)和95％乙醇(1.2L)洗涤。将亮黄色固体置于干燥盘中，并在真空干燥箱中在50℃干燥，直到恒重，提供674g(85.4％)期望的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮。
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的纯化
将装配有冷凝器、温度探头、N2气体进口和机械搅拌器的3000mL 4-颈烧瓶置于加热套中。然后向烧瓶中加入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(101.0g，0.26mol)，并将该黄色固体混悬在95％乙醇(1000mL)中并搅拌。在某些情况中使用8∶1的溶剂比率。然后将混悬液加热至温和回流(约76℃)，并搅拌约1小时。然后在回流下将反应物搅拌45-75分钟。此时，将烧瓶移离热源，并将混悬液冷却至25-30℃。然后将混悬液过滤，并将滤垫用水(2×500mL)洗涤。然后将黄色固体置于干燥盘中，并在真空干燥箱中在50℃干燥，直到恒重(通常16小时)，得到97.2g(96.2％)纯化的产物，为黄色粉末。
D.4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的乳酸盐的制备
将3000mL 4-颈加套的烧瓶装配冷凝器、温度探头、N2气体进口和机械搅拌器。将反应容器用N2冲洗至少15分钟，然后加入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(484g，1.23mol)。制备D，L-乳酸(243.3g，1.72mol单体-参见下段)、水(339mL)和乙醇(1211mL)的溶液，然后加至反应烧瓶中。以中等速度开始搅拌，并将反应物加热至68-72℃的内温。将反应物的内温在68-72℃保持15-45分钟，然后停止加热。将得到的混合物通过10-20微米的烧结滤器过滤，将滤液收集到12L烧瓶中。将12L烧瓶装配内温探头、回流冷凝器、加料漏斗、气体进口、出口和顶式搅拌器。然后将滤液以中等速度搅拌，并加热至回流(约78℃的内温)。保持温和回流，历经约20分钟将乙醇(3,596mL)加至烧瓶中。然后将反应烧瓶在15-25分钟内冷却至约64-70℃的内温，并将该温度保持约30分钟。就晶体对反应器进行检查。如果没有晶体存在，则将4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(484mg，0.1mol％)的乳酸盐的晶体加至烧瓶中，并将反应物在64-70℃搅拌30分钟，然后再就晶体对反应器进行检查。一旦晶体出现，将搅拌降至低速度，并将反应物在64-70℃再搅拌90分钟。然后经约2小时将反应物冷却至约0℃，并将得到的混合物通过25-50微米烧结滤器过滤。将反应器用乙醇(484mL)洗涤，并搅拌直到内温为约0℃。用冷乙醇洗涤滤饼，并将该过程再重复2次。将收集的固体在真空干燥器箱中在50℃、真空下干燥至恒重，得到510.7g(85.7％)结晶状黄色的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的乳酸盐。在过滤过程期间通常使用橡胶塞或惰性条件。虽然干燥固体似乎不是十分易吸水的，但是湿滤饼易于吸水并变得粘稠。应当注意避免延长湿滤饼与大气的接触时间。
商品化的乳酸通常含有约8-12％w/w水，并且除了单体乳酸外，还含有二聚体和三聚体。乳酸二聚体与单体的摩尔比通常为约1.0∶4.7。商品化级别的乳酸可以用于前面段中所述的方法，因为单乳酸盐优选从反应混合物中沉淀出。
代谢物的鉴定
已经在来自如本文所引的参考文献中所述的2周毒性研究的收集的大鼠血浆中鉴定和表征了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(化合物1)的两个代谢物。该两个鉴定的代谢物是显示在下面的哌嗪N-氧化物化合物(化合物2)和N-脱甲基化合物(化合物3)。
化合物2
化合物3
4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-4-氧哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物2)和4-氨基-5-氟-3-(6-哌嗪-1-基-1H-苯并咪唑-2-基)喹啉-2(1H)-酮(化合物3)的合成
为了确定化合物1的经鉴定的代谢物的结构，分别合成代谢物。
化合物2是化合物1的N-氧化物代谢物，其如下面流程图所示那样合成。将化合物1在乙醇、二甲基乙酰胺和过氧化氢的混合物中加热。一旦反应完全后，通过过滤分离得到化合物2，并用乙醇洗涤。如果需要的话，可以用柱色谱法进一步纯化产物。
化合物3是化合物1的N-脱甲基代谢物，其如下面流程图所示那样合成。将5-氯-2-硝基苯胺用哌嗪处理，得到4，随后将4用丁氧基羰基(Boc)基团保护得到5。还原硝基基团，随后与3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯缩合得到6。采用六甲基二硅基氨基钾作碱，6与6-氟邻氨基苯甲腈缩合，得到7。将粗品7用HCl水溶液处理，得到预期的代谢物，纯化后为黄色/棕色固体。
测定方法
酪氨酸激酶
许多蛋白酪氨酸激酶的激酶活性通过提供ATP和含有用于磷酸化的酪氨酸氨基酸残基的适当的肽或蛋白质并测定磷酸基团向酪氨酸残基的转移而测定。采用杆状病毒(Baculovirus)表达系统(InVitrogen)，将相应于FLT-1(VEGFR1)、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2、PDGFRα、PDGFRβ和FGFR1受体的胞浆域的重组蛋白表达在Sf9昆虫细胞中，并且其可以通过Glu抗体相互作用(对于Glu-表位标记的构建物)或通过金属离子色谱法(对于His6(SEQ ID NO：1)标记的构建物)。对于每一测定，将测试化合物系列稀释至DMSO中，然后与加有ATP的适当的激酶反应缓冲液混合。将激酶蛋白和适当的生物素化的肽底物加入，以得到50-100μL的终体积，将反应在室温孵育1-3小时，然后加入25-50μL的45mM EDTA，50mMHepes pH 7.5停止反应。将被停止的反应混合物(75μL)转移至链霉抗生物素涂覆的微孔板(Boehringer Mannheim)中，并孵育1小时。采用铕标记的抗-磷酸酪氨酸抗体PT66，用DELFIA时间分辨荧光系统(Wallac或PEBiosciences)(并作修改，即对于抗体稀释而言将DELFIA测定缓冲液增加1mM MgCl2)测定磷酸化的肽产物。时间分辨荧光在Wallac 1232 DELFIA荧光计或PE Victor II多重信号读数器上读数。采用XL Fit数据分析软件，应用非线性回归计算对于50％抑制而言的每一化合物的浓度(IC50)。
将FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR3、Tie-2和FGFR1激酶在50mM Hepes pH 7.0、2mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM NaF、1mMDTT、1mg/mL BSA、2μM ATP和0.20-0.50μM相应的生物素化的肽底物中测定。分别以0.1μg/mL、0.05μg/mL或0.1μg/mL加入FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2和FGFR1激酶。对于PDGFR激酶测定，使用具有如上相同的缓冲液条件的120μg/mL酶，除了将ATP和肽底物浓度改变为1.4μM ATP和0.25μM生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO：2)肽底物外。
重组和活性的酪氨酸激酶Fyn和Lck是可商购的并可购自UpstateBiotechnology。对于每一测定，将测试化合物系列稀释至DMSO中，然后与加有10nM33Pγ标记的ATP的适当的激酶反应缓冲液混合。加入激酶蛋白和适当的生物素化的肽底物，得到150μL终体积。将反应在室温孵育3-4小时，然后通过转移至链霉抗生物素涂覆的白色微孔板(ThermoLabsystems)(含有100μL的100mM EDTA和50μM未标记的ATP的终止反应缓冲液)中终止反应。孵育1小时后，将链霉抗生物素板用PBS洗涤，并将200μL Microscint 20闪烁液加至每孔中。将板密封并用TopCount计数。采用XL Fit数据分析软件，应用非线性回归计算对于50％抑制而言的每一化合物的浓度(IC50)。
Fyn、Lck和c-ABL的激酶反应缓冲液含有50mM Tris-HCl pH 7.5、15mM MgCl2、30mM MnCl2、2mM DTT、2mM EDTA、25mM β-甘油磷酸、0.01％BSA/PBS、0.5μM适当的肽底物(生物素化的Src肽底物：对于Fyn和Lck而言，生物素-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2(SEQID NO：3))、1μM未标记的ATP和1nM激酶。
c-Kit和FLT-3的激酶活性通过提供ATP和含有用于磷酸化的酪氨酸氨基酸残基的肽或蛋白并测定磷酸基团向酪氨酸残基的转移而测定。相应于c-Kit和FLT-3受体的胞浆域的重组蛋白是购买的(Proquinase)。对于测试而言，将示例性化合物例如4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮稀释在DMSO中，然后与加有ATP的如下所述的激酶反应缓冲液混合。加入激酶蛋白(c-Kit或FLT-3)和生物素化的肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO：2))，得到100μL终体积。将这些反应物在室温孵育2小时，然后加入50μL 45mM EDTA、50mM HEPES，pH 7.5停止反应。将被停止的反应混合物(75μL)转移至链霉抗生物素涂覆的微孔板(Boehringer Mannheim)中，并孵育1小时。采用铕标记的抗-磷酸酪氨酸抗体PT66，用DELPHIA时间分辨荧光系统(Wallac或PE Biosciences)测定磷酸化的肽产物，其已作修改，即对于抗体稀释而言将DELFIA测定缓冲液增加1mM MgCl2。时间分辨荧光值在Wallac 1232 DELFIA荧光计或PE Victor II多重信号读数器上确定。采用XL Fit数据分析软件，应用非线性回归计算对于50％抑制而言的每一化合物的浓度(IC50)。
将FLT-3和c-Kit激酶在50mM Hepes pH 7.5、1mM NaF、2mMMgCl2、10mM MnCl2和1mg/mL BSA、8μM ATP和1μM相应的生物素化的肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO：2))中测定。将FLT-3和c-Kit激酶的浓度在2nM进行测定。将终浓度1μM的磷酸化的肽底物与铕标记的抗-磷酸酪氨酸抗体(PT66)(Perkin Elmer LifeSciences，Boston，MA)一起孵育。采用时间分辨荧光检测铕。采用非线性回归计算IC50。
FGFR2和FGFR4由第三方(third party vendors)采用下面的各方法测定。
方法A：KinaseProfiler(Upstate/Millipore)直接放射测定法如下进行。在25μL终反应体积中，将FGFR2或FGFR4(人，5-10mU)用8mM MOPSpH 7.0、0.2mM EDTA、2.5-10mM MnCl2、0.1mg/mL聚(Glu，Tyr)4∶1、10mM乙酸镁和[γ32P-ATP]比活性约500cpm/pmol，需要的浓度)。通过加入MgATP混合物启动反应。在室温孵育40分钟后，通过加入5μL的3％磷酸溶液停止反应。然后将10μL反应物点样至Filtermat A上并在75mM磷酸中洗涤5分钟，并在甲醇中洗涤一次，然后干燥并闪烁计数。
方法B：Millipore Z′-LYTE激酶测定法(Invitrogen)基于荧光共振能量转移，并如下进行。将2X FGFR2或FGFR4/Tyr 04肽混合物在50mMHEPES pH 7.5、0.01％BRIJ-35、10mM MgCl2、4mM MnCl2、1mMEGTA、2mM DTT中制备。最终的10uL激酶反应物由在50mM HEPESpH 7.5、0.01％BRIJ-35、10mM MgCl2、2mM MnCl2、1mM EGTA、1mM DTT中的0.3-2.9ng FGFR2或2.4-105ng FGFR4和2uM Tyr 04肽组成。将激酶反应物孵育1小时后，加入5μL 1∶32稀释的发展试剂(Development Reagent)B。
MIA蛋白
蛋白印迹分析(Western Blot Analysis)：如本文所述针对MIA蛋白对CHL-1细胞或血浆进行测定。收集全血用于在BD microtainerR分离管(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中制备血浆。将CHL-1细胞在磷酸盐缓冲液(PBS，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中洗涤两次，并在RIPA缓冲液(50mM Tris HCl，pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、2mM正钒酸钠、20mM焦磷酸盐、1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠和0.1％SDS)中在冰上溶解20分钟，所述RIPA缓冲液含有新鲜的1mM苯基甲基磺酰氟、完全小型蛋白酶抑制剂混合物片(Complete Mini ProteaseInhibitor Cocktail tablet)(2片/25mL的溶胞缓冲液)(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国)和1X磷酸酶抑制剂混合物II(PhosphataseInhibitor Cocktail II)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将溶胞产物收集在离心管中，在14K RPM、4℃下旋转20分钟，并通过QIAshredder管(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)过滤。采用BCA测定法根据制造商的方案(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。通过标准方法采用
18％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)处理样品，用于蛋白质印迹(WesternBlot)。MIA用1∶1000稀释在含有5％奶粉的TBST(含有0.1％20的Tris缓冲盐水，Fisher Scientific，Hampton，NH)中的山羊多克隆抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)检测。并在4℃孵育过夜。二次抗体是1∶5000稀释的辣根过氧化物酶-连接的抗山羊抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。采用增强化学发光(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)使蛋白质带可视化。等量上载和转移用β-肌动蛋白检测(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)确定。来自两个商业来源的人重组MIA蛋白(MW 12-kDa)用作阳性对照(Axxora，LLC，San Diego，CA和ProSpec-Tany TechnoGene，LTD，Rehovot，以色列)。
MIA ELISA测定：将等数的人黑素瘤和结肠癌细胞(每细胞系～250,000个细胞)接种到组织培养皿上，并在48小时后收集每一细胞系的培养基。用商品化的一步ELISA试剂盒根据制造商的方案(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)测定培养基或血浆中MIA的水平。采用3-37ng/mL范围内的标准曲线计算测试样品中的MIA浓度。当MIA浓度超过最高标准浓度，将样品1∶5稀释，并再次测定，以得到落入标准曲线的线性范围内的结果。采用Student t-检验(双尾分布，两样品不同差异)，采用P≤0.05作为显著性水平。
统计分析
线性回归采用Microsoft Excel(Redmond，WA)进行。用Student’s t-检验测定两个治疗组之间的统计显著性。采用单向方差分析法(ANOVA)进行多重比较，采用Student-Newman Keul检验(SigmaStat，San Rafael，CA)进行比较不同处理平均的后检验(post-tests)。对于存活研究，用对数秩检验(log rank test)确定各个治疗组与溶媒组相比的存活曲线之间的显著性(Prism，San Diego，CA)。认为在研究结束被处死时具有正常健康状态的小鼠是长期存活者，并在该分析中被检查。在p＜0.05时，认为差异是统计学显著的。
黑素瘤细胞系的Western分析。将黑素瘤细胞系用冷PBS洗涤，从板上收获，并在4℃在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)和1mM PMSF(Sigma)的RIPA缓冲液(20mM Tris，pH8、135mM NaCl、2mM EDTA pH 8、10％甘油、1％Triton X-100、0.1％SDS、0.1％脱氧胆酸钠)中溶解1小时。将蛋白质溶胞产物在14000rpm离心10分钟，并收集得到的上清液。采用BCA测定法(Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL)测定蛋白质含量。将总蛋白质在NovexTris-Glycine SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上电泳，并将蛋白质转移到0.45μM硝基纤维素膜(Invitrogen)。为了检测FGFR-1、2、3和4的蛋白质水平，将总蛋白质(100μg)在Novex Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上电泳，并将蛋白转移至0.45μM硝基纤维素膜(Invitrogen)。在4℃将膜在含有5％脱脂奶粉的TBS-T(0.1％吐温20)(封闭缓冲液)中封闭最少1小时，然后用第一抗体在封闭缓冲液(总蛋白)或过滤的含有5％BSA的TBS-T(磷蛋白)中孵育3-4小时或过夜。将封闭缓冲液中的二次抗-小鼠或抗-兔在室温孵育1小时。将膜用TBS-T(0.1％吐温20)洗涤3×15分钟，然后在暴露于柯达胶卷后用ECL western检测(Amersham Biosciences)。Western分析采用对FGFR-1(Novus Biologicals ab10646)、FGFR-2(NovusBiologicals ab5476)、FGFR3(Novus Biologicals ab10649)和FGFR-4(SantaCruz C-16)特异的抗体进行。
产克隆试验(Clonogenic assays)：产克隆存活试验在24-孔板中采用改良的两层软琼脂试验进行。简单来讲，底层由补加有20％胎牛血清、0.01％w/v庆大霉素和0.75％琼脂的0.2mL/孔的Iscoves改良的Dulbecco培养基(Invitrogen)组成。将人黑素瘤细胞系进行连续传代繁殖，作为在NMRInu/nu小鼠皮肤下生长的实体人肿瘤异种移植物。通过机械解聚作用产生单细胞悬浮液，然后用由在RPMI 1640-培养基(Invitrogen)中的IV型胶原酶(41U/mL，Sigma)、DNA酶I(125U/mL，Roche)和III型玻璃酸酶(100U/mL，Sigma)组成的酶消化液在37℃孵育30分钟。使细胞通过200μm和50μm筛孔的筛子，并用无菌的PBS洗涤两次。将细胞(1.5×104-6×104)各自地接种在补加有0.4％琼脂的培养基中，并且铺在基底层上并暴露于各种浓度的化合物1，然后在37℃和7.5％二氧化碳下、在潮湿气氛下孵育8-20天。用显微镜监测细胞的群体(colony)生长(直径＞50μm)。在最大群体形成时，用自动图像分析系统(OMNICON 3600，Biosys GmbH)进行计数。
药物效应以群体形成的百分数表示，所述百分数通过比较处理孔中的群体平均数和未处理的对照的平均群体数得到(相对群体数以测试/对照标绘，即以T/C-值[％]标绘)。EC50-、EC70-和EC90-值分别为抑制50％、70％和90％群体形成所需的药物浓度。作为每一实验的阳性对照，使用1000μg/mL浓度的5-FU(Medac)以实现对照的＜30％的群体存活。
体内FGF-介导的基质胶(matrigel)血管发生试验。简单来讲，将0.5mL基质胶(Becton Dickinson，Bedford，MA)和牛2ug bFGF(ChironCorporation；Emeryville，CA)的混合物皮下植入雌性BDF1小鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)中。在植入基质胶后，每天口服施用溶媒或化合物1，施用8天。将基质胶塞(plugs)从动物中移出后通过测量其中的血红蛋白水平，对血管形成进行定量。通过Drabkin方法(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)根据制造商的指示测量血红蛋白含量。
动物：将从Charles River Laboratories，Inc.(Wilmington，MA)获得的免疫缺陷Nu/Nu雌性小鼠(4-8周龄)笼养在具有12小时明/暗循环的无菌滤盖饲养笼中的隔离设施中，并喂给随意可得的无菌啮齿动物食物和水。一旦到来便给小鼠植入皮肤ID芯片，然后在研究开始前，经过至少7天以适应环境。所有的动物研究在被国际实验动物评估认证管理委员会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal CareInternational)所认可的设施中进行，并符合动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的所有准则和实验动物管理和使用指南(Guide for The Care and Use of Laboratory Animals)(NationalResearch Council)。
用于体内效力研究的细胞培养：将人黑素瘤细胞系A375M在含有10％FBS、1％维生素、非必需氨基酸(NEAAs)和丙酮酸钠的EMEM培养基中在37℃、含有5％CO2的潮湿气氛下培养6代。将人黑素瘤细胞系CHL-1在含有少的谷氨酰胺+10％FBS的DMEM培养基中在37℃、含有5％CO2的潮湿气氛下培养6代。
单一药物化合物1在A375(突变型B-Raf)和CHL-1(野生型B-Raf)模型中的体内效力：在肿瘤细胞植入日，收获肿瘤细胞并以2.5×107个细胞/mL重悬于HBSS(A375细胞)或50％HBSS+50％基质胶(CHL-1细胞；Becton Dickenson and Company，Franklin Lakes，NJ)。将细胞以5×106个细胞/200uL/小鼠皮下接种在右胁。
当平均肿瘤体积达到～200mm3(细胞接种后12-15天)时，根据肿瘤体积将小鼠随机分进9或10的组中，并每天以10、30、60或80mg/kg口服给药溶媒或化合物。组的大小为每组9只动物(A375研究)或每组10只动物(CHL-1研究)。将化合物1(批次41)配制在5mM柠檬酸盐中。采用StudyDirector 1.4软件(Studylog Systems，Inc.，So.San Francisco，CA)对肿瘤体积和体重每周评估2-3次。采用式：1/2[长(mm)×宽(mm)]2)将肿瘤的测径器测量值转化为平均肿瘤体积(mm3)。肿瘤生长抑制(TGI)用[1-T/C]×100％计算，其中T＝测试组的平均肿瘤体积，且C＝对照组的平均肿瘤体积(单一药物研究)。采用Student’s双尾t-检验(Excel软件)评价治疗组中的平均肿瘤体积与溶媒组中的平均肿瘤体积的比较。
在CHL-1研究中，还测定了由黑素瘤细胞分泌的黑素瘤标志物黑素瘤抑制活性(MIA)蛋白的血浆水平。
化合物1+卡铂+紫杉醇组合的体内效力研究：将3×106个A375M或CHL-1细胞(5×106个细胞和50％基质胶/0.1mL/小鼠)皮下接种至雌性nu/nu小鼠(6-8周龄)的右胁。当平均肿瘤体积为200-250mm3(研究的第0天；n＝10小鼠/组)进行治疗。治疗由以下组成：药物溶媒单独，每天(qd)；卡铂(50mg/kg)+紫杉醇(20或25mg/kg；1×/周×4周)；化合物1(30或50mg/kg)；每天给药进行4周，或化合物1和卡铂+紫杉醇联合治疗(以指明的剂量；第1天)。
采用Study Director 1.4软件(Studylog Systems，Inc.，So.SanFrancisco，CA)每周对肿瘤体积和体重评价2-3次。采用式：1/2[长(mm)×宽(mm)]2)将肿瘤的测径器测量值转化为平均肿瘤体积(mm3)。肿瘤生长抑制(TGI)如下计算：[1-{(治疗组的平均肿瘤体积-随机选择的肿瘤体积)/对照组的平均肿瘤体积-随机选择的肿瘤体积}×100。当溶媒的平均肿瘤体积是～1500-2000mm3时，计算TGI。通过与治疗初始时每一动物的肿瘤体积相比，将响应定义为完全响应(CR，没有可测量的肿瘤)或部分响应(PR，50-99％肿瘤体积减小)。
当联合治疗的预期的％肿瘤生长抑制[(％T/C预期＝％T/C治疗1×％T/C治疗2)除以联合治疗的观察到的％T/C(％T/C观察)]的比率＞1时，定义为协同作用。当％T/C预期/％T/C观察＝1时，定义为相加作用，当％T/C预 期/％T/C观察＜1(39)，为拮抗作用。
FGF-R细胞捕获ELISA测定：第1天。细胞接种：将HEK293细胞用胰蛋白酶消化，采用CASY计数器(
System)计数，并以104个细胞/孔铺在96孔板(TPP#92096)中的100μL DMEM 4.5g/L葡萄糖、10％FBS、1％L-谷氨酰胺中。将细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时。
第1天。细胞转染和测试板的涂覆：采用Fugene-6-试剂(Roche#11814443001)如下将HEK293细胞用pcDNA3.1-FGF-R1、pcDNA3.1-FGF-R2、pcDNA3.1-FGF-R3、pcDNA3.1-FGF-R4或pcDNA3.1载体转染。首先将Fugene-6-试剂(0.15μL/孔)与Optimem I(Gibco#31985-047)(5μL/孔)混合，然后加入载体DNA(0.05μg/孔)。将该混合物在室温孵育15min。随后将5.2μL该混合物加至细胞上。将细胞在37℃、5％CO2下孵育24h。将FluoroNunc 96-孔板(Maxisorp black F96，Nunc#437111A)用2μg/mLα-FGF-R1 AB(R&D Systems#MAB766)、α-FGF-R2AB(R&D Systems#MAB665)、α-FGF-R3 AB(R&D Systems#MAB766)或α-FGF-R4 AB(R&D Systems#MAB685)AB涂覆。将该FluoroNunc板在4℃孵育过夜。
第3天。化合物稀释、细胞处理和细胞处置：将FluoroNunc涂覆的板用200μL含有0.05％
20(Sigma#P-1379)的PBS/0洗涤3次，并在室温下用200μL/孔的含有0.05％
20、3％Top Block(VWR-International#232010)的PBS/0封闭2h。随后将板用200μL含有0.05％
20的PBS/0洗涤3次。化合物(10mM的储备液)的系列稀释首先在DMSO(Serva#20385)中进行。最终的稀释步骤在生长培养基中进行，以在细胞中达到0.2％DMSO。将11.5μL的每一稀释液一式三份地加至细胞。处理在37℃进行40min。将细胞在100μL/孔的ELISA溶胞缓冲液(50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM EGTA、5mM EDTA、1％Triton、2mM钒酸钠、1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物Roche#11873580001)中溶解，并将50μL细胞溶胞产物转移至FluoroNunc涂覆的板。然后将涂覆的板在4℃孵育5h。将板用含有0.05％
20的200μL/孔的PBS/O洗涤3次。以50μL/孔加入α-pTyr-AP AB(Zymed PY20#03-7722)(1∶10’000在0.3％TopBlock/PBS/0.05％
20中)。将板在4℃孵育过夜，用ThermowellTM密封器密封。
第4天。显示测定结果：将FluoroNunc板用200μL含有0.05％
20的PBS/0洗涤3次，并用H2O洗涤1次。将90μL CDP-Star(Applied Biosystems#MS1000RY)加到每孔中。将板在暗处、室温下孵育45min，然后用TOP Count NXT光度计(Packard Bioscience)测量发光。
结果
化合物1证明可有效抑制FGFR激酶活性
采用如上所述的使用纯化的酶的ATP-竞争结合测定法，针对不同组的RTKs测试化合物1的特异性。发现化合物1对许多激酶是高效力的，所述激酶包括以纳摩尔活性对抗的FLT3(1nM)、c-KIT(2nM)、VEGFR1/2/3(10nM)；FGFR1/3(8nM)；PDGFRβ(27nM)和CSF-1R(36nM)(见表1A)。为确定对III、IV和V类RTKs的选择性，针对在PI3K/Akt和MAPK(K)通路中的其它激酶测试化合物1，发现其具有可忽略的活性(IC50＞10μM)(见表1A)。
表1A.4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮对各种RTKs的活性
| RTK | IC50(μM) |
| FLT3 | 0.001 |
| c-KIT | 0.002 |
| CSF-1R | 0.036 |
| FGFR1 | 0.008 |
| FGFR2 | 0.05 |
| FGFR3 | 0.009 |
| FGFR4 | 3 |
| VEGFR1/Flt1 | 0.01 |
| VEGFR2/Flk1 | 0.013 |
| VEGFR3/Flt4 | 0.008 |
| PDGFRβ | 0.027 |
| PDGFRα | 0.21 |
| TIE2 | 4 |
采用如上所述的方法，就化合物2和3测定多种蛋白酪氨酸激酶的激酶活性，提供显示在表1B中的IC50值。
表1B.化合物2-3的IC50值
FGFR1-4在人黑素瘤细胞中的表达。在一组人原发性黑素瘤肿瘤外植体(Oncotest瘤：1341/3、1765/3、276/7、462/6、514/12、672/3、989/7)和细胞系(CHL-1、HMCB、SK-Mel-2、A375M、G361、SK-Mel-28、SK-Mel-31)中检测FGFR1-4的蛋白质水平，通过Western分析描绘四种FGF受体的相对表达(图1)。采用来自表达各种FGFR的短暂表达的FGFR+293T细胞的蛋白溶胞产物确定对各种FGFR的抗体特异性(数据未显示)。
如图1所示，所有的黑素瘤细胞在细胞中表达不同模式的FGFR。在黑素瘤细胞中发现可察觉水平的FGFR1(除了SK-Mel-28)、FGFR2(除了MEXF 462)、FGFR3(除了G361)。FGFR4表达稍微更加不一致，FGFR4在CHL-1、HMCB、A375M、G361中高水平表达，在276/7、514/12、672/3、989/7中以中等水平表达、在SK-Mel-2、462/6、1765/3中低水平表达，并且在SK-Mel-28、SK-Mel-31和1341/3中具有不可检测的水平。
化合物1对抗黑素瘤细胞的体外产克隆评价。我们评价了对抗七种体外的原发性黑素瘤外植体(1341/3、1765/3、276/7、462/6、514/12、672/3、989/7)的化合物1软琼脂产克隆活性。在这些实验中，将肿瘤细胞暴露于0.001nM-10uM浓度范围内的各种浓度的化合物1下。药物响应由相对EC50值评价(见表2)。对化合物1的一般响应为以下顺序：1765/3(2.58uM)＞989/7(2.54uM)＞1341/3(2.24uM)＞672/3(1.67uM)＞276/7(1.14uM)＞514/12(1.05uM)＞462/6(0.70uM)。
表2化合物1对抗黑素瘤肿瘤细胞的产克隆评价
| MEXF | IC50 |
| 1765/3 | 2.58 |
| 989/7 | 2.54 |
| 1341/3 | 2.24 |
| 672/3 | 1.67 |
| 276/7 | 1.14 |
| 514/12 | 1.05 |
| 462/6 | 0.70 |
化合物1抑制FGF-介导的体内血管发生：为了确定化合物1在体内是否能够抑制bFGF-介导的血管发生，在bFGF-驱动的基质胶植入体模型中评价其作用。在只具有基质胶(没有bFGF增补物)情况下，观察到边缘新血管形成，但是在皮下基质胶植入体中加入bFGF导致显著诱导新血管形成，所述新血管形成通过量化基质胶塞中的血红蛋白水平确定(图2)。以3-100mg/kg的剂量每天用化合物1治疗，治疗8天，导致bFGF-驱动的新血管形成的剂量依赖性抑制(3mg/kg的IC50)。与溶媒相比，所有剂量导致统计学上的显著减少(p＜0.05)。有意思的是，所有＞10mg/kg的剂量小于在未加入基质胶植入体情况下观察到的基础血红蛋白水平，清楚地表明化合物1在体内有效地抑制bFGF-驱动的血管发生。
化合物1抗肿瘤效力研究：单一药物化合物1活性或与卡铂+紫杉醇组合在两种黑素瘤肿瘤模型中进行基准测试(benchmark)，所述肿瘤模型具有类似的FGFR表达特征，但它们的B-Raf突变状态不同(A375M B-Raf突变型和CHL-1B-Raf野生型)。
化合物1作为单一药物在A375黑素瘤模型中的活性：化合物1在Nu/Nu小鼠中的人黑素瘤A375M皮下异种移植物模型中显著地抑制肿瘤生长。原发性肿瘤生长的分析显示在图3中。在给药的第3、5、21和25天，与溶媒组比较，80mg/kg组中的平均肿瘤生长显著不同。肿瘤生长抑制(TGI)的百分数是基于第25天的肿瘤体积的。以10、30、60和80mg/kg口服给药化合物1分别导致28％、45％、58％和69％TGI。在任何组中没有观察到显著体重减轻(体重减轻不超过～5％)或者其它临床毒性症状。
化合物1作为单一药物在CHL-1黑素瘤模型中的活性：化合物1在Nu/Nu小鼠中的人黑素瘤CHL-1皮下异种移植物模型中显著地抑制肿瘤生长。原发性肿瘤生长的分析显示在图4中。从给药的第8-25天，30、60和80mg/kg组中的平均肿瘤生长与溶媒组相比显著不同。TGI的百分数基于第25天的肿瘤体积。以10、30、60和80mpk口服给药化合物1分别导致64％、73％、89％和87％TGI。在任何组中没有观察到显著体重减轻(体重减轻不超过～5％)或者其它临床毒性症状。
在第0、8和22天在溶媒、30mg/kg和80mg/kg组中评价血浆MIA水平(数据未显示)。在第0天在所有组中MIA水平等于或低于检测阈值。到第8天，溶媒组中的MIA水平升至7.7ng/mL，而在治疗组中的MIA水平是不能检测到的。在第22天，相对于溶媒组，肿瘤体积和MIA水平也是低的。总的来讲，血浆MIA水平在第8和22天时在治疗动物中是低的(即检测不到)，血浆MIA水平在溶媒对照中是较高的。
化合物1与卡铂+紫杉醇组合的活性：在A375M黑素瘤模型中，每天单独给药化合物1产生与溶媒处理在统计学上不同的显著肿瘤生长抑制(74％TGI，p＜0.05)。每周给药的卡铂(50mg/kg)和紫杉醇(20mg/kg)产生约45％的TGI(图5和表3)。化合物1和卡铂+紫杉醇的联合治疗增强抗肿瘤活性(94％TGI，与溶媒比，p＜0.001)，在该治疗组中观察到1/10部分响应，并且上述联合治疗优于单一疗法。化合物1(50mg/kg)与卡铂+紫杉醇的联合治疗被很好地耐受，在单一药物和联合组中观察到＜5％体重减轻(BWL)，并分析为相加响应(见表2/3，即预期的/观察的(E/O)～1)
表3联合治疗中的化合物1在A375M黑素瘤模型中的活性
| 处理，n＝10/组 | 平均TV，第25天 | ％TGI，第25天 | 相对于溶媒的P值；第25天 | PR/CR | ％平均BW变化，与初始相比 | 临床观察 | ％T/C观察的(O) | T/C预期的(E) | 比例(E/O) |
| 溶媒 | 759 | 0％ | BAR | ||||||
| 化合物150mg/kg，每天 | 315 | 75％ | ＜.01 | 0％ | BAR | 0.42 | |||
| 卡铂 | 494 | 45％ | ＞.05 | 1％ | BAR | 0.65 |
| 50mg/kg+紫杉醇20mg/kg，1×/周 | |||||||||
| TK125850mg/kg+卡铂+紫杉醇 | 203 | 94％ | ＜.001 | 1PR | -5％ | 第25天1只小鼠BWL＞15％ | 0.27 | 0.27 | 1.01 |
肿瘤生长抑制(TGI)＝[1-{(治疗组的平均肿瘤体积TV-随机选择的肿瘤体积)/(对照组的平均肿瘤体积-随机选择的肿瘤体积)}×100]；BAR＝明亮、警觉、响应的；BWL＝体重减轻；统计检验＝关于Ranks/Dunn’s的Kruskal-Wallis单向方差分析；响应＝CR(完全响应，没有可测量的肿瘤)或PR(部分响应，与每一动物在治疗开始时的肿瘤体积相比50-99％肿瘤体积减小)，相加响应＝1.0的E/O比例。
和卡铂+紫杉醇的联合治疗还在CHL-1模型中进行评价。如图6和表4中所见，与单一药物相比，每天给药化合物1(30mg/kg)+每周给药卡铂(50mg/kg)+紫杉醇(25mg/kg)使肿瘤抑制显著增强(84％TGI)。化合物1和卡铂+紫杉醇的联合治疗被很好地耐受，并显著不同于卡铂+紫杉醇(p＜.05，ANOVA/Dunn’s)，但单独的化合物1(30mg/kg，每天)却不(p＜.05，t-检验)。但是，在更详细的药物响应分析中，观察到用化合物1+卡铂+紫杉醇在CHL-1黑素瘤模型中超过相加响应(E/O＞1)(暗示有协同作用)。
表4.化合物1和/或卡铂+紫杉醇的组合对抗雌性Nu/Nu小鼠中的BRaf WT CHL-1黑素瘤肿瘤
| 处理(n＝10/组) | 第14天的平均Tv | 最大％TGI；第14天 | 相对于溶媒的TGI的p值；第14天 | 与初始相比的BW％平均变化 | 临床观察 | T/C观察的(O) | T/C预期的(E) | 比例(E/O) |
| 溶媒 | 1567 | 8.1％ | ||||||
| 卡铂50mg/kg+紫杉醇25mg/kg，1×/周 | 1693 | -9.65％ | ＞.05 | 2.4％ | BAR | 1.08 | ||
| 化合物130mg/kg，每天 | 884 | 52.51％ | ＞.05 | 4.3％ | BAR | 0.56 | ||
| 化合物130mg/kg+卡铂+紫杉醇 | 476 | 83.79％ | ＞.05 | 3.5％ | 1BWL＞15％ | .030 | 0.61 | 2.00 |
肿瘤生长抑制(TGI)＝[1-{(治疗组的平均肿瘤体积TV-随机选择的肿瘤体积)/对照组的平均肿瘤体积-随机选择的肿瘤体积}×100]；BAR＝明亮、警觉、响应的；BWL＝体重减轻；关于Ranks/Dunn’s的Kruskal-Wallis单向ANOVA；E/O＝1(相加响应)。E/O＞1(协同)
FGF-R细胞捕获ELISA测定：如下面表5中所示，化合物1抑制FGF受体以及其它酪氨酸激酶的细胞磷酸化。
表5.化合物1抑制RTK靶点的细胞磷酸化
| 靶点 | 细胞系 | TKI258nM IC50 |
| FGFR1 | 转染的HEK293 | 166 |
| FGFR2 | 转染的HEK293 | 78 |
| FGFR3K650E＊ | 转染的HEK293 | 55 |
| FGFR4 | 转染的HEK293 | 1915 |
| FLT3 | RS4；11AML | 500 |
| FLT3-ITD | MV4；11AML | 1-5 |
| VEGFR1 | KM12L4a结肠 | ＜50 |
| VEGFR2 | HMVEC | ＜10 |
| PDGFRb | KM12L4a结肠 | ＜50 |
＊FGFR3K650E是在一亚群的多发性骨髓瘤患者中可见的激活突变。
其它结构I化合物例如结构IB和IC化合物如上所述制备。使用这些化合物的研究可以采用上面对化合物1所述的方法进行。这些研究将表明这些化合物也可用于在小鼠、人和其它哺乳动物个体中治疗黑素瘤。
所有的出版物、专利申请、授权的专利和在本说明书中提及的其它文献在此引入本文作为参考，就如每一单独的出版物、专利申请、授权的专利或其它文献以其整体特别地和独立地引入作为参考。将包含在引入作为参考的文本中的与本公开内容相矛盾的定义排除在外。
应当理解，本发明不限于本文用于举例说明的实施方案，但包括其在本文件范围内的所有的此类形式。
Claims (20)
1.治疗黑素瘤的方法，该方法包括将治疗有效量的结构I化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、互变异构体的药学上可接受的盐或其混合物给药至患有黑素瘤的个体，其中结构I化合物是
其中，
A选自
R1选自H或含有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团。
2.权利要求1的方法，其中R1是甲基基团，且结构I的化合物具有结构IA
3.权利要求1的方法，其中R1是氢，且结构I的化合物具有结构IB
4.权利要求1的方法，其中R1是甲基基团，且结构I的化合物具有结构IC
5.权利要求1的方法，其中将结构I化合物或其互变异构体的乳酸盐给药至个体。
6.权利要求1的方法，其中个体是人。
7.权利要求1的方法，其中黑素瘤已经转移。
8.权利要求1的方法，其中黑素瘤是浅表扩散性黑素瘤、节结性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、雀斑样痣性恶性黑素瘤、或粘膜雀斑样痣性黑素瘤。
9.权利要求1的方法，其中黑素瘤是皮肤的或皮肤外的。
10.权利要求1的方法，其中黑素瘤是眼内的或是软组织的透明细胞肉瘤。
11.权利要求1的方法，其还包括给药一种或多种用于治疗黑素瘤的抗癌药物。
12.权利要求11的方法，其中一种或多种抗癌药物选自烷化抗癌药、亚硝基脲类、紫杉烷类、长春花生物碱类、拓扑异构酶抑制剂、抗癌抗生素和铂抗癌药。
13.权利要求11的方法，其中一种或多种抗癌药物选自达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、伊立替康、沙立度胺、链佐星、放线菌素D、氮芥、顺铂和卡铂、甲磺酸伊马替尼、索拉非尼、舒尼替尼或厄洛替尼。
14.权利要求11的方法，其中一种或多种抗癌药物选自干扰素类和白细胞介素-2。
15.权利要求11的方法，其中一种或多种抗癌药物选自干扰素α-2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化的干扰素α-2b和白细胞介素-2。
16.权利要求1的方法，其中化合物的治疗有效量为约0.25mg/kg至约30mg/kg。
17.权利要求1的方法，其中化合物的治疗有效量为约25mg/天至约1500mg/天。
18.权利要求1的方法，其中化合物的治疗有效量为约100mg/天至约600mg/天。
19.权利要求1的方法，其中黑素瘤表达成纤维细胞生长因子受体1、2、3和/或4。
20.权利要求1的方法，其中黑素瘤表达野生型Raf、突变型Raf、野生型Ras、突变型Ras、野生型c-Kit或突变型c-Kit。
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2008
- 2008-03-07 CN CN200880007797A patent/CN101641097A/zh active Pending
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