KR101319122B1 - 약물 저항성 암을 치료하는 방법 - Google Patents

약물 저항성 암을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료가 필요한, 약물-저항성 암을 갖는 암 환자인 대상체에게 본 명세서에서 정의된 바와 바와 같은 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 약물-저항성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
[화학식 I]
Figure 112007089361312-pct00044
약물-저항성 암, 퀴놀린 벤즈이미다졸릴 화합물, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온, 키나제, 다발성 골수종, 위장관 간질성 종양, 만성 골수성 백혈병, 이마티니브 메실레이트 (글리벡), BAY43-9006, 브로스탈리신.

Description

약물 저항성 암을 치료하는 방법 {METHODS FOR TREATING DRUG RESISTANT CANCER}
본 발명은 일반적으로 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 약물-저항성 암 및 약물 저항성 암이 있는 환자를 치료하기 위한 방법 및 4-아미노-5-플루오로-3-[5-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 화합물과 같은 4-아미노 치환된 퀴놀리논 벤즈이미다졸릴 화합물, 및 이러한 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다양한 화학적 화합물 및 조성물이 하나 또는 그 이상의 혈관 내피 성장인자 수용체 타이로신 키나제 (VEGF-RTK)에 대한 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 그의 예로는 WO 98/13350에 기술된 것과 같은 퀴놀린 유도체, 아미노니코틴아미드 유도체 (참조예: WO 01/55114), 안티센스 화합물 (참조예: WO 01/52904), 펩티도미메틱 (참조예: WO 01/52875), 퀴나졸린 유도체 (참조예: 미국 특허 제 6,258,951 호), 모노클로날 항체 (참조예: EP 1 086 705 A1), 다양한 5,10,15,20-테트라아릴-포르피린 및 5,10,15-트리아릴-코롤 (참조예: WO 00/27379), 헤테로사이클릭 알칸설폰산 및 알칸 카복실산 유도체 (참조예: DE19841985), 옥스인돌릴퀴나졸린 유도체 (참조예: WO 99/10349), 1,4-디아자안트라신 유도체 (참조예: 미국 특허 제 5,763,441 호), 및 신놀린 유도체 (참조예: WO 97/34876), 및 다양한 인다졸 화합물 (참조예: WO 01/02369 및 WO 91/53268)이 포함된다.
4-하이드록시 퀴놀린 및 4-하이드록시 퀴놀린 유도체의 합성은 다수의 문헌들에 개시되어 있다. 예를 들어, 우크라이네트 (Ukrainets) 등은 3-(벤즈이미다졸-2-일)-4-하이드록시-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린의 합성을 개시하였다 (Ukrainets, I. et al., Tetrahedron Lett. 42, 7747-7748 (1995); Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 2, 239-241 (1992)). 우크라이네트는 또한, 1H-2-옥소-3-(2-벤즈이미다졸릴)-4-하이드록시퀴놀린과 같은 다른 4-하이드록시 퀴놀론 및 티오 유사체의 합성, 항경련 및 항갑상선 활성을 개시하였다 (Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsikli-cheskikh Soedinii, 1, 105-108 (1993); Ukrainets, I. et al., Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 8, 1105-1108 (1993); Ukrainets, I. et al., Chem. Heterocyclic Comp. 33, 600-604 (1997)).
다양한 퀴놀린 유도체의 합성은 WO 97/48694에 개시되어 있다. 이들 화합물은 핵 호르몬 수용체에 결합할 수 있으며, 골아세포 증식 및 뼈 성장을 자극하는데 유용한 것으로 개시되어 있다. 화합물은 또한, 핵호르몬 수용체 집단과 연관된 질병의 치료 또는 예방에 유용한 것으로도 개시되어 있다.
퀴놀린의 벤젠 환이 황 기에 의해서 치환된 다양한 퀴놀린 유도체는 WO 92/18483에 기술되어 있다. 이들 화합물은 약제학적 제제에서 유용한 것으로, 및 의약으로서 기술되어 있다.
퀴놀론 및 쿠마린 유도체는 의약 및 약제학적 제제와 관련되지 않은 다양한 적용 분야에서의 용도를 갖는 것으로 개시되었다. 광중합성 조성물에서의 사용 또는 발광 특성을 위한 퀴놀론 유도체의 제조를 기술하는 문헌에는 다음의 문헌들이 포함된다: 오카모토 (Okamoto) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,801,212 호; JP 8-29973; JP7-43896; JP 6-9952; JP 63-258903; EP 797376; 및 DE 23 63 459.
퀴놀리논 벤즈이미다졸릴 화합물 및 4-아미노-5-플루오로-3-[5-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온과 같은 4-아미노 치환된 퀴놀리논 벤즈이미다졸릴 화합물을 포함하는 다수의 치환된 퀴놀리논 화합물이 최근에 WO 02/22598 및 WO 2004/043389와 같은 문헌에 기술되었다. 이러한 화합물들은 VEGF-RTKs를 억제하는 것으로 기술되어 있다. 이러한 화합물은 또한 공개된 미국 특허출원 U.S. 2002/0107392 및 U.S. 2003/0028018, 및 미국 특허 제 6,605,617, 6,774,237 및 6,762,194 호에 기술되어 있다. 벤즈이미다졸릴 퀴놀리논과 관련된 헤테로사이클릭 화합물은 최근에 WO 02/18383, U.S. 2002/0103230 및 미국 특허 제 6,756,383 호에 기술되었다. 그 밖의 다른 이러한 화합물은 세린/트레오닌 키나제 및 타이로신 키나제를 억제하는데 있어서의 이러한 화합물의 신규한 용도와 함께 WO 2004/018419, 및 다음의 각각의 가출원을 우선권으로 주장하는 U.S. 2004/0092535 (2003년 8월 19일에 출원됨)에 기술되어 있다: 2002년 8월 23일에 출원된 미국 가출원 제 60/405,729 호; 2002년 11월 13일에 출원된 미국 가출원 제 60/426,107 호; 2002년 11월 13일에 출원된 미국 가출원 제 60/426,226 호; 2002년 11월 13일에 출원된 미국 가출원 제 60/426,282 호; 2002년 11월 21일에 출원된 미 국 가출원 제 60/428,210 호; 2003년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 제 60/460,327 호; 2003년 4월 3일에 출원된 미국 가출원; 2003년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 제 60/460,493 호; 2003년 6월 16일에 출원된 미국 가출원 제 60/478,916 호; 및 2003년 7월 1일에 출원된 미국 가출원 제 60/484,048 호. 또 다른 화합물, 그들의 합성방법, 그의 락트산 염, 및 그의 용도는 2004년 11월 5일에 출원된 다음의 특허출원들에 개시되어 있다: 미국 특허출원 제 10/983,174 호; 미국 특허출원 제 10/982,757 호; 및 미국 특허출원 제 10/982,5423호. 이 단락에 제시된 각각의 문헌들은 이에 의해서 마치 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 온전히 모든 목적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
암을 치료하는데 유용한 다양한 신규 화합물들이 최근에 발견되었다. 예를 들어, 글리벡 (Gleevec®; 이마티니브 메실레이트)은 최근에 다수의 상이한 암에서 상당한 활성을 나타낸 화합물이다. 글리벡은 2001년 5월에 최초로 만성 골수성 백혈병 (CML)이 있는 환자에게서 이용가능하게 되었다. 노바티스 (Norvatis) 웹사이트에 따르면, 글리벡은 만성 상태의 필라델피아 염색체-양성 (Philadelphia chromosome-positive; Ph+) CML이 있는 새로이 진단된 성인 환자의 치료에 지시된다. 추적은 제한된다. 글리벡은 또한, 인터페론-알파 치료법의 실패 후의 아세포발증, 가속화기, 또는 만성기의 pH+ CML을 갖는 환자의 치료에 대해 지시된다. 글리벡은 또한, 그의 질병이 줄기세포 이식 후에 재발하였거나, 인터페론-알파 치료법에 대해서 저항성인 pH+ 만성기 CML이 있는 소아과 환자의 치료를 위해서 지시된다. 글리벡은 위장관 간질성 종양 (GIST)과 같은 다른 암이 있는 환자에서의 사용 에 대해서 승인되었다. 예를 들어, 2002년 2월 1일에 FDA는 노바티스에게 KIT (CD117) 양성인 수술불가능하고/하거나 전이성인 악성 GIST를 갖는 환자의 치료를 위한 글리벡의 승인을 허가하였다.
암을 치료하는 효능에 대해서 현재 시험 중인 그 밖의 다른 새로운 실험용 약물에는 BAY 43-9006 (소라페니브 (sorafenib)) 및 브로스탈리신 (Brostallicin)이 포함된다. BAY 43-9006은 미국 식품의약국 (FDA)에 의해서 신세포암의 치료를 위한 희귀의약품 상태로 허가되었다. BAY 43-9006은 전이성 신세포암 및 진행된 형태의 신장암의 치료에 대해서 평가되고 있다. 유사한 지정은 유럽의약청 (EMEA)의 희귀의약품 위원회 (COMP)에 의해 유럽 연합 에서 허가되었다. BAY 43-9006은 두 가지 항암활성인 종양세포 증식 및 종양 혈관형성의 억제의 조합에 의해서 종양 성장을 방지하기 위한 신규의 RAF 키나제 및 VEGFR 억제제이다. 브로스탈리신 (PNU-166196)은 현재 유럽 및 미국에서 II상 실험 중에 있는, 디스타마이신 A와 구조적으로 관련된 합성 α-브로모아크릴릭, 2-세대 DNA 마이너 그루브 결합제 (minor groove binder)이다. 이 화합물은 다른 마이너 그루브 결합제의 경우에 비해 전임상 모델에서 광범한 항종양 활성 및 인간 조혈모세포에서 극적으로 감소된 시험관내 골수독성을 나타낸다. 브로스탈리신은 통상적인 항종양제의 세포독성이 영향을 받지 않거나 감소되는 조건 하에 모세포주 (parental line)에서보다 멜파란-저항성 L1210 쥐 백혈병 세포에서 3-배 더 큰 활성을 나타내었다 (각각 IC50= 0.46 및 1.45 ng/㎖).
비록 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 개발에서 상당한 진전이 이루어 졌지만, 암을 치료하는 새로운 방법이 필요하다. 특히, 약물-저항성 암 및 약물-저항성 암을 갖는 환자를 치료하는데 유용한 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 화합물이 필요하다. 또한, 약물-저항성 암을 갖는 환자에게 공지의 항암제와 함께 투여될 수 있는 약제학적 조성물 및 화합물이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 암을 치료하는 방법, 약물-저항성 암을 치료하는 방법, 및 약물-저항성 암을 갖는 환자와 같은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 키트 및치료학적 조성물을 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 약물-저항성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부의 구체예에서, 대상체는 약물-저항성 암을 갖는 암 환자이다. 화학식 I의 화합물은 하기의 구조식을 갖는다:
Figure 112007089361312-pct00001
상기 식에서,
R1, R2, R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있으며, H, Cl, Br, F, I, -OR10 기, -NR11R12 기, 치환되거나 비치환된 일급, 이급 또는 삼급 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 치환되거나 비치환된 알케닐기, 치환되거나 비치환된 알키닐기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴알킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7 및 R8은 동일하거나 상이할 수 있으며, H, Cl, Br, F, I, -OR13 기, -NR14R15 기, -SR16 기, 치환되거나 비치환된 일급, 이급 또는 삼급 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 치환되거나 비치환된 알케닐기, 치환되거나 비치환된 알키닐기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴알킬기, 치환되거나 비치환된 알콕시알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴옥시알킬기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴옥시알킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R10 및 R13은 동일하거나 상이할 수 있으며, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴알킬기, 치환되거나 비치환된 알콕시알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴옥시알킬기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴옥시알킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R11 및 R14는 동일하거나 상이할 수 있으며, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R12 및 R15는 동일하거나 상이할 수 있으며, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R16은 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 이마티니브 메실레이트 (글리벡), BAY 43-9006, 브로스탈리신, 레날리도마이드 (레블리미드 (Revlimid)), 탈리도마이드 (탈로미드 (Thalomid)), 도세탁셀 (탁소테레 (Taxotere)), 에를로티니브 (타르세바 (Tarceva)), 바탈리니브 (PTK-787), VEGF-트랩, 펜레티딘, 보르테조미브, 베바시주마브 (아바스틴 (Avastin)), 퍼투주마브, 및/또는 리툭시마브로부터 선택된 항암 약물, 및 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 화학식 I의 화합물은 상술한 구조 및 변수를 갖는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 키트 및 치료학적 조성물을 제공한다. 키트 및 치료학적 조성물은 항암 약물 및 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 치료학적 조성물은 약물-저항성 암을 갖는 대상체의 치료에 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한 배합제제로서 항암 약물 및 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 화학식 I의 화합물은 상술한 구조 및 변수를 갖는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 대상체에서 키나제를 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 화학식 I의 화합물은 상술한 구조 및 변수를 가지며, 대상체는 암 환자이고, 키나제는 돌여변이체 게이트키퍼 잔기 (mutant gatekeeper residue)를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적, 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 KMS-11-luc 세포를 정맥내 주사한 후에 IVIS 영상시스템 (IVIS Imaging System) (Xenogen)을 사용하여 수득한 SCID-베이지 마우스의 전신 생물발광 영상 (BLI)을 나타내는 주사된 영상이다.
도 2는 KMS-11-luc 세포를 주사하고, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페 라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (20 ㎎/㎏/d)로 처리한 SCID-베이지 마우스가 비히클로 처리된 경우보다 현저하게 더 낮은 평균 광자수를 나타내었음을 보여주는 그래프이다.
도 3은 KMS-11-luc 세포의 정맥내 주사 후에 IVIS 영상시스템 (Xenogen)을 사용하여 수득한 SCID-베이지 마우스의 전신 BLIs의 주사된 영상이다. 왼쪽의 BLIs는 비히클로 처리된 마우스의 것이고, 오른쪽의 BLIs는 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물, 20 ㎎/㎏/d)로 처리한 마우스의 것이다.
도 4는 KMS-11-luc 세포를 정맥내 주사한 다음에, 비히클 (마름모꼴) 또는 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (삼각형, 20 ㎎/㎏/d)으로 처리한 SCID-베이지 마우스의 생존율을 비교한 그래프이다.
도 5-7은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)이 FLT3 표적 발현을 변조시키며, MV4;11 및 RS4;11 세포에 대한 항증식 효과를 나타내는 것을 보여주는 그래프이다. 도 5에서는, MV4;11 (▲) 또는 RS4;11 (FLT3 리간드의 존재 하) (■)을 화합물 1의 계열 희석액과 배양하였다. 세포 생존도는 72 시간의 배양기간 후의 MTS 시험에 의해서 입증되었다. EC50은 비선형 회귀를 사용하여 계산하였다. 도 6에서 혈청-기아 MV4;11 (ITD) 또는 도 7에서의 RS4;11 (WT) 세포를 세포 용해시키기 전에 3 시간 동안 증가 농도의 화합물 1과 배양하였다. RS4;11 세포를 지시된 바와 같이 FLT3 리간드 (100 ng/㎖)로 15 분 동안 자극하였다. 전세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해서 분해된 항-인간 FLT3 항체로 면역침강시켰다. 면역블럿을 항-포스포타이로신 항체로 탐침하였다 (상부 레인). 막을 스트리핑하고, 항-FLT3으로 재탐침하여 FLT3의 동등한 부하를 입증하였다 (하부 레인). FLT3의 변화는 밀도측정법 (densitometry)을 사용하여 기준선 (처리 없음)의 퍼센트로서 보고된다.
도 8 및 9는 MV4;11 세포에서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)에 의한 FLT3-매개된 ERK 및 STAT5 포스포릴화의 용량-의존적 억제를 나타내는 그래프이다. MV4;11 세포 (혈청-기아)를 다양한 농도의 화합물 1과 함께 3 시간 동안 배양하고, 세포내 pERK (도 8)는 웨스턴 블럿에 의해서 검출하였으며, pSTAT5 (도 9)는 유동세포분석을 사용하여 측정하였다. pERK 또는 pSTAT5의 변화는 밀도측정법을 사용하여 기준선 (처리 없음)의 퍼센트로서 보고된다.
도 10은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)이 시험관내에서 MV4;11에 의한 오토크린 (autocrine) VEGF 생산을 억제하는 것을 보여주는 그래프이다. 10％ FBS를 함유하는 배지 내에서 배양된 MV4;11 AML 세포를 0.001, 0.01, 0.1, 0.5 및 1 μM 화합물 1의 존재 또는 부재하에서 48 시간 동안 배양하였다. 상등액을 인간 VEGF 수준 (세포성 단백질 함량에 대해서 표준화됨)에 대해서 분석하였다.
도 11은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸- 2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)이 SCID-NOD 마우스에서의 종양 이종이식편에서 FLT3 및 STAT5 포스포릴화를 억제하는 것을 보여주는 그래프이다. s.c. MV4;11 종양 (300 ㎣; n= 3 마우스/군)을 보유하는 SCID-NOD 마우스를 비히클 또는 10 ㎎/㎏ 화합물 1로 5일 동안 처리하였다. 종양을 제5일에 투약-후 4, 8, 24 및 48 시간에 절제하여, 분말화하고 즉시 순간 동결시켰다 (-70℃). pFLT3 또는 pSTAT5 변조를 위해서는 종양 용해물을 SDS-PAGE에 의해서 분해된 항-인간 FLT3 또는 항-STAT5 항체로 면역침강시켰다. 면역블럿을 적절한 항-포스포타이로신 항체로 탐침하였다 (상부 레인). 막을 스트리핑하고, 부하 대조물로서 총 FLT3 또는 STAT5 단백질의 측정을 위해서 항-FLT3 또는 항-STAT5로 재탐침하였다 (하부 레인). 각각의 레인은 별개의 종양을 나타낸다.
도 12-16은 SCID-NOD 마우스 내의 인간 MV4;11 또는 RS4;11 백혈병성 종양의 피하 이종이식 모델에서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)의 항종양 활성을 나타내는 그래프이다. (도 12) MV4;11 또는 (도 13) RS4;11 세포를 SCID-NOD 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다 (n= 10 마우스/군). MV4;11 시험에서는 종양이 ~300 ㎣였을 때에 비히클 (◇), 또는 1 (●), 5 (▲) 또는 30 (■) ㎎/㎏의 용량의 화합물 1을 15일 동안 경구적으로 투여하였다. RS4;11 시험에서는 종양이 ~300 ㎣였을 때에 비히클 (◇), 또는 10 (▲), 30 (■), 100 (◆) 또는 150 (●) ㎎/㎏의 용량의 화합물 1을 8일 동안 경구적으로 투여하였다. (도 14) MV4;11 종양의 효능에 대한 화합물 1의 매일, 간헐적 및 주기적 투약 레지멘의 효과. 화합물 1은 30 ㎎/㎏의 용량으로 매 일 (■), 격일/q.o.d.로 (●) 또는 7일 투약/7일 중지의 주기적으로 (×) 경구 투여하였다. (도 15) 화합물 1은 큰 MV4;11 종양의 퇴행을 유도한다. MV4;11 s.c. 종양 (n= 10 마우스/군)은 300 (▲), 500 (■) 또는 1000 (●) ㎣의 단계가 되었다. 비히클 (◆)-처리된 종양은 2000 ㎣의 최대 종양 부피 (도 16에서는 단지 1000 ㎣으로 나타냄)으로 측정되었다. 화합물 1은 30 ㎎/㎏/d로 경구 투여되었다 (제 1 주기). 투약은 50일 후에 중지되었으며, 그 후에는 반응의 지속성을 모니터하였다. (도 16) 30 ㎎/㎏/d×50일로 전처리한 후에 MV4;11 종양이 재발한 것을 30 ㎎/㎏/d로 재-처리하였다 (제 2 주기). 패널 AD, 데이타는 평균 종양 부피±SE로 표현된다 (n= 10 마우스/군). 패널 E는 각각의 마우스의 종양 부피를 나타낸다 (n= 10).
도 17-19는 30 ㎎/㎏의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)으로 처리된 SCID-NOD 마우스에서 MV4;11 또는 RS4;11 종양의 종양 세포소멸/괴사 및 세포 증식의 억제를 나타내는 그래프이다. (도 17) 30 ㎎/㎏의 화합물 1 처리에 의한 조기 MV4;11 종양 반응. s.c. MV4;11 종양을 갖는 SCID-NOD 마우스 (n= 3-5/군)를 비히클 (a-e) 또는 화합물 1 30 ㎎/㎏/d으로 5일 동안 (f-j) 처리하였다. 종양을 제 2-5일에 절제하였다. 파라핀-포매된 종양을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하거나 (a, f-제1일), Ki67 (b, g-제5일), pERK (c, h-제5일), 절단된 카스파제-3 (d, i-제5일) 또는 PARP로 면역염색하였다 (헤마톡실린 대비염색에 의함). 도 17은 n= 3 개의 개별적으로 처리된 종양으로부터의 대표적인 절편을 나타낸 것이다. (도 18) 30 ㎎/㎏ 화합물 1 처리에 의한 처리 후의 RS4;11 종양의 면역조직화학. RS4;11 종양 (n= 3-5/군)을 비히클 (a-c) 또는 화합물 1 30 ㎎/㎏/d (d-f)로 처리하였다. 종양은 제9일에 절제하였다. 파라핀-포매된 종양을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하거나 (a, d), Ki67 (b, e), 또는 pERK (c, f)로 면역염색하였다. 도 18은 n= 3 개의 개별적으로 처리된 종양으로부터의 대표적인 절편을 나타낸 것이다. (도 19) MV4;11 종양을 갖는 SCID-NOD 마우스 (n= 3-5/군)을 비히클 또는 화합물 1 30 ㎎/㎏/d로 처리하였다. 비히클-처리된 종양은 제15일에 절제하고, 화합물 1-처리된 종양은 제89일 (화합물 1의 1일 용량 50일+39일 무처리)에 절제하였다. 파라핀-포매된 종양을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하거나, 또는 Ki67로 면역염색하였다 (헤마톡실린 대비염색에 의함). (a) 비히클 (H＆E, 제15일); (b) 비히클 (Ki67, 제15일); (c) 화합물 1, 부분적 반응 (H＆E, 제89일); (d) 화합물 1, 부분적 반응 (Ki67, 제89일), 및 (e) 화합물 1, 완전 반응 (H＆E, 제89일). c, d에서의 화살표는 괴사성/반흔 조직에 분산된 생존 세포의 영역을 가리킨다. 도 19는 n= 3 개의 처리된 종양으로부터의 대표적인 절편을 나타낸 것이다. 채택된 영상의 배율은 도면 상에 나타낸다.
도 20 및 21은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)이 정맥내 MV4;11 세포를 갖는 SCID-NOD 마우스의 생존을 연장시키는 것을 보여주는 그래프이다. 방사선조사된 SCID-NOD 마우스에게 MV4;11 (1×107 세포, i.v.)을 정맥내로 이식하였다. 처리는 제23일에 시작하였으며, 제 23-98일 동안 경구적인 비히클 (◆) 또는 20 ㎎/㎏를 매일 투여하거나 (▲) 7일 투약/7일 중지 (■)하는 것으로 계획된 화합물 1로 구성된다. 뒷다리 마비 또는 열등한 건강상태의 조기 징후를 야기한 마우스는 안락사시켰다. 도 20은 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존율 대 시간 플롯 (n= 10-12 마우스/군)을 나타낸 것이다. (도 21) MV4;11 세포의 i.v. 접종 후의 BM의 유동세포분석 또는 조직병리학적 평가. 대퇴골은 제51일 (a-d) 또는 제167일 (e, f)에 수집하였으며, BM을 분리하고 유동세포분석을 사용하여 인간 MV4;11 세포의 ％에 대해서 분석하였다 (a, d). BM 세포는 항-인간 HLAA, B,C-FITC (인간 MHC-I 상의 에피토프를 염색. 직선) 또는 아이소타입-대조 항체 (점선)로 염색하였다. 이식된 세포의 퍼센트는 적절한 게이팅 (gating), 및 항-인간 HLA-A,B,C (마커)에 대한 양성 염색 후에 확인되었다. 비히클-처리 (제51일)되거나 화합물 1-처리된 (제167일) 마우스의 BM 시험편은 H＆E로 조직화학적으로 염색하거나 (b, e), 마우스 BM에서 인간 MV4;11 세포를 염색하는 항-인간 미토콘드리아 항체 (c, f)로 면역염색하였다. 배율은 400×이고; 화살표는 확인된 MV4;11 세포를 지시한다 (b, c).
도 22는 본 발명의 화합물이 클래스 III, IV 및 V 수용체 타이로신 키나제를 어떻게 선택적으로 억제하는지를 보여주는 도식이다 (참조: 또한 다양한 RTKs에 대한 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 활성에 대한 표).
도 23a 및 23b는 비히클 및 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온에 의한 처리의 일수의 함수로서 종양 부피를 도시한 그래프이다. 이들 그래프는 화합물 1에 의한 처리가 크고 정착된 결장 이종이식편을 갖는 동물의 90-100％에서 퇴행 및 질병 안정화를 야기하였음을 보여준다 (누드 마우스에서 KM12L4A 인간 결장 종양 이종이식편에 대해서는 종양이 500 ㎣ (23a) 또는 1000 ㎣ (23b)에 도달하였을 때에 화합물 1을 매일 투여하였다).
도 24는 화합물 1 (CHIR258)로 처리한 이마티니브-무반응성 GIST를 갖는 인간 여성 환자의 주사된 PET-CT 영상이다.
도 25a 및 25b는 화합물 1이 투여된 경우에 혈장 노출이 비례적으로 증가하는 것을 보여주는 용량 대비 평균 Cmax (ng/㎖) 및 평균 AUC (0, tlast (ng*h/㎖))의 그래프이다.
도 26은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온이 말초혈액 백혈구 (PBL)에서 기초적 ERK 포스포릴화를 억제하는 것을 보여주는 웨스턴 블럿의 주사된 영상이다. 양성 대조 샘플은 임상적 샘플과 동일하게 처리된 정상 공여체로부터의 혈액 세포였다.
본 발명은 암을 치료하는 방법, 약물-저항성 암을 치료하는 방법, 및 약물-저항성 암을 갖는 환자와 같은 대상체에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 키트 및 치료학적 조성물을 제공한다. 화합물은 수용체 타이로신 키나제의 길항제로서, 더욱 특히는 PDGFRα 및 PDGFRβ, bFGF 및/또는 VEGF-RTK 기능의 억제제로서 작용한다. 이러한 화합물은 또한, 다른 타이로신 키나제에 관해서, 및 다양한 세린/트레오닌 키나제에 관해서 강력한 활성을 갖는다. 본 발명에서 제공된 화합물은 예를 들어, VEGF-RTK의 억제제에 대한 필요가 있는 환자를 치료하는데 유용한, 특히 모세관 증식을 감소시키기 위한 조성물 및 방법에서, 및 암, 특히 약물-저항성 암의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 제제로 제제화될 수 있다.
이하의 약어 및 정의가 본 출원 전체에 걸쳐서 사용된다:
"AML"은 급성 골수성 백혈병을 의미하는 약어이다.
"ALS"는 근위축성 측삭 경화증을 의미하는 약어이다.
"AD"는 알츠하이머병을 의미하는 약어이다.
"APP"는 아밀로이드 전구체 단백질을 의미하는 약어이다.
"ASCT"는 자가유래 줄기세포 이식을 의미하는 약어이다.
"BM"은 골수를 의미하는 약어이다.
"bFGF"는 염기성 섬유아세포 성장인자를 의미하는 약어이다.
bFGFR로도 또한 불리는 "FGFR1"은 섬유아세포 성장인자 FGF와 상호작용하는 타이로신 키나제를 의미하는 약어이다.
"Cdc 2"는 세포분열 주기 2를 의미하는 약어이다.
"Cdk 2"는 사이클린 의존성 키나제 2를 의미하는 약어이다.
"Cdk 4"는 사이클린 의존성 키나제 4를 의미하는 약어이다.
"Chk 1"은 체크포인트 (checkpoint) 키나제 1을 의미하는 약어이다.
"CK1ε"은 카제인 키나제 1 (입실론)을 의미하는 세린/트레오닌 키나제이다.
"c-ABL"은 아벨슨 (Abelson) 백혈병 바이러스로부터 최초로 분리된 종양원 생성물을 의미하는 타이로신 키나제에 대한 약어이다.
"C-Kit"는 또한, 줄기세포 인자 수용체 또는 비만세포 성장인자 수용체로 알려져 있다.
"FGF"는 FGFR1과 상호작용하는 섬유아세포 성장인자에 대한 약어이다.
"FGFR3"은 다발성 골수종-유형의 암에서 종종 발현되는 타이로신 키나제 섬유아세포 성장인자 수용체 3을 의미하는 약어이다.
"Flk-1"은 키나제-삽입 영역 타이로신 키나제로도 알려져 있는 태자 간 타이로신 키나제 1 또는 혈관 내피 성장인자 수용체-2 또는 VEGFR2로도 알려져 있는 KDR (인간)을 의미하는 약어이다 (KDR (인간), Flk-1 (마우스)).
"FLT-1"은 혈관 내피 성장인자 수용체-1 또는 VEGFR1로도 알려져 있는 fms-양 타이로신 키나제-1을 의미하는 약어이다.
"FLT-3"은 줄기세포 타이로신 키나제 I (STK I)로도 또한 알려져 있는 fms-양 타이로신 키나제-3을 의미하는 약어이다.
"FLT-4"는 VEGFR3으로 또한 알려져 있는 fms-양 타이로신 키나제-4를 의미하는 약어이다.
"Fyn"은 SRC, FGR, YES와 관련된 FYN 종양원 키나제를 의미하는 약어이다.
"GSK-3"은 글리코겐 신타제 키나제 3을 의미하는 약어이다.
"PAR-1"은 HDAK로 또한 알려져 있는, 흐트러진 결합된 키나제 (disheveled associated kinase)로도 알려진 키나제를 의미하는 약어이다.
"Lck"는 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제를 의미하는 약어이다.
"MEK1"은 Raf-MEK1-ERK의 형태가 되는 모듈 (module)에서의 MAPK (미토젠 활성화된 단백질 키나제) 시그날 전달경로에서 세린 트레오닌 키나제를 의미하는 약어이다. MEK1은 ERK (세포외 조절된 키나제)을 포스포릴화시킨다.
"MM"은 다발성 골수종을 의미하는 약어이다.
"MEK-2"는 NIM-A 관련된 키나제를 의미하는 약어이다.
"NIM-A"는 유사분열에서의 네버 (never)를 의미하는 약어이다.
"PDGF"는 혈소판 유도된 성장인자를 의미하는 약어이다. PDGF는 타이로신 키나제 PDGFRα 및 PDGFRβ와 상호작용한다.
"Rsk2"는 리보좀성 S6 키나제 2를 의미하는 약어이다.
"Raf"는 MAPK 시그날 전달경로 내의 세린/트레오닌 키나제이다.
"RTK"는 수용체 타이로신 키나제를 의미하는 약어이다.
"Tie-2"는 Ig 및 EGF 상동성 영역을 갖는 타이로신 키나제를 의미하는 약어이다.
"VEGF"는 혈관 내피 성장인자를 의미하는 약어이다.
"VEGF-RTK"는 혈관 내피 성장인자 수용체 타이로신 키나제를 의미하는 약어이다.
일반적으로, 수소 또는 H와 같은 특정의 원소에 대한 언급은 해당 원소의 모든 동위원소를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, R 기가 수소 또는 H를 포함하는 것으로 정의된다면, 이것은 또한 중수소 및 삼중수소를 포함한다.
문구 "비치환된 알킬"은 헤테로원자를 함유하지 않는 알킬기를 나타낸다. 따라서, 이 문구는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 등과 같은 직쇄 알킬기를 포함한다. 이 문구는 또한, 예로서 이하에 제공된 것을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 직쇄 알킬기의 측쇄 이성질체를 포함한다: -CH(CH3)2, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -C(CH2CH3)3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH(CH2CH3)2, -CH2C(CH3)3, -CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH2CH3)2, -CH2CH2C(CH3)3, -CH2CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2, -CH(CH2CH3)CH-(CH3)CH(CH3)(CH2CH3) 등. 이 문구는 또한 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸과 같은 사이클로알킬기 및 상기 정의한 바와 같은 직쇄 및 측쇄 알킬기에 의해서 치환된 이러한 환과 같은 사이클릭 알킬기를 포함한다. 이 문구는 또한, 아다만틸 및 노르보닐 및 비사이클로[2.2.2]옥틸 및 상기 정의한 바와 같은 직쇄 및 측쇄 알킬기에 의해서 치환된 이러한 환과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 폴리사이클릭 알킬기를 포함한다. 따라서, 문구 비치환된 알킬기는 일급 알킬기, 이급 알킬기 및 삼급 알킬기를 포함한다. 비치환된 알킬기는 모화합물 내의 하나 또는 그 이상의 탄소 원자(들), 산소 원자(들), 질소 원자(들) 및/또는 황 원자(들)에 결합될 수 있다. 바람직한 비치환된 알킬기는 1 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 측쇄 알킬기 및 사이클릭 알킬기를 포함한다. 더욱 바람직한 이러한 비치환된 알킬기는 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가지며, 더 더욱 바람직한 이러한 기는 1 내지 5 개의 탄소 원자를 갖는다. 가장 바람직한 비치환된 알킬기는 1 내지 4 개, 또는 1 내지 3 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 측쇄 알킬기를 포함하며, 메틸, 에틸, 프로필 및 -CH(CH3)2를 포함한다.
문구 "치환된 알킬"은 탄소(들) 또는 수소(들)에 대한 하나 또는 그 이상의 결합이 F, Cl, Br 및 I와 같은 할라이드에서의 할로겐 원자; 하이드록실기, 알콕시기, 아릴옥시기 및 에스테르기와 같은 기에서의 산소 원자; 티올기, 알킬 및 아릴 설파이드기, 설폰기, 설포닐기 및 설폭사이드기와 같은 기에서의 황 원자; 아민, 아미드, 알킬아민, 디알킬아민, 아릴아민, 알킬아릴아민, 디아릴아민, N-옥사이드, 이미드 및 엔아민과 같은 기에서의 질소 원자; 트리알킬실릴기, 디알킬아릴실릴기, 알킬디아릴실릴기 및 트리아릴실릴기와 같은 기에서의 실리콘 원자; 및 다양한 다른 기에서의 그 밖의 다른 헤테로원자와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 비-수소 및 비-탄소 원자에 대한 결합에 의해서 대체된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기를 나타낸다. 치환된 알킬기는 또한, 탄소(들) 또는 수소(들) 원자에 대한 하나 또는 그 이상의 결합이 카보닐, 카복실 및 에스테르 기에서의 산소; 이민, 옥심, 하이드라존, 및 니트릴과 같은 기에서의 질소와 같은 헤테로원자에 대한 결합에 의해서 치환된 기를 포함한다. 바람직한 치환된 알킬기에는 특히 탄소 또는 수소 원자에 대한 하나 또는 그 이상의 결합이 불소 원자에 대한 하나 또는 그 이상의 결합에 의해서 치환된 알킬기가 포함된다. 치환된 알킬기의 한가지 예는 트리플루오로메틸기 및 트리플루오로메틸기를 함유하는 그 밖의 다른 알킬기이다. 그 밖의 다른 알킬기에는 치환된 알킬기가 하이드록실, 알콕시, 아릴옥시기 또는 헤테로사이클릴옥시기를 함유하도록 탄소 또는 수소 원자에 대한 하나 또는 그 이상의 결합이 산소 원자에 대한 결합에 의해서 치환된 기가 포함된다. 그 밖의 또 다른 알킬기에는 아민, 알킬아민, 디알킬아민, 아릴아민, (알킬)(아릴)아민, 디아릴아민, 헤테로사이클릴아민, (알킬)(헤테로사이클릴)아민, (아릴)(헤테로사이클릴)아민 또는 디헤테로사이클릴아민 기를 갖는 알킬기가 포함된다.
문구 "비치환된 아릴"은 헤테로원자를 함유하지 않는 아릴기를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 이 문구는 페닐, 비페닐, 안트라세닐 및 나프틸과 같은 기를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 문구 "비치환된 아릴"이 나프탈렌과 같은 축합된 환을 함유하는 기를 포함하지만, 톨릴과 같은 아릴기는 본 명세서에서는 이하에 기술하는 바와 같은 치환된 아릴기인 것으로 간주되기 때문에 비치환된 아릴은 환 구성원 중의 하나에 결합된 알킬 또는 할로 기와 같은 다른 기를 갖는 아릴기는 포함하지 않는다. 바람직한 비치환된 아릴기는 페닐이다. 일부의 구체예에서, 비치환된 아릴기는 6 내지 14 개의 탄소 원자를 갖는다. 비치환된 아릴기는 모화합물 내의 하나 또는 그 이상의 탄소 원자(들), 산소 원자(들), 질소 원자(들) 및/또는 황 원자(들)에 결합될 수 있다.
문구 "치환된 아릴기"는 치환된 알킬기가 비치환된 알킬기에 관해서 갖는 것과 동일한 의미를 비치환된 아릴기에 관해서 갖는다. 그러나, 치환된 아릴기는 또한 방향족 탄소 중의 하나가 상술한 비-탄소 또는 비-수소 원자 중의 하나에 결합된 아릴기를 포함하며, 또한 아릴기의 하나 또는 그 이상의 방향족 탄소가 본 명세서에 정의된 바와 같은 치환되거나 비치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기에 결합된 아릴기를 포함한다. 이것은 아릴기의 두 개의 탄소 원자가 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기의 두 개의 원자에 결합되어 융합된 환 시스템 (예를 들어, 디하이드로나프틸 또는 테트라하이드로나프틸)을 규정하는 결합 배열을 포함한다. 따라서, 문구 "치환된 아릴"은 특히 톨릴 및 하이드록시페닐과 같은 기를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
문구 "비치환된 알케닐"은 두 개의 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중결합이 존재하는 것을 제외하고는 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기에 관해서 기술한 것과 같은 직쇄 및 측쇄 및 사이클릭 기를 의미한다. 그의 예로는 특히 비닐, -CH=C(H)(CH3), -CH=C(CH3)2, -C(CH3)=C(H)2, -C(CH3)=C(H)(CH3), -C(CH2CH3)=CH2, 사이클로헥세닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥사디에닐, 부타디에닐, 펜타디에닐 및 헥사디에닐이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 일부의 구체예에서, 비치환된 알케닐기는 2 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는다.
문구 "치환된 알케닐"은 치환된 알킬기가 비치환된 알킬기에 관해서 갖는 것과 동일한 의미를 비치환된 알케닐기에 관해서 갖는다. 치환된 알케닐기는 비-탄소 또는 비-수소 원자가 또 다른 탄소에 이중결합된 탄소에 결합된 알케닐기, 및 비-탄소 또는 비-수소 원자 중의 하나가 또 다른 탄소에 대한 이중결합에 포함되지 않은 탄소에 결합된 알케닐기를 포함한다.
문구 "비치환된 알키닐"은 두 개의 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 삼중결합이 존재하는 것을 제외하고는 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기에 관해서 기술한 것과 같은 직쇄 및 측쇄 기를 의미한다. 그의 예로는 특히 -C≡C(H), -C≡C(CH3), -C≡C(CH2CH3), -C(H2)C≡C(H), -C(H)2C≡C(CH3) 및 -C(H2)C≡C(CH2CH3)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 일부의 구체예에서, 비치환된 알키닐기는 2 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는다.
문구 "치환된 알키닐"은 치환된 알킬기가 비치환된 알킬기에 관해서 갖는 것과 동일한 의미를 비치환된 알키닐기에 관해서 갖는다. 치환된 알키닐기는 비-탄소 또는 비-수소 원자가 또 다른 탄소에 삼중결합된 탄소에 결합된 알키닐기, 및 비-탄소 또는 비-수소 원자가 또 다른 탄소에 대한 삼중결합에 포함되지 않은 탄소에 결합된 알키닐기를 포함한다.
문구 "비치환된 헤테로사이클릴"은 3 개 또는 그 이상의 환 구성원을 함유하며, 이들 중의 하나 또는 그 이상이 N, O 및 S와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 헤테로원자인, 퀴누클리딜과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 모노사이클릭, 비사이클릭 및 폴리사이클릭 환 화합물을 포함하는 방향족 및 비방향족 환 화합물 모두를 의미한다. 문구 "비치환된 헤테로사이클릴"이 벤즈이미다졸릴과 같은 축합된 헤테로사이클릭 환을 포함하지만, 이것은 환 구성원 중의 하나에 결합된 알킬 또는 할로 기와 같은 다른 기를 갖지 않는 헤테로사이클릴기를 포함하지 않는데, 이는 2-메틸벤즈이미다졸릴과 같은 화합물은 치환된 헤테로사이클릴기이기 때문이다. 헤테로사이클릴기의 예로는 다음의 기들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다: 피롤릴, 피롤리닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 디하이드로피리디닐, 피리미딜, 피라지닐, 피리다지닐, 트리아졸릴 (예를 들어, 4H-1,2,4-트리아졸릴, 1H-1,2,3-트리아졸릴, 2H-1,2,3-트리아졸릴 등), 테트라졸릴 (예를 들어, 1H-테트라졸릴, 2H-테트라졸릴 등)과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 4 개의 질소 원자를 함유하는 불포화된 3 내지 8 원 환; 피롤리디닐, 이미다졸리닐, 피페리디닐, 피페라지닐과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 4 개의 질소 원자를 함유하는 포화된 3 내지 8 원 환; 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 인돌리지닐, 벤즈이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 4 개의 질소 원자를 함유하는 축합된 불포화 헤테로사이클릭기; 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴 (예를 들어, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴 등)과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 2 개의 산소 원자 및 1 내지 3 개의 질소 원자를 함유하는 불포화된 3 내지 8 원 환; 모르폴리닐과 같이 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 11 내지 2 개의 산소 원자 및 내지 3 개의 질소 원자를 함유하는 포화된 3 내지 8 원 환; 1 내지 2 개의 산소 원자 및 1 내지 3 개의 질소 원자를 함유하는 축합된 불포화 헤테로사이클릭기, 예를 들어, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사디아졸릴, 벤즈옥사지닐 (예를 들어, 2H-1,4-벤즈옥사지닐 등); 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴 (예를 들어, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴 등)과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 3 개의 황 원자 및 1 내지 3 개의 질소 원자를 함유하는 불포화된 3 내지 8 원 환; 티아졸로디닐과 같이 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 1 내지 2 개의 황 원자 및 1 내지 3 개의 질소 원자를 함유하는 포화된 3 내지 8 원 환; 티에닐, 디하이드로디티이닐, 디하이드로디티오닐, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로티오피란과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 2 개의 황 원자를 함유하는 포화 및 불포화된 3 내지 8 원 환; 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조티아지닐 (예를 들어, 2H-1,4-벤조티아지닐 등), 디하이드로벤조티아지닐 (예를 들어, 2H-3,4-디하이드로벤조티아지닐 등)과 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 1 내지 2 개의 황 원자 및 1 내지 3 개의 질소 원자를 함유하는 축합된 불포화 헤테로사이클릭 환; 푸릴과 같이 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 산소 원자를 함유하는 불포화된 3 내지 8 원 환; 벤조디옥솔릴 (예를 들어, 1,3-벤조디옥솔릴 등)과 같이 1 내지 2 개의 산소 원자를 함유하는 축합된 불포화 헤테로사이클릭 환; 디하이드로옥사티이닐과 같이 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 산소 원자 및 1 내지 2 개의 황 원자를 함유하는 포화된 3 내지 8 원 환; 1,4-옥사티안과 같이 1 내지 2 개의 산소 원자 및 1 내지 2 개의 황 원자를 함유하는 포화된 3 내지 8 원 환; 벤조티에닐, 벤조디티이닐과 같이 1 내지 2 개의 황 원자를 함유하는 축합된 불포화 환; 및 벤족사티이닐과 같이 산소 원자 및 1 내지 2 개의 황 원자를 함유하는 축합된 불포화 헤테로사이클릭 환. 헤테로사이클릴기는 또한, 환 내의 하나 또는 그 이상의 S 원자가 하나 또는 두 개의 산소 원자에 이중-결합된 (설폭사이드 및 설폰) 상술한 기를 포함한다. 예를 들어, 헤테로사이클릴기는 테트라하이드로티오펜 옥사이드, 및 테트라하이드로티오펜 1,1-디옥사이드를 포함한다. 바람직한 헤테로사이클릴기는 5 또는 6 개의 환 구성원을 함유한다. 더욱 바람직한 헤테로사이클릴기에는 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피롤리딘, 이미다졸, 피라졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 티오펜, 티오모르폴린, 티오모르폴린 (여기에서, 티오모르폴린의 S 원자는 하나 또는 그 이상의 O 원자에 결합된다), 피롤, 호모피페라진, 옥사졸리딘-2-온, 피롤리딘-2-온, 옥사졸, 퀴누클리딘, 티아졸, 이속사졸, 푸란 및 테트라하이드로푸란이 포함된다.
문구 "치환된 헤테로사이클릴"은 하나 또는 그 이상의 환 구성원이 치환된 알킬기 및 치환된 아릴기에 관해서 상술한 바와 같이 비-수소 원자에 결합된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 헤테로사이클릴기를 의미한다. 예로는 특히 2-메틸벤즈이미다졸릴, 5-메틸벤즈이미다졸릴, 5-클로로벤즈티아졸릴, 1-메틸 피페라지닐과 같은 N-알킬 피페라지닐기, 피페라진-N-옥사이드, N-알킬 피페라진 N-옥사이드, 2-페녹시-티오펜, 및 2-클로로피리디닐이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 치환된 헤테로사이클릴기에는 비-수소 원자에 대한 결합이 치환 및 비치환된 아릴, 치환 및 비치환된 아르알킬, 또는 비치환된 헤테로사이클릴기의 일부분인 탄소 원자에 대한 결합인 헤테로사이클릴기가 포함된다. 그의 예로는 1-벤질피페리디닐, 3-페닐티오모르폴리닐, 3-(피롤리딘-1-일)-피롤리디닐 및 4-(피페리딘-1-일)-피페리디닐이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. N-메틸 피페라진과 같은 N-알킬 치환된 피페라진기, 치환된 모르폴린기, 및 피페라진 N-옥사이드 및 N-알킬 피페라진 N-옥사이드와 같은 피페라진 N-옥사이드기와 같은 기들이 일부의 치환된 헤테로사이클릴기의 예이다. N-메틸 피페라진 등과 같은 N-알킬 치환된 피페라진기와 같은 치환된 피페라진기, 치환된 모르폴린기, 피페라진 N-옥사이드기 및 N-알킬 피페라진 N-옥사이드기와 같은 기들은 R6 또는 R7 기에 특히 적합한 치환된 헤테로사이클릴기의 일부의 예이다.
문구 "비치환된 헤테로사이클릴알킬"은 비치환된 알킬기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의한 바와 같은 헤테로사이클릴기에 대한 결합으로 대체된 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기를 나타낸다. 예를 들어, 메틸 (-CH3)은 비치환된 알킬기이다. 메틸의 탄소가 피리딘의 탄소 2 (피리딘의 N에 결합된 탄소 중의 하나) 또는 피리딘의 탄소 3 또는 4에 결합되는 경우와 같이 메틸기의 수소 원자가 헤테로사이클릴기에 대한 결합으로 대체된다면, 화합물은 비치환된 헤테로사이클릴알킬기이다.
문구 "치환된 헤테로사이클릴알킬"은 치환된 아르알킬기가 비치환된 아르알킬기에 관해서 갖는 것과 동일한 의미를 비치환된 헤테로사이클릴알킬기에 관해서 갖는다. 그러나, 치환된 헤테로사이클릴알킬기는 또한 비-수소 원자가 피페리디닐알킬기의 피페리딘 환 내의 질소 원자와 같은 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 헤테로사이클릴알킬기의 헤테로사이클릴기 내의 헤테로원자에 결합된 기를 포함한다. 또한, 치환된 헤테로사이클릴알킬기는 이 기의 알킬 부분의 탄소 결합 또는 수소 결합이 치환 및 비치환된 아릴 또는 치환 및 비치환된 아르알킬기에 대한 결합으로 대체된 기를 포함한다. 그의 예로는 페닐-(피페리딘-1-일)-메틸 및 페닐-(모르폴린-4-일)-메틸이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
문구 "비치환된 알콕시"는 수소 원자에 대한 결합이 상기 정의한 바와 같은 다른 식으로 비치환된 알킬기의 탄소 원자에 대한 결합으로 대체된 하이드록실기 (-OH)를 나타낸다.
문구 "치환된 알콕시"는 수소 원자에 대한 결합이 상기 정의한 바와 같은 다른 식으로 치환된 알킬기의 탄소 원자에 대한 결합으로 대체된 하이드록실기 (-OH)를 나타낸다.
문구 "비치환된 헤테로사이클릴옥시"는 수소 원자에 대한 결합이 상기 정의한 바와 같은 다른 식으로 비치환된 헤테로사이클릴기의 환 원자에 대한 결합으로 대체된 하이드록실기 (-OH)를 나타낸다.
문구 "치환된 헤테로사이클릴옥시"는 수소 원자에 대한 결합이 상기 정의한 바와 같은 다른 식으로 치환된 헤테로사이클릴기의 환 원자에 대한 결합으로 대체된 하이드록실기 (-OH)를 나타낸다.
문구 "비치환된 아릴옥시알킬"은 탄소 결합 또는 수소 결합이 상기 정의한 바와 같은 비치환된 아릴기에 결합된 산소 원자에 대한 결합으로 대체된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기를 나타낸다.
문구 "치환된 아릴옥시알킬"은 아릴옥시알킬기의 알킬기의 탄소 또는 수소 원자에 대한 결합이 치환된 알킬기에 관해서 상술한 바와 같은 비-탄소 및 비-수소 원자에 결합되거나, 아릴옥시알킬기의 아릴기가 상기 정의한 바와 같은 치환된 아릴기인, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 아릴옥시알킬기를 나타낸다.
문구 "비치환된 헤테로사이클릴옥시알킬"은 탄소 결합 또는 수소 결합이 상기 정의한 바와 같은 비치환된 헤테로사이클릴기에 결합된 산소 원자에 대한 결합으로 대체된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기를 나타낸다.
문구 "치환된 헤테로사이클릴옥시알킬"은 헤테로사이클릴옥시알킬기의 알킬기의 탄소 또는 수소 원자에 대한 결합이 비치환된 알킬기에 관해서 상기 기술된 바와 같이 비-탄소 및 비-수소 원자에 결합되거나, 헤테로사이클릴옥시알킬기의 헤테로사이클릴기가 상기 정의한 바와 같은 치환된 헤테로사이클릴기인, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 헤테로사이클릴옥시알킬기를 나타낸다.
문구 "비치환된 헤테로사이클릴알콕시"는 탄소 결합 또는 수소 결합이 모화합물에 결합된 산소 원자에 대한 결합에 의해서 대체되고, 비치환된 알킬기의 또 다른 탄소 또는 수소 결합이 상기 정의한 바와 같이 비치환된 헤테로사이클릴기에 결합된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기를 나타낸다.
문구 "치환된 헤테로사이클릴알콕시"는 헤테로사이클릴알콕시기의 알킬기의 탄소 또는 수소 원자에 대한 결합이 치환된 알킬기에 관해서 상기에 기술한 바와 같이 비-탄소 및 비-수소 원자에 결합되거나, 헤테로사이클릴알콕시기의 헤테로사이클릴기가 상기 정의한 바와 같은 치환된 헤테로사이클릴기인, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 헤테로사이클릴알콕시기를 나타낸다. 또한, 치환된 헤테로사이클릴알콕시기는 이 기의 알킬 부위에 대한 탄소 결합 또는 수소 결합이 하나 또는 그 이상의 추가의 치환 및 비치환된 헤테로사이클에 의해서 치환될 수 있는 기를 또한 포함한다. 예로는 피리드-2-일모르폴린-4-일메틸 및 2-피리드-3-일-2-모르폴린-4-일에틸이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
문구 "비치환된 알콕시알킬"은 탄소 결합 또는 수소 결합이 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기에 결합된 산소 원자에 대한 결합에 의해서 대체된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알킬기를 나타낸다.
문구 "치환된 알콕시알킬"은 알콕시알킬기의 알킬기 및/또는 알콕시기의 탄소 또는 수소 원자에 대한 결합이 치환된 알킬기에 관해서 상술한 바와 같이 비-탄소 및 비-수소 원자에 결합된, 상기 정의한 바와 같은 비치환된 알콕시알킬기를 나타낸다.
하이드록실기, 아민기 및 설프하이드릴기에 관한 용어 "보호된"은 문헌 (Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T.W.; Wuts, P.G.M., John Wiley ＆ Sons, New York, NY, (3rd Edition, 1999))에 기술된 방법을 사용하여 부가되거나 제거될 수 있는 것으로 상기 문헌에 기술된 것과 같은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 보호기에 의해서 바람직하지 않은 반응으로부터 보호된 이들 작용기의 형태를 나타낸다. 보호된 하이드록실기의 예로는 하이드록실기와 t-부틸디메틸-클로로실란, 트리메틸클로로실란, 트리이소프로필클로로실란, 트리에틸클로로실란과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 시약의 반응에 의해서 수득된 것과 같은 실릴 에테르; 메톡시메틸 에테르, 메틸티오메틸 에테르, 벤질옥시메틸 에테르, t-부톡시메틸 에테르, 2-메톡시에톡시메틸 에테르, 테트라하이드로피라닐 에테르, 1-에톡시에틸 에테르, 알릴 에테르, 벤질 에테르와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 치환된 메틸 및 에틸 에테르; 벤조일포르메이트, 포르메이트, 아세테이트, 트리클로로아세테이트 및 트리플루오로아세테이트와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 에스테르가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 보호된 아민기의 예로는 포름아미드, 아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드 및 벤즈아미드와 같은 아미드; 프탈이미드 및 디티오석신이미드와 같은 이미드 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 보호된 설프하이드릴기의 예로는 S-벤질 티오에테르 및 S-4-피콜릴 티오에테르와 같은 티오에테르; 헤미티오, 디티오 및 아미노티오 아세탈과 같은 치환된 S-메틸 유도체 등이 포함된다.
"약제학적으로 허용되는 염"에는 무기염기, 유기염기, 무기산, 유기산, 또는 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포함된다. 무기염기의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속; 칼슘 및 마그네슘 또는 알루미늄과 같은 알칼리 토금속; 및 암모니아를 포함한다. 유기염기의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민 및 트리에탄올아민을 포함한다. 무기산의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 염산, 하이드로붕산 (hydroboric acid), 질산, 황산 및 인산을 포함한다. 유기산의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 락트산, 시트르산, 석신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 및 p-톨루엔설폰산을 포함한다. 염기성 아미노산의 염으로서, 본 발명은 예를 들어, 아르기닌, 라이신 및 오르니틴을 포함한다. 산성 아미노산은 예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 약물-저항성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 치료가 필요한 대상체에게 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 대상체는 약물-저항성 암을 갖는 암환자이고, 화학식 I의 화합물은 하기의 구조식을 갖는다:
[화학식 I]
Figure 112007089361312-pct00002
상기 식에서,
R1, R2, R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있으며, H, Cl, Br, F, I, -OR10 기, -NR11R12 기, 치환되거나 비치환된 일급, 이급 또는 삼급 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 치환되거나 비치환된 알케닐기, 치환되거나 비치환된 알키닐기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴알킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7 및 R8은 동일하거나 상이할 수 있으며, H, Cl, Br, F, I, -OR13 기, -NR14R15 기, -SR16 기, 치환되거나 비치환된 일급, 이급 또는 삼급 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 치환되거나 비치환된 알케닐기, 치환되거나 비치환된 알키닐기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴알킬기, 치환되거나 비치환된 알콕시알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴옥시알킬기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴옥시알킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R10 및 R13은 동일하거나 상이할 수 있으며, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴알킬기, 치환되거나 비치환된 알콕시알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴옥시알킬기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴옥시알킬기로부터 독립적으로 선택되고;
R11 및 R14는 동일하거나 상이할 수 있으며, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R12 및 R15는 동일하거나 상이할 수 있으며, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기로부터 독립적으로 선택되고;
R16은 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 아릴기, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기로부터 독립적으로 선택된다.
약물-저항성 암을 치료하는 방법의 일부 구체예에서는, 대상체에게 화학식 II의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하며, 여기에서 화학식 II의 화합물은 하기의 구조식을 가지고, R7은 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다:
Figure 112007089361312-pct00003
이러한 일부의 구체예에서, R7은 치환되거나 비치환된 피페리디닐기, 피페라지닐기 또는 모르폴리닐기로부터 선택된 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 이들 구체예 중의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이다. 이러한 구체예의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이고, N-알킬 피페라지닐의 알킬기는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 포함한다.
약물-저항성 암을 치료하는 방법의 일부의 구체예에서는, 대상체에게 화학식 III의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하며, 여기에서 화학식 III의 화합물은 하기의 구조식을 갖는다:
Figure 112007089361312-pct00004
본 발명은 또한, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 암의 치료가 필요한 대상체에게 글리벡, BAY43-9006, 브로스탈리신, 레날리도마이드 (레블리미드), 탈리도마이드 (탈로미드), 도세탁셀 (탁소테레), 에를로티니브 (타르세바), 바탈리니브 (PTK-787), VEGF-트랩, 펜레티딘, 보르테조미브, 베바시주마브 (아바스틴), 퍼투주마브, 및/또는 리툭시마브로부터 선택된 항암 약물, 및 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 화학식 I의 화합물은 약물-저항성 암을 치료하는 방법에 관해서 상기에 제시된 구조 및 특성을 갖는다. 화학식 I, II 및 III의 화합물은 이들 항암 약물 중의 하나 또는 그 이상에 대해서 무반응성인 암 환자를 치료하는데 유용하다. 화학식 I, II 및 III의 화합물은 이들 항암 약물 중의 하나 또는 그 이상에 대해서 무반응성이거나 저항성인 암을 갖는 암 환자를 치료하는데 유용하다.
암을 치료하는 방법의 한가지 구체예에서는, 대상체에게 화학식 II의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하며, 여기에서 화학식 II의 화합물은 상기 제시된 구조식을 가지고, R7은 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 이러한 일부의 구체예에서, R7은 치환되거나 비치환된 피페리디닐기, 피페라지닐기 또는 모르폴리닐기로부터 선택된 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 이들 구체예 중의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이다. 이러한 구체예의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이고, N-알킬 피페라지닐의 알킬기는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 포함한다.
암을 치료하는 방법의 한가지 구체예에서는, 대상체에게 화학식 III의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하며, 여기에서 화학식 III의 화합물은 상기 제시된 구조식을 갖는다.
암을 치료하는 방법의 일부 구체예에서, 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 항암 약물을 대상체에게 투여한 후에 대상체에게 투여된다. 그 밖의 다른 구체예에서, 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 항암 약물을 대상체에게 투여하기 전에 대상체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 적어도 일부의 항암 약물을 대상체에게 투여하는 것과 동시에 대상체에게 투여된다.
일부의 구체예에서, 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물을 투여한 후에 대상체에서는 안정한 질병 상태가 달성되고/되거나 종양 크기의 감소가 일어난다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 치료학적 조성물 및 키트를 제공한다. 이러한 조성물 및 키트는 항암 약물 및 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 이러한 치료학적 조성물은 약물-저항성 암을 갖는 대상체의 치료에 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한 배합제제로서 성분들을 포함할 수 있다. 화학식 I의 화합물은 약물-저항성 암을 치료하는 방법에 관하여 상술한 것과 동일한 구조 및 특성을 갖는다. 일부의 구체예에서, 키트 및 치료학적 조성물 내에 포함되는 항암 약물은 암이 저항성을 갖는 약물이 아닌 항암 약물이다. 다른 구체예에서, 키트 및 치료학적 조성물 내에 포함된 항암 약물은 암이 저항성을 갖는 항암 약물이다. 예를 들어, 환자가 글리벡에 대해서 무반응성이라면, 키트 또는 조성물은 이레사 (Iressa)와 같은 항암 약물에 더하여 하나 또는 그 이상의 화학식 I, II 및/또는 III의 화합물을 포함할 수 있다. 대신으로, 환자가 글리벡에 대해서 무반응성이라면, 키트 또는 조성물은 하나 또는 그 이상의 화학식 I, II 및/또는 III의 화합물 및 글리벡을 포함할 수 있다. 글리벡을 포함시키는 목적은 환자에서의 약물-저항성을 약물이 환자에게 투여될 때까지 모를 수 있기 때문이다. 추가로, 특정 약물에 대한 저항성이 치료 중에 발현될 수 있다. 키트는 본 발명의 화합물에 더하여 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 상이한 항암 약물을 포함할 수 있다.
키트 및 치료학적 조성물의 일부의 구체예에서, 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물은 화학식 II의 화합물, 화학식 II의 화합물의 호변이성질체, 화학식 II의 화합물의 염, 화학식 II의 화합물의 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물이며, 여기에서 화학식 II의 화합물은 상기 제시된 구조식을 가지며 R7은 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 일부의 이러한 구체예에서, R7은 치환되거나 비치환된 피페리디닐기, 피페라지닐기 또는 모르폴리닐기로부터 선택된 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 이들 구체예 중의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이다. 이러한 구체예의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이고, N-알킬 피페라지닐의 알킬기는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 포함한다.
키트 및 치료학적 조성물의 일부 구체예에서, 화학식 I의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물은 화학식 III의 화합물, 화학식 III의 화합물의 호변이성질체, 화학식 III의 화합물의 염, 화학식 III의 화합물의 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물이며, 여기에서 화학식 III의 화합물은 상기 제시된 구조식을 갖는다.
치료학적 조성물 및 키트의 일부 구체예에서, 항암 약물 및 상기 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 단일 조성물로 제공된다. 그 밖의 다른 구체예에서, 항암 약물 및 상기 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 키트의 부분들로 개별적으로 제공된다.
본 발명은 또한, 대상체에서 키나제를 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 대상체는 암 환자이고, 키나제는 돌여변이체 게이트키퍼 잔기를 포함히며, 화학식 I의 화합물은 약물-저항성 암을 치료하는 방법에 관해서 상기에 제시된 구조 및 특성을 갖는다.
키나제를 억제하는 방법의 한가지 구체예에서, 대상체에게는 화학식 II의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하며, 여기에서 화학식 II의 화합물은 상기 제시된 구조식을 가지며 R7은 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 일부의 이러한 구체예에서, R7은 치환되거나 비치환된 피페리디닐기, 피페라지닐기 또는 모르폴리닐기로부터 선택된 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 이들 구체예 중의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이다. 이러한 구체예의 일부에서, R7은 치환되거나 비치환된 N-알킬 피페라지닐기이고, N-알킬 피페라지닐의 알킬기는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 포함한다.
키나제를 억제하는 방법의 한가지 구체예에서, 대상체에게는 화학식 III의 화합물, 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하며, 여기에서 화학식 III의 화합물은 상기 제시된 구조식을 갖는다.
키나제를 억제하는 방법의 한가지 구체예에서, 키나제는 세포질 타이로신 키나제이거나 수용체 타이로신 키나제이다. 일부의 구체예에서, 키나제는 ABL, KIT, PDGFRa, EGFR 또는 FLT3으로부터 선택된다. 일부의 이러한 구체예에서, 키나제는 ABL (T3151)이다. 그 밖의 다른 이러한 구체예에서, 키나제는 FLT3 (D835Y)이다. 그 밖의 다른 이러한 구체예에서, 키나제는 EGFR이다.
키나제를 억제하는 방법의 일부의 구체예에서, 암은 이마티니브 메실레이트 (글리벡), BAY43-9006, 브로스탈리신, 레날리도마이드 (레블리미드), 탈리도마이드 (탈로미드), 도세탁셀 (탁소테레), 에를로티니브 (타르세바), 제피티니브 (이레사), 바탈리니브 (PTK-787), VEGF-트랩, 펜레티딘, 보르테조미브, 또는 일반적 모노클로날 항체에 대해서 저항성이다. 일부의 구체예에서, 암 환자의 암은 위장관 간질성 종양, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 신세포암, 비-소세포 폐암, 또는 과호산구 증후군 (HES)으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 pERK의 과발현과 연관된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게서 내인성 pERK 수준을 측정하고, 그 환자에게 화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염 또는 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부의 이러한 구체예에서, 내인성 pERK 수준의 측정은 투여하기 전에 수행된다. 이러한 구체예에서, 측정은 상기 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물이 필요한 환자를 결정하기 위하여 수행될 수 있다. 그 밖의 다른 구체예에서, 내인성 pERK 수준의 측정은 투여한 후에 수행된다. 이러한 구체예에서, 측정은 상기 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물의 투여의 유효성을 결정하기 위해서 수행될 수 있다. 일부의 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물 또는 화학식 III의 화합물, 또는 이들의 염, 이들의 호변이성질체의 염, 이들의 혼합물, 또는 이들 중의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이다.
pERK의 과발현과 연관된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법의 일부의 구체예에서, 환자에게서 내인성 pERK 수준을 측정하는 것은 말초혈액 백혈구를 함유하는 혈액을 추출하고, 웨스턴 블럿 및/또는 유동세포분석 시험에 의해서 내인성 pERK 수준을 측정하는 것을 포함한다. 일부의 구체예에서, 대상체에서의 pERK 수준은 상승된다. 그 밖의 다른 이러한 구체예에서, pERK 수준은 대상체에서 안정화되거나 감소한다.
일부의 구체예에서, R1은 H, Cl, Br, F 또는 I로부터 선택된다. 일부의 이러한 구체예에서, R1은 F이다. 일부의 구체예에서 R2, R3 및 R4는 모두 H이다. 일부의 이러한 구체예에서, R1은 F이고, R2, R3 및 R4의 각각은 H이다.
그 밖의 다른 구체예에서, R6 또는 R7 중의 적어도 하나는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릴기이다. 일부의 이러한 구체예에서, R6 또는 R7 중의 하나는 헤테로사이클릴기이고, R6 또는 R7 중의 다른 하나는 H이다. 일부의 구체예에서, R6 또는 R7 중의 하나는 치환되거나 비치환된 피페리디닐기, 피페라지닐기 또는 모르폴리닐기로부터 선택된 헤테로사이클릴기이다. 일부의 이러한 구체예에서, R6 또는 R7 중의 하나는 N-메틸 피페라지닐기 등과 같은 N-알킬 피페라지닐기이고, 일부의 이러한 구체예에서 R6 또는 R7 중의 다른 하나는 H이다.
다양한 구체예에서는, 화합물의 락트산 염이 대상체에게 투여되거나, 본 발 명의 키트 또는 치료학적 조성물 내에 포함된다.
다양한 구체예에서, 암은 글리벡에 대해서 저항성이다. 그 밖의 다른 구체예에서, 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 글리벡을 대상체에게 투여하고, 대상체에서 암이 글리벡에 대해서 저항성인 것으로 확인된 후에 대상체에게 투여된다.
다양한 구체예에서, 암은 BAY43-9006에 대해서 저항성이다. 다른 구체예에서, 상기 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 BAY43-9006을 대상체에게 투여하고, 대상체에서 암이 BAY43-9006에 대해서 저항성인 것으로 확인된 후에 대상체에게 투여된다.
다양한 구체예에서, 암은 브로스탈리신에 대해서 저항성이다. 다른 구체예에서, 상기 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 혼합물, 또는 약제학적 조성물은 브로스탈리신을 대상체에게 투여하고, 대상체에서 암이 브로스탈리신에 대해서 저항성인 것으로 확인된 후에 대상체에게 투여된다.
다양한 구체예에서, 암은 각각 개별적으로 바람직한 다음의 항암 약물 중의 하나에 대해서 저항성이거나, 상기 화합물, 염, 호변이성질체, 혼합물, 또는 약제학적 조성물이 이들 항암 약물 중의 하나와 함께 사용된다: 레날리도마이드 (레블리미드), 탈리도마이드 (탈로미드), 도세탁셀 (탁소테레), 에를로티니브 (타르세바), 제피티니브 (이레사), 바탈리니브 (PTK-787), VEGF-트랩, 펜레티딘, 보르테조미브, 또는 베바시주마브 (아바스틴), 퍼투주마브 또는 리툭시마브와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 일반적 모노클로날 항체. 트라스투주마브 (헤르셉틴 (Herceptin))가 또한, 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수도 있다.
다양한 암이 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 의해서 치료될 수 있다. 일부의 구체예에서, 암은 일부의 구체예에서 약물-저항성인 고형 종양과 같은 고형암이다. 다른 구체예에서, 암은 "액상 (liquid)" 암 또는 혈액학적 암이다. 또 다른 구체예에서, 암은 위장관 간질성 종양 (GIST)이다. 다른 구체예에서, 암은 급성 골수성 백혈병이다. 또 다른 구체예에서, 암은 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 또는 신세포암이다. 또 다른 구체예에서, 암은 전립선암, 신장암, 위장관 간질성 종양, 육종, 결장직장암, 유방암, 이하선암, 위암, 흑색종, 식도암, NET (비부비동 (sinonasal)) 암, 결장암, 난소암, 또는 일부의 구체예에서 약물-저항성인 간암으로부터 선택된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 그 밖의 다른 암의 목록에는 위장관 간질성 종양, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 신세포암, 비-소세포 폐암, 또는 과호산구 증후군 (HES)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
헤테로사이클릴기를 포함하는 다양한 기에서 헤테로사이클릴기는 다양한 방식으로 부착될 수 있다. 예를 들어, -OCH2(CH2)q(헤테로사이클릴) (여기에서, q는 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 선택된다) 기에서, 헤테로사이클릴기는 다양한 환 구성원을 통해서 -OCH2(CH2)q(헤테로사이클릴)의 -OCH2(CH2)q의 메틸렌 탄소에 결합될 수 있다. q가 1이고 헤테로사이클릴기가 테트라하이드로푸란인 비-제한적인 예로서, 이 기는 하기 화학식 IV 및 V의 두 가지 구조식에 상응하는 화학식 -OCH2CH2(테트라 하이드로푸라닐)로 표시될 수 있다:
Figure 112007089361312-pct00005
Figure 112007089361312-pct00006
여기에서, 화학식 IV의 구조는 -OCH2CH2(2-테트라하이드로푸라닐) 기로 불릴 수 있는 기를 나타내며, 화학식 V의 구조는 -OCH2CH2(3-테트라하이드로푸라닐) 기로 불릴 수 있는 기를 나타낸다. 헤테로사이클릴기가 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 또는 피롤리딘과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) N-함유 헤테로사이클릴인 경우에, 헤테로사이클은 환 탄소 원자를 통해서, 또는 N-함유 헤테로사이클의 환 내의 질소 원자를 통해서 메틸렌 탄소에 결합될 수 있다. 이들은 둘 다 바람직하다. -OCH2(CH2)q(헤테로사이클릴) 기에서 헤테로사이클릴기가 피페리딘이고, q가 2인 경우에는 다음의 구조들이 가능하고 바람직하다:
Figure 112007089361312-pct00007
Figure 112007089361312-pct00008
Figure 112007089361312-pct00009
Figure 112007089361312-pct00010
화학식 VI의 구조는 -O(CH2)3(N-피페리디닐) 또는 -O(CH2)3(1-피페리디닐) 기의 예이다. 화학식 VII의 구조는 -O(CH2)3-(2-피페리디닐) 기의 예이다. 화학식 VIII의 구조는 -O(CH2)3(3-피페리디닐) 기의 예이다. 화학식 IX의 구조는 -O(CH2)3(4-피페리디닐) 기의 예이다. -OCH2(CH2)q(헤테로사이클릴) 기에서 헤테로사이클릴기가 피페라진이고 q가 1인 경우에는 다음의 구조들이 가능하고 바람직하다:
Figure 112007089361312-pct00011
Figure 112007089361312-pct00012
화학식 X의 구조는 -O(CH2)2(2-피페라지닐) 기의 예이며, 화학식 XI의 구조는 -O(CH2)2(1-피페라지닐) 또는 -O(CH2)2(N-피페라지닐) 기의 예이다. -OCH2(CH2)q(헤테로사이클릴) 기에서 헤테로사이클릴기가 모르폴린이고 q는 1인 경우에는 다음의 구조들이 가능하고 바람직하다:
Figure 112007089361312-pct00013
Figure 112007089361312-pct00014
Figure 112007089361312-pct00015
화학식 XII의 구조는 -O(CH2)2(3-모르폴리닐) 기의 예이며, 화학식 XIII의 구조는 -O(CH2)2(4-모르폴리닐) 또는 -O(CH)2(N-모르폴리닐) 기의 예이고, 화학식 XIV의 구조는 -O(CH2)2(2-모르폴리닐) 기의 예이다. 이 기가 피롤리딘이고 q가 1인 경우에 이용할 수 있는 구조에는 -O(CH2)2(1-피롤리디닐) 또는 -O(CH2)2(N-피롤리디닐), -O(CH2)2(2-피롤리디닐) 및 -O(CH2)2(3-피롤리디닐)이 포함되는 것으로 관찰될 수 있다.
반응식 1은 벤즈이미다졸릴 퀴놀리논 화합물의 합성을 위한 한가지 예시적인 합성경로를 도시한 것이며, 본 발명은 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되지는 않아야 한다.
Figure 112007089361312-pct00016
반응식 2는 본 발명의 화합물을 합성하는 또 다른 방법을 도시한 것이며, 본 발명을 어떤 식으로든 제한하지는 않는다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 치환 되거나 비치환된 디아미노벤젠 및 치환되거나 비치환된 안트라닐로니트릴을 선택하여 광범한 종류의 화합물의 합성이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 또한, 특정의 기들은 최종 폐환반응을 위한 표준 보호기를 사용하여 보호하는 것이 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 매우 다목적의 합성경로가 화학식 III의 과다한 화합물이 매우 집중적이며 효율적인 합성경로에 의해서 쉽게 제조될 수 있도록 한다.
Figure 112007089361312-pct00017
화학식 I의 화합물은 이하의 실시예 항목에 기술되고, 각각이 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 온전히 모든 목적으로 본 발명에 참고로 포함된 이하의 문헌에 개시된 방법을 사용하여 쉽게 합성된다: 미국 특허 제 6,605,617 호, 공개된 미국 특허출원 제 2004/0092535 호, 미국 특허출원 제 10/983,174 호, 공개된 미국 특허출원 제 2004/0220196 호, 미국 특허출원 제 10/982,757 호, 및 미국 특허출원 제 10/982,543 호.
화학식 I의 화합물, 이 화합물의 호변이성질체, 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 호변이성질체의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이들의 혼합물은 본 명세서에 기술된 목적으로 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기술된 다양한 생물학적 상태를 치료하기 위해서 사용될 수 있는 의약을 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물, 염, 호변이성질체, 호변이성질체의 염, 및 이들의 혼합물은 글리벡, BAY43-9006 및 브로스탈리신과 같은 하나 또는 그 이상의 다른 항암 약물에 대해서 저항성인 암을 갖는 환자를 치료하는데 특히 유용하다.
약제학적 제제는 본 명세서에 기술된 것과 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 상술한 구체예 중의 어떤 것의 화합물, 호변이성질체 또는 염 중의 어떤 것이라도 포함할 수 있다. 이러한 제제는 또한, 글리벡, BAY43-9006 또는 브로스탈리신과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 항암 약물을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한, 전이된 종양과 관련된 장애를 치료 또는 개선시키기 위한, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 호변이성질체, 또는 이들의 혼합물을 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 결합제, 희석제 등과 혼합시킴으로써 제조될 수 있는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 전이된 종양을 치료하기 위해서 사용되는 제제를 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 캅셀제, 시럽, 좌제, 주사제, 에멀젼, 엘릭서, 현탁제 또는 용액의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, 경구 투여, 비내 투여, 직장 투여, 피하 주 사, 정맥내 주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사에 의한 다양한 투여 경로를 위해서 제제화될 수 있다. 이하의 투약형은 예로서 제시되며, 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지는 않아야 한다.
경구, 협측 (buccal) 및 설하 투여를 위해서는 분말, 현탁제, 과립, 정제, 환제, 캅셀제, 젤캡 (gelcap), 및 캐플릿 (caplet)이 고체 투약형으로 허용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 호변이성질체 또는 혼합물을 전분 또는 그 밖의 다른 첨가제와 같은 적어도 하나의 첨가제와 혼합시킴으로써 제조될 수 있다. 적합한 첨가제에는 슈크로즈, 락토즈, 셀룰로즈, 슈가, 만니톨, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 알지네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 고무, 아라비아 고무, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체 또는 글리세라이드이다. 임의로, 경구 투약형은 불활성 희석제, 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 또는 파라벤 또는 소르빈산과 같은 보존제, 또는 아스코르빈산, 토코페롤 또는 시스테인과 같은 항산화제, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 방향제 또는 향료와 같이 투여를 도와주는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 정제 및 환제는 본 기술분야에서 공지된 적합한 코팅물질로 더 처리될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투약형은 물과 같은 불활성 희석제를 함유할 수 있는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 시럽, 엘릭서, 현탁제 및 용액의 형태일 수 있다. 약제학적 제제 및 의약은 오일, 물, 알콜 및 이들의 배합물과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 멸균 액체를 사용하여 액체 현탁제 또는 용액으로 제조될 수 있 다. 약제학적으로 적합한 계면활성제, 현탁화제, 유화제가 경구 또는 비경구 투여를 위해서 첨가될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 현탁제는 오일을 포함할 수 있다. 이러한 오일에는 땅콩유, 호마유, 면실유, 옥수수유 및 올리브유가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 현탁제 제제는 또한, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세라이드 및 아세틸화 지방산 글리세라이드와 같은 지방산의 에스테르를 함유할 수 있다. 현탁제 제제는 에탄올, 이소프로필 알콜, 헥사데실 알콜, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 알콜을 포함할 수 있다. 폴리(에틸렌글리콜)과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 에테르, 광유 및 바셀린과 같은 석유 하이드로카본, 및 물이 현탁제 제제에서 또한 사용될 수 있다.
비내 투여를 위한 약제학적 제제 및 의약은 적절한 용매(들), 및 임의로 안정화제, 항미생물제, 항산화제, pH 변형제, 계면활성제, 생체이용율 변형제 및 이들의 배합물과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 화합물을 함유하는 스프레이 또는 에어로졸일 수 있다. 에어로졸 제제의 경우에 추진제는 압축 공기, 질소, 이산화탄소, 또는 하이드로카본-계 저비점 용매를 포함할 수 있다.
주사용 투약형은 일반적으로, 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 제조될 수 있는 수성 현탁제 또는 오일 현탁제를 포함한다. 주사용 형태는 용매 또는 희석제에 의해서 제조되는 용액상 또는 현탁제의 형태일 수 있다. 허용되는 용매 또는 비히클에는 멸균수, 링거 용액 또는 등장성 식염 수용액이 포함된다. 대신으로, 멸균 오일이 용매 또는 현탁화제로 사용될 수 있다. 바람직하게 는, 오일 또는 지방산은 천연 또는 합성 오일, 지방산, 모노-, 디- 또는 트리-글리세라이드를 포함하는 비-휘발성 물질이다.
주사를 위한 약제학적 제제 및/또는 의약은 상술한 바와 같은 적절한 용액으로 재구성하기에 적합한 분말일 수 있다. 이들의 예로는 동결 건조, 회전 건조 또는 스프레이 건조된 분말, 무정형 분말, 과립, 침전 또는 미립체가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 주사를 위한 제제는 임의로 안정화제, pH 변형제, 계면활성제, 생체이용율 변형제 및 이들의 배합물을 함유할 수 있다.
직장 투여를 위한 약제학적 제제 및 의약은 장, S상 결장 및/또는 직장에서 화합물을 방출시키는 좌제, 연고제, 관장제, 정제 또는 크림제의 형태일 수 있다. 직장용 좌제는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물 또는 이 화합물의 약제학적으로 허용되는 염 또는 호변이성질체를 허용되는 비히클, 예를 들어, 표준 저장온도에서는 고체상으로 존재하고 직장과 같은 신체 내부에서 약물을 방출시키기에 적합한 온도에서는 액체상으로 존재하는 코코아 버터 또는 폴리에틸렌 글리콜과 혼합시킴으로써 제조된다. 오일이 또한 연질 젤라틴 유형의 제제 및 좌제의 제조에 사용될 수 있다. 물, 식염수, 수성 덱스트로즈 및 관련된 슈가 용액, 및 글리세롤이 펙틴, 카보머, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 셀룰로즈 또는 카복시메틸 셀룰로즈와 같은 현탁화제뿐만 아니라 완충제 및 보전제를 또한 함유할 수 있는 현탁제의 제조에 이용될 수 있다.
상술한 이들 대표적인 투약형 이외에도, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 일반적으로 공지되어 있으며, 따라서 본 발명에 포함된다. 이러한 부형제 및 담체는 예를 들어, 마치 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 온전히 모든 목적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 ("Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991))에 기술되어 있다.
본 발명의 제제는 이하에 기술된 바와 같이 단시간-작용형, 속방출성, 장시간-작용형, 및 지속-방출성으로 디자인될 수 있다. 따라서, 약제학적 제제는 또한 조절-방출 또는 서방출을 위해서 제제화될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 예를 들어, 미셀 또는 리포좀, 또는 일부의 다른 캅셀화된 형태를 포함할 수 있거나, 또는 장시간 방출형으로 투여되어 장기간의 저장 및/또는 송달 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 약제학적 제제 및 의약은 펠릿 또는 실린더로 압축되어 데포 (depot) 주사제로서 또는 스텐트 (stent)와 같은 이식물로서 근육내 또는 피하 이식될 수 있다. 이러한 이식물은 실리콘 및 생물분해성 중합체와 같은 공지된 불활성 물질을 이용할 수 있다.
특정한 투약량은 질병의 상태, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이, 투약 간격, 투여 경로, 배설율 및 약물의 병용에 따라서 조정될 수 있다. 유효량을 함유하는 상기 투약형 중의 어떤 것이라도 일상적인 실험의 범위 내에 있으며, 따라서 본 발명의 범주 내에 있다.
치료학적 유효량은 투여의 경로 및 투약형에 따라서 달라질 수 있다. 본 발명의 바람직한 화합물 또는 화합물들은 높은 치료지수를 나타내는 제제이다. 치료 지수는 LD50과 ED50 사이의 비로 표현될 수 있는, 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량비이다. LD50은 집단의 50％에 대해서 치명적인 용량이며, ED50은 집단의 50％에서 치료학적으로 효과적인 용량이다. LD50 및 ED50은 동물세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 방법에 의해서 결정된다.
본 발명의 맥락에서 "치료"는 장애 또는 질병과 연관된 증상의 완화, 또는 이들 증상의 진행이나 악화의 중단, 또는 질병 또는 장애의 방지 또는 예방을 의미한다. 예를 들어, 전이된 혈액학적 종양을 갖는 환자를 치료하는 것과 관련하여 성공적인 치료는 종양(들) 또는 질병상태의 조직에 영양을 공급하는모세혈관의 증식의 감소, 암 성장 또는 종양, 모세혈관의 증식 또는 질병상태의 조직과 관련된 증상의 완화, 모세혈관 증식의 중단, 또는 암과 같은 질병의 진행 또는 암 세포의 성장의 중단을 포함할 수 있다. 치료는 또한, 본 발명의 약제학적 제제를 다른 치료법과 함께 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 약제학적 제제는 수술 절차 및/또는 방사선요법의 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 글리벡, BAY43-9006 및 브로스탈리신 및 안티센스 및 유전자 요법에서 사용되는 약물과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 항암 약물과 함께 투여될 수도 있다. 적절한 배합은 종양학 및 의약 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 결정될 수 있다.
암 치료와 관련하여 사용되는 것으로서 "안정한 질병상태"라는 것은 암의 성장의 중지를 의미한다. 이것은 종종 도면에 제시된 바와 같이 양전자 방출 단층촬 영술 (PET)과 같은 주사방법을 사용하여 가시화될 수 있다.
본 발명에 따르는 약제학적 제제 및 의약은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 화학식 I의 화합물 또는 그의 호변이성질체, 염 또는 혼합물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 의약 및 약제학적 제제를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 의약 및 약제학적 제제는 본 명세서에 기술된 치료방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 및 제제는 캄프토테신, 독소루비신, 시스플라틴, 이리노테칸 (CPT-11), 알킬화제, 토포이소머라제 I 및 II 억제제, 및 방사선 치료와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 항암 약물과 함께 사용하는 경우에 상승적 효과를 나타내는 것으로 나타났기 때문에, 병용요법에서 사용하는데 특히 적합하다. 또한, 본 발명의 화합물은 글리벡, BAY43-9006 및 브로스탈리신과 같은 항암 약물과 함께 사용될 수 있으며, 이들 항암 약물에 대해서 저항성인 암을 갖는 암 환자에게서의 특별한 용도를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 항암 약물과 함께 화학식 I의 화합물 및 그의 호변이성질체, 염 및/또는 혼합물을 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 제제 및 의약을 생성시키는데 있어서의 화합물, 호변이성질체, 염 및/또는 혼합물의 용도, 및 암 환자를 치료하는데 있어서의 화합물의 용도를 제공한다.
일부의 구체예에서, 본 발명은 암 환자와 같은 환자의 치료에 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한 배합제제로서 항암 약물 및 본 발명의 모든 구체예의 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼 합물을 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. 일부의 이러한 구체예에서, 환자는 글리벡, BAY43-9006 또는 브로스탈리신과 같은 적어도 하나의 항암 약물에 대해서 저항성인 암 환자이다. 일부의 이러한 구체예에서, 항암 약물 및 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물은 단일 조성물로 제공된다. 그 밖의 다른 이러한 구체예에서, 항암 약물 및 화합물, 호변이성질체, 화합물의 염, 호변이성질체의 염, 또는 이들의 혼합물은 키트의 부분으로 개별적으로 제공된다. 이러한 키트는 추가로 사용 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 다양한 대상체를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 적합한 대상체는 포유동물 및 인간과 같은 동물을 포함한다. 적합한 포유동물에는 여우원숭이 (lemurs), 에이프 (apes) 및 원숭이와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 영장류; 랫트, 마우스 및 기니아피그와 같은 설치류; 토끼 및 산토끼; 소; 말; 돼지; 염소; 양; 유대동물; 및 고양이, 개 및 곰과 같은 육식동물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 그 밖의 다른 구체예에서, 대상체 또는 환자는 마우스 또는 랫트와 같은 설치류이다. 일부의 구체예에서, 대상체 또는 환자는 인간 이외의 동물이며, 이러한 일부의 구체예에서 대상체 또는 환자는 인간 이외의 포유동물이다.
이하의 약어들이 실시예에서 사용된다:
EtOH: 에탄올
H2O: 물
HCl: 염산
HPLC: 고성능 액체 크로마토그라피
KHMDS: 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드
LiHMDS: 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드
NaHMDS: 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드
NaOH: 수산화나트륨
N2: 질소
TBME: t-부틸 메틸 에테르
THF: 테트라하이드로푸란
실시예의 화합물에 대한 명칭은 ACD 네임 버전 (ACD Name version) 5.07 소프트웨어 (2001년 11월 14일) (Advanced Chemistry Development, Inc.로부터 입수할 수 있음), 켐인노베이션 남엑스퍼트 + 노멘클래처 (ChemInnovation NamExpert + Nomenclature™) 브랜드 소프트웨어 (ChemInnovation Software, Inc.로부터 입수할 수 있음), 또는 켐오피스 (ChemOffice®) 울트라 소프트웨어 패키지 버전 7.0 (CambridgeSoft Corporation (Cambridge, MA)으로부터 입수할 수 있음)에서 이용할 수 있는 오토놈 (AutoNom) 버전 2.2를 사용하여 제공되었다. 화합물 및 출발물질 중의 일부는 표준 IUPAC 명명법을 사용하여 명명하였다.
다양한 출발물질은 시판 공급물로부터 수득할 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.
실시예 1
5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린의 합성
방법 A
Figure 112007089361312-pct00018
5-클로로-2-니트로아닐린 (500 g, 2.898 mol) 및 1-메틸 피페라진 (871 g, 8.693 mol)을 냉각기가 장착되고 N2로 퍼지된 2000 ㎖ 플라스크에 배치시켰다. 플라스크를 100℃의 오일욕에 배치하고, HPLC에 의해서 측정되는 바와 같이 5-클로로-2-니트로아닐린이 완전히 반응할 때까지 (일반적으로 밤새) 가열하였다. HPLC가 5-클로로-2-니트로아닐린의 소실을 확인한 후에, 반응 혼합물을 기계적으로 교반하면서 2500 ㎖의 실온의 물에 직접 (여전히 가온된 상태로) 부었다. 생성된 혼합물을 실온에 도달할 때까지 교반한 다음에, 이것을 여과하였다. 이렇게 수득된 황색 고체를 1000 ㎖의 물에 첨가하고, 30 분 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 여과하고, 생성된 고체를 TBME (500 ㎖, 2×)로 세척한 다음에, 러버댐 (rubber dam)을 사용하여 진공 하에서 1시간 동안 건조시켰다. 생성된 고체를 건조 트레이 (drying tray)에 옮기고, 항량이 될 때까지 진공 오븐 중에서 50℃로 건조시켜 황색 분말로서 670 g (97.8％)의 표제 화합물을 수득하였다.
방법 B
5-클로로-2-니트로아닐린 (308.2 g, 1.79 mol)을 오버헤드 교반기, 냉각기, 가스 유입구, 첨가 깔때기, 및 온도계 프로브가 장착된 4-구 5000 ㎖ 환저 플라스크에 첨가하였다. 그 후, 플라스크를 N2로 퍼지하였다. 1-메틸피페라진 (758.1 g, 840 ㎖, 7.57 mol) 및 표준도수 200 도의 에탄올 (508 ㎖)을 교반하면서 반응 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 다시 N2로 퍼지하고, 반응액을 N2 하에서 유지시켰다. 플라스크를 가열 맨틀에서 97℃ (+/- 5℃)의 내부 온도로 가열하고, HPLC에 의해서 측정되는 바와 같이 반응이 완결될 때까지 (일반적으로 약 40 시간) 이 온도에서 유지시켰다. 반응이 완료된 후에, 가열을 중지하고, 반응액을 교반하면서 약 20℃ 내지 약 25℃의 내부 온도로 냉각시키고, 반응액을 2 내지 3 시간 동안 교반하였다. 침전이 이미 나타나지 않은 한은 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린의 종자 결정 (0.20 g, 0.85 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 내부 온도를 약 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 유지시키면서 약 1 시간의 기간에 걸쳐서 물 (2,450 ㎖)을 교반된 반응 혼합물에 첨가하였다. 물의 첨가가 완료된 후에, 생성된 혼합물을 20℃ 내지 30℃의 온도에서 약 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 여과하고, 플라스크 및 여과 케이크를 물 (3×2.56 L)로 세척하였다. 황금색 고체 생성물을 진공 오븐 중에서 약 50℃로 진공 하에 416 g (98.6％ 수율)의 항량으로 건조시켰다.
방법 C
5-클로로-2-니트로아닐린 (401 g, 2.32 mol)을 오버헤드 교반기, 냉각기, 가 스 유입구, 첨가 깔때기, 및 온도계 프로브가 장착된 4-구 12 L 환저 플라스크에 첨가하였다. 그 후, 플라스크를 N2로 퍼지하였다. 1-메틸피페라진 (977 g, 1.08 L, 9.75 mol) 및 100％ 에탄올 (650 ㎖)을 교반하면서 반응 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 다시 N2로 퍼지하고, 반응액을 N2 하에서 유지시켰다. 플라스크를 가열 맨틀에서 97℃ (+/- 5℃)의 내부 온도로 가열하고, HPLC에 의해서 측정되는 바와 같이 반응이 완결될 때까지 (일반적으로 약 40 시간) 이 온도에서 유지시켰다. 반응이 완료된 후에, 가열을 중지하고, 반응액을 교반하면서 약 80℃의 내부 온도로 냉각시키고, 내부 온도를 82℃ (+/- 3℃)로 유지시키면서 1 시간의 기간에 걸쳐서 물 (3.15 L)을 첨가 깔때기를 통해서 혼합물에 첨가하였다. 물의 첨가가 완료된 후에 가열을 중지하고, 반응 혼합물을 4 시간 이상의 기간에 걸쳐서 20-25℃의 내부 온도로 냉각시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 20-30℃의 내부 온도에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 여과하고, 플라스크 및 여과 케이크를 물 (1×1 L), 50％ 에탄올 (1×1 L) 및 95％ 에탄올 (1×1 L)로 세척하였다. 황금색 고체 생성물을 건조 팬에 배치하고, 진공 오븐 중에서 약 50℃로 진공 하에 546 g (99％ 수율)의 항량으로 건조시켰다.
실시예 2
[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르의 합성
방법 A
Figure 112007089361312-pct00019
5000 ㎖의 4-구 플라스크에 교반기, 온도계, 냉각기, 및 가스 유입구/배출구를 장착하였다. 장치된 플라스크를 265.7 g (1.12 mol, 1.0 eq)의 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 및 2125 ㎖의 표준도수 200 도의 EtOH로 충전하였다. 생성된 용액을 15 분 동안 N2로 퍼지하였다. 그 다음에, 20.0 g의 5％ Pd/C (50％ H2O w/w)를 첨가하였다. 반응액을 40-50℃ (내부 온도)에서 격렬하게 교반하면서 H2로 혼합물을 통해서 거품을 일으켰다. 반응액은 HPLC에 의해서 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린의 소실에 대해 매시간 마다 모니터하였다. 일반적인 반응시간은 6 시간이었다.
5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 모두 반응으로부터 소실된 후에, 용액을 N2로 15 분 동안 퍼지하였다. 그 다음에, 440.0 g (2.25 mol)의 에틸 3-에톡시-3-이미노프로파노에이트 하이드로클로라이드를 고체로 첨가하였다. 반응이 완료될 때까지 반응액을 40-45℃ (내부 온도)에서 교반하였다. 반응은 HPLC에 의해서 디아미노 화합물의 소실을 추적함으로써 모니터하였다. 일반적인 반응시간은 1-2 시간이었다. 반응이 완료된 후에, 이것을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 (Celite) 여과물질의 패드를 통해서 여과하였다. 셀라이트 여과물질을 무수 EtOH (2×250 ㎖)로 세척하고, 여액을 감압하에서 농축시켜 농조한 갈색/오렌지색 오일을 수득하였다. 생성된 오일을 850 ㎖의 0.37％ HCl 용액에 용해시켰다. 그 후, 고체 NaOH (25 g)를 한꺼번에 첨가하였으며, 침전이 형성되었다. 생성된 혼합물을 1 시간 동안 교반한 다음에 여과하였다. 고체를 H2O (2×400 ㎖)로 세척하고, 진공 오븐 중의 50℃에서 건조시켜 연황색 분말로서 251.7 g (74.1％)의 [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르를 수득하였다.
방법 B
5000 ㎖의 4-구 자켓화 플라스크 (jacketed flask)에 기계적 교반기, 냉각기, 온도 프로브, 가스 유입구 및 오일 버블러 (oil bubbler)를 장착하였다. 장치된 플라스크를 300 g (1.27 mol)의 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 및 2400 ㎖의 표준도수 200 도의 EtOH (반응은 95％ 에탄올을 사용하여 수행될 수 있고 수행된다면, 이 반응을 위해서 표준도수 200 도의 에탄올을 사용할 필요는 없다)로 충전하였다. 생성된 용액을 교반하고, 15 분 동안 N2로 퍼지하였다. 그 다음에, 22.7 g의 5％ Pd/C (50％ H2O w/w)를 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응 용기를 15 분 동안 N2로 퍼지하였다. N2로 퍼지한 후에, 반응 용기는 느리지만 일정 한 유속의 H2를 플라스크를 통해서 유지시킴으로써 H2로 퍼지하였다. 반응액을 45-55℃ (내부 온도)에서 교반하면서, HPLC에 의해 측정된 것으로 5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 완전히 소비될 때까지 H2로 혼합물을 통해서 거품을 일으켰다. 일반적인 반응시간은 6 시간이었다.
5-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-니트로아닐린이 모두 반응으로부터 소실된 후에, 용액을 N2로 15 분 동안 퍼지하였다. 디아민 중간체는 공기에 민감하기 때문에 공기에 대한 노출을 피하도록 주의하여야 한다. 500 g (2.56 mol)의 에틸 3-에톡시-3-이미노프로파노에이트 하이드로클로라이드를 약 30 분의 기간에 걸쳐서 반응 혼합물에 첨가하였다. HPLC에 의해서 측정된 것으로서 디아민이 완전히 소비될 때까지 반응액을 N2 하에 45-55℃ (내부 온도)에서 교반하였다. 일반적인 반응시간은 약 2 시간이었다. 반응이 완료된 후에, 반응액을 가온된 상태로 셀라이트의 패드를 통해서 여과하였다. 그 후, 반응 플라스크 및 셀라이트를 표준도수 200 도의 EtOH (3×285 ㎖)로 세척하였다. 여액을 5000 ㎖ 플라스크에서 배합하고, 약 3300 ㎖의 에탄올을 감압하에서 제거하여 오렌지색 오일을 수득하였다. 물 (530 ㎖) 및 그 다음에 1 M HCl (350 ㎖)을 생성된 오일에 첨가하고, 생성된 혼합물을 교반하였다. 생성된 용액을 격렬하게 교반하면서 30％ NaOH (200 ㎖)를 내부 온도를 약 25-30℃로 유지시키면서 약 20 분의 기간에 걸쳐서 첨가하였으며, 이때에 pH는 9 내지 10으로 되었다. 생성된 현탁액을 내부 온도를 약 20-25℃로 유지시키면서 약 4 시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 H2O (3×300 ㎖)로 세척하였다. 수집된 고체를 진공 오븐 중에서 진공 하에 50℃로 항량이 될 때까지 건조시켜 연황색 분말로서 345.9 g (90.1％)의 [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르를 수득하였다. 대용 후처리 방법에서는, 여액을 합하고 에탄올은 적어도 약 90％가 제거될 때까지 진공 하에서 제거하였다. 그 후, 생성된 오일에 중성 pH에서 물을 첨가하고, 용액을 약 0℃로 냉각시켰다. 그 후, 20％ NaOH 수용액을 빠르게 교반하면서 서서히 첨가하여 9.2 (pH 미터로 판독함)까지의 pH가 되도록 하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 여과하고, 상술한 바와 같이 건조시켰다. 대용 후처리 방법으로 97％ 정도로 높은 수율로 담황갈색 내지 담황색의 생성물을 수득하였다.
실시예 3
[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르의 수분 함량을 감소시키는 방법
미리 후처리하고 약 8-9％ H2O의 수분 함량으로 건조시킨 [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르 (120.7 g)를 2000 ㎖의 환저 플라스크에 배치하고, 무수 에탄올 (500 ㎖)에 용해시켰다. 호박색 용액을 모든 용매가 제거될 때까지 가열하면서 회전증발기를 사용하여 농조한 오일로 농축시켰다. 이 과정을 2 회 더 반복하였다. 이렇게 수득된 농조한 오일이 플라스크 내에 잔류하며, 50℃에서 밤새 가열된 진공 오븐 내에 배치하였다. 칼피셔 분석 결과는 5.25％의 수분 함량을 나타내었다. 이 방법에 의해서 수득된 더 낮은 수분 함량은 실시예 4의 방법에서 증가된 수율을 제공하였다. 이 건조공정을 위해서 톨루엔 및 THF와 같은 다른 용매가 에탄올을 대신하여 사용될 수 있다.
실시예 4
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 합성
방법 A
Figure 112007089361312-pct00020
[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르 (250 g, 820 mmol) (상술한 바와 같이 에탄올에 의해 건조됨)를 냉각기, 기계적 교반기, 온도 프로브가 장착되고 아르곤으로 퍼지한 5000 ㎖ 플라스크 내에서 THF (3800 ㎖)에 용해시켰다. 2-아미노-6-플루오로-벤조니트릴 (95.3 g, 700 mmol)을 용액에 첨가하고, 내부 온도를 40℃로 상승시켰다. 모든 고체가 용해하고, 용액 온도가 40℃에 도달하면, 고체 KHMDS (376.2 g, 1890 mmol)를 5 분의 기간에 걸쳐서 첨가하였다. 칼륨 염기의 첨가가 완료되면, 불균질한 황색 용액이 수득되었으며, 내부 온도는 62℃로 상승하였다. 60 분의 기간 후에, 내부 온도는 다시 40℃로 저하하였으며, 반응은 HPLC에 의해서 완료된 것으로 측정되었다 (출발물질이나 폐환되지 않은 중간체가 존재하지 않음). 그 후, 농조한 반응 혼합물은 이것을 H2O (6000 ㎖)에 붓고 생성된 혼합물을 실온에 도달할 때까지 교반함으로써 켄칭하였다. 그 후, 혼합물을 여과하고, 여과 패드를 물 (1000 ㎖ 2×)로 세척하였다. 밝은 황색 고체를 건조 트레이 내에 배치하고, 50℃의 진공 오븐 내에서 밤새 건조시켜 155.3 g (47.9％)의 목적하는 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온을 수득하였다.
방법 B
5000 ㎖의 4-구 자켓화 플라스크에 증류장치, 온도 프로브, N2 가스 유입구, 첨가 깔때기 및 기계적 교반기를 장착하였다. [6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르 (173.0 g, 570 mmol)를 반응기에 충전하고, 반응기를 15 분 동안 N2로 퍼지하였다. 그 후, 무수 THF (2600 ㎖)를 교반하면서 플라스크에 충전하였다. 모든 고체가 용해된 후에, 용매는 필요에 따라 열을 사용하여 증류 (진공 또는 대기 (고압은 물의 제거를 돕는다))시킴으로써 제거하였다. 1000 ㎖의 용매를 제거한 후에, 증류를 중지하고, 반응액을 N2로 퍼지하였다. 그 후, 1000 ㎖의 무수 THF를 반응 용기에 첨가한 다음에, 모든 고체가 용해되면 별도의 1000 ㎖의 용매가 제거될 때까지 증류 (진공 또는 대기)를 다시 수행하였다. 무수 THF를 첨가하고 용매를 제거하는 이 공정을 적어도 4 회 반복하고 (4 회째의 증류시에는 처음 3 회의 증류에서와 같이 단지 40％ 대신에 60％의 용매가 제거된다), 그 후에 1 ㎖의 샘플을 수분 함량을 측정하는 칼피셔 분석을 위해서 분리하였다. 분석에 의해서 샘플이 0.20％ 미만의 물을 함유한 것으로 나타나면, 이하 의 단락에 기술된 바와 같이 반응을 계속하였다. 그러나, 분석 결과가 0.20％ 이상의 물을 나타낸다면, 상술한 건조공정을 0.20％ 미만의 수분 함량이 달성될 때까지 계속하였다.
이전 단락에 기술된 과정을 사용하여 약 0.20％ 이하의 수분 함량이 달성된 후에, 증류장치를 환류 냉각기로 교체하고, 반응액에 2-아미노-6-플루오로-벤조니트릴 (66.2 g, 470 mmol) (일부의 과정에서는 0.95 당량이 사용된다)을 충전하였다. 그 후, 반응액을 38-42℃의 내부 온도로 가열하였다. 내부 온도가 38-42℃에 도달하면, 첨가하는 중에 약 38-50℃의 내부 온도를 유지시키면서 KHMDS 용액 (1313 g, 1.32 mol, THF 중의 20％ KHMDS)을 첨가 깔때기를 통해서 5 분의 기간에 걸쳐 반응액에 첨가하였다. 칼륨 염기의 첨가가 완료되면, 내부 온도를 38-42℃에서 유지시키면서 반응액을 3.5 내지 4.5 시간 동안 교반하였다 (일부의 예에서, 이것은 30 내지 60 분 동안 교반하였으며, 반응은 이 시간 내에 완료될 수 있다). 그 후, 반응액의 샘플을 분리하여 HPLC에 의해서 분석하였다. 반응이 완료되지 않았다면, 추가의 KHMDS 용액을 5 분의 기간에 걸쳐서 플라스크에 첨가하였으며, 반응액을 38-42℃에서 45-60 분 동안 교반하였다 (첨가된 KHMDS 용액의 양은 다음에 의해서 결정되었다: IPC 비가 < 3.50이면 125 ㎖가 첨가되었으며; 10.0 ≥IPC 비 ≥ 3.50이면 56 ㎖가 첨가되었고; 20.0≥IPC 비≥ 10이면 30 ㎖가 첨가되었다. IPC 비는 폐환되지 않은 중간체에 상응하는 면적으로 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온)에 상응하는 면적을 나눈 값에 해당한다). 일단 반응이 완료되면 (IPC 비 > 20), 반응기를 25-30℃ 의 내부 온도로 냉각시키고, 25-35℃에서 내부 온도를 유지시키면서 반응기에 물 (350 ㎖)을 15 분의 기간에 걸쳐서 충전하였다 (한가지 대체예에서, 반응은 40℃에서 수행하고, 물은 5 분 이내에 첨가한다. 더 빠른 켄칭은 시간의 경과에 따라 형성되는 불순물의 양을 감소시킨다). 그 후, 환류 냉각기를 증류장치로 교체하고, 용매는 필요에 따라 열을 사용하여 증류 (진공 또는 대기)시킴으로써 제거하였다. 1500 ㎖의 용매를 제거한 후에, 증류를 중지하고, 반응액을 N2로 퍼지하였다. 그 후, 20-30℃에서 내부 온도를 유지시키면서 물 (1600 ㎖)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 20-30℃에서 30 분 동안 교반한 후에, 이것을 5-10℃의 내부 온도로 냉각시키고 1 시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 플라스크 및 여과 케이크를 물 (3×650 ㎖)로 세척하였다. 이렇게 수득된 고체를 진공 오븐 중의 50℃에서 진공 하에 항량이 될 때까지 건조시켜 황색 분말로서 103.9 g (42.6％ 수율)의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온을 수득하였다.
방법 C
Figure 112007089361312-pct00021
[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-아세트산 에틸 에스테르 (608 g, 2.01 mol) (건조됨) 및 2-아미노-6-플루오로-벤조니트릴 (274 g, 2.01 mol)을 가열 맨틀 상에 고정되고, 냉각기, 기계적 교반기, 가스 유입구, 및 온도 프로브가 장착된 4-구 12 L 플라스크에 충전하였다. 반응 용기를 N2로 퍼지하고, 톨루엔 (7.7 L)을 반응 혼합물에 충전하면서 이것을 교반하였다. 반응 용기를 다시 N2로 퍼지하고, N2 하에서 유지시켰다. 혼합물의 내부 온도는 63℃ (+/- 3℃)의 온도가 달성될 때까지 상승시켰다. 혼합물의 내부 온도를 63℃ (+/- 3℃)에서 유지시키면서 약 2.6 L의 톨루엔을 감압 (380 +/- 10 토르, 증류 헤드 t = 40℃ (+/- 10℃) 하에서 플라스크로부터 증류시켰다 (칼피셔 분석을 사용하여 혼합물 중의 수분 함량을 검사하였다. 수분 함량이 0.03％보다 큰 경우에는 추가로 2.6 L의 톨루엔을 첨가하고 증류를 반복하였다. 이 공정을 0.03％ 미만의 수분 함량이 달성될 때까지 반복하였다). 0.03％ 미만의 수분 함량에 도달한 후에, 가열을 중단하고 반응액을 N2 하에서 17-19℃의 내부 온도로 냉각시켰다. 그 후, THF 중의 칼륨 t-부톡사이드 (THF 중의 20％; 3.39 ㎏, 6.04 moles 칼륨 t-부톡사이드)를 반응액의 내부 온도가 20℃ 이하로 유지되도록 하는 속도로 N2 하에서 반응액에 첨가하였다. 칼륨 t-부톡사이드의 첨가가 완료된 후에, 반응액을 20℃ 미만의 내부 온도에서 30 분 동안 교반하였다. 그 후, 온도를 25℃로 상승시키고, 반응액을 적어도 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 온도를 30℃로 상승시키고, 반응액을 적어도 30 분 동안 교반하였다. 그 후, 출발물질의 소비를 검사하기 위한 HPLC를 사용하여 반응의 완료를 모니터하였다 (일반적으로 2-3 시간 내에, 출발물질은 둘 다 소비되었다 (HPLC 면적％로 0.5％ 미만)). 2 시간 후에 반응이 완료되지 않았다면, 추가로 0.05 당량의 칼륨 t-부톡사이드를 한꺼번에 첨가하고, HPLC가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 공정을 완료시켰다. 반응이 완료된 후에, 650 ㎖의 물을 교반된 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 후, 반응액을 50℃의 내부 온도로 가온하고, THF를 감압 하에서 반응 혼합물로부터 증류시켜 제거하였다 (약 3 L 부피). 그 후, 물 (2.6 L)을 첨가 깔때기를 사용하여 반응 혼합물에 적가하였다. 그 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 적어도 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 물 (1.2 L), 70％ 에탄올 (1.2 L), 및 95％ 에탄올 (1.2 L)로 세척하였다. 밝은 황색 고체를 건조 트레이 내에 놓고, 항량이 얻어질 때까지 50℃의 진공 오븐 내에서 건조시켜 674 g (85.4％)의 목적하는 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온을 수득하였다.
실시예 5
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 정제
냉각기, 온도 프로브, N2 가스 유입구, 및 기계적 교반기가 장착된 3000 ㎖ 4-구 플라스크를 가열 맨틀 내에 배치하였다. 그 후, 플라스크를 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온 (101.0 g, 0.26 mol)으로 충전하고, 황색 고체를 95％ 에탄올 (1000 ㎖)에 현탁시키고 교반하였다. 일부의 경우에는 8:1 용매비가 사용된다. 그 후, 현탁액을 약 1 시간의 기간에 걸쳐서 교반하면서 온화하게 환류하도록 (약 76℃의 온도) 가열하였다. 그 후, 반응액을 환류시키면서 45-75 분 동안 교반하였다. 이 시점에서, 플라스크로부터 열을 치우고, 현탁액을 25-30℃의 온도로 냉각시켰다. 그 후, 현탁액을 여과하고, 여과 패드를 물 (2×500 ㎖)로 세척하였다. 그 후, 황색 고체를 건조 트레이 내에 놓고, 항량이 얻어질 때까지 (일반적으로 16 시간) 50℃의 진공 오븐 내에서 건조시켜 97.2 g (96.2％)의 정제된 생성물을 황색 분말로서 수득하였다.
실시예 6
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 락트산 염의 제조
Figure 112007089361312-pct00022
3000 ㎖의 4-구 자켓화 플라스크에 냉각기, 온도 프로브, N2 가스 유입구 및 기계적 교반기를 장착하였다. 반응 용기를 적어도 15 분 동안 N2로 퍼지한 다음에, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온 (484 g, 1.23 mol)을 충전하였다. D,L-락트산 (243.3 g, 1.72 mol의 모노머 - 이하의 단락 참조), 물 (339 ㎖) 및 에탄올 (1211 ㎖)의 용액을 제조한 다음 에 반응 플라스크에 충전하였다. 교반은 중간 속도로 개시하고, 반응액은 68-72℃의 내부 온도로 가열하였다. 반응액의 내부 온도는 15-45 분 동안 68-72℃에서 유지시켰으며, 그 다음에 가열을 중단하였다. 생성된 혼합물을 10-20 미크론 프릿 (frit)을 통해서 여과하여 여액을 12 L 플라스크 내에 수집하였다. 12 L 플라스크에 내부 온도 프로브, 환류 냉각기, 첨가 깔때기, 가스 유입구 및 배출구 및 오버헤드 교반기를 장착시켰다. 그 후, 여액을 중간 속도로 교반하고, 환류하도록 가열하였다 (약 78℃의 내부 온도). 온화한 환류를 유지시키면서, 에탄올 (3,596 ㎖)을 약 20 분의 기간에 걸쳐서 플라스크에 충전하였다. 그 후, 반응 플라스크를 15-25 분 이내에 약 64-70℃ 범위의 내부 온도로 냉각시키고, 이 온도를 약 30 분의 기간 동안 유지시켰다. 반응기를 결정에 대해서 조사하였다. 결정이 존재하지 않으면, 플라스크에 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 락트산 염의 결정 (484 ㎎, 0.1 mol％)을 플라스크에 첨가하고, 반응액을 64-70℃에서 30 분 동안 교반한 후에 다시 결정에 대해서 플라스크를 조사하였다. 일단 결정이 존재하면, 교반을 저속으로 감소시키고, 반응액을 추가로 90 분 동안 64-70℃에서 교반하였다. 그 후, 반응액을 약 2 시간의 기간에 걸쳐서 약 0℃로 냉각시키고, 생성된 혼합물을 25-50 미크론 프릿 필터를 통해서 여과하였다. 반응기를 에탄올 (484 ㎖)로 세척하고, 내부 온도가 약 0℃가 될 때까지 교반하였다. 냉 에탄올을 사용하여 여과 케이크를 세척하고, 이 과정을 2 회 더 반복하였다. 수집된 고체를 진공 오븐 내에서 진공 하에 50℃에서 항량으로 건조시켜 510.7 g (85.7％)의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1- 일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온의 결정성 황색 락트산 염을 수득하였다. 여과공정 중에는 일반적으로 러버댐 또는 불활성 조건이 사용되었다. 건조 고체는 매우 흡습성인 것으로 보이지는 않지만, 습윤 여과 케이크는 물을 포집하여 점성으로 되는 경향이 있다. 습윤 여과 케이크가 대기에 장기간 노출되는 것은 피하도록 주의를 기울여야 한다.
시판되고 있는 락트산은 일반적으로 8-12％ w/w 물을 함유하며, 모노머성 락트산 이외에도 다이머 (dimer) 및 트라이머 (trimer)를 함유한다. 락트산 다이머 대 모노머의 몰비는 일반적으로 약 1.0:4.7이다. 시판되는 등급의 락트산을 이전 단락에서 기술된 공정에서 사용할 수 있는데, 이는 반응 혼합물로부터 모노락테이트 염이 선택적으로 침전하기 때문이다.
대사산물의 확인
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온 (화합물 1)의 두 개의 대사산물은 본 명세서에 포함된 문헌에 기술된 바와 같은 2 주일 독성시험으로부터 저류된 랫트 혈장에서 확인되고 특정화되었다. 두 가지의 확인된 대사산물은 이하에 나타낸 피페라진 N-옥사이드 화합물 (화합물 2) 및 N-탈메틸화된 화합물 (화합물 3)이었다.
Figure 112007089361312-pct00023
화합물 1-3의 IC 50
다수의 단백질 타이로신 키나제의 키나제 활성은 후술하는 방법을 사용하여 화합물 1-3에 대해서 측정하여 이하의 표에 제시된 IC50 값을 제공하였다.
화합물 1-3의 IC50
화합물 IC50 (μM)
VEGFR flt VEGFR flk1 bFGFR PDGFR Flt3 c-kit
화합물 1 0.010 0.013 0.008 0.027 0.0001 0.0015
화합물 2 0.004 0.009 0.005 0.010 0.0004 0.0002
화합물 3 0.019 0.012 0.019 0.037 0.0001 0.0002
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-4-옥시도피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 2) 및 4-아미노-5-플루오로-3-(6-피페라진-1-일-1H-벤즈 이미 다졸-2-일)퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 3)의 합성
화합물 1의 확인된 대사산물의 구조를 확인하기 위하여 대사산물을 독립적으 로 합성하였다.
화합물 2인 화합물 1의 N-옥사이드 대사산물은 이하의 반응식에 나타낸 바와 같이 합성하였다. 화합물 1을 에탄올, 디메틸아세트아미드 및 과산화수소의 혼합물 중에서 가열하였다. 반응이 완료되면, 화합물 2를 여과에 의해서 분리하고, 에탄올로 세척하였다. 필요한 경우에, 생성물은 칼럼 크로마토그라피에 의해서 더 정제할 수 있다.
Figure 112007089361312-pct00024
화합물 3인 화합물 1의 N-데스메틸 대사산물은 이하의 반응식에 나타낸 바와 같이 합성하였다. 5-클로로-2-니트로아닐린을 피페라진으로 처리하여 생성물 4를 수득하고, 이어서 이것을 부틸옥시카보닐 (Boc) 기로 보호하여 생성물 5를 수득하였다. 니트로기를 환원시키고, 이어서 3-에톡시-3-이미노프로피온산 에틸 에스테르와 축합시켜 생성물 6을 수득하였다. 생성물 6을 염기로서 칼륨 헥사메틸디실라지드를 사용하여 6-플루오로안트라닐로니트릴과 축합시켜 생성물 7을 수득하였다. 조생성물 7을 수성 HCl로 처리하여 정제한 후에 황/갈색 고체로서 목적하는 대사산물을 수득하였다.
Figure 112007089361312-pct00025
시험방법
세린/트레오닌 키나제
다양한 단백질 세린/트레오닌 키나제의 키나제 활성은 ATP 및 포스포릴화를 위한 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기를 함유하는 적합한 펩타이드 또는 단백질을 제공하고, 세린 또는 트레오닌 잔기에 대한 포스페이트 부위의 전이를 시험함으로써 측정되었다. 다수의 화학식 I, II 및 III의 화합물의 합성 및 시험 활성은 모두 이에 의해서 마치 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 온전히 모든 목적으로 참고로 포함되어 있는 이하의 문헌들에 기술되어 있다: 미국 특허 제 6,605,617 호; 공개된 미국 특허출원 제 2004/0092535 호; 2004년 11월 5일에 출원된 미국 특허출원 제 10/983,174 호; 및 공개된 미국 특허출원 제 2004/0220196 호. GSK-3, RSK-2, PAR-1, NEK-2 및 CHK1 효소의 키나제 영역을 함유하는 재조합체 단백질을 바큘로바이러스 (Baculovirus) 발현 시스템 (InVitrogen)을 사용하여 Sf9 곤충세포에서 발현시키고, Glu 항체 상호작용을 통해 (Glu-에피토프 표지된 구조물의 경우 ), 또는 금속 이온 크로마토그라피에 의해서 (His6 (SEQ ID NO: 1) 표지된 구조물의 경우) 정제하였다. Cdc2 (GST 융합 구조물) 및 사이클린 B를 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 Sf9 곤충세포에서 공동-발현시켰다. 재조합체 활성 Cdk2/사이클린 A는 시판품으로 이용할 수 있으며, 업스테이트 바이오테크놀로지 (Upstate Biotechnology)로부터 구입하였다. 이 시험에서 사용된 정제된 Cdc2 효소는 시판품으로 이용할 수 있었으며, 이것은 뉴잉글랜드 바이오랩 (New England Bio Labs)로부터 구입할 수 있다. 각각의 시험을 위해서, 시험 화합물은 DMSO 중에서 계열 희석한 다음에, 적절한 키나제 반응 완충액 + 5-10 nM의 33P 감마-표식된 ATP와 혼합하였다. 키나제 단백질 및 적절한 비오티닐화 펩타이드 기질을 첨가하여 150 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. 반응액을 실온에서 3-4 시간 동안 배양한 다음에, 100 ㎕의 정지반응 완충액을 함유하는 스트렙타비딘-코팅된 화이트 미량역가 플레이트 (white microtiter plate) (Thermo Labsystems)에 전이시킴으로써 반응을 정지시켰다. 정지반응 완충액은 50 mM 비표식된 ATP 및 30 mM EDTA로 구성된다. 1 시간 동안 배양한 후에, 스트렙타비딘 플레이트를 PBS로 세척하고, 웰당 200 ㎕ 마이크로신트 (Microscint) 20 섬광 유체를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 톱카운트 (TopCount)를 사용하여 계수하였다. 50％ 억제를 위한 각각의 화합물의 농도 (IC50)는 XL Fit 데이타 분석 소프트웨어를 사용하는 비-선형 회귀를 이용하여 계산하였다.
반응 완충액은 30 mM 트리스-HCl2 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM 베타-글리세로포스페이트, 5 mM MnCl2, 0.01％ BSA/PBS, 0.5 μM 펩타이드 기질, 및 1 μM 비표식된 ATP를 함유하였다. GSK-3 효소는 27 nM로 사용되었으며, CHK1은 5 nM, Cdc2는 1 nM, Cdk2는 5 nM, 및 Rsk2는 0.044 단위/㎖로 사용되었다. GSK-3 시험의 경우에는, 비오틴-CREB 펩타이드 (비오틴-SGSGKRREILSRRP(pS)YR-NH2 (SEQ ID NO: 4))가 사용되었다. CHK1 시험의 경우에는, 비오틴-Cdc25c 펩타이드 (비오틴-[AHX]SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR[CONH2] (SEQ ID NO: 5))가 사용되었다. Cdc2 및 Cdk2 시험을 위해서는 비오틴-히스톤 H1 펩타이드 ([Ic비오틴]GGGGPKTPKKAKKL[CONH2] (SEQ ID NO: 6))가 사용되었다. Rsk2 시험에서는 비오틴-p70 펩타이드, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 2.7 μM PKC 억제제 펩타이드, 및 2.7 μM PKA 억제제 펩타이드가 사용되었다.
타이로신 키나제
다수의 단백질 타이로신 키나제의 키나제 활성은 ATP 및 포스포릴화를 위한 타이로신 아미노산 잔기를 함유하는 적절한 펩타이드 또는 단백질을 제공하고, 타이로신 잔기에 대한 포스페이트 부위의 전이를 시험함으로써 측정되었다. FLT-1 (VEGFR1), VEGFR2, VEGFR3, Tie-2, PDGFRα, PDGFRβ 및 FGFR1 수용체의 세포질 영역에 상응하는 재조합체 단백질을 바큘로바이러스 발현 시스템 (InVitrogen)을 사용하여 Sf9 곤충세포에서 발현시켰으며, Glu 항체 상호작용을 통해 (Glu-에피토프 표지된 구조물의 경우), 또는 금속 이온 크로마토그라피에 의해서 (His6 (SEQ ID NO: 1) 표지된 구조물의 경우) 정제할 수 있다. 각각의 시험을 위해서, 시험 화합물은 DMSO 중에서 계열 희석한 다음에, 적절한 키나제 반응 완충액 + ATP와 혼합하였다. 키나제 단백질 및 적절한 비오티닐화 펩타이드 기질을 첨가하여 50-100 ㎕의 최종 부피를 제공하고, 반응액을 실온에서 1-3 시간 동안 배양한 다음에, 25-50 ㎕의 45 mM EDTA, 50 mM Hepes pH 7.5를 첨가함으로써 정지시켰다. 정지된 반응 혼합물 (75 ㎕)을 스트렙타비딘-코팅된 미량역가 플레이트 (Boehringer Mannheim)에 전이시키고, 1 시간 동안 배양하였다. 포스포릴화된 펩타이드 생성물은 DELFIA 시험 완충액을 항체 희석을 위해서 1 mM MgCl2로 보충하는 변형을 행하여, 유로피움 (Europium) 표식된 항-포스포타이로신 항체 PT66을 사용하는 DELFIA 시분해 형광 시스템 (Wallac 또는 PE Biosciences)에 의해서 측정하였다. 시분해된 형광은 월락 (Wallac) 1232 DELFIA 형광계 또는 PE 빅터 (Victor) II 다중 시그날 판독기 상에 판독하였다. 50％ 억제를 위한 각각의 화합물의 농도 (IC50)는 XL Fit 데이타 분석 소프트웨어를 사용하는 비-선형 회귀를 이용하여 계산하였다.
FLT-1, VEGFR2, VEGFR3, FGFR3, Tie-2 및 FGFR1 키나제는 50 mM Hepes pH 7.0, 2 mM MgCl2, 10 mM MnCl2, 1 mM NaF, 1 mM DTT, 1 ㎎/㎖ BSA, 2 μM ATP, 및 0.20-0.50 μM의 상응하는 비오티닐화된 펩타이드 기질 내에서 시험하였다. FLT-1, VEGFR2, VEGFR3, Tie-2 및 FGFR1 키나제는 각각 0.1 ㎍/㎖, 0.05 ㎍/㎖, 또는 0.1 ㎍/㎖로 첨가되었다. PDGFR 키나제 시험의 경우에는 ATP 및 펩타이드 기질 농도를 1.4 μM ATP, 및 0.25 μM 비오틴-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2) 펩타이 드 기질로 변화시키는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일한 완충액 조건을 갖는 120 ㎍/㎖ 효소가 사용되었다.
재조합체 및 활성 타이로신 키나제 Fyn, 및 Lck는 시판품을 이용할 수 있으며, 업스테이트 바이오테크놀로지로부터 구입하였다. 각각의 시험을 위해서, 시험 화합물은 DMSO 중에서 계열 희석한 다음에, 적절한 키나제 반응 완충액 + 10 nM 33P 감마-표식된 ATP와 혼합하였다. 키나제 단백질 및 적절한 비오티닐화 펩타이드 기질을 첨가하여 150 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. 반응액을 실온에서 3-4 시간 동안 배양한 다음에, 100 mM EDTA 및 50 μM 비표식된 ATP의 100 ㎕의 정지반응 완충액을 함유하는 스트렙타비딘-코팅된 화이트 미량역가 플레이트 (Thermo Labsystems)에 전이시킴으로써 반응을 정지시켰다. 1 시간 배양한 후에, 스트렙타비딘 플레이트를 PBS로 세척하고, 웰당 200 ㎕ 마이크로신트 20 섬광 유체를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 톱카운트를 사용하여 계수하였다. 50％ 억제를 위한 각각의 화합물의 농도 (IC50)는 XL Fit 데이타 분석 소프트웨어를 사용하는 비-선형 회귀를 이용하여 계산하였다.
Fyn, Lck 및 c-ABL을 위한 키나제 반응 완충액은 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 15 mM MgCl2, 30 mM MnCl2, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 25 mM 베타-글리세롤 포스페이트, 0.01％ BSA/PBS, 0.5 μM의 적절한 펩타이드 기질 (비오티닐화된 Src 펩타이드 기질: Fyn 및 Lck의 경우에는 비오틴-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2 (SEQ ID NO: 3)), 1 μM 비표식된 ATP, 및 1 nM 키나제를 함유하였다.
c-Kit 및 FLT-3의 키나제 활성은 ATP, 및 포스포릴화를 위한 타이로신 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 또는 단백질을 제공하고, 타이로신 잔기에 대한 포스페이트 부위의 전이를 시험함으로써 측정되었다. c-Kit 및 FLT-3 수용체의 세포질 영역에 상응하는 재조합체 단백질은 구입하였다 (Proquinase). 시험을 위해서, 예시된 화합물, 예를 들어, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온을 DMSO 중에서 희석시킨 다음에, 이하에 기술하는 키나제 반응 완충액 + ATP와 혼합시켰다. 키나제 단백질 (c-Kit 또는 FLT-3) 및 비오티닐화된 펩타이드 기질 (비오틴-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2))을 첨가하여 100 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. 이들 반응액을 실온에서 2 시간 동안 배양한 다음에, 50 ㎕의 45 mM EDTA, 50 mM HEPES, pH 7.5를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 정지된 반응 혼합물 (75 ㎕)을 스트렙타비딘-코팅된 미량역가 플레이트 (Boehringer Mannheim)에 전이시키고, 1 시간 동안 배양하였다. 포스포릴화된 펩타이드 생성물은 DELFIA 시험 완충액을 항체 희석을 위해서 1 mM MgCl2로 보충하는 변형을 행하여, 유로피움-표식된 항-포스포타이로신 항체 PT66을 사용하는 DELFIA 시분해 형광 시스템 (Wallac 또는 PE Biosciences)에 의해서 측정하였다. 시분해된 형광값은 월락 1232 DELFIA 형광계 또는 PE 빅터 II 다중 시그날 판독기 상에 판독하였다. 50％ 억제를 위한 각각의 화합물의 농도 (IC50)는 XL Fit 데이타 분석 소프트웨어를 사용하는 비-선형 회귀를 이용하여 계산하였다.
FLT-3 및 c-Kit 키나제는 50 mM Hepes pH 7.5, 1 mM NaF, 2 mM MgCl2, 10 mM MnCl2, 및 1 ㎎/㎖ BSA, 8 μM ATP, 및 1 μM의 상응하는 비오티닐화된 펩타이드 기질 (비오틴-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2) 내에서 시험하였다. FLT-3 및 c-Kit 키나제의 농도는 2 nM에서 시험하였다.
전임상적 다발성 골수종 모델에서 4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸피페라진 -1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]퀴놀린-2(1H)-온 효능의 실시간 및 포괄적 영상화 평가
조혈성 골수에서 형질구의 클론 확장을 특징으로 하는 B-세포 신생물인 다발성 골수종 (MM)은 통상적인 고용량 화학요법의 도입에도 불구하고 내재성 또는 획득된 약물 저항성의 발생에 기인하여 치명적인 혈액학적 악성종양으로 잔존한다. MM이 선택적으로 유도되고 성장하는 골수 미소환경은 MM에 대한 통상적 및 신규의 치료법에 대한 저항성을 발생시키는데 결정적인 역할을 하는 것으로 입증되었다. 따라서, MM 세포뿐만 아니라 MM 세포-골수 미소환경 상호작용도 표적화하는 분자적으로 표적화된 약제가 MM을 치료하는 잠재적인 기회를 제공한다. MM의 분자 병리학을 이해하는데 있어서의 최근의 진보는 이 질병을 치료하는 새로운 치료학적 표적을 제공하였다. t(4;14) 염색체 전좌로 인하여 역 15％ MM 환자에게서 나타나며, 임상적으로 특히 열등한 예후를 부여하는, 전위적으로 발현되고 조절해제된 FGFR-3는 MM에 대한 매력적인 치료제가 되었다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)은 VEGFR-2 및 PDGFR (키나제 시험에서 IC50 ~20 nM) 및 FGFR-3 (키나제 시험에서 IC50 ~5 nM)을 포함하는 다수의 수용체 타이로신 키나제를 표적화하는 소분자 억제제이다. 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온은 시험관내의 FGFR-3 돌연변이체 MM 세포에서 FGFR-3 자가포스포릴화 및 세포 증식을 억제하는 것으로 입증되었다 (S. Trudel et al.; Blood; 인쇄 중임). 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항골수종 효능을 평가하기 위해서, 생체내 전임상 MM 모델이 개발되었는데, 여기에서는 다-기관 MM 병소가 루시퍼라제의 구조물에 의해서 안정적으로 형질감염된 돌연변이체 FGFR-3 (Y373C)를 발현하는 인간 KMS-11-luc 세포를 꼬리 정맥에 정맥내 주사한 후에 발생되었다. 생물발광성 영상 (BLI)을 사용하여 KMS-11-luc MM 종양의 생체내 성장 및 전이를 비-침습성으로 모니터하였다. 전이성 병소의 조기 검출 및 성장에 대한 일련의 포괄적 모니터링은 이 모델을 사용한 BLI에 의해서 성공적으로 포착되었다. 거의 모든 KMS-11-luc 종양세포-주입된 동물은 26일 정도로 빠르게 MM 병소를 발생시키는 것으로 확인되었으며, 이 병소는 주로 척추, 두개골 및 골반에 국재화되어 이 모델에서 마비의 빈번한 발생을 야기하였다. 이러한 정맥내 주사된 생체내 KMS-11-luc MM 모델에서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항-골수종 효능이 조사되었으며, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온을 생체내의 KMS-11-luc 종양에서 ERK의 포스포릴화를 억제하는 것으로 입증된 용량인 20 ㎎/㎏으로 매일 경구 투여하는 것은 일련의 BLI 영상에 의해서 검출되는 바와 같이 KMS-11 종양 성장의 현저한 억제를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 4-아미노-5-플루오로-3-[6- (4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항종양 성장 활성은 비히클 처리군에 비해 동물 생존율에서의 유의적인 개선이 있는 것으로 재생되었다. 이들 시험은 MM 환자에게서 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 임상실험을 위한 추가의 전임상적 근거를 제공하며, 이러한 KMS-11-luc 생체내 모델에서 통상적이거나 그 밖의 다른 분자적으로 표적화된 약제와의 병용요법에서의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 추가의 평가를 허가한다.
18 마리 (약 8 주령)의 면역결핍성 SCID-베이지 마우스의 코호트를 잭슨 래보래토리 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 수득하였으며, 12 시간 명/암 주기를 갖는 멸균 필터-톱 케이지 (filter-top cages) 내의 배리어 설비 (barrier facility) 내에 수용하였다. 모든 실험은 국제 실험동물관리 공인협회 (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)에 의해서 인정된 설비 내에서, 실험동물관리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee) 및 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침 (Guide for The Care and Use of Laboratory Animals) (National Reseach Council)의 모든 지침에 따라 수행되었다. FGFR-3 돌연변이체 (Y373C)를 수용하는 KMS-22-luc-MM 세포를 이스코브 배지 (Iscove's Media) + 10％ FBS + L-글루타민 중에서 배양하고, 1:2 내지 1:4의 범위로 주당 2 회 통과시켰다. 세포를 10×106 세포/100 ㎕ HBSS/마우스로 꼬리 정맥 내에 정맥내 주사함으로써 이식하였다. 마우스는 세포 이식을 한 날에 3 GY (3.2 분)로 방사선조사하였다. 동물은 KOM11-luc 세포를 주사한 후 48 시간째에 시작하여 20 ㎎/㎏의 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 또는 비히클 (n = 각 군당 9)로 매일 경구적으로 처리하였다. 생물발광성 영상 (BLI)은 차광 카메라 박스 내에 장착된 고감도 냉각 CCD 카메라를 포함하는 IVIS 영상시스템 (Xenogen)을 사용하여 수득되었다. 광자/초로 정량화되는 생물발광성 시그날의 영상 및 측정은 8일째에 및 그 후 일주일에 한번 씩 획득하였다. 동물 체중은 일주일에 2 회 모니터하였으며, 임상적 관찰은 매일 기록하였다. 동물 관리 규정 및 지침에 따라서 마비 또는 그들의 생활의 품질에 있어서 주된 위태로움이 있는 경우에는 마우스를 CO2 흡입에 의해서 희생시켰다.
결과
KMS-11-luc 세포를 SCID-베이지 마우스에게 정맥내로 주사한 지 8일 후에, 전신 영상은 세포 성장 및 아마도, 주로 폐, 간 및 비장을 포함한 골격외 부분에 국재화되는 MM 병변의 발생을 나타내었다. 두개골, 골반 및 척추를 포함한 전형적인 범발성 다발성 골수종 병변은 도 1의 BLI 영상에서 나타나는 바와 같이 41일과 48일 사이에 대부분의 마우스에게서 명백하게 관찰되었으며, 이것은 뒷다리 마비와 연관되어 프로토콜에 따라서 마우스의 희생을 야기하였다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 항골수종 효능은 이러한 생체내 모델에서의 KMS-11-luc에서 시험 하였다. 마우스는 KMS-11-luc 세포를 주사한 지 48 시간 후에 20 ㎎/㎏으로 58회의 매일 경구적 치료를 행하기 시작하였다. 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 처리군에서는 도 2에서 나타낸 바와 같이 비히클 처리군에 비해서 유의적으로 더 낮은 평균 광자수를 나타내었다. 이것은 도 3에 나타낸 바와 같이, 비히클에 의해서 처리된 KMS-11-luc를 주사한 마우스 및 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리한 마우스에서 찍은 전신 BLI 영상을 비교함으로써 쉽게 관찰되었다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온에 의해서 처리된 마우스에서의 광자수의 감소는 비히클에 의해서 처리된 마우스에 비해서 생존시간의 상당한 증가에 의해서 잘 반영되었다. 91일에 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 이들 마우스에서 9 마리 중의 5 마리는 전반적으로 건강한 상태를 가지고 생존한 채로 유지되었다. 반대로, 비히클-처리된 군에서의 대부분의 동물은 대략 50일에 희생되었다. 또한, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 마우스는 이 시험의 장기간 동안에 이 치료를 잘 견뎌내었다. 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온으로 처리된 마우스의 생존시간에 있어서의 명백한 개선으로 인하여, 시험은 실용성을 고려하여 91일째에 종료되었다.
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온에 의한 일반적인 키나제 억제, FGFR3의 억제, 및 다발성 골수종을 포함한 암의 치료에 관한 다양한 시험은 공개된 미국 특허출원 제 2004/0092535 호 및 미국 특허출원 제 10/983,174 호, 미국 특허출원 제 2004/0220196 호, 및 미국 특허 제 6,605,617 호에 기술되어 있다. 따라서, 이들 문헌은 각각 이에 의해서 마치 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 온전히 모든 목적으로 참고로 포함된다.
인간 AML 의 실험적 종양 이종이식 모델에서 4-아미노-5- 플루오로 -3-[6-(4- 메틸 피페라진-1-일)-1H- 벤즈이미다졸 -2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)의 활성
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)은 내피 및 종양세포 증식에 수반되는 FLT3 키나제 및 클래스 III, IV 및 V RTKs에 대한 강력한 활성을 나타내는 신규하며 경구적으로 활성인 다표적화 소분자이다. 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 FLT3 돌연변이의 관련성을 고려하여, 화합물 1은 상이한 FLT3 돌연변이적 상태 (MV4;11 FLT3 ITD 대비 RS4;11 FLT3 WT)를 갖는 두 가지 인간 백혈병 세포주에 대해서 시험하였다. MV4;11에 대한 화합물 1의 항증식 활성은 RS4;11에 비해서 ~24-배 더 컸었으며, 이것은 구성적으로 활성화된 FLT3의 더욱 강력한 억제를 시사한다. MV4;11 세포에서 화합물 1에 의한 수용체 포스포릴화 및 하류 시그날링 (STAT5 및 ERK/MAPK)의 용량-의존적 변조는 작용의 분자적 기전을 뒷받침하였다. MV4;11 종양에서 pFLT3, pERK의 표적 변조는 화합물 1의 생물학적 활성 용량에서 달성되었다. 종양 퇴행 및 골수 (BM)로부터 AML 세포의 근절은 피하 및 BM 생착 백혈병 이종이식 모델에서 입증되었다. 종양반응은 감소된 세포 증식 및 활성 카스파제-3 및 분해된 PARP에 대한 양성 면역조직화학적 염색을 특징으로 하였으며, 이것은 세포사가 세포소멸을 경유하여 매개되었음을 시사한다. 이들 데이타는 AML에서의 화합물 1의 임상적 평가를 입증한다.
세포주
인간 MV4;11 (FLT3 ITD) 및 RS4;11 (FLT3 WT) 백혈병 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) 24-26으로부터 수득되었다. MV4;11 세포는 4 mM L-글루타민, 5 ng/㎖ 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF, R＆D Systems, Minneapolis, MN) 및 1％ 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 10％ 태자소혈청 (FBS, Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD)이 보충된 이스코브 변형된 둘베코 배지 (IMBM) 내에서 성장시켰다. RS4;11은 10％ FBS, 1 mM 나트륨 피루베이트 및 10 mM HEPES (pH 7.4)를 함유하는 RPMI-1640 배지 내에서 성장시켰다. 세포를 현탁배양으로 성장시키고, 37℃ 및 5％ CO2 하에 가습된 대기 중에서 유지시켰다.
키나제 시험
시험관내 FLT3 키나제 시험은 8 μM ATP 및 화합물 1의 계열 희석액의 존재 하에서 2 nM FLT3 효소 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA)를 사용하여 수행하였다. 1 μM의 최종 농도로 포스포릴화된 펩타이드 기질을 유로피움-표식된 항-포스포타이로신 항체 (PT66) (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA)와 함께 배양하였다. 유로피움은 시분해 형광을 사용하여 검출되었다. IC50은 비선형 회귀를 사용하여 계산되었다.
증식시험
세포를 96-웰 미량역가 플레이트 (10,000 세포/웰)에 도말하고, 화합물 1의 계열 희석액을 첨가하였다. RS4;11 세포를 FLT3 리간드 (100 ng/㎖, R＆D Systems, Minneapolis, MN)로 자극하였다. 배양기간 (37℃에서 72 h)의 종료시에 세포 생존도는 MTS 시험 (Promega, Madison, WI)에 의해서 측정되었다. EC50 값은 비선형 회귀를 사용하여 계산되었으며, 비처리 대조용 세포에 대비하여 처리된 세포에서 흡광도를 50％ 감소시키는데 필요한 농도로 정의된다.
면역침강반응 및 웨스턴 블럿 분석
시험관내 실험을 위해서, MV4;11 및 RS4;11 세포를 화합물 1로 3 시간 동안 처리하였다. 화합물 1과 함께 배양한 후에, RS4;11 세포를 15 분 동안 FLT3 리간드 (100 ng/㎖)로 자극하였다. 약물과 함께 배양한 후에, 세포를 수확하여 빙냉 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제제 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 및 포스파타제 억제제 (Sigma, St. Louis, MO)를 함유하는 RIPA 완충액 (1× 포스페이트 완충된 식염수 pH 7.2 중의 1％ 노니데트 (Nonidet) P-40, 0.5％ 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1％ 나트륨 도데실설페이트)으로 용해시켰다. 생체내 표적 변조 분석을 위해서, 절제된 종양을 급속 동결시켜 분말화하고, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 50 mM Hepes, pH 7.5, 10％ 글리세롤, 1.0％ 트리톤 X-100, 1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 mM 페파블록 (Pefabloc; Roche) 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)로 용해시키기 전에 -70℃에서 저장하였다. 용해물의 단백질 함량은 BCA 시험 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 측정되었다. pERK에 대한 웨스턴 블럿 분석은 pERK에 대한 마우스 항체 (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA)를 사용하여 수행하였으며, 4℃에서 밤새 배양하였다. 총 ERK 수준은 총 ERK에 대한 항체 (Cell Signaling)에 의해서 재-프로브화함으로써 평가되었다. 그 후, 막을 1:5000 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)와 함께 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. FLT3을 검출하기 위한 면역침강반응을 위해서는, 등량의 단백질 (STAT5의 경우 500 ㎍; FLT3의 경우 1000 ㎍)을 인간 FLT3 또는 STAT5에 대한 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, 단백질 4-아가로즈와 함께 4℃에서 2 시간 동안 배양하였다. FLT3 또는 STAT5 포스포릴화는 항-포스포타이로신 항체 (셀 시그날링 (Cell Signaling)으로부터의 항-pFLT3 항체, 및 업스테이트 (Upstate)로부터의 항-pSTAT5 항체)로 프로브화함으로써 측정되었다. 단백질은 증진된 화학발광 (ECL; Amersjam Biosciences, Bucjinghamshire, England)을 사용하여 검출되었으며, 코닥 필름에 대한 노출시킨 후에 가시화되었다. 주사 밀도측정 (scanning densitometry)을 수행하여 밴드 강도를 정량화하였다. 동등한 부하를 입증하기 위하여, 블럿을 압착하여 항-FLT3 (Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-STAT5 (BD Biosciences)에 대한 항체로 재-프 로브화하여 각각 총 FLT3 또는 STAT5를 측정하였다. pFLT3, pERK 또는 pSTAT5의 양은 총 FLT3, ERK 또는 STAT5 단백질 수준으로 표준화시켰으며, 비히클 또는 비처리된 대조군과 비교하였다.
유동세포분석
MV4;11 세포를 혈청-기아 조건 (OptiMEM 배지 내에서 밤새) 하에서 화합물 1로 3 시간 동안 처리하였다. pSTAT5를 검출하기 위해서, 세포를 1％ 포름알데히드를 고정시키고, 90％ 빙냉 메탄올로 투과시켰다. 투과된 세포 (0.5-1×106)를 항-pSTAT5 항체 (Cell Signaling)와 함께 30 분 동안 배양하였다. 동일 농도의 정제된 토끼 IgG (Oncogene, San Diego, CA)를 아이소타입 대조군으로 사용하였다. 이차 항체는 PE-컨쥬게이트된 염소 F(ab')2 항-토끼 IgG (Jackson Immunoresearch)였다. 샘플은 FACScan 유동 세포분석기 (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용한 분석을 하기 전에 암소에서 4℃로 저장하였다. 평균 형광강도 (MFI)는 셀퀘스트 소프트웨어 (CeelQuest software; Becton Dickinson)을 사용한 pSTAT5 혐색에 대해서 측정되었으며, 특이적 MFI는 아이소타입 대조 항체의 MFI로부터의 차이였다.
마우스 MV4;11 생착 모델로부터의 골수 (BM) 세포의 처리를 위해서는, 대퇴골을 냉 식염수로 퍼지하고, 적혈구를 FACS 용해 완충액 (Becton Dickinson)으로 용해시켰다. 마우스 BM에서 인간 백혈병 세포의 생착율 ％은 항-인간 HLA-A,B,C-FITC (대비 아이소타입-매치된 항체-FITC 대조군) (BD Pharmingen)로 염색함으로써 측정되었다.
VEGF ELISA
MV4;11 세포를 다양한 농도 (0-1 μM)의 화합물 1과 함께 10％ FBS 함유 배지 내에서 48 시간 동안 배양하였다. 원심분리한 후에 상등액을 수집하고, VEGF 수준을 ELISA (R＆D Systems, Minneapolis, MN)에 의해서 측정하였다. 단백질 농도는 바이오-래드 (BIO-RAD) 단백질 시험 (Hercules, CA)을 사용하여 측정하였으며, 결과는 단백질 농도로 표준화되었다.
생체내 효능시험
암컷 SCID-NOD 마우스 (4-6 주령, 18-22 g)는 챨스 리버 (Charles River, Wilmington, MA)로부터 입수하고, 시험을 시작하기 전에 병원체-부재 구역 내에서 1 주일 동안 순응시켰다. 동물은 멸균 설치류 먹이 및 물을 마음대로 공급받았으며, 12 시간 명/암 주기를 갖는 멸균 필터-톱 케이지 내에 수용하였다. 모든 실험은 국제 실험동물관리 공인협회의 지침 하에서 이루어졌다.
피하 모델
MV4;11 및 RS4;11 세포는 피하 (s.c.) 종양으로부터 SCID-NOD 마우스에서 통과시켰다. 세포 (5×106 세포/마우스)를 50％ 마트리겔 (Matrigel; Becton Dickinson)로 재구성하고, SCID-NOD 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 구체적인 시험 디자인에서 개략적으로 설명한 바와 같이 종양이 200-1000 ㎣가 되면 처리를 시작하였다. 마우스를 무작위적으로 코호트에 배정하였다 (일반적으로 효능시험을 위해서는 10 마우스/군 및 약동학적 (PD) 시험을 위해서는 3-5 마우스/ 군). 화합물 1은 경구적 가바즈를 통해서 용액으로 투여하였다. 종양 부피 및 체중은 매주 2-3 회 평가하였다. 종양의 캘리퍼 (caliper) 측정치는 수학식 1/2 (길이×[폭]2)을 사용하여 평균 종양 부피로 전환되었다. 종양 성장 억제율 (TGI) ％는 비히클-처리된 마우스와 비교하였다. 반응율은 처리 개시할 때의 종양 부피와 비교한 완전 반응 CR (감지할 수 있는 종양 없음) 또는 부분적 반응 PR (50-99％ 수축)로 정의되었다.
정맥내 골수 ( BM ) 착상 모델
SCID-NOD 마우스는 0.2 ㎖ 식염수 중의 1×107 MV4;11 세포를 꼬리 정맥에 주사하기 전에 방사선조사하였다 (3 Gy). 화합물 1 또는 비히클 처리는 세포-접종한 지 3 주일 후에 개시되었다. 마우스는 매일 모니터하였으며, 빈사상태이거나 뒷다리 운동성 상실의 조기 징후가 있는 경우에는 안락사시켰다. 처리된 마우스의 증가된 수명 (ILS)은 비히클 처리된 대조 마우스에 대비한 중앙 생존시간 (MST)의 증가율 ％로서 계산되었다.
생체내 표적 변조
SCID-NOD 마우스 (n = 3 마우스/군)에서 MN4;11 s.c. 종양은 300 ㎣의 단계였으며, 처리는 5일 동안 10 ㎎/㎏으로 경구 투여된 비히클 또는 화합물 1로 구성되었다. 화합물 1의 PD 특성을 특정화하기 위하여, 화합물 1을 투약한 후의 다양한 시점에 종양 샘플을 수집하였다 (N = 3 마우스/시점).
면역조직화학
절제된 종양을 실온에서 밤새 10％ 중성 완충된 포르말린 내에 배치하고, 70％ 에탄올에 옮기고, 더모 엘렉트론 엑셀저 조직처리기 (Thermo Electron Excelsior tissue processor; Pittsburgh, PA)를 사용하여 파라핀 포매를 위해 처리하였다. 뼈 (대퇴골) 샘플은 석회질을 제거하였다 (ProtocolITM, Fisher Diagnostics, Middletown, VA). 파라핀 블럭을 4 ㎛ 두께로 절편화하고, 양으로 하전된 유리 슬라이드 상에 배치하였다. 조직을 디스커버리 자동화 슬라이드 기계 (Discovery automated slide machine; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)를 사용하여 염색하였다. 슬라이드를 가압된 스티머 (steamer) 내에서 시트레이트 완충액 (pH 6.0)으로 처리하여 Ki-67, pERK 및 PARP 염색을 위한 항원을 복구시켰으며, 카스파제-3은 벤타나 (Ventana) 시약 CC1에 의해서 복구되었다. 사용된 일차 항체는 Ki-67 (1:750 희석, NovoCastra Laboratories, UK), pERK (1:100 희석, Biosource, Camarillo, CA), 항-인간 미토콘드리아 (1:200, Chemicon, Temecula, CA), 절단된 카스파제-3 (1:200, Cell Signaling) 및 절단된 PARP (1:100, Biosource)였다. 이차 항체는 염소 항-토끼 F(ab')2 비오티닐화 항체 (1:100 희석, Jackson ImmunoResearch)였다. 슬라드는 헤마톡실린으로 대비염색하였으며, 커버 슬립으로 고정되었다. 일반적인 조직 형태학은 또한, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 평가되었다.
통계학적 분석
선형 회귀는 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel, Redmond, WA)을 사용하여 수행되었다. 스튜던트 t-시험 (Student's t-test)을 사용하여 두가지 처리군 사이의 통계학적 유의성을 측정하였다. 다중 비교는 일원변량분석 (one-way analysis of variance)을 사용하여 수행되었으며, 상이한 처리수단을 비교하는 후검증 (post-test)은 스튜던트-뉴만 케울 시험 (Student-Newman Keul's test; SigmaStat, San Rafael, CA)을 사용하여 수행되었다. 생존시험을 위해서는 로그 순위검정 (log rank test)을 사용하여 다양한 처리 대 비히클 군의 생존곡선 사이의 유의성을 결정하였다 (Prism, San Diego, CA). 시험의 종료시에 정상적인 건강상태를 갖는 희생된 마우스는 이 분석에서 장기간 생존자로 간주되고, 중도절단되었다. 차이는 p<0.05에서 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다.
결과
화합물 1은 FLT3 키나제 활성의 강력한 억제를 나타낸다.
화합물 1의 특이성은 상술한 바와 같이 정제된 효소에 의한 ATP-경쟁적 결합시험을 사용하여 다양한 RTKs의 패널에 대해서 시험하였다. 화합물 1은 c-KIT (2 nM), VEGFR1/2/3 (10 nM); FGFR1/3 (8 nM); PDGFRβ (27 nM) 및 CSF-2R (36 nM)에 대한 나노몰 활성을 가지고 FLT3 (1 nM)에 대해서 매우 강력한 것으로 확인되었다 (참조: 이하의 표). 클래스 III, IV 및 V RTKs에 대한 선택성을 확인하기 위해서, 화합물 1은 PI3K/Akt 및 MAPK(K) 경로 내의 다른 키나제에 대해서 시험하였으며, 무시할 수 있는 정도의 활성 (IC50 > 10 μM)을 갖는 것으로 확인되었다 (참조: 이하의 표).
다양한 RTKs에 대한 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤 즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온의 활성
RTK IC50 (μM)
FLT3 < 0.001
c-KIT 0.002
CSF-1R 0.036
FGFR1 0.008
FGFR3 0.009
VEGFR1/Flt1 0.01
VEGFR2/Flk1 0.013
VEGFR3/Flt4 0.008
PDGFRβ 0.027
PDGFRα 0.21
INSR 2
EGFR1 2
c-MET > 3
EphA2 4
TIE2 4
IGFR1, HER2, PI-2K, Akt1/3, Raf, ERK-1/2, MEK, p-38-α,β,γ > 10
상기 표를 작성하기 위해서 사용된 시험관내 RTK 시험은 상술한 바와 같이 정제된 효소 및 ATP의 존재 하에서 화합물의 다양한 희석액을 사용하여 수행되었다. 포스포릴화된 펩타이드 기질 (1 μM)을 유로피움-표식된 항-포스포특이적 항체와 함께 배양하고, 유로피움을 시분해 형광을 사용하여 검출하였다.
MV4 ;11 ( FLT3 ITD ) 세포에 대한 화합물 1의 강력한 항증식 효과
FLT3의 억제가 시험관내에서 성장 억제로 전환되는지 여부를 측정하기 위해서, MTS 시험을 사용하여 MV4;11 및 RS4;11 세포에 대한 화합물 1의 활성을 시험하였다 (도 5). 화합물 1은 EC50 = 13 nM으로 하여 용량-의존적 방식으로 MV4;11 세포의 증식을 강력하게 억제하였다. 증식에 대한 유사한 농도-의존적 효과가 RS4;11 세포에 의해서 관찰되었지만, 이들은 화합물 1에 대해서 약 24-배 덜 민감 하였다 (EC50 = 315 nM). 화합물 1의 항증식 효과는 또한, MV4;1에 의해서 나타난 것 (EC50 ~6 nM)과 유사한 EC50 농도로 FLT3 ITD 돌연변이체 세포, MOLM13 및 MOLM14에 대하여 시험하였다 (데이타는 제시하지 않음). 이들 데이타는 화합물 1이 FLT3 ITD 및 WT 백혈병 세포 둘 다에 대해서 활성이 있으며, 여기에서 구성적으로 활성인 수용체가 억제에 대해서 더 민감함을 시사하는 것이다 (도 6).
백혈병 세포에서 FLT3-매개된 시그날링에 대한 화합물 1의 시험관내 효과
화합물 1의 시험관내 세포성 활성은 FLT3 돌연변이적 상태를 대비하여 두 가지 인간 백혈병 세포주 MV4;11 및 RS4;11에 대하여 조사하였다 (RT-PCR을 사용하여 확인됨, 데이타는 제시되지 않음). MV4;11 세포는 FLT3 수용체에서 내부 직렬 중복 돌연변이 (ITD)을 가짐으로써 구성적으로 활성화된 FLT3을 발생시킨다 (Levis M. et al., Blood, 99:3885-3891 (2002); O'Farrell A.M. et al., Blood, 101:3597-2605 (2003)). 이러한 활성화는 외인성 리간드 자극의 부재 하에서 FLT3의 자가포스포릴화를 제공한다 (도 6, 레인 1). 혈청-박탈된 MV4;11 세포를 화합물 1로 3 시간 동안 처리하고, FLT3 수용체 활성화에 대한 직접적인 효과는 그의 포스포릴화 상태를 분석함으로써 결정되었다. 화합물 1의 증가하는 농도에 대한 MV4;11 세포의 노출은 1-10 nM 사이의 EC50을 가지고 용량-의존적 방식으로 pFLT3을 강력하게 억제하였다 (도 6).
FLT3 ITDs는 AML 환자 아세포의 약 20％에서 우세하지만, 대부분의 급성 백혈병은 WT FLT3을 발현한다. 백혈병 RS4;11 세포 (FLT3 WT) (도 7)에 대한 화합물 1의 효과는 FLT3 수용체 포스포릴화를 활성화시키는 외인성 FLT3 리간드 (100 ng/㎖, 15 분)에 따라서 조사되었다 (도 7, 레인 1 대비 2). 화합물 1은 RS4;11 세포에서 pFLT3 수준을 감소시켰다 (도 7). 그러나, WT FLT3 대비 ITD의 변조를 위해서는 비교적 고농도가 필요하였다. 완전한 억제는 >0.5 μM의 농도에 의해서 수득되었다 (도 6 및 7).
화합물 1은 FLT3 억제의 하류 표적인 ERK 및 STAT5 를 변조시킨다.
FLT3 억제에 대한 화합물 1의 효과를 더 특정화시키기 위하여, FLT3의 하류 표적, 즉 세포 생존 및 증식에서의 주요 단백질인 STAT5 및 ERK의 변조가 조사되었다. MV4;11 세포를 증가하는 농도의 화합물 1로 3 시간 동안 처리하고, pERK 및 p-STAT5의 검출을 위해서 유동세포분석 및 웨스턴 블럿에 의해서 조사하였다 (도 8 및 9). MV4;11 세포에서는 FLT3의 활성 시그날링에 기인하여 세포가 높은 기본적 수준의 pERK 및 pSTAT5를 갖는다 (도 8 및 9). 화합물 1은 용량-의존적 방식으로 ERK (도 8) 및 STAT5 (도 9)의 포스포릴화를 억제하였다. pERK 및 pSTAT5의 실질적인 억제 (> 50％)는 > 0.1 μM의 농도에서 관찰되었다 (유동세포분석 및 웨스턴 블럿). pERK 및 pSTAT5에 대한 화합물 1의 억제효과는 FLT3 리간드-자극된 RS4;11 세포에 비해서 MV4;11에서 더 강력하였다 (데이타는 제시되지 않음).
화합물 1은 시험관내의 MV4 ;11 세포에서 오토크린 VEGF 생산을 억제한다.
시험관내에서 VEGF 생산에 대한 화합물 1의 효과를 검토하기 위해서, MV4;11 배양 상등액에 대하여 ELISA를 수행하였다 (도 10). 이들 실험에서는, MV4;11 세포를 10％ FBS를 함유하는 배지 중에서 증가하는 농도 (0-1 μM)의 화합물 1과 함 께 48 시간 동안 배양하였다. 약물 처리의 부재 하에서, MV4;11 세포는 상당한 VEGF (180 pg/㎖)를 분비하는 반면에, 화합물 1은 용량-의존적 방식으로 VEGF 생산을 억제하였으며, 여기에서 EC50는 0.001 내지 0.01 μM이며, > 0.5 μM의 농도에서 완전히 억제되었다 (도 10).
화합물 1은 생체내에서 FLT3 시그날링을 변조시킨다.
생체내에서 표적 변조를 검사하기 위해서, MV4;11 종양-보유 마우스 (300-500 ㎣ 단계)에게 5일 동안 화합물 1 (10 ㎎/㎏/d) 또는 비히클을 투여하였다. 선택된 시점 이후에 종양을 수확하고, 균질화시키고, IP/웨스턴 블럿에 의해서 pFLT3 및 pSTAT5 수준에 대해 분석하였다. 화합물 1을 단일 용량 (데이타는 제시되지 않음) 또는 수회 용량으로 투여한 지 4 시간 후 정도로 빠르게 pFLT3 및 pSTAT5 수준에서의 상당한 감소가 관찰되었으며 (도 11), 총 FLT3 또는 STAT5 단백질에 대해서는 영향이 없었다 (도 11). FLT3 및 STAT5 둘 다의 포스포릴화는 기준선에 비해서 감소하여 투약한 지 8 시간 후에 ~90％의 최대 억제에 도달하고, 24 시간 동안 억제된 상태로 유지되었다 (~85％ 억제). 포스포-FLT3은 기준선에 더 가깝게 복귀하였으며, 그 반면에 p-STAT5는 투약한 지 48 시간 후에 여전히 억제되었다 (~60％ 억제) (도 4). pERK 수준의 감소가 또한 관찰되었으며, 이것은 하류 FLT3 시그날링의 차단을 시사한다 (데이타는 제시되지 않음).
생체내 효능시험
생체내에서 MV4 ;11 및 RS4 ;11에 대한 화합물 1의 용량 반응 효과
화합물 1의 시험관내 효과가 생체내에서의 종양 성장 억제와 상관관계가 있는지 여부를 확인하기 위하여, SCID-NOD 마우스에서 MV4;11 또는 RS4;11 종양 이종이식편에 대한 화합물 1의 효능을 검사하였다. 마우스에게 종양세포를 피하로 이식하고, 화합물 1 처리는 종양이 200-300 ㎣일 때에 시작하였다. 용량-반응 효능시험에서, 화합물 1은 MV4;11 종양의 경우에는 1-30 ㎎/㎏/d 및 RS4;11 종양의 경우에는 10-150 ㎎/㎏/d의 용량 범위로 경구 투여하였다.
화합물 1은 MV4;11 종양에 대해서 매우 강력하였으며, > 5 ㎎/㎏/d의 용량에서 상당한 종양 성장 억제가 되는 우수한 용량-반응 효과를 나타내었다 (도 12). 30 ㎎/㎏/d의 용량은 부분적 및 완전한 응답자 둘 다 (1CR, 8PR)로 구성된 종양 퇴행을 유도하였다 (9/10 종양 반응). 적절한 종양 성장 억제는 투약한 지 2 주일 후에 1 ㎎/㎏/d에서 관찰되었으며 (23％), 이 모델에서 최소의 통계학적으로 효과적인 용량으로 확인되었다 (p<0.01 대 비히클). RS4;11 종양을 보유하는 마우스에서, 화합물 1에 의한 처리는 종양 성장 억제를 제공하였지만, 퇴행은 관찰되지 않았다 (도 13). 각각의 모델에서 개별적인 최소 유효용량 (8일: RS4;11 종양에 대해서 100 ㎎/㎏/d; 48％ TGI, p < 0.01 대비 MV4;11 종양에 대해서 1 ㎎/㎏/d; 23％ TGI, p < 0.01)에 의해 정의되는 것으로서 화합물 1의 억제효과는 RS4;11 종양에 비해 MV4;11 종양에 대해서 더 강력하였다.
화합물 1의 대체 투약 스케줄은 동등하게 강력하다.
MV4;1 이종이식 종양에 대한 화합물 1의 간헐적 및 주기적 투약의 효과가 또한 검사되었다 (도 14). 화합물 1은 30 ㎎/㎏으로 매일, 격일로 (q.o.d.) 또는 2 주기 동안 7일 투약하고 이어서 7일은 중지하는 식으로 주기적으로 경구 투여하였다 (도 14). 매일 투약하는 것과 유사하게, 간헐적인 투약 레지멘은 약물 처리일 내에 상당한 종양 퇴행을 제공하였다 (> 94％ TGI). 세 가지 레지멘은 모두 동등한 항종양 활성을 야기하였으며 (29일, p > 0.05), q.o.d. (6PR) 및 7일 투약/7일 중지 (9PR)에 의해서 나타나는 반응의 수는 매일 처리에 의해서 나타나는 반응 (1CR, 9PR)과 유사하였다.
화합물 1은 큰 MV4 ;11 종양에 대해서 효과적이다.
300, 500 또는 1000 ㎣로 다양한 크기의 큰 MV4;11 종양에 대한 화합물 1의 효과를 또한 조사하였다. 화합물 1 (30 ㎎/㎏/d)에 의한 처리는 처리를 시작할 시점에서의 초기 종양 크기와는 무관하게 모든 MV4;1 종양에서 상당한 퇴행을 유도하였다 (도 15). 종양 퇴행은 3-5일의 약물 처리 이내에 명백하였다. 모든 처리된 종양이 15％의 완전한 반응 및 70％의 부분적 반응으로 반응하였다 (n= 27). 나머지 15％는 미약하게 반응하였거나, 안정하게 유지되었다. 투약은 50일 후에 중단되었다. 50일 처리 중에 어떤 종양도 재성장하지 않았으며, 이것은 화합물 1에 대한 저항성이 발현되지 않았음을 시사한다. 처리의 중단 후에 반응의 지속성도 또한 검사되었다. 하나의 CR 및 PRs의 약 50％가 화합물 1의 투약을 중지한 후에 40일 동안 지속하였다. 재성장한 (600-2000 ㎣로) 10 개의 종양은 시험 90일 (투약을 중지한 후의 40일)에 시작하여 30 ㎎/㎏/d의 화합물 1로 재처리하였으며, 60일 동안 지속하였다. 모든 종양은 화합물 1의 제 2 주기에 반응하였으며 (2CR, 8PR), 이것은 화합물 1에 대한 종양 저항성이 결여함을 명백히 시사하는 것이다 (도 16).
생체내 생물학적 활성의 조직학적 평가
종양 부피 및 표적 변조 종말점 이외에도 면역조직화학적 정보가 약물 활성의 지표로서 사용되었다 (도 17-19). 화합물 1 투여 (30 ㎎/㎏/d)의 일시적인 효과는 1 또는 5 회의 투약 후에 MV4;11 종양에서 조사하였다 (도 17). H＆E 염색을 사용한 형태학적 평가는 비히클-처리된 종양이 골수성 과형성의 지표인 현저한 세포과다를 갖는 MV4;11 종양세포로 구성되었음을 밝혀내었다 (도 17-a). 종양세포는 Ki67로 강력하게 염색되었으며, 이것은 매우 증식성인 세포의 종양 조성을 시사하는 것이다 (도 17-b). 투약한 후 24 시간까지, 화합물 1로 처리된 종양은 조밀하게 채워진 세포의 감소를 나타내었으며, 세포소멸성/괴사성 세포의 희박한 영역으로 구성되었다 (1일, 도 17-a 대 f). 세포소멸/괴사의 영역은 5 회 투약한 후에 감소된 Ki67 염색과 일치하는 생존불가능한 종양의 상당한 영역을 가지고 더 현저하였다 (도 17-g). 표적 변조는 생체내에서 pERK의 면역조직화학적 염색으로부터 확인되었다. 포스포-ERK는 종양 내의 pERK의 웨스턴 분석을 확증하는 것으로, 5-일 투약기간 중에 화합물 1-처리된 종양에서 현저하게 저하되었다 (도 17-c 대 h). 5일째에 종양에서의 증가된 활성화된 카스파제-3 (도 17-d 대 i) 및 절단된 PARP (도 17-e 대 j) 염색으로부터 입증되는 화합물 1-유도된 세포소멸은 비히클-처리된 대조군과 비교하였다. 감소된 세포충실성 및 증식뿐만 아니라 감소된 pERK의 유사한 효과는 화합물 1 (30 ㎎/㎏/d)로 처리된 RS4;11 종양에서 명백하였다 (도 18).
부분적 (도 19-c,d) 또는 완전한 반응 (도 19-e)로 정의된 종양의 조직학도 또한 검사되었다. 완전한 응답자는 MV4;11 종양세포가 전혀 없었으며, 단지 괴사 및/또는 반흔 조직의 흔적만을 나타내었다 (도 19-e). 부분적 반응에서는, Ki67-양성 증식성 종양세포의 포켓이 종양의 주변에서 관찰되었다 (도 19-a,c 대 b,d).
화합물 1은 전파된 인간 백혈병 세포를 보유하는 마우스의 생존시간을 연장시킨다 .
화합물 1의 효능은 세포를 방사선조사된 SCID-NOD 마우스의 꼬리 정맥 내로 접종한 MV4;11 백혈병 모델에서 시험하였다 (도 20). 이 모델에서, MV4;11 세포는 인간 백혈병과 유사한 질병 패턴을 병리학적으로 모방하여 골수 (BM)로 전파되었다. 마우스에게는 제1일에 MV4;11 세포를 주사하고, 화합물 1의 처리 (20 ㎎/㎏, 매일 또는 7일 투약/7일 중지, n= 10-12/군)는 MV4;11 세포를 BM에 착상시킨 후 제23일에 시작하였다. 대조군 (비히클-처리됨) 마우스는 일반적으로 종양세포가 BM을 침윤시킨 결과로 뒷다리 마비를 야기하며, 중앙 생존시간 (MST)이 51일이었다 (도 20). 생존시험에서, 화합물 1에 의한 매일의 처리 (제 23-100일)는 비히클-처리된 대조군 (MST= 51일)(p < 0.0001)에 비해서 질병 진행의 시간을 현저하게 지연시켰으며 (MST= 134일), 이것은 163％의 증가된 수명 (ILS)을 나타낸다 (도 20). 현저하게, 화합물 1의 매일 처리에 의해서 4 마리의 마우스는 장기간 생존자였다 (MST > 160 일). 조직학적 분석 및 유동세포분석을 사용하여 BM 내에서 MV4;11 세포의 착상율 ％을 정량화하였다 (도 21). 유동세포분석에서, 인간 MV4;11 세포는 인간 MHCI 상의 에피토프에 결합하는 항-인간 HLA-A,B,C 항체에 의해서 마우스 BM에서 확인되었다. 비히클-처리된 마우스에서, 전체 분리된 BM 세포의 약 2-19％는 착상된 MV4;11 세포로 구성되었다 (제51일, 도 21-a). 이것은 또한, 마우스 BM 매트릭스 내에서 MV4;11 세포로 식별되는 인간 세포를 염색하는 인간 미토콘드리아에 대한 항체를 사용한 면역조직화학에 의해서 확증되었다 (도 21-b,c). 25일에 걸쳐서 매일 투약된 화합물 1 (20 ㎎/㎏)은 비히클 처리에 비해서 백혈병성 부하를 현저하게 감소시켰다 (BM에서 < 1％ MV4;11 세포) (도 21-a 대 d). 흥미롭게도, 화합물 1 처리 후에 생존하는 마우스는 BM에서 면역조직화학적으로 종양세포의 증거를 나타내지 않았으며 (제167일에 항-인간 미토콘드리아-양성 세포의 부재로 나타남), "치유"된 것으로 정의되었다 (도 21-e,f). 화합물 1의 주기적 투약 (7일 투약/7일 정지, 5 주기)은 또한, 현저하게 증가된 생존시간 (MST= 118일, 131％ ILS 대 비히클, p= 0.0001)을 제공하였지만, 매일 투약하는 레지멘만큼 효과적이지는 않았다 (p= 0.007, 도 20 및 21).
고찰
종양-세포 증식에 포함된 비정상적인 세포내 키나제 시그날링 경로를 표적화하는 것은 세포성 과정을 붕괴시킬 수 있고, 종양 성장의 억제를 야기할 수 있다. 이것은 두 가지 소분자 표적화제인 CML (Bcr-Abl) 및 위장관 간질성 종양 (c-KIT)에서의 이마티니브 (Gleevec) 및 무반응성인 진행되거나 전이성인 비-소세포 폐암 (EGFR)에서의 제피티니브 (Irressa)의 승인에 의해서 예시되었다 (Druker B.J. Oncogene, 21:8541-8546 (2002); Giaccone G. Clin Cancer Res. 10:4233S-4237S (2004)). 두 가지 화합물은 종양세포 내의 특이적인 분자적 결함을 표적으로 하며, 이러한 성공은 FLT3 15,20-23을 포함한 다른 종양원성 키나제에 대한 분자적 표적화 치료법에 대한 연구를 추진시켰다. FLT3 유전자에서의 돌연변이는 거의 35％의 환자가 활성화 돌연변이를 수용하는 AML에서의 가장 통상적인 유전적 변화이 다. FLT3 돌연변이는 열등한 임상적 예후를 제공하는 것으로 나타났으며, 따라서 AML에서 치료학적 표적으로서 FLT3을 결부시킨다 (Thiede C. et al., Blood, 99:4326-4335 (2002); Schnittger S, et al., Blood, 2002;100:59-66 (2002)).
화합물 1은 종양 증식 및 혈관형성에 수반된 클래스 III, IV 및 V RTKs에 대하여 나노몰 효력을 갖는 다표적화 키나제 억제제이다. 생화학적 키나제 시험은 화합물 1이 FLT3에 대해서 강력한 활성을 가짐을 나타낸다 (1 nM의 IC50). 두 가지 백혈병 세포주에서 화합물 1의 활성은 FLT3 상태 MV4;11 (FLT3 ITD) 및 RS4;11 (FLT3 WT)을 대비함으로써 특정화되었다. 화합물 1은 세포 내에서의 분자 활성을 확인하는 것으로서, 용량-의존적 방식으로 FLT3 포스포릴화를 감소시키는 것으로 나타났다. 시험관내에서, 화합물 1은 둘 다 세포증식성 경로에서 주요 조절자인 유사분열촉진성 MAPK 및 STAT5 경로에서 그 다음의 하류 시그날링 분자를 차단하였다. 흥미롭게도, FLT3 표적 변조에 대한 활성은 세포의 세포독성/증식 시험에서의 화합물 1의 효과와 같이 RS4;11 세포에서보다 MV4;11 세포에서 더 현저하였다. FLT3-ITD 및 야생형 FLT3에 대한 유사한 차등적 효과는 다른 FLT3 억제제에 대해서 보고되었다. 이것은 FLT3 ITD MV4;11 세포가 세포 증식을 추진시키는 구성적으로 활성인 시그날 (Ras, STAT5)를 가지며, FLT 활성화와 무관한 성장을 유지시킬 수 있고/있거나 다른 종양원성 경로에 근거할 수 있는 FLT3 WT (RS4;11) 세포와는 상이한 것으로 추론될 수 있다 (Minami Y. et al., Blood, 102:2969-2975 (2003); Kiyoi H. et al., Oncogene, 21:2555-2563 (2002); Spiekermann K. et al ., Clin Cancer Res. 9:2140-2150 (2003)).
생체내 시험으로부터의 결과는 화합물 1이 고형 종양 및 백혈병의 전파된 BM 모델 둘 다에 대해서 강력한 활성을 갖는다는 것을 입증하였다. 전임상적 모델에서 화합물 1의 분자 활성은 표적 변조의 정도 및 지속기간을 시험하도록 PD 종말점을 사용하여 검토되었다. 화합물 1은 MV4;11 종양에서 pFLT3 및 pERK 둘 다를 실질적으로 하향-조절하는 것으로 나타났다. 표적 변조 (pFLT3)는 4 시간까지 관찰되었으며, 화합물 1의 단일 용량 또는 수회 용량을 투여한 후에 24 시간까지 종양에서 유지되었다. 생물학적 효과는 또한, 종양 조직병리학으로부터 명백하였는데, 여기에서는 종양에서 감소된 pERK, 증식 및 세포소멸 반응이 약물 처리의 1-2일 이내에 관찰되었다. MV4;11의 고형 종양 이종이식에서, 종양 퇴행은 또한 약물 처리일 이내에 현저하였다. MV4;11 모델에서 화합물 1의 강력한 억제효과는 다른 RTKs의 억제와 함께 FLT3의 직접적인 억제로부터 발생할 수 있는 가능성이 있다. 데이타 (RT-PCR, 제시되지 않음)는 MV4;11 세포가 또한, 모두 화합물 1에 의해서 강력하게 억제되는 RTKs인 VEGFR1, cKIT, PDGFRβ, FGFR1, CSF-1R 32를 발현함을 시사한다 화합물 1은 VEGF1/2/3 키나제에 대해서 < 10 nM 활성을 가지며, 이 데이타는 화합물 1이 시험관내 배양물에서 오토크린 VEGF 수준을 억제할 수 있음을 명백하게 입증한다. 생체내에서, 종양세포 또는 종양 간질세포 (내피세포를 포함)에 의해서 분비된 VEGF 또는 FGF의 오토크린 또는 파라크린 (paracrine) 억제는 이들 세포의 증식 및 생존을 억제할 수 있다 (Ferrara N. et al ., Nat Med., 9:669-676 (2003); Compagni A. et al ., Cancer Res. 60:7163-7169 (2000); Carmeliet P. Nat Med., 9:653-660 (2003)). 고형 종양에서의 화합물 1의 추가의 활성은 혈관형성 중에 혈관주위세포 동원 및 혈관세포의 성숙에 영향을 미침으로써 PDGFRβ에 대한 그의 강력한 효과로부터 발생할 수 있다 (Carmeliet P. Nat Med., 9:653-660 (2003); Ostman A. Cytokine Growth Factor Rev., 15:275-286 (2004)). AML BM 모델에서, 본 발명자들은 화합물 1이 마우스의 생존을 개선시켰으며, 일부의 마우스에서는 질병을 근절시켰음을 입증하였다. 이것은 직접적인 항증식 효과, 또는 아세포 생존에 역할을 할 수 있는 골수 혈관형성의 조절에 의해서 순환하는 아세포 및 BM 질병 둘 다를 근절시키는 화합물 1의 잠재력을 나타낸다 (Carow C.E. et al ., Blood, 87:1089-1096 (1996); Drexler H.G. Leukemia, 10:588-599 (1996)).
화합물 1의 약물학 및 표적 억제를 기준으로 하여, 화합물 1의 간헐적 및 주기적 투약 스케줄을 시험하였다. 화합물 1의 대체 투약 스케줄은 화합물 1의 매일 투약에 비해서 유사한 활성을 나타내었으며, 이것은 진료소에서의 융통성이 있는 투약 레지멘에 대한 가능성을 시사한다. 화합물 1의 수회 용량은 종양의 성장을 계속적으로 억제할 수 있었으며, 처리를 중지한 후에 나타나는 어떤 재발성 종양이라도 약물에 의한 재-처리에 대해서 동등하게 민감한 것으로 나타났다. 일부 AML 환자가 키나제 억제제에 의한 처리시에 연속적인 처리에도 불구하고 재발한 것으로 나타났기 때문에, 이들 결과는 임상장면으로 적용되는 경우에 실제로 가치가 있는 것이다 (Fiedler W. et al ., Blood, (2004); Cools J. et al ., Cancer Res . 64:6385-6389 (2004)). 대사 및 세포성 유출 (P-글리코프로테인과 같은 약물 수송자의 발현을 통함)을 포함하는 다수의 기전, 및 약물 결합을 저해하는 효소 활성부 위의 ATP 결합 영역에서의 돌연변이는 키나제 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (Bagrintseva K. et al., Blood, 103:2266-2275 (2004); Grundler R. et al., Blood, 102:646-651 (2003)). 화합물 1은 P-GP 기질이 아니며, 약물 처리의 과정 전체에 걸친 지속적 반응은 화합물 1에 의해서 저항성의 발현을 피할 수 있음을 의미할 수 있다.
AML에 대한 FLT 억제제 (SU11248 PKC412, CEP-701, MLN518)의 임상적 발전은 아직 초기상태이다 (O'Farrell A.M. et al ., Clin . Cancer Res . 9:5465-5476 (2003); Fiedler W. et al ., Blood, (2004); Stone R.M. et al ., Ann Hematol. 83 Suppl 1:S89-90 (2004); Smith B.D. et al ., Blood. 103:3669-3676 (2004); DeAngelo D.J. et al ., Blood, 102:65a (2003)). 단일약제 치료법의 선택은 아직 상당한 반응을 제공하지 못하였으며, AML에서 FLT3 억제제의 추가의 임상적 발전은 이들 약제를 세포독성 약물 또는 다른 분자 표적화제와 배합하는 것에 따라 좌우될 수 있다. AML의 병인론에서 역할을 나타내는 것으로 알려진 RTKs에 대한 추가의 활성을 갖는 강력한 FLT3 억제제인 화합물 1에 대해서 본 발명에 보고된 데이타는 그의 임상적 평가를 보장한다.
환자에게서 약물-저항성 암에 대한 활성
4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온 (화합물 1)과 같은 화학식 I, II 및 III의 화합물은 종양세포 및 종양에 공급하는 혈관의 형성 및 유지에 대해 직접적인 활성을 갖는다. 이들 화합물은 또한, 다양한 혈관형성 종양 및 전이 동물 모델에서 경구적 활성을 나타내었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 클래스 III, IV 및 V RTKs를 선택적으로 억제한다 (또한 IC50 값을 제시한 표를 참조). 정착된 큰 KM12L4A 인간 결장종양 이종이식편을 갖는 누드 마우스에 대한 화합물 1의 투여는 처리된 동물의 90-100％에서 퇴행 및/또는 질병 안정화를 제공하였다.
제1상 용량 증가식 멀티-센터 오픈 라벨 시험은 진행된 고형 악성종양을 갖는 대상체에서 화합물 1의 안전성, 약력학 및 약동학을 평가하기 위해서 수행되었다. 시험의 추가적인 일차 목표에는 다음이 포함되었다: 1) 최대 허용용량 (MTD)을 결정하고; 2) 용량 제한 독성 (DLT)을 확인하고; 3) 진행된 고형 종양을 갖는 대상체에서 안전성 프로빌 (provil)을 평가한다. 시험의 이차적인 목표에는 다음이 포함되었다: 1) 약력학을 평가하고; 2) 혈장, 말초혈액 림프구, 뇨 및 종양세포 내에서 약동학을 평가하고; 3) 미래의 연구자들에게 용량 및 스케줄을 추천하고; 4) 항종양 활성 (RECIST)의 증거를 결정한다.
이 시험에 관한 상세한 사항은 이하에 기술된다.
투약 레지멘에는 다음이 포함되었다:
- 7일 투약/7일 정지로 1회 매일 투약을 반복함 (용량 25-100 ㎎)
- 7일 투약/7일 정지의 1 주기에 ≥ 100 ㎎ 용량에 이어서 그 후에는 연속적인 매일 투약.
용량 증가:
- 코호트당 3-4 명의 환자, 용량은 > 등급 2 독성이 될 때까지 용량을 배가 시킴; 그 후 변형된 피보나치식 (Fibonacci schema).
포함기준:
● 표준 치료법에 대해서 무반응성이거나, 그에 대한 치료용 표준 치료법이 존재하지 않는 조직학적으로 또는 세포학적으로 입증된 고형 종양
● >18 세의 연령
● ECOG 성능 상태 0-1
● 헤모글로빈 ≥ 8.0 gm/dL; 호중구 ≥ 1,500/㎣; 혈소판 ≥ 75,000/㎣
● 크레아티닌 ≤ 1.5×표준의 상한선 (ULN); 빌리루빈 ≤ 1.5×ULN; 알칼리성 포스파타제 ≤ 5×ULN; 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) ≤ 2.5×ULN (간 연루 ≤ 5×ULN은 제외); 아밀라제 ≤ULN
● 서명된 사전동의
● 항종양성 치료법 (호르몬 치료법은 제외)의 최종 투약 > 21일.
배제기준:
● 두개골내 부종, 두개골내 전이 또는 경막외 질병
● 임상적으로 유의적인 심장병 (NYHA 클래스 III 또는 IV): 기존의 부정맥; 울혈성 심부전; 심근병; QTc 간격 > 450 msec (남성) 및 > 470 msec (여성) 또는 > G2 LVEF (MUGA 또는 초음파심음향도에 의함)
● 임상적으로 유의적인 말초혈관병을 갖는 당뇨병 (만성적 투약을 필요로 함)
● 이전의 심막염; 이전의 12 개월 이내에 임상적으로 유의적인 흉막 삼출액 또는 > 2 개입/월이 필요한 재발성 복수
● 흡수장애 증후군 또는 제어되지 않은 GI 독성 (> G2 오심, 설사, 구토). 어떤 병인론에 의한 것이든 선행하는 급성 또는 만성 췌장염
● 선행하는 폐색 또는 스텐트의 차단이 없이 안정하게 치료되지 않은 경우의 이전의 12 개월 이내에 선행하는 간내 또는 간외 담도 폐색, 또는 담관 스텐트를 필요로 하는 악성 폐색의 병력.
DLT/MTD의 정의:
● G4 호중구감소증 < 5일 또는 발열성 호중구감소증; G4 혈소판감소증
● G4 피로, 또는 ECOG 성능 상태에서 2-포인트 감소
● 적절한/최대 의학적 개입 및/또는 예방의 사용에도 불구하고 G3 이상의 오심 및/또는 구토
● G3 이상의 비-혈액학적 독성 (피로를 제외)
● G2 또는 그 이상의 임상적 유의성의 심장독성 (예를 들어, 휴지기 EF의 40％≤50％로의 감소 또는 15％≤24％로의 구획 단축; 심장 트로포닌 T/I ≥0.05 ng/MI
MTD: > 2/6 환자가 DLT를 경험하는 수준 이하의 용량 수준
환자 특징:
환자 특징
대상체의 수 (2005. 4. 22): 25
중앙 연령 (범위): 57 (30-72)
성별: 남성: 14
여성: 11
ECOG PS: 0: 12
1: 7
선행 화학요법 레지멘 (수) 0-3: 8
4-6: 4
>6: 2
종양 유형 전립선: 5
신장: 3
GIST: 2
육종: 2
결장직장: 1
유방: 1
이하선: 1
위: 2
흑색종: 2
식도: 2
NET (비부비동): 3
결장: 1
난소: 1
간: 1
용량 수준:
용량 수준 환자의 수 DLT (1 주기에서 나타남)
25 ㎎ 3 0
50 ㎎ 4 0
75 ㎎ 4 0
100 ㎎ (7 투약/7 정지) 4 0
100 ㎎ (연속적) 6 1 (G3 고혈압)
125 ㎎ (연속적)* 4 0
* 등록 진행중
Figure 112007089361312-pct00026
화합물 1의 항종양 활성의 증거는 환자의 7/22 (32％)가 그들의 최초 평가시에 안정한 질병 (SD)을 가진 것으로 관찰되었다. 또한, 4 개월 이상 동안의 SD가 이하선 종양을 갖는 환자 (7 개월 이상) 및 글리벡-무반응성 GIST 환자 (6 개월 이상)를 포함한 4 명의 환자에게서 보고되었다. 도 24는 휴지 치료법 (time off therapy)에 비해서 화합물 1에 의한 처리 중에 흡수의 현저한 감소를 나타내는 글리벡-무반응성 GIST를 갖는 환자의 주사된 PET-CT 영상으로, 화합물 1의 치료학적 효과를 시사한다. 이 환자 및 치료 프로토콜에 관한 추가의 정보는 이하에 기술된다:
위장관 간질성 종양 (GIST)으로 진단된 여성 환자.
환자는 이전에 다음과 같이 치료되었다:
약물 용량 주석
글리벡 200 내지 800 ㎎의 총 일일 용량
BAY 43-9006 400 ㎎ 1일 2 회 진행성 질병
브로스탈리신 18 ㎎ 1일 1 회
글리벡 100 ㎎ 격일로 약물 저항성
브로스탈리신 12.8 ㎎ 1일 1 회
환자는 상술한 바와 같이 2004년 6월 2일에 프로토콜의 포함 및 배제 기준에 따라 시험에 등록하였다.
화합물 1 치료 기록:
용량 빈도 스케줄
75 ㎎ 1일 1 회 7일 치료/7일 중지
100 ㎎ 1일 1 회 7일 치료/7일 중지
환자는 총 9,625 ㎎의 총용량을 투여받았다 (첨부된 표 참조). 환자는 화합 물 1에 의한 치료 중에 안정한 질병 (SD)에 도달하였다 (8 주기 완료됨).
도 25에 나타낸 바와 같이, 혈장 노출은 환자에게서 화합물 1의 용량에 비례하여 증가한다. 100 ㎎ 용량군에서 혈장 노출은 전임상 효능이 나타난 범위에 근접한다.
시험은 표적 조직에 대하여 제한된 접근이 있는 경우의 고형 종양 환자에게서 대용조직으로서 말초혈액 백혈구 (PDL)을 사용하여 화합물 1 생물학적 활성에 대한 약동학적 (PD) 마커를 확인하기 위해서 수행되었다.
이론적 근거 및 시험 개발:
● ERK 포스포릴화는 RTK 활성화의 잘 특정화된 하류 효과이며, 화합물 1은 종양 및 내피세포에서 ERK 포스포릴화를 변조시킨다.
● 화합물 1이 PBL에서 ERK 활성화에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해서, 정상적인 공여체로부터의 혈액을 화합물 1로 생체외 처리하였다. PMA 또는 PHA에 의한 외인성 자극은 부가되지 않았다.
● 내인성 pERK에서의 용량 의존적 억제는 PBL을 화합물 1과 함께 배양한 후에 웨스턴 블럿 및 유동세포분석에 의해서 관찰되었으며 (도 26), 이것은 이 시험이 화합물 1이 그의 표적을 변조시키는 것을 보여주기 위한 임상실험에 유용할 수 있음을 시사하는 것이다.
화합물 1은 글리벡 및 그 밖의 다른 키나제 억제제에 대해서 저항성인 것으로 확인된 ABL의 돌연변이체 형태 (T315l)를 포함하는 키나제의 패널에 대서 시험하였다 (참조: Shah, N.P. Science, 305, p. 399 (2004); 및 LaRosse, Cancer Res. 67, p. 7149-7153 (2002)). ABL에서 T315 잔기는 "게이트키퍼 잔기"로 알려져 있으며, ABL 구조 내의 소수성 포켓 내에 위치한다. 이 잔기뿐만 아니라 Flt-3, KIT, PDGFRa, EGFR 등과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 키나제에서 이 잔기의 유사한 위치가 글리벡, 이레사, 타르세바 (Tarceva) 등과 같은 특정의 화학요법제에 대해서 저항성이 된 환자와 같이 특정의 키나제 억제제에 대해서 재발된 환자에게서 빈번하게 발견된다. 따라서, 이들 약물에 대해서 저항성이 되는 이들 환자를 위한 대체 치료전략에 대한 의학적 필요성이 있다. 화합물 1은 글리벡의 경우의 > 10 마이크로몰 및 SU11248의 경우의 0.371 마이크로몰에 비해서 0.0184 마이크로몰의 IC50 값을 가지고 ABL의 T315l 돌연변이체를 억제하는 것으로 확인되었다. ABL은 세포질 타이로신 키나제이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 수용체 타이로신 키나제 및 세포질 타이로신 키나제를 포함하는 돌연변이체 키나제를 억제하는 능력을 갖는다. 화학식 I, II 및 III의 화합물은 ABL에서 이러한 돌연변이를 갖는 환자에게서 대체 치료법으로서 또는 다른 항암 약물과의 병용 치료법으로서 사용될 수 있다. 화합물 1은 또한, FLT3의 돌연변이체 형태 (D835Y)에 대해서 시험되었다. 이 잔기는 혈액학적 악성종양을 갖는 환자에게서 빈번하게 돌연변이된다 (참조: Yamamoto, Y. Blood, 97. 2434 (2001)). 따라서, 화합물 1과 같은 화학식 I, II 및 III의 화합물은 이러한 돌연변이를 갖는 환자를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. EGFR에서 게이트키퍼 잔기의 돌연변이는 제피티니브 (Iressa)로 치료된 폐암 환자에게서 최근에 보고되었다 (참조: Pao W., PLos Med. 2(3):e73 (2005)). 화합물 1은 "게이트키퍼 잔기"에서의 돌연변이를 갖는 다른 키나제에 대해서 시험한다. 화합물 1은 이들 돌연변이를 갖는 암 환자를 치료하는데 유용하다. 이하의 표는 글리벡 및 SU11248과 비교한 화합물 1의 IC50 값을 나타낸다.
Figure 112007089361312-pct00027
ABL (T315l)의 IC50을 측정하기 위한 시험은 이하의 절차를 사용하여 수행되었다. 25 ㎕의 최종 반응 부피로 Abl (T315l) (h) (5-10 mU)을 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 50 μM EAIYAAPFAKKK (SEQ ID NO: 7), 10 mM Mg아세테이트 및 33P 감마-표식된 ATP (약 500 cpm/pmol의 비활성, 필요에 따라 농축)와 함께 배양한다. 반응은 MgATP 혼합물을 첨가함으로써 개시된다. 실온에서 40 분 동안 배양한 후에, 반응은 5 ㎕의 3％ 인산 용액을 첨가함으로써 중지된다. 그 후, 10 ㎕의 반응액을 P30 필터 매트 상에 스포팅하고, 75 mM 인산 중에서 5 분 동안 3 회 및 메탄올 중에서 1 회 세척한 후에 건조시키고, 섬광 계수하였다.
화학식 II 및 화학식 III의 화합물과 같은 화학식 I의 다른 화합물은 상기 및 본 명세서에 인용된 문헌에서 기술한 바와 같이 제조되었다. 이들 화합물을 사용한 시험은 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온에 대해서 상술한 방법을 사용하여 수행된다. 이들 시험은 이들 화합물이 마우스, 인간 및 그 밖의 다른 포유동물 대상체에서 약물-저항성 암을 포함한 암을 치료하는데 유용하며, 본 명세서에 기술된 항암 약물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 유기 화합물은 호변이성의 현상을 나타낼 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 내에서 화학구조는 한번에 가능한 호변이성질체 형태 중의 단지 하나를 표현할 수 있기 때문에, 본 발명은 도시된 구조의 어떤 호변이성질체 형태라도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 화학식 IIIB를 갖는 화합물은 이하에서 하나의 호변이성질체인 호변이성질체 IIIBa로 나타낸다:
Figure 112007089361312-pct00028
Figure 112007089361312-pct00029
화학식 IIIB를 갖는 화합물의 다른 호변이성질체인 호변이성질체 IIIBb 및 호변이성질체 IIIBc는 이하에 나타낸다:
Figure 112007089361312-pct00030
Figure 112007089361312-pct00031
상기 인용된 특허, 특허출원 및 잡지의 논문 각각의 내용은 이에 의해서 마치 본 명세서에 충분히 기술된 것처럼 온전히 모든 목적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 설명을 위해서 본 명세서에 제시된 구체예로 제한되지 않으며, 이 하의 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 이러한 모든 형태들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (71)

  1. 하기 화학식의 화합물 1, 이 화합물의 호변이성질체, 이 화합물의 염, 상기 호변이성질체의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 글리벡-저항성 위장관 간질성 종양 환자에서 V-abl 아벨슨 (Abelson) 쥐 백혈병 바이러스 종양원 상동체 1, v-kit 하디-주커만 (Hardy-Zuckerman) 4 고양이 육종 바이러스 종양원 상동체, 혈소판 유도된 성장인자 수용체α, 내피 성장인자 수용체 또는 fms-양 타이로신 키나제-3인, 돌연변이체 게이트키퍼 (gatekeeper) 잔기를 포함하는 세포질 타이로신 키나제 또는 수용체 타이로신 키나제를 억제하여 글리벡-저항성 위장관 간질성 종양을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
    Figure 112013044022998-pct00071
  2. 제1항에 있어서, 염이 화합물의 락트산 염인 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 글리벡-저항성 위장관 간질성 종양의 치료에 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 이마티니브 메실레이트 (글리벡), 소라페니브, 브로스탈리신, 레날리도마이드 (레블리미드), 탈리도마이드 (탈로미드), 도세탁셀 (탁소테레), 에를로티니브 (타르세바), 바탈리니브 (PTK-787), 혈관 내피 성장 인자-트랩, 펜레티딘, 보르테조미브, 베바시주마브 (아바스틴), 퍼투주마브 및 리툭시마브로부터 선택되는 1종 이상의 항암 약물과 조합된 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 키나제가 V-abl 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스 종양원 상동체 1 T315I 돌연변이인 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 키나제가 fms-양 타이로신 키나제-3 D835Y 돌연변이인 약제학적 조성물.
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