JP2024514958A - ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ｕｓｐ２２）の阻害剤、並びに疾患及び障害の治療のためのその使用 - Google Patents

ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ｕｓｐ２２）の阻害剤、並びに疾患及び障害の治療のためのその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024514958A
JP2024514958A JP2023565294A JP2023565294A JP2024514958A JP 2024514958 A JP2024514958 A JP 2024514958A JP 2023565294 A JP2023565294 A JP 2023565294A JP 2023565294 A JP2023565294 A JP 2023565294A JP 2024514958 A JP2024514958 A JP 2024514958A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
usp22
cells
nitrothiophen
reg
carbonitrile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023565294A
Other languages
English (en)
Inventor
ファン トーユイ
モンタウティ エレナ
イェン ミン
カオ ペイシュエ
タン エイミー
リウ ホイピン
Original Assignee
ノースウェスタン ユニバーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノースウェスタン ユニバーシティ filed Critical ノースウェスタン ユニバーシティ
Publication of JP2024514958A publication Critical patent/JP2024514958A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A61K31/10—Sulfides; Sulfoxides; Sulfones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4436—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の発現に関連する疾患又は障害を治療する方法を開示する。開示する方法は、癌を含めた、細胞増殖に関連する疾患又は障害を治療するのに利用され得る。E.C. 3.4.19.12活性、又はユビキチンのC末端グリシンによって形成されるエステル、チオエステル、アミド、ペプチド、及びイソペプチド結合のチオール依存性加水分解、を特異的に阻害するUSP22の阻害剤もまた開示する。開示する化合物はまた、USP22活性に関連する細胞増殖性疾患又は障害の治療のための医薬組成物及び方法に使用されてもよい。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年4月23日に出願された米国特許出願第63/201,330号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願の内容を全体として参照により援用する。
連邦政府によって支援された研究開発に関する記述
本願発明は、国立衛生研究所から授与されたCA232347及びCA220801の下で国庫支援を受けて成された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介して電子的に出願され、かつ、.txt形式で電子的に提出した配列表を包含する。該.txtファイルには、2022年4月25日に作成した「702581_02132_ST25.txt」と題した配列表が収められており、そのサイズは18,669バイトである。この.txtファイルに収められた配列表は、本明細書の一部であり、その全体として参照により本明細書に援用する。
背景
本発明の分野は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の小分子阻害剤と、USP22の生物学的活性に関連する疾患及び障害を治療する際のその使用に関する。特に、本発明の分野は、癌などの細胞増殖性疾患及び障害の治療のための医薬組成物として処方され得るUSP22のペプチダーゼ活性の小分子阻害剤に関する。
ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の発現は、すべてのタイプのヒト癌ではないが、その多くで増強されることが多い。USP22は、一部、腫瘍サプレッサp53転写活性を減少させる及び細胞サイクルを駆動することよって、肺及び結腸癌の腫瘍形成及び進行における潜在的癌遺伝子として機能する。免疫細胞における遺伝子のUSP22抑制を有するマウスは、肺癌、リンパ腫、黒色腫、及び結腸癌を含めた複数の同種同系腫瘍モデルを使用してより良好な腫瘍拒絶があった。一方で、腫瘍細胞におけるUSP22の阻害がそれらのアポトーシスを直接誘発でき、かつ、細胞周期進行を遮断でき、その一方で、免疫細胞におけるUSP22抑制が抗腫瘍性免疫を促進するので、これらの結果は、USP22が抗腫瘍治療における理想的な治療標的であることを示している。
ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の阻害剤と、その疾患及び障害の治療のための使用が、本明細書に開示されている。その技術の一態様は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)活性に関連する疾患又は障害の治療を必要としている対象を治療する方法を提供し、該方法は、USP22の生物学的活性を阻害する治療薬の有効量をその対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、疾患又は障害は、細胞増殖性疾患又は障害である。いくつかの実施形態において、疾患又は障害は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、胃癌、膵臓癌、黒色腫、リンパ腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、神経膠腫、中皮腫、神経芽細胞腫、マントル細胞リンパ腫、及び急性骨髄性白血病から成る群から選択され得る。
その技術の別の態様は、それを必要としている対象においてTreg細胞活性を抑制する方法を提供し、該方法は、USP22の活性を阻害する治療薬の有効量をその対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、感染症を患っている。いくつかの実施形態において、対象は、突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV2)感染症を患っている。
その技術の別の態様は、それを必要としている対象のUSP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害する方法を提供し、該方法は、USP22の生物学的活性を阻害する治療薬の有効量を対象に投与することを含む。
開示する方法に関して、治療薬は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の阻害剤である。いくつかの実施形態において、治療薬は、表S1から選択される1若しくは複数の化合物を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルである。
本明細書に記載した治療薬と好適な医薬担体を含む医薬組成物。いくつかの実施形態において、治療薬は、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルである。いくつかの実施形態において、組成物は、それを必要としている対象に投与されたときに、USP22の生物学的活性を阻害するための化合物の有効量を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、それを必要としている対象においてTreg細胞活性を抑制するための化合物の有効量を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、
それを必要としている対象のUSP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害するための化合物の有効量を含む。
図1：腫瘍内Tｒｅｇ細胞は、Usp22及びUsp21のmRNA発現が増加している。A～C、対照マウス脾臓、及び腫瘍-抗原投与マウス脾臓及び腫瘍細胞からのYFP+選別Tｒｅｇ細胞のmRNAレベル。全mRNAレベルは、非抗原投与マウスのWT Tｒｅｇ細胞レベルに対して計算した。脾臓B16) Usp22：n=5～6、Usp21：n=3～5、Usp7：n=3～5。LLC1) Usp22：n=5～6、Usp21：n=3～6、Usp7：n=3～6。EG7) Usp22：n=4～5、Usp21 n=3～4、Usp7：n=3～7。D、同じ患者から単離された癌に隣接する健康な肺組織から回収したTreg細胞に対する、患者からのヒト肺癌組織から単離されたCD4＋CD25＋CD127－Tｒｅｇ細胞におけるUsp22、Usp21、及びFoxp3のmRNAレベル。AHL：隣接する健康な肺。LTu：肺腫瘍。Usp22：n=8、Usp21：n=3、FoxP3：n=11。E、ヒト肺癌患者から単離されたTｒｅｇ細胞におけるUsp21及びFoxP3のmRNAレベル。AHL：隣接する健康な肺。LTu：肺腫瘍n=9。A～C、対応のない両側t-検定をおこなって、統計的有意性を決定した。D、両側対応のあるt-検定を実施して、Ltu対AHLにおけるFoxP3及びUsp22の統計的有意性を決定した。E、線形回帰をLtuの中のUsp22とFoxP3との相関関係について計算した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 D、同じ患者から単離された癌に隣接する健康な肺組織から回収したTreg細胞に対する、患者からのヒト肺癌組織から単離されたCD4＋CD25＋CD127－Tｒｅｇ細胞におけるUsp22、Usp21、及びFoxp3のmRNAレベル。AHL：隣接する健康な肺。LTu：肺腫瘍。Usp22：n=8、Usp21：n=3、FoxP3：n=11。E、ヒト肺癌患者から単離されたTｒｅｇ細胞におけるUsp21及びFoxP3のmRNAレベル。 図2：TGF-β増大を分泌する腫瘍細胞は、iTｒｅｇ細胞においてUsp22及びUsp21が増加する。A、24時間にわたるT細胞培地との50/50での腫瘍細胞処理培地の添加と比較した、対照T細胞培地中のiTｒｅｇ細胞におけるUSP mRNAレベル。Usp22) 対照：n=14、B16：n=10、LLC1：n=5、EG7：n=4。Usp21) 対照：n=12、B16：n=8、LLC1：n=3、EG7：n=3。Usp7) 対照：n=10、B16：n=7、LLC1：n=4、EG7：n=5。B、24時間にわたるT細胞培地を用いた50/50での腫瘍細胞処理培地の添加と比較した、対照T細胞培地中のiTｒｅｇ細胞におけるUSPタンパク質レベル。 C、腫瘍細胞培地中のTGF-β阻害剤の添加を伴ったiTｒｅｇ細胞におけるUSP mRNAレベル(Usp22) 対照：n=22、B16：n=15、B16+Inh：n=5、LLC1：n=10、LLC1+inh：n=5、EG7：n=7、EG7+inh：n=5。Usp21) 対照：n=20、B16：n=13、B16+Inh：n=5、LLC1：n=8、LLC1+inh：n=4、EG7：n=7、EG7+inh：n=5。Usp7) 対照：n=14、B16：n=10、B16+Inh：n=5、LLC1：n=8、LLC1+inh：n=3、EG7：n=8、EG7+inh：n=6。D、TGFb阻害下でのUsp22プロモーターに沿ったSMAD2、SMAD3、及びSMAD4結合能。SMAD2：n=4～5。SMAD3：n=3。SMAD4：n=3。A～C、未処理WT iTreg細胞に対して計算した全mRNAレベル。A～D、多重比較を伴った通常の一元配置ANOVAを実施して、有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 図3：Usp22及びUsp21は、TMEで見られる環境及び代謝的ストレス下でnTｒｅｇ細胞におけるFOXP3の安定性を必要とする。全mRNAレベルを、未処理WT Tｒｅｇ細胞に対して計算した。A、24時間後の(n=6～13)の通常酸素状態(21%のO２)対低酸素状態(1%のO２)条件のnTｒｅｇ USP mRNAレベル。B、通常酸素状態(21%のO２)対低酸素状態(1%のO２)条件における72時間後のWT nTｒｅｇ細胞に対する22KO nTｒｅｇ細胞におけるFOXP3 MFI変化(n=5)。C、24時間にわたるdMOGを用いた処理後のnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=6)。D、通常培地(11mMのグルコース)に対する24時間後のグルコース制限(0.5mM)条件への曝露後のnTｒｅｇ細胞におけるUSP mRNAレベル(n=7～18)。E、対照からのnTｒｅｇ細胞、及び48時間後の低グルコース条件下で培養した細胞における相対FOXP3 MFI変化(n=3)。F、24時間にわたるアミノ酸飢餓下でのnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～9)。G、通常培地条件対アミノ酸飢餓における48時間後の培養したUsp22又はUsp21-ヌルnTｒｅｇ細胞におけるFOXP3 MFI安定性(n=3)。H、24時間にわたる1μMのオリゴマイシンAを用いた処理後のnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～7)。I、24時間にわたる250nMのTorin1を用いた処理後のnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～7)。A、C～D、F及びH～I、多重比較を伴った通常の一元配置ANOVAを実施して、有意性を決定した。B、E及びG、対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 C、24時間にわたるdMOGを用いた処理後のnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=6)。F、24時間にわたるアミノ酸飢餓下でのnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～9)。I、24時間にわたる250nMのTorin1を用いた処理後のnTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～7)。 図4：Treg細胞におけるUsp22及びUsp21の喪失は、FoxP3発現と細胞機能を示差的に損なう。A、WT、21KO、22KO、及びdKOマウスにおけるUsp22及びUsp21レベル(n=5～8)。全mRNAレベルを、WT Tｒｅｇ細胞に対して計算した。B、2カ月の期間を通じたマウスの計量(n=2～9)。C、CD44ｈｉCD62Lｌｏ発現によって計測されるCD4+及びCD8+T細胞の末梢活性化(n=7～9)。D、WT及びKO動物の脾臓Tｒｅｇ細胞におけるFOXP3 MFIの代表ヒストグラム(左側)及び定量化(右側)(n=6～8)。E、21KO(n=2)、22KO(n=3)、及びdKO(n=3)対WT(n=3)マウスのTｒｅｇ細胞識別特性遺伝子(*有意性を調整するP<0.01)のヒートマップ。F、22KO、21KO及びdKOの間のDEGs(adj. p<0.01)のベン図(n=2～3)。G、Wt、21KO、22KO、及びdKOマウスのRNA配列決定から作り出した遺伝子セットを比較する分子識別特性データベースに設定した顕著な特徴の遺伝子からの遺伝子セット濃縮分析(偽発見率、FDR<25%)からの正規化濃縮スコア(n=2～3)。A～C、多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。D、多重比較を伴った一元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 B、2カ月の期間を通じたマウスの計量(n=2～9)。C、CD44ｈｉCD62Lｌｏ発現によって計測されるCD4+及びCD8+T細胞の末梢活性化(n=7～9)。 D、WT及びKO動物の脾臓Tｒｅｇ細胞におけるFOXP3 MFIの代表ヒストグラム(左側)及び定量化(右側)(n=6～8)。 E、21KO(n=2)、22KO(n=3)、及びdKO(n=3)対WT(n=3)マウスのTｒｅｇ細胞識別特性遺伝子(*有意性を調整するP<0.01)のヒートマップ。 F、22KO、21KO及びdKOの間のDEGs(adj. p<0.01)のベン図(n=2～3)。 G、Wt、21KO、22KO、及びdKOマウスのRNA配列決定から作り出した遺伝子セットを比較する分子識別特性データベースに設定した顕著な特徴の遺伝子からの遺伝子セット濃縮分析(偽発見率、FDR<25%)からの正規化濃縮スコア(n=2～3)。 図5：Tｒｅｇ細胞におけるUsp21及びUsp22の欠失は、抗腫瘍性免疫を高めるために相乗作用を示す。A、WT、21KO、22KO、及びdKOマウスの脇腹に皮下注射されたB16細胞の腫瘍増殖曲線(n=13～14)。B、B16抗原投与マウスの脾臓内のCD4＋及びCD8＋T細胞のCD44ｈｉCD62Lｌｏによって定義されるパーセント活性化(n=5～6)。C、末梢CD8＋T細胞のパーセントIFN-γ及びGranzyme B(GZMB)産生(n=3)。D、WTに対する末梢Tｒｅｇ細胞のFOXP3 MFI(n=7～9)。E、WTに対する末梢Tｒｅｇ細胞のPD-1 MFI(n=3)。F、WTに対する末梢Tｒｅｇ細胞のGITR MFI(n=6～8)。G、WTに対する末梢Tｒｅｇ細胞のLAG3 MFI(n=3)。H、腫瘍中のCD4＋及びCD8＋T細胞の%浸潤の代表的なフローサイトメトリーのプロット及びグラフ表示(n=5～6)。I～J、腫瘍内のCD8＋及びCD4＋細胞(n=5～6)のパーセンテージIFN-γ及びGZMB産生。K、itTｒｅｇ細胞のWTに対するCD4＋細胞の代表的なFOXP3+のパーセンテージ(n=6)。L、WT(n=6～9)に対する腫瘍Tｒｅｇ細胞の中のFOXP3 MFIの代表的なフロープロット(左側)及び定量的表示。M、WT及びdKOマウスの脇腹に皮下注射したTGF-βshRNA又はスクランブル対照shRNAで処理したB16細胞の腫瘍増殖曲線(n=3～4)。A～C、H～J、及びM、行間の多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。D～G、並びにK及びL、行間の多重比較を伴った一元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 。C、末梢CD8＋T細胞のパーセントIFN-γ及びGranzyme B(GZMB)産生(n=3)。F、WTに対する末梢Tｒｅｇ細胞のGITR MFI(n=6～8)。G、WTに対する末梢Tｒｅｇ細胞のLAG3 MFI(n=3)。 H、腫瘍中のCD4＋及びCD8＋T細胞の%浸潤の代表的なフローサイトメトリーのプロット及びグラフ表示(n=5～6)。I～J、腫瘍内のCD8＋及びCD4＋細胞(n=5～6)のパーセンテージIFN-γ及びGZMB産生。K、itTｒｅｇ細胞のWTに対するCD4＋細胞の代表的なFOXP3+のパーセンテージ(n=6)。 I～J、腫瘍内のCD8＋及びCD4＋細胞(n=5～6)のパーセンテージIFN-γ及びGZMB産生。L、WT(n=6～9)に対する腫瘍Tｒｅｇ細胞の中のFOXP3 MFIの代表的なフロープロット(左側)及び定量的表示。M、WT及びdKOマウスの脇腹に皮下注射したTGF-βshRNA又はスクランブル対照shRNAで処理したB16細胞の腫瘍増殖曲線(n=3～4)。 図6：Usp22阻害剤投与は、抗腫瘍性免疫を高める。A、化合物CS30(Usp22i-S02)の構造。B、インビボにおける20mg/kgのUsp22i-S02を用いた処理後のTｒｅｇ細胞のWT及び22KOのFOXP3 MFI(n=3)。C、対照に対する、20mg/kgのUsp22i-S02を用いて処理したマウスのCD4＋体皮細胞のFOXP3+CD25＋MFIの代表的なフローサイトメトリーのプロット(n=5)。D、Usp22i-S02投与後のFoxp3 MFIのグラフ表示(n=5)。E、15日目に開始する、100μLの油中の、20mg/kg/回のUsp22阻害剤の追加を用いて又はそれなしにWTマウスの脇腹に皮下注射したLLC1細胞の腫瘍増殖曲線(n=4)。F～G、腫瘍の中のCD4＋及びCD8＋T細胞の代表的なフローサイトメトリープロット及び%浸潤のグラフ表示(n=4)。H、itTreg Foxp3 MFIの代表的なヒストグラムプロット及びグラフ表示(n=4)。I、itTreg抑制マーカーのMFI(n=3～4)。J、対照及びUsp22-S02処理マウスにおけるパーセントFoxp3+IFNg+itTreg細胞(n=3～4)。B、D～E、G、H～I、行間の多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。J、対応のない両側T検定を実施して、有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 D、Usp22i-S02投与後のFoxp3 MFIのグラフ表示(n=5)。F～G、腫瘍の中のCD4＋及びCD8＋T細胞の代表的なフローサイトメトリープロット及び%浸潤のグラフ表示(n=4)。H、itTreg Foxp3 MFIの代表的なヒストグラムプロット及びグラフ表示(n=4)。I、itTreg抑制マーカーのMFI(n=3～4)。J、対照及びUsp22-S02処理マウスにおけるパーセントFoxp3+IFNg+itTreg細胞(n=3～4)。 図7：腫瘍内Tｒｅｇ細胞は、Foxp3及び活性化マーカーが増加している。A、非腫瘍-抗原投与対照、並びにB16-、LLC1-、及びEG7-抗原投与マウスからの細胞のフローサイトメトリーによる代表的なCD4+ FOXP3+パーセンテージ。B16：n=3～4、G7：n=2～6、及びLLC1：n=5～6。B、対照と腫瘍-抗原投与マウスのCD45+CD4+FOXP3+(Tｒｅｇ)細胞に関する、腫瘍と脾臓におけるFOXP3 MFIの代表的な重ね合わせ。C、対照脾臓、腫瘍-抗原投与脾臓、及び腫瘍Tｒｅｇ細胞のFOXP3 MFIの定量化(n=4～11)。D～G、B16、EG7、又はLLC1-抗原投与動物からの脾臓、並びに脾臓及び腫瘍Tｒｅｇ細胞から単離された対照Tｒｅｇ細胞下のTreg細胞関連マーカーのMFI。CD25：n=4～11。GITR：n=3～11。CTLA-4：n=4～11。PD-1：n=4～11。すべてのMFI値を、非抗原投与マウス脾臓のWT Tｒｅｇ細胞レベルに対して計算した。C～G、対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 C、対照脾臓、腫瘍-抗原投与脾臓、及び腫瘍Tｒｅｇ細胞のFOXP3 MFIの定量化(n=4～11)。D～G、B16、EG7、又はLLC1-抗原投与動物からの脾臓、並びに脾臓及び腫瘍Tｒｅｇ細胞から単離された対照Tｒｅｇ細胞下のTreg細胞関連マーカーのMFI。 D～G、B16、EG7、又はLLC1-抗原投与動物からの脾臓、並びに脾臓及び腫瘍Tｒｅｇ細胞から単離された対照Tｒｅｇ細胞下のTreg細胞関連マーカーのMFI。 D～G、B16、EG7、又はLLC1-抗原投与動物からの脾臓、並びに脾臓及び腫瘍Tｒｅｇ細胞から単離された対照Tｒｅｇ細胞下のTreg細胞関連マーカーのMFI。 図8：TGF-βは、Tｒｅｇ細胞においてUsp22及びUsp21の発現を誘発する。A、腫瘍馴化培地(TCM)実験の視覚表示。B、TGF-β誘導ポスト分極後下におけるiTｒｅｇ USP mRNAレベル。Usp22：n=18～19。Usp21：n=7～8。Usp7：4～5。C、TGF-β阻害剤を伴った又はそれなしのTGF-β下のiTｒｅｇ USP mRNAレベル。Usp22：n=3～11。Usp21：n=8～18。Usp7：3～8。D、TGF-β誘導を伴ったTｒｅｇ FoxP3 mRNAレベル(n=10)。B～D、WT無処理iTｒｅｇ細胞に対して計算された全mRNA値。E、B16、LLC1、及びEG7腫瘍馴化培地のTGF-βレベル(n=3)。F～H、腫瘍馴化培地におけるUSP誘導とTGF-βレベルの間の相関関係。Usp22：n=3～10。Usp21：n=3～8。Usp7：n=3～6。I、対照又はTGF-βshRNA処理B16細胞のTGF-βmRNAレベル(n=3)。J、shRNA処理B16細胞を注射したマウスからの選別itTreg細胞におけるUsp22のmRNAレベル(n=4)。B、D、及びI、対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。C及びE、群間の多重比較を伴った通常の一元配置Anovaを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 E、B16、LLC1、及びEG7腫瘍馴化培地のTGF-βレベル(n=3)。F～H、腫瘍馴化培地におけるUSP誘導とTGF-βレベルの間の相関関係。Usp22：n=3～10。Usp21：n=3～8。Usp7：n=3～6。I、対照又はTGF-βshRNA処理B16細胞のTGF-βmRNAレベル(n=3)。J、shRNA処理B16細胞を注射したマウスからの選別itTreg細胞におけるUsp22のmRNAレベル(n=4)。 図9：MAD3及びSMAD4はUsp22プロモーター上に保存されたSBEに結合するが、その一方で、Usp21は、非標準TGF-βシグナル伝達によって上方制御される。A、Usp22プロモーター領域を、有望なSMAD結合要素(SBE)と重ね合わせ、プライマーの置換をChIPについておこなった。B及びC、ChIP-qPCRを使用したUsp22及びUsp21プロモーター領域に沿ったSMAD2、SMAD3、及びSMAD4の結合。Usp22：n=2～7；Usp21：n=1～2。D～F、Foxp3 MFIの代表的なフロープロット及びグラフ表示、並びに5ng/μlのTGF-β中で分極化したWT及びUsp21-ヌルiTreg細胞中のパーセンテージ(n=3)。G、TGF-β非標準経路p38キナーゼ阻害剤(p38i)を伴った又はそれなしのTGF-β下でのiTｒｅｇ Usp21mRNAレベル(n=4)。E及びF、対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。G、群間の多重比較を伴った通常の一元配置Anovaを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 図10：USP22は、正のフィードバックループにおけるSMADタンパク質安定化によってTGF-βシグナル伝達を相互的に増強する。A、USP22 WT及びKO iTｒｅｇ細胞におけるSMAD2、SMAD3、及びSMAD4の代表的なタンパク質レベル。B、USP22 WTとKO iTｒｅｇ細胞におけるSMAD2、SMAD3、及びSMAD4のmRNAレベル(n=3)。未処理WT iTｒｅｇ細胞に対して計算された全mRNAレベル。対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。C、iTｒｅｇ細胞内のSMAD2、SMAD3、及びSMAD4タンパク質を用いたUSP22の内因性IP。 D～F、SMAD2、SMAD3、及びSMAD4を用いたUSP22の293T細胞における過剰発現DUBアッセイIP。G、2、4、及び6時間にわたるシクロヘキシミド処理下でのWT及びKO iTｒｅｇ細胞におけるSMAD2及びSMAD4タンパク質分解。H、4時間にてMG132プロテアーゼ阻害剤を用いた又はそれなしのシクロヘキシミド処理下でのWT及びKO iTｒｅｇ細胞におけるSMAD2及びSMAD4タンパク質分解。 図11：HIF-α及びAMPK/mTORバランスは、USP22及びUSP21によってTｒｅｇ細胞FoxP3の安定性を調節する。未抗原投与WT Tｒｅｇ細胞に対して計算された全mRNAレベル。A、4時間後の通常酸素条件及び低酸素条件におけるiTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=4～5)。B、24時間後の通常酸素条件及び低酸素条件におけるiTreg USPタンパク質レベル。C、Foxp3 MFIレベルの安定性分析計算の視覚表示。%O２は、酸素のパーセンテージであり、Gluはグルコースであり、及びAAはアミノ酸である。1つの変数が一度に変化し、他のものはベースライン対照を維持した。D、24時間にわたるDMOGでの処理後のiTｒｅｇ細胞USP mRNAレベル(n=6)。E、未処理のnTｒｅｇに対する、48時間にわたるDMOGで処理したnTｒｅｇ細胞Foxp3 MFIの変化(n=9～10)。F、未処理細胞と比較した低酸素状態における72時間後のiTregのFoxp3 MFI変化(n=3)。Ｇ、未処理iTreg細胞に対する72時間にわたるDMOGで処理したiTregのFoxp3 MFIの変化(n=4)。H、24時間後の低グルコース条件下でのiTｒｅｇ細胞のUSP mRNAレベル(n=3～8)。I、24時間後の低グルコース条件下でのiTｒｅｇ細胞のUSPタンパク質レベル。J、完全培地に対する、72時間後の低グルコース条件でのiTｒｅｇ Foxp3 MFIの変化(n=7)。K、24時間後の完全培地に対する、アミノ酸飢餓におけるiTｒｅｇ細胞のUSP mRNAレベル(n=6)。L、未処理iTｒｅｇ細胞に対する、72時間にわたるアミノ酸飢餓下でのiTｒｅｇ細胞のFoxp3 MFIの変化(n=6)。M、24時間にわたる1μMのオリゴマイシンを用いた処理後のiTｒｅｇ細胞のUSP mRNAレベル(n=6)。N、24時間にわたる250nMのTorin1を用いた処理後のiTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～9)。A、D、H、及びK～M、群間の多重比較を伴った通常の一元配置Anovaを実施して、統計的有意性を決定した。E～G及びJ、対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 H、24時間後の低グルコース条件下でのiTｒｅｇ細胞のUSP mRNAレベル(n=3～8)。I、24時間後の低グルコース条件下でのiTｒｅｇ細胞のUSPタンパク質レベル。J、完全培地に対する、72時間後の低グルコース条件でのiTｒｅｇ Foxp3 MFIの変化(n=7)。K、24時間後の完全培地に対する、アミノ酸飢餓におけるiTｒｅｇ細胞のUSP mRNAレベル(n=6)。L、未処理iTｒｅｇ細胞に対する、72時間にわたるアミノ酸飢餓下でのiTｒｅｇ細胞のFoxp3 MFIの変化(n=6)。M、24時間にわたる1μMのオリゴマイシンを用いた処理後のiTｒｅｇ細胞のUSP mRNAレベル(n=6)。N、24時間にわたる250nMのTorin1を用いた処理後のiTｒｅｇ USP mRNAレベル(n=5～9)。 図12：Treg細胞におけるUsp22及びUsp21の喪失は、Treg代謝経路を示差的に変更する。A、KO及びWT動物の末梢器官におけるT及びB細胞のパーセンテージ(n=5～9)。B、CD45+細胞?の末梢器官におけるCD4及びCD8T細胞のパーセント(n=4～10)。C～E、WT(n=3)マウスに対するU21KO(n=2)、U22KO(n=3)、及びdKO(n=3)の代謝経路(有意性を、P<0.01に調整した*によって指摘する)のヒートマップ。遺伝子を、dKOマウスにおける示差的発現(adj. p<0.01)に基づいて選択した。WT(n=5)nTｒｅｇ細胞に対する21KO(n=5)、22KO(n=5)、及びdKO(n=4～5)の、F、基礎ミトコンドリアOCR及びG、基礎ECAR。A～B、行間のSidakの多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。F～G、行間のTukeyの多重比較を伴った一元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 C～E、WT(n=3)マウスに対するU21KO(n=2)、U22KO(n=3)、及びdKO(n=3)の代謝経路(有意性を、P<0.01に調整した*によって指摘する)のヒートマップ。 C～E、WT(n=3)マウスに対するU21KO(n=2)、U22KO(n=3)、及びdKO(n=3)の代謝経路(有意性を、P<0.01に調整した*によって指摘する)のヒートマップ。 C～E、WT(n=3)マウスに対するU21KO(n=2)、U22KO(n=3)、及びdKO(n=3)の代謝経路(有意性を、P<0.01に調整した*によって指摘する)のヒートマップ。 図13：Usp21-欠失は、細胞を変化させる。A、22KO及びdKOマウスのRNA配列決定から作り出した遺伝子セットを比較する分子識別特性データベースに設定した顕著な特徴の遺伝子からの遺伝子セット濃縮分析(偽発見率、FDR<1%)からの正規化濃縮スコア(n=3)。B、CD4+Foxp3+ Treg区画の中のパーセントKi67陽性細胞の代表的なグラフ(n=7)。Tukeyの多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。D、多重比較を伴った一元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 図14：構造ベースの階層的な仮想スクリーニングによるUsp22特異的阻害剤の開発とバリデーション。A、構造ベースの仮想スクリーニングのフローチャート。B、USP22-m(SWISS MODELを使用して作り出されるUSP22モデル)の全体的な立体構造は、カラーコードバーを使用した保存度によって色分けされたカートゥーン漫画によって表される。USP22の触媒中心は、結合位置と定義された。C、PROCHEK経過(左側)によって作り出されるUSP22-mのRamachandranプロット統計。UBP8(PDB：3MHS)及びUSP22-m(右側)と比較したUSP22-md(MD最適化モデル)の触媒中心ループの置換。 D、USP22-md構造のポケット内に結合した緑色のスティックで表示されたS02(左側)。S02のUSP22-mdとの水素結合及び疎水性接触を示すLigplot(中央)。USP22-mdの結合ポケット内のS02の最高ランク位置(緑色で示す)が提示され、結合によって作り出される。 E、MDシミュレーション及びPBSA計算後のアミノ酸残基の個別のエネルギー寄与。F～G、USP22モデルに対する化合物S02の結合自由エネルギー。 図15：Usp22i-S02は、Usp22媒介Foxp3脱ユビキチン化を止める。A、WT対、様々な用量のUsp22i-S02で処理された22KO iTreg細胞におけるFoxp3 MFI変化のグラフ表示(n=3)。B、Usp22阻害剤濃度が0～20μg/mLから増加するので、iTreg細胞におけるFoxp3 MFIレベルの代表的なヒストグラム。C、様々な用量のUsp22i-S02で処理されたiTreg細胞の細胞生存率(n=3)。D、10μg/mLのUsp22i-S02で処理されたWT及び22KOマウスにおけるFOXP3及びUSP22タンパク質レベル。Ｅ～F、様々な用量のUsp22i-S02で処理されたヒトTｒｅｇ細胞のFoxp3 MFIのグラフデータ及び代表的なデータ(n=3)。G、10μg/mLにてUsp22i-S02で処理されたWT、Usp21-ヌル、及びUsp22-ヌルTｒｅｇ細胞におけるFoxp3 MFIのグラフ表示(n=3)。H、10μg/mLのUsp22i-S02の添加を伴った又はそれなしのシクロヘキシミド処理iTｒｅｇ細胞(10μg/mL)のFOXP3及びUSP22タンパク質分解。I～J、高濃度のUsp22i-S02下でのFOXP3を用いたUSP22のiTｒｅｇ細胞における内因性DUBアッセイIP。K、Usp22阻害剤濃度が0～20μg/mLから増加するので、iTｒｅｇ細胞におけるFoxp3 mRNAレベル(n=3)。L、20μMのMG132で処理した20μg/mLのUsp22阻害剤を伴った又はそれなしのWT iTｒｅｇ細胞におけるFOXP3及びUSP22レベル。M、10μg/mLのUsp22i-S02の添加を伴った又はそれなしの低グルコース条件に置かれたWT又はUsp22-ヌルnTｒｅｇ細胞のいずれかのFoxp3 MFIの減少のパーセンテージのグラフ表示(n=7～8)。N、10μg/mLのUsp22i-S02の添加を伴った又はそれなしの低酸素状態又は低アミノ酸条件に置かれたWT nTｒｅｇ細胞のFoxp3 MFIの減少のパーセンテージのグラフ表示(n=3～5)。G、群内で比較された対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。K、対照に対する行間のDunnetの多重比較を伴った一元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。m～N、行間のSidakの多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 D、10μg/mLのUsp22i-S02で処理されたWT及び22KOマウスにおけるFOXP3及びUSP22タンパク質レベル。G、10μg/mLにてUsp22i-S02で処理されたWT、Usp21-ヌル、及びUsp22-ヌルTｒｅｇ細胞におけるFoxp3 MFIのグラフ表示(n=3)。H、10μg/mLのUsp22i-S02の添加を伴った又はそれなしのシクロヘキシミド処理iTｒｅｇ細胞(10μg/mL)のFOXP3及びUSP22タンパク質分解。I～J、高濃度のUsp22i-S02下でのFOXP3を用いたUSP22のiTｒｅｇ細胞における内因性DUBアッセイIP。K、Usp22阻害剤濃度が0～20μg/mLから増加するので、iTｒｅｇ細胞におけるFoxp3 mRNAレベル(n=3)。 L、20μMのMG132で処理した20μg/mLのUsp22阻害剤を伴った又はそれなしのWT iTｒｅｇ細胞におけるFOXP3及びUSP22レベル。M、10μg/mLのUsp22i-S02の添加を伴った又はそれなしの低グルコース条件に置かれたWT又はUsp22-ヌルnTｒｅｇ細胞のいずれかのFoxp3 MFIの減少のパーセンテージのグラフ表示(n=7～8)。N、10μg/mLのUsp22i-S02の添加を伴った又はそれなしの低酸素状態又は低アミノ酸条件に置かれたWT nTｒｅｇ細胞のFoxp3 MFIの減少のパーセンテージのグラフ表示(n=3～5)。 図16：Usp22i-S02は、未感作マウスに対してほとんど効果がないが、それにもかかわらず、LLC1抗原投与マウスにおける抗腫瘍性免疫を高める。A、処理の間にわたる、DMSO処理対照に対するUsp22i-S02処理マウスの体重(n=4)。A～F、注射は、10mg/kgにて連続3日間にわたり1日2回であった(n=4)。B、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスにおける細胞集団のパーセント(n=3～4)。C、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスにおける様々な区画内のKI-67+細胞のパーセント(n=3～4)。D、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスにおけるCD45+細胞においてゲートされたT細胞中のパーセント CD44ｈｉCD62Lｌｏ(n=3)。E、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスにおけるCD45+細胞にゲートするAnnexin+PI+ T細胞のパーセント(n=4)。F～H、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスの臓器毒性パネル(VetScan VS2 Comprehensive Diagnostic Rotorロット1061AA2)(n=2～3)。I、10mg/kgにてUsp22i-S02で処理されたWTマウスにおける皮下注射されたLLC1の増殖曲線(n=5～10)。I～Q、注射は、10mg/kgにて連続5日間にわたり1日2回であった。J、16日目にIから切除された腫瘍の重量(n=10)。K～L、CD45+細胞でゲートされた浸潤T細胞の代表的なフロープロット及びグラフ表示(n=5)。M～P、Usp22i-S02で処理されたマウスからの腫瘍内CD8＋ T細胞の特徴づけ(n=3～5)。Q、マウスからCD4+Foxp3+にゲートした、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理されたマウスからの腫瘍内Tｒｅｇ細胞のパーセント)(n=5)。A～E、I及びL、対照に対する行間のSidaksの多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。F～H、J、及びM～Q、対応のない両側t-検定を実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 E、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスにおけるCD45+細胞にゲートするAnnexin+PI+ T細胞のパーセント(n=4)。F～H、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理された未感作マウスの臓器毒性パネル(VetScan VS2 Comprehensive Diagnostic Rotorロット1061AA2)(n=2～3)。I、10mg/kgにてUsp22i-S02で処理されたWTマウスにおける皮下注射されたLLC1の増殖曲線(n=5～10)。I～Q、注射は、10mg/kgにて連続5日間にわたり1日2回であった。J、16日目にIから切除された腫瘍の重量(n=10)。K～L、CD45+細胞でゲートされた浸潤T細胞の代表的なフロープロット及びグラフ表示(n=5)。 M～P、Usp22i-S02で処理されたマウスからの腫瘍内CD8＋ T細胞の特徴づけ(n=3～5)。Q、マウスからCD4+Foxp3+にゲートした、DMSO対照に対する、Usp22i-S02で処理されたマウスからの腫瘍内Tｒｅｇ細胞のパーセント)(n=5)。 図17：Usp22i-S02は、インビトロ及びインビボにおいて腫瘍増殖を阻害する。A、24時間にわたる様々な濃度でのUsp22i-S02による処理後のLLC1のインビトロカウント(n=2)。B、24時間にわたる様々な濃度でのUsp22i-S02による処理後のLLC1のインビトロ生存率(n=2)。C、OD600を用いた、7日間にわたる、DMSO処理対照に対する、10μg/mlのUsp22i-S02で処理されたLLC1細胞のインビトロ相対増殖(n=4)。D、腫瘍増殖15日目における、DMSO対照注射に対する、3日間にわたりUsp22i-S02で処理されたRAG-/-マウス内に皮下注射された100万個のLLC1細胞の増殖曲線(n=4)。C～D、対照に対する行間のSidaksの多重比較を伴った二元配置ANOVAを実施して、統計的有意性を決定した。すべてのデータを平均±stdevとして提示する。NS、有意ではない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。 図18：TME特異的因子は、潜在的なTGF-βシグナル伝達、HIF1a、AMPK、及びmTOR活性の調節による高レベルのUsp22及びUsp21を駆動して、腫瘍内微小環境においてTｒｅｇ細胞をより安定した状態できる。
本発明の詳細な説明
ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の阻害剤、並びに疾患及び障害の治療のためのその使用が、本明細書に開示されている。コンピュータベースの及び生物学的なアプローチを使用して、小分子特異的阻害剤を同定した。実施例で実証されたとおり、マウスとヒトの両方において、USP22の阻害剤での制御性T細胞(Treg)の処理は、USP22の基質であるFoxP3のタンパク質発現を有意に減少させた。対照的に、処理は、USP22-ヌルTregにおけるFoxP3発現をさらに阻害することなく、USP22の阻害剤がUSP22の高度に特異的な阻害剤であり得ることを示した。加えて、処理は、肺癌細胞におけるUSP22活性を阻害し、その結果、肺癌細胞増殖を抑制した。より重要なことには、肺癌担持マウスの処理は、腫瘍質量を大きく減少させた。これらの結果は、USP22の阻害剤が抗腫瘍治療において強力な薬物として使用できることを示す。加えて、USP22の抑制がTreg抑制機能を低減させるという事実もまた、これらの阻害剤が免疫不全に関連する疾患を処理する、並びにSARS-CoV2感染症などの感染症と闘うために免疫応答を促進する、ために使用されることを可能にする。
本発明は、以下の当該出願及び当該出願を通じて説明されるとおり、いくつかの定義を使用して本明細書に記載される。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」及び「その(the)」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態を含む。例えば、「置換基」という用語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「1以上の置換基」を意味すると解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「約(about)」、「およそ(approximately)」、「実質的に(substantially)」、及び「有意に(significantly)」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈によってある程度変化するであろう。使用される文脈を考慮すると、当業者には明らかでない用語の使用が存在する場合、「約」及び「およそ」は、特定の用語のプラス又はマイナス10％を意味し、「実質的に」及び「有意に」は、特定の用語のプラス又はマイナス10％を超えることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「含む(include)」及び「含む(including)」は、用語「含む(comprise)」及び「含む(comprising)」と同じ意味を有する。用語「含む(comprise)」及び「含む(comprising)」は、特許請求の範囲に記載される構成要素にさらに追加の構成要素を含めることを可能にする「オープンな」遷移用語であると解釈されるべきである。用語「から成る(consist)」及び「から成る(consisting of)」は、特許請求の範囲に記載される構成要素以外の追加の構成要素の包含を許容しない「クローズな」経過用語であると解釈されるべきである。用語「から本質的に成る」は、部分的に閉じていると解釈され、特許請求される主題の性質を根本的に変更しない追加の構成要素のみを含むことを可能にするべきである。
語句「例えば(such as)」は、「例えば、含む(for example、including)」と解釈されるべきである。さらに、限定されるものではないが「例えば(such as)」を含む任意の及びすべての例示的な言語の使用は、本発明をより良く示すことを意図しているだけであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。
さらに、「A、B、及びCのうちの少なくとも1つ」に習慣的に類似するが使用されるそれらの例では、一般に、そのような構文は、当業者が習慣を理解するという意味で意図される(例えば、「A、B、及びCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、A単独で、B単独で、C単独で、A及びBを一緒に、A及びCを一緒に、B及びCを一緒に、及び/又はA、B、及びCを一緒に有するシステムを含むが、これらに限定されない。)。2つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離散的な単語及び/又はフレーズは、説明又は図面のいずれにおいても、用語のうちの1つ、用語のいずれか、又は両方を含む可能性を考慮するように理解されるべきであることが、当技術分野内の者によってさらに理解されるであろう。例えば、語句「A又はB」は、「A」又は「B」又は「A及びB」の可能性を含むと理解されるであろう。
「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての言語は、列挙された数を含み、後に上述のように範囲と部分的な範囲に分解され得る範囲を指す。
範囲は、各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、1～3個のメンバーを有するグループとは、1個、2個、又は3個のメンバーを有するグループを指す。同様に、6個のメンバーを有するグループとは、1個、2個、3個、4個、又は6個のメンバーを有するグループを指す、などである。
法動詞「し得る」は、その中に含まれるいくつかの説明された実施形態又は特徴のうちの1つ以上の選択肢又は選択の好ましい使用又は選択を指す。それらに含まれる特定の実施形態又は特徴に関して選択肢又は選択が開示されていない場合、法動詞「し得る」は、それらに含まれる記載された実施形態又は態様の作製又は使用方法及び態様に関する肯定的行為、又はそれらに含まれる記載された実施形態又は特徴に関して特定のスキルを使用する決定的決定を指す。この後者の文脈では、法動詞「may」は、助動詞「can」と同じ意味及び意味を有する。
本明細書で利用される「それを必要としている対象」とは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)活性及び/又は発現に関連する疾患又は障害の治療を必要としている対象を指し得る。それを必要としている対象としては、USP22の活性及び/又は発現を特徴とする癌を患っている対象を挙げてもよい。開示する化合物、医薬組成物、及び方法は、USP22活性及び/又は発現に関連する疾患及び障害を治療するのに利用されてもよい。
いくつかの実施形態において、それを必要としている対象としては、USP22の生物学的活性を阻害する、及び/又は癌細胞の拡散を阻害する治療薬を投与することによって治療される癌を患っている対象を挙げてもよい。
開示する化合物、医薬組成物、及び方法は、細胞増殖性疾患、癌などの疾患及び障害を包含し得るUSP22活性及び/又は発現に関連する疾患及び障害を治療するのに利用されてもよい。開示する化合物、医薬組成物、及び方法による治療に好適な癌としては、これだけに限定されるものではないが、肺癌、胃癌、膵臓癌、黒色腫、リンパ腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、神経膠腫、中皮腫、神経芽細胞腫、マントル細胞リンパ腫、及び急性骨髄性白血病が挙げられる。
いくつかの実施形態において、それを必要としている対象としては、感染の治療を必要としている対象を挙げてもよい。いくつかの実施形態において、感染症とは、コロナウイルスによる感染症などのウイルス感染である。いくつかの実施形態において、それを必要としている対象とは、突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV2)やCOVIDによる感染症の治療を必要としている。いくつかの実施形態において、それを必要としている対象とは、感染症に対する免疫応答を増強させることを必要としている対象を指してもよい。いくつかの実施形態において、それを必要としている対象は突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV2)感染症に対する免疫応答を増強させることを必要としている対象を指してもよい。
開示する化合物、医薬組成物、及び方法は、感染症、並びに突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV2)感染症を含めた、呼吸器感染症などの疾患及び障害を包含し得るUSP22活性及び/又は発現に関連する疾患及び障害を治療するのに利用されてもよい。
「対象」という用語は、「個体」や「患者」といった用語と互換的に使用されてもよく、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の対象を包含する。
開示する化合物は、USP22のペプチダーゼ活性を調節することを含め、USP22の生物学的活性を調節するのに利用されてもよい。「調節」という用語は、ペプチダーゼ活性を含めたUSP22の生物学的活性を「阻害すること」を含むように幅広く解釈されなければならない。
ユビキチン特異的ペプチダーゼ(USP22)は、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ22の名称によって呼ばれることもあるタンパク質を指す。USP22は、ユビキチンのC末端グリシンによって形成されたエステル、チオエステル、アミド、ペプチド、及びイソペプチド結合のチオール依存性加水分解を触媒することを含む酵素活性を有することが示された。USP22は、ENZYME登録：EC3.4.19.12を有する。従って、本明細書に開示された化合物は、USP22の活性の1若しくは複数を阻害し得る。
ヒトUSP22は、2つのアイソフォームを有することが知られており、そして開示する化合物は、アイソフォーム1及び/又はアイソフォーム2のうちの1若しくは複数の活性を阻害し得る。
ヒトUSP22のアイソフォーム1は、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有する：
アイソフォーム2は、以下の配列（配列番号２）を有する：
医薬組成物
本明細書中に開示される組成物及び方法において使用される化合物は、医薬組成物として投与され得、したがって、該化合物を組み込む医薬組成物は、本明細書に開示される組成物の実施形態であると考えられる。このような組成物は、薬学的に許容される任意の物理的形態をとることができる。例示的には、それらは、経口投与される医薬組成物であり得る。そのような医薬組成物は、有効量の開示化合物を含み、有効量は、投与される化合物の1日用量に関連する。各投薬単位は、所与の化合物の1日用量を含み得るか、又は各投薬単位は、1日用量の一部、例えば、用量の半分又は3分の1を含み得る。各投薬単位に含まれる各化合物の量は、部分的には、治療のために選択される特定の化合物の特徴及び所与の兆候などの他の因子に依存し得る。本明細書中に開示される医薬組成物は、周知の手順を使用することにより、患者への投与後に活性成分の迅速、持続、又は遅延放出を提供するように製剤化され得る。
本明細書に開示される方法に従って使用するための化合物は、単一の化合物又は化合物の組み合わせとして投与され得る。例えば、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の生物学的活性を阻害する化合物は、単一の化合物として、又はUSP22の生物学的活性を阻害する、若しくは異なる薬理活性を有する別の化合物と組み合わせて投与され得る。
上記に示したように、化合物の薬学的に許容される塩が意図され、開示された方法において利用され得る。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」は、生物に対して実質的に無毒である化合物の塩を指す。典型的な薬学的に許容される塩には、本明細書に開示される化合物と薬学的に許容される無機若しくは有機酸又は有機若しくは無機塩基との反応によって調製される塩が含まれる。そのような塩は、酸付加塩及び塩基付加塩として知られている。当業者であれば、本明細書中に開示される化合物のほとんど又は全てが塩を形成することができ、その医薬品の塩形態は、遊離酸又は遊離塩基よりもより容易に結晶化及び精製されるため、一般的に使用されることが多い。
酸付加塩を形成するために一般的に使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、及び同様のものなどの無機酸、例えばp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、及び同様のものなどの有機酸を含むことができる。適切な薬学的に許容される塩の例は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸、ピロリン酸、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、塩酸塩、二塩酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオレート、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-ジオエート、ヘキシン-1,6-ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブチレート、クエン酸塩、乳酸塩、α-ヒドロキシブチレート、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホネート、ナフタレン-1-スルホネート、ナフタレン-2-スルホネート、マンデレート、及び同様のものを含むことができる。
塩基付加塩には、無機塩基、例えばアンモニウム又はアルカリ又はアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、及び同様のものなどから誘導されるものを含む。このような塩の調製に有用な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、及び同様のものを含む。
本明細書中に開示される化合物のいずれかの塩の一部を形成する特定のカウンターイオンは、塩全体が薬理学的に許容され、対イオンが塩全体に望ましくない特性をもたらさない限り、化合物の活性にとって重要ではない可能性がある。望ましくない品質は、望ましくない溶解度又は毒性を含み得る。
化合物の薬学的に許容されるエステル及びアミドもまた、本明細書中に開示される組成物及び方法において使用され得る。適したエステルの例は、アルキル、アリール、及びメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ドデシルエステル、ベンジルエステルなどのアラルキルエステル、及び同様のものを含む。適したアミドの例は、非置換アミド、一置換アミド、メチルアミド、ジメチルアミド、メチルエステルアミドなどの二置換アミド、及び同様のものを含む。
加えて、本明細書中に開示される方法は、化合物又はその塩、エステル及び/又はアミドの溶媒和化合物形態を用いて実施され得る。溶媒和化合物形態は、エタノール溶媒和物、水和物、及び同様のものなどを含み得る。
医薬組成物は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の生物学的活性に関連する疾患又は障害を治療する方法に利用され得る。
本明細書で使用される場合、「治療(treating)」又は「治療する(to treat)」という用語は、症状を緩和し、一時的又は恒久的な基準で結果的な症状の原因を排除し、及び/又は症状の予防又は遅延、又は指定された疾患又は障害の結果として生じる症状の進行又は重症度を逆転させるために使用することができることをそれぞれ意味する。このように、本明細書に開示される方法は、治療的投与及び予防的投与の両方を包含する。
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、診断又は治療下の被験体において所望の効果を提供する、被験体への単回投与又は複数回投与時の化合物の量又は投与量を指す。開示された方法は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の生物学的活性に関連する疾患又は障害を治療するための有効量の(例えば、医薬組成物中に存在する)開示された化合物を投与することを含み得る。
有効量は、当業者に知られている技術の使用によって、及び類似の状況下で得られた結果を観察することにより、担当診断医によって容易に決定され得る。投与される化合物の有効量又は用量を決定する際には、例えば：被験体の種；サイズ、年齢、及び一般的な健康状態；関与する疾患又は障害の関与又は重症度；個々の被験体の応答；投与される特定の化合物；投与様式；投与された製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択された投与計画；付随する投薬の使用；及びその他の関連状況などの多数の要因が、担当診断者によって考慮され得る。
典型的な1日の投与量は、本治療方法で使用される各化合物約0.01mg/kg～約100mg/kg(例えば、約0.05mg/kg～約50mg/kg及び/又は約0.1mg/kg～約25mg/kg)を含み得る。
組成物は、単位投薬形態で製剤化することができ、各投薬量は、各化合物約1～約500mgを個別に、又は例えば約5～約300mg、約10～約100mg、及び/又は約25mgなどの単一単位剤形で製剤化することができる。「単位剤形」という用語は、患者のための単位用量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を適切な医薬担体、希釈剤又は賦形剤とともに含む。
経口投与は、本明細書に開示される組成物及び方法において使用される化合物を投与する例示的な経路である。他の例示的な投与経路には、経皮(transdermal)、経皮(percutaneous)、静脈内、筋肉内、鼻腔内、頬側、髄腔内、脳内、又は直腸内経路を含み得る。投与経路は、何れかの方法において変化し得、使用される化合物の物理的性質及び被験体及び介護者の便宜によって制限され得る。
当業者には理解されるように、適切な製剤には、1つ以上の投与経路に適した製剤を含む。例えば、製剤は、髄腔内投与及び大脳内投与の両方に適したものであり得る。あるいは、適切な製剤には、1つの投与経路に適しているものだけでなく、1つ又はそれ以上の投与経路に適しているが、1つ又はそれ以上の他の投与経路には適していないものも含まれる。例えば、製剤は、口腔、経皮(transdermal)、経皮(percutaneous)、静脈内、筋肉内、鼻腔内、頬側、及び/又は髄腔内投与に適すが、脳内投与には適さない製剤であり得る。
医薬組成物の不活性成分及び製剤の様式は従来通りである。医薬科学に使用される通常の製剤方法を本明細書で使用することができる。錠剤、チュアブル錠、カプセル、溶液、注射液、鼻腔内スプレー又は粉末、トローチ、坐剤、経皮パッチ及び懸濁液を含む、通常の種類の組成物をすべて使用することができる。一般に、組成物は、所望の用量及び使用される組成物のタイプに応じて、合計で約0.5％～約50％の化合物を含有する。しかしながら、化合物の量は、「有効量」、すなわち、そのような治療を必要とする患者に所望の用量を提供する化合物の量として最もよく定義される。本明細書中に開示される組成物及び方法において使用される化合物の活性は、組成物の性質に大きく依存するとは考えられず、したがって、組成物は、主に又は単独で便宜と経済性のために選択及び製剤化され得る。
カプセルは、化合物を適当な希釈剤と混合すること、及び適切な量の混合物をカプセルに充填することによって調製される。通常の希釈剤は、不活性粉末物質(デンプンなど)、粉末セルロース(特に結晶セルロース及び微結晶セルロース)、糖類(フルクトース、マンニトール及びスクロースなど)、穀物粉及び類似の食用粉末を含む。
錠剤は、直接圧縮、湿式造粒、又は乾式造粒によって調製される。それらの製剤は、通常、希釈剤、結合剤、潤滑剤、及び崩壊剤(化合物に加えて)を取り入れる。典型的な希釈剤には、例えば、種々のタイプのデンプン、ラクトース、マンニトール、カオリン、リン酸カルシウム若しくは硫酸カルシウム、無機塩(塩化ナトリウムなど)及び粉末糖を含む。粉末セルロース誘導体も使用することができる。典型的な錠剤結合剤は、デンプン、ゼラチン、及び糖類(例えば、ラクトース、フルクトース、グルコース、及び同様のものなど)などの物質を含む。アカシア、アルギン酸塩、メチルセルロース、ポリビニルピロリジン、及び同様のものなどを含む天然及び合成ガムも使用することができる。ポリエチレングリコール、エチルセルロース及びワックスもまた結合剤として役立ち得る。
錠剤は、例えば風味増強剤及びシーラントとして糖で被覆することができる。化合物はまた、製剤中にマンニトールのような多量の矯味物質を使用することにより、チュアブル錠剤として製剤化することができる。例えば、患者が剤形を摂取することを確実にするために、及び一部の患者が固形物を嚥下する際に経験する困難性を避けるために、即座に溶解する錠剤様製剤を使用することもできる。
錠剤及びパンチがダイに粘着するのを防止するために、錠剤配合物中に潤滑剤を使用することができる。潤滑剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、及び硬化植物油のような滑りやすい固形物から選択することができる。
錠剤は、崩壊剤を含有することもできる。崩壊剤は、濡れたときに膨潤して錠剤を分解し、化合物を放出する物質である。それらは、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、及びガムを含む。さらなる例として、トウモロコシ及びポテトデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、木材セルロース、粉末天然スポンジ、カチオン交換樹脂、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、ラウリル硫酸ナトリウム及びカルボキシメチルセルロースが使用できる。
組成物は、例えば、胃の強酸含有物から活性成分を保護するために、腸溶性製剤として製剤化され得る。そのような製剤は、酸性環境に不溶性であり、塩基性環境に可溶性であるポリマーのフィルムで固体剤形をコーティングすることによって作製することができる。例示的なフィルムには、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートを含む。
経皮パッチも化合物を届けるために使用され得る。経皮パッチには、化合物が溶解するか又は部分的に溶解する樹脂組成物が含まれ得、並びに組成物を保護及び樹脂組成物を皮膚に接触させて保持するフィルムを含み得る。他のより複雑なパッチ組成物、例えば、薬物が浸透作用によってポンプ輸送される複数の細孔が開けられた膜を有するものも使用することができる。
当業者には理解されるように、製剤は、製剤をヒトへの投与に適したものにする特性(例えば、純度)を有する材料(例えば、活性賦形剤、担体(シクロデキストリンなど)、希釈剤など)で調製することができる。あるいは、製剤は、非ヒト対象への投与に適しているが、ヒトへの投与には適さないことを示す純度及び/又は他の特性を有する物質で調製され得る。
ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の阻害剤とその使用
化合物、該化合物を含む医薬組成物、並びにユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の生物学的活性に関連する疾患又は障害を患っているか又はそれを発症するリスクがある対象を治療するための該化合物及び医薬組成物を使用する方法が開示される。開示する化合物は、USP22の生物学的活性を阻害し得る。このように、開示する化合物及び医薬組成物は、癌などの細胞増殖性疾患であり得るUSP22活性に関連する疾患又は障害、或いはSARS-CoV2などの突発性急性呼吸器症候群などの感染症関連疾患又は障害を患っているか又は発症するリスクがある対象を治療するための方法で利用され得る。
いくつかの実施形態において、開示する方法は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)活性に関連する疾患又は障害の治療を必要としている対象を治療することを包含する。開示する方法では、対象は、USP22の生物学的活性を阻害する治療薬の有効量を投与し得る。
開示する方法は、癌を含んでもよい細胞増殖性疾患又は障害を治療するために実施され得る。開示する方法によって治療され得る好適な癌としては、これだけに限定されるものではないが、肺癌、胃癌、膵臓癌、黒色腫、リンパ腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、神経膠腫、中皮腫、神経芽細胞腫、マントル細胞リンパ腫、及び急性骨髄性白血病が挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、開示する方法は、肺癌、例えば、非小細胞肺癌(NSCLC)を治療するために実施され得る。
いくつかの実施形態において、開示する方法は、皮膚癌、例えば、黒色腫を治療するために実施され得る。
開示する方法では、それを必要としている対象は、典型的には、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の生物学的活性を阻害する治療薬が投与される。いくつかの実施形態において、治療薬は、USP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C.：3.4.19.12)を阻害する。
開示する方法での使用のために好適な治療薬としては、これだけに限定されるものではないが、以下のものから成る群から選択される式を有する化合物が挙げられる：
開示する方法のいくつかの実施形態において、対象は、以下のものから成る群から選択される化合物が投与される：
7-(ジフルオロメチル)-N-(3,4-ジメチルフェニル)-5-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリジン3-カルボキサミド、
11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル、
2,7-ビス(4-メトキシフェニル)9-オキソ9Hフルオレン-2,7-ジスルホナート、
6-(2,5-ジメトキシフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボニトリル、
2,4-ジメタンスルホニル-8-メトキシ5H,6H-ベンゾ[h]キナゾリン、
4,5-ビス(4-メトキシフェノキシ)ベンゼン-1,2-ジカルボニトリル、
9-[(3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ]-7Hフロ[3,2-g]クロメン-7-オン、
N-(2-｛[5-(エタンスルホニル)-3-ニトロチオフェン-2-イル]スルファニル｝フェニル)アセトアミド、
1-[4-ニトロ-5-(ピリジン-4-イルスルファニル)チオフェン-2-イル]エタン-1-オン、
ビス[(4-メトキシフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
5-｛[(2,4-ジメチルフェニル)スルホニル]アミノ｝-2-メチル-N-フェニルナフト[1,2-b]フラン-3-カルボキサミド、
8-オキソテトラヒドロパルマチン、
1-｛5-[(4-クロロフェニル)アミノ]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
エチル6-シアノ-7-(4-メトキシフェニル)-5-オキソ-1-フェニル-1,5-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリミジン-3-カルボキシラート、
1-(5-｛[(4-クロロフェニル)メチル]スルファニル｝-4-ニトロチオフェン-2-イル)エタン-1-オン、
ビス[(3-クロロフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
1-｛5-[(4-メトキシフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
4-(4-メトキシフェニル)-2-メチル-5-オキソ-5H-インデノ[1,2-b]ピリジン-3-カルボニトリル、
1-｛5-[(2,3-ジクロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
1-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)エタノン(6-メチル-4-フェニル-2-キナゾリニル)ヒドラゾン、
1-｛5-[(4-クロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
クリプトクリシン、
2-アミノ-4-(4-ヒドロキシフェニル)-5-オキソ-4H,5H-ピラノ[3,2-c]クロメン-3-カルボニトリル、
α-ナフトフラバノン、及び
エチル2-(4-エトキシアニリノ)-5-[3-メトキシ-4-(2-プロピニルオキシ)ベンジリデン]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-3-チオフェンカルボキシラート。
開示する方法のいくつかの実施形態において、対象に投与される治療薬は、以下の式を有する化合物であってもよい：
、別名、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルと呼ばれる。
開示する方法はまた、それを必要としている対象でTreg細胞活性を抑制するために実施され得る。例えば、開示する方法では、対象には、USP22の活性を阻害する治療薬の有効量が投与され、その結果、対象におけるTreg細胞活性が抑制され得る。
いくつかの実施形態において、開示する方法はまた、それを必要としている対象の感染症に対する対象の免疫応答を増強するために実施され得る。
いくつかの実施形態において、開示する方法は、それを必要としている対象の突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV2)感染症に対する免疫応答を増強させるために使用される。
いくつかの実施形態において、開示する方法は、それを必要としている対象の感染症に対する対象の免疫応答を増強させるために使用される。いくつかの実施形態において、治療薬は、USP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C.：3.4.19.12)を阻害する。
いくつかの実施形態において、開示する方法は、感染症に対する対象の免疫応答を増強する。例えば、それを必要としている対象に投与される治療薬は、本明細書に記載した化合物のいずれかから選択される式を有する化合物であってもよい。
医薬組成物もまた開示される。いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、本明細書に記載した化合物のいずれかから選択される式を有する治療薬の有効量と、好適な医薬担体を含む。
開示する医薬組成物のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載した化合物のいずれかから選択される有効量の化合物と、好適な医薬担体を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、有効量の11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル及び好適な医薬担体を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)の生物学的活性を阻害する治療薬の有効量を含む。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、Treg細胞活性を抑制するための化合物の有効量を含む。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、USP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害するための化合物の有効量を含む。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、それを必要としている対象に投与されたときに、USP22の生物学的活性を阻害するための化合物の有効量を含む。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、それを必要としている対象に投与されたときに、Treg細胞活性を抑制するための化合物の有効量を含む。
いくつかの実施形態において、開示する医薬組成物は、それを必要としている対象に投与されたときに、USP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害するための化合物の有効量を含む。
以下の実施例は、説明に役立ち、そして、主張する内容の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
実施例1：腫瘍内微小環境におけるTreg適応性のために不可欠な脱ユビキチン化モジュールの同定
高度に免疫抑制性の腫瘍内微小環境(TME)は、制御性T(Tｒｅｇ)細胞の安定性と機能に有利に働くが、その一方で、エフェクターT細胞の抗腫瘍性活性を低減少させる。ここで、我々は、腫瘍内Tｒｅｇ適応を促進するこれまで知られていなかったTME特異的細胞及び分子の機構を特徴づけた。我々は、TME下でのTｒｅｇ安定化におけるFOXP3デユビキチナーゼ、ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(Usp22)、及び21(Usp21)の重要役割を明らかにした。具体的には、高TGF-β、低酸素状態、及び栄養枯渇を含めたTMEストレッサーは、HIF、AMPK、及びmTOR活性における変更に対応した最適なFoxp3発現を維持するためにUsp22及びUsp21を上方制御する。両方のUSPの同時消失は、Tｒｅｇの代謝的な識別特性を変更し、及び抑制機構を喪失するのに相乗作用を与え、そして、高められた抗腫瘍性活性をもたらした。最後に、我々は、最初のUsp22特異的小分子阻害剤を開発し、そしてそれは、腫瘍内Tｒｅｇ細胞を有意に低減し、その結果、抗腫瘍性免疫を高めた。我々の知見は、腫瘍内Tｒｅｇ細胞の機能的な独自性の基礎となる新機構を明らかにし、そして、TMEにおけるTｒｅｇ順応性を阻害する抗腫瘍性治療標的としてのUsp22を同定した。
腫瘍は長い間、増殖、侵襲、及び転移の特徴的性質を有すると認識されていたが、最近、免疫認識と破壊を回避するそれらの能力が注目を集めている。新生細胞は抗腫瘍性免疫応答を促進するのに十分な抗原性を有しているが、腫瘍は、免疫抑制伝達物質やサイトカインの産生、欠陥がある抗原提示、及びT制御性(Tｒｅｇ)細胞などの免疫制御性細胞の動員を含めたさまざまな機構を通して免疫系を回避する(1、2)。さらに、腫瘍において観察される制御されていない血管系や高い増殖速度は、酸素、グルコース、及びアミノ酸の枯渇した不利な微小環境を作り出すが、その一方で、サイトカインや乳酸によって濃縮された(3)。すべてでなくても多くの、腫瘍内微小環境(TME)におけるこれらの変化が、さまざまな機構を通して抗腫瘍性免疫応答を阻害することが知られている。具体的には、これらのTME由来の圧力は、好意的に腫瘍内(it)Tｒｅｇ細胞を変更し、そして、高められた生存率と抑制された能力をもたらすが、その一方で、エフェクターT(Tｅｆｆ)細胞の抗腫瘍性効果を低減させる(4～7)。そのうえ、itTｒｅｇ細胞自体が転移癌を援助することが知られており、それらの増えた数は低い臨床成果と相関する(1、6)。
itTｒｅｇ細胞の適確な組成物は、この集団の大部分が天然型(n)Tｒｅｇ又は腫瘍誘発性Tｒｅｇ細胞から成るか否かに関係なく、不明なままであり、そして、腫瘍型の間で異なっていてもよい(8)。しかしながら、両方の集団は、後成的に異なるが、TMEで繁栄し、そして、抗腫瘍性免疫を抑える更なる助けとなる可能性が高くなる。興味深いことに、itTｒｅｇ細胞は、系統を定義するTｒｅｇ転写因子、Forkhead Box P3(FOXP3)の上方制御された発現を示し(9、10)、そしてそれは、Tｒｅｇ細胞安定性と抑制された分子機能を増大させることによってTｒｅｇ適応性を高めるために機能する。重要なことには、Foxp3発現は、適切なTｒｅｇ発生と機能には不可欠である(11)。しかしながら、増力なitTｒｅｇ抑制機能まで、どのように及びどのTME因子がFoxp3発現を上方制御するかの基礎となる分子機序は不明なままである。
itTｒｅｇ細胞の存在は、抗腫瘍性免疫の抑制性において極めて重要な役割を担い、そして、現在の腫瘍標的化免疫療法の主要なハードルである。Tｒｅｇ特異的マーカーを使ったTｒｅｇの喪失が課題を残したままなので(12、13)、TME内のTｒｅｇ抑制能力を高める特異的経路は、itTｒｅｇ抑制機能を低減させる新しい治療標的のための魅力的な候補である。Foxp3はTｒｅｇ同定と機能について一意的に重要であるが、完全阻害が顕著な自己免疫の駆動に期待できそうなので、それは、その標的化が大きな注意を必要とするであろう細胞内タンパク質である(11)。加えて、FOXP3のような転写因子を特異的に標的化することには、技術的な課題が残っている。そのため、優れた治療用候補は、TMEにおいてFoxp3の発現と安定性を特異的に制御するものになる。
Foxp3発現と安定性は、各階層がTｒｅｇ細胞の安定性と総括的な機能を独立して制御して、転写レベルから翻訳後レベルまでで調整され得る。特に、Foxp3調整及びTｒｅｇ機能的調節に関する新たに認識された階層は、ユビキチン化による(14、15)。E3ユビキチンリガーゼを介したFoxp3プロモーター及び保存された非コードDNA配列(CNS)領域上のヒストンのユビキチン化は、クロマチン凝集とFoxp3転写の欠如をもたらす(16)。さらに、FOXP3タンパク質の直接的なユビキチン化は、プロテアソーム分解をもたらし得る。重要なことには、ユビキチンは、脱ユビキチン化酵素(DUB)によってこれらの部位から取り除かれ得、そして、転写レベルでクロマチンを開くために、及びタンパク質レベルでFOXP3を安定させるために機能する(14)。Foxp3発現に対するE3リガーゼとDUBの間のバランスTｒｅｇ細胞の中でFoxp3レベルを調整する平衡状態をもたらす。我々と他の人達は、転写及び/又は翻訳後レベルでのFOXP3脱ユビキチン化(deubiqutination)の直接的なモジュレーターとしてユビキチン特異的ペプチダーゼ(USP)ファミリーの3つのメンバー：Usp7、Usp21、及びUsp22を発見した(14、17、18)。しかしながら、これらのデユビキチナーゼの幅広い環境的役割と細胞制御は、不明なままである。ここで、我々は、USP-FOXP3軸に対するTMEの役割を調査し、そして、抗腫瘍活性が可能な最初のUsp22特異的阻害剤を開発する。我々の調査では、FOXP3 デユビキチナーゼUsp22とUsp21発現を選択的に誘発するが、Usp7発現を誘発することなく、Tregの安定性と適応を制御する、特異的TME因子を同定した。
結果
itTｒｅｇ細胞におけるFoxP3 デユビキチナーゼの選択的上方制御
腫瘍は、免疫細胞機能が大きく変化する不利な微小環境を作り出すので、我々は、マウスitTｒｅｇ細胞の抑制プロファイルを特徴づけすることによって開始した(図7)。WT Foxp3ＹＦＰ－ｃｒｅ(WT)マウスへのB16黒色腫、LLC1Lewis肺癌腫、及びEG7リンパ腫の皮下注射により、itTｒｅｇは、同じマウス内の脾臓Tｒｅｇ細胞に対して、並びに非抗原投与対照マウスに対して高いパーセンテージのFOXP3＋細胞とFOXP3タンパク質レベルの両方を示した(図7A～C)。さらに、各腫瘍型のitTｒｅｇ細胞は、CTLA-4やPD-1を含めた複数の公知のTｒｅｇ抑制マーカーの増強された表面発現を示した(図S1D～G)。これらのデータは、itTｒｅｇ細胞が、FOXP3や表面阻害受容体の上方制御を通して免疫抑制機能を高めることを示唆し、そしてそれは、ヒト腫瘍内Tｒｅｇ細胞が高い抑制機能を示すことを実証する以前の調査と一致する(4)。
3つのFOXP3標的化USPは、FOXP3安定性を維持する際に助けとなるので(16～18)、我々は、それらの発現の調節がitTｒｅｇ細胞のFOXP3上方制御を駆動し得ると仮定した。興味深いことに、Usp22のmRNAレベルは、同じマウス又は非抗原投与対照から採収された末梢Tｒｅｇ細胞と比較して、itTｒｅｇ細胞内で一貫して増強されたが、Usp7 mRNAレベルは変化しなかった。対照的に、Usp21 mRNAレベルは、B16抗原投与下で増強されただけであり、Tｒｅｇ細胞におけるUsp21上方制御は、特定のTME条件下でのみ起こることを示唆した(図1A～C)。これらのデータは、TMEにおける1若しくは多くの因子がUsp22とUsp21の両方の転写を上方制御して、FOXP3を潜在的に安定化し、そして、安定したitTｒｅｇ機能に通じる。この概念を支持するために、我々は、隣接する健常肺組織(AHL)と比較して、ヒト腫瘍肺組織患者サンプル(LTu)から単離したTｒｅｇ細胞においてUsp22が上方制御されることをさらに確認した(図1D)。この上方制御は、LTu患者サンプル中のFOXP3上方制御との強い陽性相関関係を示し、そして、Usp22はヒト腫瘍内のitTｒｅｇ細胞のFoxp3発現を促進することを示唆する(図1D～E)。同種同系肺癌モデルからの我々の観察に類似して、Usp21は、ヒト肺腫瘍itTreg細胞で増強されず、それはFoxp3との顕著な陽性相関関係も有しておらず(図1D及びF)、そして、Usp22が少なくとも肺癌における腫瘍の中のTreg細胞でより優位なUSPであることを示唆した。
腫瘍由来TGF-βは、Tｒｅｇ細胞においてUsp22とUsp21を選択的に誘発する
腫瘍によって分泌された可溶性因子が、免疫細胞機能を変更することが知られているので(19、20)、我々は、itTreg細胞におけるUsp22及びUsp21を調整する際のTME可溶性因子の役割を調査した。我々は、培養腫瘍細胞から得られた培地(腫瘍馴化培地又はTCM)に、インビトロにおいて誘発された(i)Tｒｅｇ細胞を晒した(図8A)。興味深いことに、EG7細胞ではなく、B16及びLLC1からのTCMは、Usp22及びUsp21 mRNAレベルを高めた(図2A)。対照的に、Usp7のレベルは変わりがないままであったが、図1の結果を要約する。mRNAレベルに類似して、USP22及びUSP21タンパク質レベルは、LLC1 TCMとのインキュベーションによって増強された(図2B)。一貫して、EG7培養培地の添加は、タンパク質レベルで任意のUSPを高めることができず(図2B)、そして、特定の腫瘍型がTｒｅｇ細胞においてFoxp3デユビキチナーゼを選択的に誘導することを示す。
多くのタイプの腫瘍が大量のTGF-βを分泌し、そしてそれは、免疫応答を排除し、及び転移癌を促進する(21、22)。TGF-βがiTｒｅｇ産生と安定性に特に重要であるという事実と共に(23)、我々は、TGF-βがUsp22とUsp21の誘導によって、itTｒｅｇ細胞におけるFoxp3発現を高める際に助けとなる場合があると推測した。実際に、両Foxp3標的化USPのmRNAレベルは、TGF-βがiTｒｅｇ細胞の培地に追加されたとき、増強されたが、その一方で、Usp7は、そのような増加を示さなかった(図8B)。Usp22とUsp21両方の発現のこの増大は、TGF-β阻害剤(LY3200882)の添加によって大きく減少した(図8C)。重要なことには、Foxp3 mRNAのレベルはUsp22とUsp21のレベルと並行して上昇し(図8D)、TGF-βがUsp22及びUsp21誘導によってFoxP3発現をさらに増強できることを実証した。
TGF-βがTCM駆動Usp22及びUsp21上方制御に関係するかさらに測定するために、我々は、前述の腫瘍細胞株のそれぞれからのTCMにTGF-β阻害剤を加えた。実際に、TGF-β阻害剤はUsp22のmRNA増強を完全に減少させ(図2C)、TGF-βがUsp22発現を高めるB16及びLLC1のTCMに関する主因であることを意味している。興味深いことに、阻害剤がLLC1 TCMに加えられたとき、Usp21レベルもまた減少したが、B16 TCM条件下ではそうではなかった(図2C)。この差が、培地中に腫瘍細胞株によって分泌されるTGF-βの量に起因し得る可能性がある。実際に、LLC1細胞は、B16及びEG7細胞の両方に比べて、有意に多量のTGF-βを分泌し(図2SE)、そしてそれは、観察されたUsp22及びUsp21 mRNA発現の増大と有意に相関する(図8F及びG)。Usp7のレベルは、すべての治療群の下で変化がないままであり、様々な腫瘍型の高レベルのTGF-βへの相関関係を示さなかった(図2C、並びに図8B～C及びH)。そのため、我々のデータは、Tｒｅｇ細胞においてUsp22及びUsp21を選択的に誘発するための重要な可溶性因子としてTGF-βを同定した。
腫瘍由来TGF-βが本来のTME中でUsp22及びUsp21を上方制御する際に重要であるか否か決定するために、我々は、TGF-βを欠いているB16黒色腫に浸透するitTreg細胞におけるUsp22及びUsp21のレベルがまだ上方制御されているか否かを測定した。shRNAノックダウンは、B16細胞におけるTGF-β発現を大きく減少させた(図8I)。しかしながら、スクランブルshRNAで処理腫瘍のものと比較してTGF-βを欠いているB16黒色腫からのitTregにおける低減の傾向と同時に、Usp22レベルは、いずれの統計的有意性も達成せず、そして、腫瘍由来TGF-βがインビトロにおけるUsp22及びUsp21の両方を誘発するのに十分であるが、他のTME因子もまた、現在の実験設定にてTGF-βノックダウンの効果を克服する役割も担う。
TGF-βシグナル伝達は、特有の経路を通してUsp22及びUsp21を上方制御する
それによってTGF-βがUsp22及びUsp21転写に影響する機構を明らかにするために、我々は最初に、標準的なTGF-βシグナル伝達経路を調査し、そしてそれは、SMAD結合要素(SBE)に特異的に結合することによってSMAD2、SMAD3及びSMAD4を含めた
SMAD転写因子(ドロソフィラ属(Drosophila)タンパク質の相同体、デカペンタプレジック(Mad)に対する母親、及びセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)タンパク質Sma)の同時活性化によって作用する(24、25)。我々は、保存されたSBEの配列についてUsp22及びUsp21の両方のプロモーター領域に沿ってスキャンした。Usp22プロモーターに沿って、我々は、それについて我々がプライマーを作製し、SMAD結合能を評価した、3つの有望な領域を発見した(図9A及びB)。クロマチン免疫沈降法(ChIP)分析では、転写開始部位の約300及び1200塩基対上流にてUsp22プロモーターに、SMAD3及びSMAD4が結合するが、SMAD2は結合しないことを検出した(図9B)。両部位にて結合するSMADはTGF-β阻害剤の添加時に除去され、Usp22プロモーターに結合するSMAD3及びSMAD4がTGF-βシグナル伝達に直接起因することを実証した(図2D)。SMAD2は、Usp22プロモーターのあらゆる領域への結合能がないことも示された(図2D；図9B)；その直接的なDNA相互作用を妨げる立体障害に起因する可能性が高い(26)。
最近、我々は、Usp22-ヌルiTｒｅｇ細胞が高レベルのTGF-βにより通常分極するが、部分最適分極条件が、FOXP3 MFIとWT iTｒｅｇ細胞に対するパーセンテージの有意な減少をもたらしたことを観察した(16)。これは、iTｒｅｇ分極の中でTGF-βシグナル伝達を継続させる際のUsp22の重要な機能を示す。実際に、Usp22-ヌルiTｒｅｇ細胞は、それらのmRNAレベルで差がない、WT iTｒｅｇ細胞と比較した、SMAD2とSMAD4タンパク質レベルの両方の有意な欠乏を示し(図10A及びB)、タンパク質レベルでのSMADの安定化を通したTGF-βシグナル伝達経路の正の調節因子としてのUsp22機能を示唆する。この減少は、Usp22がDUBであるので、促進されたSMADユビキチン化とUsp22欠如によるプロテアソーム分解に起因する可能性がある。実際に、Usp22は、SMAD2とSMAD4の両方と相互作用し、そして、脱ユビキチン化する(図10C～D及びF)。Usp22はSMAD3と相互作用するが、それがSMAD3のDUBとして機能することはなく、それがSMAD2とSMAD4の安定化を通して特異的に作用することを示唆している(図10C及びE)。特に、USP22-ヌルiTｒｅｇ細胞は、WTに対して、シクロヘキシミド処理時に、SMAD2とSMAD4の分解促進を示し、そしてそれは、MG132処理を用いたプロテアソーム阻害時に解放される(図10G及びH)。そのため、我々のデータは、USP22が、SMAD2及びSMAD4タンパク質安定化によるTGF-βシグナル伝達を相互的に高めるように能することを示唆している。この働きは、正のフィードバックループを通してそれ自体の上方制御を確実にし、そして、itTｒｅｇ細胞におけるFoxp3発現をさらに確実にする。
Usp22とは異なり、Usp21プロモーターをスキャンしたときにはSBEは見られず、TGF-βがSMADの如何にかかわらずUsp21発現を誘発することを意味した。実際に、試験されたSMADタンパク質のすべてに関して結合能を示す領域は存在せず、Usp21発現が標準的なTGF-βシグナル伝達を通して誘発されていないことを確認した(図9C)。しかしながら、iTｒｅｇ細胞におけるUsp21の欠如は、インビトロにおける減少したFoxp3発現をもたらし、Usp21誘導を駆動し、Foxp3の安定化をもたらす非標準TGF-βシグナル伝達の機会を残した(図9D～F)。実際に、Smad独立型TGF-β媒介性MAPキナーゼであるp38の阻害は、TGF-β媒介性Usp21誘導を抑制した(図9G)。要するに、これらのデータは、Usp22とUsp21が異なったTGF-βシグナル伝達経路によって媒介されていることを示唆している。
低酸素状態は、Tｒｅｇ Usp22を選択的に誘発し、そしてそれは、Foxp3発現を支援する
腫瘍由来TGF-βはインビトロにおけるUsp22及びUsp21を上方制御するのに重要であるが、TGF-β抑制は、itTｒｅｇ細胞におけるUsp22上方制御を排除するには不十分であり(図8I～K)、追加TME因子がitTｒｅｇの安定性及びUSPを通じた機能に影響を及ぼし得ることを意味する。腫瘍細胞分泌因子に加えて、腫瘍駆動低酸素状態は、FOXP3の安定性とTｒｅｇ細胞機能に繰り返し関与していた(27、28)。固形腫瘍の公知の負の予後因子である(3、29)、低酸素状態は、T細胞増殖、受容体シグナル伝達、及びエフェクター機能を下方制御するが、その一方で、Tｒｅｇ細胞抑制能力を増強する(27、30、31)。そのため、我々は、Tｒｅｇ細胞のUSPレベルに対する低酸素状態の効果を調査した。驚いたことに、Usp22発現だけが、mRNA及びタンパク質レベルの両方が低酸素条件下で高められた(図3A、図11A及びB)。そのため、我々は、Usp22がTMEにおいて低酸素条件下でFOXP3の安定化剤として機能し得ると推測し、FOXP3安定性の分析を実施した(図11C)。実際に、Usp22欠乏nTｒｅｇ細胞は、低酸素条件下でFOXP3発現を維持する能力の減少を示し(図3B)、Usp22が、TME中で見つけられる低酸素条件下でのFOXP3安定化に必要であることを意味した。
低酸素条件下では、低酸素誘導因子α(HIF-α)が安定し、低酸素レベルへの細胞適応を促進する転写プログラムの活性化をもたらす(32)。HIF-αがUsp22プロモーター(33)上に2つの機能性結合部位を有することが知られており、Usp22の低酸素誘導がHIF-αに依存することが示唆された。実際に、低酸素独立性HIF-α活性化因子であるジメチルオキザリルグリシン(dMOG)とのインキュベーションは、nTｒｅｇとiTｒｅｇ細胞の両方でUsp22 mRNAレベルを増強し(図3C；図11D)、低酸素誘導Usp22発現がFoxP3安定化にかかわることを示した。これを裏付けるために、我々は、Usp22欠乏nTｒｅｇ細胞がdMOGでの処理後にFOXP3の安定性を減少させたことをさらに示し、そして、低酸素条件下におけるUsp22依存性FOXP3安定化がHIF-α依存性であることを確認した(図11E)。対照的に、このFOXP3安定化は、低酸素条件下又はdMOG処理を伴ったiTｒｅｇ細胞では観察されなかった(図11F及びG)。これは、実験条件下でのTGF-βの存在の欠如に起因している可能性があり、そしてそれは、iTｒｅｇ細胞におけるFoxp3発現安定化に重要である。とにかく、これらの結果は、TME中での低酸素媒介性Tｒｅｇ細胞FOXP3発現におけるUsp22の重要さを実証する。
TMEにおける代謝変化は、Usp22及びUsp21を誘発して、Foxp3の安定性を促進する
酸素状態に加えて、TMEにおけるグルコースレベルは、高糖分解Tｅｆｆ細胞のグルコース必要性と競合する腫瘍細胞によるその取り込み増加もあって、減少することが多い(34、35)。逆に、FOXP3は、Tｒｅｇ細胞において解糖を越える酸化的リン酸化を促進して、TME中でのそれらへの機能的な利点を潜在的に与える(5、36、37)。そのため、我々は、栄養素の貧しい環境における観察されるTｒｅｇ細胞の利点が、Foxp3発現のUSP媒介性安定化の因果関係として部分的に存在する可能性があると仮定した。実際に、Usp22 mRNAとタンパク質レベルは、グルコース除去によりTｒｅｇ細胞で増強された(図3D、図11H、及びI)。加えて、Usp22欠乏Tｒｅｇ細胞は、WT Tｒｅｇ細胞と比較してグルコース除去下で有意に低いFOXP3継続性を有し、グルコース制限下でFOXP3を安定させるUsp22の機能を実証した(図3E及び図11J)。
グルコースの競合と共に、腫瘍中のアミノ酸の不足もまた、免疫細胞の機能を変更し得る(35)。重要なことには、アミノ酸飢餓がTｒｅｇ細胞誘導を高めることが知られている(38)。アミノ酸飢餓誘発性Foxp3発現におけるUSPの役割を調査するために、我々は、アミノ酸を欠いた培地中でTｒｅｇ細胞を培養した。実際に、アミノ酸飢餓は、nTｒｅｇとiTｒｅｇ細胞において、Usp7ではなく、Usp22及びUsp21の発現増加につながった(図3F；図11K)。さらに、iTｒｅｇ、細胞ではなく、アミノ酸飢餓nTｒｅｇのFOXP3の安定性は、Usp22又はUsp21の欠乏によって低減される(図3G；図11L)。グルコースとアミノ酸の両方を枯渇させた環境では、アデノシンモノホスファートタンパク質キナーゼ(AMPK)の活性化がタンパク同化性代謝を抑制し、その一方で、酸化代謝を上方制御して、細胞生存を促進し(39)、そして、AMPK活性化がUsp22又はUsp21の上方制御に関与することを示唆した。そこで、我々は、ミトコンドリアATPシンターゼの阻害剤であるオリゴマイシンAを用いてTｒｅｇ細胞を処理し、そして、USP mRNAレベルを計測した。実際に、オリゴマイシン処理は、Usp7ではなく、Usp22及びUsp21の両方で、nTｒｅｇのmRNAレベルを増強し(図3H)、グルコース除去とその後のエネルギーストレスがTｒｅｇ細胞におけるUsp22発現を誘発するという我々の観察をさらに裏付けた。細胞代謝状態を調整するためのラパマイシンの哺乳類標的(mTOR)のシグナル伝達とのバランスでAMPKが機能することは周知されている(39)。興味深いことに、mTORの薬理学的阻害はまた、nTｒｅｇ細胞におけるUsp7ではなく、Usp22及びUsp21の増強された発現をもたらした(図3I)。しかしながら、iTｒｅｇ細胞では、Usp21は、AMPK活性化又はmTOR阻害によりmRNAレベルで上方制御されず(図11M及びN)、応答の細胞型特異性が示唆された。まとめると、これらの知見は、AMPKとmTOR活性のバランスによって決定される全体的な代謝状態が、Tｒｅｇ細胞におけるUsp22(ある程度Usp21)によるFoxp3発現及び安定性を調節するのに役立つことを示唆する。
itTｒｅｇ細胞が、TMEの代謝的にストレスが多い条件によりうまく順応し、そしてそれが、Tｅｆｆ細胞を超える機能的な利点をそれらに示すことが提案された(5、19)。組み合わせられて、我々のデータは、微小環境における変化が、潜在的にHIF-α、AMPK、及びmTOR活性の調節による高レベルのUsp22及びUsp21を駆動して、腫瘍内微小環境におけるTregの安定性を高めることを示唆する。
USP22及びUSP21は、個別経路を通じてTｒｅｇ適応性を調節する
我々の発見は、これまでのところ、Usp22及びある程度Usp21が、複数の経路を通じてTMEにおけるFOXP3発現と、これによりTｒｅｇ適応性を維持するのに重要であると示唆した。インビボにおけるそれらの混合機能性について研究するために、我々は、Usp22ｆ／ｆFoxP3ＹＦＰｃｒｅシングルノックアウトマウスとUsp21ｆ／ｆマウスを交配させることによってTｒｅｇ特異的Usp22及びUsp21ダブルノックアウト(dKO)マウスの系統を作出した。この交配戦略は、Usp22(22KO)、Usp21(21KO)、及びdKOのTｒｅｇ特異的ノックアウトを我々にもたらし、そのすべてがqPCRを介して確認された(図4A)。Tｒｅｇ細胞におけるUsp22、Usp21、又はその両方の欠失は、6週齢マウスの脾臓においてB又はT細胞のいずれかの頻度を変更しなかった(図12A及びB)。重要なことには、そのマウスは24週齢までの寿命早期には類似した体重を示していたが、22KO及びdKO動物は、WTと比較して、一貫してサイズが小さかった(図4B)。
当然ながら、3種類のKO群すべてが、年齢が同じWTマウスと比較してCD44ｈｉCD62Ｌｏ活性化脾臓Tｅｆｆ細胞の有意な増大を示し、加齢による低レベルの、進行性炎症の発症と一致した(図4C)。重要なことには、22KOとdKOマウスだけが、Foxp3発現の減少と、Tｒｅｇ細胞関連抑制マーカーにおける有意な低減を示した(図4D及びE)。先の調査では、21KOマウスがTｒｅｇ細胞機能における年齢に関係した障害を発症し、そして欠陥Foxp3発現に次ぐ数であると報告したが(18)、我々の8週齢マウスは、Foxp3発現における変化を示さず、Usp21媒介性Foxp3安定化がTMEの外側では重要ではあり得ないことが示唆された。
興味深いことに、転写プロファイリングは、さらに多くのTｒｅｇ細胞抑制マーカーが、WT遺伝子発現と比較したときに、いずれかのシングルKO動物に比べて、dKOマウスで示差的に発現され(図4E)、Tｒｅｇ細胞の安定性及び機能に対する喪失Usp22及びUsp21の間の見込まれる相乗作用を示唆していることを明らかにした。さらに、21KOと22KOの間の示差的な発現遺伝子(DEG)は比較的異なっていた(図4F)。両シングルKOマウスの遺伝子セット濃縮分析(GSEA)では多くの細胞周期及び、例えば、G2MチェックポイントやE2F標的などの増殖経路における変化、並びに酸化的リン酸化における変化を示したが(図4G)、21KOと22KOの間では合計32種類の重複する示差的な発現遺伝子しか存在しなかった(図4F)。重要なことには、dKO動物からのTｒｅｇ細胞は、それぞれシングルKOマウスに見られる変化を統合するGSEA及びバルク遺伝子発現特性を示し、Usp22及びUsp21の両方の喪失がTｒｅｇ細胞機能を減少させるように相乗作用を及ぼすことが示唆された(図4G)。
我々が、Usp22及びUsp21の両方がTMEにおける代謝変化によって調整されることを実証したので、それぞれのKO動物において複数の代謝経路の破損を同定することは特に興味深かった。実際には、dKOマウスからのTｒｅｇ細胞は、脂質代謝過程、一炭素代謝、及びリボソームの生合成の重大な変化があった(図12C～E)。興味深いことに、Usp21欠乏細胞ではなく、Usp22-ヌルTｒｅｇ細胞が、dKO Tｒｅｇ細胞に対する脂質代謝と一炭素代謝の両方に類似した変化を示した(図12C及びD)。対照的に、21KO及びdKOマウスからのTｒｅｇ細胞は、リボソーム遺伝子発現の大幅な減少であり、そしてそれが、Usp22-ヌルTｒｅｇ細胞で同定されず(図12E)、それによってUsp22及びUsp21がTｒｅｇ適応性を調節する個別経路を示唆した。我々のインビトロにおける代謝フラックス分析は、
21KOと異なって、22KOとdKOの両方が、ミトコンドリア酸素消費(OCR)及び細胞外酸性化速度(ECAR)を高めることをさらに実証して(図12F及びG)、Usp22が制御性T細胞の代謝状態を調節する際の本質的な役割を担い得ることを示唆した。
Usp21が、Treg機能においてFoxp3から独立した役割を有すると思われたので、我々は、dKO表現型に対するUsp21の寄与を測定するために、22KO及びdKOマウスからのDEGを比較した。興味深いことに、我々は、細胞周期経路とエフェクター分化経路における有意な変化に気付き(図13A)、Tｒｅｇ区画における恒常性の喪失が示唆された。実際に、Ki67染色は、WT Tｒｅｇ細胞との比較において、21KO及びdKO Tｒｅｇ細胞の増殖の増大を明らかにしたが、22KOではそうではなく(図13B)、通常高度な抑制エフェクターTｒｅｇが、機能遺伝子の下方制御を伴った増強された増殖能を有することを示した。
まとめると、これらのデータは、Usp22及びUsp21の両方が、外見的ではあるが、独特な経路を通してTｒｅｇ細胞代謝を調節して、Tregの安定性及び機能を維持することを意味する。
Tｒｅｇ細胞におけるUsp22及びUsp21欠失は、抗腫瘍性免疫を高めるように相乗的に作用する
インビボにおいて腫瘍条件のTｒｅｇ細胞Usp22及びUsp21の重要さを試験するために、我々は、B16黒色腫同種同系腫瘍モデルを使用した。Usp22のTｒｅｇ特異的切除を伴ったマウスは、Usp21の欠失と比較して、増強された腫瘍拒絶を示した。重要なことには、重要なことには、Tｒｅｇ細胞におけるUsp22及びUsp21の両方の同時欠失を担持するマウスでは、最も小さい腫瘍が生じた(図5A)。さらに、dKO及び22KO動物は、脾臓のエフェクターメモリーCD4＋及びCD8＋T細胞に関してより高い割合を示した。対照的に、Tｒｅｇ細胞におけるUsp21の欠失は、B16腫瘍拒絶を高めるためには不十分であった(図5A)。一貫して、21KOマウスサイトカインレベルはWTマウスと同等であるが、その一方で、22KOマウスは、CD8＋グランザイムB(GZMB)産生の増大を示した。特に、癌担持dKOマウスは、脾臓においてインターフェロン-γ(IFN-γ)及びGZMBの両方を産生するCD8＋T細胞の有意な増大があり、そして、各サイトカインは、シングルKO動物との比較でさえ高められた(図5C)。さらに、22KOとdKOの両方が、末梢Tｒｅｇ細胞のFOXP3及びTｒｅｇ抑制マーカーMFIにおいて有意に低下し、そしてそれは、21KO Tｒｅｇ細胞で観察されなかった(図5D～G)。まとめると、これらのデータは、Tｒｅｇ細胞におけるUsp21とUsp22の同時喪失が、Usp21又はUsp22単独の個々の喪失と比較して、Tｅｆｆ細胞効果の活性化増強をもたらしたことを示唆している。
腫瘍浸潤リンパ球の更なる分析では、WTマウスより大量のIFN-γとGZMBの両方を分泌するdKOの各区画を有する、dKOマウスにおけるCD4＋及びCD8＋T細胞頻度の有意な増大を示した(図5H～J)。特に、dKOマウスは、22KO及び21KOマウスの両方より有意に高いレベルのTｅｆｆ細胞浸潤を有し、並びに最高レベルのIFN-γ分泌を有することがあった。脾臓のTｒｅｇ細胞と一致して、22KO及びdKOマウスにおけるitTｒｅｇ細胞は、WT及び21KOより有意に低いTｒｅｇ浸潤とFOXP3 MFIを有した(図5K及びL)。我々のRNAseqデータによって示されるように(図4E)、Usp22及びUsp21の喪失が多くのTｒｅｇ抑制遺伝子を下方制御したので、我々は、Usp22及びUsp21の喪失によるTｒｅｇの脆弱性が、CD8喪失後の抗腫瘍性応答の喪失によって示される、細胞傷害性CD8＋T細胞におけるTｒｅｇ抑制の緩和によって抗腫瘍性免疫を永続させるとの結論に至った(図5N)。
USP22のみの喪失は有意な抗腫瘍性免疫を示したが、Tｒｅｇ細胞におけるUsp22及びUsp21の両方の喪失は、劇的に増強されたサイトカイン産生、最大の浸潤T細胞数、及び最小の腫瘍サイズを有するdKOマウスによって記録されるように、より活発な抗腫瘍性応答を示した。まとめると、このデータは、Usp21とUsp22が同時に働いて、TMEにおけるFoxp3発現及びTｒｅｇ細胞機能を維持することを示唆した。
Usp22特異的小分子阻害剤の同定
Tｒｅｇ細胞におけるUsp22に加えてUsp21の欠失は抗腫瘍性免疫を高めるが、Usp22欠失だけで、全身腫瘍組織量の減少に十分である。Usp22の薬理学的阻害がTｒｅｇ機能を調節し得るかどうか評価するために、我々は、Usp22特異的阻害剤を同定することを目指した。それは、インビトロ精製USP22タンパク質が触媒能を欠いており(40、41)、ハイスループットスクリーニングの困難さにつながることがし示唆された。そのため、我々は、コンピュータ支援薬物設計(CADD)を使用して、Usp22特異的小分子阻害剤を開発した(図14A)。Usp22は酵母からヒトまで高度に保存された推定上の触媒ドメイン(Cys、His、及びAsp)を含むので、相同性モデリング研究を実施して、構造ベースの仮想スクリーニングにおける使用のためのヒトUsp22モデルを入手した(図14B)。Usp22の3つの妥当な構造モデルに関して、酵母UBP8構造(PDBコード3MHS)が、SwissモデルによるUsp22モデルを構成するための鋳型タンパク質として選ばれた(Usp22-m)(図14C及びD)。最低ポテンシャルにて立体構造を得るために、Usp22-mの構造は、Gromacs5.15を使用した分子動力学シミュレーションとクラスタリング分析にさらに供し、そして、Cys185とHis479の間の距離がUSP22の触媒部位の位置で3.6Åから4.8Åまで増加した(Usp22-md)(図14C)。我々はさらに、150の相同完全配列とUSP22の予測されたアミノ酸配列を比較した。保存グレードを構造上にマッピングし、Cysドメインが高度に保存されていた。この調査は、相同性モデル化の精度のための塩基を提供するだけではなく、薬剤選択性スクリーニングのために好ましい条件も提供する。
次に、我々は、LipinskiルールとVeberルールの両方を使用して、Specsデータベースによってフィルターをかけて、我々のUsp22モデルの触媒ポケットに結合する合計240Kの化合物を見出した。次に、我々は、MD及びMM/PBSA法による結合親和性によって格付けした上位100個の化合物をフィルタリングし、そして、25個の化合物を残した(表1)。この限られた数の化合物は、我々の更なる生物学的スクリーニングを可能にした。USP22抑制がFOXP3発現レベルにおける劇的な低減につながるので、我々は、
25個の化学物質それぞれによるUSP22抑制有効性の生物学的なバリデーションのための読み出し値としてFOXP3 MFI低減に利用した。表1に示したように、化学物質S02(11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル)は、FOXP3発現の下方制御の際に強い有効性を示した。化合物S02(図6Aに構造を示す)は、我々のUSP22-mdモデルに対して高い結合エネルギーでを有する、RMSD軌道(図14E)によって示されるUSP22触媒ドメインポケットに安定して結合した(図14F)。さらに、Usp22の各残基とのS02相互作用の分析は、側鎖の陰性残基(Glu、Asp)が阻害剤とタンパク質の結合に対して好ましい寄与をするが、ArgやLysなどの陽性荷電残基は有害な役割を担った(図14G)。そのため、次世代のUsp22阻害剤は、疎水性残基だけではなく、阻害剤と、結合ポケット表面の荷電及び極性残基との間の相互作用も考慮しなければならない。
Usp22i-S02は、抗腫瘍性免疫を増強する際に大きな臨床前有効性を保持する
一次スクリーニング後に、我々は、WT及びUsp22-ヌルiTｒｅｇ細胞の両方で化合物S02(現在Usp22i-S02と呼ばれている)に対してインビトロ用量応答研究をおこなった(図15A～C)。10μg/mLの濃度では、生存率にわずかな変化があったUsp22-ヌルiTｒｅｇ細胞に匹敵するFoxp3 MFI及びタンパク質レベルの減少を示し、Foxp3を安定化する際にUsp22活性のほぼ完全な抑制を示した(図15A～D)。重要なことには、ヒトTｒｅｇ細胞への低用量のUsp22i-S02投与が、細胞生存率にわずかな効果を伴って、Foxp3 MFIを有意に低減少し、ヒト細胞に対するこの阻害剤の関連性を示した(図15E及びF)。対照的に、Usp22i-S02は、インビボ(図6B)及びインビトロの両方において、Usp22を事前に欠いているマウスTｒｅｇ細胞でFOXP3レベルに対して最小の効果を有し、その一方で、Usp21を欠いているiTｒｅｇ細胞に対して最大の効果を有する(図15A及びG)。機能上、Usp22i-S02投与は、iTｒｅｇ細胞におけるUsp22欠失に対して類似した効果を有し、シクロヘキシミド(CHX)処理細胞における高いFOXP3分解、FOXP3ユビキチン化の増強、及びFoxp3転写の減少をもたらした(図15H～K)。さらに、Usp22i-S02媒介性FOXP3分解は、MG132プロテアーゼ阻害によって妨げられ、Usp22i-S02がFOXP3のプロテアソーム特異的分解を高めることを示した(図15L)。重要なことには、Usp22i-S02は、グルコース飢餓下のTｒｅｇ細胞においてFoxp3の安定性を有意に低少させ、その一方で、Usp22を欠いているTｒｅｇ細胞においてFoxp3に対する効果はなかった(図15M)。傾向はまた、低酸素状態及びアミノ酸飢餓条件下でも見られ、Usp22i-S02がTME因子の下でFoxp3の安定性を低減することを示した(図15L)。そのため、これらの結果は、Usp22i-S02が、Tｒｅｇ細胞においてFoxp3が発現を下方制御する強力なUSP22特異的小分子阻害剤であることを示す。
潜在的免疫治療の重要な側面は、低免疫毒性と対をなすその抗腫瘍性機能性である。インビボにおけるUsp22i-S02の毒性を測定するために、我々は最初に、未感作マウスにおけるその効果を測定した。我々は、DMSO処理対照マウスと比較して、処理マウスの体重、B細胞及びTｅｆｆ細胞のパーセンテージと増殖、並びにTｅｆｆ細胞活性化のわずかな変化を見出した(図16A～D)。Tｅｆｆ細胞と異なって、Tｒｅｇ細胞死は有意に増加し(図16E)、Tｒｅｇパーセンテージの減少をもたらした(図16B)。興味深いことに、Tｒｅｇ増殖もまた増強された(図16C)、Fig14Bに示されているように、腫瘍内の機能不全Tｒｅｇ集団を示す可能性がある。重要なことには、WTマウスへのUsp22i-S02の投与は、Tｒｅｇ細胞におけるUsp22の遺伝子欠失を模倣し、Usp22-KOマウスにおけるFOXP3 MFIへの追加の減少なしに、Tｒｅｇ細胞頻度におけるいずれの変化も伴わず、脾臓とリンパ節からのTｒｅｇ細胞におけるFOXP3 MFIの有意な低下を示した(図6B～D)。さらに、包括的な組織パネルは、対照DMSO処理マウスからの器官毒性の違いを示さなかった(図16F～H)。これらのデータは、Usp22i-S02の投与が、他の免疫細胞型及び組織毒性に対するわずかな影響で未感作マウスにおけるTｒｅｇ特異的表示型をもたらすことを示す。
潜在的治療薬としてのUsp22i-S02の機能性を測定するために、我々は、樹立した腫瘍に対して阻害剤を試験した。初期LLC1腫瘍樹立に続いて、Usp22i-S02を投与したWTマウスは、未処理のマウスと比較して、衝撃的な腫瘍拒絶を示し、並びにTｅｆｆ細胞腫瘍浸潤の有意な増大を示した(図6E～G)。重要なことには、脾臓ではない腫瘍内のFoxp3＋ Tｒｅｇパーセンテージは、Usp22i-S02の投与後に有意に減少した(図6H)。さらに、itTｒｅｇ細胞は、低レベルのGITRとPD-1を有し、また、有意に高いレベルのIFN-γ、Tｒｅｇ機能不全及び脆弱性のマーカーも発現し(42)、特異的に腫瘍内のTｒｅｇ細胞に対するUsp22i-S02の重要性を示唆した(図6J)。腫瘍浸潤リンパ球の更なる分析を、腫瘍移植処理直後のマウスに対しておこなった(図16I)。減少した腫瘍組織量と増加したTｅｆｆ細胞浸潤と共に、腫瘍内CD8＋T細胞は、無処理マウスと比較した、CD44＋細胞の増大と、T-bet＋、Blimp1＋、及びAnnexin V＋細胞の減少を伴った、消耗の少ない表示型を示した(図16H～P)。重要なことには、腫瘍内Foxp３＋ Tｒｅｇパーセンテージは、Usp22i-S02の投与後に有意に減少した(図16Q)。
Usp22もまた重要な癌遺伝子であったので(43、44)、我々は、Usp22i-S02の潜在的デュアル治療機能に興味をもった。実際に、インビトロにおけるLLC1細胞へのUsp22i-S02の投与は、減少した腫瘍細胞数、生存率、及び増殖をもたらした(図17A～C)。さらに、樹立した腫瘍に伴うRag-/-マウスの処理は、腫瘍細胞固有Usp22が腫瘍増殖に必要であるという先の観察と一致して、小さいが、しかし、統計的に有意な腫瘍増殖の減少をもたらした(図17D)(45)。それと共に、我々のデータは、TME内のTｒｅｇ細胞の安定性及び適応性におけるUsp22の重要役割、並びに小分子阻害剤を用いたUsp22の特異的標的化が腫瘍及び免疫固有機構の両方を通じて抗腫瘍性免疫を高めることを示す。
考察
新たなデータは、(栄養物と酸素を奪う)TMEがTｅｆｆ細胞を超えてTｒｅｇ細胞に代謝的優位性を提供する可能性が高く、さらに免疫抑制性の微小環境を促進することを示唆している。しかしながら、TME特異的因子や、Tｒｅｇ細胞抑制機能及び適応を増強するそれらの細胞標的は、ほとんどが同定されていないままである。我々の調査は、TMEにおいてFoxp3の安定性を増強する環境感受性因子としてのFoxp3特異的DUB、Usp22及びUsp21のこれまで十分に評価されていない役割を例示する。我々は、Usp22及びUsp21を上方制御し、最終的にFoxp3を安定化させるいくつかのTME因子：(1)腫瘍分泌型TGF-β；(2)低酸素状態；(3)グルコース制限；及び(4)アミノ酸欠乏、を特定した(図18)。我々の知見は、itTｒｅｇ細胞の代謝的及び機能的な一意性に隠れた新機構を明らかにし、これらの細胞が環境信号に対応してどのように適合し、それらの機能を支援するのかに対する証拠を提供する。
itTｒｅｇ細胞が、より抑制され、かつ、高いFoxp3発現を有することが多いことは十分に記録されているので(9、10、46)、我々は最初に、様々なマウス腫瘍モデルのこれらの知見を確認した。興味深いことに、我々は、非腫瘍常駐Tｒｅｇ細胞と比較して、これらのモデル及び肺癌患者のitTｒｅｇ細胞がUsp22、及び時々Usp21を上方制御することを見出した。さらに、Usp22上方制御は、ヒト肺癌itTｒｅｇ細胞におけるより高いFoxp3発現に関連し、TME因子が、これらのUSPを選択的に誘発して、ユビキチン介在性分解からFoxp3を保護し、それと同時に、Foxp3転写を同時に促進することを示唆している。我々が観察したヒトitTｒｅｇ細胞における増強されたUsp22という事実は、この経路の関連性をヒト腫瘍治療まで拡大する。Tｒｅｇ細胞におけるUsp7は大腸炎モデルにおいてFoxp3発現とTreg抑制機能を制御することが知られていたが、我々はitTregにおけるUsp7発現の増大を観察せず、Usp7が恒常性状態の間、主としてTｒｅｇ機能を調整し得ることが示唆された。
TGF-βは、iTｒｅｇ転換と安定性の主な担い手であり、多くの腫瘍型によって幅広く分泌される。我々は、腫瘍が分泌したTGF-βが、標準的なTGF-βシグナル伝達によるUsp22の上方制御に十分であることがわかった。さらに、Usp22は、SMADタンパク質安定化によるそれ自体とFoxp3のさらなる上方制御のためのフィードバックループに参加する。Usp21は標準的なTGF-β経路を通して機能していなかったが、非標準TGF-βJNK/P38シグナル伝達経路が役割を担い得ることは可能である(47)。TGF-βがFoxp3発現と安定性、及びiTｒｅｇ機能に広く関係しているので、我々のデータは、既に知られているシステムに新レベルの複雑性を追加する(23、48)。これらの新規機序は、別経路を通したTｒｅｇ細胞安定化を確実にし、さまざまの微小環境におけるそれらの抑制能力を維持するそれらの能力を強化するために強力に機能する。
しかしながら、腫瘍で分泌されたTGF-βは、USPを上方制御することができる唯一の因子でない、なぜなら、EG7 TCMで処理されたTｒｅｇ細胞が、EG7腫瘍から単離されたitTｒｅｇ細胞において見られたUsp22の増大について繰り返す場合がないからである。そのため、我々は、TME中の他の環境要因もまた、USPによるTｒｅｇ安定化に関係することと仮定した。低酸素状態は固形腫瘍の主要な顕著な特徴であったので(3、29)、我々は、低酸素条件がTｒｅｇ細胞においてどのようにUsp22レベルに影響を及ぼすかを調査した。低酸素状態は、HIF依存性様式でUsp22を誘発した。また、Usp22欠失時に、低酸素ストレス下のnTｒｅｇ細胞は、安定したFOXP3発現を維持できなかった。我々の知見は、低酸素条件下でのnTｒｅｇ細胞の高められた増殖と抑制された能力を実証した先のデータと一致した(27)。Usp22プロモーターに沿った2つの機能性HIF結合部位に関する知識と組み合わせた、これらのデータは、低酸素状態がFOXP3のUsp22依存性安定化によってTｒｅｇ抑制機能を高め得ることを意味する(33)。
酸素利用の減少と共に、TME中で起こる栄養競合は、免疫細胞の増殖、生存、及び機能に影響を及ぼす。古典的に、Tｒｅｇ細胞は、Tｅｆｆ細胞に比べて、解糖において有意に低い依存性を有しており、別の利点を潜在的提供すると考えられている(5、34、37)。我々のデータは、グルコース及びアミノ酸欠乏下でFOXP3を安定させるために機能する、このプロセスにおける重要なメディエーターとしてUsp22を同定する。一つには、FOXP3の高められた安定性は、AMPK活性化に次ぐように見え、そしてそれは、TME中のグルコース制限下で起こる可能性が高い。興味深いことに、Tｒｅｇ細胞におけるAMPK活性化は、酸化代謝に向かうシフトを伴い、そしてそれは、TMEにおけるTｒｅｇ生存をさらに高め得る(49)。我々は、AMPK活性化がUsp22及びUsp21を上方制御するのに十分であり、エネルギーストレス下でTｒｅｇ細胞機能のためのFOXP3安定化へのそれらの関与に関わっていることを示す。栄養素欠乏を通じたAMPKシグナル伝達のプロモーションはまた、T細胞内のmTOR活性を抑制する(35、50)。AMPKとmTORシグナル伝達のバランスが栄養利用に関する環境センサーとして機能するので、AMPK活性化がmTORシグナル伝達の阻害を通してUsp22及びUsp21発現を主として増強することが可能である。実際に、mTOR阻害は、Tｒｅｇ細胞においてUsp22及びUsp21を上方制御することができた。
免疫細胞の代謝状態は、それらの細胞生存及び機能に関して、TME中で非常に重要である。Tｒｅｇ細胞は低酸素状態、低栄養環境に適合するので、これは、Tｅｆｆ細胞と比較して、それらに代謝的優位性をもたらす。重要なことには、Tｒｅｇ細胞中の酸化的リン酸化を促進することが知られているので、FOXP3はこのプロセスに不可欠である。我々は、Usp22欠乏及びUsp21欠乏Tｒｅｇ細胞が、有意に変化した代謝遺伝子の発現、並びに欠損OCR及びECARを有することを示す。加えて、RNA配列解析では、Tｒｅｇ細胞におけるUsp22及びUsp21の喪失が、細胞成長や増殖に関連する複数の経路の上方制御をもたらすことが実証された。まとめると、これらのデータは、Usp22及びUsp21がTｒｅｇ細胞の代謝プログラムを調節することを一部使用して、栄養制約環境におけるTｒｅｇ細胞休止を促進するように働く、好奇心をそそる可能性を生じさせる。それと共に、我々のデータは、TME中の微小環境ストレスが、Tｒｅｇ USPレベルを上方制御し、そしてそれが、次に、FOXP3を安定させるために機能することを示す。高められたFOXP3の安定性は、TMEへのTｒｅｇ細胞適応をさらに裏付け；これにより、Usp22及びUsp21を、TMEにおけるTｒｅｇ細胞の同一性、代謝及び機能を調整する重要な環境感受性因子と同定した。
さらに、我々と他の人達は、Usp22及びUsp21の両方が、例えば、胃癌、膵臓癌及び黒色腫などの多くの癌型で上方制御され、そして、予後不良に関連したことを実証した(51、52)。Usp22は、発癌性c-myc活性化を促進し、並びにp53の腫瘍抑制機能と間接的に拮抗し、その一方で、Usp21は、Fra1、FoxM1及びWntを含めた転写因子群を安定させることによって癌遺伝子として機能する(52～54)。重要なことには、Usp22及びUsp21はまた、転写(Usp22)及び翻訳後(両方)レベルでDUB機能によってFoxp3発現を維持するように機能する。この二重性は、Usp22及びUsp21を腫瘍細胞固有及び免疫抑制経路の両方を同時に標的化できる非常に魅力的な潜在的治療薬にする。実際に、それらの同時喪失は、Tｒｅｇ腫瘍促進機能の最も顕著な障害をもたらし、Usp22及びUsp21がTME におけるTreg細胞適応及び機能を調節する際に独特な役割を担っていることが示唆された。
しかしながら、itTｒｅｇ細胞におけるUsp22の喪失は、Usp21の喪失に対して高められた抗腫瘍性免疫をもたらし、Tｒｅｇ細胞におけるUsp22の優位性が示唆された。そのため、Usp22を特異的に標的化することは、Tｒｅｇ細胞がTME中でTｅｆｆを超える利点を排除するのに十分であり得る。これを試験するために、我々は、史上初のUsp22-特異的阻害剤を開発し、そして、試験した。阻害剤の投与は、itTreg数の劇的な減少をもたらし、インビボにおける強い抗腫瘍性効果をもたらした。我々のデータは、Usp22が標的化可能なタンパク質であり、かつ、阻害剤Usp22i-S02が、腫瘍免疫療法に組み込まれる潜在力を有することを実証している。さらに、現在の治療薬の多くが、それ自体、現在の治療法を用いたUsp22阻害の追加が相乗効果により抗腫瘍性免疫をさらに高める可能性があり、Tｅｆｆ細胞機能を促進することに焦点を合わせる。
材料と方法
腫瘍モデル
EG7リンパ腫、LLC1肺癌、及びB16-F10黒色腫細胞株は、NorthwesternにてZhang研究室によって提供され、先に報告した腫瘍モデルに使用された(14)。細胞株を、10%のFBSを加えたDMEM中で培養し、LookOutマイコプラズマPCR検出キット(Sigma、MP0035-1KT)を使用してマイコプラズマについて試験した。培養癌細胞を、トリプシン処理し、PBSで1回洗浄した。LLC1肺癌腫瘍細胞を、マウス毎に1×10６個の腫瘍細胞にて、及び5×10４個の腫瘍細胞にてB16黒色腫を、8～10週齢のマウスの右脇腹に皮下投与した。腫瘍を、2～3日毎に、3本の直交した軸(x、y及びz)に沿って計測することによって計測し、そして、腫瘍体積を(xyz)/2として計算した。IRBによって承認された腫瘍サイズ制限は2cm３であった。
インビトロにおけるiTｒｅｇ細胞TCM及びTGF-βアッセイ
先に作出したiTｒｅｇ細胞を、洗浄し、5ng/mlのIL-2を含むOPTImem培地中で7時間休ませて、生存状態を維持した。OPTImemを、血清中に見られるあらゆるTGF-β汚染を避けるのに使用した。休養後に、細胞を、20ng/mlのTGF-βを伴う又はそれなしのIL-2含有OPTImem、又は様々な腫瘍細胞培地(B16、LLC1、及びEG7)中でインキュベートした。16時間にわたり50%の集密度にてB16、EG7、又はLLC1細胞株を平板培養することによってTCMを得た。次に、TCMを、新鮮なOPTImemと50:50で混合し、そして、24時間にわたりiTreg細胞上でインキュベートした。TGF-β阻害剤LY3200882(Med Chem Express: Cat No.: HY-103021)を、示した25μg/mLにて加えた。
インビトロにおけるTｒｅｇ細胞の低酸素培養
nTｒｅｇ細胞を、先に記載したように単離し、24時間にわたり通常酸素条件(21%のO２)又は低酸素条件(1%のO２)のいずれかで37℃にて培養した。低酸素状態を(低酸素チャンバー及び会社の名称)を使用して誘発した。T細胞培地を、使用前3時間にわたり通常酸素状態又は低酸素状態で37℃にてインキュベートした。次に、細胞を採収し、そして、RNAを、先に記載したように抽出した。iTｒｅｇ細胞に関しては、先に記載したように、細胞を単離し、そして分極させた。それに続いて、細胞を、optiMEM中で一晩休ませ、次に、通常酸素条件又は低酸素条件のいずれかで5ng/mlのIL-2を含有するoptiMEM中で平板培養した。optiMEM培地を、用法前に通常酸素状態又は低酸素状態で一晩、37℃にてインキュベートした。低酸素安定性アッセイを先に記載したように実施したが、細胞を、72時間にわたり通常酸素状態又は低酸素状態で培養し、次に採収し、そして、フローサイトメトリーのためにFOXP3について染色した。
グルコース及びアミノ酸制限アッセイ
nTｒｅｇ細胞を、先に記載したように単離し、そして、1×10５細胞/ウェルにて24時間にわたり、通常のT細胞培地、グルコースを欠いたT細胞培地(Thermo Fisher Catalog# 11879020)又は透析FBS(GIBCO Catalog#A3382001)で置き換えた、グルタミンを含めたアミノ酸を欠いたT細胞培地(US Biological Catalog#R9010-02)のいずれかの中で培養した。T細胞培地は、先に記載した2000UのIL-2やCD3/CD28ビーズを包含した。iTｒｅｇ細胞を、単離し、そして、3日間にわたり先に記載したように分極させた。分極後に、iTｒｅｇ細胞を、通常T細胞培地又はグルコース若しくはアミノ酸を欠いているT細胞培地で24時間培養した。次に、nTｒｅｇ及びiTｒｅｇ細胞の両方を採収し、そして、RNAを先に記載したように抽出した。安定性アッセイのために、細胞を、48時間にわたり先に記載したように培養し、次に、採収し、そして、フローサイトメトリーのためにFOXP3について染色した。
インビトロにおける阻害剤アッセイ
すべてのnTｒｅｇ及びiTｒｅｇ細胞を、先に記載したように平板培養し、そして、DMOG(Sigma Catalog#D3695)を、関連実験において24時間にわたり、1mMにてその細胞に投与した。オリゴマイシン(Sigma Catalog#75351)を、24時間にわたり1μMにて関連実験における細胞の培地に投与した。Torin1(Millipore Catalog#475991)を、24時間にわたり250nMにて関連細胞に投与した。FOXP3タンパク質レベルを、先に記載した阻害剤での処理の48時間後にフローサイトメトリーによって評価した。Usp22i-S02のインビトロ投与は10μg/mLであった。
Usp22i-S02のインビボにおける阻害剤実験
LLC1細胞を、6～8週齢のC57BL/6雄マウスに移植した。皮下注射を、1^6細胞/注射を使用して100μLの終量でマウスの右脇腹において実施した。USP22i-S02を、LLC1細胞注射の日に開始して5日間にわたり1日2回、100μLのオイル中の20mg/kg/回の濃度にて腹腔内(i.p)に注射した。対照動物には、100μLのオイルを単独で与えた。マウスコホート内のいずれかの腫瘍がその最大直径で2.5cmに達するまで、皮下腫瘍の直径をカリパスで毎日計測した。細胞を、先に述べたように加工し、そして、分析した。
統計とデータの有効性
サンプルサイズを事前決定するために統計的方法を使用しなかった。実験は無作為化しなかった。研究者は、実験及び結果評価の間、割り付けに対してブラインドしなかった。すべての統計的分析をGraphPadを用いてコンピュータ処理し、そして、各実験に使用した検定を図面の凡例に列挙する。行間の多重比較を伴ったANOVAを、Tukeyの検定を用いて補正し、統計的有意性を決定した。対応のない両側t検定を、Welchの補正を用いて実施した。
参照文献：
結論
我々の調査では、USP22特異的阻害剤として11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル、又はUSP22i-S02を同定する。この阻害剤は、理想的な抗腫瘍性治療薬であると考えられる、なぜなら：(i) それが、Tｒｅｇ抑制機能を阻害し、かつ、(ii) PD-L1の腫瘍細胞発現を阻害し、そしてその両方が、抗腫瘍性免疫応答を高めるからである。加えて、(iii)USP22i-S02は、USP22抑制を通じて腫瘍細胞増殖を直接阻害する。
表
表1.化合物
表2.抗体
表3.プライマー

Claims (23)

  1. ユビキチン特異的ペプチダーゼ22(USP22)活性に関連する疾患又は障害の治療を必要としている対象を治療する方法であって、USP22の生物学的活性を阻害する治療薬の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
  2. 前記疾患又は障害が、細胞増殖性疾患又は障害である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記疾患又は障害が、癌である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記疾患又は障害が、肺癌、胃癌、膵臓癌、黒色腫、リンパ腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、神経膠腫、中皮腫、神経芽細胞腫、マントル細胞リンパ腫、及び急性骨髄性白血病から成る群から選択される癌である、請求項2に記載の方法。
  5. 前記疾患又は障害が、肺癌である、請求項2に記載の方法。
  6. 前記疾患又は障害が、黒色腫である、請求項2に記載の方法。
  7. 前記治療薬が、以下の：
    7-(ジフルオロメチル)-N-(3,4-ジメチルフェニル)-5-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリジン3-カルボキサミド、
    11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル、
    2,7-ビス(4-メトキシフェニル)9-オキソ9Hフルオレン-2,7-ジスルホナート、
    6-(2,5-ジメトキシフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボニトリル、
    2,4-ジメタンスルホニル-8-メトキシ5H,6H-ベンゾ[h]キナゾリン、
    4,5-ビス(4-メトキシフェノキシ)ベンゼン-1,2-ジカルボニトリル、
    9-[(3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ]-7Hフロ[3,2-g]クロメン-7-オン、
    N-(2-｛[5-(エタンスルホニル)-3-ニトロチオフェン-2-イル]スルファニル｝フェニル)アセトアミド、
    1-[4-ニトロ-5-(ピリジン-4-イルスルファニル)チオフェン-2-イル]エタン-1-オン、
    ビス[(4-メトキシフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    5-｛[(2,4-ジメチルフェニル)スルホニル]アミノ｝-2-メチル-N-フェニルナフト[1,2-b]フラン-3-カルボキサミド、
    8-オキソテトラヒドロパルマチン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)アミノ]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    エチル6-シアノ-7-(4-メトキシフェニル)-5-オキソ-1-フェニル-1,5-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリミジン-3-カルボキシラート、
    1-(5-｛[(4-クロロフェニル)メチル]スルファニル｝-4-ニトロチオフェン-2-イル)エタン-1-オン、
    ビス[(3-クロロフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    1-｛5-[(4-メトキシフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    4-(4-メトキシフェニル)-2-メチル-5-オキソ-5H-インデノ[1,2-b]ピリジン-3-カルボニトリル、
    1-｛5-[(2,3-ジクロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    1-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)エタノン(6-メチル-4-フェニル-2-キナゾリニル)ヒドラゾン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    クリプトクリシン、
    2-アミノ-4-(4-ヒドロキシフェニル)-5-オキソ-4H,5H-ピラノ[3,2-c]クロメン-3-カルボニトリル、
    α-ナフトフラバノン、及び
    エチル2-(4-エトキシアニリノ)-5-[3-メトキシ-4-(2-プロピニルオキシ)ベンジリデン]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-3-チオフェンカルボキシラート、
    から成る群から選択される化合物である、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記治療薬が、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルである、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記治療薬が、USP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害する、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
  10. それを必要としている対象においてTreg細胞活性を抑制する方法であって、USP22の活性を阻害する治療薬の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
  11. 前記対象が、感染症を患っている、請求項10に記載の方法。
  12. 前記対象が、突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV2)感染症を患っている、請求項10に記載の方法。
  13. 前記治療薬が、以下の：
    7-(ジフルオロメチル)-N-(3,4-ジメチルフェニル)-5-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリジン3-カルボキサミド、
    11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル、
    2,7-ビス(4-メトキシフェニル)9-オキソ9Hフルオレン-2,7-ジスルホナート、
    6-(2,5-ジメトキシフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボニトリル、
    2,4-ジメタンスルホニル-8-メトキシ5H,6H-ベンゾ[h]キナゾリン、
    4,5-ビス(4-メトキシフェノキシ)ベンゼン-1,2-ジカルボニトリル、
    9-[(3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ]-7Hフロ[3,2-g]クロメン-7-オン、
    N-(2-｛[5-(エタンスルホニル)-3-ニトロチオフェン-2-イル]スルファニル｝フェニル)アセトアミド、
    1-[4-ニトロ-5-(ピリジン-4-イルスルファニル)チオフェン-2-イル]エタン-1-オン、
    ビス[(4-メトキシフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    5-｛[(2,4-ジメチルフェニル)スルホニル]アミノ｝-2-メチル-N-フェニルナフト[1,2-b]フラン-3-カルボキサミド、
    8-オキソテトラヒドロパルマチン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)アミノ]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    エチル6-シアノ-7-(4-メトキシフェニル)-5-オキソ-1-フェニル-1,5-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリミジン-3-カルボキシラート、
    1-(5-｛[(4-クロロフェニル)メチル]スルファニル｝-4-ニトロチオフェン-2-イル)エタン-1-オン、
    ビス[(3-クロロフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    1-｛5-[(4-メトキシフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    4-(4-メトキシフェニル)-2-メチル-5-オキソ-5H-インデノ[1,2-b]ピリジン-3-カルボニトリル、
    1-｛5-[(2,3-ジクロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    1-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)エタノン(6-メチル-4-フェニル-2-キナゾリニル)ヒドラゾン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    クリプトクリシン、
    2-アミノ-4-(4-ヒドロキシフェニル)-5-オキソ-4H,5H-ピラノ[3,2-c]クロメン-3-カルボニトリル、
    α-ナフトフラバノン、及び
    エチル2-(4-エトキシアニリノ)-5-[3-メトキシ-4-(2-プロピニルオキシ)ベンジリデン]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-3-チオフェンカルボキシラート、
    から成る群から選択される化合物である、請求項10～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記治療薬が、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルである、請求項10～12のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記治療薬が、USP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害する、請求項10～14のいずれか一項に記載の方法。
  16. それを必要としている対象においてUSP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害する方法であって、USP22の生物学的活性を阻害する治療薬の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
  17. 前記治療薬が、以下の：
    7-(ジフルオロメチル)-N-(3,4-ジメチルフェニル)-5-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリジン3-カルボキサミド、
    11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル、
    2,7-ビス(4-メトキシフェニル)9-オキソ9Hフルオレン-2,7-ジスルホナート、
    6-(2,5-ジメトキシフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボニトリル、
    2,4-ジメタンスルホニル-8-メトキシ5H,6H-ベンゾ[h]キナゾリン、
    4,5-ビス(4-メトキシフェノキシ)ベンゼン-1,2-ジカルボニトリル、
    9-[(3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ]-7Hフロ[3,2-g]クロメン-7-オン、
    N-(2-｛[5-(エタンスルホニル)-3-ニトロチオフェン-2-イル]スルファニル｝フェニル)アセトアミド、
    1-[4-ニトロ-5-(ピリジン-4-イルスルファニル)チオフェン-2-イル]エタン-1-オン、
    ビス[(4-メトキシフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    5-｛[(2,4-ジメチルフェニル)スルホニル]アミノ｝-2-メチル-N-フェニルナフト[1,2-b]フラン-3-カルボキサミド、
    8-オキソテトラヒドロパルマチン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)アミノ]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    エチル6-シアノ-7-(4-メトキシフェニル)-5-オキソ-1-フェニル-1,5-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリミジン-3-カルボキシラート、
    1-(5-｛[(4-クロロフェニル)メチル]スルファニル｝-4-ニトロチオフェン-2-イル)エタン-1-オン、
    ビス[(3-クロロフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    1-｛5-[(4-メトキシフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    4-(4-メトキシフェニル)-2-メチル-5-オキソ-5H-インデノ[1,2-b]ピリジン-3-カルボニトリル、
    1-｛5-[(2,3-ジクロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    1-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)エタノン(6-メチル-4-フェニル-2-キナゾリニル)ヒドラゾン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    クリプトクリシン、
    2-アミノ-4-(4-ヒドロキシフェニル)-5-オキソ-4H,5H-ピラノ[3,2-c]クロメン-3-カルボニトリル、
    α-ナフトフラバノン、及び
    エチル2-(4-エトキシアニリノ)-5-[3-メトキシ-4-(2-プロピニルオキシ)ベンジリデン]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-3-チオフェンカルボキシラート、
    から成る群から選択される化合物である、請求項16に記載の方法。
  18. 前記治療薬が、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルである、請求項16に記載の方法。
  19. (i)治療薬、及び(ii)好適な医薬担体、を含む医薬組成物であって、該治療薬が、以下の：
    7-(ジフルオロメチル)-N-(3,4-ジメチルフェニル)-5-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリジン3-カルボキサミド、
    11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリル、
    2,7-ビス(4-メトキシフェニル)9-オキソ9Hフルオレン-2,7-ジスルホナート、
    6-(2,5-ジメトキシフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボニトリル、
    2,4-ジメタンスルホニル-8-メトキシ5H,6H-ベンゾ[h]キナゾリン、
    4,5-ビス(4-メトキシフェノキシ)ベンゼン-1,2-ジカルボニトリル、
    9-[(3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ]-7Hフロ[3,2-g]クロメン-7-オン、
    N-(2-｛[5-(エタンスルホニル)-3-ニトロチオフェン-2-イル]スルファニル｝フェニル)アセトアミド、
    1-[4-ニトロ-5-(ピリジン-4-イルスルファニル)チオフェン-2-イル]エタン-1-オン、
    ビス[(4-メトキシフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    5-｛[(2,4-ジメチルフェニル)スルホニル]アミノ｝-2-メチル-N-フェニルナフト[1,2-b]フラン-3-カルボキサミド、
    8-オキソテトラヒドロパルマチン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)アミノ]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    エチル6-シアノ-7-(4-メトキシフェニル)-5-オキソ-1-フェニル-1,5-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリミジン-3-カルボキシラート、
    1-(5-｛[(4-クロロフェニル)メチル]スルファニル｝-4-ニトロチオフェン-2-イル)エタン-1-オン、
    ビス[(3-クロロフェニル)アミノ]ピラジン-2,3-ジカルボニトリル、
    1-｛5-[(4-メトキシフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    4-(4-メトキシフェニル)-2-メチル-5-オキソ-5H-インデノ[1,2-b]ピリジン-3-カルボニトリル、
    1-｛5-[(2,3-ジクロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    1-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)エタノン(6-メチル-4-フェニル-2-キナゾリニル)ヒドラゾン、
    1-｛5-[(4-クロロフェニル)スルファニル]-4-ニトロチオフェン-2-イル｝エタン-1-オン、
    クリプトクリシン、
    2-アミノ-4-(4-ヒドロキシフェニル)-5-オキソ-4H,5H-ピラノ[3,2-c]クロメン-3-カルボニトリル、
    α-ナフトフラバノン、及び
    エチル2-(4-エトキシアニリノ)-5-[3-メトキシ-4-(2-プロピニルオキシ)ベンジリデン]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-3-チオフェンカルボキシラート、
    から成る群から選択される化合物である、前記医薬組成物。
  20. 前記化合物が、11-アニリノ-7,8,9,10-テトラヒドロベンズイミダゾ[1,2-b]イソキノリン-6-カルボニトリルである、請求項19に記載の医薬組成物。
  21. 前記組成物が、それを必要としている対象に投与されたときにUSP22の生物学的活性を阻害するための化合物の有効量を含む、請求項19～20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 前記組成物が、それを必要としている対象においてTreg細胞活性を抑制するための化合物の有効量を含む、請求項19～20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 前記組成物が、それを必要としている対象においてUSP22のユビキチン特異的ペプチダーゼ活性(E.C. 3.4.19.12)を阻害するための化合物の有効量を含む、請求項19～20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
JP2023565294A 2021-04-23 2022-04-25 ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ｕｓｐ２２）の阻害剤、並びに疾患及び障害の治療のためのその使用 Pending JP2024514958A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163201330P 2021-04-23 2021-04-23
US63/201,330 2021-04-23
PCT/US2022/026159 WO2022226402A1 (en) 2021-04-23 2022-04-25 Inhibitors of ubiquitin specific peptidase 22 (usp22) and uses thereof for treating diseases and disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024514958A true JP2024514958A (ja) 2024-04-03

Family

ID=83723225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023565294A Pending JP2024514958A (ja) 2021-04-23 2022-04-25 ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ｕｓｐ２２）の阻害剤、並びに疾患及び障害の治療のためのその使用

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4326327A1 (ja)
JP (1) JP2024514958A (ja)
KR (1) KR20240001703A (ja)
CN (1) CN117597147A (ja)
CA (1) CA3216296A1 (ja)
WO (1) WO2022226402A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007230910A (ja) * 2006-03-01 2007-09-13 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd Ｖｅｇｆ産生の低減方法
KR101782532B1 (ko) * 2015-06-19 2017-10-11 서울대학교산학협력단 백지 추출물 또는 이로부터 분리된 퓨라노쿠마린을 함유하는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 코로나 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물
CN114053414A (zh) * 2021-12-31 2022-02-18 大连医科大学 一种黄酮类化合物usp22抑制剂在制备抗肿瘤免疫药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN117597147A (zh) 2024-02-23
CA3216296A1 (en) 2022-10-27
WO2022226402A1 (en) 2022-10-27
KR20240001703A (ko) 2024-01-03
EP4326327A1 (en) 2024-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hanna et al. Inhibition of Hedgehog signaling reprograms the dysfunctional immune microenvironment in breast cancer
AU2016296878B2 (en) Chiral diaryl macrocycles and uses thereof
JP6823587B2 (ja) Ｍｄｍ２阻害剤とｂｔｋ阻害剤との併用治療法
KR20220133258A (ko) 화합물 및 이의 용도
WO2015168599A1 (en) Combination therapies targeting mitochondria for cancer therapy
KR20230131189A (ko) Tead 억제제 및 이의 용도
AU2013307383A1 (en) Aminoheteroaryl compounds as MTH1 inhibitors
JP2022511443A (ja) Ｓｅｔｄ２を阻害することにより、ｗｈｓｃ１を過剰発現する癌を処置する方法
US20230072053A1 (en) Compounds and uses thereof
CA3191363A1 (en) Pharmaceutical combination and tumor treatment
TWI550089B (zh) Evaluation of anti-tumor agents and therapeutic effects in patients with mutated colorectal cancer of KRAS gene
JP6373252B2 (ja) オーロラキナーゼ阻害薬を使用する癌の治療方法
WO2017117386A1 (en) Methods of treating cancer using network brakes
KR101652010B1 (ko) p34의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 전이 억제용 조성물
JP2024514958A (ja) ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ｕｓｐ２２）の阻害剤、並びに疾患及び障害の治療のためのその使用
US20220288067A1 (en) Treatment of cancer with cdk inhibitors
US9566334B2 (en) Combinations of a PI3K/AKT inhibitor compound with an HER3/EGFR inhibitor compound and use thereof in the treatment of a hyperproliferative disorder
US20200101070A1 (en) Methods of treating cancer having an active wnt/beta-catenin pathway
Sreenivasan et al. Targeting the gp130/STAT3 Axis Attenuates Tumor Microenvironment Mediated Chemoresistance in Group 3 Medulloblastoma Cells. Cells 2022, 11, 381
CA3196283A1 (en) Csf1r kinase inhibitor and use thereof
TW202202143A (zh) 使用cdk4/6及cdk2抑制劑共同治療以遏止腫瘤對cdk2抑制劑之適應性
CN116783311A (zh) Hormad1疗法
US20180028611A1 (en) Compositions and methods to induce targeted apoptosis by modulating protein tyrosine phosphatase 13 (ptpn13)
CN116940365A (zh) 慢性髓性白血病干细胞抑制剂
EP3897613A1 (en) Use of il-1beta binding antibodies