TW202202143A - 使用cdk4/6及cdk2抑制劑共同治療以遏止腫瘤對cdk2抑制劑之適應性 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種用於治療疾病或病症且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量的CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中該CDK4/6抑制劑防止由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。

Description

使用CDK4/6及CDK2抑制劑共同治療以遏止腫瘤對CDK2抑制劑之適應性

本發明係關於用於經由週期素依賴性激酶2 (CDK2)與週期素依賴性激酶4及6 (CDK4/6)之共同抑制來治療或緩解異常細胞增殖性病症(諸如癌症)的組合及方法。在一些實施例中，該等組合及方法提供CDK2與CDK4/6之協同共同抑制。

細胞週期之進程係藉由週期素依賴性激酶(CDK)所介導的依序磷酸化事件來進行。CDK活性在整個細胞週期中之時序及特異性係藉由各種週期素之升高及下降來實現，該等週期素經由異二聚複合物之形成來活化CDK。處於休眠或靜息狀態之細胞可藉由促分裂原刺激以進入細胞週期，該等促分裂原活化經促分裂原活化之蛋白激酶路徑，從而導致D型週期素(週期素D1、D2及D3)上調(Aktas等人, 1997；Sherr, 1993, 1994)。週期素D隨後結合CDK4及CDK6，且引發視網膜母細胞瘤蛋白Rb之磷酸化。雖然CDK4/6介導之Rb磷酸化的性質及影響尚在活躍爭論中(Chung等人, 2019；Narasimha等人, 2014；Sanidas等人, 2019)，但當前模型陳述Rb磷酸化導致其失活及驅動進入S期所需之基因表現的E2F轉錄因子(包括週期素E及週期素A)之後繼釋放(Chellappan等人, 1991；Ohtani等人, 1995)。CDK4及CDK6展現結構及功能同源性，且皆可使Rb磷酸化(Kato等人, 1993；Meyerson及Harlow, 1994)然而，CDK4及CDK6之獨特譜系特異性表現圖譜表明，其並非完全多餘(Hu等人, 2009；Malumbres等人, 2004；Rane等人, 1999)。

在藉由添加促分裂原而經刺激以重新進入細胞週期之靜息細胞中，需要CDK4/6活性直至週期素E使CDK2活化，其進一步使Rb磷酸化，從而引發確保E2F的完全釋放及通過限制點(定義為其後細胞變為促分裂原非依賴型的時間)之正回饋環路(Baldin等人, 1993；Lundberg及Weinberg, 1998；Matsushime等人, 1994；Mittnacht等人, 1994)。在異步循環細胞中，僅在G1期的前3至6小時期間需要CDK4/6，如藉由其後添加CDK4/6抑制劑(諸如哌柏西利(palbociclib) (IBRANCE®，亦參見以引用之方式併入本文中的美國專利第6,936,612號及RE47,739))不再阻礙CDK2活性升高及細胞週期進程的時間所測定(Yang等人, 2017b)。在進入S期時，週期素E含量降低，且CDK2-週期素A接替，其促進DNA複製(例如Cdc6)、DNA修復(例如Nbs1)、組織蛋白合成(例如NPAT)、中心體複製(例如核仁磷酸蛋白Mps1)以及其他過程所必需之蛋白的磷酸化(Fisk及Winey, 2001；Okuda等人, 2000；Petersen等人, 1999；Wohlbold等人, 2012；Zhao等人, 2000)。最終，CDK1-週期素A與CDK1-週期素B複合物在S及G2晚期中活化以分別驅動向有絲分裂之轉變及有絲分裂之完成(Katsuno等人, 2009) (Lindqvist等人, 2009；Lohka等人, 1988)。鑒於CDK-週期素複合物之生物重要性，不出人意料的是此等複合物及調節其之蛋白質通常在癌症中突變(Deshpande等人, 2005)。常見改變包括Rb功能損失或週期素D、週期素E、CDK4及CDK6之上調/擴增(Burkhart及Sage, 2008；Keyomarsi等人, 2002；Khatib等人, 1993；Massague, 2004；Musgrove等人, 2011；Park等人, 2014)。

不管CDK之關鍵功能如何，除CDK1之外，許多CDK為活體內非必需的，從而表明CDK之間的功能補償。舉例而言，小鼠中之CDK4缺失選擇性地影響胰臟β細胞及垂體催乳素細胞的增殖，CDK6缺失僅影響造血細胞亞群，且CDK2損失選擇性地影響生殖系細胞之增殖(Malumbres等人, 2004；Moons等人, 2002；Rane等人, 1999)。雖然CDK4/CDK6雙基因敲除由於造血缺陷對小鼠胚胎為致命的，但其他組織展現正常的增殖(Malumbres等人, 2004)。一致地，各種細胞培養物模型中的CDK2之基因敲除或基因敲落顯示CDK2對於細胞增殖而言為非必需的(Tetsu及McCormick, 2003)。

雖然此等研究支持CDK2活性對於存活率及增殖而言為非必需之想法，但並不清楚CDK2對於細胞週期進程或在補償性激酶在無CDK2環境中具活性的情況下是否不必要(Berthet等人, 2003)。由於CDK2/CDK4雙重基因敲除小鼠亦存活，因而在不存在CDK2或CDK4之情況下的增殖係歸因於CDK1之補償性磷酸化(Malumbres等人, 2004)。實際上，缺乏CDK2、CDK3、CDK4及CDK6之小鼠胚胎可發育至妊娠中期(Santamaria等人, 2007)。此等小鼠基因敲除研究之結論為，CDK1為哺乳動物細胞中之唯一必需CDK，且可驅動所有必需CDK2、CDK4及CDK6受質之補償性磷酸化。

不管如藉由上述研究所證實的CDK2之非必需性如何，在研發將CDK2靶向用於治療過度表現且依賴於週期素E之癌症的小分子抑制劑方面仍存在大量關注。此等癌症對臨床CDK4/6抑制劑具有內部耐藥性，且被視為對CDK2「上癮」以維持存活(Caldon等人, 2012)。另外，在臨床前模型中，用CDK4/6抑制劑(例如哌柏西利、阿貝西利(abemaciclib)、利波西利(ribociclib))進行長期處理導致經由Rb損失獲得之耐藥性、導致CDK2/週期素E活性上調的CCNE1擴增，或非典型CDK2/週期素D1複合物形成(Franco等人, 2014；Herrera-Abreu等人, 2016；Yang等人, 2017a)。為解決此臨床假設，Pfizer Inc.近來研發出一種新的ATP競爭性CDK抑制劑PF-06873600 (有時在本文中稱為PF3600，其進一步揭示於美國專利第10,233,188號中，各化學結構及其用途特別以引用之方式併入本文中)。PF3600經設計以捕捉CDK2、4及6複合物之細胞信號傳導活性，同時在抗目標CDK1上維持顯著效力窗口。如可見，長期迫切需要較佳地理解CDK2、4及6尤其在治療異常細胞增殖性病症(諸如癌症)中之組合抑制的潛在治療效果。

此處，本發明人使用單細胞時移成像以及其他傳統技術來表徵CDK2抑制對受質磷酸化及細胞週期進程之動態影響。使用衍生自DNA解螺旋酶B (DHB)之C端的針對CDK2活性之活細胞感測器，證實在CDK2抑制時驅動CDK2受質重新磷酸化及細胞週期進程之快速補償性機制。如所預期，CDK2之抑制導致在廣泛多種不同CDK2受質中的即時磷酸化損失。然而，在顯著呈現細胞適應性時，補償性受質磷酸化在1至2小時內快速開始。出人意料地，CDK2與CDK1之共同抑制不阻斷補償性磷酸化，而CDK2與CDK4/6之共同抑制消除反彈磷酸化且將細胞送至CDK^low 非增殖狀態中。此等結果指示細胞可經由CDK4/6之補償性活化而快速適應CDK2活性損失，且CDK2抑制劑準備與靶向CDK4/6之治療劑(包括經批准之CDK4/6抑制劑)組合協同作用。

本發明部分地提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之兩種或更多種CDK抑制劑，該兩種或更多種CDK抑制劑抑制CDK2及CDK4以及CDK6或其組合之活性。

本發明進一步部分地提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之兩種或更多種CDK抑制劑，該兩種或更多種CDK抑制劑抑制由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。

在一個態樣中，本發明提供一種用於治療異常細胞增殖性疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中該CDK4/6抑制劑抑制由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。

在另一態樣中，本發明提供一種方法，其用於抑制細胞中由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化，該方法包含向該細胞引入一定量之CDK2抑制劑及一定量之CDK4/6抑制劑，其中該量之CDK4/6抑制劑有效抑制由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。在一些實施例中，引入CDK2抑制劑，隨後引入CDK4/6抑制劑。

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中該等治療有效量一起有效治療該疾病或病症。

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含當在有需要之個體中觀測到由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化時，向該個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑。

本發明亦提供治療疾病或病症(且較佳地癌症)之治療方法及用途，其包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，再與治療有效量之一或多種額外抗癌劑或姑息劑組合，其中該等治療有效量一起有效治療該疾病或病症，例如癌症。

在另一態樣中，本發明提供一種方法，其用於治療由個體中之CDK2、CDK4及/或CDK6所介導，且較佳地特徵在於由個體中之CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化的疾病或病症。

在本文中所提供之方法的一些實施例中，該疾病或病症為特徵在於週期素E1 (CCNE1)及/或週期素E2 (CCNE2)之擴增或過度表現的癌症。在本文所提供之方法的一些實施例中，癌症之特徵在於對一或多種CDK4/6抑制劑之耐藥性(例如歸因於週期素E表現增加)。在本文所提供之方法的其他常見實施例中，癌症之特徵在於腫瘤細胞增殖依賴CDK2。

參考本發明之較佳實施例的以下詳細描述及本文中所包括之實例可更易於理解本發明。應理解，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且並不意欲為限制性的。應進一步理解，除非在本文中特別限定，否則將對本文中所使用之術語賦予其在相關技術中所已知的傳統含義。

如本文中所使用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此，舉例而言，對「細胞」之參考包括一或多個細胞及其為熟習此項技術者所已知的等效物，以此類推。類似地，除非上下文另外明確指示，否則字語「或」意欲包括「及」。因此，「包含A或B」意謂包括A，或B，或A及B。此外，術語「包括(including)」以及諸如「包括(includes)」及「包括(included)」之其他相關形式的使用不具限制性。

如本文中所使用，術語「約」為具有與「大約」或「幾乎」類似的含義之靈活字語。術語「約」指示不主張精確性，而是所涵蓋之變化。因此，如本文中所使用，術語「約」意謂在離特定敍述值1個或2個標準差內，或與特定敍述值相比，±至多20%、至多15%、至多10%、至多5%或至多4%、3%、2%或1%之範圍。

本文中所描述之本發明可適當地在不存在本文中所特別揭示之任何要素的情況下予以實踐。因此，舉例而言，在本文中之各情況下，術語「包含」、「基本上由……組成」及「由……組成」中之任一者可由另外兩個術語中之任一者替換。

如本文中所使用，「抑制(inhibits)」、「抑制(inhibition)」係指目標蛋白產物之活性相對於正常野生型含量減小。抑制可引起目標酶，且較佳地CDK之活性減小，且更佳地由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化減小。在一些實施例中，由CDK4及/或CDK6介導之反彈磷酸化減少小於10%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

CDK及相關絲胺酸/蘇胺酸激酶為重要的細胞酶，該等細胞酶在調節細胞分裂及增殖中執行必要功能。「CDK抑制劑」意謂抑制一或多種CDK蛋白或CDK/週期素激酶複合物之活性的任何化合物或藥劑。化合物或藥劑可藉由與CDK蛋白之直接或間接相互作用而抑制CDK活性(諸如磷酸化)，或該化合物或藥劑可用以防止一或多種CDK基因之表現。在較佳實施例中，CDK抑制劑為小分子CDK抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽。

CDK抑制劑包括靶向廣泛範圍之CDK的泛CDK抑制劑或靶向一或多種特異性CDK之選擇性CDK抑制劑。CDK抑制劑可針對除CDK以外之目標具有活性，該等目標諸如Aurora A、Aurora B、Chk1、Chk2、ERK1、ERK2、GST-ERK1、GSK-3α、GSK-3β、PDGFR、TrkA及VEGFR。

CDK抑制劑包括但不限於阿貝西利(CAS號1231929-97-7)、阿伏西地(alvocidib) (亦即夫拉平度(flavopiridol)；CAS號146426-40-6)、地那西利(dinaciclib) (CAS號779353-01-4)、因帝替尼(inditinib) (AGM-130；CAS號1459216-10-4)、嘧西利(milciclib) (PHA-848125；CAS號802539-81-7)、哌柏西利(CAS號571190-30-2)、利波西利(CAS號1211441-98-3)、羅斯維汀(roscovitine) (塞利西利(seliciclib)；CAS號186692-46-6)、AT7519 (CAS號844442-38-2)、AZD5438 (CAS號602306-29-6)、BMS-265246 (CAS號582315-72-8)、BMS-387032 (SNS-032；CAS號345627-80-7)、BS-181 (CAS號1397219-81-6)、FN-1501 (CAS號1429515-59-2)、JNJ-7706621 (CAS號443797-96-4)、K03861 (CAS號853299-07-7)、MK-8776 (CAS號891494-63-6)、P276-00 (CAS號920113-03-7)、PF-06873600 (CAS號2185857-97-8)、PHA-793887 (CAS號718630-59-2)、R547 (CAS號741713-40-6)、RO3306 (CAS號872573-93-8)及SU 9516 (CAS號377090-84-1)。

泛CDK抑制劑之實例包括但不限於阿伏西地、地那西利、羅斯維汀、AT7519、AZD5438、BMS-387032、P276-00、PHA-793887、R547及SU 9516。選擇性CDK1抑制劑之一非限制性實例為RO3306。CDK1/2抑制劑之實例包括但不限於BMS-265246及JNJ-7706621。

CDK2抑制劑可為選擇性CDK2抑制劑或非選擇性CDK2抑制劑。CDK2抑制劑之實例包括但不限於K03861、PF-06873600、因帝替尼、嘧西利及FN-1501。雖然諸如PF-06873600之一些化合物可鑑別為CDK2抑制劑，但此指定並不限制該化合物針對其他CDK之活性。如此，PF-06873600可例如以劑量依賴性方式有效抑制CDK2，且亦可同樣在一些情況下以劑量依賴性方式(亦即，其可充當CDK2/4/6抑制劑)抑制CDK4及CDK6。在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，CDK2抑制劑係選自由以下組成之群：6-(二氟甲基)-8-[(1R ,2R )-2-羥基-2-甲基環戊基]-2-{[1-(甲磺醯基)哌啶-4-基]胺基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H )-酮(PF-06873600)、嘧西利、因帝替尼及FN-1501，或其醫藥學上可接受之鹽。在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，CDK2抑制劑係選自由以下組成之群：6-(二氟甲基)-8-[(1R ,2R )-2-羥基-2-甲基環戊基]-2-{[1-(甲磺醯基)哌啶-4-基]胺基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H )-酮(PF-06873600)、因帝替尼及FN-1501，或其醫藥學上可接受之鹽。在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽。

選擇性CDK4/6抑制劑之實例包括但不限於阿貝西利、利波西利、哌柏西利、勒羅西利(lerociclib) (CAS號1628256-23-4)、曲拉西利(trilaciclib) (CAS號1374743-00-6)、SHR-6390 (CAS號2278692-39-8)及BPI-16350 (CAS號2412559-19-2)或其醫藥學上可接受之鹽。在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，CDK4/6抑制劑係選自由以下組成之群：阿貝西利、利波西利、哌柏西利、勒羅西利、曲拉西利、SHR-6390及BPI-16350，或其醫藥學上可接受之鹽。在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，CDK4/6抑制劑係選自由以下組成之群：阿貝西利、利波西利及哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。

在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。

CDK4/6抑制劑之較佳實例及其結構提供於下：

哌柏西利(PD-0332991；IBRANCE^® )為由Pfizer出售之用於與內分泌療法組合治療激素受體陽性、HER2陰性轉移性乳癌的選擇性CDK4/6抑制劑。哌柏西利之結構為：

阿貝西利(LY2835219；VERZENIO^® )為由Eli Lilly出售之用於與內分泌療法組合治療激素受體陽性、HER2陰性轉移性乳癌的選擇性CDK4/6抑制劑。阿貝西利之結構為：

利波西利(Lee011；KISQALI®)為由Novartis出售之用於與內分泌療法組合治療激素受體陽性、HER2陰性轉移性乳癌的選擇性CDK4/6抑制劑。利波西利之結構為：

。

勒羅西利為在G1 Therapeutics之臨床研發中與其他靶向療法組合用於多種腫瘤學適應症的經口選擇性CDK4/6抑制劑。勒羅西利具有以下結構：

曲拉西利為在G1 Therapeutics之臨床研發中用於接受化療之患者的骨髓保存療法中之選擇性CDK4/6抑制劑。曲拉西利為在化療之前投與的短效靜脈內CDK4/6抑制劑，且當前正在進行臨床評估。曲拉西利具有以下結構：

SHR-6390為由Jiangsu HengRui Medicine Co., Ltd研發之選擇性CDK4/6抑制劑。SHR-6390當前正在患有HR陽性及HER2陰性晚期乳癌之患者中與來曲唑(letrozole)或阿那曲唑(anastrozole)或氟維司群(fulvestrant)結合進行研究。已研發各種其他嘧啶類藥劑來治療過度增殖性疾病。由Tavares及Strum申請且轉讓給G1 Therapeutics之美國專利第8,822,683號；第8,598,197號；第8,598,186號；第8,691,830號；第8,829,102號；第8,822,683號；第9,102,682號；第9,499,564號；第9,481,591號；及第9,260,442號描述一類N-(雜芳基)-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺週期素依賴性激酶抑制劑，其包括下式(變數如其中所定義)之彼等：

BPI-16350為由Betta Pharmaceuticals研發之選擇性CDK4/6抑制劑。BPI-16350當前正在局部晚期或轉移性實體腫瘤之I期劑量遞增研究中進行研究。BPI-16350具有以下結構：

CDK2抑制劑之較佳實例及其結構提供於下：

在本文中亦稱為PF-06873600或PF3600之化合物6-(二氟甲基)-8-[(1R ,2R )-2-羥基-2-甲基環戊基]-2-{[1-(甲磺醯基)-哌啶-4-基]胺基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H )-酮為正在由Pfizer研發的另外抑制CDK4及CDK6之CDK2抑制劑。PF3600之化學結構鑑別於下，且更充分地描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第10,233,188號中：

可進一步抑制其他CDK (例如CDK4及CDK6)之額外CDK2抑制劑包括但不限於：嘧西利、FN-1501及因帝替尼(AGM-130)。化學結構提供於下：

除非另外指示，否則本文中對小分子CDK抑制劑，且特定言之對小分子CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑之所有參考包括對其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物及複合物的參考，及對其醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物、水合物及複合物之參考，且包括其非晶及多晶形式、立體異構體及經同位素標記之型式。

本文中所描述之方法係關於組合療法，其包含向有需要之個體投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑，該CDK2抑制劑可為選擇性或非選擇性CDK2抑制劑，該CDK4/6抑制劑通常為選擇性CDK4/6抑制劑。出於清楚起見，在本文中所描述之方法及組合中，將理解，CDK2抑制劑(亦即第一CDK抑制劑)及CDK4/6抑制劑(亦即第二CDK抑制劑)為兩種獨立且相異的化合物，而非抑制CDK2、CDK4及CDK6之單一化合物。

在一個實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑。在一些實施例中，投與CDK2抑制劑，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2/4/6抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑。在一些實施例中，投與CDK2/4/6抑制劑，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，治療有效量之CDK2抑制劑與CDK4/6抑制劑一起有效治療疾病或病症，諸如癌症。

在本文中之方法及組合中之每一者的一些實施例中，除非另外指示，否則CDK2抑制劑可進一步抑制CDK4/6 (亦即CDK2/4/6抑制劑)。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中CDK4/6抑制劑防止由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中該量之CDK4/6抑制劑有效預防、減輕或減少由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中CDK4/6抑制劑防止由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。在一些實施例中，投與CDK2抑制劑，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中該量之CDK4/6抑制劑有效減輕或減少由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。在一些實施例中，投與CDK2抑制劑，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2/4/6抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中CDK4/6抑制劑防止由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。在一些實施例中，投與CDK2/4/6抑制劑，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2/4/6抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中該量之CDK4/6抑制劑有效減輕或減少由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2/4/6抑制劑對CDK2之抑制的反彈磷酸化。在一些實施例中，投與CDK2/4/6抑制劑，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在一個實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之選自由以下組成之群的CDK4/6抑制劑：哌柏西利、利波西利及阿貝西利或其醫藥學上可接受之鹽。在較佳實施例中，CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。

在一個實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑，其中CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽；及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其選自由以下組成之群：哌柏西利、利波西利及阿貝西利或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，投與PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽，隨後投與CDK4/6抑制劑。

在另一實施例中，本發明提供一種用於治療疾病或病症，且較佳地癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之CDK2抑制劑，其中CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽；及治療有效量之CDK4/6抑制劑，其中CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明進一步提供治療方法及用途，其包含單獨或與一或多種其他治療劑或姑息劑組合投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽。

在本文中所提供之方法的一些實施例中，疾病或病症為異常細胞生長，特定言之癌症。在一個態樣中，本發明提供一種方法，其用於治療個體中之異常細胞生長，該方法包含向個體投與治療有效量之CDK2抑制劑及治療有效量之CDK4/6抑制劑。在常見實施例中，異常細胞生長為癌症。在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體中之癌症的方法，該方法包含向個體投與一定量之CDK2抑制劑及一定量之CDK4/6抑制劑，再與一定量之額外抗癌劑組合，該等量一起有效治療該癌症。

在又另一態樣中，本發明提供一種用於抑制個體中之癌細胞增殖的方法，該方法包含以有效抑制癌細胞增殖的量向個體投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑。

在另一態樣中，本發明提供一種用於抑制個體中之癌細胞侵襲的方法，該方法包含以有效抑制癌細胞侵襲的量向個體投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑。

在另一態樣中，本發明提供一種用於誘導個體中之癌細胞之細胞凋亡的方法，該方法包含以有效誘導細胞凋亡的量向個體投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑。

在另一態樣中，本發明提供一種組合，其包含用於治療有需要之個體中之癌症的CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑。在一些此類實施例中，CDK2抑制劑進一步抑制CDK4/6 (亦即CDK2/4/6抑制劑)。

在另一態樣中，本發明提供一種包含CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑之組合的用途，其用於治療有需要之個體中之癌症。

在另一態樣中，本發明提供一種包含CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑之組合的用途，其用於製造用於治療有需要之個體中之癌症的藥物。

在本文中所提供之方法、組合及用途中之每一者的較佳實施例中，CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽。在本文中所提供之方法、組合及用途中之每一者的較佳實施例中，CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。在本文中所提供之方法、組合及用途的尤其較佳組合中，CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽，且CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。

在本文中所提供之方法、組合及用途中之每一者的一些實施例中，癌症之特徵在於對CDK4/6抑制劑之耐藥性，例如歸因於週期素E表現增加。在本文中所提供之方法、組合及用途中之每一者的其他實施例中，癌症之特徵在於腫瘤細胞增殖依賴CDK2。

在本文中所提供之方法、組合及用途之每一者的常見實施例中，癌症係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、前列腺癌、肺癌(包括NSCLC、SCLC、鱗狀細胞癌或腺癌)、食道癌、頭頸癌、結直腸癌、腎癌(包括RCC)、肝癌(包括HCC)、胰臟癌、胃(stomach)(亦即胃(gastric))癌及甲狀腺癌。

在本文中所提供之方法、組合及用途之每一者的其他實施例中，癌症係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝癌、胰臟癌及胃癌。在一些此類實施例中，癌症之特徵在於腫瘤細胞增殖依賴CDK2。在本文中所提供之方法的其他實施例中，異常細胞生長為特徵在於週期素E1 (CCNE1)及/或(CCNE2)之擴增或過度表現的癌症。在本文中所提供之方法、組合及用途之每一者的一些實施例中，個體經鑑別為患有特徵在於CCNE1及/或CCNE2之擴增或過度表現的癌症。

在一些實施例中，癌症係選自由乳癌及卵巢癌組成之群。在一些此類實施例中，癌症為特徵在於CCNE1及/或CCNE2之擴增或過度表現的乳癌或卵巢癌。在一些此類實施例中，癌症為(a)乳癌或卵巢癌；(b)特徵在於CCNE1或CCNE2之擴增或過度表現；或(c) (a)及(b)兩者。

在一些實施例中，癌症為卵巢癌。在一些此類實施例中，卵巢癌之特徵在於CCNE1及/或CCNE2之擴增或過度表現。

在一些實施例中，癌症為乳癌。在一些此類實施例中，乳癌為激素受體陽性(HR+)，其可為雌激素受體陽性(ER+)及/或孕酮受體陽性(PR+)。在一些實施例中，乳癌為激素受體陰性(HR-)。在一些實施例中，乳癌為人類表皮生長因子受體2陽性(HER2+)。在一些實施例中，乳癌為人類表皮生長因子受體2陰性(HER2-)。在其他此類實施例中，乳癌為HR陽性、HER2陰性乳癌；HR陽性、HER2陽性乳癌；HR陰性、HER2陽性乳癌；三陰性乳癌(TNBC)；或炎性乳癌。在一些實施例中，乳癌為內分泌抗性乳癌、曲妥珠單抗(trastuzumab)抗性乳癌或呈現對CDK4/6抑制原發性(primary)或獲得性抗性之乳癌。在一些實施例中，乳癌為晚期或轉移性乳癌。在前述之每一者的一些實施例中，乳癌之特徵在於CCNE1及/或CCNE2之擴增或過度表現。

在一些實施例中，CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑可作為第一線療法投與。在其他實施例中，CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑作為第二(或較晚)線療法投與。在一些實施例中，CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑在經內分泌治療劑治療之後作為第二(或較晚)線療法投與。在一些實施例中，CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑在經內分泌治療劑治療之後作為第二(或較晚)線療法投與。在一些實施例中，依序投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑，其中在時間0處投與CDK2抑制劑，隨後在時間1處投與CDK4/6抑制劑。在一些實施例中，CDK抑制劑在經一或多種化療方案(例如包括紫杉烷或鉑劑)治療之後作為第二(或較晚)線療法投與。在一些實施例中，CDK抑制劑在經例如HER2靶向劑(例如曲妥珠單抗)治療之後作為第二(或較晚)線療法投與。

如本文中所使用，術語「治療有效量」係指所投與的將在一定程度上緩解所治療之病症的症狀中之一或多者的化合物的量。參考癌症治療，治療有效量係指具有以下作用之量：(1)減小腫瘤大小，(2)抑制(亦即在一定程度上減緩，較佳地阻止)腫瘤轉移，(3)在一定程度上抑制(亦即在一定程度上減緩，較佳地阻止)腫瘤生長或腫瘤侵襲，及/或(4)在一定程度上緩解(或較佳地消除)與癌症相關的一或多種病徵或症狀。

如本文中所使用，「個體」係指人類或動物個體。在某些較佳實施例中，個體為人類。

除非另外指示，否則如本文中所使用，術語「治療」意謂逆轉、減輕、抑制此術語所適用之病症或病狀或此病症或病狀的一或多種症狀的進展，或預防病症或病狀或此病症或病狀之一或多種症狀。因「治療(treating)」在上文剛定義，故除非另外指示，否則如本文中所使用，術語「治療(treatment)」係指治療行動。術語「治療」亦包括對個體之輔助治療及新輔助治療。

術語「異常細胞生長」及「過度增殖性病症」在本申請案中可互換使用。

除非另外指示，否則如本文中所使用，「異常細胞生長」係指獨立於正常調節機制(例如接觸抑制喪失)之細胞生長。異常細胞生長可為良性(非癌性)或惡性(癌性)的。

如本文中所使用，術語「額外抗癌劑」意謂除本發明之CDK2及CDK4/6抑制劑之組合以外的用於或可用於治療癌症之任一種或多種治療劑，諸如來源於以下類別之藥劑：有絲分裂抑制劑、烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓樸異構酶I及II抑制劑、植物鹼、激素劑及拮抗劑、生長因子抑制劑、輻射、蛋白質酪胺酸激酶及/或絲胺酸/蘇胺酸激酶之抑制劑、細胞週期抑制劑、生物反應調節劑、酶抑制劑、反義寡核苷酸或寡核苷酸衍生物、細胞毒性劑及免疫腫瘤學試劑。

如本文中所使用，「癌症」係指異常細胞生長所導致之任何惡性及/或侵襲性生長或腫瘤。癌症包括針對形成實體腫瘤之細胞類型命名之實體腫瘤、血液癌症、骨髓癌症或淋巴系統癌症。實體腫瘤之實例包括肉瘤及癌瘤。血液癌症包括但不限於白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。癌症亦包括起源於身體特定部位處之原發性癌症、自其開始之位置擴散至身體其他部分的轉移性癌症、初始原發性癌症在緩解之後的復發及作為個體之新原發性癌症之第二原發性癌症，該個體之先前癌症病史與後一癌症的類型不同。

CDK抑制劑之投與，且較佳地CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑之投與可藉由使得能夠將抑制劑遞送至作用部位的任何方法進行投與。此等方法包括經口途徑、十二指腸內途徑、非經腸注射(包括靜脈內、皮下、肌內、血管內或輸注)、局部及直腸投與。可依序、並行或同時投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑。術語「依序(sequential/sequentially)」係指單獨或以藥物形式相繼投與組合療法之各治療劑，其中各治療劑可以任何次序進行投與。依序投與可尤其適用於當組合療法中之治療劑呈不同劑型(例如一種藥劑為錠劑且另一藥劑為無菌液體)時，且/或藥劑係根據不同給藥排程進行投與，例如一種藥劑每日投與，且第二藥劑以更低頻率(諸如每週)投與。術語「並行」係指單獨或以單獨的藥物形式投與本發明之組合療法中的各治療劑，其中第二治療劑緊接在第一治療劑之後投與，但該等治療劑可以任何次序進行投與。術語「同時」係指以同一藥物形式投與本發明之組合療法的各治療劑。

可調整給藥方案以提供最佳所要反應。舉例而言，可投與單次推注，可隨時間投與若干分次劑量，或可如治療情況之緊急狀態所指示而按比例減少或增加劑量。就投藥簡易性及劑量均一性而言，以單位劑型調配非經腸組合物尤其有利。如本文中所使用，單位劑型係指適合作為待治療之哺乳動物個體之單位劑量的物理離散單位；各單位含有經計算以產生與所需醫藥載劑相關之所要治療作用的預定量之活性化合物，例如CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑。單位劑型之規格藉由下列情況規定且直接視以下情況而定：(a)化學治療劑之獨特特徵及待達成之特定治療或防治作用，及(b)對用於治療個體敏感性之此活性化合物進行化合之技術中的固有限制。

因此，熟習此項技術者將瞭解，基於本文中所提供之揭示內容，根據治療技術中所熟知的方法來調整劑量及給藥方案。亦即，可容易地確立最大可耐受劑量，且亦可確定向患者提供可偵測治療益處之有效量，亦可確定投與各藥劑以向患者提供可偵測治療益處的時間要求。因此，雖然本文中例示某些劑量及投藥方案，但此等實例決不限制在實踐本發明時可向個體提供之劑量及投與方案。

應注意，劑量值可隨待減輕之病狀的類型及嚴重程度而變化，且可包括單次或多次劑量。應進一步理解，對於任何特定個體，特定劑量方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之人員的專業判斷而隨時間調整，且本文中所闡述之劑量範圍僅為例示性的，且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。舉例而言，可基於藥物動力學或藥效學參數來調整劑量，所述參數可包括臨床效果，諸如毒性作用及/或實驗值。因此，本發明涵蓋如熟習此項技術者所確定之患者內劑量遞增。確定用於投與化學治療劑之適當劑量及方案在相關技術中熟知，且一旦提供本文中所揭示之教示，則熟習此項技術者應理解該確定涵蓋於該等教示中。

所投與之CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑的量將視所治療之個體、病症或病狀的嚴重程度、投藥速率、化合物之處置及開處方醫師的判斷而定。然而，有效劑量通常以單次或分次劑量在每公斤體重約0.001至約100 mg，較佳約0.01至約35毫克/公斤/天之範圍內。對於70 kg人類，此將合計約0.07至約7000毫克/天，較佳約0.7至約2500毫克/天。在一些情況下，低於前述範圍之下限的劑量水準可更適合，而在其他情況下，可在不產生任何有害副作用之情況下使用再更大劑量，其中此類較大劑量通常分為用於在一整天中投與之若干較小劑量。在一個較佳實施例中，有效劑量以單次或分次劑量在每天約0.001至約100毫克/公斤體重，較佳地約1至約35毫克/公斤/天之範圍內。對於70 kg人類，此將合計約0.05至約7公克/天，較佳地約0.1至約2.5公克/天。在一些情況下，低於前述範圍之下限的劑量水準可能已完全足夠，而在其他情況下，在不產生任何有害副作用之情況下可採用再更大劑量，其限制條件為首先將此類較大劑量分為用於在一整天中投與之若干較小劑量。在一些情況下，前述劑量實例可描述CDK2抑制劑與CDK4/6抑制劑之組合的劑量範圍。在替代實施例中，前述劑量實例可描述CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑單獨之劑量範圍。

在一個較佳實施例中，CDK4/6抑制劑之治療有效量或劑量可為足以防止由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制劑對CDK2之抑制的反彈磷酸化之劑量。

如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」係指不對有機體產生顯著刺激且不消除所投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑之生物活性及特性的載劑或稀釋劑。

醫藥學上可接受之載劑可包含任何習知醫藥載劑或賦形劑。載劑及/或賦形劑之選擇在很大程度上將視諸如投藥模式、載劑或賦形劑對溶解度及穩定性之影響以及劑型之性質的因素而定。

合適之醫藥載劑包括惰性稀釋劑或填充劑、水及各種有機溶劑(諸如水合物及溶劑合物)。視需要，醫藥組合物可含有額外成分，諸如調味劑、黏合劑、賦形劑及其類似者。因此，對於經口投與，含有各種賦形劑(諸如檸檬酸)之錠劑可與各種崩解劑(諸如澱粉、褐藻酸及某些複合矽酸鹽)以及黏合劑(諸如蔗糖、明膠及阿拉伯膠)一起採用。賦形劑之實例非限制性地包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖及各種類型之澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油及聚乙二醇。另外，潤滑劑(諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉及滑石)通常適用於製錠目的。類似類型之固體組合物亦可以軟填充及硬填充明膠膠囊形式予以採用。因此，材料之非限制性實例包括乳糖或奶糖及高分子量聚乙二醇。當需要經口投與水性懸浮液或酏劑時，可將其中之活性化合物與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料及(視需要)乳化劑或懸浮劑以及稀釋劑(諸如水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合)組合。

醫藥組合物可例如呈適用於經口投與之形式(如錠劑、膠囊、丸劑、散劑、持續釋放調配物、溶液、懸浮液)，適用於非經腸注射之形式(如無菌溶液、懸浮液或乳液)；適用於局部投與之形式(如軟膏或乳膏)，或適用於直腸投與之形式(如栓劑)。醫藥組合物可呈適用於單次投與精確劑量之單位劑型。

例示性非經腸投與形式包括活性化合物於無菌水溶液(例如丙二醇或右旋糖水溶液)中之溶液或懸浮液。視需要，此類劑型可進行適當緩衝。

適用於遞送本發明之化合物(亦即如本文中所描述之CDK2及CKD4/6抑制劑)的醫藥組合物及其製備方法將對熟習此項技術者顯而易見。此類組合物及其製備方法可見於例如『Remington's Pharmaceutical Sciences』, 第19版(Mack Publishing Company, 1995)中，該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

CDK2及CKD4/6抑制劑可經口投與。經口投與可涉及吞咽，以使得化合物進入胃腸道，或可採用經頰或舌下投與，藉此使化合物直接自口腔進入血流中。適用於經口投與之調配物包括固體調配物，諸如錠劑、含有顆粒、液體或粉末之膠囊、口含錠(包括液體填充口含錠)、咀嚼片、多顆粒及奈米顆粒、凝膠、固溶體、脂質體、膜(包括黏性黏著膜)、卵形栓劑、噴霧劑及液體調配物。

液體調配物包括懸浮液、溶液、糖漿及酏劑。此類調配物可作為填充劑用於軟膠囊或硬膠囊中，且通常包括例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素或合適的油之載劑，及一或多種乳化劑及/或懸浮劑。液體調配物亦可藉由將例如來自藥囊之固體復原來製備。

CDK2及CKD4/6抑制劑亦可以諸如描述於由Liang及Chen (2001)之Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11(6), 981-986中之彼等的快速溶解劑型、快速崩解劑型來使用，該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

對於錠劑劑型，視劑量而定，藥物可佔劑型之1重量%至80重量%，更通常佔劑型之5重量%至60重量%。除藥物以外，錠劑一般含有崩解劑。崩解劑之實例包括羥基乙酸澱粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯羧甲纖維素鈉、交聯普維酮(crospovidone)、聚乙烯吡咯啶酮、甲基纖維素、微晶纖維素、經低碳烷基取代之羥丙基纖維素、澱粉、預膠凝化澱粉及褐藻酸鈉。一般而言，崩解劑將包含劑型之1重量%至25重量%，較佳地5重量%至20重量%。

黏合劑一般用以向錠劑調配物賦予黏結品質。合適的黏合劑包括微晶纖維素、明膠、糖、聚乙二醇、天然及合成膠、聚乙烯吡咯啶酮、預膠凝化澱粉、羥丙基纖維素及羥丙基甲基纖維素。錠劑亦可含有稀釋劑，諸如乳糖(單水合物、噴霧乾燥之單水合物、無水物及其類似者)、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纖維素、澱粉及二水合磷酸氫鈣。

錠劑亦可視情況包括界面活性劑，諸如月桂基硫酸鈉及聚山梨醇酯80；及滑動劑，諸如二氧化矽及滑石。當存在時，界面活性劑通常呈錠劑之0.2重量%至5重量%的量，且滑動劑通常為錠劑之0.2重量%至1重量%的量。錠劑一般亦含有潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂醯反丁烯二酸鈉及硬脂酸鎂與月桂基硫酸鈉之混合物。潤滑劑一般以錠劑之0.25重量%至10重量%，較佳地0.5重量%至3重量%的量存在。其他習知成分包括抗氧化劑、著色劑、調味劑、防腐劑及遮味劑。例示性錠劑含有多至約80重量%藥物、約10重量%至約90重量%黏合劑、約0重量%至約85重量%稀釋劑、約2重量%至約10重量%崩解劑及約0.25重量%至約10重量%潤滑劑。

錠劑摻混物可直接或藉由滾筒壓縮以形成錠劑。錠劑摻混物或摻混物之部分可在製錠之前交替地進行濕式、乾式或熔融粒化、熔融聚結或擠塑。最終調配物可包括一或多個層，且可經包覆或未經包覆；或經囊封。錠劑之調配詳細論述於由H. Lieberman及L. Lachman之「Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 第1卷」, Marcel Dekker, N.Y., N.Y., 1980 (ISBN 0-8247-6918-X)中，該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。用於經口投與之固體調配物可調配為立即釋放及/或調節釋放。調節釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放及程控釋放。合適的調節釋放調配物描述於美國專利第6,106,864號中。其他合適的釋放技術(諸如高能分散劑及滲透且經塗覆之顆粒)之細節可見於Verma等人, Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14 (2001)中。用以達成受控釋放之口嚼錠的用途描述於WO 00/35298中。此等參考文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

本發明之CDK2及CDK4/6抑制劑亦可直接投與至血流中、肌肉中或內部器官中。適用於非經腸投與之手段包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌內及皮下。適用於非經腸投與之裝置包括針(包括微針)注射器、無針注射器及輸注技術。

非經腸調配物通常為水溶液，其可含有賦形劑，諸如鹽、碳水化合物及緩衝劑(較佳地達3至9之pH)，但對於一些應用，該等水溶液更適合調配為無菌非水性溶液，或調配為待與合適的媒劑(諸如無菌無熱原質水)結合使用之乾燥形式。

在無菌條件下例如藉由凍乾來製備非經腸調配物可易於使用熟習此項技術者所熟知之標準醫藥技術來實現。用於製備非經腸溶液之本發明化合物的溶解度可使用諸如併入溶解度增強劑之適當調配技術來增加。用於非經腸投與之調配物可調配為立即釋放及/或調節釋放。調節釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放及程控釋放。因此，本發明之化合物可調配為固體、半固體或搖溶性液體以按植入式儲槽形式投與，從而提供活性化合物之調節釋放。此類調配物之實例包括經藥物塗覆之血管內支架及PLGA微球粒。

本發明之CDK抑制劑亦可局部投與至皮膚或黏膜，亦即經真皮或經皮。用於此目的之典型調配物包括凝膠、水凝膠、乳劑、溶液、乳膏、軟膏、敷粉、敷料、泡沫劑、膜、皮膚貼劑、糯米紙囊劑、植入物、海綿、纖維、繃帶及微乳劑。亦可使用脂質體。典型載劑包括醇、水、礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、甘油、聚乙二醇及丙二醇。可併入滲透增強劑；參見例如由Finnin及Morgan之J Pharm Sci, 88 (10), 955-958 (1999年10月)。局部投與之其他手段包括藉由電穿孔法、離子導入療法、超音波藥物透入療法、超音波電滲法及微針或無針(例如Powderject™、Bioject™等)注射來遞送。此等參考文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。用於局部投與之調配物可調配為立即釋放及/或調節釋放。調節釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放及程控釋放。

本發明之CDK抑制劑亦可通常以乾燥散劑形式(單獨或以混合物形式，例如以與乳糖乾燥摻合之形式，或以混合組分微粒形式，例如與磷脂(諸如磷脂醯膽鹼)混合)自乾燥散劑吸入器經鼻內或藉由吸入投與，或以氣溶膠噴霧劑形式自使用或不使用此項技術內已知的合適推進劑之加壓容器、泵、噴霧器、霧化器(較佳地使用電流體動力學來產生細霧之霧化器)或噴灑器投與。對於鼻內用途，散劑可包括生物黏著劑，例如聚葡萄胺糖或環糊精。

加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或噴灑器含有本發明之化合物的溶液或懸浮液，該溶液或懸浮液包含例如乙醇、乙醇水溶液或適用於分散、溶解活性物質或延長活性物質之釋放的替代劑、作為溶劑之推進劑及視情況選用之界面活性劑，諸如脫水山梨糖醇、三油酸酯、油酸或寡聚乳酸。在乾燥散劑或懸浮液調配物中使用之前，藥品經微粉化至適合於藉由吸入遞送之大小(通常小於5微米)。此可藉由任何適當粉碎方法來達成，該粉碎方法諸如螺旋形噴射研磨、流化床噴射研磨、用以形成奈米顆粒之超臨界流體處理、高壓均質化或噴霧乾燥。

用於吸入器或吹入器中之膠囊(由例如明膠或HPMC製成)、泡殼及藥筒可經調配以含有CDK抑制劑之散劑混合物、合適的散劑基體(諸如乳糖或澱粉)及效能調節劑，諸如I-白胺酸、甘露糖醇或硬脂酸鎂。乳糖可為無水的，或呈單水合物形式，較佳地為後者。其他合適之賦形劑包括聚葡萄糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖及海藻糖。

適用於使用電流體動力學來產生細霧之霧化器中的溶液調配物可含有每次致動1 μg至20 mg的本發明之CDK抑制劑，且致動體積可自1 μL至100 μL變化。典型調配物包括一或多種本發明之CDK抑制劑、丙二醇、無菌水、乙醇及氯化鈉。可代替丙二醇使用之替代溶劑包括甘油及聚乙二醇。可將合適的調味劑(諸如薄荷醇及左薄荷腦)或甜味劑(諸如糖精或糖精鈉)添加至意欲用於吸入/鼻內投與的彼等本發明之調配物中。

用於吸入/鼻內投與之調配物可使用例如聚(DL-乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)調配為立即釋放及/或調節釋放。調節釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放及程控釋放。

在乾燥散劑吸入劑及噴霧劑之情況下，藉助於遞送計量之閥門來確定劑量單位。根據本發明之單位通常經配置以投與較佳地含有所要量的本發明之CDK2及CDK4/6抑制劑的計量之劑量或「噗(puff)」。總每日劑量可以單次劑量或更常在一整天中以分次劑量投與。

本發明之CDK2及CDK4/6抑制劑可例如以栓劑、子宮托或灌腸劑之形式經直腸或經陰道投與。可可脂為傳統栓劑基質，但適當時可使用各種替代物。用於經直腸/經陰道投與之調配物可調配為立即釋放及/或調節釋放。調節釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放及程控釋放。

本發明之CDK2及CDK4/6抑制劑亦可通常以等張、pH調節之無菌生理鹽水中的微粉化懸浮液或溶液之滴劑形式直接投與至眼或耳。適用於經眼及經耳投與之其他調配物包括軟膏、可生物降解(例如可吸收凝膠海綿體、膠原蛋白)及非可生物降解(例如矽酮)植入物、糯米紙囊劑、晶體及粒狀或囊狀系統，諸如非離子界面活性劑囊泡(niosome)或脂質體。諸如交聯聚丙烯酸、聚乙烯醇、玻尿酸、纖維素聚合物(例如羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素或甲基纖維素)之聚合物或雜多糖聚合物(例如結冷膠)可與防腐劑(諸如苯紮氯銨)一起併入。此類調配物亦可藉由離子導入療法來遞送。用於經眼/耳投與之調配物可調配為立即釋放及/或調節釋放。調節釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放或程控釋放。

本發明之CDK2及CDK4/6抑制劑及其合適之衍生物或含聚乙二醇聚合物，以便改良其溶解度、溶解速率、遮味性、生物可用性及/或穩定性以用於任一投藥模式。舉例而言，發現藥物-環糊精複合物一般適用於大多數劑型及投藥途徑。可使用包合複合物及非包合複合物兩者。作為與藥物直接複合之替代物，環糊精可用作輔助添加劑，亦即用作載劑、稀釋劑或增溶劑。α-環糊精、β-環糊精及γ-環糊精最常用於此等目的，其實例可見於PCT公開案第WO 91/11172、WO 94/02518及WO 98/55148號中，該等公開案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

因例如出於治療特定疾病或病狀(諸如癌症)之目的，可能需要投與CDK2抑制劑與CDK4/6抑制劑之組合，故在本發明之範疇內，含有CDK2抑制劑之第一醫藥組合物與含有CDK4/6抑制劑之第二醫藥組合物可適宜地以適用於共投與組合物之套組形式進行組合。因此，本發明之套組包括兩種或更多種單獨的醫藥組合物，其中之一者含有CDK2抑制劑，且其中之另一者含有CDK4/6抑制劑；及用於分別保存該等組合物之構件，諸如容器、分隔瓶或分隔箔片封裝。此套組之一實例為常用於錠劑、膠囊及其類似者之封裝的泡殼封裝。本發明之套組尤其適用於投與不同劑型(例如經口及非經腸)，以用於以不同給藥時間間隔投與單獨的組合物，或用於針對彼此滴定單獨的組合物。為有助於遵從性，套組通常包括投藥指導，且可具備記憶輔助。

在一些態樣中，CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑為組合療法之部分。如本文中所使用，術語「組合療法」係指依序、並行或同時投與CDK2抑制劑及CDK4/6抑制劑，視情況以及一或多種額外醫藥劑或藥劑(例如抗癌劑)。本發明之化合物在某些腫瘤中之治療有效性可藉由與其他經批准或實驗癌症療法(例如輻射、手術、化學治療劑、靶向療法、抑制在腫瘤中失調之其他信號傳導路徑的藥劑及其他免疫增強劑，諸如PD-1拮抗劑及其類似者)組合來增強。

在本文中所提供之方法中之每一者的一些實施例中，方法包含投與第一CDK抑制劑及第二CDK抑制劑，其中第一CDK抑制劑為CDK2抑制劑(其可為選擇性或非選擇性CDK2抑制劑)，且第二CDK抑制劑為CDK4/6抑制劑，該CDK4/6抑制劑在較佳實施例中為選擇性CDK4/6抑制劑。選擇性CDK抑制劑通常抑制標準生物化學檢定中所關注之特異性CDK，其中IC₅₀ 呈現比其他CDK高至少五倍的選擇性，且較佳地比此類其他CDK高十倍或更大的選擇性。舉例而言，選擇性CDK4/6抑制劑通常將以比其他CDK高至少五倍，且較佳地十倍之選擇性抑制CDK4及CDK6。

當使用包含額外抗癌劑之組合療法時，一或多種額外抗癌劑可與CDK2抑制劑及/或CDK4/6抑制劑依序、並行或同時投與。在一個實施例中，在投與本發明之CDK2及/或CDK4/6抑制劑之前向哺乳動物(例如人類)投與額外抗癌劑。在另一實施例中，在投與本發明之CDK2及/或CDK4/6抑制劑之後向哺乳動物投與額外抗癌劑。在另一實施例中，與投與本發明之CDK2及/或CDK4/6抑制劑同時地向哺乳動物(例如人類)投與額外抗癌劑。

本發明亦係關於一種用於治療包括人類之哺乳動物中之異常細胞生長的醫藥組合物，該醫藥組合物包含如上文所定義之一定量之CDK2抑制劑及一定量之CDK4/6抑制劑(包括該化合物或其醫藥學上可接受之鹽之水合物、溶劑合物及多晶型物)以及一或多種(較佳地一種至三種)額外抗癌劑。

在特定實施例中，一或多種額外抗癌劑為靶向劑，諸如以下之抑制劑：Pl3激酶、mTOR、PARP、IDO、TOO、ALK、ROS、MEK、VEGF、FL T3、AXL、ROR2、EGFR、FGFR、Src/Abl、RTK/ Ras、Myc、Raf、PDGF、AKT、c-Kit、erbB、CDK2、CDK2/4/6、CDK4/6、CDK5、CDK7、CDK9、SMO、CXCR4、HER2、GLS1、EZH2或Hsp90；或免疫調節劑，諸如PD-1或PD-L 1拮抗劑、OX40促效劑或4-1 BB促效劑。

在其他實施例中，一或多種額外抗癌劑為護理標準劑，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、順鉑(cisplatin)、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、長春瑞賓(vinorelbine)、依西美坦(exemestane)、來曲唑、氟維司群、阿那曲唑或曲妥珠單抗。

在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含CDK2抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；及一種醫藥組合物，其包含CDK4/6抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含兩種或更多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。在其他實施例中，醫藥組合物進一步包含至少一種額外抗癌劑。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物進一步包含至少一種額外抗癌劑或姑息劑。在一些此類實施例中，至少一種額外藥劑為如下文所描述之抗癌劑。在一些此類實施例中，組合提供累加、大於累加或協同抗癌作用。

在一個實施例中，本發明提供一種用於治療有需要之個體中之異常細胞生長的方法，其包含向個體投與治療有效量的本發明之醫藥組合物或其醫藥學上可接受之鹽。

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療有需要之個體中之異常細胞生長的方法，其包含向個體投與一定量的本發明之醫藥組合物或其醫藥學上可接受之鹽以及一定量的額外治療劑(例如抗癌治療劑)，該等量一起有效治療該異常細胞生長。

在本文中所提供之方法的常見實施例中，異常細胞生長為癌症。本發明之醫藥組合物可以例如CDK2抑制劑之醫藥組合物、CDK4/6抑制劑的醫藥組合物或CDK2/4/6抑制劑之醫藥組合物的單一藥劑形式投與，或以單一醫藥組合物形式投與，或可與其他抗癌劑，特定言之適合於特定癌症之護理標準劑組合投與。在一些實施例中，所提供之方法產生以下效果中之一或多者：(1)抑制癌細胞增殖；(2)抑制癌細胞侵襲；(3)誘導癌細胞之細胞凋亡；(4)抑制癌細胞轉移；或(5)抑制血管生成。

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體中由CDK2、CDK4及/或CDK6所介導之病症(諸如某些癌症)的方法，該方法包含以對治療該病症有效的量向個體投與CDK2抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽及本發明之CDK4/6抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽。

除非另外指示，否則本文中對CDK抑制劑之所有參考包括對其鹽、溶劑合物、水合物、類似物及複合物的參考，以及對其鹽之溶劑合物、水合物及複合物的參考，包括其多晶型物、立體異構體及經同位素標記之型式。

本發明之CDK抑制劑中的一或多者可以醫藥學上可接受之鹽形式存在，該等醫藥學上可接受之鹽諸如本文中所鑑別之CDK抑制劑中的一者之化合物的酸加成鹽及鹼加成鹽。如本文中所使用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保持親本化合物之生物有效性及特性的彼等鹽。除非另外指示，否則如本文中所使用，片語「醫藥學上可接受之鹽」包括可存在於本文中所鑑別之CDK抑制劑中的酸性或鹼性基團之鹽。

本發明亦係關於本文中所提供之式的化合物之前驅藥。因此，本身可具有少量藥理學活性或無藥理學活性之本發明之化合物的某些衍生物在向患者投與時可例如藉由水解裂解而轉化為本發明化合物。此類衍生物稱為『前驅藥』。關於前驅藥之用途的其他資訊可見於『Pro-drugs as Novel Delivery Systems』, 第14卷, ACS Symposium Series (T Higuchi及W Stella)及『Bioreversible Carriers in Drug Design』, Pergamon Press, 1987 (E B Roche編, American Pharmaceutical Association)中，該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

根據本發明之前驅藥可例如藉由用熟習此項技術者所已知的某些部分作為『前驅部分』置換本發明化合物中所存在之適當官能基而產生，如例如由H Bundgaard之「Design of Prodrugs」(Elsevier, 1985)中所描述，該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

本說明書中所引用之所有公開案及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。一般熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離所附申請專利範圍之精神或範疇的情況下對其作出某些改變及修改。

實例實例 1 ： 經由 CDK4/6 介導之反彈磷酸化快速適應 CDK2 抑制的概述。

本發明證實，CDK2抑制導致在數小時內相繼恢復之受質磷酸化的快速及劇烈損失。在處於細胞週期之所有時期的多種細胞株中觀測到此補償性磷酸化現象。本發明進一步證實，細胞株經由在G1早期具有超出其典型作用之活性的CDK4及CDK6之活化而快速適應CDK2活性損失。本發明進一步證實，使用CDK2/4/6抑制劑PF3600及以細胞類型依賴性方式對CDK2受質之固定細胞及活細胞成像，CDK4/6週期素D複合物引起重新接線事件，該等重新接線事件可在CDK2之抑制(例如回應於諸如PF3600之小分子CDK2抑制劑)時驅動細胞週期。此CDK4/6依賴性活性在CDK2抑制之後展現全強度達10小時，且可部分地藉由CDK4/6/週期素D之上調來驅動。此等研究結果之驚人特徵為細胞激活回應於CDK2活性減小之旁路機制的速度。

值得注意地，由於靶向癌症療法之出現，因而大量研究精力已致力於理解驅動對該等靶向癌症療法之耐藥性的分子機制。雖然一些癌症耐藥性係藉由對藥物之預先存在(內部)的遺傳耐藥性驅動，但新出現的證據已證實，包括表觀遺傳改變及旁通路徑之活化的非遺傳補償性機制允許細胞抵抗靶向療法(Hata等人, 2016；Ramirez等人, 2016；Shaffer等人, 2017；Sharma等人, 2010)。此等自適應反應使得細胞能夠通過藥物耐受狀態，該藥物耐受狀態充當細胞可自其中獲得真正的遺傳耐藥性突變之儲庫。儘管旁路機制之存在已在多種癌症類型中得到證實，但所報導的對藥物之適應性時間標度介於數週至數月範圍內(Hata等人, 2016；Ramirez等人, 2016；Sharma等人, 2010)。歸因於本文中所證實之分子事件的精細時間解析度，在小時之時間標度上觀測到對CDK2抑制之適應性。100%之細胞最初對PF3600起反應的事實與對藥物之內部耐藥性相悖，且適應性之快速時間標度與作為對CDK2抑制劑之所觀測耐受度的驅動因子之所獲得基因突變相悖。實際上，如所證實，本文中所提供之資料共同支持快速上調以及作為例如在用CDK2抑制劑藥物治療之後適應CDK2抑制之機制的可能存在之CDK/週期素重新複合。

CDK2/週期素複合物使涉及關鍵細胞過程之眾多受質磷酸化。由此，認為CDK2為細胞週期之關鍵調節因子。然而，此思想在十年半以前受到小鼠及細胞株基因敲除研究之挑戰，該等研究顯示CDK2對於發育及增殖為非必需的(Berthet等人, 2003；Ortega等人, 2003；Santamaria等人, 2007；Tetsu及McCormick, 2003)。此等研究提出兩種可能解譯：CDK2受質磷酸化在所測試情境下對細胞週期進程並不關鍵，或過剩激酶活性可在不存在CDK2之情況下使CDK2受質磷酸化(Berthet等人, 2003；Grim及Clurman, 2003)。本文中所呈現之資料支持以下想法：CDK2受質之至少一子集為細胞週期進程所必需，且在不存在CDK2的情況下，CDK4/6可在某些細胞情境下實現此等關鍵功能。實際上，本文中所提供之資料進一步指示調節補償性磷酸化之CDK4/6/週期素D錯合物可為細胞類型特異性的。鑒於已知不同D型週期素CDK4及CDK6具有組織特異性表現及功能，此並不出人意料。然而，涉及對PF3600之適應性的激酶/週期素不必與給定細胞類型中之正常細胞週期進程所需的激酶/週期素相同。

在細胞週期之廣泛接受模型中，CDK4/6/週期素D複合物在G1早期中起作用，其後週期素D經分解且致使CDK4/6失活(Matsushime等人, 1992)。然而，少數研究已報導CDK4/6活性在細胞週期晚期中之作用(Brookes等人, 2015；Gabrielli等人, 1999)。另外，若干研究已報導，週期素D1蛋白在MCF10A、RPE-hTERT及MRC5人類纖維母細胞中之細胞週期的G2期中升高，但任何激酶活性是否相關為未知的(Gookin等人, 2017；Yang等人, 2006；Zerjatke等人, 2017)。此處證實，雖然CDK4/6活性似乎在G1期之後為非必需的，但CDK4/6在CDK2抑制時介導所有細胞週期階段中之受質磷酸化。CDK4/6再活化之明顯延遲可見於以下事實中：在一個實施例中，PF3600與哌柏西利之共同治療不導致DHB信號即時下降至基線。實際上，DHB信號首先升高大約5小時(與單獨用PF3600處理之細胞的DHB信號並行)，隨後開始需要另一5小時降至基線的降低。CDK4/6再活化之明顯延遲可歸因於其上調涉及補償性激酶活性之蛋白所花費的時間。

CDK4/6介導的CDK2受質之補償性磷酸化可經由直接或間接處理來進行。舉例而言，利用經純化CDK/週期素複合物及經純化DHB感測器之試管內激酶檢定顯示，DHB藉由CDK2/週期素E1、CDK2/週期素A2、CDK1/週期素A2及CDK1/週期素E1磷酸化，但不藉由CDK1/週期素B1、CDK4/週期素D1或CDK6/週期素D1磷酸化(Schwarz等人, 2018；Spencer等人, 2013)。然而，此等檢定使用在正常的CDK2功能正常條件下表現之經標記及經純化CDK/週期素複合物。因此，CDK/週期素複合物將不含有轉譯後修飾或新蛋白間相互作用，該等蛋白間相互作用可藉由CDK2抑制誘導，且可為活化CDK4/6/週期素D所必需。CDK4/6能夠經由活化其他激酶或抑制磷酸酶之間接作用進行CDK2受質重新磷酸化或CDK2自身變為再活化當然亦為可能的。

CDK1在細胞週期期間執行非過剩功能，且藉此被視為必需的。與此一致，CDK1基因敲除胚胎未能發育(Santamaria等人, 2007)，且細胞培養物中之CDK1的小分子抑制導致G2遏制及有絲分裂阻滯。CDK1足以使小鼠在不存在CDK2及CDK4之情況下存活至妊娠中期，其後胚胎由於嚴重造血缺陷而死亡(Santamaria等人, 2007)。因此，暗示CDK1可在大多數組織類型中不存在CDK2及CDK4之情況下實施所有補償性激酶活性。相比之下，吾等在此處展示，雖然在CDK2功能背景中之急劇CDK2抑制後，CDK1仍為進入有絲分裂所必需(圖3，右側 )，但CDK1在此處測試之細胞情境下在CDK2受質之磷酸化中僅發揮極小補償性作用。

與此處所展示之酶抑制對比，CDK1驅動補償性磷酸化之直接證據僅展現於其中所有其他分裂間期CDK完全去除(CDK2/3/4/6四重基因敲除)的小鼠中。有趣地是，在CDK4/CDK2雙重基因敲除小鼠中，觀測到CDK6與週期素D2之間的相互作用增加，且推測CDK6/週期素D可在不存在CDK4及CDK2之情況下驅動補償性磷酸化(Barriere等人, 2007)。此外，與其野生型對應物相比，缺乏CDK2或CDK2及CDK4之MEF增殖得更低效(Barriere等人, 2007；Berthet等人, 2003；Ortega等人, 2003)。與此一致，在本發明中，當在MCF10A、MCF7及RPE-hTERT細胞中使用PF3600急劇抑制CDK2活性時，觀測到較長分裂間期時間(圖8C)。

本文中所提供之資料表明，選擇性CDK2抑制在由於週期素E表現增加已變為對臨床CDK4/6抑制劑具有耐藥性之癌症中、在腫瘤細胞增殖依賴於CDK2之癌症中或在不能藉由補償性激酶上調予以補償之癌症中作為靶向療法可為有前景的策略。與此想法一致，歸因於週期素E擴增，OVCAR3細胞對哌柏西利具有耐藥性，但尤其對CDK2抑制敏感，且不展現對受質之補償性磷酸化或回應於PF3600而經歷任何其他有絲分裂。此外，經基因工程改造之哌柏西利耐藥性小鼠肺腫瘤展現對CDK2損失之組合活性及與經由PF3600抑制CDK2/4/6類似的CDK4/6抑制。經由CDK4/6適應CDK2抑制之彼等腫瘤可為用於CDK2及CDK4/6抑制劑之組合治療的候選者。

實例 2 ： CDK2 活性之抑制引起受質磷酸化之快速損失。

首先使用DHB類CDK2活性感測器來檢查PF3600處理對CDK2抑制之即時影響(Spencer等人, 2013) (圖1A)。當核未經磷酸化時，將DHB感測器定位至核。在磷酸化時，核定位信號經遮蔽，核輸出信號未經遮蔽，且感測器回應於CDK2活性增加而穩定地易位至細胞質(圖1A)。因此，可藉由DHB感測器之細胞質與核螢光強度的比率(C/N比率)來定量激酶活性。在本發明中，細胞IC₅₀ 值(圖8A)用以選擇25nM及100nM作為PF3600之相關劑量，且DHB感測器之時移成像在兩個未轉化上皮細胞株(MCF10A及RPE-hTERT)、乳癌細胞株(MCF7)及卵巢癌株(OVCAR3)中執行。首先在不存在藥物之情況下對異步循環細胞成像大約20小時，以確立各細胞之細胞週期階段；隨後暫停影片以添加藥物，且隨後再繼續成像1至2天。因細胞異步循環，故對使用一次藥物處理之所有細胞週期階段進行取樣。此允許本發明人以計算方式分離在自分裂後期完成之任何時間處接受藥物之細胞的跡線。

在較高濃度下，除CDK2以外，PF3600亦抑制CDK4/6。為確保PF3600之作用主要係歸因於CDK2之抑制而不干擾CDK4/6抑制，使分析限於其中CDK4/6被認為失活的細胞週期階段。與CDK4/6主要作用於細胞週期之G1期中的觀點(Chung等人, 2019; Sherr及Roberts, 2004)一致，在分裂後期之後5小時或更晚時添加哌柏西利對DHB感測器磷酸化、細胞週期進程或有絲分裂之時序不具有影響(圖3，左側 )。因此，本發明人推論，在分裂後期之後5小時開始的回應於PF3600之DHB磷酸化的任何變化將歸因於CDK2活性的抑制。類似地，1小時哌柏西利處理導致具有2N DNA含量之細胞中的Rb去磷酸化，但對具有3-4N DNA含量之細胞的Rb磷酸化不具有影響(圖8B)，再次與Chung等人, 2019一致。因此，對於評估用PF3600處理之後的CDK2受質磷酸化之所有實驗，使分析限於具有3-4N DNA含量之細胞或在分裂後期之後≥5小時處理的彼等細胞。

如所預期，在細胞週期中期添加PF3600導致全部四種所測試細胞株中之DHB感測器的C/N比率之急劇且快速的下降(圖1B、圖1D、圖1F及圖1G)。亦檢查PF3600對另一CDK2受質CDC6 (亦回應於CDK2磷酸化而自核易位至細胞質之預複製複合物的組分)之磷酸化的即時影響(Petersen等人, 1999；Saha等人, 1998)。添加PF3600導致CDC6磷酸化下降，從而導致其易位回至核(圖1C)。綜合而言，DHB與CDC6兩者之C/N比率的下降表明在用PF3600處理時對CDK2活性之快速(在1小時內)抑制。

在評估DHB感測器之特異性中，在有絲分裂之後5小時或更晚時用高劑量的1μM哌柏西利處理對DHB感測器磷酸化、細胞週期進程或有絲分裂之時序不具有即時影響(圖3，左側 )。然而，在即將出現之有絲分裂完成時，此等經哌柏西利處理之細胞進入CDK2^low G0遏制，此指示哌柏西利在抑制CDK4/6及阻斷對後續細胞週期之承諾方面的有效性。使用9μM RO3306之CDK1抑制亦對DHB感測器磷酸化具有極小即時影響(圖3，右側 )。在細胞週期將結束時，此等經RO3306處理之細胞展現G2遏制及DHB磷酸化平穩，此指示RO3306在抑制CDK1及阻斷有絲分裂進入方面的有效性。此等觀測結果連同先前公佈之試管內激酶資料(Schwarz等人, 2018；Spencer等人, 2013)以及週期素E1^-/- E2^-/- A1^-/- A2^-/- MEF維持核DHB感測器(Chung等人, 2019)的事實證實DHB感測器主要藉由CDK2磷酸化，其中極少磷酸化係藉由CDK4、CDK6或CDK1在正常生長條件下進行。

實例 3 ： 在 CDK2 抑制之後的 CDK2 受質磷酸化之快速反彈

除DHB感測器磷酸化在經PF3600處理時即時下降以外，在1至2小時內開始的磷酸化之快速反彈亦標註於MCF10A、MCF7及RPE-hTERT細胞中(分別為圖1B、圖1F及圖1D)。截至5小時，DHB感測器磷酸化返回至治療前水準，且其後持續升高。與此一致，細胞週期進程繼續，且細胞最終完成有絲分裂(圖8C)。相較於MCF10A及RPE-hTERT細胞，MCF7乳癌細胞對PF3600更敏感(圖1F、圖8A及圖8C)。雖然25nM PF3600展現在MCF7中之下降反彈行為，但100nM PF3600導致短時反彈，隨後長期遏止DHB磷酸化且阻斷有絲分裂(圖1F及8C)。亦對經PF3600處理之MCF10A細胞中的CDC6磷酸化觀測到下降反彈(圖1C)。細胞中之約30小時PF3600半衰期以及藥物動力學及藥效學研究指示，在PF3600處理時所觀測之CDK2受質重新磷酸化並不歸因於化合物之不穩定性或抑制劑結合的損失。

其中觀測到感測器磷酸化反彈之三種細胞株(MCF10A、MCF7及RPE-hTERT)對於細胞週期進入均依賴於CDK4/6/週期素D，且如所預期，對哌柏西利具敏感性。相比之下，OVCAR3細胞具有週期素E擴增，且對哌柏西利具有耐藥性。本發明人假設，若OVCAR3細胞對於其存活及增殖更依賴於CDK2活性，則如用DHB感測器所觀察，此等細胞將對藉由PF3600之CDK2抑制呈現較大敏感性。與此想法一致，用較低25nM劑量之PF3600處理OVCAR3細胞會抑制細胞增殖，且防止所有進一步有絲分裂持續成像期之剩餘部分(圖1G及圖8C)。有趣地是，不同於MCF10A、MCF7或RPE-hTERT細胞，DHB感測器磷酸化在PF3600處理之後並未在OVCAR3細胞中反彈，而是下降，且隨後在中間水準處達至平穩(圖1G)。

為以正交(orthogonal)方式測試下降-反彈效應，將DHB感測器轉導至含有F80G突變在兩個CDK2對偶基因(CDK2^F80G/F80G ；(Merrick等人, 2011))之CDK2類似物敏感性RPE-hTERT細胞中。此突變產生經修飾之ATP結合袋，其經龐大的ATP-競爭性類似物3MB-PP1 (1-(三級丁基)-3-(3-甲基苯甲基)-1H -吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺) (CAS號956025-83-5)特異性抑制。與PF3600處理一致，CDK2活性由3MB-PP1抑制導致迅速反彈的DHB感測器磷酸化減少，而野生型RPE-hTERT細胞不受3MB-PP1影響(圖1E、圖9A及圖9B)。儘管用3MB-PP1之CDK2^F80G/F80G 細胞中的DHB磷酸化下降顯然不較用PF3600之野生型RPE-hTERT細胞戲劇性，但CDK2^F80G/F80G 實際上受抑制，如Nbs1磷酸化之損失所顯示(圖9C)。鑒於已知守門殘基之突變降低CDK2功能(Merrick等人, 2011)，3MB-PP1對DHB磷酸化之小影響可能係歸因於CDK2^F80G/F80G 細胞與野生型RPE-hTERT細胞相比更依賴於CDK1活性的事實。與野生型RPE-hTERT細胞相比，添加CDK1抑制劑RO3306導致RPE-hTERT CDK2^F80G/F80G 細胞中之DHB磷酸化下降得更多(圖9E)。因此，在RPE-hTERT CDK2^F80G/F80G 細胞中，CDK1在細胞週期中異常早地具有活性且促成CDK2受質之磷酸化，藉此消除(muting)可用3MB-PP1達成的DHB磷酸化之抑制。

隨後，使用免疫螢光及西方墨點法來研究CDK2抑制是否對內源性CDK2受質：Cdc6 (Petersen等人, 1999；Saha等人, 1998)、核仁素(Sarcevic等人, 1997)及Rb (Akiyama等人, 1992)之磷酸化動力學具有類似影響。PF3600對具有3-4N DNA含量之細胞的影響藉由免疫螢光定量，且PF3600處理導致Rb及核仁素磷酸化短暫減少，隨後反彈(圖4A及圖4B)。藉由西方墨點法對於Cdc6、Rb及核仁素獲得類似結果(圖4C)。

經由磷酸-蛋白質體學(phospho-proteomics)全面地評估CDK2受質動力學。用25nM PF3600處理MCF7細胞1小時或24小時，且藉由質譜分析來評估對CDK受質磷酸化之影響(圖9F)。僅考慮具有最小CDK共同磷酸化位點(SP或TP)之肽，鑑別磷酸化在PF3600處理1小時之後顯著減少(p＜0.05)的40種肽，且絕大多數至24小時反彈至對照水準(圖4D、圖9F及表1)。綜合而言，由活細胞成像、免疫螢光、西方墨點法及磷酸-蛋白質體學之觀測表明，當CDK2活性急劇抑制時，癌細胞(諸如MCF10A、MCF7及RPE-hTERT細胞)藉由目前使CDK2受質磷酸化以促進細胞週期最終完成的補償性激酶活化而快速適應。

實例 4 ： 補償性激酶活性研究 ： CDK1 之作用較小。

CDK1已展現出在CDK2/4/6小鼠基因敲除中藉由形成非典型CDK1週期素複合物而驅動完整的細胞週期(Aleem等人, 2005；Santamaria等人, 2007)。藉由在用RO3306 (CDK1抑制劑(Vassilev等人, 2006))共同處理之MCF10A、RPE-hTERT及MCF7細胞中時移成像來研究CDK1是否可在急劇CDK2抑制時驅動CDK2受質之磷酸化。與預期相反，CDK2 (100 nM或25nM PF3600)與CDK1 (9μM RO3306)之共同抑制仍導致DHB感測器之磷酸化反彈(圖5A)，但在此等共同處理條件下所達成之DHB磷酸化水準略微更低。類似地，與僅CDK2抑制(100 nM PF3600)相比，CDK2 (100 nM PF3600)與CDK1 (9μM RO3306)之共同抑制對Rb或核仁素磷酸化不具有額外影響(圖10A)。總之，此等資料表明，在CDK2之抑制時，DHB及其他CDK2受質僅微弱地藉由具有全功能CDK2之細胞中的CDK1磷酸化。由於CDK2及CDK1之共同抑制尚未消除受質磷酸化的反彈，因而本發明人假設存在可能夠在不存在CDK2活性之情況下進行CDK2受質磷酸化的替代激酶。

實例 5 ： 補償性激酶活性研究 ： 藉由 CDK4/6 抑制消除活性。

HCT116結腸癌細胞中之先前研究顯示，當經由遺傳途徑去除CDK2時，Rb仍在細胞中經磷酸化。推測CDK4活性升高為此磷酸化之原因(Tetsu及McCormick, 2003)，但此可藉由Rb亦為CDK4/6受質之事實予以解釋。類似地，儘管HCT116細胞一般對哌柏西利不敏感，但CDK2之遺傳性去除致使其易受CDK4/6抑制影響。此等觀測結果暗示，CDK4可致使此等細胞中之CDK2活性過剩，但尚未檢查CDK2特異性受質的磷酸化。由於DHB感測器通常不為CDK4/6受質(圖3及(Spencer等人, 2013))，因而本發明人使用DHB感測器來研究可能存在的經由CDK4/6/週期素D補償對PF3600之適應性。

藉由哌柏西利(1μM)以及MCF10A (100nM PF3600)、RPE-hTERT (100 nM PF3600)及MCF7 (25nM PF3600)細胞中之PF3600對CDK4/6與CDK2之共同抑制揭露短暫而非持久的磷酸化反彈，該磷酸化反彈隨後下降至基線水準持續成像期之剩餘部分(圖5B)。此等細胞未經歷任何其他有絲分裂，此表明對細胞週期完成較關鍵之受質磷酸化經阻斷(圖10B及圖10C)。此現象不限於DHB感測器，此係由於Rb、Cdc6及核仁素之磷酸化在CDK4/6與CDK2的共同抑制之後快速損失，且甚至在處理之後24小時亦未觀測到恢復(圖5C及圖5D)。

為測試正交系統中之此效應，在所指示時間處，在RPE-hTERT CDK2^F80G/F80G 細胞中用10 μM 3MB-PP1、1 μM哌柏西利或10 μM 3MB-PP1+1 μM哌柏西利共同抑制CDK2與CDK4/6。先前對3MB-PP1單獨所見之持續反彈磷酸化(圖9A)在用3MB-PP1及哌柏西利共同處理(圖2A)時經消除。單細胞跡線數目：DMSO (133)、10 μM 3MB-PP1 (104)、1 μM哌柏西利(146)、10 μM 3MB-PP1+1 μM哌柏西利(160)。根據圖1D再製DMSO及10 μM 3MB-PP1中值跡線。此等結果支持多種CDK2受質在急劇抑制CDK2活性之後以CDK4/6依賴性方式經磷酸化的觀點。在MCF10A細胞中用100 nM PF3600、5 μM利波西利、100 nM PF3600+5 μM利波西利共同抑制CDK2與CDK4/6 (圖2B)。單細胞跡線數目：DMSO (55)、100 nM PF3600 (53)、5 μM利波西利(23)、100 nM PF3600+5 μM利波西利(26) (圖2B)。在MCF10A細胞中用100 nM PF3600、1 μM阿貝西利或100 nM PF3600+1 μM阿貝西利共同抑制CDK2與CDK4/6 (圖2C)。單細胞跡線數目，右側 ：DMSO (197)、100 nM PF3600 (242)、1 μM阿貝西利(390)、100 nM PF3600+1 μM阿貝西利(270) (圖2C)。

實例 6 ： CDK4/6- 週期素 D 複合物在 CDK2 受質之反彈磷酸化中發揮關鍵作用。

由於CDK4及CDK6具有重疊且獨特的細胞功能，因而測定其在CDK2之抑制之後所見的對受質磷酸化反彈之個別作用為所關注的。循環MCF10A及MCF7細胞中之CDK4或CDK6的siRNA介導性基因敲落(圖11A)揭露MCF7細胞對於正常細胞週期進程主要依賴於CDK4，然而需要CDK4與CDK6之同時基因敲落以阻斷MCF10A增殖(圖11B)。

在經PF3600處理之MCF10A細胞中，CDK4基因敲落在阻斷DHB之反彈磷酸化方面相當有效(圖6A，左側 )，其中大部分單細胞跡線展示DHB感測器之核定位以及有絲分裂的抑制(圖6B，頂部 )。相比之下，在MCF7細胞中，需要CDK4與CDK6兩者之同時基因敲落以有效阻斷DHB的反彈磷酸化(圖6A右側 及圖6B底部 )。因此，CDK4/6基因敲落表型模擬由PF3600與哌柏西利共同處理得到之觀測結果(圖5B)。

由於CDK4及CDK6習知地與D型週期素配對，因而使用siRNA介導性基因敲落(圖11C)來研究哪些D型週期素有助於補償性激酶活性。在循環MCF10A細胞中，由於僅三重基因敲落對細胞週期進程具有較強影響，因而全部三種週期素D1、D2及D3有助於細胞週期進入(圖11D，頂部 )。由於MCF7細胞不表現週期素D2 (Evron等人, 2001)，因而本發明人聚焦於週期素D1及D3。在MCF7細胞中，週期素D1之基因敲落有效阻斷細胞週期進程，而週期素D3為非必需的(圖11D，底部 )。

在經PF3600處理之MCF10A細胞中，DHB磷酸化之反彈藉由對週期素D1、D2或D3單獨進行基因敲落而經部分阻斷，而D型週期素之三重基因敲落消除持續反彈(圖6C左側 及圖11E頂部 )。在經PF3600處理之MCF7細胞中，對週期素D3進行基因敲落具有極小影響，而靶向週期素D1在很大程度上阻斷DHB磷酸化之反彈，且週期素D1與D3的同時基因敲落甚至在防止此反彈方面更有效(圖6C右側 及圖11E底部 )。因此，對週期素D1、D2及D3 (MCF10A)或週期素D1 (MCF7)進行基因敲落表型模擬由圖5B中所展示之PF3600與哌柏西利共同處理得到的觀測結果。總而言之，MCF10A細胞對於正常細胞週期進入可使用CDK4、CDK6、週期素D1、週期素D2及週期素D3，但在急劇CDK2抑制時對於反彈磷酸化略微更依賴於CDK4/週期素D2及D3。相比之下，MCF7細胞對於正常細胞週期進程使用CDK4/週期素D1，但在急劇CDK2抑制時對於反彈磷酸化依賴於CDK4及CDK6兩者以及週期素D1。

實例 7 ： 在 CDK2 抑制時上調週期素 D1 及 D3 含量

研究在CDK2抑制後驅動反彈激酶活性之機制。在MCF10A細胞中，在24小時PF3600 (100 nM)處理內觀測到週期素D1及D3蛋白含量之增加，而CDK2、CDK4及CDK6蛋白含量保持穩定(圖6D)。相比之下，在MCF7細胞中，週期素D1、週期素D3、CDK2、CDK4及CDK6蛋白含量在24小時PF3600 (25 nM)處理內均在不同程度上增加。為測定上調是否出現於轉錄之層級上，執行mRNA FISH以量測CDK4、CDK6以及週期素D1、D2及D3之表現。與西方墨點結果一致，回應於PF3600處理，在MCF10A中觀測到週期素D1及D3之mRNA表現的增加，且特定言之，在MCF7細胞中觀測到週期素D1之較強增加(圖6E至圖6F)。此等研究結果至少部分地解釋蛋白含量增加。

為測定週期素D蛋白含量上調是否轉化為MCF10A細胞中之CDK週期素D3複合物增加，在經DMSO或PF3600處理24小時之MCF10A細胞中執行CDK4及CDK6的免疫沈澱，且探測週期素D3。實際上，在CDK2抑制之後，觀測到結合至CDK4及CDK6兩者之較高量的週期素D3 (圖11F)。總之，此等資料證明，CDK2之急劇抑制觸發細胞類型特異性CDK4/6/週期素D複合物的上調，該等複合物之子集可促進CDK2受質之反彈磷酸化。

實例 8 ： CDK4/6 及 CDK2 在 活體內彼此補償。

為測試CDK2與CDK4/6之間的活體內潛在補償性關係，使用由KRAS^G12V 及TRP53突變驅動之已確立小鼠肺腫瘤模型。以5個月之時延使鼻內感染編碼Cre重組酶之腺病毒顆粒的Kras^+/LSLG12V ,Trp53^L/L 小鼠發展肺腫瘤。一旦由CT掃描偵測到腫瘤發展，則用媒劑或哌柏西利(70 mg/kg QD)處理動物28天，且隨後在處理期結束時藉由CT掃描量測腫瘤體積。經媒劑處理與經哌柏西利處理之小鼠之間的腫瘤體積倍數變化之比較顯示在哌柏西利處理之後，腫瘤負荷無顯著減小(圖7A)。然而，在經哌柏西利處理之肺腫瘤中藉由西方墨點偵測到CDK2 T-環磷酸化及週期素E1之上調。連同CDK抑制劑p21之顯著下調(圖7B)，此等資料指示CDK2活性之上調可解釋對哌柏西利的不敏感性。

為測試CDK2是否在哌柏西利耐藥性腫瘤中發揮作用，產生Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L ; Cdk2^-/- 小鼠。此等小鼠發展出與Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L ; Cdk2^+/+ 對照動物具有類似大小之肺腫瘤(圖7C)。顯著地，Cdk2 缺失肺腺癌攜帶小鼠之哌柏西利處理導致腫瘤大小顯著減小(p=0.037) (圖7C)。因此，在此腫瘤環境中，CDK4/6抑制足以在不存在CDK2之情況下遏止腫瘤生長。

為進一步支持CDK2及CDK4/6兩者皆有助於腫瘤生長之想法，藉由用PF3600以50 mg/kg BID (比在迄今存在的涵蓋CDK2、CDK4及CDK6之細胞研究中所使用更高的劑量)處理來抑制Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L 肺腫瘤攜帶小鼠中之CDK2、CDK4及CDK6活性。與缺失Cdk2 腫瘤之哌柏西利敏感性一致，用PF3600抑制CDK2/4/6導致腫瘤體積顯著減小(圖7C)。綜合而言，活體內資料支持CDK2及CDK4/6激酶可執行重疊功能且彼此補償之假設。

實例 9 ： 材料及方法。 實驗模型細節：

除西奈山伊坎醫學院(Icahn School of Medicine)之Robert Fisher實驗室提供之RPE-hTERT野生型及CDK2類似物敏感性細胞之外，在此研究中所使用之細胞株係獲自ATCC。在補充有5%馬血清(Invitrogen)、20 ng/mL表皮生長因子(Sigma-Aldrich)、0.5 mg/mL氫化可的松(hydrocortisone) (Sigma-Aldrich)、100 ng/mL霍亂毒素(Sigma-Aldrich)及10 μg/mL胰島素(Invitrogen)之DMEM/F12中培養MCF10A (人類乳腺上皮)細胞。使RPE-hTERT細胞生長於具有10% FBS之DMEM中。MCF7及OVCAR3細胞使用補充有10% FBS之RPMI-1640進行生長。除在siRNA轉染期間之外，所有全生長培養基均補充有青黴素/鏈黴素。在37℃及5% CO₂ 下培養所有細胞。 使用慢病毒載體之穩定細胞株產生：

穩定表現CDK2感測器(DHB-mVenus或DHB-mCherry)及標記有mTurquoise之H2B的細胞係藉由慢病毒轉導產生。對於病毒產生，使用Fugene-HD試劑(Promega E2311)使HEK293T細胞經CSII-EF質體(CSII-EF DHB-mVenus、CSII-EF DHB-mCherry、CSII-EF CDC6-YFP或CSII-EF H2B-mTurquoise)以及輔助封裝及包膜質體(pMDLg、pRSV-Rev、pCMV-VSV-G)轉染。在轉染之後48小時採集慢病毒，經由0.45 µm過濾器(Millipore)過濾，且在5 µg/ml凝聚胺(EMD Millipore #TR-1003)之存在下與目標細胞一起培育6至10小時。將具有穩定整合之細胞分選於Aria Fusion流式細胞儀上以建立表現所要感測器之所有細胞的群體。 siRNA轉染

用Dharmafect1試劑(Dharmacon)使用製造商之方案進行siRNA轉染。對於各目標，使用靶向基因之三個不同區的siRNA池。將細胞與轉染複合物在缺乏抗生素之全生長培養基中培育6至7小時。用於研究中之siRNA序列如下：CCND1 (Dharmacon號MU-003210-05-0002)、CCND2 (Dharmacon號MU-003210-05-0002)、CCND3 (Dharmacon號J-003212-10-0002、J-003212-11-0002、J-003212-12-0002)、CDK4 (IDT產品號198569326、198569329、198569332)、CDK6 (IDT產品號200925870、200925873、200925876)。 時移成像：

至少在成像之前24小時，將細胞接種於在接種之前塗佈有膠原蛋白的玻璃底96孔盤(CellVis P96-1.5H-N)中之無苯酚紅全生長培養基中。接種密度經選擇以使得細胞將保持亞匯合直至成像期結束。首先在不具有藥物之全生長培養基中對細胞成像16至20小時。隨後將影片短暫暫停，且將全生長培養基用含有呈所要濃度之藥物的全生長培養基替換。隨後將培養盤重新插入至顯微鏡中，且對準其先前位置，並再繼續成像24至48小時。在5% CO2下，在加濕的37℃腔室中，在具有10× 0.45 NA物鏡之Nikon Eclipse Ti或Ti2顯微鏡上，每12 min (針對MCF10A或RPE-hTERT)或每20 min (針對MCF7或OVCAR3)獲得一次影像。將針對所有通道之所有影片的曝光時間保持在每時間點500ms下以最小化光毒性。如先前所描述(Arora等人, 2017)，使用公開MATLAB腳本(Cappell等人, 2016)執行細胞追蹤。追蹤程式碼可於https://github.com/scappell/Cell_tracking處下載獲得。藉由對影片之各訊框中之分裂核的數目進行計數而獲得隨時間之細胞計數。 免疫螢光：

將細胞用新鮮製備之4%多聚甲醛固定15分鐘，用PBS洗滌兩次，且在室溫下用阻斷緩衝液(含3% BSA之PBS)培育1小時。在4℃下使用0.2% Triton-X 100進行滲透持續15 min。將初級抗體在阻斷緩衝液中稀釋，且在4℃下與細胞一起培育隔夜，隨後用1×PBS洗滌三次。將結合至Alexa Fluor488、Alexa Fluor546或Alexa Fluor647之二級抗體培育1小時，隨後用1×PBS洗滌三次。使用Hoechst 33342染料以1:10000 (ThermoFisher H3570)將DNA染色10分鐘。在具有10× 0.45 NA物鏡之Nikon Eclipse Ti或Ti2顯微鏡上獲得影像。藉由採用各細胞之Hoechst信號的整合強度來測定DNA含量。藉由標繪DNA含量直方圖且繪製臨限值及2N峰之末端而將細胞劃定為3-4N DNA含量。 抗體及試劑：

此研究中使用之抗體為磷酸-Rb (Ser807/811) (CST 8516)、磷酸-核仁素(Thr84) (Abcam ab196338)、磷酸-NBS1 (Ser432) (Abcam ab12297)、磷酸-CDC6 (Ser54) (Abcam ab75809)、GAPDH (圖4中之CST 5174，圖5中之Invitrogen ZG003)、β-微管蛋白(CST 86298)、組織蛋白H3 (CST)、CDK2 (Abcam ab32147)、CDK4 (Abcam ab108357)、CDK6 (Abcam ab151247及ab124821)、週期素D1 (週期素D1純系SP4) (Thermo Scientific RM-9140-S0)、週期素D2 (CST 3741)、週期素D3 (CST 2936)、磷酸-CDK2 T160 (Cell Signaling 2561)、CDK2 (Abcam 32147)、p21 (Santa Cruz 6246)、週期素E (Santa Cruz 481)、紐蛋白(Sigma V9131)、Alexa 488山羊抗小鼠(Thermo Fisher Scientific，A-11001)、Alexa Fluor 546山羊抗兔(Thermo Fisher Scientific，A-11035)及Alexa Fluor 647山羊抗兔(Thermo Fisher Scientific，A-21245)。

將哌柏西利及PF3600 溶解於無水DMSO (Sigma-Aldrich目錄號：276855)中；將哌柏西利添加至1 μM之最終濃度，且將P3600添加至如所指示的25 nM、100 nM或500 nM之最終濃度。阿貝西利(目錄號：HY-16297A)及利波西利(目錄號：HY-15777)係購自MedChemExpress，且溶解於無水DMSO中。將阿貝西利添加至1 μM之最終濃度，且將利波西利添加至5 μM的最終濃度。將3MB-PP1 (Cayman Chemical目錄號：17860)溶解於無水DMSO中，且添加至10μM之最終濃度。RO3306 (#SML0569)係購自Sigma Aldrich。 共同免疫沈澱：

使用補充有苯甲基磺醯氟(PMSF)、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich P8340之1:1000稀釋液)之1×細胞裂解緩衝液(CST 9803)使經DMSO或100 nM PF3600處理24小時的MCF10A細胞裂解。使用Bradford檢定來量測裂解物中之總蛋白濃度，且在4℃下用5 μg之抗體將同等量的蛋白培育隔夜。藉由用蛋白G戴諾珠粒(Dynabead) (ThermoFisher 10003D)培育而將抗原-抗體複合物摧毀，且用1×裂解緩衝液洗滌三次。使用1× LDS樣本緩衝液(ThermoFisher NP0007)將結合至珠粒之蛋白溶離，且藉由西方墨點法進行分析。 磷酸-絲胺酸807/811 Rb ELISA：

以25,000個細胞/孔將MCF10A或MCF7細胞接種於96孔細胞培養盤中之生長培養基中，且使其在37℃下在5% CO₂ 下黏附隔夜。第二天，將化合物自10 mM儲備液針對11.3倍稀釋曲線在DMSO (Sigma)中連續稀釋。將化合物1:200中間稀釋至生長培養基中，之後針對細胞上之0.1% DMSO中的最終濃度10 µM最高劑量1:5稀釋於細胞上。在37℃下在5% CO₂ 中將細胞處理1小時。將細胞在冰上裂解於含有蛋白酶抑制劑混合液(Cell Signaling Technologies，5872)、SDS及PMSF之裂解緩衝液(Cell Signaling Technologies，9803)中，且轉移至經預塗且阻斷之抗磷酸-Ser807/811 Rb (Cell Signaling Technologies，8516) ELISA盤以用於在4℃下培育隔夜。用磷酸鹽緩衝生理鹽水洗滌盤以移除殘餘未結合細胞蛋白，且在37℃下經90 min添加總Rb偵測抗體(Cell Signaling Technologies，9309)。在洗滌以移除未結合總Rb抗體之後，在37℃下使HRP標記抗體(Cell Signaling Technologies，7076)結合30 min。在洗滌以移除未結合HRP抗體之後，添加Glo受質試劑(R&D Systems，DY993)，且避光培育5至10 min。在Envision盤讀取器(Perkin Elmer)上以發光模式讀取盤，且使用GraphPad Prism版本8.0.2計算IC50值。 西方墨點法：

使用1× LDS樣本緩衝液(ThermoFisher NP007)使用同等數目之細胞來製備裂解物。使用NuPAGE預製聚丙烯醯胺凝膠(ThermoFisher NP0301)分離蛋白。總蛋白使用Azure Red染料(Azure Biosystems AC2124)來定量，且用以標準化來自所關注抗體之信號。依據「抗體」章節來指定所用初級抗體。經HRP結合或經IR700及IR800標記之螢光二級抗體用於視覺化(Cell Signaling Technology 7074及7076)。

對於圖7B中之西方墨點，在補充有蛋白酶與磷酸酶抑制劑之混合液(完全的Mini, Roche, 11836153001；磷酸酶抑制劑混合液2及3, Sigma, P5726及P0044)的蛋白裂解緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、0.5% NP-40)中執行蛋白萃取。使用Bradford (Bio-Rad)方法量測蛋白濃度。將自腫瘤組織獲得之25g蛋白萃取物在NUPAGE TM 4-12% Bis-Tris Midi凝膠(Invitrogen)上分離，轉移至硝化纖維素膜(GE Healthcare)，且用初級抗體漬墨。用針對小鼠或兔IgG之山羊二級抗體(HRP、Dako及Alexa Fluor 680，Invitrogen)偵測初級抗體，且用ECL西方墨點偵測溶液(GE Healthcare)進行視覺化。 mRNA FISH：

目標特異性mRNA探針獲自ThermoFisher，且使用ViewRNA ISH套組(QVC001)以及製造商之方案以偵測單細胞中之目標mRNA表現。研究中使用之探針為CCND1 (VA6-16943-VC)、CCND2 (VA4-3083615-VC)、CCND3 (VA6-17696-VC)、CDK4 (VA6-18880)及CDK6 (VA6-3169253)。對於mRNA FISH信號之定量，使用Hoechst來獲得核遮罩，將該核遮罩擴大1像素以便獲得每個細胞之中值細胞質信號強度。 單細胞CDK2活性分析：

在成像期期間經分裂且接受藥物處理之異步循環細胞最初經劃分為基於細胞相對於藥物添加時間之分裂後期時間的類別。隨後基於其在有絲分裂事件之後的DHB細胞質/核(C/N)比率將此等細胞進一步子分類。藉由定量細胞質與核平均DHB螢光之比率來計算C/N比率，其中細胞質組分經計算為在核遮罩外部之像素環的前50百分位之平均值。

若DHB C/N比率在分裂後期之後3小時高於0.5單位，則將細胞分類為CDK2^inc ，否則將其分類為CDK2^low 。圖例指示僅標繪CDK2^inc 細胞抑或所有細胞。子類別中之單細胞跡線的中值隨後用以形成中值跡線，其中95%置信區間表示特定子類別。使用定製MATLAB腳本進行所有細胞跡線分析，且可在請求時獲得程式碼。 磷酸-蛋白質體學：

如先前描述來執行磷酸-肽富集(Lapek等人, 2017b)。經凍乾磷酸-肽隨後經TMT標記，且藉由逆相鹼性pH分餾進行分餾，且如先前描述(Edwards及Haas, 2016)合併溶離份。將溶離份凍乾且儲存在80℃下直至MS分析。對於LC-MS2/MS3分析，在10 µL之含5%乙腈的5%甲酸中復原樣本，且在Orbitrap Fusion Lumos上注射8 µL各溶離份以供分析。

在加熱至60℃之PepMap RSLC C18管柱(2 µm，100Å，75 µm×50 cm)上在300 nL/min下以7%至32%溶劑B (含80%乙腈之0.1%甲酸)的165分鐘梯度溶離肽。以Top Speed模式以5秒週期獲得光譜。在Orbitrap中以60000解析度跨越500至1500 m/z之範圍收集MS1資料。使用2×10⁵ 之自動增益控制(AGC)目標，其中最大注射時間為100 ms。在離子阱中以較快掃描速率、70 ms之最大注射時間及2×10⁴ 的AGC目標來獲得MS2資料。使用四極子進行分離，其中分離窗為0.5 m/z。用CID在30%標準化撞擊能量下使肽碎裂，其中活化時間為10 ms，且活化Q為0.25。對於MS3光譜，選擇至多10個離子以供同步前驅物選擇，且在Orbitrap中以60000解析度收集資料。在55%之能量下用HCD使離子碎裂。MS3 AGC設定為1×10⁵ ，其中最大注射時間為250 ms，且第一質量為110 m/z。所有階段之資料進行質心處理。

在IP2GPU伺服器上處理所得原始檔案(Integrated Proteomics Applications, Inc.)。針對與當前雜質資料庫及逆向資料庫串聯之Uniprot Human資料庫(2018年1月29日下載)用ProLuCID演算法(Xu等人, 2015)搜索資料。半胱胺酸殘基(+57.02146)之胺甲醯胺基甲基化以及肽n末端及離胺酸殘基(+229.162932)的TMT-11修飾包括為靜態修飾。甲硫胺酸(+15.9949)之氧化以及絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸(+79.966331)之磷酸化包括為可變修飾。允許最多4個可變修飾及兩個錯誤分裂。肽必須具有待考慮之6個胺基酸的最小長度。以50 ppm MS1容許度(Huttlin等人, 2010)及800 ppm MS2容許度搜索資料。最終資料經過濾至1%蛋白含量假发現率。

如先前描述，以多步處理將資料標準化(Lapek等人, 2017a)。簡言之，以彙集之橋通道將第一資料標準化以解釋運行間的儀器性能差異，且隨後進行中值擦除以解釋任何混合誤差。所有磷酸資料在肽層級下進行處理及分析。 實驗模型細節：

除西奈山伊坎醫學院之Robert Fisher實驗室提供之RPE-hTERT野生型及CDK2類似物敏感性細胞之外，在此研究中所使用之細胞株係獲自ATCC。在補充有5%馬血清(Invitrogen)、20 ng/mL表皮生長因子(Sigma-Aldrich)、0.5 mg/mL氫化可的松(hydrocortisone) (Sigma-Aldrich)、100 ng/mL霍亂毒素(Sigma-Aldrich)及10 μg/mL胰島素(Invitrogen)之DMEM/F12中培養MCF10A (人類乳腺上皮)細胞。使RPE-hTERT細胞生長於具有10% FBS之DMEM中。MCF7及OVCAR3細胞使用補充有10% FBS之RPMI-1640進行生長。除在siRNA轉染期間之外，所有全生長培養基均補充有青黴素/鏈黴素。在37℃及5% CO₂ 下培養所有細胞。 小鼠研究：

小鼠 ： 先前已描述Kras^+/LSLG12V Trp53^L/L 及Cdk2^-/- 小鼠(Guerra等人, 2003；Jonkers等人, 2001；Ortega等人, 2003)。產生使用以下轉基因之化合物小鼠以供此研究：Kras^+/LSLG12V (Guerra等人, 2003)；Trp53 ^L/L (Lee等人, 2012)及Cdk2 ^-/- (Ortega等人, 2003)。所有動物實驗均由西班牙國家癌症研究中心(CNIO)之倫理委員會(the Ethical Committees of the Spanish National Cancer Research Centre)、卡羅斯三世衛生研究所(the Carlos III Health Institute)及馬德里自治區(the Autonomous Community of Madrid) (PROEX 270/14)批准，且根據關於涉及生物醫學研究之動物的國際指導準則(由國際醫學科學組織委員會(CIOMS)研發)中所陳述之準則進行。在無特異性病原體條件下將小鼠圈養於CNIO's Animal Facility (AAALAC, JRS:dpR 001659)中。將雌性及雄性小鼠用於實驗。所有小鼠在CNIO's Genomic Unit進行基因分型。

肺腫瘤誘導 ： 藉由鼻內滴注編碼Cre重組酶(Ad-Cre)之腺病毒的單次劑量10⁶ pfu/小鼠，在經麻醉(氯胺酮75 mg/kg，甲苯噻𠯤12 mg/kg)之8週齡小鼠中進行肺腺癌之誘導。所有腺病毒製劑購自愛荷華大學(University of Iowa) (美國愛荷華城)。

微 CT 成像 ： 藉由CNIO處之分子成像核心單位進行影像研究。用1%至3%異氟醚/氧氣混合物之連續流(0.5 L/min)麻醉小鼠，且藉由用CompaCT掃描儀(SEDECAL Madrid SpainGE)執行之三維微電腦斷層攝影術對胸部區域進行成像。藉由360度掃描、三個訊框100 ms之整合時間、50 KeV之光子能及100 uA之電流來獲得具有720個投影之資料。用GE MicroView軟體v2.2獲得腫瘤量測值。腫瘤體積計算如下：(短軸×短軸×長軸/2)。

小鼠中之藥理學治療 ： 使Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L ;Cdk2^-/- 及Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L ;Cdk2^+/+ 小鼠經感染有10⁶ pfu之Ad-Cre。一旦藉由CT偵測到腫瘤，則將含有至少一個大於3 mm³ 之腫瘤的小鼠選入不同處理組中。以70 mg/kg QD將哌柏西利給藥4週，且以50 mg/kg BID將PF3600給藥4週。藉由CT量測來監測藥物效力。 表1：在處理(25nM PF3600)後1小時及24小時之目標蛋白磷酸化水準

蛋白質	描述	基因	序列	3600_1hr_log2	3600_24hr_log2
E7EVA0	微管相關蛋白 OS=智人 GN=MAP4 PE=1 SV=1	MAP4	DVPPLSETEApTPVPIK (SEQ ID NO: 1)	-2.05	1.30
P12270	核蛋白 TPR OS=智人 GN=TPR PE=1 SV=3	TPR	GIASTSDPPTANIKPTPVVSpTPSK (SEQ ID NO: 2)	-2.33	0.16
Q13330	癌轉移相關蛋白MTA1 OS=智人GN=MTA1 PE=1 SV=2	MTA1	SVSSVLSSLpTPAK (SEQ ID NO: 3)	-2.82	-0.89
Q9UBF8	磷脂醯肌醇4-激酶β OS=智人 GN=PI4KB PE=1 SV=1	PI4KB	ELPSLSPAPDTGLpSPSK (SEQ ID NO: 4)	-2.50	0.71
Q13330	癌轉移相關蛋白MTA1 OS=智人GN=MTA1 PE=1 SV=2	MTA1	AGVVNGTGAPGQpSPGAGR (SEQ ID NO: 5)	-0.98	-0.63
P31689	DnaJ同源物亞家族A成員1 OS=智人GN=DNAJA1 PE=1 SV=2	DNAJA1	VNFPENGFLpSPDK (SEQ ID NO: 6)	-1.15	0.01
P28749	視網膜母細胞瘤樣蛋白1 OS=智人GN=RBL1 PE=1 SV=3	RBL1	RVIAIDSDAEpSPAK (SEQ ID NO: 7)	-1.39	-0.40
Q8WYP5-3	蛋白ELYS之異構體3 OS=智人GN=AHCTF1	AHCTF1	GLSQNQQIPQNSVpTPR (SEQ ID NO: 8)	-2.29	0.54
Q09666	神經母細胞分化相關蛋白AHNAK OS=智人GN=AHNAK PE=1 SV=2	AHNAK	ISMQDVDLSLGpSPK (SEQ ID NO: 9)	-1.85	0.14
Q09666	神經母細胞分化相關蛋白AHNAK OS=智人GN=AHNAK PE=1 SV=2	AHNAK	GGVTGSPEASISGpSK (SEQ ID NO: 10)	-2.39	-0.92
Q14004	週期素依賴性激酶13 OS=智人 GN=CDK13 PE=1 SV=2	CDK13	TNpTPQGVLPSSQLK (SEQ ID NO: 11)	-1.72	0.00
Q53GA4	普列克底物蛋白同源(Pleckstrin homology)樣域家族A成員2 OS=智人 GN=PHLDA2 PE=1 SV=2	PHLDA2	TAPAAPAEDAVAAAAAAPSEPSEPSRPpSPQPK (SEQ ID NO: 12)	-1.42	0.21
Q96HC4	PDZ及LIM域蛋白5 OS=智人 GN=PDLIM5 PE=1 SV=5	PDLIM5	EVVKPVPIpTSPAVSK (SEQ ID NO: 13)	-1.67	-0.29
O15446	DNA引導之RNA聚合酶I次單位RPA34 OS=智人 GN=CD3EAP PE=1 SV=1	CD3EAP	QEQINTEPLEDTVLpSPTKK (SEQ ID NO: 14)	-0.97	0.19
Q9NQS7	內著絲粒蛋白OS=智人 GN=INCENP PE=1 SV=3	INCENP	HSPIAPSpSPSPQVLAQK (SEQ ID NO: 15)	-1.40	0.03
P42858	亨廷頓(Huntingtin)OS=智人 GN=HTT PE=1 SV=2	HTT	EKEPGEQASVPLpSPK (SEQ ID NO: 16)	-1.28	-0.25
Q6IQ22	Ras相關蛋白Rab-12 OS=智人 GN=RAB12 PE=1 SV=3	RAB12	AGGGGGLGAGpSPALSGGQGR (SEQ ID NO: 17)	-1.42	-0.72
Q9UGU0	轉錄因子20 OS=智人 GN=TCF20 PE=1 SV=3	TCF20	NCPAVTLTpSPAK (SEQ ID NO: 18)	-0.96	-0.47
Q9NQS7	內著絲粒蛋白OS=智人 GN=INCENP PE=1 SV=3	INCENP	HpSPIAPSpSPSPQVLAQK (SEQ ID NO: 19)	-1.23	-0.46
E7EVA0	微管相關蛋白 OS=智人 GN=MAP4 PE=1 SV=1	MAP4	DGVLTLANNVpTPAK (SEQ ID NO: 20)	-1.11	0.85
Q8NEF9	血清反應因子結合蛋白1 OS=智人 GN=SRFBP1 PE=1 SV=1	SRFBP1	DSVVSLESQKpTPADPK (SEQ ID NO: 21)	-1.92	0.31
Q12830	核小體重構因子次單位BPTF OS=智人 GN=BPTF PE=1 SV=3	BPTF	PQVAAQSQPQSNVQGQpSPVR (SEQ ID NO: 22)	-1.10	-0.85
P49454	著絲粒蛋白F OS=智人 GN=CENPF PE=1 SV=2	CENPF	SQQAAQSADVSLNPCNpTPQK (SEQ ID NO: 23)	-1.41	0.36
P85037	叉頭框(Forkhead box)蛋白K1 OS=智人 GN=FOXK1 PE=1 SV=1	FOXK1	YSQSAPGpSPVSAQPVIM(15.995)AVPPRPSSLVAK (SEQ ID NO: 24)	-1.24	-1.53
J3QS41	可能存在之具有鋅指域的解螺旋酶OS=智人 GN=HELZ PE=1 SV=1	HELZ	GpSPIPYGLGHHPPVTIGQPQNQHQEK (SEQ ID NO: 25)	-1.17	0.36
B5MBX0	Sororin OS=智人 GN=CDCA5 PE=1 SV=1	CDCA5	RIVAHAVEVPAVQpSPR (SEQ ID NO: 26)	-1.07	0.59
Q9H7N4	剪接因子，精胺酸/絲胺酸富集19 OS=智人 GN=SCAF1 PE=1 SV=3	SCAF1	pSPSPAPAPAPAAAAGPPTR (SEQ ID NO: 27)	-0.91	-0.16
Q5JSZ5	蛋白PRRC2B OS=智人 GN=PRRC2B PE=1 SV=2	PRRC2B	ApSPQENGPAVHK (SEQ ID NO: 28)	-2.32	-0.64
Q8N8A6	ATP依賴性RNA解螺旋酶DDX51 OS=智人 GN=DDX51 PE=1 SV=3	DDX51	VNDAEPGpSPEAPQGK (SEQ ID NO: 29)	-0.97	0.96
Q5VT52-3	含有核前mRNA域之蛋白2之調節的異構體3 OS=智人 GN=RPRD2	RPRD2	NTGVSPASRPSPGpTPTSPSNLTSGLK (SEQ ID NO: 30)	-1.32	-0.09
Q9Y6D5	布雷非德菌素(Brefeldin) A抑制性鳥嘌呤核苷酸交換蛋白2 OS=智人 GN=ARFGEF2 PE=1 SV=3	ARFGEF2	PQSPVIQAAAVpSPK (SEQ ID NO: 31)	-1.08	-0.69
Q9Y446	橋粒斑菲素蛋白-3 OS=智人 GN=PKP3 PE=1 SV=1	PKP3	AGGLDWPEATEVpSPSR (SEQ ID NO: 32)	-0.94	0.83
Q9H7N4	剪接因子，精胺酸/絲胺酸富集19 OS=智人 GN=SCAF1 PE=1 SV=3	SCAF1	pSPSPAPAPAPAAAAGPPTRK (SEQ ID NO: 33)	-0.99	-0.53
Q6KC79	夾持-B樣蛋白OS=智人 GN=NIPBL PE=1 SV=2	NIPBL	DVPPDILLDpSPERK (SEQ ID NO: 34)	-0.86	-0.06
Q12955-5	錨蛋白-3之異構體3 OS=智人 GN=ANK3	ANK3	RYSYLTEPGM(15.995)SPQpSPCER (SEQ ID NO: 35)	-2.38	0.35
Q9UHG0	含有雙皮質激素域之蛋白2 OS=智人 GN=DCDC2 PE=1 SV=2	DCDC2	STVGSSDNSpSPQPLK (SEQ ID NO: 36)	-1.69	-0.37
Q9UHB7	AF4/FMR2家族成員4 OS=智人 GN=AFF4 PE=1 SV=1	AFF4	DLLPpSPAGPVPSK (SEQ ID NO: 37)	-1.00	-0.36
Q96T58	Msx2相互作用蛋白OS=智人 GN=SPEN PE=1 SV=1	SPEN	DSELKpTPPSVGPPSVTVVTLESAPSALEK (SEQ ID NO: 38)	-0.93	-0.05
Q86UU0-4	B細胞CLL/淋巴瘤9樣蛋白之異構體4 OS=智人 GN=BCL9L	BCL9L	TAM(15.995)PpSPGVSQNK (SEQ ID NO: 39)	-0.88	0.53
Q8WUF5	RelA相關抑制劑 OS=智人 GN=PPP1R13L PE=1 SV=4	PPP1R13L	AGpSPRGpSPLAEGPQAFFPER (SEQ ID NO: 40)	-1.12	0.63

參考文獻

以下參考文獻以全文引用之方式併入本文中： [1] Akiyama, T., Ohuchi, T., Sumida, S., Matsumoto, K., and Toyoshima, K. (1992). Phosphorylation of the retinoblastoma protein by cdk2. Proc Natl Acad Sci U S A89 , 7900-7904. [2] Aktas, H., Cai, H., and Cooper, G.M. (1997). Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via regulation of cyclin D1 and the Cdk inhibitor p27KIP1. Mol Cell Biol17 , 3850-3857. [3] Aleem, E., Kiyokawa, H., and Kaldis, P. (2005). Cdc2-cyclin E complexes regulate the G1/S phase transition. Nat Cell Biol7 , 831-836. [4] Arora, M., Moser, J., Phadke, H., Basha, A.A., and Spencer, S.L. (2017). Endogenous Replication Stress in Mother Cells Leads to Quiescence of Daughter Cells. Cell reports19 , 1351-1364. [5] Baldin, V., Lukas, J., Marcote, M.J., Pagano, M., and Draetta, G. (1993). Cyclin D1 is a nuclear protein required for cell cycle progression in G1. Genes Dev7 , 812-821. [6] Barriere, C., Santamaria, D., Cerqueira, A., Galan, J., Martin, A., Ortega, S., Malumbres, M., Dubus, P., and Barbacid, M. (2007). Mice thrive without Cdk4 and Cdk2. Mol Oncol1 , 72-83. Berthet, C., Aleem, E., Coppola, V., Tessarollo, L., and Kaldis, P. (2003). Cdk2 knockout mice are viable. Curr Biol13 , 1775-1785. [7] Brookes, S., Gagrica, S., Sanij, E., Rowe, J., Gregory, F.J., Hara, E., and Peters, G. (2015). Evidence for a CDK4-dependent checkpoint in a conditional model of cellular senescence. Cell Cycle14 , 1164-1173. [8] Burkhart, D.L., and Sage, J. (2008). Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer8 , 671-682. [9] Caldon, C.E., Sergio, C.M., Kang, J., Muthukaruppan, A., Boersma, M.N., Stone, A., Barraclough, J., Lee, C.S., Black, M.A., Miller, L.D., et al. (2012). Cyclin E2 overexpression is associated with endocrine resistance but not insensitivity to CDK2 inhibition in human breast cancer cells. Mol Cancer Ther11 , 1488-1499. [10] Cappell, S.D., Chung, M., Jaimovich, A., Spencer, S.L., and Meyer, T. (2016). Irreversible APC(Cdh1) Inactivation Underlies the Point of No Return for Cell-Cycle Entry. Cell166 , 167-180. [11] Chellappan, S.P., Hiebert, S., Mudryj, M., Horowitz, J.M., and Nevins, J.R. (1991). The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein. Cell65 , 1053-1061. [12] Chung, M., Liu, C., Yang, H.W., Koberlin, M.S., Cappell, S.D., and Meyer, T. (2019). Transient Hysteresis in CDK4/6 Activity Underlies Passage of the Restriction Point in G1. Mol Cell. [13] Deshpande, A., Sicinski, P., and Hinds, P.W. (2005). Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene24 , 2909-2915. [14] Edwards, A., and Haas, W. (2016). Multiplexed Quantitative Proteomics for High-Throughput Comprehensive Proteome Comparisons of Human Cell Lines. Methods in molecular biology1394 , 1-13. [15] Evron, E., Umbricht, C.B., Korz, D., Raman, V., Loeb, D.M., Niranjan, B., Buluwela, L., Weitzman, S.A., Marks, J., and Sukumar, S. (2001). Loss of cyclin D2 expression in the majority of breast cancers is associated with promoter hypermethylation. Cancer Res61 , 2782-2787. [16] Fisk, H.A., and Winey, M. (2001). The mouse Mps1p-like kinase regulates centrosome duplication. Cell106 , 95-104. [17] Franco, J., Witkiewicz, A.K., and Knudsen, E.S. (2014). CDK4/6 inhibitors have potent activity in combination with pathway selective therapeutic agents in models of pancreatic cancer. Oncotarget5 , 6512-6525. [18] Gabrielli, B.G., Sarcevic, B., Sinnamon, J., Walker, G., Castellano, M., Wang, X.Q., and Ellem, K.A. (1999). A cyclin D-Cdk4 activity required for G2 phase cell cycle progression is inhibited in ultraviolet radiation-induced G2 phase delay. J Biol Chem274 , 13961-13969. [19] Gookin, S., Min, M.W., Phadke, H., Chung, M.Y., Moser, J., Miller, I., Carter, D., and Spencer, S.L. (2017). A map of protein dynamics during cell-cycle progression and cell-cycle exit. Plos Biology15 . [20] Grim, J.E., and Clurman, B.E. (2003). Cycling without CDK2? Trends Cell Biol13 , 396-399. [21] Guerra, C., Mijimolle, N., Dhawahir, A., Dubus, P., Barradas, M., Serrano, M., Campuzano, V., and Barbacid, M. (2003). Tumor induction by an endogenous K-ras oncogene is highly dependent on cellular context. Cancer Cell4 , 111-120. [22] Hata, A.N., Niederst, M.J., Archibald, H.L., Gomez-Caraballo, M., Siddiqui, F.M., Mulvey, H.E., Maruvka, Y.E., Ji, F., Bhang, H.E., Krishnamurthy Radhakrishna, V., et al. (2016). Tumor cells can follow distinct evolutionary paths to become resistant to epidermal growth factor receptor inhibition. Nature medicine22 , 262-269. [23] Herrera-Abreu, M.T., Palafox, M., Asghar, U., Rivas, M.A., Cutts, R.J., Garcia-Murillas, I., Pearson, A., Guzman, M., Rodriguez, O., Grueso, J., et al. (2016). Early Adaptation and Acquired Resistance to CDK4/6 Inhibition in Estrogen Receptor-Positive Breast Cancer. Cancer Res76 , 2301-2313. [24] Hu, M.G., Deshpande, A., Enos, M., Mao, D., Hinds, E.A., Hu, G.F., Chang, R., Guo, Z., Dose, M., Mao, C., et al. (2009). A requirement for cyclin-dependent kinase 6 in thymocyte development and tumorigenesis. Cancer Res69 , 810-818. [25] Huttlin, E.L., Jedrychowski, M.P., Elias, J.E., Goswami, T., Rad, R., Beausoleil, S.A., Villen, J., Haas, W., Sowa, M.E., and Gygi, S.P. (2010). A tissue-specific atlas of mouse protein phosphorylation and expression. Cell143 , 1174-1189. [26] Jonkers, J., Meuwissen, R., van der Gulden, H., Peterse, H., van der Valk, M., and Berns, A. (2001). Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nat Genet29 , 418-425. [27] Kato, J., Matsushime, H., Hiebert, S.W., Ewen, M.E., and Sherr, C.J. (1993). Direct binding of cyclin D to the retinoblastoma gene product (pRb) and pRb phosphorylation by the cyclin D-dependent kinase CDK4. Genes Dev7 , 331-342. [28] Katsuno, Y., Suzuki, A., Sugimura, K., Okumura, K., Zineldeen, D.H., Shimada, M., Niida, H., Mizuno, T., Hanaoka, F., and Nakanishi, M. (2009). Cyclin A-Cdk1 regulates the origin firing program in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A106 , 3184-3189. [29] Keyomarsi, K., Tucker, S.L., Buchholz, T.A., Callister, M., Ding, Y., Hortobagyi, G.N., Bedrosian, I., Knickerbocker, C., Toyofuku, W., Lowe, M., et al. (2002). Cyclin E and survival in patients with breast cancer. N Engl J Med347 , 1566-1575. [30] Khatib, Z.A., Matsushime, H., Valentine, M., Shapiro, D.N., Sherr, C.J., and Look, A.T. (1993). Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas. Cancer Res53 , 5535-5541. [31] Lapek, J.D., Jr., Greninger, P., Morris, R., Amzallag, A., Pruteanu-Malinici, I., Benes, C.H., and Haas, W. (2017a). Detection of dysregulated protein-association networks by high-throughput proteomics predicts cancer vulnerabilities. Nature biotechnology35 , 983-989. [32] Lapek, J.D., Jr., Lewinski, M.K., Wozniak, J.M., Guatelli, J., and Gonzalez, D.J. (2017b). Quantitative Temporal Viromics of an Inducible HIV-1 Model Yields Insight to Global Host Targets and Phospho-Dynamics Associated with Protein Vpr. Molecular & cellular proteomics : MCP16 , 1447-1461. [33] Lee, C.L., Moding, E.J., Huang, X., Li, Y., Woodlief, L.Z., Rodrigues, R.C., Ma, Y., and Kirsch, D.G. (2012). Generation of primary tumors with Flp recombinase in FRT-flanked p53 mice. Dis Model Mech5 , 397-402. [34] Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., and Medema, R.H. (2009). The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. Journal of Cell Biology185 , 193-202. [35] Lohka, M.J., Hayes, M.K., and Maller, J.L. (1988). Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad Sci U S A85 , 3009-3013. [36] Lundberg, A.S., and Weinberg, R.A. (1998). Functional inactivation of the retinoblastoma protein requires sequential modification by at least two distinct cyclin-cdk complexes. Molecular and cellular biology18 , 753-761. [37] Malumbres, M., Sotillo, R., Santamaria, D., Galan, J., Cerezo, A., Ortega, S., Dubus, P., and Barbacid, M. (2004). Mammalian cells cycle without the D-type cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk6. Cell118 , 493-504. [38] Massague, J. (2004). G1 cell-cycle control and cancer. Nature432 , 298-306. [39] Matsushime, H., Ewen, M.E., Strom, D.K., Kato, J.Y., Hanks, S.K., Roussel, M.F., and Sherr, C.J. (1992). Identification and properties of an atypical catalytic subunit (p34PSK-J3/cdk4) for mammalian D type G1 cyclins. Cell71 , 323-334. [40] Matsushime, H., Quelle, D.E., Shurtleff, S.A., Shibuya, M., Sherr, C.J., and Kato, J.Y. (1994). D-type cyclin-dependent kinase activity in mammalian cells. Mol Cell Biol14 , 2066-2076. [41] Merrick, K.A., Wohlbold, L., Zhang, C., Allen, J.J., Horiuchi, D., Huskey, N.E., Goga, A., Shokat, K.M., and Fisher, R.P. (2011). Switching Cdk2 On or Off with Small Molecules to Reveal Requirements in Human Cell Proliferation. Molecular Cell42 , 624-636. [42] Meyerson, M., and Harlow, E. (1994). Identification of G1 kinase activity for cdk6, a novel cyclin D partner. Mol Cell Biol14 , 2077-2086. [43] Mittnacht, S., Lees, J.A., Desai, D., Harlow, E., Morgan, D.O., and Weinberg, R.A. (1994). Distinct sub-populations of the retinoblastoma protein show a distinct pattern of phosphorylation. EMBO J13 , 118-127. [44] Moons, D.S., Jirawatnotai, S., Parlow, A.F., Gibori, G., Kineman, R.D., and Kiyokawa, H. (2002). Pituitary hypoplasia and lactotroph dysfunction in mice deficient for cyclin-dependent kinase-4. Endocrinology143 , 3001-3008. [45] Musgrove, E.A., Caldon, C.E., Barraclough, J., Stone, A., and Sutherland, R.L. (2011). Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat Rev Cancer11 , 558-572. [46] Narasimha, A.M., Kaulich, M., Shapiro, G.S., Choi, Y.J., Sicinski, P., and Dowdy, S.F. (2014). Cyclin D activates the Rb tumor suppressor by mono-phosphorylation. Elife3 . Ohtani, K., DeGregori, J., and Nevins, J.R. (1995). Regulation of the cyclin E gene by transcription factor E2F1. Proc Natl Acad Sci U S A92 , 12146-12150. [47] Okuda, M., Horn, H.F., Tarapore, P., Tokuyama, Y., Smulian, A.G., Chan, P.K., Knudsen, E.S., Hofmann, I.A., Snyder, J.D., Bove, K.E., et al. (2000). Nucleophosmin/B23 is a target of CDK2/cyclin E in centrosome duplication. Cell103 , 127-140. [48] Ortega, S., Prieto, I., Odajima, J., Martin, A., Dubus, P., Sotillo, R., Barbero, J.L., Malumbres, M., and Barbacid, M. (2003). Cyclin-dependent kinase 2 is essential for meiosis but not for mitotic cell division in mice. Nat Genet35 , 25-31. [49] Park, S., Lee, J., Do, I.G., Jang, J., Rho, K., Ahn, S., Maruja, L., Kim, S.J., Kim, K.M., Mao, M., et al. (2014). Aberrant CDK4 amplification in refractory rhabdomyosarcoma as identified by genomic profiling. Sci Rep4 , 3623. [50] Petersen, B.O., Lukas, J., Sorensen, C.S., Bartek, J., and Helin, K. (1999). Phosphorylation of mammalian CDC6 by cyclin A/CDK2 regulates its subcellular localization. EMBO J18 , 396-410. [51] Ramirez, M., Rajaram, S., Steininger, R.J., Osipchuk, D., Roth, M.A., Morinishi, L.S., Evans, L., Ji, W., Hsu, C.H., Thurley, K., et al. (2016). Diverse drug-resistance mechanisms can emerge from drug-tolerant cancer persister cells. Nature communications7 , 10690. [52] Rane, S.G., Dubus, P., Mettus, R.V., Galbreath, E.J., Boden, G., Reddy, E.P., and Barbacid, M. (1999). Loss of Cdk4 expression causes insulin-deficient diabetes and Cdk4 activation results in beta-islet cell hyperplasia. Nat Genet22 , 44-52. [53] Saha, P., Chen, J., Thome, K.C., Lawlis, S.J., Hou, Z.H., Hendricks, M., Parvin, J.D., and Dutta, A. (1998). Human CDC6/Cdc18 associates with Orc1 and cyclin-cdk and is selectively eliminated from the nucleus at the onset of S phase. Mol Cell Biol18 , 2758-2767. [54] Sanidas, I., Morris, R., Fella, K.A., Rumde, P.H., Boukhali, M., Tai, E.C., Ting, D.T., Lawrence, M.S., Haas, W., and Dyson, N.J. (2019). A Code of Mono-phosphorylation Modulates the Function of RB. Mol Cell73 , 985-1000 e1006. [55] Santamaria, D., Barriere, C., Cerqueira, A., Hunt, S., Tardy, C., Newton, K., Caceres, J.F., Dubus, P., Malumbres, M., and Barbacid, M. (2007). Cdk1 is sufficient to drive the mammalian cell cycle. Nature448 , 811-815. [56] Sarcevic, B., Lilischkis, R., and Sutherland, R.L. (1997). Differential phosphorylation of T-47D human breast cancer cell substrates by D1-, D3-, E-, and A-type cyclin-CDK complexes. J Biol Chem272 , 33327-33337. [57] Schwarz, C., Johnson, A., Koivomagi, M., Zatulovskiy, E., Kravitz, C.J., Doncic, A., and Skotheim, J.M. (2018). A Precise Cdk Activity Threshold Determines Passage through the Restriction Point. Mol Cell69 , 253-264 e255. [58] Shaffer, S.M., Dunagin, M.C., Torborg, S.R., Torre, E.A., Emert, B., Krepler, C., Beqiri, M., Sproesser, K., Brafford, P.A., Xiao, M., et al. (2017). Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature546 , 431-435. [59] Sharma, S.V., Lee, D.Y., Li, B., Quinlan, M.P., Takahashi, F., Maheswaran, S., McDermott, U., Azizian, N., Zou, L., Fischbach, M.A., et al. (2010). A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell141 , 69-80. [60] Sherr, C.J. (1993). Mammalian G1 cyclins. Cell73 , 1059-1065. [61] Sherr, C.J. (1994). G1 phase progression: cycling on cue. Cell79 , 551-555. [62] Sherr, C.J., and Roberts, J.M. (2004). Living with or without cyclins and cyclin-dependent kinases. Genes Dev18 , 2699-2711. [63] Spencer, S.L., Cappell, S.D., Tsai, F.C., Overton, K.W., Wang, C.L., and Meyer, T. (2013). The proliferation-quiescence decision is controlled by a bifurcation in CDK2 activity at mitotic exit. Cell155 , 369-383. [64] Tetsu, O., and McCormick, F. (2003). Proliferation of cancer cells despite CDK2 inhibition. Cancer Cell3 , 233-245. [65] Wohlbold, L., Merrick, K.A., De, S., Amat, R., Kim, J.H., Larochelle, S., Allen, J.J., Zhang, C., Shokat, K.M., Petrini, J.H., et al. (2012). Chemical genetics reveals a specific requirement for Cdk2 activity in the DNA damage response and identifies Nbs1 as a Cdk2 substrate in human cells. PLoS Genet8 , e1002935. [66] Xu, T., Park, S.K., Venable, J.D., Wohlschlegel, J.A., Diedrich, J.K., Cociorva, D., Lu, B., Liao, L., Hewel, J., Han, X., et al. (2015). ProLuCID: An improved SEQUEST-like algorithm with enhanced sensitivity and specificity. Journal of proteomics129 , 16-24. [67] Yang, C., Li, Z., Bhatt, T., Dickler, M., Giri, D., Scaltriti, M., Baselga, J., Rosen, N., and Chandarlapaty, S. (2017a). Acquired CDK6 amplification promotes breast cancer resistance to CDK4/6 inhibitors and loss of ER signaling and dependence. Oncogene36 , 2255-2264. [68] Yang, H.W., Chung, M., Kudo, T., and Meyer, T. (2017b). Competing memories of mitogen and p53 signalling control cell-cycle entry. Nature549 , 404-408. [69] Yang, K., Hitomi, M., and Stacey, D.W. (2006). Variations in cyclin D1 levels through the cell cycle determine the proliferative fate of a cell. Cell Div1 . [70] Zerjatke, T., Gak, I.A., Kirova, D., Fuhrmann, M., Daniel, K., Gonciarz, M., Muller, D., Glauche, I., and Mansfeld, J. (2017). Quantitative Cell Cycle Analysis Based on an Endogenous All-in-One Reporter for Cell Tracking and Classification. Cell Reports19 , 1953-1966. [71] Zhao, J., Kennedy, B.K., Lawrence, B.D., Barbie, D.A., Matera, A.G., Fletcher, J.A., and Harlow, E. (2000). NPAT links cyclin E-Cdk2 to the regulation of replication-dependent histone gene transcription. Genes Dev14 , 2283-2297.

圖1A至圖1G：CDK2活性藉由PF3600急劇抑制，但磷酸化快速反彈。(A) CDK2活性感測器之示意圖。當未磷酸化時，DHB (DNA解螺旋酶B片段)定位至核；進展性磷酸化導致感測器易位至細胞質。NLS，核定位信號；NES，核輸出信號；S，絲胺酸上之CDK共有磷酸化位點。(B) MCF10A中之DHB感測器磷酸化。若活躍增殖性細胞(CDK2^inc ，參見方法)在以散列陰影標記之時間窗期間接受藥物，則選擇該等活躍增殖性細胞來標繪。若細胞在藥物添加之前t 小時完成分裂後期，則選擇該等細胞來標繪，其中選擇t 來取樣分裂間期時間之25%與75%之間的細胞週期。單細胞跡線數目：DMSO (121, 92, 99, 71)、25nM PF3600 (133, 92, 104, 76)、100nM PF3600 (80, 95, 107, 80)、500nM (19, 51, 159, 119)。(C)如藉由CDC6-YFP C/N比率讀出之MCF10A細胞中的CDC6磷酸化。細胞經成像、處理，且如圖1B中所標繪。單細胞跡線數目：DMSO (83)、100nM PF3600(86)、500nM PF3600 (95)。如圖1B中之(D)、(F)及(G) DHB感測器磷酸化。針對以下之單細胞跡線數目：(D) RPE-hTERT：DMSO (69, 74, 100, 97)、25nM PF3600 (66, 97, 92, 106)、100nM PF3600 (43, 111, 121, 87)、500nM PF3600 (25, 151, 231, 182)；(F)MCF7：DMSO (148, 126, 124, 107)、25nM PF3600 (196, 179, 167, 145)、100nM PF3600 (172, 198, 188, 161)、500nM PF3600 (246, 230, 191, 190)；(G)OVCAR3：DMSO (100, 100, 100, 86)、25nM PF3600 (100, 100, 100, 95)、100nM PF3600 (62, 100, 100, 100)、500nM PF3600 (22, 100, 88, 94)。(E)在所指示時間處經DMSO或10 μM 3MB-PP1處理之CDK2類似物敏感性RPE-hTERT中的DHB感測器磷酸化。單細胞跡線數目：DMSO (133)、10 μM 3MB-PP1 (104)。

圖2A至圖2C：CDK4/6與CDK2之共同抑制阻斷CDK2受質之增殖性及補償性磷酸化。(A)在所指示時間處經DMSO、10 μM 3MB-PP1、1μM哌柏西利或10 μM 3MB-PP1+1 μM哌柏西利處理之CDK2類似物敏感性RPE-hTERT細胞中的DHB感測器磷酸化，如圖1B中。3MB-PP1用以抑制CDK2類似物敏感性細胞中之CDK2活性。單細胞跡線數目：DMSO (133)、10 μM 3MB-PP1 (104)、1 μM哌柏西利(146)、10 μM 3MB-PP1+1 μM哌柏西利(160)。根據圖1E再製DMSO及10 μM 3MB-PP1中值跡線。(B)經DMSO、100nM PF3600、5μM利波西利、100nM PF3600+5μM利波西利處理之MCF10A細胞中的DHB感測器磷酸化，如圖1B中；(C)經DMSO、100nM PF3600、1μM阿貝西利或100nM PF3600+1μM阿貝西利處理之MCF10A細胞中的DHB感測器磷酸化，如圖1B中。(B)單細胞跡線數目，左側 ：DMSO (55)、100nM PF3600 (53)、5μM利波西利(23)、100nM PF3600+5μM利波西利(26)。(C)單細胞跡線數目，右側 ：DMSO (197)、100nM PF3600 (242)、1μM阿貝西利(390)、100nM PF3600+1μM阿貝西利(270)。 圖3.以所指示濃度經1μM哌柏西利或9μM RO3306處理之MCF10A細胞中的DHB感測器磷酸化。單細胞跡線數目：DMSO (39)、哌柏西利(72)及RO3306 (43)。細胞在分裂後期之後5至6小時接受藥物。 圖4A至圖4D：CDK2受質磷酸化在CDK2抑制時之短暫損失及反彈。(A)及(B) MCF10A細胞經100nM PF3600處理所指示時間，且針對(A)磷酸-Rb或(B)磷酸-核仁素進行固定及染色。使用Hoechst來定量個別細胞中之DNA含量。針對具有3至4N DNA含量之細胞定量平均核信號，且將其標繪為右側之機率密度直方圖。(C)西方墨點展示在經PF3600處理所指示時間之後的MCF10A細胞中之所選CDK2受質的磷酸化水準。β-微管蛋白及GAPDH充當內參照物。帶強度經定量且標繪為條形圖。資料表示兩個生物學重複。(D)在經PF3600處理之後的磷酸化肽之無偏性整體分析。MCF7細胞經25nM PF3600處理，且藉由蛋白質體學評估磷酸化肽之所得調節。展示在1小時處理(p＜0.05)之後含有極少CDK共有模體(SP或TP)的經顯著調節之磷酸化肽及彼等相同肽在24小時處的命運。相對於DMSO對照標繪資料。

圖5A至圖5D：哌柏西利消除CDK2受質之補償性磷酸化。(A)及(B)經DMSO、PF3600、PF3600+9µM RO3306或PF3600+1µM哌柏西利處理之MCF10A、RPE-hTERT及MCF7細胞中的DHB感測器磷酸化。對於MCF10A及RPE-hTERT，使用100nM PF3600；對於MCF7，使用25nM PF3600。細胞經成像，且如圖1B中所標繪。豎直散列條形圖表示藥物添加之時間。(C)西方墨點展示在經100nM PF3600及1µM哌柏西利共同處理所指示時間之後的MCF10A細胞中之所選CDK2受質的磷酸化水準。β-微管蛋白及GAPDH充當內參照物。根據圖4C再製白色條形圖。資料表示兩個生物學重複。(D) MCF10A細胞經100nM PF3600 +1µM哌柏西利處理所指示時間，且針對磷酸-Rb或磷酸-核仁素進行固定及染色。針對具有3至4N DNA含量之細胞定量平均核信號，且將其標繪為機率密度直方圖。陰影直方圖表示根據圖4A及圖4B再製的在對應時間點處進行PF3600單處理之後的磷酸-Rb或磷酸-NCL分佈。 圖6A至圖6F：CDK4/6/週期素D之基因敲落減少CDK2受質之補償性磷酸化。(A)在經以下siRNA轉染之後20小時經DMSO或PF3600處理之MCF10A及MCF7中的DHB感測器磷酸化：非靶向CDK4、CDK6或CDK4及CDK6。豎直黑線標記PF3600添加之時間(100nM PF3600針對MCF10A；25nM PF3600針對MCF7)。(B) 標繪於(A)中之個別MCF10A (頂部)及MCF7 (底部)細胞的DHB C/N單細胞跡線。在藥物處理之後的任何其他有絲分裂由C/N比率之急劇下降來標註。DHB C/N比率之逐漸下降表示未經有絲分裂之DHB的去磷酸化。(C)在經以下siRNA轉染之後6小時經DMSO或PF3600處理之MCF10A及MCF7中的DHB感測器磷酸化：非靶向CCND1、CCND2、CCND3，或CCND1、CCND2及CCND3 (MCF10A)或CCND1與CCND3 (MCF7)之組合基因敲落。由於MCF7細胞不表現週期素D2，因而MCF7實驗省略CCND2基因敲落。(D)所指示CDK及D型週期素在所指示時間處回應於PF3600處理(100nM針對MCF10A，25nM針對MCF7)之西方墨點分析。藉由SDS-PAGE分析全細胞萃取物。對照組樣本經標記為0 h。組織蛋白H3用作內參照物。(E)代表性mRNA FISH影像展示所指示時間處MCF10A或MCF7細胞中之CCND1、CCND2、CCND3、CDK4及CDK6 mRNA回應於PF3600處理的表現。核經Hoechst染料染色，且顯示呈青色；mRNA呈紫紅色。(F) (E)中之mRNA FISH資料的定量。誤差條指示多個影像之標準差。 圖7A至圖7C：Cdk2去除增加在Kras^G12V /Trp53^-/- 驅動肺腫瘤中對哌柏西利之敏感性。(A)Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L 小鼠之平均腫瘤體積倍數變化(如藉由CT掃描量測)之定量。在用哌柏西利(70mg/kg)處理之後28天處進行量測。在各群組中分析之腫瘤數目經指定為『n』。平均腫瘤體積倍數變化經計算為最終腫瘤體積除以初始腫瘤體積。誤差條指示SEM。(B)針對所指示生物標記探測圖7A中所描繪之經哌柏西利處理之Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L 小鼠之腫瘤的西方墨點且進行定量。p 值來自雙樣本t 測試。(C)來自Kras^+/LSLG12V ;Trp53^L/L 小鼠之各群組的所指示數目個腫瘤(n)之平均腫瘤體積倍數變化的定量。Cdk2狀態經指示為野生型(Cdk2^+/+ )或缺失型(Cdk2^-/- )。藉由CT掃描量測腫瘤體積。平均腫瘤體積倍數變化經計算為以A 為單位。誤差條指示SEM。 圖8A至圖8C：(A) MCF10A及MCF7細胞經增加劑量之PF3600處理1小時，且藉由ELISA量測磷酸-Rb (S807/811)。資料表示自根據藥物濃度進行重複量測所獲得之平均值及標準差。(B)以經DMSO或1µM哌柏西利處理1小時之個別MCF10A或MCF7細胞中之總Rb標準化的平均核磷酸-Rb S807/S811信號強度之密度散佈圖。使用Hoechst染料之總核強度定量DNA含量。(C)個別MCF10A、RPE-hTERT、MCF7及OVCAR3細胞之DHB C/N單細胞跡線。若細胞在藥物添加之前t 小時完成分裂後期，則選擇該等細胞來標繪，其中選擇t 來捕獲在藥物添加時處於細胞週期半途(基於分裂間期時間)之細胞。單細胞跡線數目：MCF10A：DMSO (53)、25nM PF3600 (72)、100nM PF3600 (66)。MCF7：DMSO (100)、25nM PF3600 (100)、100nM PF3600 (100)。RPE-hTERT：DMSO (71)、25nM PF3600 (68)、100nM PF3600 (62)。OVCAR3：DMSO (19)、25nM PF3600 (29)、100nM PF3600 (23)。標記在藥物處理之後的任何額外有絲分裂。 圖9A至圖9F：(A)及(B) 野生型RPE-hTERT (B)或在兩個Cdk2對偶基因中之守門殘基處具有CDK2基因體突變之RPE-hTERT細胞(RPE-hTERT CDK2^F80G/F80G ) (A)中的DHB感測器磷酸化。細胞在分裂後期後之所指示時間窗處經DMSO或10µM之ATP類似物3MB-PP1處理，且成像並如圖1B中所標繪。(C) RPE-hTERT CDK2^F80G/F80G 經10µM 3MB-PP1處理1小時，且用磷酸-NBS1抗體進行固定及染色。展示核磷酸-NBS1信號之直方圖。合併來自兩個技術複本之資料。(D)野生型RPE-hTERT細胞中之DHB感測器磷酸化。細胞在分裂後期後之所指示時間窗處經100nM PF3600處理，且成像並如圖1B中所標繪。(E)野生型RPE-hTERT與RPE-hTERT CDK2^F80G/F80G 細胞中之DHB感測器磷酸化。細胞在分裂後期後之所指示時間窗處經9µM RO3306處理，且成像並如圖1B中所標繪。(F)經25 nM PF3600處理1小時或24小時之MCF7細胞相對於DMSO對照中的蛋白質標準化磷酸-蛋白質體變化。各磷酸化肽以其在類似條件下所測定之總細胞含量進行標準化。黑色球突出顯示在1小時時間點處具有顯著減小之磷酸-肽，該等磷酸-肽一般在24小時時間點處返回至基線水準。

圖10A至圖10C：(A) MCF10A細胞經100nM PF3600+9µM RO3306處理所指示時間，且針對磷酸-Rb或磷酸-核仁素進行固定及染色。針對具有3至4N DNA含量之細胞定量平均核信號，且將其標繪為機率密度直方圖。陰影直方圖表示根據圖4A及圖4B再製的在對應時間點處進行PF3600單處理之後的磷酸-Rb或磷酸-NCL分佈。(B)來自圖5B的經PF3600加帕柏西利處理之個別MCF10A、RPE-hTERT及MCF7細胞之DHB C/N單細胞跡線。(C)如所指示進行處理之MCF10A、RPE-hTERT及MCF7之對應於圖5B的增殖資料。以第一成像框中之細胞數目對細胞計數進行標準化。合併三個技術複本之資料。豎直黑線標記藥物添加之時間。應注意，歸因於有絲分裂細胞在培養基變化時之損失，可能在媒劑或藥物添加時出現細胞計數之微動。 圖11A至圖11F：(A)驗證在所指示siRNA處理之後的MCF10A及MCF7中之CDK4及CDK6之損失的西方墨點。在siRNA之轉染後24小時收集裂解物。β-微管蛋白或組織蛋白H3用作內參照物。(B)在經以下siRNA處理之後的MCF10A或MCF7細胞中之DHB感測器磷酸化：非靶向CDK4、CDK6或CDK4及CDK6。緊接在siRNA轉染之後開始對細胞進行連續成像50小時。(C)驗證在所指示siRNA處理之後的MCF10A及MCF7中之週期素D1、D2、D3之損失的西方墨點。在轉染後將裂解物收集24小時。β-微管蛋白、GAPDH或組織蛋白H3用作內參照物。(D)在經以下siRNA處理之後的MCF10A或MCF7細胞中之DHB感測器磷酸化：非靶向CCND1、CCND2、CCND3，同時CCND1、D2及D3 (MCF10A)，或同時CCND1及D3 (MCF7)基因敲落。(E)標繪於圖6C中之個別MCF10A (頂部)及MCF7 (底部)細胞的DHB C/N跡線。在藥物處理之後的任何其他有絲分裂由C/N比率之急劇下降來標註。DHB C/N比率之逐漸下降表示未經有絲分裂之DHB的去磷酸化。(F)在經100nM PF3600處理24小時之後的MCF10A細胞中之週期素D3-CDK4及週期素D3-CDK6蛋白相互作用增加。使用針對CDK4或CDK6之抗體對CDK週期素複合物進行免疫沈澱。兔IgG用於模擬免疫沈澱(IgG)。藉由西方墨點來測定免疫沈澱物及輸入物(InP)中之週期素D3及CDK含量。

Claims (16)

1. 一種CDK2抑制劑之用途，其用於製造用於治療癌症之藥物，其中該藥物進一步包含治療有效量之CDK4/6抑制劑，或與治療有效量之CDK4/6抑制劑組合使用。
2. 如請求項1之用途，其中該癌症之特徵在於腫瘤細胞增殖依賴CDK2。
3. 如請求項1或2之用途，其中該治療有效量之該CDK4/6抑制劑防止由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。
4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該CDK4/6抑制劑係選自由以下組成之群：阿貝西利(abemaciclib)、利波西利(ribociclib)、哌柏西利(palbociclib)、勒羅西利(lerociclib)、曲拉西利(trilaciclib)、SHR-6390及BPI-16350，或其醫藥學上可接受之鹽。
5. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該CDK2抑制劑係選自由以下組成之群：6-(二氟甲基)-8-[(1R ,2R )-2-羥基-2-甲基環戊基]-2-{[1-(甲磺醯基)哌啶-4-基]胺基}吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7(8H )-酮(PF-06873600)、嘧西利(miciclib)、因帝替尼(inditinib)及FN-1501，或其醫藥學上可接受之鹽。
6. 如請求項1至5中任一項之用途，其中依序、並行或同時投與該CDK2抑制劑及該CDK4/6抑制劑。
7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽。
8. 如請求項1至7中任一項之用途，其中該CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。
9. 一種CDK2抑制劑之用途，其用於製造用於抑制細胞中由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化的藥物，其中該藥物進一步包含CDK4/6抑制劑或與CDK4/6抑制劑組合使用，其中該CDK4/6抑制劑之量有效抑制由CDK4及/或CDK6所介導之回應於CDK2抑制的反彈磷酸化。
10. 如請求項9之用途，其中該細胞為癌細胞。
11. 如請求項10之用途，其中該癌細胞之特徵在於腫瘤細胞增殖依賴CDK2。
12. 如請求項9至11中任一項之用途，其中該CDK4/6抑制劑係選自由以下組成之群：阿貝西利、利波西利、哌柏西利、勒羅西利、曲拉西利、SHR-6390及BPI-16350，或其醫藥學上可接受之鹽。
13. 如請求項9至12中任一項之用途，其中該CDK2抑制劑係選自由以下組成之群：PF-06873600、嘧西利、因帝替尼及FN-1501，或其醫藥學上可接受之鹽。
14. 如請求項9至13中任一項之用途，其中向有需要之個體依序、並行或同時投與該CDK2抑制劑及該CDK4/6抑制劑。
15. 如請求項9至14中任一項之用途，其中該CDK2抑制劑為PF-06873600或其醫藥學上可接受之鹽。
16. 如請求項9至15中任一項之用途，其中該CDK4/6抑制劑為哌柏西利或其醫藥學上可接受之鹽。

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