EA023999B1 - Ингибиторы csf-1r для лечения опухолей головного мозга - Google Patents

Ингибиторы csf-1r для лечения опухолей головного мозга Download PDF

Info

Publication number
EA023999B1
EA023999B1 EA201391629A EA201391629A EA023999B1 EA 023999 B1 EA023999 B1 EA 023999B1 EA 201391629 A EA201391629 A EA 201391629A EA 201391629 A EA201391629 A EA 201391629A EA 023999 B1 EA023999 B1 EA 023999B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tumor
cells
compound
brain
mice
Prior art date
Application number
EA201391629A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391629A1 (ru
Inventor
Дилан Дэниел
Джоанна Джойс
Джеймс Саттон
Original Assignee
Новартис Аг
Слоан-Кеттеринг Инститьют Фор Кэнсер Рисерч
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Аг, Слоан-Кеттеринг Инститьют Фор Кэнсер Рисерч filed Critical Новартис Аг
Publication of EA201391629A1 publication Critical patent/EA201391629A1/ru
Publication of EA023999B1 publication Critical patent/EA023999B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение описывает способ лечения ассоциированных с опухолью макрофагов и микроглии у субъекта-млекопитающего, имеющего мультиформную глиобластому, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулыили его фармацевтически приемлемой соли.

Description

Раковые опухоли головного мозга и нервной системы являются одними из самых сложных для лечения. Прогноз для пациентов с этими опухолями зависит от типа и месторасположения опухоли, так же как от стадии ее развития. Для многих типов рака головного мозга средняя предполагаемая продолжительность жизни после появления симптомов может составлять месяцы или один год или два. Лечение состоит, прежде всего, из хирургического удаления и лучевой терапии; также применяют химиотерапию, но диапазон подходящих химиотерапевтических агентов ограничен, возможно, поскольку большинство терапевтических агентов не проникает достаточно сквозь гематоэнцефалический барьер для лечения опухоли головного мозга. Применение известной химиотерапии наряду с хирургией и облучением редко сильно увеличивает продолжительность жизни по сравнению с результатом только от хирургии и облучения. Таким образом, необходимы улучшенные возможные терапевтические способы лечения опухолей головного мозга.
Глиомы представляют собой распространенный тип опухолей головного мозга. Они появляются из вспомогательной нервной ткани, состоящей из глиальных клеток (отсюда название глиома), которые поддерживают положение и функцию нейронов. Глиомы классифицируют по типу глиальных клеток, на которые они похожи: астроцитомы (включая глиобластомы) напоминают глиальные клетки звездчатые астроциты, олигодендроглиомы напоминают глиальные клетки олигодендроциты; и эпендимомы напоминают глиальные клетки эпендимоциты, которые образуют внутреннее покрытие желудочков для жидкости в головном мозге. В некоторых случаях опухоль может содержать смесь этих типов клеток, и тогда она называется смешанной глиомой.
В настоящее время типичным лечением опухолей головного мозга является хирургическое удаление большей части опухолевой ткани, которое может быть осуществлено инвазивной хирургией или с применением биопсии или экстракционными способами. При этом глиомы имеют тенденцию распространяться нерегулярно, случайным образом, и поэтому их очень трудно удалить полностью. В результате, почти всегда вскоре после удаления опухоли возникает рецидив. Лучевая терапия и/или химиотерапия могут быть применены в комбинации с хирургическим удалением, но они, в целом, обеспечивают только небольшое увеличениепродолжительности жизни. Например, недавняя статистика показала, что только приблизительно половина пациентов в США, у которых диагностировали глиобластому, оставались живы спустя один год после установления диагноза, и только приблизительно 25% оставались все еще живы через два года, даже когда их лечили по современным стандартам лечения комбинированной терапией.
Мультиформная глиобластома (МФГ) является наиболее распространенной первичной опухолью головного мозга у взрослых и печально общеизвестной за ее летальность и недостаточный отклик на современные подходы лечения. К сожалению, за последние годы не было никаких существенных улучшений в подходах к лечению, и были минимальные улучшения в прогнозах продолжительности жизни пациентов с МФГ. Таким образом, остается острая необходимость в улучшенных способах лечения заболеваний раком головного мозга, таких как глиомы.
Глиомы развиваются в сложной микросреде тканей, состоящей из многих различных типов клеток в мозговой паренхиме в дополнение к собственно раковым клеткам. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) являются одними из значительно представленных типов стромальных клеток и часто составляют существенную часть клеток в опухолевых тканях. Их происхождение не является определенным: эти ОАМ могут происходить или от микроглии, постоянной популяции макрофагов в головном мозге, или они могут быть привлечены с периферии.
ОАМ могут модулировать инициацию опухоли и ее прогрессию тканеспецифичным образом: кажется, что они подавляют развитие опухоли в некоторых случаях, но в большинстве исследований до настоящего времени они усиливали развитие опухоли. В действительности, приблизительно в 80% случаев опухолей, в которых имеет место усиленная инфильтрация макрофагами, повышенные уровни ОАМ ассоциированы с более активно развивающимся заболеванием и плохим прогнозом для пациента. Несколько исследований показали, что глиомы у человека также демонстрируют значительное увеличение в числе ОАМ, что коррелирует с поздней стадией развития опухоли, и ОАМ, как правило, являются преобладающим типом иммунных клеток в глиомах. Однако функция ОАМ в происхождении глиомы остается плохо изученной, и до сих пор неизвестно, является нацеливание на эти клетки эффективной терапевтической стратегией. В действительности, антагонистическое действие на рост опухоли приводилось в литературе, в некоторых случаях даже там, где подобную экспериментальную стратегию применяли для истощения макрофагов в той же самой ортотопической модели имплантации глиомы. В некоторых исследованиях ΤΝΡ-α или интегрин β3, вырабатываемые ОАМ, были вовлечены в подавление роста глиомы, тогда как в других отчетах ССЬ2 и МТ1-ММР были предложены в качестве усилителей развития опухоли и ее прорастания.
Ингибирование передачи сигнала С8Р-1К представляет собой новый, трансляционно-значимый подход, который применяли в нескольких онкологических контекстах, включая ксенотрансплантат опухоли внутри большеберцовой кости. Однако его эффективность при опухолях головного мозга еще не была показана. Некоторые виды немозговых опухолей лечили путем целенаправленного воздействия
- 1 023999 лекарственными соединениями на множество типов клеток, которые ассоциированы с опухолевыми клетками или поддерживают их, а не путем целенаправленного воздействия на собственно опухолевые клетки. Например, РЬХ3397, как показано, совместно ингибирует три мишени (ΡΜ8, Κίΐ и РИЗ-ΙΤΌ) и понижающим образом регулирует различные типы клеток, включая макрофаги, микроглию, остеокласты и тучные клетки. РЬХ3397 тестировали при лечении лимфомы Ходжкина. Однако согласно литературе по РЬХ3397 лимфома Ходжкина хорошо откликается на различные химиотерапии, в то время как опухоли головного мозга являются намного более устойчивыми к химиотерапиям и не поддаются успешному лечению. При этом, как показано в настоящем описании, ингибитор С8Р-1Р не обладает прямым действием на пролиферацию клеток глиобластомы в культуре, и он не снижает число макрофагальных клеток в опухолях животных, проходящих лечение. Таким образом, удивительно, что, как также продемонстрировано в настоящем описании, ингибитор С8Р-1К может эффективно затормаживать рост опухолей головного мозга ίη νίνο, приводить к сокращению объема опухоли на поздних стадиях МФГ и даже заметно уничтожать некоторые глиобластомы.
Описание вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение основано на демонстрации того, что опухоли головного мозга, в частности глиобластомы, можно лечить ингибитором С8Р-1К Эффективность ингибиторов С8Р-1К, приведенная в настоящем описании, считается результатом ингибирования ими определенных активностей ОАМ, даже при том, что это, по всей видимости, не снижает значительно количество присутствующих ОАМ и вероятно также является функцией продемонстрированной способности этих соединений эффективно проникать сквозь гематоэнцефалический барьер у пациентов с опухолью головного мозга. Эти способы предоставляют крайне необходимые новые терапевтические возможности для пациентов, у которых диагностированы опухоли головного мозга, особенно глиобластомы.
Колониестимулирующий фактор-1 (С8Р-1), также называемый макрофагальным колониестимулирующим фактором (М-С8Р), передает сигнал через свой рецептор С8Р-1К (также известный как е-ΡΜδ), чтобы регулировать дифференциацию, пролиферацию, привлечение и выживание макрофагов. Разработаны небольшие молекулы-ингибиторы С8Р-1К, которые блокируют фосфорилирование рецептора путем конкурентного связывания с АТФ на активном сайте, как для других ингибиторов рецепторной тирозинкиназы. В настоящем изобретении применяется мощный, избирательный С8Р-1К ингибитор, который проникает через гематоэнцефалический барьер (ВВВ), чтобы заблокировать передачу сигнала С8Р-1К в глиоме, как показано в модели возникновения глиомы мыши ВСЛ8-РОСР-В-НА/№51п1-Ту-а:1пк4а/АгГ'-. Эта генетически спроектированная модель глиомы идеальна для доклинических испытаний в качестве модели для МФГ человека, поскольку она повторяет все черты глиобластомы человека в иммунокомпетентном окружении. Поскольку она довольно хорошо моделирует МФГ человека и проневральный МФГ, в частности, предполагается, что эффективность действия в этой модели соотносится с эффективностью клинического действия на глиобластомы у человека, такие как мультиформные глиобластомы и смешанные глиомы.
Настоящее изобретение может практиковать с любым ингибитором С8Р-1К, способным проникать сквозь головной мозг. Некоторые такие соединения представляют собой 6-О-замещенный бензоксазол и соединения бензотиазола, раскрытые в АО 2007/121484, в частности соединения формулы 11а и 11Ь по этой ссылке и соединения, раскрытые в настоящем описании.
В одном аспекте настоящее изобретение описывает способ лечения ассоциированных с опухолью макрофагов и микроглии у субъекта-млекопитающего, имеющего мультиформную глиобластому, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы
или его фармацевтически приемлемой соли.
Способ может быть применен для лечения пациента-человека, у которого диагностирована опухоль головного мозга. Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А представляет собой график, показывающий относительные количества живых ΌΑΡΙпозитивных клеток в нормальном головном мозге и ткани глиобластомы, измеренные по повышенной пропорции клеток, положительно окрашиваемых по С.П45 (пан-лейкоцитарный маркер) и СЭ11Ь (маркер миелоидных клеток) в опухолевой ткани. Также показаны данные о флюоресцентной сортировке клеток (РЛС8).
Фиг. 1В изображает окрашенные по С.П68 клетки головного мозга из нормальной мозговой ткани и из глиобластомы стадии IV и показывает обильную макрофагальную инфильтрацию в ткани опухоли. См. пример 1.
Фиг. 1С изображает повышенный уровень мРНК для С.П68. С8Р-1К и С8Р-1 относительно консти- 2 023999 тутивного гена убиквитина С (ЦЪе) для ткани МФГ относительно нормальной мозговой ткани.
Фиг. 1Ό показывает относительные количества СЭ11Ъ. ТУА, С8Р-1 и С8Р-1К в ОАМ относительно опухолевых клеток.
Фиг. 2 изображает количество ΒΡΖ945 в плазме, мозговой ткани из левой половины мозга, содержащей МФГ, и из правой половины того же самого мозга без видимой МФГ в несколько моментов времени после лечения групп мышей при помощи ΒΡΖ945.
Фиг. ЗА показывает ингибирование фосфорилирования С8Р-1К посредством ΒΡΖ945 после стимулирования С8Р-1 в макрофагальных клетках, полученных из костного мозга (ΒΜΌΜ).
Фиг. ЗВ показывает скорость удвоения популяции необработанных клеток ΒΜΌΜ и демонстрирует, что воздействие на клетки с 67 нМ ΒΡΖ945 так же влияет на эту скорость, как отсутствие С8Р-1 стимулирования.
Фиг. ЗС-ЗЕ показывают скорость пролиферации клеток ΒΜΌΜ из 1ик4а/Аг£ мыши, нормальных клеток головного мозга мыши СКР-2647 и для двух клеточных культур МФГ мыши.
Фиг. ЗР показывает, что 670 нМ ΒΡΖ945 не влияли на общее количество и размер нейросфер.
Фиг. 4А изображает бессимптомное выживание мышей ΚΟΑ3-ΡΌΟΡ-Β-ΗΑ/Νθ8ίίη-Τν-α; 1ик4а/АгР/-, которым вводили только растворитель-плацебо или растворитель + ΒΡΖ945. См. пример 4.
Фиг. 4В изображает стадию опухоли для мышей, которые проходили и не проходили лечение, в конце 26-недельного исследования. Все контрольные мыши имели опухоли III или IV стадии.
Фиг. 5А показывает данные по размерам опухолей, измеренных при помощи ΜΚΙ (МРТ), для животных, которые проходили лечение, и контрольных животных в течение первых 6 дней введения ΒΡΖ945.
Фиг. 5В показывает объем опухолей для отдельных контрольных мышей (верхний график) и мышей, которые проходили лечение (график ниже), в течение первых 6 дней после начала введения доз ΒΡΖ945.
Фиг. 5С и 5Ό изображают объемы опухоли, измеренные при помощи ΜΚΙ, у животных, которым вводили ΒΡΖ945, начиная с больших опухолей (объем >40 ммЗ), и показывают, что даже при больших опухолях объемы опухолей уменьшались почти у всех пациентов.
Фиг. 5-2 показывает данные по объему опухоли для отдельных животных в контрольной группе из примера 5 (5-2А) и группе, которая проходила лечение (5-2В), и фиг. 5-2С показывает данные о размере опухоли для пациентов с большой опухолью, которым вводили ΒΡΖ945, в примере 5.
Фиг. 6 - первый график показывает процент клеток Θ1ί§2+ в головном мозге животных в группах, которым вводили чистый растворитель плацебо, лекарственное средство, и в группе с большой опухолью из примера 5. Второй график показывает фракцию опухолевых клеток, которые активно делились, как измерено при помощи бромодиоксиуридиновой (БДУ) метки. Третий график показывает уровень апоптоза в опухолевых клетках, как измерено путем окрашивания расщепленной каспазы З (ССЗ), и демонстрирует, что ΒΡΖ945 вызывает апоптоз опухолевых клеток.
Фиг. 7А показывает стадии, применяемые для РАС8 разделения клеток для анализа экспрессии генов в примере 7.
Фиг. 7В показывает генную сигнатуру δνΜ для животных, которые проходили и не проходили лечение, по которой идентифицировали гены, регулируемые лечением повышающим и понижающим образом.
Фиг. 7С-7Е показывают избирательную повышающую регуляцию М2-ассоциированных генов и ЕОК.2 мишеней.
Фиг. 8А графически изображает степень повышающей регуляции и статистической значимости, примененных для классификации дифференциально экспрессирующихся генов в генной сигнатуре δνΜ.
Фиг. 8В показывает регрессию Лассо сигнатуры 5 генов.
Фиг. 8С показывает прогноз генной сигнатуры по регрессии Лассо для проневральных опухолей МФГ в наборе данных ТСОА.
Фиг. 8Ό показывает прогноз генной сигнатуры по регрессии Лассо для проневральных опухолей МФГ в объединенном наборе данных.
Фиг. 8Е показывает прогноз генной сигнатуры δνΜ для проневральных опухолей МФГ в наборе данных ТСОА.
Фиг. 8Р показывает прогноз генной сигнатуры δνΜ для проневральных опухолей МФГ в объединенном наборе данных.
Фиг. 8О изображает соотношения рисков сигнатуры гена ΒΡΖ945 для ТСОА и объединенных наборов данных для проневральных, классических, мезенхимальных и невральных МФГ опухолей и подчеркивает статистическую корреляцию с проневральной МФГ по всем данным.
Подробное описание
Настоящее изобретение описывает соединения формулы (I) для применения при лечении опухолей головного мозга и способы применения соединений формулы (I) для лечения опухолей головного мозга. Соединения формулы (I) имеют такую формулу
в которой К1 представляет собой алкилпиразол или алкилкарбоксамид; и К2 представляет собой гидроксициклоалкил;
и включают фармацевтически приемлемые соли, также как нейтральные соединения с этой формулой.
Конкретные соединения в объеме настоящего изобретения дополнительно описаны ниже.
Лечение опухоли головного мозга может включать снижение скорости роста опухоли головного мозга (замедление роста опухоли), или инверсию роста опухоли головного мозга (т.е. сокращение объема опухоли), или существенное устранение опухоли, что было продемонстрировано лечением, приведенным в настоящем описании, у мышей с такими опухолями. В частности, лечение может замедлить развитие или вызвать инверсию развития глиобластомы. Оно может быть применено совместно с другими терапиями, включая удаление основного объема опухоли головного мозга, и может быть применено для замедления или инверсии роста или сокращения объема или массы остаточной опухолевой ткани после удаления опухоли головного мозга хирургическим путем или путем биопсии. Соединения также могут быть применены совместно с другими химиотерапиями.
Соединения формулы (I) включают соединения, в которых К1 представляет собой алкилзамещенный пиразол или карбоксамид, например С1-С4 алкилпиразол или карбоксамид по формуле Ο(Θ)ΝΗΚ, где К представляет собой С1-С4 алкильную группу. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения алкильная группа представляет собой Ме или ЕЕ Конкретные предпочтительные соединения для применения в настоящем изобретении раскрыты ниже. В некоторых вариантах осуществления этих способов К1 представляет собой
К' /
в которой К' представляет собой Ме или ЕЕ Предпочтительно пиразольное кольцо присоединено в положении 4, т.е.
К' /
В этих соединениях К2 может представлять собой гидроксициклогексильную группу, такую как
или 2-гидроксициклопент-1-ильную группу.
Конкретные предпочтительные соединения включают любые соединения из следующих, или смесь любых двух или более из этих соединений, или фармацевтически приемлемую соль любого из них
- 4 023999
Каждое из этих соединений и их фармацевтически приемлемых солей является предпочтительным в целях осуществления вариантов настоящего изобретения. Предпочтительные варианты осуществления этих соединений также включают соединения по этим формулам
где К' представляет собой Ме, Εΐ или пропил, предпочтительно метил. Конкретные варианты осуществ- 5 023999 ления этих соединений могут иметь (К,К) абсолютную стереохимию или (δ,δ) абсолютную стереохимию.
Предполагается, что эти соединения обладают таким же свойством проникновения сквозь гематоэнцефалический барьер, как ΒΕΖ945, на основе их очень схожих физико-химических свойств и поэтому являются подходящими для применения в способах лечения по настоящему изобретению.
Соединения формулы (I) известны в области техники, и способы их получения раскрыты, например, в \νϋ 2007/121484; их полезность для лечения глиомы и их способность проникать сквозь гематоэнцефалический барьер не были известны ранее. Соединение (1с) соответствует ΒΕΖ945, которое применяли для испытаний ίη νίΐΓο и ίη νίνο, приведенных в настоящем описании.
Соединения формулы (Ιη), обладающие (1δ,2δ) стереохимией при циклогексильном кольце, являются новыми. Эти соединения являются неожиданно хорошими ингибиторами ΡΌΟΡΚβ, также очень эффективно ингибирующими ί'.'δΡ-1Ρ (см. данные в настоящем описании). Соответственно, новые соединения этой формулы
где К' представляет собой Ме, Εΐ или пропил, представляют собой другой аспект настоящего изобретения, который обеспечивает двойное ингибирующее действие, которое, как ожидается, увеличит эффективность в способах лечения, раскрытых в настоящем описании.
Соединения могут быть применены в отдельности, или они могут быть составлены в фармацевтическую композицию, которая также содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент и часто содержит по меньшей мере два фармацевтически приемлемых эксципиента. Понятно, что фармацевтически приемлемые эксципиенты, как правило, стерилизуют. Некоторые подходящие эксципиенты раскрыты в настоящем описании; в некоторых вариантах осуществления соединение составлено в композицию в виде композиции, включающей каптисол, например, 20% каптисол.
В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга отобрана из метастаза головного мозга, астроцитомы (включая глиобластому), олигодендроглиомы, эпендимом и смешанной глиомы. В предпочтительных вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой глиому, в частности мультиформную глиобластому. В других вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой метастаз головного мозга, т.е. метастатическую опухоль, являющуюся результатом рака, который образуется в другом месте тела.
В некоторых вариантах осуществления пациентом является таковой с глиобластомой. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения пациентом является такой, у которого диагностирована проневральная глиобластома. См. Уегйаак еΐ а1., Сапсег се11 17(1):98-110 (2010). Этот подтип глиобластомы имеет тенденцию встречаться у более молодых пациентов и включать мутации ТР53, ГОН1 и ΡΌΟΡΚΑ. УегНаак еΐ а1. опубликовали, что пациенты с проневральной глиобластомой отвечали хуже, чем пациенты с другими подтипами глиобластомы (классический, невральный, мезенхимальный), на применение агрессивной химиотерапии в 2010, и даже предположили, что такое лечение может быть противопоказано этим пациентам. Способы по настоящему изобретению особенно эффективны при лечении проневральной глиобластомы, как продемонстрировано моделью животных с проневральной МФГ, примененной в настоящем описании. Обнаружено, что определенные генетические сигнатуры, найденные в ОАМ у мышей, которым вводили ΒΕΖ945, соответствуют таковым у пациентов-людей с проневральной глиобластомой, которые имели продолжительность жизни больше среднего; такая корреляция не встречалась при сравнении с пациентами, страдающими другими подтипами глиобластомы. Таким образом, информация генной сигнатуры может быть применена для выбора пациентов для лечения при помощи ингибитора СδΡ-1К, как приведено в настоящем описании, или для оценки прогноза для пациента, получающего такое лечение.
В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению для лечения пациента применяют перед другими способами лечения, такими как оперативное удаление опухоли. В других вариантах осуществления способ по настоящему изобретению для лечения пациента применяют совместно с другими способами лечения, такими как удаление опухоли как хирургическим путем, так и путем биопсии, или совместно с лучевой терапией, или совместно и с удалением опухоли, и лучевой терапией.
По желанию, могут быть применены другие химиотерапевтические агенты наряду с соединениями и способами, раскрытыми выше. Подходящие дополнительные химиотерапевтические агенты для применения в этих способах известны в области техники как традиционные для применения при лечении глиобластомы. Некоторые такие химиотерапевтические агенты включают антиангиогенные агенты, бевацизумаб с или без иринотекана, нитрозомочевины, такие как кармустин (ВСЫИ), соединения платины, такие как цис-платина (цисплатин), алкилирующие агенты, такие как темозоломид, ингибиторы тирозин- 6 023999 киназы (гефитиниб или эрлотиниб), украин и каннабиноиды. Эти дополнительные терапевтические агенты (совместная терапия) могут быть применены одновременно с С8Р-1К ингибитором путем параллельного введения, смешивания совместного терапевтического агента с С8Р-1К ингибитором или последовательного введения. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает применение соединения, выбранного из таковых по формуле I, раскрытых в настоящем описании (например, по формуле 1а, 1Ь, 1с, И, 1е, 1£, 1д или ΙΠ). в комбинации с темозоломидом или соединением платины.
Кроме того, считается, что макрофаги ответственны за сниженные терапевтические ответы при раке молочной железы и увеличенную реваскуляризацию в ксенотрансплантатах глиобластомы после лучевой терапии. Так как эти действия макрофагов снижают эффективность других способов лечения, можно ожидать, что соединения по настоящему изобретению, которые ингибируют активность макрофагов в глиобластоме ίη νίνο, обеспечат синергический эффект при применении в комбинации с другими терапевтическими агентами или лучевой терапией.
В некоторых вариантах осуществления способы, приведенные в настоящем описании, практикуются с соединением формулы (1с). В других вариантах осуществления способы можно практиковать с соединением формулы (I), которое не является таким же, как соединение формулы (1с), как и другие виды, раскрытые в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения соединение формулы (I) также ингибирует по меньшей мере одну другую мишень, чтобы обеспечить усиленное противоопухолевое действие. Например, соединения этих формул
также ингибируют ΡΌΟΡΚ в концентрациях, достигаемых в типичных терапевтических дозировках, таких как приведенные в настоящем описании. Соответственно, эти соединения могут быть применены там, где желателен двойной механизм действия, и могут быть применены в любом из способов, описанных выше.
Типовые соединения формул 1д и Ιη включены в следующую таблицу, чтобы проиллюстрировать соотносительные действия на С8Р-1К и ΡΌΟΡΚ. Многие из таких соединений известны в области техники, см. \νϋ 2007/066898, и способы получения этих соединений также известны. Соединения формулы I являются вполне активными в отношении С8Р-1К независимо от стереохимии при циклогексильном кольце, как показано в таблице ниже. Среди различных изомеров δ,δ-изомеры также являются высокоактивными в отношении ΡΌΟΡΚ-β, так же как в отношении С8Р-1К, и, таким образом, чтобы обеспечить усиленное действие могут действовать на глиомы двумя механизмами.
(Ю) СИ)
Соединение к1 Стереохимия С8Р-1К 1С-50 (мкМ) ΡϋΟΡΡ-β 1С-50 (мкМ)
1д-А Ме (1Р.2Р) 0,001 5,9
1д-В Е1 (1П.2К) 0,006 мкМ 13,9
1д-с Рг (1Р.2К) 0,008 7,7
- 7 023999
1д-0 Ме (18,28) 0,0008 0,048
1д-Е Ме (1Р,23) 0,006 6,6
|д-Р Ме (13,2Р) 0,001 0,78
ΙΜ-Α Ме (1Р,2Р) 0,0009 0,74
ΙΜ-Β Е1 (1Р,2Р) 0,003 1,7
ΙΙΊ-С Рг (1Р,2Р) 0,007 1,5
ΙΐΊ-β Ме (18,23) 0,001 0,02
ΙΜ-Ε Ме (13,2Р) 0,002 0,63
Следующие перечисленные варианты осуществления являются представительными для настоящего изобретения.
1. Способ лечения опухоли головного мозга у млекопитающего пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы (I)
в которой К1 представляет собой алкилпиразол или алкилкарбоксамид; и К2 представляет собой гидроксициклоалкил; или его фармацевтически приемлемой соли.
2. Способ варианта осуществления 1, в котором К1
в которой К' представляет собой Ме или ЕЕ
3. Способ варианта осуществления 1 или 2, в котором К2 представляет собой
4. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором опухоль головного мозга представляет собой глиому, предпочтительно проневральную глиобластому.
5. Способ варианта осуществления 4, в котором глиома представляет собой мультиформную глиобластому.
6. Способ по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения 1-3, в котором опухоль головного мозга представляет собой метастаз головного мозга, астроцитому (включая глиобластому), олигодендроглиому, эпендимомы или смешанную глиому.
7. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором соединение формулы (I) представляет собой
или их фармацевтически приемлемую соль;
или изолированный стереоизомер одного из них.
8. Способ варианта осуществления 7, в котором соединение формулы (I) представляет собой
- 8 023999
9. Способ варианта осуществления 7, в котором соединение формулы (I) представляет собой
10. Способ варианта осуществления 7, в котором соединение формулы (I) представляет собой
11. Способ варианта осуществления 7, в котором соединение формулы (I) представляет собой
12. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором способ дополнительно включает введение пациенту эффективного количества дополнительных противораковых антиангиогенные агентов, бевацизумаба с или без иринотекана, нитрозомочевин, таких как кармустин (ВСЫИ), соединений платины, таких как цис-платина (цисплатин), алкилирующих агентов, таких как темозоломид, ингибиторов тирозинкиназы (гефитиниб или эриотиниб), украина и каннабиноидов.
13. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором соединение формулы (I) вводят перорально.
14. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором количество соединения формулы (I), вводимое пациенту, составляет между приблизительно 50 и приблизительно 500 мг/кг в сутки, или между 5 и 500 мг/кг, или между 100 и 300 мг/кг в сутки.
15. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором пациент страдает от проневральной глиобластомы.
16. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором пациент выбран, поскольку пациент имеет повышенный уровень передачи сигналов ΡΌΟΡΚ или ΡΌΟΡ.
17. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором пациент одновременно проходит лечение ингибитором ΡΌΟΡΚ или лечение ингибитором С8Р-1К с субнаномолярной активностью в качестве ингибитора ΡΌΟΡΚ, например, соединением (Щ) или (II).
18. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором пациентом является человек.
19. Соединение варианта осуществления 1 для применения при лечении опухоли головного мозга.
20. Соединение варианта осуществления 19, в котором опухоль головного мозга представляет собой глиобластому.
21. Соединение варианта осуществления 20, в котором глиобластома представляет собой проневральную глиобластому.
22. Соединение варианта осуществления 20, которое составлено в композицию для применения с совместным терапевтическим агентом.
23. Соединение формулы
- 9 023999
где К' представляет собой Ме, Ε1 или пропил.
24. Соединение варианта осуществления 23, в котором К' представляет собой Ме.
25. Фармацевтическая композиция, включающая соединение варианта осуществления 23 или 24 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
Как применено в настоящем описании, термины соль или соли относятся к солям присоединения кислоты или основания соединения по настоящему изобретению. Термин соли включает, в частности, фармацевтически приемлемые соли. Термин фармацевтически приемлемые соли относится к солям, которые сохраняют эффективность биологического действия и свойства соединений по настоящему изобретению и которые, как правило, не являются биологически или иначе нежелательными.
Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с минеральными кислотами и органическими кислотами, например, такие соли как ацетат, аспартат, бензоат, бесилат, бромид/бромгидрат, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, камфорсульфонат, хлорид/хлоргидрат, хлортеофиллонат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, гиппурат, йодгидрат/йодид, изетионат, лактат, лактобионат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, манделат, месилат, метилсульфат, нафтоат, напсилат, никотинат, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигалактуронат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфосалицилат, тартрат, тозилат и трифторацетат.
Минеральные кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, соляную кислоту, бромводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т.п.
Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т.п. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы с неорганическими и органическими основаниями.
Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, аммоний и металлы из Ι-ΧΙΙ групп Периодической таблицы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения соли получают из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; в частности, подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния.
Органические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая природные замещенные амины, циклоамины, основные катионообменные смолы и т.п. Конкретные органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглумин, пиперазин и трометамин.
Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению могут быть получены традиционными химическими способами. В целом, такие соли могут быть получены путем приведения в реакцию свободных кислотных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат Να, Са, Мд или К и т.п.) или путем приведения в реакцию свободной основной формы этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующей кислоты. Такие реакции, как правило, осуществляют в воде или в органическом растворителе, или в смеси обоих. В целом, применение неводных сред, таких как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, является по возможности желательным. Списки дополнительных подходящих солей могут быть найдены, например, в КеттдЮпК рЬагтасеийса1 8С1епсе8, 20-е издание, Маек РиЫМипд Сотрапу, Истон, Пенсильвания (1985); и в НапбЬоок οί рЬагтасеиЬса1 кайк: ргорегйек, 5е1есЬоп. апб ике авторов §1аЬ1 и ХУетпПЬ (ЛУПеу-УСН, Вайнхайм, Германия, 2002).
Любая формула, приведенная в настоящем описании, предназначена для описания немаркированных форм, также как маркированных изотопами форм соединений. Маркированные изотопами соединения имеют структуры, изображенные формулами, приведенными в настоящем описании, за исключением того, что один или несколько атомов замещены атомом с выбранной атомной массой или массовым числом. Примеры изотопов, которые могут быть введены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как 2Н, 3Н, 11С, 13С, С, Ν, Ρ, Ρ, Ρ, 8, С1, I соответственно. В предпочтительных вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению являются немаркированными, т.е. они включают изотопы всех атомов в приблизительно естественном количестве. В других вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению являются маркированными путем селективного введения обогащенного не основного изотопа одного атома в соединение формулы (Ι). Настоящее изобретение включает различные маркированные изотопами соединения, как определено в настоящем описании, например, такие, в которых при- 10 023999 сутствуют радиоактивные изотопы, такие как ЗН и 14С, или такие, в которых присутствуют нерадиоактивные изотопы, такие как 2Н и 1ЗС. Такие маркированные изотопами соединения полезны в исследованиях метаболизма (с 14С), исследованиях кинетики реакций (например, с 2Н или ЗН), в техниках обнаружения или изображения, таких как позитронно-эмиссионная томография (РЕТ) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ЯРЕСТ), включая испытания распределения лекарственного агента или субстрата в тканях, или при лечении пациентов при помощи радиоактивного облучения. В частности, 18Р или маркированное соединение может быть особенно желательным для РЕТ или δΡЕСΤ исследований. Маркированные изотопами соединения формулы (I), в целом, могут быть получены традиционными способами, известными специалистам в области техники ввиду описания синтеза соединений формулы I, например, в патентной публикации США № υδ 2008/0045528 (νθ 2007/121484). ΒΕΖ945 описан по этой ссылке, так же как несколько из его изомеров. Примеры 17З и 174 по этой ссылке описывают синтез соединения пиразола Ое) с применением 1К,2К-аминоциклогексанола, и он может быть адаптирован для синтеза других соединений пиразола формулы I как маркированных, так и немаркированных. Та же самая публикация на стр. 16З описывает синтез как 1К,2К-, так и Ш^-аминоциклогексанола, которые могут быть легко замещены в способе примера 17З для получения (Н) и других соединений формулы I как маркированных, так и немаркированных.
Дополнительно замещение более тяжелыми изотопами, в частности дейтерием (т.е. 2Н или Ό), может предоставить определенные терапевтические преимущества, исходящие из большей метаболической устойчивости, например увеличенный период полураспада ίη νίνο или меньшие необходимые дозировки или улучшение терапевтического индекса. Понятно, что дейтерий в этом контексте рассматривается как заместитель соединения формулы (I). Концентрация такого более тяжелого изотопа, в частности дейтерия, может быть определена коэффициентом изотопного обогащения. Термин коэффициент изотопного обогащения, как применено в настоящем описании, обозначает соотношение между содержанием изотопа в образце и природным содержанием указанного изотопа. Если заместителем в соединении по настоящему изобретению указан дейтерий, то такое соединение имеет коэффициент изотопного обогащения на каждый указанный атом дейтерия по меньшей мере З500 (52,5% инкорпорации дейтерия при каждом указанном атоме дейтерия), по меньшей мере 4000 (60% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 4500 (67,5% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 5000 (75% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 5500 (82,5% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 6000 (90% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 6ЗЗЗ,З (95% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (97% инкорпорации дейтерия), по меньшей мере 6600 (99% инкорпорации дейтерия) или по меньшей мере 66ЗЗ,З (99,5% инкорпорации дейтерия).
Как применено в настоящем описании, термин фармацевтически приемлемые эксципиенты включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консервирующие агенты (например, бактерицидные агенты, противогрибковые агенты), изотонирующие агенты, агенты, замедляющие поглощение, соли, консервирующие агенты, стабилизаторы лекарственных средств, связывающие вещества, эксципиенты, дезинтегрирующие агенты, смазки, подслащивающие агенты, ароматизирующие агенты, краски и т.п. и их комбинации, как известно специалисту в области техники (см., например, РепипдЮп'х Рбагтасеибса1 δοίοηοοδ, 18-е издание, Μаск Ргтбид Сотрапу, 1990, стр. 1289-1З29). За исключением случаев, когда традиционный носитель несовместим с активным ингредиентом, его применение в терапевтических или фармацевтических композициях рассматривается.
Термин терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое вызывает биологический или медицинский ответ у пациента, например снижение или ингибирование активности фермента или белка, или снятие симптомов, улучшение состояния, медленное или отсроченное развитие заболевания или предотвращение заболевания и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении пациенту эффективно для (1) по меньшей мере, частичного облегчения, торможения развития, предотвращения и/или улучшения состояния или нарушения или заболевания, (ί) опосредованного СδР-1Κ, или (ίί) ассоциированного с активностью СδР-1Κ, или (ίίί) характеризующегося активностью (нормальной или патологической) СδР-1Κ; или (2) снижения или ингибирования активности СδР-1Κ; или (З) снижения или ингибирования экспрессии СδР-1Κ. В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку или ткань или неклеточный биологический материал или питательную среду является эффективным, по меньшей мере, для частичного снижения или ингибирования активности СδР-1Κ; или, по меньшей мере, частичного снижения или ингибирования экспрессии СδР-1Κ. Значение термина терапевтически эффективное количество, как проиллюстрировано в вышеуказанном варианте осуществления для СδР-1Κ, также применимо таким же образом к любым другим соответствующим белкам/пептидам/ферментам, таким как РЭОРР и т.п.
Как применено в настоящем описании, термин пациент относится к животному. Как правило, жи- 11 023999 вотное является млекопитающим. Пациент также относится, например, к приматам (например, людям, мужчине или женщине), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошками, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и т.п. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения пациент является приматом. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пациент является человеком.
Как применено в настоящем описании, термин ингибировать, ингибирование или ингибирующий относится к снижению или подавлению рассматриваемого состояния, симптома или нарушения или заболевания или значительному снижению базового уровня биологической активности или процесса.
Как применено в настоящем описании, термины лечить, лечащий или лечение любого заболевания или нарушения относятся в одном варианте осуществления к улучшению состояния заболевания или нарушения (т.е. замедление или остановка или уменьшение развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления лечить, лечащий или лечение относятся к облегчению или улучшению по меньшей мере одного физического параметра, включая такие, которые могут не быть различимыми пациентом. В еще одном варианте осуществления лечить, лечащий или лечение относятся к регуляции заболевания или нарушения как физически (например, стабилизация различимого симптома), так и физиологически (например, стабилизация физического параметра), или обоими путями. В еще одном варианте осуществления лечить, лечащий или лечение относятся к предотвращению или отсрочке начала или развития или прогрессии заболевания или нарушения. В отношении опухоли головного мозга лечение, как правило, включает как снижение скорости роста опухоли или повторного роста опухоли после удаления основной части опухоли, так и сокращение размера опухоли или остатков опухоли после удаления основной части опухоли.
Как применено в настоящем описании, пациент нуждается в лечении, если этот пациент получит от такого лечения полезный эффект с биологической, медицинской точки зрения или качества жизни. Как правило, у пациентов диагностируют опухоль головного мозга, часто в форме глиобластомы и предпочтительно мультиформной глиобластомы.
Как применено в настоящем описании, указания на единственное число и подобные термины, примененные в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), должны быть рассмотрены как охватывающие и единственное, и множественное число, если иначе не указано в настоящем описании или ясно не противоречит контексту.
Все способы, приведенные в настоящем описании, могут быть выполнены в любом удобном порядке, если иначе не указано в настоящем описании или иначе ясно не противоречит контексту. Применение любого и всех примеров или типового языка (например, такой как) в настоящем описании предназначено просто для лучшего освещения настоящего изобретения и не налагает ограничения на объем настоящего изобретения, указанный формулой изобретения.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении применяется фармацевтическая композиция, включающая соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый контроль растворителем или эксципиент.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в композицию для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение и ректальное введение и т.д. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в твердой форме (включая, без ограничения, капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или свечи) или в жидкой форме (включая, без ограничения, растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции могут быть подвергнуты обычным фармацевтическим воздействиям, таким как стерилизация, и/или могут содержать традиционные инертные разбавители, смазывающие агенты или буферирующие агенты, а также вспомогательные агенты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы и буферы и т.д.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический агент в эффективном количестве, такой как темозоломид.
Как правило, фармацевтические композиции имеют форму таблеток или желатиновых капсул, включающих активный ингредиент вместе по меньшей мере с одним эксципиентом, таким как каптисол (примененный в примерах настоящего описания), одним из следующих:
a) растворители, например лактоза, декстроза, сахароза, маннитол, сорбитол, целлюлоза и/или глицин;
b) смазки, например,кремнезем, тальк, стеариновая кислота, ее магниевая или кальциевая соль и/или полиэтиленгликоль; для таблеток также
c) связывающие вещества, например магниево-алюминиевый силикат, крахмальный клейстер, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон; по желанию,
б) носители, такие как водный растворитель, содержащий косольватирующее вещество, такое как каптисол, ПЭГ, глицерин, циклодекстрин и т.п.;
е) дезинтеграторы, например, крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль, или шипучие смеси; и/или
- 12 023999
ί) абсорбенты, пигменты, ароматизаторы и подсластители.
Таблетки могут быть либо покрытыми оболочкой, либо кишечнорастворимыми согласно способам, известным в области техники.
Предпочтительно соединение или композицию получают для перорального приема, например, в виде таблетки или капсулы, или в виде раствора или суспензии соединения формулы (I), по желанию, в упакованном виде единичной дозы, такой как капсула.
Подходящие композиции для перорального приема включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в форме таблеток, пилюль, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, получают любым способом, известным в области техники получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или более агентов, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих агентов, ароматизирующих агентов, красящих агентов и консервирующих агентов, для получения фармацевтически изящных и приятных на вкус и цвет препаратов. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые подходят для получения таблеток. Эти эксципиенты представляют собой, например, инертные растворители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, например кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; связующие вещества, например крахмал, желатин или акацию; и смазывающие агенты, например стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Таблетки не имеют покрытия или покрыты известными способами для задержки их дезинтеграции и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечения устойчивого действия в течение более длительного периода. Например, может быть применено вещество, вызывающее отсрочку, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Композиции для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например арахисовым маслом, вазелиновым маслом или оливковым маслом.
В некоторых вариантах осуществления соединение или композицию получают для введения при помощи инъекции. Определенные композиции для введения путем инъекции представляют собой водные изоосмотические растворы или суспензии, а свечи преимущественно получают из жирных эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать вспомогательные агенты, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, промоторы растворов, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически ценные вещества. Указанные композиции получают согласно традиционным способам смешивания, гранулирования или нанесения покрытия соответственно, и они содержат приблизительно 0,1-75% или приблизительно 1-50% активного ингредиента.
В некоторых вариантах осуществления соединение или композицию получают для местного применения. Подходящие композиции для трансдермального введения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для трансдермальной доставки, включают поглощаемые фармакологически приемлемые растворители для улучшения проникновения сквозь кожу хозяина. Например, устройства для трансдермального введения представляют собой бандаж, включающий подложку, резервуар, содержащий соединение, по желанию с носителями, по желанию контрольный барьер для обеспечения доставки соединения через кожу хозяина с контролируемой и предопределенной скоростью в течение длительного периода времени, предназначенный для предохранения кожи от устройства.
Подходящие композиции для местного применения, например к коже и глазам, включают водные растворы, суспензии, мази, крема, гели или распыляемые композиции, например, для доставки в виде аэрозоля и т.п. Такие системы местной доставки, в частности, будут подходящими для кожного применения, например для лечения рака кожи, например с целью профилактики в кремах для загара, лосьонах, спреях и т.п. Поэтому они, в частности, подходят для местного применения, включая косметические композиции, известные в области техники. Таковые могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, агенты, усиливающие тоничность, буферы и консерванты.
Как применено в настоящем описании, местное применение может также относиться к ингаляции или интраназальному применению. Они могут быть удобным образом доставлены в форме сухого порошка (как в отдельности, так и в виде смеси, например сухой смеси с лактозой, или частиц со смешанными составляющими, например с фосфолипидами) из ингалятора для сухих порошков или емкости со сжатым газом для получения аэрозоля, помпы, разбрызгивателя, распылителя, ингалятора с применением или без применения подходящего газа-вытеснителя.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (I) составляет между приблизительно 10 и приблизительно 500 мг/кг в сутки. В частных вариантах осуществления эффективное количество составляет между приблизительно 25 и приблизительно 300 мг/кг в сутки, такое как от приблизительно 100 до приблизительно 250 мг/кг в сутки. Доза может быть введена за 1-4 раза в
- 13 023999 сутки, или она может быть введена в чередующиеся дни. В предпочтительном варианте осуществления доза составляет приблизительно 200 мг/кг в сутки и вводится за один или два пероральных приема в сутки.
Настоящее изобретение дополнительно описывает безводные фармацевтические композиции и дозировочные формы, включающие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, так как вода может способствовать разложению определенных соединений.
Безводные фармацевтические композиции и дозировочные формы по настоящему изобретению могут быть получены с применением безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги или в условиях низкой влажности. Безводная фармацевтическая композиция может быть получена и сохранена таким образом, чтобы поддерживалось ее безводное состояние. Соответственно, безводные композиции упаковывают с применением материалов, которые, как известно, предотвращают контакт с водой, так, что они могут быть включены в состав соответствующих формулярных наборов. Примеры подходящих упаковок включают, но не ограничены ими, герметично запаянную фольгу, пластики, емкости для единичной дозы (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные упаковки.
Настоящее изобретение дополнительно описывает фармацевтические композиции и дозировочные формы, которые включают один или более агентов, которые снижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента разлагается. Такие агенты, которые указаны в настоящем описании как стабилизаторы, включают, но не ограничены ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН буфер или солевой буфер и т.д.
Соединения и способы, приведенные в настоящем описании, полезны для лечения множества видов опухолей головного мозга на основе их продемонстрированной способности проникать через гематоэнцефалический барьер и ингибировать накопление ОАМ в и/или вокруг опухоли в головном мозге. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль головного мозга представляет собой метастаз рака, который образуется в другом месте тела. В других вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль головного мозга представляет собой глиому, такую как мультиформная глиобластома.
Соединения формулы I в свободной форме или в форме соли проявляют ценные фармакологические свойства, например свойства регуляции С8Р-1К и по желанию РЭСБК. например, как указано в ίη νίίτο и ίη νίνο испытаниях, описанных в следующих секциях, и поэтому показаны для терапии.
Таким образом, в качестве дополнительного варианта осуществления настоящее изобретение описывает применение соединения формулы (I) в терапии. В дополнительном варианте осуществления терапия выбрана для лечения заболевания, которое лечится ингибированием С8Р-1К. В другом варианте настоящего изобретения заболевание выбрано из вышеуказанного списка, соответственно, любая опухоль головного мозга, более подходяще, глиобластома, такая как мультиформная глиобластома.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение описывает способ лечения заболевания, которое лечится ингибированием С8Р-1К, включая назначение терапевтически приемлемого количества соединения формулы (I) или по любому из вариантов осуществления этих соединений, раскрытых в настоящем описании. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание выбрано из вышеуказанного списка, соответственно, опухолей головного мозга, таких как глиомы, конкретно, включая мультиформную глиобластому.
Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению могут быть в единичной дозе приблизительно 1-1000 мг активного ингредиента(ов) для пациента массой приблизительно 5070 кг, или приблизительно 1-500 мг, или приблизительно 1-250 мг, или приблизительно 1-150 мг, или приблизительно 0,5-100 мг, или приблизительно 1-50 мг активных ингредиентов.
Терапевтически эффективная доза соединения, фармацевтическая композиция или их комбинации зависят от вида пациента, веса тела, возраста и индивидуального состояния, лечимого нарушения или заболевания или их тяжести. Такие специалисты как врач, клинический врач или ветеринар могут легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для лечения или остановки прогрессирования нарушения или заболевания, на основе настоящего раскрытия.
Вышеназванные свойства дозировок демонстрируются в ίη νίίτο и ίη νίνο испытаниях с применением преимущественно млекопитающих, например мышей, крыс, собак, обезьян, или изолированных органов, тканей и их препаратов. Соединения по настоящему изобретению могут быть применены ίη νίίτο в форме растворов, например водных растворов, и ίη νίνο, и энтерально и парентерально, преимущественно внутривенно, например, в виде суспензии или в водном растворе. Дозировка ίη νίίτο может варьировать между приблизительно 10-3 и 10-9 молярными концентрациями. Терапевтически эффективное количество ίη νίνο может варьировать в зависимости от пути введения приблизительно 0,1-500 мг/кг, как правило, 10-400 мг/кг, или приблизительно 100-300 мг/кг, или между 1-100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза, составляющая приблизительно 200 мг/кг, подходит для лечения глиобластомы и может быть введена перорально.
Действие соединения по настоящему изобретению может быть оценено следующими ίη νίίτο и ίη νίνο способами.
При помощи способов испытательного анализа, описанных в И8 20080045528, можно показать, что
- 14 023999 соединения по настоящему изобретению ингибируют С8Р-1К. Как описано в настоящем описании, эти соединения легко проникают сквозь гематоэнцефалический барьер, а также ингибируют или вызывают обратный процесс роста опухоли в головном мозге. Предпочтительно опухоль обнаруживают известными способами, и за прогрессом лечения можно наблюдать известными способами. В некоторых вариантах осуществления за прогрессом лечения наблюдают с применением МРТ (магнитно-резонансная томография), чтобы определить размер опухоли и наличие каких-либо метастазов.
Соединение по настоящему изобретению может быть введено как одновременно, так и до или после введения одного или более других терапевтических агентов, таких как совместимые терапевтические агенты, приведенные в настоящем описании. Соединение по настоящему изобретению может быть введено отдельно тем же самым или другим путем, или вместе в одной фармацевтической композиции с другими агентами.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение описывает продукт, включающий соединение формулы (I) и по меньшей мере один другой терапевтический агент в виде объединенного препарата, для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения терапия представляет собой лечение заболевания или состояния, опосредованного ингибированием С8Р-1К Продукты, предоставленные в виде объединенного препарата, включают композицию, включающую соединение формулы (I) и другой терапевтический агент(ы) вместе в одной и той же фармацевтической композицией, или соединение формулы (I) и другой терапевтический агент(ы) в отдельной форме, например в форме набора.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение описывает фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы (I) и другой терапевтический агент(ы). По желанию, фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемый эксципиент, как описано выше, или более одного такого совместимого терапевтического агента.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение описывает набор, включающий две или более отдельных фармацевтических композиции, по меньшей мере одна из которых содержит соединение формулы (I). В одном варианте осуществления набор включает средства для раздельного хранения указанных композиций, такие как емкость, бутыль с отсеками, пакет из фольги с отделениями. Примером такого набора является блистерная упаковка, как правило, применяемая для упаковки таблеток, капсул и т.п.
Набор по настоящему изобретению может быть применен для введения различных дозированных форм, например пероральной и парентеральной, для введения отдельных композиций с различным дозировочным интервалом или для дозирования отдельных композиций относительно друг друга. Чтобы улучшить соблюдение предписанного режима терапии, набор по настоящему изобретению, как правило, включает указания к применению.
В комбинированной терапии по настоящему изобретению соединение по настоящему изобретению и другие терапевтические агенты могут быть получены и/или составлены в композицию одним и тем же или различными производителями. Кроме того, соединение по настоящему изобретению и другой терапевтический агент могут быть объединены в комбинированный препарат: (ί) до предоставления комбинированного продукта врачам (например, в случае набора, включающего соединение по настоящему изобретению и другой терапевтический агент); (ίί) врачом самостоятельно (или под руководством врача) незадолго до введения; (ίίί) пациентом самостоятельно, например, во время последовательного введения соединения по настоящему изобретению и другого терапевтического агента.
Соответственно, настоящее изобретение описывает применение соединения формулы (I) для лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, при котором медикамент получают в форме, подходящей для введения вместе с другим терапевтическим агентом, включая один из дополнительных химиотерапевтических агентов, раскрытых в настоящем описании, в качестве подходящего для введения в комбинации с соединениями формулы I. Настоящее изобретение также описывает применение другого терапевтического агента для лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, при котором медикамент вводят вместе с соединением формулы (I).
Настоящее изобретение также описывает соединение формулы (I) для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, в котором соединение формулы (I) получают в форме для введения вместе с другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также описывает другой терапевтический агент для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, в котором другой терапевтический агент получают в форме для введения вместе с соединением формулы (I). Настоящее изобретение также описывает соединение формулы (I) для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, в котором соединение формулы (I) вводят вместе с другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также описывает другой терапевтический агент для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, в котором другой терапевтический агент вводят вместе с соединением формулы (I).
Настоящее изобретение также описывает применение соединения формулы (I) для лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, при котором пациент ранее (например, в течение 24 ч) проходил лечение другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также описывает примене- 15 023999 ние другого терапевтического агента для лечения заболевания или состояния, опосредованного С8Р-1К, в котором пациент ранее (например, в течение 24 ч) проходил лечение соединением формулы (I).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения другой терапевтический агент выбран из антиангиогенных агентов, бевацизумаба с или без иринотекана, нитрозомочевин, таких как кармустин (ВСЫИ), соединений платины, таких как цис-платина (цисплатин), алкилирующих агентов, таких как темозоломид, ингибиторов тирозинкиназы (гефитиниб или эрлотиниб), Украина и каннабиноидов. В некоторых вариантах осуществления другой агент представляет собой совместимый терапевтический агент, выбранный из антиангиогенного соединения, каннабиноида и темозоломида.
Определенные индивидуальные комбинации, которые могут обеспечить конкретные благоприятные эффекты лечения, включают соединение 1а, 1Ь, 1с, И, 1е, Ιί, 1д или Ιίί в комбинации с темозоломидом. Эта комбинация может быть введена перорально, как приведено в настоящем описании, для лечения различных опухолей головного мозга, таких как мультиформная глиобластома.
В дополнение к способам лечения, соединениям и фармацевтической композиции также обнаружили определенные изменения в генной сигнатуре, ассоциированные с действием С8Р-1К соединений при лечения МФГ. Примеры ниже предоставляют информацию об этих изменениях и идентифицируют генные сигнатуры или биомаркеры, которые могут быть применены в связи со способами лечения, раскрытыми в настоящем описании. Как будет очевидно специалистам в области техники, данные сигнатуры Лассо и сигнатуры §УМ, приведенные в настоящем описании, могут быть применены при определении прогноза для пациента, проходящего лечение этими способами, путем получения образца из пациента и сравнения данных экспрессии гена в образце с изменениями в экспрессии гена и сигнатурами, раскрытыми в настоящем описании, путем корреляции с положительным прогнозом и/или продлением времени жизни.
Примеры
Соединения по настоящему изобретению получали согласно способам, известным в области техники, в частности описанным в \УО 2007/121484.
Характеристики соединений и/или промежуточных продуктов получали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением хроматографической системы \Уа1ег5 МШешит с разделительным модулем 2695 (Милфорд, Массачусетс). Аналитические колонки Ркеиотеиех Ьииа С18-5, 4,6x50 мм от А111есП (Дирфилд, Иллинойс) были обратнофазными. Применяли градиентную элюцию (поток 2,5 мл/мин), как правило, начиная со смеси 5% ацетонитрил/95% вода и увеличивая содержание ацетонитрила до 100% в течение 10 мин. Все растворители содержали 0,1% трифторуксусную кислоту (ТФК). Соединения обнаруживали по поглощению ультрафиолетового света (УФ) как при 220, так и при 254 нм. Производителями растворителей для ВЭЖХ были ВитФск и Нскяоп (Маскигон, Мичиган) или Изскет §шеибйс (Питсбург, Пенсильвания).
Масс-спектрометрический анализ выполняли на одном из двух приборов ЖХ-МС: \Уа1ег §у81ет (АШапсе НТ ВЭЖХ и масс-спектрометр М1сгота88 ΖΡ; колонка: Есйрзе ХЭВ-С18, 2,1x50 мм; градиент: 5-95% (или 35-95%, или 65-95%, или 95-95%) ацетонитрил в воде с 0,05% ТФК в течение 4 мин; скорость потока 0,8 мл/мин; диапазон молекулярной массы 200-1500; напряжение на конусе 20 В; температура колонки 40°С) или Не\\!е11 Раскатб §у81ет (серия 1100 ВЭЖХ; колонка: Есйрзе ХИВ-С18, 2,1x50 мм; градиент: 5-95% ацетонитрил в воде с 0,05% ТФК в течение 4 мин; скорость потока 0,8 мл/мин; диапазон молекулярной массы 150-850; напряжение на конусе 50 В; температура колонки 30°С). Все массы приведены как массы протонированных исходных ионов.
Аналитические данные для соединения (Ιί): время удерживания ВЭЖХ 1,93 мин. Молекулярный ион (МН+): т/ζ = 422,1 (ЖХ/МС ВУ = 0,50 мин).
Пример 1. Количество макрофагов увеличивается в мышиной модели образования глиомы по сравнению с нормальным головным мозгом.
Этот пример продемонстрировал вклад опухоль-ассоциированных макрофагов (ОАМ) с образованием глиомы в мышиной модели ВСА5>-РОСР-В-НА/№5Цп-Ту-а;1пк4а/АгГ-. У этих мышей, когда развитие опухоли начинается у взрослых особей, значительное большинство развивающихся поражений представляет собой высокодифференцированную мультиформную глиобластому (МФГ), которая гистологически моделирует МФГ человека. Фиг. 1 (А). Из образцов головного мозга/переднего мозга мышей №8Оп-Ту-а;1пк4а/АгГ-. которым не делали инъекцию (нормальный мозг), или опухоли IV стадии (МФГ) из симптоматических мышей КСА§-РНСР-В-НА/№8Йп-Ту-а;1пк4а/АгТ/- (РИС) получали суспензию отдельных клеток с папаином для проточной цитометрии (п=5 в каждом случае). Имело место значительное увеличение количества СИ45+ лейкоцитов с 3,6±0,6% до 13,1±2,0%. СИ11Ь+ миелоидные клетки/макрофаги составляли подавляющее большинство лейкоцитов (89,9-98,5% клетки СИ45+) при 3,8кратном увеличении количества клеток СН45+СН11Ь+ в опухолях (12,7±2,0%) по сравнению с нормальным мозгом (3,3±0,5%) и отсутствии различий в популяциях клеток СЭ45+СЭ11Ь-. (В). Нормальный мозг или секции ткани МФГ из РЭС симптоматических мышей иммунофлуоресцентно окрашивали для обнаружения С8Р-1К, СЭ68 (макрофаги) и ЭАР1. (С). Нормальный мозг и МФГ опухоли (п=3 в каждом случае) применяли для выделения РНК, синтеза кДНК и количественной ПЦР. Испытания проводили в
- 16 023999 трех повторностях и экспрессию нормализовали по убиквитину С (ИЬс) для каждого образца. Экспрессия изображена относительно нормального мозга. (Ό). Нормальный мозг или секции ткани МФГ из ΡΌΟ симптоматических мышей окрашивали для обнаружения С8Р-1К в комбинации с макрофагальными маркерами Р4/80 и СЭ11Ь. так же как Р4/80, СЭ11Ь и СЭ68 в комбинации с 1Ьа-1 (макрофаги/микроглия). ЭЛИ применяли для контрастного окрашивания ядра. Масштабная метка составляет 50 мкм. Данные представлены в виде среднего значения + стандартная ошибка среднего. Р значения получали с применением непарного двустороннего ΐ-теста Стьюдента; *Р<0,05; **Р<0,01.
Количества клеток макрофагов было существенно выше, чем в тканях МФГ, по отношению к нормальному мозгу, как показано окрашиванием при помощи макрофаг-специфического антитела СЭ68 (фиг. 1В). Это подтвердили анализом проточной цитометрии, в котором опухоль-ассоциированные лейкоциты (ΟΌ45+) составили 13,1 мас.% опухоли, а значительное большинство представляло собой макрофаги (СЭ11Ь+) (фиг. 1А). Анализ экспрессии генов в нормальном мозге по сравнению с МФГ показал, что уровень мРНК С8Р-1 и С8Р-1К, так же как ΟΌ68, увеличивается в опухолях (фиг. 1С).
Различные популяции, специфические к типу клеток, также были взяты из МФГ для определения источника С8Р-1 и его рецептора. Чистоту отдельных популяций подтверждала экспрессия рецептора ТУА только во фракции опухолевых клеток и СО11Ь исключительно в ОАМ. В то время как С8Р-1 экспрессировался и в опухолевых клетках и в ОАМ, С8Р-1К экспрессировался только в ОАМ (фиг. 1Ό). Первый столбец в каждой группе из трех столбцов на фиг. 1Ό относится к смешанным клеткам, второй относится к РАС8-очищенным опухолевым клеткам, и третий относится к РАС8-очищенным ОАМ; смешанные клетки приняты за 1, чтобы нормализовать данные. Графики показывают отсутствие экспрессии СЭ11Ь в опухолевых клетках и отсутствие экспрессии С8Р-1К в опухолевых клетках, в то время как ТУА окрашивает только опухолевые клетки, не окрашивая клетки ОАМ, С8Р-1 присутствует в приблизительно равных количествах как в опухолевых клетках, так и в клетках ОАМ. Результаты этих исследований подтверждались иммунным окрашиванием, и все С8Р-1К+ клетки являлись также положительными в отношении СЭ68 (не показано). Это демонстрирует, что любые эффекты при онкогенезе после ингибирования С8Р-1К в этой модели являются макрофаг-зависимыми.
Пример 2. Анализ С8Р-1К ингибитора ΒΡΖ945: фармакокинетика и клеточные испытания.
ΒΡΖ945 (соединение ^) раскрыто как избирательный ингибитор с-£ш8 (С8Р-1К) киназы для супрессии опухоль-индуцируемых остеолитических поражений в кости. ΒΡΖ945 является конкурентным ингибитором АТФ, который ингибирует С8Р-1К в биохимических испытаниях при концентрации 1 нМ и ингибирует С8Р-зависимую пролиферацию клеток при концентрации ГС-50 приблизительно 67 нМ. Для сравнения, величины ГС50 для большей части из >200 различных тестированных киназ составляют >10 мкМ (10000 нМ), а для сКГГ и ΡΌΟΡΚβ величины ГС-50 составляют 3,5 мкМ (3500 нМ) и 5,9 мкМ (5900 нМ) соответственно. При скринировании в сопоставлении с несколькими сотнями киназ в наборе киназ ЛтЬП® соединение показало активность ниже 50% по сравнению с контролем только в отношении С8Р1К, ΡΌΟΡΚα и ΡΌΟΡΚβ, и активность в отношении двух ΡΌΟΡΚ было намного ниже, чем его активность в отношении С8Р-1К в испытаниях прямого ингибирования. Как рассмотрено в настоящем описании, такие соединения как ΒΡΖ945, но обладающие (8,8) стереохимией, проявляют активность в отношении ΡΌΟΡΚβ на уровне, подобном своему высокому уровню активности в отношении С8Р-1К.
Мышам, у которых МФГ обнаруживается только в правой половине головного мозга, вводили ΒΌΖ945 и затем концентрацию соединения в плазме и в правой и левой половине головного мозга измеряли в различные моменты времени (15 мин, 2 ч, 8 ч, 24 ч). Как показано на фиг. 2, концентрация в плазме резко повышается до чуть более 100 мкМ и остается на уровне выше 50 мкМ к моменту времени 8 ч, затем снижается до низкого уровня в течение 24 ч. Концентрация в мозговой ткани изменяется схожим образом: она остается немного ниже уровня в плазме, но повышается намного больше 50 мкМ в моменты времени 15 мин и 2 ч. Это показывает, что ΒΌΖ945 пересекает гематоэнцефалический барьер (ВВВ) и что в головном мозге могут быть достигнуты концентрации, достаточные для ингибирования роста макрофагов и/или их выживания. Это также показывает, что соединение проникает в схожих количествах в опухоль-содержащие ткани и не содержащие опухоль половины головного мозга, указывая на то, что проникновение может не зависеть от поражения в ВВВ, вызываемого наличием опухоли. Это демонстрирует достаточно быстрое проникновение сквозь гематоэнцефалический барьер для обеспечения терапевтически эффективных уровней лекарственного средства в головном мозге, намного выше уровней, необходимых для эффективного ингибирования макрофагов в культуре.
Пример 3. Ингибирующее действие ΒΌΖ945 в отношении различных типов клеток ίη νίίτο.
Макрофаги из костного мозга (ΒΜΌΜ) выделяли и дифференцировали, как ранее описано в литературе, и затем обрабатывали 67 нМ ΒΌΖ945. ΒΌΖ945 вызвал явное ингибирование фосфорилирования С8Р-1К после стимуляции С8Р-1 (фиг. 3А) в каждый момент времени (1,5 мин, 3 мин, 5 мин).
Также изучали действие ΒΌΖ945 на макрофаги: в диапазоне доз от 67 до 6700 нМ резко останавливалось выживание макрофагов, сопоставимо с эффектом резкого исчезновения С8Р-1 (фиг. 3В).
ΒΜΌΜ из контрольных мышей !пк4а/АгГ (генетический контекст в модели МФГ) также тестировали в присутствии и отсутствие ΒΌΖ945. Фиг. 3С показывает, что эти ΒΜΌΜ, как и таковые из мышей
- 17 023999 дикого типа, были существенно ингибированы при концентрациях ΒΕΖ945 от 67 нМ и выше (фиг. 3Ό). Таким образом, ΒΕΖ945 является эффективным ингибитором передачи сигналов С8Р-1К, что приводит к полной остановке выживаемости макрофагов. Фиг. 3С-3Е демонстрируют, что пролиферация ΒΜΌΜ клеток из 1пк4а/АгТ/-мышей так же сильно ингибируется при концентрациях ΒΕΖ94567 нМ и выше, как и клеток СКЕ-2467 (нормальный головной мозг мыши), в то время как даже при 6700 нМ имеется небольшое или вообще отсутствует действие на пролиферацию клеточных культур глиобластомы четырех мышей и человека.
Чтобы определить недостаток прямого действия ΒΕΖ945 на опухолевые клетки, клеточную линию глиомы человека и серию первичных опухолевых клеток и нейросфер обрабатывали ΒΕΖ945 в концентрациях, схожих с эффективными в отношении роста макрофагов. Клетки И87-МО, полученные из МФГ человека, которые показали зависимость от передачи сигнала ΡΌΟΡΚ в культуре и ίη νίνο, не испытывали воздействия ΒΕΖ945 при тех же самых дозах, как указано выше (фиг. 3Е). Схожим образом, образование вторичных нейросфер из первичных нейросфер (полученных из ^Αδ-ΡΌΟΡ-Β-ΗΑ/Νοδΐίη-Τνа;1пк4а/АтГ/- мышиной МФГ) не изменилось в результате введения ΒΕΖ945 (фиг. 3Р). Ни количество, ни размер нейросфер не были значительно изменены в присутствии ΒΕΖ945. Наконец, исследовали действие ΒΕΖ945 на множество линий опухолевых клеток, полученных из вторичных нейросфер МФГ мыши, и снова не было обнаружено никаких различий (фиг. 3Р). Все вместе эти эксперименты демонстрируют, что ингибирующее действие ΒΕΖ945 на С8Р-1К является специфическим для макрофагов без различимых прямых последствий для опухолевых клеток.
Пример 4. Введение ΒΕΖ945 ингибитора С8Р-1К блокирует развитие глиомы.
Учитывая мощное ингибирующее действие ΒΕΖ945 в клеточных испытаниях на макрофагах и его продемонстрированную способность пересекать гематоэнцефалический барьер, представляется желательным тестирование этого ингибитора в доклинических испытаниях в модели ΒΟΆδ-ΡΩΟΡ-ΒНА/№50п-Ту-а;1пк4а/АгГ-. Этим генетически сконструированным мышам в возрасте 5-6 недель вводили ΌΡ-1 клетки, зараженные вирусом ^^Αδ-ΡΌΟΡ-Β-ΗΑ, чтобы инициировать образование глиомы, как описано в литературе (НатЬагб/итуап с1 а1., Тгап§1. Опсо1., νοί. 2, 89-95 (2009)). Через 2,5 недели после инициирования опухоли группам мышей ежедневно перорально вводили дозу принудительного питания либо с ΒΕΖ945 в количестве 200 мг/кг в 20% каптисоле, либо плацебо (20% каптисол) в качестве контроля. Затем мышей обследовали на предмет бессимптомного выживания. Средняя продолжительность жизни у группы, которой вводили плацебо, составляла 5,71 недели (40 дней), тогда как 64,4% группы, которой вводили ΒΕΖ945, были все еще живы в конце 26-недельного испытания после инъекции (возраст 31-32 недели) (фиг. 4А, Р<0,0001). Выбор окончания испытания был определен тем, что у мышей с 1пк4а/АтТ/-контекстом начинали развиваться спонтанные опухоли, главным образом, лимфомы и саркомы, приблизительно в возрасте 30 недель, что затруднило бы интерпретацию фенотипа глиомы в более длительных исследованиях. Данные на фиг. 4А показывают, что ни одна из контрольных мышей (только плацебо) не была без симптомов на 8 неделе после вирусной инъекции, в то время как более половины мышей, которым вводили лекарственное средство, не имели симптомов в конце 26-недельного испытания. Отметьте: 4 мышей, которым вводили лекарственное средство, умерщвляли на 12 неделе для гистологического исследования. Из них 3 не имели опухоли, и одна имела глиому II степени.
Степени опухоли определяли у мышей в обеих группах мышей (см. фиг. 4В). Все мыши, которым вводили плацебо, в конце исследования имели высокодифференцированные опухоли с поражениями МФГ стадии IV у 13 из 14 мышей. Напротив, животные, которым вводили ΒΕΖ945, имели значимо меньше злокачественных опухолей: 80% либо имели опухоль стадии II, либо не имели опухоли; оставшиеся 20% имели опухоль стадии III. У 56% мышей, оставшихся в живых в конце 26-недельного испытания, не было никаких заметных поражений (фиг. 4В). Пять из мышей, которым вводили ΒΕΖ945, умерщвляли в течение испытания в качестве симптоматических (п=5) и сравнивали с группой мышей, которые все еще не имели симптомов, когда их умерщвляли в конце испытания (п=9). Тем не менее, в обеих группах наблюдали значительное снижение степени развития опухоли по сравнению с животными, которым вводили плацебо. Это показывает значительное увеличение выживания и сокращение злокачественного развития опухоли в этом длительном испытании с введением ΒΕΖ945.
Пример 5. Визуализация при помощи МРТ для наблюдения за действием ΒΕΖ945 на рост опухолию
Кратковременное 7-дневное испытание ΒΕΖ945 у мышей с индуцированной опухолью контролировали регулярными сканами МРТ для измерения изменений размера опухоли во время короткого периода лечения, когда рост опухоли обычно быстрый. Объем опухоли у мышей ΚСΑ§-Ρ^ΟΡ-Β-ΗΑ/Nеδΐт-Τνа;1пк4а/АтГ/- определяли посредством МРТ, и мыши были добавлены к испытанию, когда он составлял по меньшей мере 4,5 мм3 или больше. Мышей обрабатывали ΒΕΖ945 или плацебо-контролем в течение 7 дней, как описано выше. Сканы МРТ выполняли в день перед началом лечения, в середине лечения и в день перед концом испытательного периода. Мыши, которым вводили плацебо, проявляли постепенное, значительное увеличение в объеме опухоли в течение этого краткосрочного испытания, как показано на фиг. 5А, со средним объемом опухоли, увеличивающимся приблизительно 5-кратно. Введение ΒΕΖ945 блокировало развитие опухоли, как было определено посредством МРТ (фиг. 5А), без увеличения размера опухоли за тот же самый короткий период. Пациенты, получавшие лечение (нижняя линия), демонст- 18 023999 рировали небольшое или отсутствие увеличения опухоли, в то время как объем опухоли резко увеличился в контролях, которым вводили плацебо. Фиг. 5В показывает объем опухоли у отдельных контрольных мышей (верхний график) и получавших лечение мышей (нижний график) в течение первых 6 дней после дозирования с начатым ΒΕΖ945. Почти все животные, которым вводили ΒΕΖ945, демонстрируют небольшое или отсутствие увеличения в размере опухоли, в то время как все контрольные животные проявляют значительное увеличение объема опухоли.
Как показано на фиг. 5В, без лечения опухоли увеличивались приблизительно на 150-850% в объеме в течение этого времени, в то время как у 7 из 11 животных, получавших лечение, размер опухоли уменьшался, и только у двух из животных, получавших лечение, увеличение объема опухоли составило более чем на 50%. Фиг. 5-2А и 5-2В изображают данные об объеме опухоли для всех 11 тестовых и контрольных животных и демонстрируют, что лечение в значительной степени останавливало возрастания размера опухоли, в то время как в отсутствие лечения опухоли значительно росли в течение 6-дневного лечения. Эти результаты указывают на то, что передача сигнала С8Р-1К, а также предположительное содействие С8Р-1К-зависимых макрофагов критичны для развития глиомы в этой модели мыши и что ΒΕΖ945 может предотвращать рост опухоли головного мозга в высокозначимой модели млекопитающего для глиобластомы человека.
Во втором ίη νίνο тесте на больших опухолях в той же самой модели МФГ (группа большая опухоль) мышей с объемами опухоли от 48,7 до 132 мм3 обрабатывали ΒΕΖ945 и изменения в объеме опухоли контролировали посредством МРТ через промежуток в 6 дней. Объем опухоли фактически уменьшался почти у всех тестируемых животных, и у 6 из 18 получавших лечение мышей наблюдали сокращение в размере опухоли по меньшей мере на 30% (фиг. 5Ό и 5-2С). Контрольные животные не были включены в этот тест, поскольку, как ожидалось, они не дожили бы до конечной точки.
Пример 6. Анализ отличительных свойств в опухолях при введении ΒΕΖ945.
Идентификация четко выраженного действия ингибирования С8Р-1К на глиомогенез привела к тому, чтобы исследовать основные механизмы для этого ответа и определить, как введение ΒΕΖ945 влияет на некоторые из отличительных признаков рака. Исследования были выполнены на тканях от кратковременного испытания (см. пример 5) так, что опухоли от групп другой обработки могли быть сравнены в той же самой конечной точке. Плотность опухолевых клеток исследовали посредством применения олигодендроцитарного маркера Ο1ί§2, который был ранее применен для идентифицирования клеток глиомы. О1щ2 был значительно снижен в группе, получавшей лечение с ΒΕΖ945, по сравнению с контролями плацебо, демонстрируя, что ΒΕΖ945 значительно снижал количества опухолевых клеток. (фиг. 6А).
Анализ пропорции клеток ОЬд2+, которые пролиферировали, как определено инкорпорацией бромдеоксиуридина (Βτάυ), показал значительное сокращение в группе ΒΕΖ945 (фиг. 6В). Опять же, ΒΕΖ945 значительно снижал пролиферацию опухолевых клеток.
Также оценивали уровень апоптоза в этих клетках. Апоптотическими клетками считали такие, которые содержали окрашивание по эндоплазматической расщепленной каспазе-3 (СС3)+ и конденсированные ядра. Как показано на фиг. 6С, введение ингибитора С8Р-1К вызывало увеличение в апоптозе, в частности, в более ранний момент времени, хотя немного окрашивания наблюдали в 7-дневной группе большой опухоли.
Следующая таблица суммирует гистологические исследования, выполненные на образцах из примера 5.
- 19 023999
Таблица 1
Гистологические исследования
Параметр Растворитель ΒίΖ945 день 3 ΒίΖ945 день 7 ΒίΖ945 большая, день 3 ΒΙ-Ζ945 большая, день 7
Объем опухоли (день 1 по сравнению с днем 6) +493% +0,63% -24,3%
Общее количество □ΑΡΙ* клеток -72% -30% -40% -65%
Клетки опухоли (% ОПд2*) -27% -77% -14% -73%
Пролиферация (%ВШи+ОНд2*) -91% -67% -98% -94%
Апоптоз (%ССЗ+) +17-кратно +6-кратно +9-кратно +2-кратно
Сосудистая сеть (СО31 мущ -17% -67%
Макрофаги (%СО63*) +3-кратно +2-кратно +2-кратно +4-кратно
Фагоцитарный индекс +2,6-кратно +3,0-кратно +2,2-кратно +4,1-кратно
Фагоцитирующая способность +11,5-кратно +5,0-кратно +7,1-кратно +6,0-кратно
Изменение объема опухоли представляет собой объем в конечной точке (день 6) относительно дня один, и представленные изменения являются относительными к группе контроля (плацебо).
Вместе эти исследования демонстрируют, что ингибирование передачи сигнала СδР-1К эффективно блокирует рост и злокачественное развитие глиом посредством совместного воздействия на сокращение пролиферации опухолевых клеток и увеличения гибели клеток.
Суммируя вышесказанное, эти данные демонстрируют, что ингибитор СδР-1К ΒΡΖ945 представляет собой мощную новую терапию, которая блокирует развитие опухоли в модели очень агрессивной глиомы у мышей. Соединение резко усиливало выживание в преклинической модели глиомогенеза мыши и резко снижало темпы роста опухоли и также снижало размер опухоли за короткий и более длительный испытательный период. В долгосрочном тесте ΒΡΖ945, по-видимому, уничтожает видимые опухоли у значительного количества мышей и резко снижает степень развития опухоли у большинства получавших лечение мышей.
Так как было показано, что увеличенная инфильтрация макрофагов коррелирует со злокачественным развитием в глиомах человека, эффективность ΒΡΖ945 в этой модели мыши, очевидно, является следствием нацеленного воздействия ОАМ у пациентов с МФГ, что, как ожидается, преобразуется в действие против глиобластомы у других млекопитающих, включая людей. Так как миелоидные клетки, включая макрофаги, вовлечены в притупление химиотерапевтического ответа в моделях рака молочной железы и в усиление адаптивного ответа после облучения в моделях ксенотрансплантата МФГ, этот и подобные ингибиторы СδР-1К могут быть эффективными в комбинации со способами лечения, направленными против раковых клеток в глиомах; возможность, которая заслуживает дополнительного исследования. В частности, такие соединения как
предлагают способность нацеленно воздействовать на СδР-1К и РИОРК в схожих концентрациях и, та- 20 023999 ким образом, могут быть даже более эффективными, чем ΒΕΖ945. В действительности, соединение (1б) ингибирует ΡΌΟΡΚ с 1С50 только приблизительно в 4 раза выше, чем его (ингибирование) 1С50 с С8Р1К. Таким образом, терапевтически эффективная концентрация любого из этих соединений, как ожидается, окажет влияние на оба сайта нацеленного действия и продемонстрирует синергическое действие на глиомы.
Пример 7.
Чтобы исследовать молекулярные механизмы, с помощью которых при введении ΒΕΖ945 ОАМ может выявить такой выраженный антиканцерогенный ответ ш γί\Ό, несмотря на отсутствие абсолютного истощения ОАМ или любого прямого антипролиферативного действия на клетки МФГ человека, у мышей, обработанных плацебо, отбирали СЭ11Ь'Сг-1- ОАМ или ΒΕΖ945 и проводили микроматричный анализ профиля экспрессии (см. фиг. 7). Микроматричный анализ идентифицировал 257 генов как значительно дифференцированно экспрессированные между группами: 52 гена регулировались положительно и 205 регулировались отрицательно (фиг. 7В; также 8А). Среди них анализ получения дополнительной информации о конфигурации генов (О8ЕА) выявил, что мишени для Едг2, транскрипционного фактора, расположенного ниже факторов передачи сигнала С8Р-1К, отрицательно регулировались в ОАМ при введении ΒΕΖ945 (фиг. 7С). Непропорционально, гены, ассоциированные с фазой М2, регулировались положительно (фиг. 7Ό и 7Е).
Пример 8. Изменения экспрессии генов, вызванные ингибитором СРК-1К.
Моделирование регрессии Лассо применялось, чтобы определить минимальное количество генов, которые лучше всего отличали две группы лечения. Это идентифицировало 5-генную сигнатуру для лечения с ΒΕΖ945, состоящую из адреномедуллина (Абт), аргиназы 1 (Агд1), фактора свертывания крови Р13а1, рецептора маннозы С 1 типа (Мгс1/СЭ206) и протеазного ингибитора 5егр1пЕ2 (фиг. 8В). Примечательно, каждый из этих генов был ассоциирован с альтернативно активированной/М2 поляризацией макрофагов, и 4 из 5 генов отрицательно регулировались после введения ΒΕΖ945. 8егр1пЕ2 (также известный как РА12), единственный регулируемый положительно ген в 5-генной сигнатуре, обычно коррелирует положительно с повышенным выживанием, особенно у пациентов с раком молочной железы.
Во многих тканевых окружениях было найдено, что ОАМ были более М2-поляризованные, что было связано с их иммуносупрессивными и проонкогенными функциями. Также макрофаги в глиомах человека демонстрируют М2-подобный фенотип, определенный увеличенными уровнями фагоцитарных рецепторов СЭ163 и СЭ204, которые ассоциированы с более высокой степенью развития опухоли. Учитывая выраженное обогащение М2 генов в ограниченной 5-генной сигнатуре, 257-генный перечень был исследован, чтобы определить, были ли дополнительные М2-ассоциированные маркеры, измененные после введения ΒΕΖ945. Это выявило 10 дополнительных генов [А1ох15 (15-липооксигеназа арахидоната); СбЬ1 (кадгерин); С6163 (антиген СЭ163); Ррг2 (формильный пептидный рецептор 2); Нтох1 (оксигеназа тема (дециклирующая) 1); Н1Ь (интерлейкин 1 бета); и 81аЬ1 (стабилин 1)], большинство которых были отрицательно регулированы (фиг. 7Ό, табл. 2). Классически активированные/М1 поляризационные гены соответственно не регулировались положительно, за исключением рецептора интерлейкина-1-бета (фиг. 7Е). Эти данные предполагают, что в ответе на ингибирование С8Р-1К посредством ΒΕΖ945 ОАМ теряет их М2 поляризацию и может приобретать антионкогенные функции.
Это также предполагает, что наблюдение за этими изменениями экспрессии генов в качестве биомаркеров может предоставить ценную информацию о прогнозе для лечения больных глиомой ингибиторами С8Р-1К. Получающие лечение пациенты, изменение профилей экспрессии гена которых в таком же или подобном паттерне как эти наблюдаемые изменения, как можно ожидать, будут отвечать положительно на лечение ингибитором С8Р-1К, и те, кто не демонстрируют таких изменений экспрессии генов, возможно, должны получать альтернативное или дополнительное лечение из-за негативного прогноза в отношение одного только ингибитора С8Р-1К.
- 21 023999
Таблица 2
Дифференцированная экспрессия генов как результат введения ингибитора С8Р-1К
Обозначение Описание Кратность изменения ΒΙ-Ζ945 - растворитель Номинальная р-величина
Акар 12 якорный белок киназы(РГСКА) 12 -2,85 1,31Е-04
АРМ 15 ген альфа/бета домен-содержащей гидролазы 15 -2,48 1,36Е-05
Аср5 кислая фосфатаза, тартрат-устойчи&ая 2,36 2.03Е-03
АоаН ацилоксиацнлгндролаза -2,43 ЗгЗЗЕ-06
Айа аденозиндеаминаза -3,00 2.23Е-07
Агхев 1 адипоцит-связанная последовательность, экспрессируемая с X хромосомы 1 -2,23 1.63Е-03
Агхез 2 адипоцит-связанная последовательность, экспрессируемая с X хромосомы 2 -2,96 3,37Е-04
Айт’# адреномедуллин -10,85 2,60Е-09
АИЬ 1а2 семейство альдегиддегидрогеназ 1, подсемейство 2 -2,18 8.36Е-04
АрЬЬ2 амилоид бета(А4) предшественник связывания с белком, семейство В, член 2 2,27 2,97Е-06
Αηίπ анилин, актинсвязывающий белок -2,99 1 ,ЗЗЕ-04
АзЫО белок с анкириновым повтором и 5005-мотив-содержащий 10 2,10 1.14Е-03
АзЬ11 белок с анкириновым повтором и ЗОСЗ-мотив-содержащий 11 2,19 3,00Е-04
МИ67 антиген, идентифицируемый моноклональным антителом Κί 67 -7,13 2,73Е-05
АроЬ аполипопротеин В -2,92 3,42Е-05
- 22 023999
Арос1 аполипопротеин С-1 3,21 1.5ΘΕ-06
Арос4 аполипопртеин С-ΐν 3,14 1.91Е-04
А1ох15 # арахидонат 15-липоксигеназа 4,24 8.35Е-03
АгдГ# аргиназа, печень -3,43 5.07Е-03
Азрт аер (аномальный веретено)видный, микроцевало-ассоциированный (Дрозофила) -2,22 1.02Е-03
Аигка киназа Аигога А -2,23 1, ЗОЕ-03
АигкЬ киназа Аигога В -2,71 4.19Е-06
Вкс5 ген бакуловируса, содержащий ΙΑΡ- повтор 5 -6,13 3.00Е-06
ВатЫ ВМР и активин-мембран-связанный ингибитор, гомолог (Хепорие 1аеу|5) 2,64 6.53Е-05
ВиЫ почкование, ингибируемое гомологом 1 бензоимидазоламиов г (3. οβΓβνίείθβ) -2,72 4.19Е-06
СбМ # кадгерин 1 -6,43 1.70Е-04
СбЬ2 кадгерин 2 -2,23 6.25Е-04
Саткк1 кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа, киназа 1, альфа -2,13 2,69 Е-03
Са1т14 кальмодулин-подобный 4 -2,06 2.12Е-05
СИ512 углеводная сульфотрансфераза 2 2,44 5.14Е-04
СРг2 карбонилредуктаза 2 -4,15 2.93Е-07
СраЗ карбоксипептидаза АЗ, тучная клетка 2,17 6,ЗОЕ-04
С1пгк12 катенин (кадгерин-ассоциированный белок), дельта 2 -2,94 3.46Е-07
С1У катепсин Р 2,10 1.53Е-04
С<1163 # СО163 антиген -2,65 3.37Е-07
СЧ22 СО22 антиген 2,35 1.09Е-05
С6244 СО244 естественный рецептор клеток- киллеров 2В4 -2,71 1.11Е-07
сазз СОЗЗ антиген -3,72 4,44 Е-05
С<!5 СР5 антиген 3,62 2.96Е-05
сазз СОЗЗ антиген 2,23 2.53Е-05
саэз СО93 антиген -2,42 2,ЗОЕ-07
Ск51Ь СОС23 протеинкиназа 1Ь -2,54 1.71Е-06
сасго цикл деления клетки 20 гомолог 3 (5. сегеУ!51ае) -2,75 1.16Е-04
сас45 цикл деления клетки 45 гомолог 3 (3. сегеуЫае) -2,03 9.73Е-03
сасб цикл деления клетки 6 гомолог 5 (5. сегеуыае) -3,67 8.12Е-08
Сасаб ассоциированный с циклом деления клетки 5 -2,24 6.77Е-06
Сепре центромерный белок Е -4,13 1.96Е-05
Сепрк центромерный белок К -2,45 1.46Е-05
- 23 023999
Сер55 центросомальный белок 55 -2,40 8,23Е-05
Сеи хемокиновый (С-С мотив) рецептор 1 -4,56 8.86Е-05
Схсг7 хемокиновый (С-Х-С мотив) рецептор 7 -2,26 3,65Е-03
Сзрд5 хондроитинсульфат протеогликан 5 -2,61 1.09Е-05
С1и клустерин -2,34 3,55Е-04
1=3 фактор коагуляции III -2,11 4,53Е-03
Р9 фактор коагуляции IX 2,12 5.92Е-04
Р13аГ# фактор коагуляции XIII, субъединица А1 -10,66 1.39Е-09
Со111а1 коллаген, тип XI, альфа 1 -3,49 3.09Е-04
Со114а1 коллаген, тип XIV, альфа 1 -2,65 1.37Е-06
СГр комплементарный фактор пропердин -2,64 2,60Е-04
СП№1 контактин I -4,93 2,80Е-08
Српе2 копии II -2,20 1,13Е-05
СгуЬМ кристаллин, бета В1 -2,83 2.44Е-05
С1ес4п семейство 4 С-типа домена лектинов, член η -6,53 4,34Е-10
Сспа2 циклин А2 -3,90 1,19Е-05
СспЫ циклин В1 -3,55 2.25Е-05
СспЬ2 циклин В2 -4,53 1.16Е-05
СспсЛ циклин ϋ1 -3,01 1,06Е-08
Сспс12 циклин ϋ2 -3,34 1,36Е-05
Сспе2 циклин Е2 -5,28 3,67Е-08
СсМ циклин Г -2,30 1,43Е-04
Сс1к1 циклин-зависимая киназа 1 -2,18 2,75Е-05
С517 цистатии Р (лейкоцистатин) 2,62 2.29Е-07
Сур4уЗ цитохром Р450, семейство 4, подсемейство ν, полипептид 3 2,14 1,15Е-05
СреМ элемент-связывающий белок 1 цитоплазматической полиадениляции 2,86 1,97Е-05
Скар2 цитоскелет-ассоциированный белок 2 2,17 1,ЗОЕ-04
0СП1С11 ΟϋΗϋ домен, содержащий 1 2,06 4,86Е-03
Опег <1еИа/по1сЬ-подобный рецептор, ассоциированный с эпидермальным фактором роста -2,68 2,65Е-04
Оск деоксицитидинкиназа -2,07 2.50Е-04
ОерРс 1а ЭЕР домен, содержащий 1а -2,81 9,05Е-05
□МГг дигидрофолатредуктаза -2,40 5,79Е-06
Рпт 1 ДНК-праймаза, р49 субъединица -2,76 2.37Е-07
□17Н6Э56Е-5 сегмент ДНК, СПг 17, ϋ6356Ε человека 5 -2,01 1,66Е-03
ООП4 транскрипт, индуцируемый повреждением ДНК 4 -2,43 5.07Е-06
- 24 023999
Оизр 1 фосфатаза с двойной специфичностью 1 2,33 3,55Е-04
Е2Г8 Е2Р фактор транскрипции 8 -2,71 1.20Е-05
Ес12 еы2 онкоген -3,19 1,65Е-04
ЕтЬ эмбигин -2,59 9,66Е-05
ЕерсН эндонуклеаза/экзонуклеаза, семейство фосфатаз, домен, содержащий 1 2,70 1,62Е-06
ΕζΜ2 энхансер гомолог агез1е( Дрозофила) -2,54 1.36Е-05
Ε1Ι4 локус энхансерной ловушки 4 2,41 1,24Е-05
ЕрзЗ субстрат (сигнального) пути рецептора эпидермального фактора роста 8 -2,51 4,00Е-06
Етр 1 эпителиальный мембранный белок 1 -3,19 6,42Е-04
ЕрИх1 эпоксидгидролаза 1, микосомальная 2.76 1.75Е-04
Его II ЕР01-подобный (3.сегеУ151ае) -2,64 1,07Е-05
Рат20с семейство со схожестью последовательностей 20, член С 2,79 3,62Е-06
РаЬрЗ белок, связывающий жирные кислоты 3, мышцы и сердце 2,93 4,99Е-06
РаЬр7 белок, связвающий жирные кислоты 7, головной мозг -6,77 9.66Е-06
РЬхо32 Р-Ьох белок 32 2,54 1,79Е-05
РЬп2 фибриллин 2 -2,13 3,39Е-03
Рар белок активации фибробластов -2,25 1,46Е-03
Ррг2# формилпептидный рецептор 2 -2,83 6.68Е-05
РИ11 домены четыре с половиной ИМ 1 -2,02 5.40Е-03
С]а1 белок межклеточных щелевых контактов, альфа 1 -2,73 1,97Е-03
ОратЬ гликопротеин (трансмембранный) пглЬ 3,22 3,98Е-05
Сд1а1 гликопротеин галактозилтрансфераза альфа 1,3 -2,40 2,12Е-06
Ортба гликопротеин тба -5,35 3,23Е-06
Сгта гранзим А 3,55 4,11Е-03
Сас1с145а останавливающий рост и индуцируемый повреждением ДНК 45 альфа 2,40 2,77Е-04
Сар43 рост-ассоциированный белок 43 -2,56 7,42Е-05
ОЙГЗ фактор дифференциации роста 3 -3,33 1,40Е-07
Сет ΘΤΡ-связывающий белок (сверхэкспрессируемый ген в скелетных мышцах) 2,17 7,03Е-04
Нзра 1а белки теплового шока 1А -4,33 1,45Е-05
Нзра 1Ь белки теплового шока 15 -8,71 1,88Е-03
Н5р90аа1 белки теплового шока 90, альфа (цитозольный), класс А, член 1 -2,23 1.01Е-03
НеНз хеликаза, лимфоид-специфический -3,59 9.75Е-06
- 25 023999
Нтох1 # гемоксигеиаза (расщепляющая циклы) 1 -2,90 7,05Е-05
НтдЬЗ группа с высокой мобильностью Ьох 3 -2,42 2,32Е-06
Нтдп5 домен белка из группы белкое с высокой подвижностью, связывающийся с нуклеосомой 53,36 -2,56 1,79Е-05
|д] соединительная иммуноглобулиновая цепь 3,36 4,53Е-03
|кЬке ингибитор каппаВ-киназы, эпсилон 2,38 1,50Е-04
1дТ1 инсулин-подобный фактор роста 1 2,13 8,56Е-05
1д№>р2 связывающий белок инсулин-подобного фактора роста 2 -3,54 1,24Е-06
1дТЬрЗ связывающий белок инсулин-подобного фактора роста 3 -6,53 1,05Е-05
Цдат интегрин альфа М -2,25 2,27Е-04
Идах интегрин альфа X 2,08 1,36Е-03
№1т1 интерферон-индуцируемый трансмембранный белок 1 -5,18 1,21 Е-04
ίίίϋη 2 интерферон-индуцируемый трансмембранный белок 2 -2,82 1,54Е-03
МтЗ интерферон-индуцируемый трансмембранный белок 3 -2,06 4,73Е-03
Кйт 6 интерферон-индуцируемый трансмембранный белок 6 -4,14 6.14Е-04
111 ь# интерлейкин 1 бета 2,06 4,50Е-04
111 ВЬр интерлейкин 13 связывающий белок 3,66 4.53Е-04
И7г интерлейкин 7 рецептор -2,01 4,96Е-03
Крпа2 кариоферин (импортин) альфа 2 -2,38 1,98Е-05
КПСгЬзЗ КН домен содержащий, РНК связывающий, ассоциированный с передачей сигнала 3 -2,10 3.94Е-04
К1гЬ1а подсемейство В лектин-подобного рецептора клеток-киллеров, член 1А 4,30 9.00Е-05
ΚΪΓ11 член семейства кинезина 11 -2,57 9.00Е-05
РЬк ΡΟΖ-связывающая киназа -5,63 9,20Е-07
рад 1 гипофизный опухоль- трансформирующий ген 1 -2,83 2,73Е-06
Р1ас8 плацента-специфичный б -2,79 6,64Е-03
Рс1дГга рецептор фактора роста тромбоцитов, альфа-полипептид -3,16 4,84Е-06
Ρί4 тромбоцитарный фактор 4 -2,96 1,21Е-05
РбдГс фактор роста тромбоцитов, С полипептид -2,25 2.96Е-03
Ρίη плеотрофин -3,21 4.42Е-04
Р(1рп подопланин -2,01 3,51 Е-04
- 26 023999
Р1к 1 поло-подобная киназа 1 (Дрозофила) -2,68 5.72Е-05
Ро1а1 полимераза (ДНК направленная), альфа 1 -2,37 3,52Е-06
Рок12 полимераза (ДНК направленная), дельта 2, регуляторная субъединица -2,02 5.72Е-06
Ро1е полимераза (ДНК направленная), эпсилон -2,27 5,96Е-05
Кспк2 калийный канал, подсемейство К, член 2 -2,13 8.52Е-05
Рйск1е1 рпск1е гомолог 1 (Дрозофила) 2,32 1,75Е-04
Р4Па2 проколлаген-пролин, 2-оксиглутарат 4- диоксигеназа (пролин-4-гидроксилаза), альфа II полипептид -3,54 1.25Е-06
Р1дег4 простагландина Е рецептор 4 (подтип ЕР4) 2,43 5,12Е-05
Ртера1 трансмембранный белок предстательной железы, андроген- индуцируемый 1 -2,35 5,85Е-04
РзтЬ7 протеасома (просома, мульти каталитическая протеаза) субъединица бета тип 7 -2,17 4.27Е-03
Ргс1 белковый регулятор цитокинеза 1 -3,06 1.26Е-04
Р1ргг1 протеинтирозинфосфатаза, рецептор типа Ζ, полипептид 1 -3.68 4.43Е-05
Р2гу12 пурннергический рецептор Ρ2Υ, связанный сО-протеином 12 -2,55 1.86Е-04
РаЬ34 ЕАВ34, член семейства РАЗ онкогена 2,08 3,95Е-05
Расдар1 белок, активирующий Рас ОТР-азу 1 -2,56 2.92Е-05
РаР51ар1 РА051-ассоциированный протеин 1 -2,61 1.26Е-07
РаФ51 ΡΑϋ51 гомолог (3. сегеу|31ае) -2,90 З.ЗЗЕ-06
РапЬр1 ΡΑΝ связывающий белок 1 -2,01 6.62Е-07
Р(с4 фактор репликации О (активатор 1)4 -2.17 4.24Е-05
РЬр1 ретинол-связывающий белок 1, клеточный -4,22 1.88Е-05
Ргт1 рибонукпеотид-редуктаза М1 -2,14 1,79Е-05
Кгт2 рибонуклеотид-редукгаза М2 -8,23 1.04Е-07
2310016С08Р1к ΡΙΚΕΝ кДНК 2310016С08 ген -2,14 1,12Е-04
2810417Н1 ЗР!к ΡΙΚΕΝ кДНК2310417Н13 ген -3,96 2.33Е-07
4930583Н14Р1к ΡΙΚΕΝ КДНК4930583Н14 ген -2,37 1.25Е-05
РЬтЗ РНК-связывающий мотив белка 3 -2,20 2,23Е-09
2Ιίη4 ген эсЫаТеп 4 -3,35 3.42Е-03
εΐίΐ локус 8с1/Та11 прерывания -3,15 2.15Е-06
5егр|пб2' # ингибитор серин (или цистеин)пептидазы, таксон В, член 2 6,20 1.12Е-02
- 27 023999
ЗегрюРбЬ ингибитор серин (или цистеин)пептидазы, таксон В, член 6Ь 2,03 1,22Е-03
5туб2 ЗЕТ и ΜΥΝϋ домены, содержащие 2 -2,25 6.90Е-04
ЗИЗЬдг ЗНЗ-связывающий домен белка с высоким содержанием глутаминовой кислоты 3,33 6.84Е-07
ЗОЗЬдИ Подобный ЗНЗ-связывающему домену белка с высоким содержанием глутаминовой кислоты -2.02 4.68Е-04
311сЬр1 5(1С 5Н2-домен связывающий белок 1 -4,72 1,74Е-06
51ат18 51_АМ семейство, член 8 2,81 5,20Е-03
Зпгра1 небольшой ядерный рибонуклеопротеиновый полипептид А‘ -2,04 1.48Е-06
31с2а5 раствор-носитель семейства 2 (ускоренный переносчик глюкозы), член 5 -3,46 8,15Е-07
31с39а4 раствор-носитель семейства 39 (переносчик цинка), член 4 2,44 7.33Е-05
31с6а1 раствор-носитель семейства 6 (переносчик нейромедиаторов, (ЗАВА), член 5 -2,09 5.66Е-04
ЗрагсИ ЗРАВК-подобный 1 -3,23 1,06Е-03
Зроп1 спондин 1, (Г-спондин) внеклеточный матричный белок -2.50 9.32Е-05
Зох2 3ΒΥ Рох - содержащий ген 2 -2,50 5.13Е-03
51а М# стабилин 1 -2,64 3.92Е-06
31тп1 статмин 1 -2,52 5,52Е-05
Зтс2 структурная устойчивость хромосом 2 -2,87 7,80Е-05
Зтс4 структурная устойчивость хромосом 4 -3.20 2.26Е-04
5114 супрессия онкоген ности 14 (рак толстой кишки) 2,47 4,21 Е-06
Лрагр ТСОО-индуцируемая поли(АОР- рибоза) полимераза -2.06 1.25Е-03
Тпс тенасцин С -2,56 2.48Е-03
Тк1 тимидин киназа 1 -3,39 1,24Е-07
Τΐρίη бессрочный взаимодействующий белок -2,50 6,24Е-06
πρϊ2 ингибитор пути тканевого фактора 2 -2,60 3.99Е-03
Τΐηηρί тканевый ингибитор металлопротеиназ 1 -2,07 1,64Е-04
Тор2а топоизомераза (ДНК) II альфа -2,11 2.13Е-05
ΤορΡρΙ топоизомераза (ДНК) II связывающий белок 1 -2,37 9,96Е-06
Трх2 ТРХ2, микротрубочка-ассоциированный гомолог белка (Хепориз 1аемз) -2,52 1.16Е-05
ТсМ9 фактор транскрипции 19 -2,32 1,67Е-06
ТдТЫ трансформирующий фактор роста, бета индуцированный -3,23 1,68Е-06
Тдт2 трансглутаминаза 2, С полипептид -2,94 2,86Е-03
Ттет119 трансмембранный белок 119 -3,12 1,71 Е-06
Ттет163 трансмембранный белок 163 2,20 5,42Е-03
Тгрз I трихоринофаланговый синдром I (человека) -2,97 1,68Е-07
Тпт59 трипартит мотив-содержащий 59 -2,73 3.02Е-04
Т1к ТТк протеинкиназа -2,63 3.35Е-05
ТиЬЬ2с тубулин, бета 2С -2,13 3.84Е-06
иЬе2с убиквитин-сопряженный фермент Е2С -3,93 1.12Е-04
иигп убиквитин-подобный, содержащий ΡΗϋ и ΡΙΝΟ Ипдег домены 1 -2,96 3.73Е-07
ипд урацип ДНК гликозилаза -2,50 5,81 Е-07
ШсНкЛ ДНК-связывающий белок с \ЛЮ повторами и содержащий НОМ-Ьох -2,01 2.52Е-04
ΖννΙοή Ζν/ίΙΰΓι кинетохора-ассоциированный, гомолог (Дрозофила) -4,32 3,61 Е-06
*Компонент сигнатуры ответа на ΒΕΖ945 по методу оценки регрессии Лассо. # Макрофаг-ассоциированные гены, относящиеся к М2.
- 28 023999
В таблице негативно регулируемые гены получают номер отрицательного кратного изменения, в то время как регулируемые положительно гены имеют положительные значения. Номинальные рзначения непарного двустороннего ΐ-теста Стьюдента.
Кроме того, генные сигнатуры, полученные от ОАМ мышей, которым вводили ΒΕΖ945, повидимому, связаны с дифференцированным выживанием у пациентов с МФГ. Метод опорных векторов (δνΜ) и сигнатуру Лассо применяли, чтобы проанализировать данные о МФГ из Атласа Генов Рака (ТСОА) и второй объединенной серии наборов данных о МФГ и разделить пациентов или в «ΒΕΖ945» или в плацебо классификаторы. Эти исследования показали увеличение среднего выживания в пределах от 10 месяцев у ТСОА проневральных пациентов, применяя сигнатуру Лассо (фиг. 8С и 8Ό), до 31,5 месяца в объединенных наборах данных с сигнатурой δνΜ (фиг. 8Е и 8Р). Примечательно, это увеличение в выживании не было очевидным в других подтипах МФГ и не зависело от обогащения 0-ΟΜΡ+ проневральных пациентов.
Таблица 3
Данные о продолжительности жизни для метода опорных векторов (δνΜ) и моделей Лассо в различных популяциях МФ
Г руппа ΒίΖ945 Растворитель Средняя выживаемость р-значения
5УМ комбинированная невральная 49 16 5,42 1.59Е-01
ЗУМ комбинированная проневральная 46 62 31,54 6.86Е-04
ЗУМ комбинированная мезенхимальная 37 102 -2,25 8.92Е-01
ЗУМ комбинированная классическая 11 48 0,40 6.67Е-01
ЗУМ ТССА проневральная 45 83 7,64 7.27Е-03
ЗУМ ТССА проневральная СС1МР 13 8 -40,60 2,01 Е-01
ЗУМ ТССА проневральная не-СС1МР 22 44 -0,76 2.64Е-01
зум тсса СС1МР 14 8 -35,60 2.03Е-01
ЗУМ ТССА не-СС1МР 83 157 -1,06 7.27Е-01
ЗУМ ТССА невральная 23 30 2,34 7,73Е-01
ЗУМ ТССА мезенхимальная 53 99 0,30 7.62Е-01
ЗУМ ТССА классическая 31 66 -3,14 7,71 Е-01
Лассо комбинированная невральная 51 14 7,01 6.50Е-02
Лассо комбинированная проневральная 79 29 6,51 4.15Е-02
Лассо комбинированная мезенхимальная 21 118 1,88 5.55Е-01
Лассо комбинированная классическая 28 31 0,33 9.68Е-01
Лассо ТССА проневральная 84 49 9,98 5,41 Е-06
Лассо ТССА проневральная СС1МР 20 1 ΝΑ ΝΑ
Лассо ТССА проневральная не-СС1МР 40 26 10,84 1,40Е-02
Лассо ТССА СС1МР 20 2 -16,13 7,21 Е-01
Лассо ТССА не-СС1МР 100 140 0,10 4.14Е-01
Лассо ТССА невральная 31 22 -5,19 2.77Е-02
Лассо ТСОА мезенхимальная 23 129 0,40 8,35Е-01
Лассо ТССА классическая 49 43 -1,42 6,34Е-01
- 29 023999
Анализ ассоциированных отношений рисков продемонстрировал проневрально-специфическое преимущество выживания в обоих, ТССА и в объединенных наборах данных (фиг. 8С). Проневральная специфичность согласуется с сигнатурами, первоначально происходящими от модели глиомогенза РОС, которая наиболее близко отражает проневральный МФГ. Это предполагает, что эти генные сигнатуры могут обеспечить полезное прогностическое руководство для пациентов, проходящих лечение с химиотерапевтическими препаратами, особенно пациентов с МФГ, получающих лечение ингибиторами С8Р1К. Поскольку проневральная МФГ не отвечает на агрессивную химио- и лучевую терапию по сравнению с другими подтипами, обнаружение прогностического значения, связанного с этими сигнатурами, может иметь важный трансляционный потенциал для этой группы пациентов. На основе наблюдаемой корреляции пациенты, получающие химиотерапию, кто демонстрирует генную сигнатуру, по меньшей мере, приблизительно на 80% подобных или генной сигнатуре Лассо, или генной сигнатуре δνΜ, как ожидается, положительно ответят на эту химиотерапию. В частности, эта корреляция, как ожидают, будет полезной у пациентов, получающих лечение ингибитором С8Р-1К, особенно соединениями формулы (I), как приведено в настоящем описании.
Таблица 4
Отношение рисков и ассоциированные 95%-ные доверительные интервалы для модели регрессии Лассо в различных С-С1МР и не-С-С1МР группах пациентов. С-С1МР соответствует глиоме с фенотипом метилятора СрС островка. Значения Р получали, применяя тест Вальда
Группа Популяция пациентов Модель Отношение рисков 95% доверительный интервал Р- значение
'ΒίΖ945' Лассо не-СС1МР проневральные* однопараметрическая 0,4921 (0,2766-0,8758) 0,0063
ΒΙ.Ζ945’ Лассо все проневральные однопараметрическая 0,3937 (0,2601-0,5961) 9,729е-06
С-С1МР все проневральные однопараметрическая 0,3289 (0,1481-0,7304) 0,01367
С-С1МР все проневральные многопараметрическая* 0,4601 (0,1972-1,0733) 0,00783
‘ΒΙ.Ζ945’ Лассо все проневральные многопараметрическая* 0,4295 (0,2304-0,8007) 0,07244
*Группа проневральных пациентов с данными о метилировании, которое опрделенно не является не-С-С1МР положительным (67/133 всего Проневральных ТССА пациентов.) **Многофакторная модель пропорционального риска Кокса, использующая оба, С-С1МР и В^Ζ945, слоя классификации.
Таблица 5
Опасность нормирует для модели регрессии Лассо в различных терпеливых наборах данных. Р-значения получали при помощи \Уа1б-теста. Отношения рисков только у проневральных подтипов являются статистически значимыми
Группа Отношение рисков 95% доверительный интервал р-значение
ТССА -проневральная 0,29 (0,17-0,50) 6.32Е-06
ТССА - классическая 1,28 (0,73-2,26) 3.89Е-01
ТССА - мезенхимальная 0,93 (0,49-1,72) 8.07Е-01
ТССА - невральная 1,93 (0,83-4,46) 1,25Е-01
Комбинированная - проневральная 0,44 (0,25-0,79) 5.97Е-03
Комбинированная - классическая 1,01 (0,47-2,17) 9,79Е-01
Комбинированная - мезенхимальная 1,02 (0,54-1,94) 9.43Е-01
Комбинированная - невральная 0,46 (0,22-1,01) 5.23Е-02
Примененные методы и материалы
Мыши.
Все исследования на животных были одобрены Организацией по уходу за животными и комитетом по использованию (животных) мемориального онкологического центра рака 81оап-Кейетш£. Ыекйп-Туа;1пк4а/АтГ/- модель мыши (смешанная линия фона) была ранее описана (см. Е. ТсЬоидоипоуа е1 а1., Опсодепе 26, 6289 (2007)). Мышей дикого типа (^Т) С57ВЬ/6 и З-асйп-СРР (С57ВЬ/6) мышей приобретали у СЬат1е8 Юует ЬаЬогаЮпех и 1аск§оп ЬаЬотаФпек соответственно, и также размножали в пределах нашего вивария.
- 30 023999
Внутричерепные инъекции.
Инициирование опухолей с ΚСА8-Ρ^ΟΡ-Β-НА у взрослых мышей было ранее описано (А.Н. 81ιίη с1 а1., Сапсег Ке8 64, 4783 (2004)). Кратко, мышам делали общую анестезию посредством 10 мг/мл кетамина/1 мг/мл ксилазина и им подкожно вводили 50 мкл местного обезболивающего 0,25% бупивакаина в оперируемом участке. Мышам делали внутричерепные инъекции 1 мкл, содержащим 2x105 ОР-1:КСА8ΡΌΟΡ-Β-НА клеток, в возрасте между 5-6 неделями с применением фиксированного стереотактического прибора (81ое111пд). Инъекции делали в правую фронтальную кору, приблизительно 1,5 мм латерально и 1 мм каудально от брегмы, и на глубину 2 мм.
Чтобы исследовать экспрессию С8Р-1 и С8Р-1К, характерную для типа клеток в проточноцитометрических сортированных популяциях клеток, опухоли инициировали у мышей с ΚСА8-Ρ^ΟΡ-ΒНА-8V40-еΟΡΡ (ΚСА8-Ρ^ΟΡ-ΟΡΡ), как ранее описано (ЕТ. РотсПепко е1 а1., Ρ1ο8 ΟΝΕ 6, е20605 (2011)). Детенышам №кйп-^-а;1пк4а/АгГ/- вводили 1 мкл клеток ^Ρ-1:ΚСА8-Ρ^ΟΡ-Β-ΟΡΡ на 2 постнатальный день в левую кору между глазом и ухом.
Ингибитор ΒΕΖ945 и лечение.
Ингибитор С8Р-1К ΒΕΖ945 составляли в композицию с 20% каптизолом в концентрации 12,5 мг/мл. Плацебо контроль, 20% каптизол, получали тем же способом. Для исследований ΒΕΖ945 мышам вводили 200 мг/кг ΒΕΖ945 или плацебо (20% каптизол) перорально зондовым питанием один раз в сутки.
Чтобы определить, смогло ли лекарственное средство пройти сквозь гематоэнцефалический барьер, несущих опухоль мышей обрабатывали единичной дозой ΒΕΖ945 и умерщвляли в различные моменты времени после лечения. Плазма, а также левое (контралатеральное) и правое (несущее опухоль) полушария мозга были криостатно заморожены в жидком азоте для последующего анализа концентраций ΒΕΖ945 в ткани. Для долговременных исследований выживания дозирование начинали на этапе 17 дней/2,5 недель после введения ΚСА8-Ρ^ΟΡ-Β-НА. Для исследований с фиксированными моментами времени мышей подвергали сканированию МРТ на 4-5 неделе после введения ΚСА8-Ρ^ΟΡ-Β-НА, как ранее описано (Тгапк1 Опсо1 2, 89 (2009)).
Чтобы определить объем опухоли, области интереса (КО^ обозначали на Т2-взвешенных изображениях, и соответствующую им область в мм2 умножали на высоту среза 0,7 мм. Общий объем опухоли представляет собой сумму объема ΚΟI в каждом срезе и объема для первого и последнего среза, в котором появляется опухоль, деленную на два для аппроксимации объема трапеции. Когда объем опухоли составлял в диапазоне 4,5-40 мм3, животных брандомизированно распределяли в группы лечения. Третьей группе мышей с опухолями больше 40 мм3 также вводили ΒΕΖ945 (обозначены как ΒΕΖ945 большие). Группа, получающая плацебо в соответствии с размером, не была включена в эту группу, несущую большую стартовую опухоль, поскольку эти мыши не были бы способны остаться в живых к конечной точке испытания.
Умерщвление мыши и забор ткани.
Мышей подвергали эвтаназии в определенные моменты времени, как описано в условных обозначениях к чертежам, или когда у них наступали клинические проявления их опухолей, которые включали признаки плохого ухода, летаргию, потерю веса, сворачивание, макроцефалию или приступы.
Чтобы выделить ткани для криостатного замораживания в жидком азоте, мышей подвергали эвтаназии удушением диоксидом углерода или полностью анестезировали посредством авертина (2,2,2триброэтанол, 81дта), и им смещали шейные позвонки перед забором ткани. Для проточной цитометрии мышей полностью анестезировали посредством авертина и транскардиаольно опрыскивали 20 мл ΡΒ8. Затем мозг изолировали и опухоль макроскопически препарировали из окружающей нормальной ткани. Для анализа пролиферации мышам вводили 100 мг/г бромдиоксиуридина (Βτάυ; 81дта) внутрибрюшинно за 2 ч до умерщвления. Чтобы выделить ткани для замороженной гистологии, мышей полностью анестезировали посредством авертина и транскардиаольно опрыскивали 10 мл ΡΒ8 с последующими 10 мл 4%-го параформальдегида в ΡΒ8 (ГРА). Мозг постфиксировали в ΡΡА за ночь при 4°С, в то время как другие ткани сохраняли замораживанием в 30%-ной сахарозе и инкубировали при 4°С. Затем, после вторичной фиксации мозг перемещали в 30%-ную сахарозу и инкубировали при 4°С до тех пор, пока мозг не был полностью уравновешен и не опустился на дно колбы (как правило, 2-3 дня). Затем все ткани заливали в ОСТ (Т15кие-Тек) и применяли 10 микрометровые криостатные срезы ткани для всего последующего анализа.
Гистология, иммуногистохимия и анализ.
Для того чтобы оценить злокачественность опухоли, проводили окрашивание по гематоксилину и эозину (Н&Е), и ткани вслепую подсчитывал независимый невропатолог.
Для иммунофлюоресценции быстро замороженные срезы толщиной 10 мкм размораживали и сушили при комнатной температуре и затем промывали в ΡΒ8. Для стандартного протокола окрашивания срезы ткани блокировали в 0,5% ΡΝΒ в ΡΒ8 в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре или вплоть до конца ночи при 4°С, с последующей инкубацией в первичном антителе в 0,25% ΡΝΒ в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Информация о первичном антителе и разведении перечислена в табл. 6. Затем срезы отмывали в ΡΒ8 и инкубировали с подходящим флуорофор-сопряженным вторичным антителом ^окс^ат кгоЬек) в разведении 1:500 в 0,25% ΡΝΒ в
- 31 023999 течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания в РВ8 срезы ткани контрастно окрашивали с ΌΆΡΙ (5 мг/мл исходного раствора, разведение 1:5000 в РВ8) в течение 5 мин перед заливкой заливочной средой РтоЬопд Со1б АпйГабе (1пуйтодеп).
Для анализа ангиогенеза и пролиферации срезы ткани сначала подвергали восстановлению антигена, основанному на цитратном буфере, посредством погружения в антиген-демаскирующий раствор (0,94% объем/объем в дистиллированной воде; УесЮг ЬаЬогаЮОе:?) и выдерживания в микроволновке в течение 10 мин на половине мощности, с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 мин. Затем для анализа ангиогенеза ткани промывали в РВ8 и блокировали с мышиным 1д-блокирующим реагентом (УесЮг ЬаЬога1о11е5) согласно инструкциям изготовителя в течение 1 ч при комнатной температуре. Для анализа пролиферации, после восстановления антигена, срезы ткани инкубировали с 2М НС1 в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать ДНК, и затем в нейтрализирующем 0,1 М буфере борнокислого натрия (рН 8,5) в течение 5 мин. После отмывок в РВ8 остальную часть окрашивания выполняли согласно стандартному протоколу.
Для окрашивания для анализа фагоцитоза 10 мкм быстро замороженных срезов размораживали и сушили при комнатной температуре и затем промывали в РВ8. Секции ткани блокировали в 0,5% РЫВ в РВ8 в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией в первичном кроличьем антителе к расщепленной каспазе-3, разбавленном 1:500 в 0,5% РЫВ, в течение ночи при 4°С. На следующий день срезы промывали 6 раз в течение 5 мин в РВ8 перед инкубацией с вторичным антикроличьим антителом козы А1еха568 (1:500 в 0,5% РЫВ) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем срезы ткани промывали 6 раз в течение 5 мин в РВ8 и блокировали в течение ночи при 4°С в новом буфере 5%-ной сыворотки осла, 3%-го бычьего сывороточного альбумина и 0,5% РЫВ в РВ8. На следующий день срезы инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре со следующим набором первичных антител: кроличье аий-О11§2 (1:200) и крысиное ап11-СЭ11Ь(1:200). разведенных в 5%-й сыворотке осла, 3%-м бычьем сывороточном альбумине и 0,5% РЫВ в РВ8. Срезы промывали 6 раз в течение 5 мин в РВ8 перед инкубацией с вторичным антикроличьим антителом осла А1еха647 (1:500) и вторичным антикрысиным антителом осла А1еха488 (1:500) в 0,5% РЫВ в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем срезы ткани промывали 4 раза в течение 5 мин в РВ8 перед окрашиванием с ЭЛР1 (5 мг/мл стоковый раствор, разведенный 1:5000 в РВ8) в течение 5 мин, еще дважды в РВ8 в течение 5 мин и заливали заливочной средой РтоЬоид Со1б АпОГабе (1пуйтодеп). Совместное окрашивание для С8Р-1К (первое первичное антитело) и !Ьа1 (второе первичное антитело) также выполняли последовательно тем же самым образом, с добавлением восстановления антигена, основанного на цитратном буфере, вначале.
Срезы ткани визуализировали под микроскопом Саг1 2е188 Ахюшадет Ζ1, оборудованным АроЮте. Анализ иммунофлюоресцентного окрашивания, количества клеток, пролиферации, апоптоза и исследований колоколизации проводили с применением аналитического программного обеспечения Т|88иеОие81 (Т188иеСио8ЙС8), как ранее описано (1оигпа1 1ттипо1 Ме(Ъоб8 237, 39 (2000)).
Обзор срезов ткани от глиом, окрашенных для анализа ангиогенеза, осуществляли с помощью обрабатывающего программного обеспечения Т188иеОпо8ЙС8 посредством сшивки вместе индивидуальных 200х (увеличенных в 200 раз) изображений.
Все параметры ангиогенеза подсчитывали путем применения Ме1аМогрН (Мо1еси1аг Оеуюе8), как ранее описано (У. Оосйеуа, е! а1., Вю1 С’Нет 391, 937 (2010)).
Для анализа фагоцитоза 15 случайно выбранных областей общего вида изнутри опухоли обрабатывали с применением 63 х объектива для масляной иммерсии (общее увеличение 630х) и АроЮте, чтобы гарантировать, что клетки были в том же самом оптическом разрезе. Положительные клетки подсчитывали вручную с применением Уо1осПу (Ретк1иЕ1тет) и опознавали по наличию ЭАР1+ ядер. Апоптотические клетки подсчитывали как те, которые содержали окрашивание по эндоплазматической расщепленной каспазе-3 (СС3)+ и конденсированные ядра. Клетку считали поглощенной макрофагом, когда она была окружена смежным СЭ11Ь+ кольцом, которое окружало, по меньшей мере, две трети каймы клетки. Количество проанализированных мышей указано в описаниях фигур.
Выделение белков и Вестерн-блоттинг.
Мышам вводили В^Ζ945 или плацебо и умерщвляли 1 ч спустя итоговой дозы и отбирали образцы опухолей. Образцы биохимически фракционировали, как описано ранее. Фракции синаптосомальных мембран растворяли в лизисном буфере ЫР-40 (0,5% ЫР-40, 50 мМ ТГ18-НС1 [рН 7,5], 50 мМ ЫаС1, 1кратная смесь абсолютного протеазного ингибитора Μίηί (Косйе), 1-кратная смесь ингибитора фосфатазы Р1Ю88ТОР (Косйе)) и белок определяли количественно с применением анализ ВСА (Р1етсе). Белковые лизаты наносили (90 мкг/лунка) на 808-РАСЕ гели и переносили на мембраны РУОР для иммуноблоттинга.
Мембраны исследовали с антителами к фосфо-С8Р-1К Υ721 (1:1000; Се11 81диаШп§ ТесЬпо1о§у), С8Р-1К (1:1000; 8ап1а Сти/ Тесйпо1о§у) или САРОН (1:1000; Се11 81дпаШп§ Тесйпо1о§у) и детектировали с применением НКР-конъюгированных кроличьих (1аск8оп 1ттипоге8еагсй) антител с применением хемилюминесцентного детектирования (Мййроте). Бэнды от Вестерн-блоттингов определяли количественно в динамическом диапазоне с применением аналитического модуля Се1 в программном обеспечении
- 32 023999
1таде1.
Макрофаги, происходящие из первичного костного мозга (ΒΜΌΜ), культивировали в отсутствие С8Р-1 в течение 12 ч перед стимуляцией С8Р-1 (10 нг/мл) в моменты времени, указанные на фиг. 82, в присутствии или отсутствие 67 нМ ΒΕΖ945. Лизаты общего белка выделяли с применением лизисного буфера ΝΡ40 и детектировали посредством Вестерн-блоттинга, как описано выше.
Получение суспензий единичных клеток и проточная цитометрия.
Для исследования популяций макрофагов мозга посредством проточной цитофотометрии или сортировки опухоль перерабатывали в суспензию отдельных клеток инкубацией с 5 мл раствором расщепления папаином (0,94 мг/мл папаина |Аог1к1пд1оп|. 0,48-мМ ΕΌΤΆ, 0,18 мг/мл Ν-ацетил-Ь-цистеина [81дта], 0,06 мг/мл дезоксирибонуклеазы I [81дта], разведенных в сбалансированном солевом растворе Эрла) и выдерживали для активации при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 30 минут. После расщепления фермент инактивировали добавлением 2 мл 0,71 мг/мл овомукоида (ХУогОипдЮп). Суспензию клеток затем пропускали через 40 мкм сеть для удаления нерасщепленной ткани, промывали РАС8 буфером (1% Β8Α без 1дС в ΡΒ8 Цаскъои 1ттипоте8еагсй]) и центрифугировали при низкой скорости 750 об/мин (8отуа11 Ьедепб КТ), чтобы удалить остатки и получить клеточный осадок. Поскольку много эпитопов иммунных клеток, чувствительны к папаину, для исследования инфильтрации иммунных клеток проточной цитофотометрией опухоли перерабатывали в суспензию отдельных клеток инкубацией в течение 10 минут при 37°С с 5 мл 1,5 мг/мл коллагеназы III (\Уог11ипд1оп) и 0,06 мг/мл дезоксирибонуклеазы I в 1-кратном сбалансированном солевом растворе Хэнкса (ΗΒ88) с кальцием и магнием.
Затем суспензию клеток промывали с ΡΒ8 и пропускали через 40 мкм мембрану, чтобы удалить необработанную ткань. Чтобы удалить остатки миелина, клеточный осадок повторно ресуспендировали в 15 мл при 25% перколла комнатной температуры, приготовленного из стокового изотонического перколла (90% перколл [81дта], 10% 10х ΗΒ88), и затем центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин (8отуа11 Ьедепб КТ) с ускорителем и тормозом, установленными на 1. Затем клеточный осадок промывали с 1-кратным ΗΒ88 перед тем, как его повторно суспендировать в РАС8 буфере. После подсчета клетки инкубировали с 1 мкл Β1оск Рс для каждого миллиона клеток в течение по меньшей мере 15 мин при 4°С. Затем клетки окрашивали соответствующими антителами в течение 10 мин при 4°С, промывали с РАС8 буфером и повторно ресуспендировали в РАС8 буфере, содержащем БАР! (5 мг/мл, разведенный 1:5000), для выделения живых/мертвых клеток. Антитела, примененные для проточной цитометрии, перечислены в табл. 6.
Таблица 6
Список антител и источников
Антитело Клон Поставщик Флюорофор(ы) Разведение
СО45 30-Р11 Βϋ РЬаггттдеп Р1ТС.АРС, РЕ-Су7 1:100-1:200
СЭЗе 145-2С11 Βϋ Рпагтюдеп РЕ-Су7 1:250
Сг-1 КВ6-8С5 Βϋ РЬаггттдеп Е1ТС 1:200
СО4 ΘΚ1,5 Βϋ РЬаггттдеп РЕ 1:1000
СЭ11Ь М1/70 Βϋ РЬаггтпдеп А488, АРС, РЕ 1:200
1_у6О 1А8 Βϋ Рпагтюдеп РЕ-Су7 1:2000
Р4/80 С1:АЗ-1 8его1ес РЕ 1:50
СО8а 53-6,7 Вю1едепс1 А488 1:1000
СО19 6Э5 Вю1едепс1 РЕ 1:2000
ΝΚ1,1 РК136 Вю1едепс1 АРС 1:1000
СЭ206 МР5ЭЗ Вю1едепс1 А488 1:50
Для анализа образцы пропускали на ΒΌ Ь8К II Щес1оп БюкЧет) и всю последующую корректировку и установку дискриминационного окна выполняли с аналитическим программным обеспечением Р1о\\'1о (Ттее81ат). Для сортинга образцы пропускали на сортере клеток ΒΌ РАС8Апа (РесЮп БкЫеш) и клетки собирали в РАС8 буфер. Затем клетки центрифугировали и повторно суспендировали в 500 мкл Тризола (ЗпуПгодеп) перед моментальной заморозкой в жидком азоте и хранением при -80°С.
Получение первичных культур глиомы мыши, нейросфер и клеточных линий глиомы.
Микропрепарируемые опухоли дегистировали в суспензию отдельных клеток посредством инкубации в течение 8-12 мин при 37°С, как описано выше. Клеточную суспензию промывали базальной средой (81ет Се11 ТесЬпо1од1е8) невральных стволовых клеток (N80) и центрифугировали при низкой скорости (750 об/мин, 8отуа11 Ьедепб КТ), чтобы удалить остатки. Чтобы получить первичные культуры глиомы мыши, клеточный осадок повторно суспендировали в ΌΜΕΜ, содержащем 10% РΒ8 (С1Ьсо). Эти первичные культуры применяли при раннем пассаже (Р2-Р3), и они содержали смесь различных типов клеток, найденных в глиомах, включая опухолевые клетки, макрофаги и астроциты, как определено иммунофлюоресцентным окрашиванием. Первичные культуры глиомы культивировали в течение 24 ч на по- 33 023999 кровных стеклах, покрытых ро1у-Ь-1у8ше (ΒΌ ΒίοοοαΙ). Затем клетки фиксировали с 4%-ным РРА в 0,1М фосфатном буфере в течение ночи при 4°С, пермеабилизировали с 0,1% ТгПоп-Х в течение 5 мин и блокировали с 0,5% ΡΝΒ в течение по меньшей мере 1 ч. Исследование на наличие макрофагов, опухолевых клеток и астроцитов проводили иммунофлюоресцентным окрашиванием на СБ11Ь (1:200), №δΐίη (1:500) и СРАР (1:1000), соответственно (табл. 7).
Таблица 7
Список антител, примененных для окрашивания
Антитело Клон Поставщик Разведение
Козьи к антитела СО31 мыши -- МВ ЗуЫета 1:100
Мышиные антитела к актину гладких мышц (ЗМА) человека 1А4 ОакоСу1ота110П 1:100
Кроличьи антитела к расщепленной каспазе 3 (Авр175) (ССЗ) Се11 &|дпа1|пд ТесЬпо1оду 1:500
Кроличьи антитела и СЗР-1Р человека С-20 Зал1а Сш2 1:200
Кроличьи антитела к 1Ьа1 человека -- Иако 1:1000
Кроличьи антитела к зеленому флуоресцентному белку (СРР) Мо1еси1аг РгоЬе5 1:200
Кроличьи антитела к 0Пд2 -- МП Проге,'СНегтпсоп 1:200
Мышиные антитела к ΝβΒΐίη крысы -- Βϋ Рпагггмпдеп 1:500
Крысиные антитела к СО11Ь мыши М1/70 Βϋ Рпагггмпдеп 1:200
Крысиные антитела к Вгс1и Ви1/75(1СР1) 5его(ес 1:200
Крысиные антитела к Οϋ68 мыши РА-11 Зего1ес 1:1000
Куриные антитела к СРАР -- АЬсат 1:1000
Для образования нейросферы клеточные осадки повторно ресуспендировали в средах нейросфер, состоящих из базальных сред мыши N80, пролиферативных добавок N80, 10 нг/мл ЕСР, 20 нг/мл основнго фактора роста фибробластов Ва81с-РСР и 1 мг/мл гепарина (81ет Се11 ТесЬпо1од1е8). Свежие среды добавляли каждые 72 ч в течение 2 недель. Первичные нейросферы собирали, механически разъединяли в суспензию отдельных клеток и размножали последовательным пассированием. Для получения клеточных линий глиомы вторичные нейросферы диссоциировали в суспензии отдельных клеток и культивировали в БМЕМ+10% РВ8 в виде монослоя. Многочисленные клеточные линии глиомы получали из независимых мышей, обозначенных в настоящем описании СВМ1-4. Клетки глиомы инфицировали конструкцией рВаЬе-Н2В-шСЬеггу, как описано ранее (О. Р1огеу, е1 а1., Ναι Се11 Βίο1 13, 1335 (2011)).
Выделение полученных из костного мозга макрофагов (ВМБМ).
Для выделения костного мозга с последующим получением макрофагов С57ВЬ/6 ^Т, С57ВЬ/6 βасйп-СРР или №8Йп-Ту-а; 1пк4а/АгГ- мышей анестезировали авертином (81дша) и затем умерщвляли посредством смещения шейных позвонков. Бедренные кости и большие берцовые кости извлекали в стерильных условиях из обеих лап и промывали. Мозг пропускали через 40 мкм фильтр и культивировали в 30 мл пакетах Тейоп® (РегшаЫГе РЬ-30) с 10 нг/мл С8Р-1 рекомбинантной мыши (К&Б 8у81ет8). Клетки костного мозга культивировали в пакетах ТеЯоп® в течение 7 дней со свежими С8Р-1-содержащими средами, заменяющими старые через день, чтобы индуцировать дифференцировку макрофагов.
Дополнительные клеточные линии глиомы И-87 МС (НТВ-14) и клеточные линии микроглии СКЕ2467 приобретали у АТСС. Клеточную линию МС И-87 культивировали в БМЕМ+10% РВ8. Клеточную линию СКЬ-2467 культивировали в БМЕМ+10% РВ8 с 30 нг/мл С8Р-1 рекомбинантной мыши.
Среду из экспериментов с кондиционированной клеточной средой глиомы (ССМ), которую кондиционировали опухолевыми линиями глиомы, выращенными в среде без сыворотки в течение 24 ч, пропускали через 0,22 мкм фильтры, чтобы удалить продукты распада клеток, и обозначали в настоящем описании как кондиционированную клетками глиомы среду (ССМ). ССМ применяли, чтобы стимулировать дифференцированные \УТ С57ВБ/6 или в-асйп-СРР+ ВМБМ. Контрольные макрофаги получали свежие среды, содержащие 10%-ый РВ8 и 10 нг/мл С8Р-1 рекомбинантной мыши. Где указано, дифференцированные ВМБМ культивировали в ССМ, содержащей или БМ8О в качестве плацебо, или 67 нМ ВЬ2945, 670 нМ ВЬ2945, или в обычных средах, содержащих 10 нг/мл С8Р-1 мыши и 10 нг/мл 1Ь-4 (К&Б 8у81еш8) в течение 24 ч или 48 ч перед экспериментальным анализом.
Анализ экспрессии Мгс1/СБ206 проточной цитометрией.
Для первичных культур глиомы мыши (содержащих смешанную популяцию опухолевых клеток, ОАМ, астроциты и т.д.) 1х106 клеток культивировали в БМЕМ+10% РВ8 в присутствии ВБ2945 или БМ8О в качестве плацебо. Для ВМБМ 1 х 106 клеток культивировали в БМЕМ с добавлением С8Р-1 рекомбинантной мыши или ССМ в присутствии ВЬ2945 или БМ8О в качестве плацебо. После 48 ч клетки снимали и промывали РАС8 буфером. Клетки подсчитывали и инкубировали с 1 мкл Рс В1оск (ВБ РЬагтшдеп) на 106 клеток в течение по меньшей мере 15 мин при 4°С. Затем клетки окрашивали СБ45 и СБ11Ь антителами в течение 10 мин при 4°С и промывали РАС8 буфером. Клетки фиксировали и пермеабилизировали с применением ВБ Су1ойх/Су1орегт™ Κίΐ (ВБ Вю8шепсе8) согласно инструкциям из- 34 023999 готовителя. Впоследствии клетки окрашивали антителом к СИ206. Для анализа образцы пропускали на ΒΌ ΕδΚ II Щекоп И|ск51е1п) и всю последующую корректировку и установку дискриминационного окна выполняли при помощи аналитического программного обеспечения Р1о\\По (Τ^ееδΐа^).
Анализ клеточного цикла.
Контроль или предварительно стимулированные ОСМ макрофаги, полученные из 3-асНп-ОРР+ мышей, совместно культивировали в отношении 1:1 с 1 х 105 шСйеггу-положительных клеток глиомы без сыворотки (из клеточных линий, полученных выше) в течение 48 ч в присутствии 670 нМ ΒΕΖ945 или ΩΙ^δΟ в качестве плацебо. После сбора трипсинизированных совместно культивированных клеток лунки промывали в дополнительных средах и этот объем собирали, чтобы гарантировать сбор всех макрофагов, которые плотно прилегали к чашкам для клеточных культур. Затем образцы промывали единожды РΑСδ буфером с последующей инкубацией в течение 10 минут при комнатной температуре в пермеабилизирующем буфере (10 мМ ΡΡΕδ. 0,1 М ЫаС1, 2 мМ МдС12, 0,1% Тритон Х-100, рН 6,8), содержащем 0,1 мг ИАР! (!пу|1годеп). После получения на проточном цитометре ΕδΚ II (ΒΌ) с применением ИУ лазера (350360 нм) анализировали статус клеточного цикла опухолевых клеток глиомы с применением программы Р1о№ 1о Иеап-.Тей-Рох для анализа клеточного цикла.
Анализы пролиферации.
Скорость роста клеток определяли с применением набора клеточной пролиферации МТТ (Коске). Кратко, клетки помещали в 96-луночные плашки в трех экземплярах (1х103 клеток/лунку для клеточных линий глиомы и 5х103 клеток/лунку для ΒМ^М и СКЬ-2467 клеток) в присутствии или отсутствие 6,76700 нМ ΒΕΖ945. Среды меняли каждые 48 ч. К клеткам ΒМ^М и клеткам СКЬ-2467 добавляли 10 нг/мл и 30 нг/мл СδР-1 рекомбинантной мыши, соответственно, если иначе не указано. 10 мкл реагента мечения МТТ добавяли в каждую лунку и затем инкубировали в течение 4 ч при 37°С с последующим добавлением 100 мкл солюбилизирующего реагента МТТ на ночь. Смесь мягко ресуспендировали и абсорбцию измеряли при 595 и 750 нм на спектрофотометре для прочтения планшетов 8рес1гаМа\ 340рс (Мо1еси1аг Ие\асе8).
Анализ образования вторичных нейросфер.
Первичные нейросферы разъединяли в суспензию отдельных клеток и 5х103 клеток помещали в 6луночные плашки в среды для нейросфер в присутствии ΒΕΖ945 или ПМЗО в качестве плацебо. Среды меняли каждые 48 ч. Образование вторичных нейросфер оценивали путем подсчета количества нейросфер, полученных после 2 недель.
Изоляция РНК, синтез кДНК и количественный РСК в реальном времени.
РНК выделяли тризолом, обрабатывали дезоксирибонуклеазой и 0,5 мкг РНК применяли для синтеза кДНК. Зонды Тасрпап (Аррйей Β^λΈ^η® для СЙ11Ь (Мт00434455_т1), СЙ68 (Мт03047343_т1), С8П-1 (Мт00432688_т1), С8П-1г (Мт00432689_т1), 1134 (Мт00712774_т1), Мгс1 (Мт00485148_т1) и Τν-а (си81от) применяли для количественной ПЦР. Испытания проводили в трех повторностях и экспрессию нормализовали по убиквитину С (Мт01201237_т1) для каждого образца.
Микроматричный анализ и определение профиля экспрессии генов.
Все образцы получали и обрабатывали в Профильном Центре по геномике в МδΚСС. РНК выделяли с применением тризола и качество оценивали с применением прогонки на АдйеШ Β^ηκ-ιΠ^ΐ'. 75 нг общей РНК подвергали обратной транскрипции и помечали с применением набора экспрессии ОепесЫр 3' ГУТ (АППушейтх). Полученную в результате кРНК гибридизировали на чипах АПуте1п\ МОЕ 430А 2.0. Исходные данные об экспрессии анализировали с применением ОСΟδ 1.4 (АПуте1п\). Данные нормализовали к интенсивности цели 500, чтобы оценить различия в общей интенсивности чипа.
Микроматричный анализ.
Все биоинформатические исследования осуществляли в К с применением пакетов Β^οсοηάисΐο^ διι®. Функциональные значения экспрессии МиШ-Аггау Ауегаде (КМА) генерировали с применением пакета аППу и квантильной нормализации (К.А. М/апу еΐ а1., №.1с1ею Ас® Ке8. 31, е15 (2003); Ь. ОаиПег, еΐ а1., Β^ο^ηΓο^таι^С8 20, 307 (2004)). Пакет йтша (О.К. δтуΐЬ, δίаί^8ΐ^са1 АррПсаПоп8 ίη ОепеРс8 апй Мо1еси1аг Β^ο1ο§у 3, АгПс1е 3 (2004)) применяли, чтобы идентифицировать дифференцированно экспрессированные гены между плацебо и образцами, которым вводили ΒΕΖ945. Дифференцированную экспрессию считали значительной при кратности изменении ±2 с уровнем ложноположительных результатов 10%. Анализ получения дополнительной информации о конфигурации генов (ОδΕΑ) применяли так, как описано ранее (15). Для последующего анализа и сравнения с наборами данных человека значения экспрессии мыши представляли собой средние значения, центрированные по всем образцам.
Метод оценки регрессии Лассо для идентификации генных сигнатур.
Данные об экспрессии мыши нормализовали и среднее значение центрировали, как описано выше. Дифференцированно экспрессированные гены применяли для дополнительного анализа. Модель регрессии Лассо настраивали на дифференцирование между плацебо и образцами, которым вводили ΒΕΖ945, с применением пакета д1тпе1 (I Рпейтап, еΐ а1., 1опгпа1 оП δίаΐ^8ΐ^са1 δοΠ\γа^е 33, 1 (2010)). Параметр регуляризации для регрессии Лассо выбирали 4-кратной перекрестной проверкой достоверности.
- 35 023999
Наборы данных пациентов.
Данные об экспрессии ТСОА загружали с портала данных ТСОА и все клинические данные загружали с портала данных <1Шр://1сда-ба1ал1сйпйдоу/1сда/1сдаНоте2.йр> Клинические данные и данные по экспрессии для набора данных КетЬгапб! загружали с <ййр8://саш1едга1ог.пс1.шйдоу/гетЬгапб1/> Наборы данных Ргеуе (О8Е4412), Мига! (О8Е7696) и Рйййрк (О8Е4271) загружали с NСΒI <1Шр://\у\у\ул1сЬгп1тлййдоу/део/> Для наборов данных Ргеуе рассматривали только образцы, которые прогоняли на платформе НОИ133А, поскольку образцы на платформе ΗΟΠ133Β содержали минимальное перекрытие с остальными наборами данных. Каждый набор данных импортировали отдельно с применением пакета Айу и генерировали КМА значения экспрессии. Во всех наборах данных проводили квантильную нормализацию и среднее значение для каждого гена центрировали по всем пациентам.
Выделение подтипа не-ТСОА пациентов.
Для исследования специфических различий в продолжительности жизни подтипа во всех публично доступных наборах данных применяли классификатор подтипа, описанный ранее (К.О. Уегйаак е! а1., Сапсег Се11 17, 98 (2010)), чтобы настроить метод опорных векторов (8УМ). 840 генов, примененных Уегйаак и коллегами для анализа С1ас№, применяли для получения подвыборки набора данных. Впоследствии, из наборов данных были взяты подвыборки для генов, которым присваивали статус встречаемых во всех наборах данных пациентов, описанных выше. Оставшиеся 776 генов применяли, чтобы настроить мультикласс 8УМ на основные образцы из набора данных ТСОА. 8УМ завершали с применением радиально-базисной функции ядра Гаусса с применением пакета кегп1аЬ (А. Кага1/од1ои, е! а1., 1. 8!аЙ8Йса1 8ой^аге, 11, 9 (2004)). Затем этот 8УМ применяли, чтобы предсказать подтип остальных ТСОА-пациентов и общественных наборов данных.
Классификация пациентов.
8УМ настраивали на данные по экспрессии мыши для классификации пациентов в классификацию Плацебо и ΒΕΖ945. Из данных экспрессии пациентов были взяты подвыборки общих генов во всех наборах данных и генов, у которых имелись известные мышиные гомологи. Точно так же из данных по экспрессии мыши были взяты подвыборки генов с человеческими гомологами, которые были общими во всех образцах пациентов. Впоследствии, из данных мыши выделяли подвыборку дифференцированно экспрессированных генов, идентифицированных с применением пакета йтта. Из данных человека были взяты подвыборки для человеческих гомологов этих дифференцированно экспрессированных генов. Это привело к сокращению элементов от 257 дифференцированно экспрессированных генов до 206 дифференцированно экспрессированных генов с известными человеческими гомологами во всех наборах данных пациентов. Затем применяли пакет кегп1аЬ, чтобы настроить 8УМ на данные по экспрессии мыши с применением Ванильной функции ядра. Затем этот 8УМ применяли, чтобы предсказать отнесение пациентов или в классификатор Плацебо или в классификатор ΒΕΖ945.
Подобный подход применяли, чтобы классифицировать пациентов с применением модели регрессии Лассо. Выделение подвыборок пациентов и данные по мыши были идентичны описанным выше. Вместо применения пакета кегп1аЬ, модель регрессии Лассо настраивали с применением пакета д1тпе!. Затем эту модель применяли, чтобы предсказать отнесение пациентов или в классификатор Плацебо или в классификатор ΒΕΖ945. Статус пациента О-С1МР определяли иерархическим объединением в кластеры данных пациентов о метилировании (Н. №и8Йтейг е! а1., Сапсег Се11 17, 510 (2010)), как описано ниже.
Стратификиция пациентов по статусу О-С1МР.
Экспериментально, по-видимому, преимущество в выживании, представленное сигнатурой введения ΒΕΖ945, получалось не из-за обогащения пациентами с фенотипом СрО-островного метилятора (ОС1МР), которое, как ранее было показано, ассоциировано с улучшенным общим выживанием (№и§йтейг). Из этих 453 МФГ, проанализированных из набора данных ТСОА, 263 также содержали геномные данные о метилировании и были отнесены в кластеры метилирования, как описано ранее. Из 21 пациента О-С1МР, 20 (95%) были отнесены к классификации ΒΕΖ945, демонстрирующей значительное обогащение образцов ΒΕΖ945 в пациентах О-С1МР. Несмотря на это обогащение, анализ выживаемости проневральных пациентов, как известно, был ОС1МР негативным (67/133 от общего числа проневральных пациентов), показал, что группа классификации ΒΕΖ945 все еще демонстрировала увеличение в продолжительности жизни на ~10,8 месяцев (Р=0,014).
Кроме того, модель пропорциональных рисков Кокса продемонстрировала, что увеличение выживания, продемонстрированное классификацией ΒΕΖ945, не зависело от пациентов О-С1МР. Отношение рисков, ассоциированное с сигнатурой ΒΕΖ945, было значительным с и без пациентов О-С1МР. Кроме того, отношение рисков для группы О-С1МР не было значительным, когда сигнатура ΒΕΖ945 также рассматривалась в смешанной модели. Таким образом, хотя пациенты О-С1МР очевидно обогащены имитирующими ΒΕΖ945 образцами классификации, преимущество выживания, представленное этой классификацией, не зависит от статуса ОС1МР.
Анализ продолжительности жизни.
Анализ продолжительности жизни выполняли с применением пакета 8игу1уа1 в К (Т. Тйегпеаи, ш К раскаде уегмоп 2.36-12 (2012)). Отношения рисков определяли с применением функции сохрй из па- 36 023999 кета §игу1уа1. Пациентов стратифицировали на основе вероятности модели классификации оценки регрессии Лассо, статуса О-ОМР или обоих, как указано. Значения Р получали с применением теста \\'а1с1.
Графические изображения анализа пациентов.
Все кривые продолжительности жизни Кар^-Мехет, карты интенсивности и диаграммы рассеяния νοίοαηο получали в К ν 2.14.1, с применением пакета βρίοίδ (О.К. \\'ате5 еί а1., К раскаде \Όΐ'δίοη 2.10.1, (2011)). МлеЛ-диаграммы разброса отношения рисков получали в ОгарЬРаб Рг1§ш Ργο5.
Представление данных и статистический анализ.
Данные представлены как средние с соответствующей им стандартной ошибкой (8ЕМ) или как статистические диаграммы разброса с применением ОгарЬРа! Рп§ш Рго5. Числовые данные анализировали непарным двусторонним ί-тестом Стьюдента, если не указано иное. Для кривых продолжительности жизни значения Р получали с применением теста 5ορ Каик (МайеР^х) и применяли точный тест Фишера для гистологической оценки стадии опухоли. Р=0,05 считали статистически значимым.

Claims (7)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения ассоциированных с опухолью макрофагов и микроглии у субъектамлекопитающего, имеющего мультиформную глиобластому, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы или его фармацевтически приемлемую соль.
  2. 2. Способ по п.1, где соединение формулы представляет собой или его фармацевтически приемлемую соль.
  3. 3. Способ по п.1, где соединение формулы представляет собой или его фармацевтически приемлемую соль.
  4. 4. Способ по п.1, где способ дополнительно включает введение субъекту эффективного количества дополнительного противоракового терапевтического агента, выбранного из бевацизумаба с иринотеканом или без него, нитрозомочевин, платина, алкилирующего агента, ингибитора тирозинкиназы, украина и каннабиноида.
  5. 5. Способ по п.1, где указанное соединение вводят перорально.
  6. 6. Способ по п.1, где количество указанного соединения, вводимое субъекту, составляет между приблизительно 50 и приблизительно 500 мг/кг в сутки.
  7. 7. Способ по п.1, где указанное вводимое соединение включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
EA201391629A 2011-05-05 2012-05-04 Ингибиторы csf-1r для лечения опухолей головного мозга EA023999B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161482723P 2011-05-05 2011-05-05
US201261624861P 2012-04-16 2012-04-16
PCT/US2012/036589 WO2012151523A1 (en) 2011-05-05 2012-05-04 Csf-1r inhibitors for treatment of brain tumors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391629A1 EA201391629A1 (ru) 2016-01-29
EA023999B1 true EA023999B1 (ru) 2016-08-31

Family

ID=46062775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391629A EA023999B1 (ru) 2011-05-05 2012-05-04 Ингибиторы csf-1r для лечения опухолей головного мозга

Country Status (19)

Country Link
US (3) US20140065141A1 (ru)
EP (1) EP2704713B1 (ru)
JP (1) JP6046702B2 (ru)
KR (1) KR101938431B1 (ru)
CN (1) CN103501785B (ru)
BR (1) BR112013028095B1 (ru)
CA (1) CA2834696C (ru)
CY (1) CY1119642T1 (ru)
DK (1) DK2704713T3 (ru)
EA (1) EA023999B1 (ru)
ES (1) ES2622527T3 (ru)
HR (1) HRP20170593T1 (ru)
HU (1) HUE032754T2 (ru)
LT (1) LT2704713T (ru)
MX (1) MX347616B (ru)
PL (1) PL2704713T3 (ru)
PT (1) PT2704713T (ru)
SI (1) SI2704713T1 (ru)
WO (1) WO2012151523A1 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014147631A1 (en) * 2013-03-22 2014-09-25 Natco Pharma Limited Formulation comprising gefitinib as oral suspension
WO2016182988A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for treatment of glioma
WO2016189045A1 (en) * 2015-05-27 2016-12-01 Ucb Biopharma Sprl Method for the treatment of neurological disease
US11065332B2 (en) 2015-11-04 2021-07-20 Duke University Combination therapy of immunotoxin and checkpoint inhibitor
WO2018069893A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Novartis Ag Methods for treating ocular disease using inhibitors of csf-1r
WO2018069892A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Novartis Ag Crystalline forms of 4-(2-((1r,2r)-2-hydroxycyclohexylamino) benzothiazol-6-yloxy)-n-methylpicolinamide
CA3040914A1 (en) 2016-11-03 2018-05-24 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell based therapy and a microglia inhibitor
WO2018223101A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods for treatment using adoptive cell therapy
CN111201438A (zh) 2017-06-02 2020-05-26 朱诺治疗学股份有限公司 与和细胞疗法相关的毒性有关的制品和方法
CN111050545A (zh) 2017-06-29 2020-04-21 朱诺治疗学股份有限公司 评估与免疫疗法相关的毒性的小鼠模型
EP3676403A1 (en) 2017-09-01 2020-07-08 Juno Therapeutics, Inc. Gene expression and assessment of risk of developing toxicity following cell therapy
US11564946B2 (en) 2017-11-01 2023-01-31 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
EP3836951A1 (en) 2018-08-13 2021-06-23 Signablok, Inc. Peptides and compositions for targeted treatment and imaging
PT3886875T (pt) 2018-11-30 2024-06-27 Juno Therapeutics Inc Métodos para tratamento utilizando terapia celular adotiva
FI3886894T3 (fi) 2018-11-30 2024-05-24 Juno Therapeutics Inc Menetelmiä annosteluun ja b-solumaligniteettien hoitoon adoptiivisessa soluterapiassa
CN110468210A (zh) * 2019-09-12 2019-11-19 暨南大学 Cdc45作为胶质母细胞瘤标志物及其作为治疗靶点的应用
BR112022010310A2 (pt) 2019-12-06 2022-08-16 Juno Therapeutics Inc Métodos relacionados com a toxicidade e resposta associada com terapia celular para tratamento de malignidades de célula b
TW202220988A (zh) * 2020-09-21 2022-06-01 大陸商和記黃埔醫藥（上海）有限公司 雜芳環類化合物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007121484A2 (en) * 2006-04-19 2007-10-25 Novartis Ag 6-o-substituted benzoxazole and benzothiazole compounds and methods of inhibiting csf-1r signaling
WO2007119046A1 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Astrazeneca Ab 4-anilinoquinoline-3-carboxamides as csf-1r kinase inhibitors
WO2008144062A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Novartis Ag Csf-1r inhibitors, compositions, and methods of use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100721656B1 (ko) 2005-11-01 2007-05-23 주식회사 엘지화학 유기 전기 소자
CN101432281B (zh) * 2006-04-19 2013-08-28 诺瓦提斯公司 6-0-取代的苯并*唑和苯并噻唑化合物以及抑制csf-1r信号传导的方法
EP2016070B1 (en) 2006-04-20 2016-01-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Inhibitors of c-fms kinase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007119046A1 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Astrazeneca Ab 4-anilinoquinoline-3-carboxamides as csf-1r kinase inhibitors
WO2007121484A2 (en) * 2006-04-19 2007-10-25 Novartis Ag 6-o-substituted benzoxazole and benzothiazole compounds and methods of inhibiting csf-1r signaling
WO2008144062A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Novartis Ag Csf-1r inhibitors, compositions, and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONIGLIO SALVATORE J. ET AL.: "Microglial Stimulation of Glioblastoma Invasion Involves Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and Colony Stimulating Factor 1 Receptor (CSF-1R) Signaling", MOLECULAR MEDICINE, vol. 18, no. 3, 27 January 2012 (2012-01-27), pages 519-527, XP002679581, (BALTIMORE) ISSN: 1076-1551 abstract page 519, column 3, paragraph 2 - page 520, column 3, paragraph 1 figure 3 page 526, column 3, paragraph 2 - page 527, column 1, paragraph 1 *
KOMOHARA Y. ET AL.: "Possible involvement of the M2 anti-inflammatory macrophage phenotype in growth of human gliomas", JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 216, no. 1, September 2008 (2008-09), pages 15-24, XP002679579, ISSN: 0022-3417 abstract page 19, column 1, last paragraph - column 2, paragraph 3 page 22, column 1, paragraph 3 - column 2, paragraph 1 *
Tracey W.R., Jefferson A.B.: "NIBR Postdoctoral Program", 21 September 2010 (2010-09-21), pages 1-2, 40, XP002679580, Retrieved from the Internet: URL:http://med.stanford.edu/careercenter/highlights/files/Novartis%20PowerPoint.pdf [retrieved on 2012-07-09] page 40 *

Also Published As

Publication number Publication date
SI2704713T1 (sl) 2017-05-31
PT2704713T (pt) 2017-04-24
ES2622527T3 (es) 2017-07-06
LT2704713T (lt) 2017-04-25
PL2704713T3 (pl) 2017-08-31
EP2704713B1 (en) 2017-01-18
WO2012151523A1 (en) 2012-11-08
US20140065141A1 (en) 2014-03-06
CA2834696A1 (en) 2012-11-08
KR20140029475A (ko) 2014-03-10
KR101938431B1 (ko) 2019-01-14
AU2012250574A8 (en) 2016-07-28
EP2704713A1 (en) 2014-03-12
MX347616B (es) 2017-05-04
HUE032754T2 (en) 2017-10-30
JP6046702B2 (ja) 2016-12-21
AU2012250574B2 (en) 2016-07-07
CA2834696C (en) 2019-07-23
MX2013012939A (es) 2014-02-27
BR112013028095A2 (pt) 2016-12-27
US10537561B2 (en) 2020-01-21
EA201391629A1 (ru) 2016-01-29
CN103501785A (zh) 2014-01-08
BR112013028095B1 (pt) 2020-03-03
US20190030013A1 (en) 2019-01-31
CY1119642T1 (el) 2018-04-04
DK2704713T3 (en) 2017-04-24
CN103501785B (zh) 2016-10-26
US20150306085A1 (en) 2015-10-29
HRP20170593T1 (hr) 2017-07-14
AU2012250574A1 (en) 2013-11-28
JP2014513136A (ja) 2014-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023999B1 (ru) Ингибиторы csf-1r для лечения опухолей головного мозга
US11357840B2 (en) Methods and compositions for reducing growth, migration and invasiveness of brain cancer stem cells and improving survival of patients with brain tumors
US20200397894A1 (en) Compositions and methods for treating cancer
US20210401987A1 (en) Methods and compositions for treating inflammatory and fibrotic pulmonary disorders
WO2012151541A1 (en) Csf-1r inhibitors for treatment of brain tumors
KR101401891B1 (ko) 테모졸로미드 및 발프로산을 함께 이용하는 항암적 용도
US20130150386A1 (en) Methods for the treatment of lung cancer
JP2017109987A (ja) ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージによって媒介される疾患の治療方法
WO2019103984A1 (en) Compositions including fatp1, fatp3, fatp4, fatp5, and/or fatp6 inhibitors and uses thereof
AU2012250574B8 (en) CSF-1R inhibitors for treatment of brain tumors
WO2024077264A2 (en) Compositions and methods of treating subjects with brca1 mutation or deficiency
WO2023044366A1 (en) Androgen receptor biomarkers for cancer therapy
AU2022407330A1 (en) Combination therapy comprising a pkc inhibitor and a c-met inhibitor
JP2022544264A (ja) 脆弱ｘ症候群の治療

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM