ES2622527T3 - Inhibidores de CSF-1R para el tratamiento de tumores de cerebro - Google Patents

Inhibidores de CSF-1R para el tratamiento de tumores de cerebro Download PDF

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Abstract

Un compuesto de Fórmula (I):**Fórmula** en donde R1 es**Fórmula** en donde R' es Me o Et; y R2 es**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de un tumor de cerebro en un sujeto mamífero.

Description

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DESCRIPCION
Inhibidores de CSF-1R para el tratamiento de tumores de cerebro Antecedentes
Los canceres del cerebro y del sistema nervioso estan entre los mas diffciles de tratar. El pronostico para los pacientes con estos canceres depende del tipo y de la localizacion del tumor, asf como de su etapa de desarrollo. Para muchos tipos de cancer de cerebro, la expectativa de vida promedio despues del establecimiento de los sfntomas puede ser de meses o de un ano o dos. El tratamiento consiste primordialmente en remocion quirurgica y terapia de radiacion; tambien se utiliza quimioterapia, pero la gama de agentes quimioterapeuticos adecuados es limitada, tal vez debido a que la mayorfa de los agentes terapeuticos no penetran en la barrera hematoencefalica adecuadamente para tratar los tumores de cerebro. La utilizacion de los productos quimioterapeuticos conocidos junto con cirugfa y radiacion raramente prolonga la sobrevivencia mucho mas alla de aquella producida por la cirugfa y la radiacion solas. Por consiguiente, se necesitan mejores opciones terapeuticas para los tumores de cerebro.
Los gliomas son un tipo comun de tumor de cerebro. Se presentan a partir del tejido neuronal de soporte comprendido de las celulas gliales (de ahf su nombre de glioma), las cuales mantienen la posicion y funcion de las neuronas. Los gliomas se clasifican de acuerdo con el tipo de celulas gliales a las que se parecen: los astrocitomas (incluyendo glioblastomas) se parecen a las celulas gliales de astrocitos en forma de estrella, los oligodendrogliomas se parecen a las celulas gliales de oligodendrocitos; y los ependimomas se parecen a las celulas gliales ependimales que forman el revestimiento de las cavidades de fluidos en el cerebro. En algunos casos, un tumor puede contener una mezcla de estos tipos de celulas, y serfa referido como un glioma mixto.
El tratamiento actual tfpico para los canceres de cerebro es la remocion quirurgica de la mayor parte del tejido tumoral, la cual se puede hacer mediante cirugfa invasiva o utilizando biopsia o metodos de extraccion. Los gliomas tienden a diseminarse de una manera irregular y son muy diffciles de remover completamente. Como un resultado, la recurrencia casi siempre se presenta pronto despues de la remocion del tumor. Se puede utilizar terapia de radiacion y/o quimioterapia en combinacion con la remocion quirurgica, pero estas en general proporcionan una prolongacion solamente modesta del tiempo de sobrevivencia. Por ejemplo, estadfsticas recientes mostraron que solo aproximadamente la mitad de los pacientes en los Estados Unidos que son diagnosticados con glioblastoma estan vivos un ano despues del diagnostico, y solo aproximadamente el 25 % estan todavfa vivos despues de dos anos, inclusive cuando se tratan con el actual estandar de tratamientos de combinacion de atencion.
El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor de cerebro primario de adultos mas comun, y es notorio por su letalidad y falta de respuesta a los planteamientos actuales de tratamiento. Desafortunadamente, no se han presentado mejoras sustanciales en las opciones de tratamiento en los anos recientes, y solo ha habido mejoras mfnimas en las perspectivas de sobrevivencia para los pacientes con glioblastoma multiforme (GBM). Por consiguiente, sigue existiendo una urgente necesidad de mejores tratamientos para los canceres del cerebro, tales como gliomas.
Los gliomas se desarrollan en un micro-ambiente de tejido complejo comprendido de muchos tipos diferentes de celulas en el parenquima del cerebro en adicion a las celulas de cancer mismas. Los TAM son uno de los tipos de celulas estromales prominentes presentes, y con frecuencia cuentan por una porcion sustancial de las celulas en los tejidos tumorales. Su origen es incierto: estos TAM se pueden originar ya sea por microglias, la poblacion de macrofagos residente en el cerebro, o se pueden reclutar a partir de la periferia.
Los TAM pueden modular el inicio y progreso del tumor de una manera especffica del tejido: parecen suprimir el desarrollo de cancer en algunos casos, pero mejoran el progreso del tumor en la mayorfa de los estudios hasta la fecha. En realidad, en aproximadamente el 80 % de los canceres en donde hay un incremento en la infiltracion de macrofagos, los niveles elevados de TAM estan asociados con la enfermedad mas agresiva y con un mal pronostico del paciente. Varios estudios han demostrado que los gliomas humanos tambien exhiben un aumento significativo en los numeros de TAMs, lo cual se correlaciona con un grado de tumor avanzado, y los TAM son tfpicamente el tipo de celula inmunitaria predominante en los gliomas. Sin embargo, la funcion de los TAM en la gliomagenesis sigue siendo pobremente entendida, y actualmente no se sabe si la direccion de estas celulas representa una estrategia terapeutica viable. De hecho, se han reportado en la literatura efectos opuestos sobre el crecimiento tumoral, en algunos casos incluso en donde se utilizo una estrategia experimental similar para agotar los macrofagos en el mismo modelo de implantacion de glioma ortotopico. En algunos estudios, se ha implicado al TNF-a o a la integrina-133 producida por los TAM en la supresion del crecimiento del glioma, mientras que en otros reportes, se han propuesto CCL2 y MT1-MMP como potenciadores del desarrollo e invasion de tumores.
La inhibicion de la senalizacion de CSF-1R representa un novedoso planteamiento relevante en la traduccion, que se ha utilizado en varios contextos oncologicos, incluyendo los tumores oseos intra-tibiales de xenoinjerto. Sin embargo, todavfa no se ha demostrado que sea efectiva en los tumores de cerebro. Algunos canceres no
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cerebrales se han tratado con compuestos que afectan a una variedad de tipos de celulas que estan asociadas con, o soportan, las celulas tumorales, en lugar de dirigirse directamente a las celulas tumorales mismas. Por ejemplo, se reporta que PLX3397 co-inhibe tres objetivos (FMS, Kit, y Flt3-ITD) y sub-modula diversos tipos de celulas, incluyendo macrofagos, microglias, osteoclastos, y mastocitos. El PLX3397 se ha probado para el tratamiento de linfoma de Hodgkin. Sin embargo, el linfoma de Hodgkin responde bien a diversos productos quimioterapeuticos, de acuerdo con la literatura del PLX3397, mientras que los tumores de cerebro son mucho mas resistentes a los productos quimioterapeuticos y no se han tratado con exito. Como se demuestra en la presente, un inhibidor de CSF-1R no tuvo ningun efecto directo sobre la proliferacion de las celulas de glioblastoma en cultivo, y no redujo los numeros de celulas de macrofagos en los tumores de los animales tratados. Por consiguiente, es sorprendente que, como tambien se demuestra en la presente, un inhibidor de CSF-1R puede inhibir efectivamente el crecimiento de los tumores de cerebro in vivo, puede provocar la reduccion en el volumen tumoral de glioblastoma multiforme (GBM) en etapa avanzada, e incluso aparentemente puede erradicar algunos glioblastomas.
Resumen de las realizaciones de la invencion
La presente invencion se basa en la demostracion de que los tumores de cerebro, en particular el glioblastoma, se pueden tratar con un inhibidor de CSF-1R. Se cree que la efectividad de los inhibidores de CSF-1R descritos en la presente se debe a su inhibicion de ciertas actividades de los TAM, incluso cuando no parezcan reducir significativamente el numero de los TAM presentes, y probablemente tambien es una funcion de la capacidad demostrada de estos compuestos para penetrar en la barrera hematoencefalica efectivamente en los sujetos con un tumor de cerebro. Estos metodos proporcionan nuevas opciones terapeuticas muy necesarias para los pacientes diagnosticados con tumores de cerebro, en particular glioblastomas.
El factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), tambien denominado como factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), senaliza a traves de su receptor CSF-1R (tambien conocido como c-FMS) para regular la diferenciacion, proliferacion, reclutamiento y sobrevivencia de los macrofagos. Se han desarrollado inhibidores de moleculas pequenas del CSF-1R que bloquean la fosforilacion del receptor compitiendo por el enlace al ATP en el sitio activo, como para otros inhibidores de la cinasa de tirosina receptora. La presente invencion utiliza un potente inhibidor selectivo del CSF-1R, que penetra en la barrera hematoencefalica (BBB), para bloquear la senalizacion del CSF-1R en el glioma, como se ilustra en el modelo de gliomagenesis de raton RCAS-PDGF-B-HAJNestin-Tv-a;Ink4a/Arf/-. Este modelo de glioma geneticamente disenado es ideal para la prueba pre-clfnica como un modelo para el glioblastoma multiforme (GBM) humano, debido a que recapitula todas las caracterfsticas del glioblastoma multiforme (GBM) humano en un establecimiento inmunocompetente. Debido a que modela cercanamente al glioblastoma multiforme (GBM) humano, y en particular el glioblastoma multiforme (GBM) pro-neural, se espera que la eficacia en este modelo se traduzca en eficacia clfnica sobre los glioblastomas humanos, tales como el glioblastoma multiforme y los gliomas mixtos.
Algunos inhibidores de CSF-1 R capaces de penetrar el cerebro son los compuestos de benzoxazol y de benzotiazol 6-O-sustituidos que se dan a conocer en la WO2007/121484, en particular los compuestos de las formulas IIa y 11 b de esa referencia, y los compuestos que se dan a conocer en la presente.
La WO 2007/119046 A1 se relaciona con 4-anilinoquinolin-3-carboxamindas como inhibidores de CSF-IR como agentes anticancer.
En un aspecto, la invencion proporciona un compuesto de la formula (I):
en donde R1 es
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en donde R' es ME o Et; y R2 es
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, o uso en el tratamiento de un tumor de cerebro en un sujeto mairufero.
Los compuestos se pueden utilizar para tratar a un paciente, con frecuencia a un sujeto humano, que haya sido diagnosticado con un tumor de cerebro. Otras realizaciones de la invencion se describen mas adelante.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1A es una grafica que muestra las cantidades relativas de celulas positivas para DAPI Vivo en el tejido de cerebro normal y de glioblastoma, como se miden mediante el aumento en la proporcion de las celulas que tinen positivo para CD45 (marcador de pan-leucocitos) y para CD11b (marcador de celulas mieloides) en el tejido tumoral. Tambien se muestran los datos de la clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS).
La Figura 1B ilustra las celulas de cerebro tenidas con CD68 a partir de tejido de cerebro normal y a partir de un glioblastoma de Grado IV, y muestra la abundante infiltracion de macrofagos en el tejido tumoral. Vease el Ejemplo 1.
La Figura 1C ilustra el aumento del nivel de ARNms para CD68, CSF-1R y CSF-1 en relacion con el gen de mantenimiento de Ubiquitina C (Ubc), para el tejido de glioblastoma multiforme (GBM) en relacion con el tejido de cerebro normal.
La Figura 1D muestra las cantidades relativas de CD11b, TVA, CSF-1 y CSF-1R en los TAM en relacion con las celulas tumorales.
La Figura 2 ilustra las cantidades de BLZ945 en plasma, tejido de cerebro a partir de la mitad izquierda de un cerebro que contiene glioblastoma multiforme (GBM), y a partir de la mitad derecha del mismo cerebro sin glioblastoma multiforme (GBM) visible en varios puntos del tiempo despues de tratar a las cohortes de ratones con BLZ945.
La Figura 3A muestra la inhibicion mediante BLZ945 de la fosforilacion del CSF-1R, en seguida de la estimulacion del CSF-1, en celulas de macrofagos derivados de medula osea (BMDM).
La Figura 3B muestra la velocidad de duplicacion de la poblacion de celulas de macrofagos derivados de medula osea (BMDM) no tratadas, y demuestra que el tratamiento de las celulas con BLZ945 67 nM tiene el mismo efecto sobre esta velocidad que la ausencia de estimulacion del CSF-1.
Las Figuras 3C a 3E muestran la velocidad de proliferacion de las celulas de macrofagos derivados de medula osea (BMDM) a partir de los ratones lnk4a/Arf-/-, de las celulas de cerebro de raton normales CRL-2647, y para dos cultivos celulares de glioblastoma multiforme (GBM) de raton.
La Figura 3F muestra que el numero total y el tamano de las neuroesferas no fueron afectados por el BLZ945 en 670 nM.
La Figura 4A ilustra la sobrevivencia sin smtomas de los ratones RCAS-PDGF-B-HAJNestin-Tv-a;Ink4a/Arf/- tratados con vehfculo solo o con vehfculo + BLZ945. Vease el Ejemplo 4.
La Figura 4B ilustra el grado del tumor para los ratones tratados y no tratados en el punto final del estudio de 26 semanas. Todos los ratones de control tuvieron tumores de grado III o IV.
La Figura 5A muestra los datos del tamano del tumor medidos mediante MRI para los animales tratados y de control durante los primeros 6 dfas de tratamiento con BLZ945.
La Figura 5B muestra el volumen del tumor para los ratones de control individuales (grafica superior) y los ratones tratados (grafica inferior) durante los primeros 6 dfas despues de iniciarse la dosificacion con BLZ945.
Las Figuras 5C y 5D ilustran el volumen del tumor medido mediante MRI en los animales tratados con BLZ945 empezando con los tumores grandes (volumen >40 milfmetros cubicos), y muestra que incluso con los tumores grandes, el volumen del tumor disminuyo en casi todos los sujetos.
La Figura 5-2 muestra los datos sobre el volumen del tumor para los animales individuales en el grupo de
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control para el Ejemplo 5 (5-2A) y en el grupo tratado (5-2B), y la Figura 5-2C muestra los datos del tamano del tumor para los sujetos con tumor grande tratados con BLZ945 en el Ejemplo 5.
Figura 6: La primera grafica muestra el porcentaje de celulas Olig2+ en los cerebros de los animales de los grupos con vehfculo, tratados, y con “tumor grande” en el Ejemplo 5. La segunda grafica muestra la fraccion de celulas tumorales que se estaban dividiendo activamente, como se miden mediante marcado con bromo- desoxiuridina (BrdU). La tercera grafica muestra el nivel de apoptosis en las celulas tumorales, como se miden mediante el tenido con caspasa 3 (CC3) disociada, y demuestra que el BLZ945 promueve la apoptosis de las celulas tumorales.
La Figura 7A muestra los pasos utilizados para la separacion con FACS de las celulas para los analisis de expresion genetica en el Ejemplo 7.
La Figura 7B muestra la firma del gen de SVM para los animales tratados y no tratados, a partir de los cuales se identificaron los genes sobre-regulados y sub-regulados mediante su tratamiento.
Las Figuras 7C a 7E muestran la sobre-regulacion selectiva de los genes asociados con M2 y los objetivos del EGR2.
La Figura 8A ilustra graficamente el grado de la sobre-regulacion y la relevancia estadfstica utilizada con el fin de clasificar los genes diferencialmente expresados en la firma del gen de SVM.
La Figura 8B muestra la firma de regresion del gen Lasso-5.
La Figura 8C muestra la prediccion de la firma del gen Lasso para los tumores pro-neurales de (GBM) en el conjunto de datos de TCGA.
La Figura 8D muestra la prediccion de la firma del gen Lasso para los tumores pro-neurales de GBM en el conjunto de datos combinados.
La Figura 8E muestra la prediccion de la firma del gen de SVM para los tumores pro-neurales de GBM en el conjunto de datos de TCGa.
La Figura 8F muestra la prediccion de la firma del gen de SVM para los tumores pro-neurales de GBM en el conjunto de datos combinados.
La Figura 8G ilustra las proporciones de riesgo de la firma del gen de BLZ945 para los conjuntos de datos de TCGA y combinados, para los tumores pro-neurales, clasicos, mesenquimales, y neurales de GBM, y resalta la correlacion estadfstica con el GBM pro-neural a traves de todos los datos.
Descripcion detallada
La invencion proporciona los compuestos de la formula (I) para usarse en el tratamiento de tumores de cerebro. Los compuestos de la formula (I) tienen esta formula:
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en donde R1 es en donde R' es Me o Et, y
R2 es;
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e incluyen las sales farmaceuticamente aceptables, asf como los compuestos neutros de esta formula.
Los compuestos especfficos dentro del alcance de la invencion se describen adicionalmente mas adelante.
El tratamiento de un tumor de cerebro puede incluir la inhibicion de la velocidad de crecimiento de un tumor de 5 cerebro (hacer mas lento el crecimiento tumoral), o la reversion del crecimiento de un tumor de cerebro (es decir, la reduccion en el volumen del tumor), o la eliminacion sustancial del tumor, lo cual se ha demostrado en la presente mediante el tratamiento de ratones que tienen estos tumores. En particular, el tratamiento puede hacer mas lento el progreso o puede revertir el progreso de un glioblastoma. Se puede utilizar en conjunto con otros tratamientos, incluyendo la remocion del volumen de un tumor de cerebro, y se puede 10 utilizar para hacer mas lento o revertir el re-crecimiento, o para reducir el volumen o la masa del tejido tumoral residual en seguida de la remocion del tumor del cerebro mediante metodos quirurgicos o de biopsia. Los compuestos tambien se pueden utilizar en conjunto con otros productos quimioterapeuticos.
Ciertos compuestos preferidos para uso en la invencion son cualquiera de los siguientes compuestos, o una mezcla de cualesquiera dos o mas de estos compuestos, o una sal farmaceuticamente aceptable de 15 cualquiera de estos:
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Cada uno de estos compuestos y sus sales farmaceuticamente aceptables son las realizaciones preferidas para los propositos de la presente invencion. Las realizaciones preferidas de estos compuestos tambien 20 incluyen los compuestos de esta formula:
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en donde R' es Me, o Et, de preferencia metilo. Las realizaciones especfficas de estos compuestos pueden ser de estereoqufmica absoluta (R,R) o de estereoqufmica absoluta (S,S).
Se espera que estos compuestos exhiban penetracion en la barrera hematoencefalica como el BLZ945, basandose en sus propiedades ffsico-qufmicas muy similares, y por consiguiente, que sean adecuados para utilizarse en los presentes metodos de tratamiento.
Los compuestos de la formula (I) son conocidos en la materia, y los metodos para la elaboracion de los mismos se dan a conocer, por ejemplo, en la WO2007/121484; su utilidad para tratar glioma y su penetracion en la barrera hematoencefalica no se conocfan anteriormente. El compuesto (1c) corresponde al BLZ945, el cual se utilizo para las pruebas in vitro e in vivo descritas en la presente.
Los compuestos se pueden utilizar solos o se pueden formular en una composicion farmaceutica que tambien contenga cuando menos un excipiente farmaceuticamente aceptable, y con frecuencia contienen cuando menos dos excipientes farmaceuticamente aceptables. Se entendera que los excipientes farmaceuticamente aceptables son tfpicamente esterilizados. Algunos excipientes adecuados se dan a conocer en la presente; en algunas realizaciones, el compuesto se formula como una composicion que comprende captisol, por ejemplo, captisol al 20 %.
En algunas realizaciones, el tumor de cerebro se selecciona a partir de una metastasis de cerebro, un astrocitoma (incluyendo glioblastoma), un oligodendroglioma, un ependimoma, y un glioma mixto. En las realizaciones preferidas, el tumor de cerebro es un glioma, en particular glioblastoma multiforme. En otras realizaciones, el tumor de cerebro es una metastasis de cerebro, es decir, un tumor metastasico que se presenta a partir de un cancer que se origino en cualquier otra parte del cuerpo.
En algunas realizaciones, el paciente es uno que tiene glioblastoma. En las realizaciones especfficas, el sujeto es uno diagnosticado con glioblastoma pro-neural. Vease Verhaak y colaboradores, Cancer Cell 17(1): 98-110 (2010). Este subtipo de glioblastoma tiende a presentarse en los sujetos mas jovenes y a involucrar mutaciones de TP53, IDH1 y PDGFRA. Verhaak y colaboradores reportaron que los pacientes con glioblastoma pro-neural respondfan menos que otros subtipos (clasico, neural, mesenquimal) a las agresivas quimioterapias en uso en el 2010, e inclusive sugirieron que este tratamiento podrfa ser contraindicado para estos pacientes. Los presentes metodos son en especial efectivos para tratar glioblastoma pro-neural, como fue demostrado por el modelo animal de GBM pro-neural utilizado en la presente. Se descubrio que las firmas geneticas especfficas encontradas en los TAM en los ratones tratados con BLZ945 concordaban con aquellas de los pacientes humanos con glioblastoma pro-neural que tuvieron tiempos de sobrevivencia media mas largos que el promedio; esta correlacion no se presento cuando se comparo con los pacientes que tenfan otros subtipos de glioblastoma. Por consiguiente, la informacion de la firma genetica se puede utilizar para seleccionar a los pacientes para el tratamiento con un inhibidor de CSF-1R, como se describe en la presente, o para evaluar el pronostico para un sujeto que reciba dichos tratamientos.
En algunas realizaciones, los compuestos se utilizan para tratar a un sujeto antes de otros metodos de tratamiento, tales como la remocion del tumor. En otras realizaciones, los compuestos se utilizan para tratar a un sujeto en conjunto con otros metodos de tratamiento, tales como la remocion del tumor mediante ya sea los metodos quirurgicos o de biopsia, o en conjunto con terapia de radiacion, o en conjunto con tanto la remocion del tumor como terapia de radiacion.
Opcionalmente, se pueden utilizar otros agentes quimio-terapeuticos junto con los compuestos y metodos que se dan a conocer anteriormente. Los agentes quimioterapeuticos adicionales adecuados para utilizarse en estos metodos son aquellos conocidos en la materia como los convencionales para utilizarse en el tratamiento de glioblastoma. Algunos de estos agentes quimioterapeuticos incluyen agentes anti-angiogenicos, bevacizumab con o sin irinotecano, nitrosoureas tales como Carmustina (BCNU), platinas tales como cis- platino (cisplatina), agentes alquilantes tales como temozolomida, inhibidores de cinasa de tirosina (gefitinib o erlotinib), Ucrafna, y canabinoides. Estos agentes terapeuticos adicionales (agentes co-terapeuticos) se pueden utilizar simultaneamente con el inhibidor de CSF-1R, tal como mediante su administracion concurrente, la mezcla del agente co-terapeutico con el inhibidor de CSF-1R, o mediante su administracion en
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secuencia. Una realizacion preferida involucra el uso de un compuesto seleccionado a partir de aquellos de la formula I que se dan a conocer en la presente (por ejemplo, las formulas Ia, Ic, Id, o Ig) en combinacion con temozolomida o con un compuesto de platina.
En adicion, los macrofagos se han implicado en las respuestas terapeuticas reducidas en el cancer de mama y en el aumento de la revascularizacion en xenoinjertos de glioblastoma en seguida de la terapia de radiacion. Debido a que estos efectos de los macrofagos reducen la eficacia de otras terapias, se puede esperar que los compuestos de la invencion, los cuales inhiben las actividades de los macrofagos en el glioblastoma in vivo, proporcionen un efecto sinergico cuando se utilicen en combinacion con otros agentes terapeuticos o con terapia de radiacion.
En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente se practican con un compuesto de la formula (Ic). En otras realizaciones, los metodos se pueden practicar con un compuesto de la formula (I) que no sea el compuesto de la formula (Ic), tal como las otras especies que se dan a conocer en la presente.
En algunas realizaciones, el compuesto de la formula (I) tambien inhibe cuando menos otro objetivo para proporcionar mejores efectos anti-tumorales. Por ejemplo, el compuesto de esta formula:
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tambien inhiben al PDGFR en concentraciones que se alcanzan con las dosificaciones terapeuticas tfpicas, tales como aquellas descritas en la presente. De conformidad con lo anterior, estos compuestos se pueden utilizar cuando se desee un mecanismo de accion doble, y se pueden utilizar en cualquiera de los metodos descritos anteriormente.
Los compuestos de ejemplo de las formulas Ig e Ih se incluyen en la siguiente tabla para ilustrar las actividades relativas sobre CSF-1R y PDGFR. Muchos de estos compuestos son conocidos en la materia, vease la WO2007/066898, y los metodos para hacer estos compuestos tambien son bien conocidos. Los compuestos de la formula I son muy activos sobre el CSF-1R independientemente de la estereoqufmica en el anillo de ciclohexilo, como se muestra en la siguiente Tabla. Entre los diversos isomeros, los isomeros S,S tambien son altamente activos sobre el PDGFR-13 asf como sobre el CSF-1R y, por consiguiente, pueden actuar sobre los gliomas mediante dos mecanismos para proporcionar una mayor eficacia.
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(Ig)
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Compuesto
R' Estereo-qufmica CSF-1R IC50 (pM) PDGFR-13 IC50 (pM)
Ig-A
Me (1R,2R) 0.001 5.9
Ig-B
Et (1R,2R) 0.006 pM 13.9
Ig-C
Pr (1R,2R) 0.008 7.7
Compuesto
R' Estereo-qufmica CSF-1R IC50 (pM) PDGFR-13 IC50 (pM)
Ig-D
Me (1S,2S) 0.0008 0.048
ig-E
Me (1R,2S) 0.006 6.6
Ig-F
Me (1S,2R) 0.001 0.78
Ih-A
Me (1R,2R) 0.0009 0.74
Ih-B
Et (1R,2R) 0.003 1.7
Ih-C
Pr (1R,2R) 0.007 1.5
Ih-D
Me (1S,2S) 0.001 0.02
Ih-E
Me (1S,2R) 0.002 0.63
Las siguientes realizaciones enumeradas son representativas de la invencion. Las realizaciones 1-8 corresponden a las reivindicaciones 1-8. Las realizaciones 9-14 no forman parte de las reivindicaciones.
1. Un compuesto de la formula (I):
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en donde R1 es
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(I)
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en donde R2 es Me, o Et; y
R2 es
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para uso en el tratamiento de un tumor cerebral en un sujeto mamffero.
2. Un compuesto para uso de acuerdo con la realizacion 1, en donde el compuesto de Formula (I) es:
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3. Un compuesto para uso de acuerdo con la realizacion 1, en donde el compuesto de Formula (I) es:
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4. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde el tumor de cerebro es un glioma.
5. Un compuesto para uso de acuerdo con la realizacion 4, en donde el glioma es glioblastoma multiforme.
6. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones precedentes, 1-3, en donde el tumor de cerebro es una metastasis de cerebro, astrocitoma (incluyendo glioblastoma), oligodendroglioma, ependimomas, o un glioma mixto.
7. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones precedentes, cuando el compuesto es formulado para uso con un agente coterapeutico.
8. Un compuesto para uso de acuerdo con la realizacion 7, en donde el agente coterapeutco se selecciona de un agente anti-angiogenico, bevacizumab con o sin irinotecano, nitrosoureas tales como Carmustina (BCNU), platinas tales como cis-platino (cisplatina), agentes alquilantes tales como temozolomida, inhibidores de cinasa de tirosina (gefitinib o erlotinib), Ucrafna, y canabinoides.
9. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el compuesto de la formula (I) es para administracion oral.
10. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la cantidad del compuesto de la formula (I) administrada al sujeto es de entre aproximadamente 50 miligramos/kilogramo al dfa y aproximadamente 500 miligramos/kilogramo al dfa, o de entre 5 y 500 miligramos/kilogramo, o de entre 100 y 300 miligramos/kilogramo al dfa.
11. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el sujeto tiene glioblastoma pro-neural.
12. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el sujeto es uno seleccionado debido a que el sujeto tiene un nivel elevado de senalizacion de PDGF o PDGFR.
13. Un compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el sujeto se trata de una manera contemporanea con un inhibidor de PDGFR, o se trata con un inhibidor de CSF-1R que tiene una actividad sub-nanomolar como un inhibidor de PDGFR, por ejemplo, el compuesto (Id) o (If).
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o
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14. Un compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el sujeto es un humano.
Como se utilizan en la presente, los terminos “sal" o "sales” se refieren a una sal de adicion de acido o de adicion de base de un compuesto de la invencion. Las “sales” incluyen en particular las “sales farmaceuticamente aceptables”. El termino “sales farmaceuticamente aceptables” se refiere a las sales que conservan la efectividad biologica y las propiedades de los compuestos de esta invencion y, que tfpicamente no son biologicamente o de otra manera indeseables.
Las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables se pueden formar con acidos inorganicos y acidos organicos, por ejemplo, las sales de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canfor-sulfonato, cloruro/clorhidrato, clorteofilonato, citrato, etan- disulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, lauril-sulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metil-sulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/fosfato acido/fosfato diacido, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, sulfo-salicilato, tartrato, tosilato, y trifluoro-acetato.
Los acidos inorganicos a partir de los cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, acido clorhfdrico, acido bromhfdrico, acido sulfurico, acido nftrico, acido fosforico, y similares.
Los acidos organicos a partir de los cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido oxalico, acido maleico, acido malonico, acido succfnico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido mandelico, acido metan-sulfonico, acido etansulfonico, acido toluen-sulfonico, acido sulfo-salicflico, y similares. Las sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables se pueden formar con bases inorganicas y organicas.
Las bases inorganicas a partir de las cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, las sales de amonio y de los metales de las columnas I a XII de la Tabla Periodica. En ciertas realizaciones, las sales se derivan a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc, y cobre; las sales particularmente adecuadas incluyen las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
Las bases organicas a partir de las cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias, y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo las aminas sustituidas que se presentan naturalmente, aminas cfclicas, resinas basicas de intercambio de iones, y similares. Ciertas aminas organicas incluyen isopropil-amina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietil-amina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.
Las sales farmaceuticamente aceptables de la presente invencion se pueden preparar mediante los metodos qufmicos convencionales. En terminos generales, estas sales se pueden preparar mediante la reaccion de las formas del acido libre de estos compuestos con una cantidad estequiometrica de la base apropiada (tal como
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hidroxido, carbonato, o bicarbonato de Na, Ca, Mg, o K, o similares), o mediante la reaccion de las formas de base libre de estos compuestos con una cantidad estequiometrica del acido apropiado. Estas reacciones tfpicamente se llevan a cabo en agua o en un solvente organico, o en una mezcla de los dos. En terminos generales, es recomendable el uso de medios no acuosos como eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetonitrilo, cuando sea practicable. Las listas de las sales adecuadas adicionales se pueden encontrar, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 20a Edicion, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" por Stahl y Wermuth (Wiley- VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
Cualquier formula dada en la presente pretende representar las formas no marcadas asf como las formas isotopicamente marcadas de los compuestos. Los compuestos isotopicamente marcados tienen las estructuras ilustradas por las formulas dadas en la presente, excepto que uno o mas atomos son reemplazados por un atomo que tiene una masa atomica o numero de masa seleccionados. Los ejemplos de los isotopos que se pueden incorporar en los compuestos de la invencion incluyen los isotopos de hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxfgeno, fosforo, fluor, y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36Cl, 125I, respectivamente. En las realizaciones preferidas, los compuestos de la invencion no estan marcados, es decir, comprenden abundancias de los isotopos aproximadamente naturales para todos los atomos. En otras realizaciones, los compuestos de la invencion se marcan mediante la incorporacion selectiva de un isotopo no natural enriquecido para un atomo en el compuesto de la formula (l). La invencion incluye diferentes compuestos isotopicamente marcados, como se definen en la presente, por ejemplo, aquellos en donde hay isotopos radioactivos presentes, tales como 3H y 14C, o aquellos en donde hay isotopos no radioactivos presentes, tales como 2H y 13C. Estos compuestos isotopicamente marcados son utiles en los estudios metabolicos (con 14C), en los estudios de cinetica de reaccion (con, por ejemplo, 2H o 3H), en las tecnicas de deteccion o de formacion de imagenes, tales como tomograffa por emision de positrones (PET) o tomograffa computarizada con emision de un solo foton (SPECT), incluyendo los ensayos de distribucion del farmaco o del sustrato en el tejido, o en el tratamiento radioactivo de los pacientes. En particular, un 18F o un compuesto marcado puede ser particularmente deseable para los estudios de pEt o SPECT. Los compuestos isotopicamente marcados de la formula (I) se pueden preparar en terminos generales mediante las tecnicas convencionales conocidas por los expertos en este campo en vista de la descripcion de la sfntesis de los compuestos de la formula I, por ejemplo, en la Publicacion de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero US2008/0045528 (WO2007/121484). El BLZ945 se describe en esa referencia, asf como varios de sus isomeros. La misma publicacion, en la pagina 163, describe la sfntesis de ambos 1R,2R- y 1S,2S-amino- ciclohexanol, los cuales pueden ser facilmente utilizados como sustitucion en el metodo del Ejemplo 173 para producir el (If) y otros compuestos de la formula I, tanto marcados como no marcados.
Ademas, la sustitucion con isotopos mas pesados, en particular con deuterio (es decir, 2H o D), puede proporcionar algunas ventajas terapeuticas resultantes de la mayor estabilidad metabolica, por ejemplo un aumento de la vida media in vivo o requerimientos de dosificacion reducida, o una mejora en el fndice terapeutico. Se entiende que el deuterio en este contexto se considera como un sustituyente de un compuesto de la formula (I). La concentracion de este isotopo mas pesado, especfficamente deuterio, se puede definir por el factor de enriquecimiento isotopico. El termino "factor de enriquecimiento isotopico", como se utiliza en la presente, significa la proporcion entre la abundancia isotopica y la abundancia natural de un isotopo especificado. Si un sustituyente en un compuesto de esta invencion es denotado como deuterio, este compuesto tiene un factor de enriquecimiento isotopico para cada atomo de deuterio designado de cuando menos 3500 (52.5 % de incorporacion de deuterio en cada atomo de deuterio designado), cuando menos 4000 (60 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 4500 (67.5 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 5000 (75 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 5500 (82.5 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 6000 (90 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 6333.3 (95 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 6466.7 (97 % de incorporacion de deuterio), cuando menos 6600 (99 % de incorporacion de deuterio), o cuando menos 6633.3 (99.5 % de incorporacion de deuterio).
Como se utiliza en la presente, el termino "excipientes farmaceuticamente aceptables" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, tensoactivos, antioxidantes, conservadores (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotonicos, agentes retardantes de absorcion, sales, conservadores, estabilizantes de farmacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegracion, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, y similares y combinaciones de los mismos, como serfan conocidos por los expertos en este campo (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, Mack Printing Company, 1990, paginas 1289-1329). Excepto hasta donde cualquier vehfculo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas o farmaceuticas.
El termino "una cantidad terapeuticamente efectiva" de un compuesto de la presente invencion se refiere a una cantidad del compuesto de la presente invencion que provocara la respuesta biologica o medica de un sujeto, por ejemplo, la reduccion o inhibicion de la actividad de una enzima o de una protefna, o la mitigacion de los sfntomas, el alivio de las condiciones, el alentamiento o la demora del progreso de la enfermedad, o la prevencion de una enfermedad, etc. En una realizacion no limitante, el termino “una cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se
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administra a un sujeto, es efectiva para: (1) cuando menos parcialmente aliviar, inhibir, prevenir y/o mitigar una condicion, o un trastorno, o una enfermedad (i) mediada por el CSF-1R, o (ii) asociada con la actividad del CSF-1R, o (iii) caracterizada por una actividad (normal o anormal) del CSF-1R; o (2) reducir o inhibir la actividad del CSF-1R; o (3) reducir o inhibir la expresion del CSF-1R. En otra realizacion no limitante, el termino “una cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a una celula, o a un tejido, o a un material biologico no celular, o a un medio, es efectiva para reducir o inhibir cuando menos parcialmente la actividad del CSF-1R; o para reducir o inhibir cuando menos parcialmente la expresion del CSF-1R. El significado del termino “una cantidad terapeuticamente efectiva”, como se ilustra en la realizacion anterior para el CSF-1R, tambien se aplica mediante el mismo significado a cualesquiera otras protefnas/peptidos/enzimas relevantes, tales como el PDGFR y similares.
Como se utiliza en la presente, el termino “sujeto” se refiere a un animal. Tfpicamente, el animal es un mamffero. Un sujeto tambien se refiere, por ejemplo, a primates (por ejemplo, a seres humanos, masculinos o femeninos), reses, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y similares. En ciertas realizaciones, el sujeto es un primate. En las realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano.
Como se utiliza en la presente, el termino "inhibir", "inhibicion" o “inhibiendo”, se refiere a la reduccion o supresion de una condicion, sfntoma, o trastorno o enfermedad dados, o a una disminucion significativa en la actividad de la lfnea base de una actividad o proceso biologico.
Como se utiliza en la presente, el termino "tratar", "tratando" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno, se refiere, en una realizacion, a disminuir la enfermedad o el trastorno (es decir, hacer mas lento o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o cuando menos uno de los sfntomas clfnicos de la misma). En otra realizacion, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mitigar cuando menos un parametro ffsico, incluyendo aquellos que puedan no ser discernibles por el paciente. En todavfa otra realizacion, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea ffsicamente (por ejemplo, la estabilizacion de un sfntoma discernible), fisiologicamente (por ejemplo, la estabilizacion de un parametro ffsico), o ambos. En todavfa otra realizacion, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a prevenir o demorar el establecimiento o desarrollo o progreso de la enfermedad o del trastorno. Con referencia a un tumor de cerebro, 'tratar' tfpicamente incluye cualquiera de hacer mas lenta la velocidad del crecimiento de un tumor o del re-crecimiento de un tumor despues de que se haya removido el volumen del tumor, o reducir el tamano del tumor o de los restos del tumor despues de que se haya removido el volumen del tumor.
Como se utiliza en la presente, un sujeto tiene "necesidad de" tratamiento si este sujeto se beneficiarfa biologicamente, medicamente, o en su calidad de vida, a partir de dicho tratamiento. Tfpicamente, el sujeto ha sido diagnosticado con un tumor de cerebro, con frecuencia una forma de glioblastoma, y de preferencia con glioblastoma multiforme.
Como se utiliza en la presente, el termino "un", "uno", "el” y terminos similares utilizados en el contexto de la presente invencion (en especial en el contexto de las reivindicaciones) se deben interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o que sea claramente contradicho por el contexto.
Todos los metodos descritos en la presente se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que sea indicado de otra manera en la presente, o que sea claramente contradicho de otra manera por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o de lenguaje (de ejemplo, “tal como”) proporcionado en la presente, pretende meramente iluminar mejor la invencion, y no presenta una limitacion sobre el alcance de la invencion reivindicada de otra manera.
En algunas realizaciones, la presente invencion utiliza una composicion farmaceutica, la cual comprende un compuesto de la presente invencion, y un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica se puede formular para vfas de administracion particulares, tales como administracion oral, administracion parenteral, y administracion rectal, etc. En adicion, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden configurar en una forma solida (incluyendo, sin limitacion, capsulas, tabletas, pfldoras, granulos, polvos o supositorios), o en una forma lfquida (incluyendo, sin limitacion, soluciones, suspensiones o emulsiones). Las composiciones farmaceuticas se pueden someter a las operaciones farmaceuticas convencionales, tales como esterilizacion, y/o pueden contener diluyentes inertes, agentes lubricantes, o agentes reguladores convencionales, asf como adyuvantes, tales como conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes y reguladores del pH, etc.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende cuando menos un agente quimioterapeutico adicional, tal como temozolomida, en una cantidad efectiva.
Tfpicamente, las composiciones farmaceuticas son tabletas o capsulas de gelatina que comprenden el ingrediente activo junto con cuando menos un excipiente, tal como captisol (utilizado en los Ejemplos de la presente) y uno de los siguientes:
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a) diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina;
b) lubricantes, por ejemplo, sflice, talco, acido estearico, su sal de magnesio o de calcio y/o polietilenglicol; para tabletas tambien,
c) aglutinantes, por ejemplo, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidon, gelatina, tragacanto, metil-celulosa, carboxi-metil-celulosa de sodio y/o polivinil-pirrolidona; si se desea;
d) vehmulos, tales como un vehmulo acuoso que contenga un material co-solvatante, tal como captisol, PEG, glicerina, ciclodextrina, o similares;
e) desintegrantes, por ejemplo, almidones, agar, acido algmico o su sal sodica, o mezclas efervescentes; y/o
f) absorbentes, colorantes, saborizantes y edulcorantes.
Las tabletas pueden tener recubrimiento de pelmula o recubrimiento enterico de acuerdo con los metodos conocidos en este campo.
De preferencia, el compuesto o una composicion se prepara para su administracion oral, como una tableta o capsula, por ejemplo, o como una solucion o suspension del compuesto de la formula (I), opcionalmente empacada en un recipiente de una sola dosis, tal como una capsula.
Las composiciones adecuadas para administracion oral incluyen una cantidad efectiva de un compuesto de la invencion en la forma de tabletas, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsion, capsulas duras o blandas, o jarabes o elfxires. Las composiciones destinadas para uso oral se preparan de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica para la elaboracion de las composiciones farmaceuticas, y estas composiciones pueden contener uno o mas agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, y agentes conservadores, con el objeto de proporcionar preparaciones farmaceuticamente elegantes y de buen sabor. Las tabletas pueden contener al ingrediente activo mezclado con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos que sean adecuados para la elaboracion de tabletas. Estos excipientes son, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio, o fosfato de sodio; agentes de granulacion o desintegrantes, por ejemplo almidon de mafz, o acido algmico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidon, gelatina, o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, acido estearico, o talco. Las tabletas no se recubren, o bien se recubren mediante tecnicas conocidas para demorar la desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal y de esta manera proporcionar una accion sostenida durante un penodo mas largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de demora de tiempo tal como monestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Las formulaciones para uso oral se pueden presentar como capsulas de gelatina dura en donde se mezcla el ingrediente activo con un diluyente solido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio, o caolm, o como capsulas de gelatina blanda en donde se mezcla el ingrediente activo con agua o con un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina lfquida, o aceite de oliva.
En algunas realizaciones, el compuesto o la composicion se prepara para administrarse mediante inyeccion. Algunas composiciones inyectables son soluciones o suspensiones isotonicas acuosas, y los supositorios se preparan convenientemente a partir de emulsiones o suspensiones grasas. Estas composiciones se pueden esterilizar y/o pueden contener adyuvantes, tales como agentes conservadores, estabilizantes, humectantes,
0 emulsionantes, promotores de solucion, sales para regular la presion osmotica, y/o reguladores del pH. En adicion, tambien pueden contener otras sustancias terapeuticamente valiosas. Estas composiciones se preparan de acuerdo con los metodos convencionales de mezcla, granulacion, o recubrimiento, respectivamente, y pueden contener de aproximadamente el 0.1 al 75 %, o contienen de aproximadamente el
1 al 50 % del ingrediente activo.
En algunas realizaciones, el compuesto o la composicion se prepara para administrarse topicamente. Las composiciones adecuadas para aplicacion transdermica incluyen una cantidad efectiva de un compuesto de la invencion con un vehmulo adecuado. Los vehmulos adecuados para suministro transdermico incluyen solventes farmacologicamente aceptables absorbibles para ayudar al paso a traves de la piel del huesped. Por ejemplo, los dispositivos transdermicos estan en la forma de un parche, el cual comprende un miembro de respaldo, un deposito que contiene al compuesto opcionalmente con vehmulos, opcionalmente una barrera de control de velocidad para suministrar el compuesto a la piel del huesped a una velocidad controlada y previamente determinada durante un penodo de tiempo prolongado, y elementos para asegurar el dispositivo a la piel.
Las composiciones adecuadas para aplicacion topica, por ejemplo a la piel y a los ojos, incluyen soluciones acuosas, suspensiones, unguentos, cremas, geles, o formulaciones rociables, por ejemplo para suministrarse en aerosol o similar. Estos sistemas de suministro topico seran apropiados en particular para la aplicacion dermica, por ejemplo, para el tratamiento de cancer de piel, por ejemplo, para su uso profilactico en cremas,
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lociones, aspersiones protectoras del sol, y similares. De esta manera, son particularmente adecuadas para utilizarse en formulaciones topicas, incluyendo cosmeticas, bien conocidas en este campo. Estas pueden contener solubilizantes, estabilizantes, agentes mejoradores de tonicidad, reguladores del pH, y conservadores.
Como se utiliza en la presente, una aplicacion topica tambien puede pertenecer a una inhalacion o a una aplicacion intranasal. De una manera conveniente, se pueden suministrar en la forman de un polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, por ejemplo una mezcla seca con lactosa, o bien como una partfcula componente mezclada, por ejemplo con fosfolfpidos) a partir de un inhalador de polvo seco o de una presentacion de aspersion en aerosol a partir de un recipiente presurizado, bomba, aspersor, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado.
En algunas realizaciones, la cantidad efectiva del compuesto de la formula (I) es de entre aproximadamente 10 miligramos/kilogramo al dfa y aproximadamente 500 miligramos/kilogramo al dfa. En las realizaciones particulares, la cantidad efectiva es de entre aproximadamente 25 miligramos/kilogramo al dfa y aproximadamente 300 miligramos/kilogramo al dfa, tal como de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 miligramos/kilogramo al dfa. La dosificacion se puede administrar en 1 a 4 dosis al dfa, o se puede administrar en dfas alternados. En una realizacion preferida, la dosificacion es de aproximadamente 200 miligramos/kilogramo al dfa, y se administra en una o dos dosis orales al dfa.
La presente invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion anhidras, las cuales comprenden los compuestos de la presente invencion como ingredientes activos, debido a que el agua puede facilitar la degradacion de ciertos compuestos.
Se pueden preparar composiciones farmaceuticas anhidras y formas de dosificacion de la invencion utilizando ingredientes anhidros o que contengan una baja humedad, y condiciones de baja humedad. Una composicion farmaceutica anhidra se puede preparar y almacenar de tal manera que se mantenga su naturaleza anhidra. De conformidad con lo anterior, las composiciones anhidras se empacan utilizando materiales que se sepa que previenen la exposicion al agua, de tal forma que se puedan incluir en kits de formulacion adecuados. Los ejemplos del empaque adecuado incluyen, pero no se limitan a, laminas hermeticamente selladas, plasticos, recipientes de dosis unitaria (por ejemplo, frascos), paquetes de burbuja, y paquetes de tiras.
La invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion que comprenden uno o mas agentes que reducen la velocidad a la cual se descompondra el compuesto de la presente invencion como un ingrediente activo. Estos agentes, los cuales son referidos en la presente como "estabilizantes", incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, tales como acido ascorbico, reguladores del pH, o reguladores de sales, etc.
Los compuestos y metodos descritos en la presente son utiles para el tratamiento de una variedad de tumores de cerebro, basandose en su capacidad demostrada para penetrar en la barrera hematoencefalica y para inhibir la acumulacion de los TAM en y/o alrededor de un tumor en el cerebro. En algunas realizaciones, el tumor de cerebro es una metastasis de un cancer que se origino en cualquier otra parte del cuerpo. En otras realizaciones, el tumor de cerebro es un glioma, tal como glioblastoma multiforme.
Los compuestos de la formula I, en forma libre o en forma de sal, exhiben valiosas propiedades farmacologicas, por ejemplo, propiedades moduladores del CSF-1R y opcionalmente del PDGFR, por ejemplo, como se indica en las pruebas in vitro e in vivo proporcionadas en las siguientes secciones y, por consiguiente, se indican para terapia.
La composicion o una combinacion farmaceutica de la presente invencion puede estar en una dosificacion unitaria de aproximadamente 1 a 1,000 miligramos de ingrediente(s) activo(s) para un sujeto de aproximadamente 50 a 70 kilogramos, o de aproximadamente 1 a 500 miligramos, o de aproximadamente 1 a 250 miligramos, o de aproximadamente 1 a 150 miligramos, o de aproximadamente 0.5 a 100 miligramos, o de aproximadamente 1 a 50 miligramos de ingredientes activos. La dosificacion terapeuticamente efectiva de un compuesto, de la composicion farmaceutica, o de las combinaciones de los mismos, depende de la especie del sujeto, del peso corporal, de la edad y condicion individual, del trastorno o enfermedad que se este tratando, o de la gravedad de la misma. Un medico, clfnico, o veterinario de una experiencia ordinaria puede determinar facilmente la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos necesaria para tratar o inhibir el progreso del trastorno o de la enfermedad, basandose en la presente divulgacion.
Las propiedades de dosificacion anteriormente citadas se pueden demostrar en pruebas in vitro e in vivo utilizando convenientemente mamfferos, por ejemplo, ratones, ratas, perros, monos u organos aislados, tejidos y preparaciones de los mismos. Los compuestos de la presente invencion se pueden aplicar in vitro en la forma de soluciones, por ejemplo, soluciones acuosas, e in vivo ya sea enteralmente, parenteralmente, de una manera conveniente intravenosamente, por ejemplo, como una suspension o en solucion acuosa. La dosificacion in vitro puede estar en el intervalo de concentraciones de entre aproximadamente 10-3 molar y 109 molar. Una cantidad terapeuticamente efectiva in vivo, dependiendo de la via de administracion, puede estar
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en el intervalo de entre aproximadamente 0.1 y 500 miligramos/kilogramo, tfpicamente de entre 10 y 400 miligramos/kilogramo, o de entre aproximadamente 100 y 300 miligramos/kilogramo, o de entre 1 y 100 miligramos/ kilogramo. En algunas realizaciones, es adecuada una dosis de aproximadamente 200 miligramos/kilogramo para el tratamiento de glioblastoma, y se puede administrar oralmente.
La actividad de un compuesto de acuerdo con la presente invencion se puede evaluar mediante los siguientes metodos in vitro e in vivo.
Empleando los metodos de prueba de ensayo descritos en la US20080045528, se puede demostrar que los compuestos de la invencion inhiben el CSF-1R. Como se describe en la presente, estos compuestos atraviesan facilmente la barrera hematoencefalica, y tambien inhiben o revierten el crecimiento de un tumor en el cerebro. De preferencia, el tumor es detectable mediante los metodos conocidos, y se puede monitorear el progreso del tratamiento mediante los metodos conocidos. En algunas realizaciones, el progreso del tratamiento se monitorea utilizando MRI (imagenes de resonancia magnetica) para determinar el tamano del tumor y cualquier metastasis.
El compuesto de la presente invencion se puede administrar ya sea simultaneamente con, o antes o despues de, uno o mas agentes terapeuticos diferentes, tales como los co-agentes terapeuticos descritos en la presente. El compuesto de la presente invencion se puede administrar por separado, por la misma o diferente via de administracion, o juntos en la misma composicion farmaceutica que los otros agentes.
Se puede proporcionar un producto que comprende un compuesto de la formula (I), y cuando menos otro agente terapeutico, como una preparacion combinada para su uso simultaneo, separado, o en secuencia, en terapia. La terapia es el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por la inhibicion del CSF-1R. Los productos proporcionados como una preparacion combinada incluyen una composicion que comprende el compuesto de la formula (I) y los otros agentes terapeuticos juntos en la misma composicion farmaceutica, o el compuesto de la formula (I) y los otros agentes terapeuticos en una forma separada, por ejemplo, en la forma de un kit.
Se puede proporcionar una composicion farmaceutica, la cual comprende un compuesto de la formula (I) y otros agentes terapeuticos. Opcionalmente, la composicion farmaceutica puede comprender un excipiente farmaceuticamente aceptable, como se describe anteriormente, o mas de uno de estos co-agentes terapeuticos.
Se puede proporcionar un kit, el cual comprende dos o mas composiciones farmaceuticas separadas, cuando menos una de las cuales contiene un compuesto de la formula (I). El kit comprende medios para contener por separado estas composiciones, tales como un recipiente, un frasco dividido, o un paquete de lamina dividido. Un ejemplo de este kit es un paquete de burbujas, como se utiliza tfpicamente para el empaque de tabletas, capsulas, y similares.
El kit se puede utilizar para administrar formas de dosificacion diferentes, por ejemplo, oral y parenteral, para administrar las composiciones separadas en diferentes intervalos de dosificacion, o para titular las composiciones separadas una contra la otra. Para ayudar al cumplimiento, el kit tfpicamente comprende instrucciones para la administracion.
En las terapias de combinacion de la invencion, el compuesto para uso y el otro agente terapeutico pueden ser elaborados y/o formulados por el mismo o por diferentes fabricantes. Mas aun, el compuesto para uso y el otro agente terapeutico se pueden reunir en una terapia de combinacion: (i) antes de liberar el producto de combinacion a los medicos (por ejemplo, en el caso de un kit que comprenda el compuesto de la invencion y el otro agente terapeutico); (ii) por el medico mismo (o bajo la gufa del medico) poco antes de la administracion; (iii) en el paciente mismo, por ejemplo, durante la administracion en secuencia del compuesto de la invencion y el otro agente terapeutico.
De conformidad con lo anterior, la invencion proporciona el uso de un compuesto de la formula (I) para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el medicamento se prepara para su administracion con otro agente terapeutico, incluyendo uno de los agentes quimioterapeuticos adicionales que se dan a conocer en la presente como adecuados para utilizarse en combinacion con los compuestos de la formula I. Tambien se puede proporcionar otro agente terapeutico para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el medicamento se administra con un compuesto de la formula (I).
La divulgacion tambien proporciona un compuesto de la formula (I) para utilizarse en un metodo para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R], en donde el compuesto de la formula (I) se prepara para su administracion con otro agente terapeutico. La divulgacion tambien proporciona otro agente terapeutico para utilizarse en un metodo para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el otro agente terapeutico se prepara para su administracion con un compuesto de la formula (I). La divulgacion tambien proporciona un compuesto de la formula (I) para utilizarse en un metodo para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el compuesto de la
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formula (I) se administra con otro agente terapeutico. La divulgacion tambien proporciona otro agente terapeutico para utilizarse en un metodo para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el otro agente terapeutico se administra con un compuesto de la formula (I).
Se puede proporcionar un compuesto de la formula (I) para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de 24 horas) con otro agente terapeutico. Tambien se puede proporcionar el uso de otro agente terapeutico para el tratamiento de una enfermedad o condicion mediada por el CSF-1R, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de 24 horas) con un compuesto de la formula (I).
En una realizacion, el otro agente terapeutico se selecciona a partir de un agente anti-angiogenico, bevacizumab con o sin irinotecano, nitrosoureas, tales como Carmustina (BCNU), platinas, tales como cis- platino (cisplatina), agentes alquilantes, tales como temozolomida, inhibidores de cinasa de tirosina (gefitinib o erlotinib), Ucrafna, y canabinoides. En algunas realizaciones, el otro agente es un co-agente terapeutico seleccionado a partir de: un compuesto anti-angiogenico, un canabinoide, y temozolomida.
Las combinaciones individuales especfficas que pueden proporcionar beneficios de tratamiento particulares incluyen el compuesto Ia, Ic, Id, o 1g, 1h, en combinacion con temozolomida. Esta combinacion se puede administrar oralmente como se describe en la presente, para tratar diferentes tumores de cerebro, tales como glioblastoma multiforme.
En adicion a los metodos de tratamiento, a los compuestos, y a la composicion farmaceutica, tambien se han identificado ciertos cambios de firma genetica asociados con la eficacia de los compuestos de CSF-1R para el tratamiento de GBM. Los Ejemplos que se encuentran mas adelante proporcionan informacion acerca de estos cambios, e identifican las firmas geneticas o los biomarcadores que se pueden utilizar en conjunto con los metodos de tratamiento que se dan a conocer en la presente. Como sera evidente para el lector experto, los datos de la firma de Lasso y de la firma de SVM proporcionados en la presente, se pueden utilizar en la determinacion de un pronostico para un paciente tratado con estos metodos, mediante la obtencion de una muestra del paciente, y la comparacion de los datos de expresion genetica para la muestra contra los cambios y firmas de la expresion genetica que se dan a conocer en la presente, correlacionandose con un pronostico positivo y/o con una sobrevivencia prolongada.
EJEMPLOS
Los compuestos de la invencion se prepararon de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica, en particular aquellos descritos en la WO2007/121484.
Los compuestos y/o intermediarios se caracterizaron mediante cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento (HPLC), utilizando un sistema de cromatograffa Waters Millenium con un Modulo de Separacion 2695 (Milford, MA). Las columnas analfticas fueron Phenomenex La C18 en fase inversa, de 5 micras, 4.6 x 50 milfmetros, de Alltech (Deerfield, IL). Se utilizo una elucion en gradiente (flujo 2.5 mililitros/minuto), tfpicamente empezando con el 5 % de acetonitrilo/95 % de agua, y progresando hasta el 100 % de acetonitrilo durante un perfodo de 10 minutos. Todos los solventes contenfan acido trifluoro-acetico (TFA) al 0.1 % (TFA). Los compuestos se detectaron mediante absorcion de luz ultravioleta (UV) ya sea a 220 o a 254 nanometros. Los solventes de HPLC fueron de Burdick and Jackson (Muskegan, MI), o de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).
El analisis espectrometrico de masas se llevo a cabo en uno de dos instrumentos de LCMS: un Sistema Waters (Alliance HT HPLC) y un espectrometro de masas Micromass ZQ; Columna: Eclipse XDB-C18, de 2.1 x 50 milfmetros; gradiente: del 5 al 95 % (o del 35 al 95 %, o del 65 al 95 %, o del 95 al 95 %) con acetonitrilo en agua con TFA al 0.05 % durante un perfodo de 4 minutos; velocidad de flujo de 0.8 mililitros/minuto; intervalo de peso molecular de 200 a 1,500; voltaje del cono de 20 V; temperatura de la columna de 40°C) o un Sistema Hewlett Packard (Serie 1100 HPlC; Columna: Eclipse xDb-C18, de 2.1 x 50 milfmetros; gradiente: del 5 al 95 % de acetonitrilo en agua con TFA al 0.05 % durante un perfodo de 4 minutos; velocidad de flujo de 0.8 mililitros/minuto; intervalo de peso molecular de 150 a 850; voltaje del cono de 50 V; temperatura de la columna de 30°C). Todas las masas se reportaron como aquellas de los iones progenitores protonados.
Datos analfticos para el compuesto (If): HPLC, tiempo de retencion de 1.93 minutos. Ion Molecular (MH+): m/z = 422.1 (LC/MS RT = 0.50 minutos).
Ejemplo 1: Los numeros de macrofagos aumentan en un modelo de gliomagenesis de raton comparandose con cerebro normal.
Este ejemplo demostro la contribucion de los macrofagos asociados con tumor (TAMs) a la gliomagenesis en el modelo de raton RCAS-PDGF-B-HNNestin-Tv-a;Ink4a/Arf/-. En estos ratones, cuando se induce el desarrollo de tumores en adultos, la gran mayorfa de las lesiones que se desarrollan son glioblastoma multiforme (GBM) de alto grado, el cual modela histologicamente el GBM humano. Figura 1. (A) Los cerebros/
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cerebros anteriores a partir de ratones no inyectados Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/- (cerebro normal) o con tumores grado IV (GBM) a partir de ratones sintomaticos RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/-(PDG) se procesaron hasta obtener una sola suspension celular con papafna para la citometria de flujo (n = 5 de cada uno). Hubo un aumento significativo en los leucocitos CD45+ desde el 3.6 ± 0.6 % hasta el 13.1 ± 2.0 %. las celulas mieloides CD11b+/ macrofagos contaron por una gran mayorfa de los leucocitos (del 89.9 al 98.5 % de celulas CD45+), con un aumento de 3.8 veces en las celulas CD45+CD11 b+ en los tumores (12.7 ± 2.0 %) comparandose con el cerebro normal (3.3 ± 0.5 %), y no hubo diferencias en las poblaciones de celulas CD45+CD11b-. (B) Las secciones de cerebro normal o del tejido de GBM a partir de ratones PDG
sintomaticos, se co-tineron inmunofluorescentemente para determinar CSF-1R, CD68 (macrofagos), y DAPI. (C) Se utilizaron cerebro normal y GBM (n = 3 de cada uno) para el aislamiento del ARN, la sfntesis del ADNc, y qPCR. Los ensayos se ejecutaron por triplicado, y la expresion se normalizo con la ubiquitina C (Ubc) para cada muestra. La expresion se ilustra en relacion con el cerebro normal. (D) Las secciones de cerebro normal
0 del tejido GBM a partir de ratones PDG sintomaticos se tineron para determinar el CSF-1R en combinacion con los marcadores de macrofagos F4/80 y CD11b, asf como F4/80, CD11b, y CD68 en combinacion con Iba-
1 (macrofagos/microglfa). Se utilizo DAPI para el contra-tenido nuclear. Barra de escala de 50 micras. Los datos se presentan como el promedio + SEM. Los valores P se obtuvieron utilizando la prueba t de Student de dos colas no emparejada; *P<0.05; **P<0.01.
Los numeros de celulas de macrofagos fueron sustancialmente mas altos en el tejido de GBMen relacion con el cerebro normal, como se muestra mediante el tenido con el anticuerpo especffico de macrofagos CD68 (Figura 1B). Esto se confirmo mediante el analisis de citometria de flujo, en donde los leucocitos asociados con tumor (CD45+) constituyen el 13.1 % de la masa tumoral, y la gran mayorfa son macrofagos (CD11b+) (Figura 1A). El analisis de expresion del cerebro normal comparandose con el GBM revelo que el nivel de ARNm de CSF-1 y CSF-1R, asf como de CD68, aumenta en los tumores (Figura 1C).
Las diferentes poblaciones especificas del tipo de celula tambien fueron a partir de los GBMs, para determinar la fuente de CSF-1 y su receptor. La pureza de las distintas poblaciones se confirmo mediante la expresion del receptor de TVA solamente en la fraccion de celulas tumorales y CD11b exclusivamente en los TAM. Aunque el CSF-1 fue expresado tanto por las celulas tumorales como por los TAM, el CSF-1R solamente fue expresado por los TAM (Figura 1D). La primera columna de cada grupo de tres en la Figura 1D es de celulas mixtas, la segunda es de celulas tumorales purificadas con FACS, y la tercera es de los TAM purificados con FACS; las celulas mixtas se ajustan a 1 para normalizar los datos. Las graficas no muestran expresion de CD11b en las celulas tumorales, y no muestran expresion de CSF-1R en las celulas tumorales, mientras que el TVA tine las celulas tumorales solamente, y no los TAM, y el CSF-1 esta presente en cantidades aproximadamente iguales tanto en el tumor como en las celulas de TAM. Estos hallazgos se confirmaron mediante inmunotenido, y todas las celulas de CSF-1R+ tambien fueron positivas para CD68 (no mostrado). Esto demuestra que cualquier efecto sobre la tumorigenesis en seguida de la inhibicion del CSF-1R en este modelo depende de los macrofagos.
Ejemplo 2: Analisis del inhibidor de CSF-1R BLZ945: farmacocinetica y ensayos basados en celulas.
El BLZ945 (Compuesto Ic) se ha dado a conocer como un inhibidor de cinasa c-fms (CSF-1R) selectivo para la supresion de lesiones osteoliticas inducidas por tumor en el hueso. El BLZ945 es un inhibidor competitivo del ATP que inhibe el CSF-1R en los ensayos bioquimicos a 1 nM, e inhibe la proliferacion celular dependiente del CSF a una IC50 de aproximadamente 67 nM. Por comparacion, los valores IC50 para la mayorfa de las >200 cinasas varias probadas son de >10 pM (10,000 nM), y para cKIT y PDGFRI3, las IC50s son de 3.5 pM (3,500 nM) y de 5.9 pM (5,900 nM), respectivamente. Cuando se rastreo contra varios cientos de cinasas en el arreglo de cinasa Ambit®, el compuesto mostro una actividad mas baja que el 50 % del control solamente contra CSF-1R, PDGFRa y PDGFRI3, y la actividad sobre los dos PDGFRs fue mucho mas baja que su actividad sobre el CSF-1R en los ensayos de inhibicion directa. Como se discute en la presente, los compuestos como BLZ945, pero que tienen la estereoqufmica (S,S) exhiben actividad contra el PDGFRI3 en niveles similares a su alto nivel de actividad sobre el CSF-1R.
Los ratones que tenfan glioblastoma multiforme (GBM) detectable en solamente la mitad derecha de sus cerebros se trataron con BLZ945, y entonces se midio la concentracion del compuesto en plasma y en las mitades derechas e izquierdas del en diversos puntos del tiempo (15 minutos, 2 horas, 8 horas, 24 horas). Como lo muestra la Figura 2, la concentracion en plasma se eleva rapidamente hasta un poco mas de 100 pM, y permanece por arriba de 50 pM a las 8 horas, y entonces declina hasta un nivel bajo a las 24 horas. La concentracion en el tejido de cerebro sigue un patron similar: permanece un poco mas bajo que el nivel en plasma, pero se eleva bien por arriba de 50 pM en los puntos del tiempo de 15 minutos y de 2 horas. Esto muestra que el BLZ945 cruza la barrera hematoencefalica (BBB), y que se pueden alcanzar en el cerebro concentraciones suficientes para inhibir el crecimiento y/o la sobrevivencia de los macrofagos. Tambien muestra que el compuesto penetra en niveles similares en las mitades del cerebro que contienen tumor y que estan libres de tumor, sugiriendo que la penetracion puede no depender de una lesion en la barrera hematoencefalica (BBB) causada por la presencia del tumor. Esto demuestra suficientemente la rapida penetracion en la barrera hematoencefalica para proporcionar niveles del farmaco terapeuticamente efectivos en el cerebro, bien por encima de los niveles necesarios para inhibir efectivamente los macrofagos en cultivo.
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Ejemplo 3: Actividad inhibidora del BLZ945 contra diferentes tipos de celulas in vitro.
Los macrofagos derivados de medula osea (BMDMs) se aislaron y se diferenciaron como se describio anteriormente en la literatura, y se trataron entonces con BLZ945 67 nM. El BLZ945 provoco una clara inhibicion de la fosforilacion del CSF-1R en seguida de la estimulacion del CSF-1 (Figura 3A) en cada punto del tiempo (1.5 minutos, 3 minutos, 5 minutos).
Tambien se examinaron los efectos del BLZ945 sobre los macrofagos: Un intervalo de dosis, desde 67 nM hasta 6,700 nM, bloqueo dramaticamente la sobrevivencia de los macrofagos, comparable con los efectos del retiro de CSF-1 (Figura 3B).
Los BMDMs a partir de ratones nulos en Ink4a/Arf (los antecedentes geneticos del modelo de GBM), tambien se probaron en la presencia y en ausencia del BLZ945. La Figura 3C muestra que estos macrofagos derivados de medula osea (BMDMs), como aquellos a partir de los ratones de tipo silvestre, fueron sustancialmente inhibidos por concentraciones de BLZ945 de 67 nM y mayores (Figura 3D). Por consiguiente, el BLZ945 es un inhibidor efectivo de la senalizacion del CSF-1R, que conduce a un bloqueo completo en la viabilidad de los macrofagos. Las Figuras 3C a 3E demuestran que la proliferacion de las celulas de macrofagos derivados de medula osea (BMDMs) a partir de los ratones lnk4a/Arf-/- es fuertemente inhibida en concentraciones de BLZ945 de 67 nM y mayores, al igual que las celulas CRL-2467 (cerebro normal de raton), mientras que incluso en 6,700 nM, tiene poco o ningun efecto sobre la proliferacion de cuatro cultivos de celulas de glioblastoma de raton y uno humano.
Con el fin de determinar la falta de un efecto directo del BLZ945 sobre las celulas tumorales, una lfnea celular de glioma humano y una serie de celulas tumorales primarias y neuroesferas se trataron con BLZ945 en concentraciones similares a aquellas encontradas como efectivas contra el crecimiento de macrofagos. Las celulas U87-MG, derivadas a partir de un glioblastoma multiforme (GBM) humano, las cuales han mostrado ser dependientes de la senalizacion del PDGFR en cultivo e in vivo, no fueron afectadas por el tratamiento con el BLZ945 en la misma dosis que anteriormente (Figura 3E). De una manera similar, la formacion de neuroesferas secundarias a partir de neuroesferas primarias (derivadas a partir de raton RCAS-PDGF-B- HNNestin-Tv-a;Ink4a/Arf/- GBMs) no fue alterada por el tratamiento con el BLZ945 (Figura 3F). Ni el numero ni el tamano de las neuroesferas fueron significativamente afectados por el BLZ945. Finalmente, se examinaron los efectos del BLZ945 sobre multiples lfneas celulares tumorales que se establecieron a partir de neuroesferas secundarias de glioblastoma multiforme (GBM) de raton y, nuevamente, no hubo diferencias (Figura 3F). Colectivamente, estos experimentos demuestran que los efectos de la inhibicion del CSF-1R por el BLZ945 son especfficos para los macrofagos, sin consecuencias directas discernibles sobre las celulas tumorales.
Ejemplo 4: T ratamiento con el inhibidor de CSF-1 R, BLZ945, bloquea el progreso del glioma.
Dados los potentes efectos inhibidores del BLZ945 en los ensayos basados en celulas de macrofagos, y su capacidad demostrada para cruzar la barrera hematoencefalica, parecio ser recomendable probar este inhibidor en los estudios pre-clfnicos en el modelo RCAS-PDGF-B-HA/Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf/-. Estos ratones geneticamente disenados se inyectaron a las 5-6 semanas de edad con celulas DF-1 infectadas con virus RCAS-PDGF-B-HA para iniciar la formacion del glioma como se describe (Hambardzumyan y colaboradores, Transl. Oncol., volumen 2, 89-95 (2009). A las 2.5 semanas en seguida de la iniciacion del tumor, las cohortes de ratones se dosificaron por medio de intubacion oral forzada diariamente ya sea con 200 miligramos/kilogramo de BLZ945 en captisol al 20 %, o bien con el vehfculo (captisol al 20 %), como un control. Los ratones subsiguientemente se evaluaron para determinar su sobrevivencia sin sfntomas. La sobrevivencia media en la cohorte tratada con vehfculo fue de 5.71 semanas (40 dfas), mientras que el 64.4 % de la cohorte tratada con BLZ945 todavfa estaba viva en el punto final del estudio de 26 semanas despues de la inyeccion (de 31 a 32 semanas de edad) (Figura 4A, P < 0.0001). Este punto final se selecciono debido a que los ratones del antecedente de Ink4a/Arf-/- empiezan a desarrollar tumores espontaneos, en su mayor parte linfomas y sarcomas, alrededor de las 30 semanas de edad, lo cual complicarfa la interpretacion del fenotipo del glioma en estudios mas largos. Los datos de la Figura 4A muestran que ninguno de los ratones de control (vehfculo solamente) estuvo sin sfntomas a las 8 semanas despues de la inyeccion del virus, mientras que mas de la mitad de los ratones tratados estaban sin sfntomas en el punto final de las 26 semanas. Nota: 4 ratones tratados se sacrificaron a las 12 semanas para los estudios de histologfa. De estos, 3 estaban libres de tumor, y uno tenia un glioma de grado II.
Se determinaron los grados del tumor para los ratones en ambas cohortes de ratones (vease la Figura 4B). Todos los ratones tratados con vehfculo en la etapa final tuvieron tumores de alto grado, con lesiones de GBM de Grado IV en 13 de 14 ratones. En contraste, los animales tratados con BLZ945 tuvieron tumores significativamente menos malignos: 80 % fueron ya sea de Grado II o bien estaban libres de tumor; el 20 % restante tenfan el tumor de Grado II. En el 56 % de los ratones vivos en el punto final del estudio de 26 semanas, no hubo lesiones detectables (Figura 4B). Cinco los ratones tratados con BLZ945 se sacrificaron como sintomaticos durante el estudio (n=5), y comparandose con el grupo que todavfa era asintomatico cuando se sacrificaron al final del estudio (n=9). En ambos grupos, todavfa hubo una disminucion significativa
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en el grado del tumor comparandose con los animales tratados con vehfculo. Esto muestra un aumento dramatico en la sobrevivencia y una reduccion en la malignidad del tumor en este estudio a largo plazo con el tratamiento con BLZ945.
Ejemplo 5: Imagenes de MRI para monitorear los efectos del BLZ945 sobre el crecimiento tumoral.
Un estudio de corto plazo, de 7 dfas, del BLZ945 en los ratones en los que se indujo el tumor, se monitoreo mediante exploraciones regulares de MRI, para medir los cambios de tamano del tumor durante un corto perfodo de tratamiento cuando el crecimiento tumoral es normalmente rapido. El volumen tumoral en los ratones RCAS-PDGF-B-HAJNestin-Tv-a;ink4a/Arf/- se determino mediante MRI, y los ratones se agregaron al estudio cuando este fue cuando menos 4.5 milfmetros cubicos o mayor. Los ratones se trataron con BLZ945 o con el control de vehfculo durante 7 dfas, como se describe anteriormente. Las exploraciones de MRI se llevaron a cabo en el dfa antes de que se iniciara el tratamiento, en el punto medio del tratamiento, y el dfa anterior al final del perfodo de estudio. Los ratones tratados con vehfculo mostraron un incremento dramatico y progresivo en el volumen tumoral durante este corto estudio, como se muestra en la Figura 5A, aumentando el volumen tumoral promedio por aproximadamente 5 veces. El tratamiento con el BLZ945 bloqueo el progreso del tumor, como se determino mediante MRI (Figura 5A), sin aumento alguno en el tamano del tumor durante el mismo corto perfodo. Los sujetos tratados (lfnea inferior) mostraron poco o ningun agrandamiento del tumor, mientras que el volumen tumoral aumento agudamente en los controles tratados con vehfculo. La Figura 5B muestra el volumen tumoral para los ratones de control individuales (grafica superior), y para los ratones tratados (grafica inferior) durante los primeros 6 dfas despues de iniciarse la dosificacion con el BLZ945. Casi todos los animales tratados con BLZ945 muestran poco o ningun aumento en el tamano del tumor, mientras que todos los animales de control muestran grandes incrementos en el volumen del tumor.
Como se muestra en la Figura 5B, los tumores no tratados aumentaron por aproximadamente el 150 al 850 % en volumen durante este tiempo, mientras que el tamano del tumor se redujo en 7 de 11 animales tratados, y solamente dos de los animales tratados tuvieron aumentos del volumen tumoral de mas del 50 %. Las Figuras 5-2A y 5-2B ilustran los datos del volumen tumoral para todos los 11 animales de prueba y de control, y muestran que el tratamiento detuvo en gran parte los incrementos en el tamano del tumor, mientras que los tumores no tratados crecieron sustancialmente en el dfa 6 del tratamiento. Estos resultados indican que la senalizacion del CSF-1R y la contribucion supuesta de los macrofagos dependientes del CSF-1R es crftica para el progreso del glioma en este modelo de raton, y que el BLZ945 puede impedir el crecimiento de un tumor de cerebro en un modelo de mamffero altamente relevante para el glioblastoma humano.
En una segunda prueba in vivo sobre tumores mas grandes en el mismo modelo de glioblastoma multiforme (GBM) (cohorte de “tumor grande”), los ratones con los volumenes tumorales de 48.7 a 132 milfmetros cubicos se trataron con BLZ945, y se monitorearon los cambios en el volumen tumoral mediante MRI durante un lapso de 6 dfas. El volumen tumoral realmente disminuyo en casi todos los animales de prueba, y 6 de los 18 ratones tratados tuvieron una reduccion de cuando menos el 30 % en el tamano del tumor (Figuras 5D y 5- 2C). En esta prueba no se incluyeron animales de control, debido a que no se habrfa esperado que sobrevivieran hasta el punto final.
Ejemplo 6: Analisis de las capacidades distintivas del cancer en los tumores tratados con BLZ945.
La identificacion de un efecto sorprendente de la inhibicion del CSF-1R sobre la gliomagenesis nos condujo a investigar los mecanismos subyacentes para esta respuesta, y a determinar la manera en que el tratamiento con el BLZ945 afectaba a varias de las capacidades distintivas del cancer. Los analisis se llevaron a cabo en tejidos a partir del estudio de corto plazo (vease el Ejemplo 5), de tal manera que se pudieran comparar los tumores a partir de diferentes grupos de tratamiento hasta el mismo punto final definido. La densidad de las celulas tumorales se examino utilizando el marcador de oligodendrocitos Olig2, el cual se ha utilizado anteriormente para identificar las celulas de glioma. Olig2 se redujo significativamente en el grupo tratado con BLZ945 comparandose con los controles de vehfculo, lo cual muestra que el BLZ945 reduce significativamente los numeros de las celulas tumorales. (Figura 6A).
El analisis de la proporcion de celulas Olig2+ que estaban proliferando, como se determino mediante la incorporacion de bromo-desoxiuridina (BrdU), revelo una reduccion significativa en el grupo de BLZ945 (Figura 6B). Nuevamente, el BLZ945 reduce significativamente la proliferacion de las celulas tumorales.
Tambien se evaluo el nivel de apoptosis en estas celulas. Las celulas apoptoticas se contaron como aquellas que tenfan el tenido de caspasa-3 (CC3) citoplasmica disociada y los nucleos condensados. Como se muestra en la Figura 6C, el tratamiento con el inhibidor de CSF-1R provoco un aumento en la apoptosis en el primer punto del tiempo en particular, aunque se observo poco tenido en la cohorte de tumor grande en el dfa 7.
La siguiente Tabla resume los analisis histologicos llevados a cabo sobre las muestras del Ejemplo 5:
Tabla 1. Analisis Histologicos
Parametro
Vehfculo BLZ945 Dfa 3 BLZ945 Dfa 7 BLZ945 Grande Dfa 3 BLZ945 Grande Dfa 7
Volumen del tumor (Dfa -1 vs Dfa 6)
+498% - - +0.68% - - -24.3%
Celulas DAPI+ totales
- - -72% -80% -40% -65%
Celulas tumorales (%Olig2+)
- - -27% -77% -14% -73%
Proliferacion (%BrdU+Olig2+)
- - -91% -67% -98% -94%
Apoptosis (%CC3+)
- - +17 veces +6 veces +9 veces +2 veces
Vasculatura (CD31 MVD)
- - - - -17% - - -67%
Macrofagos (%CD68+)
- - +3 veces +2 veces +2 veces +4 veces
fndice fagocitico
- - +2.6 veces +3.0 veces +2.2 veces +4 veces
Capacidad fagocitica
- - +11.5 veces +5.0 veces +7.1 veces +6.0 veces
El cambio en el volumen tumoral es el volumen en el punto final (dfa 6) en relacion con el dfa uno, y los cambios reportados son en relacion con el grupo de control (vehfculo).
5 Juntos, estos analisis demuestran que la inhibicion de la senalizacion del CSF-1R efectivamente bloquea el crecimiento y la malignidad de los gliomas a traves de un efecto combinado sobre la reduccion de la proliferacion celular tumoral y el aumento de la muerte celular.
En resumen, estos datos demuestran que el inhibidor de CSF-1R, BLZ945, es una potente nueva terapia que bloquea el progreso del tumor en un modelo de glioma muy agresivo en los ratones. El compuesto mejoro 10 dramaticamente la sobrevivencia en un modelo de raton pre-clfnico de gliomagenesis, y redujo agudamente los indices de crecimiento tumoral, y tambien redujo el tamano del tumor durante un perfodo de prueba corto y mas largo. En la prueba a largo plazo, el BLZ945 parece eliminar los tumores visibles en un numero significativo de ratones, y reduce agudamente el grado del tumor en la mayor parte de los ratones tratados.
Debido a que se ha demostrado que el aumento en la infiltracion de macrofagos se correlaciona con la 15 malignidad en los gliomas humanos, se espera que la potencia del BLZ945 en este modelo de raton,
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aparentemente debido a la direccion terapeutica de los TAM en los sujetos con GBM se traduzca en eficacia contra el glioblastoma en otros mairuferos, incluyendo los seres humanos. Debido a que se han implicado las celulas mieloides, incluyendo los macrofagos, en el embotamiento de la respuesta quimioterapeutica en los modelos de cancer de mama, y en la mejora de la respuesta adaptable en seguida de la irradiacion en los modelos de xenoinjerto de GBM, este y los inhibidores de CSF-1R similares pueden ser efectivos en combinacion con las terapias dirigidas contra las celulas de cancer en los gliomas, una posibilidad que amerita mayor investigacion. En particular, el compuesto
imagen20
ofrece la capacidad para dirigirse al CSF-1R y al PDGFR en concentraciones similares y, por consiguiente, pueden ser incluso mas efectivos que el BLZ945. En realidad, el compuesto (Id) inhibe el PDGFR con una IC50 solo aproximadamente 4 veces mas alta que su IC50 para el CSF-1R. Por consiguiente, se espera que una concentracion terapeuticamente efectiva de cualquiera de este compuesto afecte a ambos sitios objetivo, y exhiba una actividad sinergica sobre los gliomas.
Ejemplo 7
Con el fin de investigar los mecanismos moleculares en donde los TAM tratados con BLZ945 puedan provocar esta sorprendente respuesta anti-tumoral in vivo, a pesar de la falta de un agotamiento evidente de los TAM o de cualquier efecto anti-proliferativo directo sobre las celulas de GBM humanas, se aislaron los TAM CD11b+Gr-1- a partir de ratones tratados con vehfculo o con BLZ945, y se llevo a cabo la perfilacion de la expresion del microarreglo (vease la Figura 7). El analisis del microarreglo identifico 257 genes como significativamente expresados diferencialmente entre los grupos: 52 genes fueron sobre-regulados, y 205 fueron sub-regulados (Figuras 7B; y tambien 8A). Entre estos, los analisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) revelaron que los objetivos de Egr2, un factor de transcripcion corriente abajo de la senalizacion del CSF-1R, eran sub-regulados en los TAM tratados con BLZ945 (Figura 7C). De una manera desproporcionada, los genes asociados con la fase M2 fueron sobre-regulados (Figuras 7D y 7E).
Ejemplo 8. Cambios de expresion genetica inducidos por el inhibidor del CFR-1R.
Se empleo la modelacion de regresion de Lasso para determinar el numero mmimo de genes que discriminaban mejor los dos grupos de tratamiento. Esta identifico una firma de 5 genes para el tratamiento con el BLZ945, comprendida de adrenomedulina (Adm), arginasa-1 (Arg1), el factor de coagulacion F13a1, el receptor de manosa C tipo 1 (Mrc1/CD206), y el inhibidor de proteasa serpinB2 (Figura 8B). Es interesante que cada uno de estos genes se ha asociado con la polarizacion de macrofagos M2/alternativamente activada, y que 4 de 5 genes son sub-regulados en seguida del tratamiento con el BLZ945. SerpinB2 (tambien conocido como PAI2), el unico gen sobre-regulado en la firma de 5 genes, se correlaciona en general positivamente con un aumento en la sobrevivencia, en particular en los pacientes con cancer de mama.
En muchos contextos de tejido, se ha encontrado que los TAM estan mas polarizados a M2, lo cual se ha vinculado con sus funciones inmunosupresora y pro-tumorigenica. Ademas, los macrofagos en los gliomas humanos exhiben un fenotipo de tipo M2, determinado por un aumento de los niveles de los receptores eliminadores CD163 y CD204, los cuales estan asociados con un tumor de grado mas alto. Dado el sorprendente enriquecimiento para los genes de M2 en la firma restringida de 5 genes, se examino la lista de 257 genes para determinar si hubo marcadores asociados con M2 adicionales alterados en seguida del tratamiento con BLZ945. Esto revelo 10 genes adicionales [Alox15 (15-lipoxigenasa de araquidonato); Cdh1 (cadherina); Cd163 (antfgeno CD163); Fpr2 (receptor peptfdico de formilo-2); Hmox1 (heme-oxigenasa (deciclaje) 1); il1b (interleucina 1 beta); y Stab1 (estabilina 1)], la mayona de los cuales fueron sub-regulados (Figura 7D, tabla 2). Los genes de polarizacion M1/ clasicamente activados no fueron sobre-regulados de una manera correspondiente, con la excepcion del receptor de interleucina-1-beta (Figura 7E). Estos datos sugieren que, en respuesta a la inhibicion del CSF-1R mediante el BLZ945, los TAM pierden su polarizacion M2 y pueden ganar funciones anti-tumorigenicas.
Esto tambien sugiere que el monitoreo de estos cambios de la expresion genetica como biomarcadores puede proporcionar valiosa informacion de pronostico para el tratamiento de los pacientes de glioma con los inhibidores del CSF-1R. Se puede esperar que los sujetos tratados cuyos perfiles de expresion genetica cambien en el mismo patron o en un patron similar a estos cambios observados, respondan positivamente al tratamiento con el inhibidor de CSF-1R, y aquellos que no exhiban esos cambios de expresion genetica
pueden necesitar recibir un tratamiento alternativo o adicional debido a un pronostico negativo con el inhibidor de CSF-1R solo.
Tabla 2. Expresion genetica diferencial como un resultado del tratamiento con el inhibidor de CSF-1R
Sfmbolo
Descripcion Veces de Cambio BLZ945- Vehfculo Valor P Nominal
Akap 1
Una protefna de ancla quinasa (PRKA (gravin) 12 -2.85 1.31E-04
Abhd
Dominio abhidrolasa que contiene 15 -2.48 1.36E-06
Acp5
Fosfatasa acida 5, resistente al tartrato 2.36 2.08E-03
Aoah
Aciloxiacil hidrolasa -2.43 3.83E-06
Ada
Adenosina desaminasa -3.00 2.28E-07
Arxes 1
Secuencia 1 expresada en cromosoma X relacionada con adipocitos -2.23 1.68E-03
Arxes 2
Secuencia 2 expresada en cromosoma X relacionada con adipocitos -2.96 3.37E-04
Adm * #
Adrenomedulina -10.85 2.60E-09
Aldh1a2
Aldehfdo deshidrogenasa familia 1, subfamilia 2 -2.18 8.36E-04
Apbb2
Enlazante a protefna precursor de amiloide beta (A4), familia B, miembro 2 2.27 2.97E-06
Anin
Anilina, protefna enlazante a actina -2.99 1.38E-04
Asb10
Repeticion de anquirina y 10 que contiene caja de SOCS 2.10 1.14E-03
Asb11
Repeticion de anquirina y 11 que contiene caja de SOCS 2.19 3.00E-04
Mki67
Antfgeno identificado por anticuerpo monoclonal Ki 67 -7.18 2.78E-05
Apob
Apolipoprotefna B -2.92 3.42E-05
Apoc1
Apolipoprotefna C-l 3.21 1.56E-06
Apoc4
Apolipoprotefna C-IV 3.14 1.91E-04
Alox15 #
Araquidonato 15-lipoxigenasa 4.24 8.85E-03
Arg1 * #
Arginasa, higado -8.48 5.07E-03
Aspm
Tipo asp (husillo anormal), microcefalia asociada (Drosofila) -2.22 1.02E-03
Aurka
Aurora quinasa A -2.23 1.30E-03
Aurkb
Aurora quinasa B -2.71 4.19E-06
Birc5
5 que contiene repeticion de baculoviros IAP -6.13 -3.00E-06
Bambi
Inhibidor unido a lamembrana de BMB y activina, homologo (Xenopus laevis) 2.64 6.53E-05
Bub1
Deshinibida incipiete por homologos de bencimidazoles 1 -2.72 4.19E-06
Cdh1 #
Caderina 1 -6.43 1.70E-04
Cdh 1
Caderina 2 -2.23 6.25E 04
Camkk1
Protefna quinasa dependiente de calcio/calmodulina quinasa 1, alfa -2.13 2.69E-08
Calml4
4 tipo calmodulina -2.06 2.12E-05
Chst2
Carbohidrato sulfotransferasa 2 2.44 5.14E-04
Cbr2
Carbonilo reductasa 2 -4.15 2.93-07
Cpa3
Carboxipeptidasa A3, mastocito 2.17 6.30E-04
Ctnnd2
Catenina (protefna asociada a caderina), delta 2 -2.94 8.46E-07
Ctsf
Catepsina F 2.10 1.53E-04
Cd163#
Antfgeno CD163 -2.65 3.87E-07
Cd22
Antfgeno CD22 2.35 1.09E-05
Cd244
CD244 receptor de celulas asesinas naturales 2B4 -2.71 1.11E 07
Cd38
Antigeno CD38 -3.72 4.44E-05
Cd5
Antigeno CD5 3.62 2.96E-05
Cd83
Antigeno CD83 2.28 2.53E -05
Cd93
Antfgeno CD93 -2.42 2.30E-07
Ckslb
Proteina cinasa 1b CDC28 -2.54 1.71E-06
Cdc20
Homologo 20 de ciclo de division celular (S. cerevisiae) -2.75 1.16E-04
Cdc45
Homologo 45 de ciclo de division celular (S. cerevisiae) -2.03 9.78E-08
Cdc6
Homologo 6 de ciclo de division celular (S. cerevisiae) -3.67 8.12E-08
Cdca5
5 asociado con el ciclo de division celular -2.24 6.77E-06
Cenpe
Centromero proteina E -4.18 1.96E-05
Cenpk
Centromero proteina K -2.45 1.46E-05
Cep55
Proteina centrosomal 55 -2.40 8.23E-05
Ccr1
Receptor 1 de quimiocina (motivo C-C) -4.56 6.86E-05
Cxcr7
Receptor 7 de quimiocina (motivo C-X-C) -2.26 8-65E-03
Cspg5
Proteoglicano de sulfato de condroitina 5 -2.61 1.09E-05
Clu
Clusterina -2.34 3.55E-04
F3
Factor de coagulacion III -2.11 4.58E-03
F9
Factor de coagulacion IX 2.12 5.92E-04
F13a1+#
Factor de coagulacion XIII, subunidad A1 -10.66 1.39E-09
Col11a1
Colageno, tipo XI, Alfa 1 -3.49 3.09E-04
Col14a1
Colageno, tipo XIV, Alfa 1 -2.65 1.37E-06
Cfp
Properdina de factor de complemento -2.64 2.60E-04
Cntn1
Contactina 1 -4.93 2.80E-08
Cpne2
Copina II -2-20 1.13E-05
Crybb1
Cristalina, beta B1 -2.83 2.44E-05
Clec4n
Familia de dominio de lectina tipo C 4, miembro n -6.53 4.34E-10
Ccna2
Ciclina A2 -3.90 1.19E-05
Cnnb1
Ciclina B1 -3.55 2.25E-05
Ccnb2
Ciclina B2 -4.53 1.16E-05
Ccnd1
Ciclina D1 -3.01 1.06E-05
Ccnd2
Ciclina D2 -3.34 1.36E-05
Ccne2
Ciclina E2 -5.28 3.67E-08
Ccnf
Ciclina F -2.30 1.48E-04
Cdk1
Cinasa dependiente de ciclina 1 -2.18 2.75E-05
Cst7
Cistatina F (leucocistatina) 2.63 2.29E-07
Cyp4v3
Citocromo P450, familia 4, subfamilia v, polipeptido 3 2.14 1.15E-05
Cpebl
Protefna de enlace del elemento de poliadenilacion citoplasmico 1 2.86 1.97E-05
Ckap2
Protefna asociada con citoesqueleto -2.17 1.80E-04
Ddhdl
1 que contiene dominio DDHD 2.06 4.86E-03
Dner
Receptor relacionado con EGF similar a delta/notch -2.68 2.65E-04
Dck
Cinasa de desoxicitidina -2.07 2.50E-04
Depdcla
1a que contiene Dominio DEP -2.81 9.05E-05
Dhfr
Reductasa de dihidrofolato -2.40 5.79E-06
Prim1
Primasa de DEP, subunidad p49 -2.76 2.87E-07
D17H6S56E- 5
Segmento de ADN, Chr 17, D6S56E 5 humano -2.01 1.66E-03
Ddit4
Transcripcion inducible por dano del ADN 4 -2.43 5.07E-06
Dusp1
Fosfatasa de especificidad doble 1 2.33 3.55E-04
E2f8
Factor de transcripcion de E2F 8 -2.71 1.20E05
Ect2
Oncogen de ect2 -3.19 1.65E-06
Emb
Embigina -2.59 9.66E-05
Eepd1
1 que contiene dominio de la familia de endonucleasa/exonucleasa/fosfatasa 2.70 1.62E-06
Ezh2
Mejorador de homologo zeste 2 (Drosophila) -2.54 1.36E-05
Etl4
Mejorador de trap locus 4 2.41 1.24E-05
Eps8
Sustrato de senda del receptor de factor de crecimiento epidermico 8 -2.51 4.00E-06
Emp1
Protefna de membrana epitelial 1 -3.19 6.42E-04
Ephxl
Epoxido-hidrolasa 1, microsomal 2.76 1.75E-04
Eroll
Similar a ERO1 (S. cerevisiae) -2.64 1.0E-05
Fam20c
Familia con similitud de secuencia 20, miembro C 2.79 3.62E-06
Fabp3
Protefna 3 que se enlaza al acido graso, musculo y corazon 2.93 4.99E-06
Fabp7
Protefna 7 que se enlaza al acido graso, cerebro -6.77 9.66E-06
Fbxo32
Protefna de cuadro-F 32 2.54 1.79E05
Fbn2
Fibrilina 2 -2.13 3.89E-03
Fap
Protefna de activacion de fibroblastos -2.25 1.46E-03
Fpr2#
Receptor de peptido de formilo 2 -2.83 6.68E-05
Fhl1
Cuatro y medio dominios de LIM 1 -2.02 5.40E-03
Gja1
Protefna de union de hueco, alfa 1 -2.78 1.97E-03
Gpnmb
Glicoprotefna (transmembrana) nmb 3.22 3.98E-05
Ggta1
Galactosil-transferasa de glicoprotefna alfa 1, 3 -2.40 2.12E-06
Gpm6a
Glicoprotefna m6a -5.35 3.23E-06
Gzma
Granzima A 3.55 4.11E-03
Gadd45a
Detencion de crecimiento y alfa 45 inducible por dano de ADN 2.40 2.77E-04
Gap43
Protefna 43 asociada al crecimiento -2.56 7.42E-05
Gdf3
Factor de diferenciacion de crecimiento 3 -3.33 1.40E-07
Gem
Protefna de enlace de GTP (gen sobre- expresado en musculo esqueletico 2.17 7.03E-04
Hspala
Protefna de choque por calor 1A -4.38 1.45E-05
Hspalb
Protefna de choque por calor 1B -8.71 1.88E-08
Hsp90aa1
Protefna de choque por calor 90, alfa (citosolica), clase A, miembro 1 -2.23 1.01E-03
Hells
Helicasa, especffica de linfoide -3.59 9.75E-06
Hmoxl#
Heme-oxigenasa (deciclaje) 1 -2.90 7.05E-05
Hmgb3
Cuadro 3 de grupo de alta movilidad -2.42 2.32E-06
Hmgn5
Dominio de enlace de nucleosoma del grupo de alta movilidad 5 -2.58 1.79E-05
Igj
Cadena de union de inmunoglobulina 3.36 4.53E-03
Ikbke
Inhibidor de cinasa epsilon kappaB 2.38 1.50E-04
Igfi
Factor de crecimiento tipo insulina 1 2.13 8.56E-05
Igfbp2
Protefna que se enlaza al factor de crecimiento tipo insulina 2 -3.54 1.24E-06
Igfbp2
Protefna que se enlaza al factor de crecimiento tipo insulina 3 6.53 1.05E-05
Itgam
Integrina alfa M -2.25 2.27E-04
Itgax
Integrina alfa X 2.08 1.36E-03
Ifitml
Protefna transmembrana inducida por interferon 1 -5.18 1.21E-04
Ifitm2
Protefna transmembrana que inducida por interferon 2 -2.82 1.54E-03
Ifitm3
Protefna transmembrana que inducida por interferon 3 -2.06 4.73E-03
Ifitm6
Protefna transmembrana inducida por interferon 6 -4.14 6.14E-04
Ill b#
Interleucina 1 beta 2.06 4.50E-04
1118bp
Protefna que se enlaza a interleucina 18 3.66 4.53E-04
Il7r
Receptor de interleucina 7 -2.01 4.96E-03
Kpna2
Karioferina (importina) alfa 2 -2.38 1.98E-05
Khdrbs3
Que contiene dominio KH, enlace de ARN, 3 asociada con transduccion de serial -2.10 3.94E-04
Klrbla
Miembro 1A de la subfamilia B del receptor tipo lectina de celula aniquiladora 4.30 9.00E-05
Kif11
Miembro de familia de cinesina 11 -2.57 9.00E-05
Pbk
Cinasa de enlace de PDZ -5.63 9.20E-07
Pttg 1
Gen que transforma el tumor de pituitaria 1 -2.83 2.73E-06
Plac8
Especffico de placenta 8 -2.79 6.64E-03
Pdgfra
Receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipeptido alfa -3.16 4.84E-06
Pf4
Factor de plaquetas 4 -2.96 1.21E-05
Pdgfc
Factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipeptido C -2.25 2.98E-03
Ptn
Pleiotrofina -3.21 4.42E-04
Pdpn
Podoplanina -2.01 3.51E-04
Plk1
Cinasa tipo polo 1 (Drosophila) -2.68 5.72E-05
Pola1
Polimerasa (dirigida por ADN), alfa 1 -2.37 3.52E-06
Pold2
Polimerasa (dirigida por ADN), delta 2, subunidad reguladora -2.02 5.72E-06
Pole
Polimerasa (dirigida por ADN), epsilon -2.27 5.96E-05
Kcnk2
Canal de potasio, subfamilia K, miembro 2 -2.13 8.52E-05
Prickle1
Homologo de prickle 1 (Drosophila) 2.32 1.75E-04
P4ha2
Procolageno-prolina, 4-dioxigenasa de 2- oxoglutarato (4-hidroxilasa de prolina), polipeptido alfa II -3.54 1.25E-06
Pmepa1
Protefna transmembrana de prostata, 1 inducido por androgeno -2.35 5.85E-04
Psmb7
Subunidad de proteasoma (prosoma, macropafna), beta tipo 7 -2.17 4.27E-03
Prc1
Regulador de protefna de citoquinesis 1 -3.06 1.26E-04
Ptprzl
Fosfatasa de protefna tirosina, tipo receptor Z, polipeptido 1 -3.66 4.43E-05
P2ry12
Receptor P2Y purinergico, 12 acoplado con protefna G -2.55 1.86E.04
Rab34
RAB34, miembro de la familia de oncogenes RAS 2.08 3.95E-05
Racgapl
Protefna activadora de GTPasa Rac 1 -2.56 2.92E-05
Rad51ap1
Protefna 1 asociada con RAD51 -2.61 1.26E-07
Rad51
Homologo de RAD51 (S. cerevisiae) -2.90 3.33E-06
Ranbp1
Protefna que se enlaza a RAN 1 -2.01 6.62E-07
Rfc4
Factor de replicacion C (activador 1) 4 -2.17 4.24E-05
Rbp1
Protefna 1 que se enlaza a retinol, celular -4.22 1.88E-05
Rrm1
Reductasa de ribonucleotido M1 -2.14 1.79E-05
Rrm2
Reductasa de ribonucleotido M2 -8.23 1.04E-07
2310016C08 Rik
Gen RIKEN ADNc 2310016C08 -2.14 1.12E.04
2810417H13 Rik
Gen RIKEN ADNc 2810417H13 -3.96 2.33E-07
4930583H14 Rik
Gen RIKEN ADNc 4930583H14 -2.37 1.25E-05
Rbm3
Protefna 3 de motivo que se enlaza al ARN -2.20 2.23E-09
Slfn4
Esclafeno 4 -3.35 3.42E-03
Stil
Locus que interrumpe Scl/tal1 -3.15 2.15E-06
Serpinb2*#
Inhibidor de peptidasa de serina (o cistefna), 6.20 1.12E-02
clado B, miembro 2
Serpinb6b
Inhibidor de peptidasa de serina (o cistefna), clado B, miembro 6b 2.03 1.22E-03
Smyd2
2 que contiene el dominio SET y MYND -2.25 6.90E-04
Sh3bgr
Protefna rica en acido glutamico del dominio que se enlaza a SH3 3.33 6.84E-07
Sh3bgrl
Tipo protefna rica en acido glutamico del dominio que se enlaza a SH3 -2.02 4.68E-04
Schbpl
Protefna 1 que se enlaza al dominio SH2 Shc -4.72 1.74E-06
Slamf8
Miembro 8 de la familia SLAM 2.81 5.20E-03
Snrpal
Polipeptido de ribonucleo-protefna nuclear pequeno A' -2.04 1.48E-06
Slc2a5
Familia portadora de soluto 2 (transportador de glucosa facilitado), miembro 5 -3.46 8.15E-07
Slc39a4
Familia portadora de soluto 39 (transportador de zinc), miembro 4 2.44 7.83E-05
Slc6a1
Familia portadora de soluto 6 (transportador de neurotransmisor, GABA), miembro 1 -2.09 5.66E-04
Sparcl1
Tipo SPARC 1 -3.23 1.06E-03
Spon1
Espondina 1, (f-espondina) protefna de matriz extracelular -2.50 9.32E-05
Sox2
Gen 2 que contiene al cuadro SRY -2.50 5.13E-03
Stab1#
Estabilina 1 -2.64 3.92E-05
Stmn1
Estatmina 1 -2.52 5.52E-05
Smc2
Mantenimiento estructural de cromosomas 2 -2.87 7.80E-'5
Smc4
Mantenimiento estructural de cromosomas 4 -3.20 2.26E-04
St14
Supresion de tumorigenicidad 14 (carcinoma de colon) 2.47 4.21E-06
Tiparp
Polimerasa de poli-(ADP-ribosa) inducible por TCDD -2.06 1.25E-03
Tnc
Tenascina C -2.56 2.48E-03
Tk1
Cinasa de timidina 1 -3.39 1.24E-07
Tipin
Protefna que interactua sin tiempo -2.50 6.24E-06
Tfpi2
Inhibidor de senda de factor de tejido 2 -2.60 3.99E-03
Timpl
Inhibidor de tejido de metaloproteinasa 1 -2.07 1.64E-04
Top2a
Topoisomerasa (ADN) II alfa -2.11 2.13E-05
Topbpl
Protefna 1 que se enlaza a topoisomerasa (ADN) II -2.37 9.96E-06
T px2
TPX2, homologo de protefna asociada con microtubulos (Xenopus laevis) -2.52 1.16E-05
Tcf19
Factor de transcripcion 19 -2.32 1.67E-06
Tgfbi
Factor de crecimiento transformante, inducido por beta -3.23 1.68E-06
Tgm2
Transglutaminasa 2, polipeptido C -2.94 2.86E-03
Tmem119
Protefna transmembrana 119 -3.12 1.71E-06
Tmem163
Protefna transmembrana 163 2.20 5.42E-03
Trps1
Sfndrome tricorrinofalangeal I (humano) -2.97 1.68E-07
Trim59
59 que contiene motivo tripartita -2.78 3.02E-04
Ttk
Cinasa de protefna Ttk -2.63 3.35E-05
Tubb2c
Tubulina, beta 2C -2.13 3.84E-06
Ube2c
Enzima E2C conjugada con ubiquitina -3.98 1.12E-04
Uhrf1
Tipo ubiquitina, que contiene dominios de dedo PHD y RING, 1 -2.96 3.73E-07
Ung
Glicosilasa de ADN de uracilo -2.50 5.81E-07
Wdhd1
Repeticion de WD y protefna 1 de enlace de ADN de cuadro-HMG -2.01 2.52E-04
Zwilch
Zwilch, asociado con cineto-nucleo, homologo (Drosophila) -4.32 3.61E-06
* Componente de la firma de regresion de Lasso de respuesta al BLZ945.
# Genes asociados con el macrofago M2 relevante.
En la Tabla, los genes sub-regulados reciben un numero de "veces de cambio" negativo, mientras que los genes sobre-regulados tienen valores positivos. Los valores p nominales son de la prueba t de dos colas de 5 Student.
En adicion, las firmas geneticas generadas a partir de los TAM tratados con BLZ945 en los ratones, parecen estar asociadas con una sobrevivencia diferencial en los pacientes con GBM. Se utilizaron una maquina de vector de soporte (SVM) y la firma de Lasso para analizar los datos del GBM del The Cancer Gene Atlas (TCGA) [El Atlas de Genes de Cancer], y una segunda serie combinada de conjuntos de datos de 10 glioblastoma multiforme (GBM), y para segregar a los pacientes en los clasificadores ya sea de “BLZ945” o de “Vehfculo”. Estos analisis revelaron un aumento en la sobrevivencia media en el intervalo de 10 meses en los pacientes pro-neurales del TCGA utilizando la firma de Lasso (Figuras 8C y 8D) a 31.5 meses en los conjuntos de datos combinados con la firma de SVM (Figuras 8E y 8F). Es interesante que este aumento en la sobrevivencia no fue evidente en otros subtipos de GBM, y no era dependiente del enriquecimiento de los 15 pacientes pro-neurales G-CIMP+.
Tabla 3. Datos de Sobrevivencia para la Maquina de Vector de Soporte (SVM) y modelos Lasso en las
diferentes poblaciones de GBM
Grupo
BLZ945 Vehfculo Super- vivencia media Valor P
SVM combinado neural
49 16 5.42 1.59E-01
SVM combinado proneural
46 62 31.54 6.86E-04
Grupo
BLZ945 Vehfculo Super- vivencia media Valor P
SVM combinado mesenquimal
37 102 -2.25 8.92E-01
SVM combinado clasico
11 48 0.40 6.67E-01
SVM TCGA proneural
45 88 7.64 7.27E-03
SVM TCGA proneural GCIMP
13 8 -40.60 2.01E-01
SVM TCGA proneural no GCIMP
22 44 -0.76 2.64E-01
SVM TCGA GCIMP
14 8 -35.60 2.03E-01
SVM TCGA no GCIMP
83 157 -1.06 7.27E-01
SVM TCGA neural
23 30 2.84 7.73E-01
SVM TCGA mesenquimal
53 99 0.30 7.62E-01
SVM TCGA clasico
31 66 -3.14 7.71E-01
Lasso combinado neural
51 14 7.01 6.50E-02
Lasso combinado proneural
79 29 6.51 4.15E-02
Lasso combinado mesenquimal
21 118 1.88 5.55E-01
Lasso combinado clasico
28 31 0.33 9.68E-01
Lasso TCGA proneural
84 49 9.98 5.41E-06
Lasso TCGA proneural GCIMP
20 1 NA NA
Lasso TCGA proneural no GCIMP
40 26 10.84 1.40E-02
Lasso TCGA GCIMP
20 2 -16.13 7.21E-01
Grupo
BLZ945 Vehfculo Super- vivencia media Valor P
Lasso TCGA no GCIMP
100 140 0.10 4.14E-01
Lasso TCGA neural
31 22 -5.19 2.77E.02
Lasso TCGA mesenquimal
23 129 0.40 8.35E-01
Lasso TCGA clasico
49 48 -1.42 6.34E-01
El analisis de las proporciones de riesgo asociadas demostro la ventaja de sobrevivencia especffica del proneural tanto en TCGA como en los conjuntos de datos combinados (Figura 8G). La especificidad pro-neural es consistente con las firmas de TAM que se han generado originalmente a partir del modelo de giomagenesis 5 PDG, el cual representa mas estrechamente el GBM pro-neural. Esto sugiere que estas firmas geneticas pueden proporcionar una gufa de pronostico util para los sujetos que se sometfan al tratamiento con productos quimioterapeuticos, en particular los pacientes con gBm tratados con los inhibidores del CSF-1R. Debido a que el GBM pro-neural no responde a las agresivas quimioterapia y radioterapia comparandose con los otros subtipos, el hallazgo de un valor de pronostico asociado con estas firmas puede tener un importante 10 potencial de traduccion para este grupo de pacientes. Basandose en la correlacion observada, se espera que los pacientes que reciban quimioterapia y que exhiban una firma genetica cuando menos aproximadamente el 80 % similar a cualquiera de las firmas geneticas de Lasso o SVM, responderan positivamente a ese producto quimioterapeutico. En particular, se espera que esta correlacion sea util con los sujetos tratados con un inhibidor de CSF-1R, en particular los compuestos de la formula (I) como se describen en la presente.
15 Tabla 4. Proporciones de riesgo e intervalos de confianza del 95 % asociados para el modelo de regresion de Lasso en diferentes grupos de pacientes con G-CIMP y sin G-CIMP. G-ClMP corresponde al Fenotipo Metilador de Isla CpG de Glioma. Los valores P se obtuvieron empleando la prueba de Wald.
Estrato
Poblacion de pacientes Modelo Razon de riesgo Cl 95% Valor P
'BLZ945' Lasso
No GCIMP proneural* Univariado 0.4921 (0.2766 0.8756) 0.0063
'BLZ945' Lasso
Todo proneural Univariado 0.3937 (0.2601 0.5961) 9.729e-06
G-CIMP
Todo proneural Univariado 0.3289 (0.1481 0.7304) 0.01367
G-CIMP
Todo proneural Multivariado* 0.4601 (0.1972 1.0733) 0.00783
'BLZ945' Lasso
Todo proneural Multivariado* 0.4295 (0.2304 0.8007) 0.07244
* Conjunto de pacientes pro-neurales con datos de metilacion que definitivamente no son positivos para G- 20 CIMP (67/133 en total de pacientes TCGA pro-neurales).
** Modelo de riesgo proporcional cox multivariado usando ambos estratos de clasificacion G-CIMP y 'BLZ945'.
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Tabla 5. Proporciones de riesgo para el modelo de regresion de Lasso en diferentes conjuntos de datos de pacientes. Los valores P se obtuvieron utilizando la prueba de Wald. Solamente las proporciones de riesgo de los subtipos pro-neurales son estadfsticamente significativas.
Grupo
Razon de riesgo Cl 95% Valor P
TCGA-proneural
0.29 (0.17-0.50) 6.32E-06
TCGA-clasico
1.28 (0.73-2.26) 3.89E-01
TCGA-mesenquimal
0.93 (0.49-1.72) 8.07E-01
TCGA-neural
1.93 (0.83-4.46) 1.25E-01
Proneural combinado
0.44 (0.25-0.79) 5.97E-03
Clasico combinado
1.01 (0.47-2.17) 9.79E-01
Mesenquimal combinado
1.02 (0.54-1.94) 9.43E-01
Neural combinado
0.46 (0.22-1.01) 5.23E-02
Metodos y materiales usados Ratones
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee [Comite de Cuidado y Uso Institucional de Animales] del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. El modelo de raton Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/- (antecedentes de raza mixta) ha sido anteriormente descrito (vease E. Tchougounova y colaboradores, Oncogene 26, 6289 (2007)). Los ratones C57BL/6 de tipo silvestre (WT) y los ratones de 13-actina-GFP (C57BL/6) se adquirieron en Charles River Laboratories y en Jackson Laboratories, respectivamente, y tambien se criaron dentro de nuestra instalacion de animales.
Inyecciones intracraneales
La iniciacion de los tumores con RCAS-PDGF-B-HA en ratones adultos se ha descrito anteriormente (A. H. Shih y colaboradores, Cancer Res 64, 4783 (2004)). Dicho de una manera breve, los ratones se anestesiaron completamente con 10 miligramos/mililitro de quetamina/1 miligramos/mililitro de xilazina, y se inyectaron subcutaneamente con 50 microlitros del anestesico local de Bupivacafna al 0.25 % en el sitio quirurgico. Los ratones se inyectaron intracranealmente con 1 microlitro que contenfa 2 x 105 celulas DF-1:RCAS-PDGF-B- HA de entre 5 y 6 semanas de edad utilizando un aparato estereotactico fijo (Stoelting). Las inyecciones se hicieron en la corteza frontal derecha, aproximadamente 1.5 milfmetros lateral y 1 milfmetro caudal desde la bregma, y a una profundidad de 2 milfmetros.
Con el fin de investigar la expresion especffica del tipo de celulas de CSF-1 y CSF-1R en las poblaciones de celulas clasificadas mediante citometria de flujo, se iniciaron tumores en los ratones con RCAS-PDGF-B-HA- SV40- eGFP (RCAS-PDGF-GFP) como se describio anteriormente (E. I. Fomchenko y colaboradores, PloS ONE 6, e20605 (2011).). Las crfas Nestin-Tv-a;Ink4a/Arf-/- se inyectaron con 1 microlitro de celulas DF- 1:RCAS-PDGF-B-GFP en el dfa 2 post-natal, en la corteza izquierda entre el ojo y la oreja.
Inhibidor BLZ945 y tratamiento
El inhibidor de CSF-1R, BLZ945, se formulo en captisol al 20 % en una concentracion de 12.5 miligramos/mililitro. El control de vehfculo, captisol al 20 %, se proceso de la misma manera. Para los estudios de BLZ945, los ratones se dosificaron con 200 miligramos/kilogramo de BLZ945 o vehfculo (captisol
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al 20 %) mediante intubacion oral forzada una vez al dfa.
Con el fin de determinar si el farmaco era capaz de cruzar la barrera hematoencefalica, los ratones portadores de tumor se trataron con una sola dosis de BLZ945 y se sacrificaron en diferentes puntos del tiempo despues del tratamiento. El plasma, y los hemisferios izquierdo (contralateral) y derecho (portador de tumor) del cerebro se congelaron instantaneamente en nitrogeno lfquido para el subsiguiente analisis de las concentraciones de BLZ945 en el tejido. Para los estudios de sobrevivencia a largo plazo, la dosificacion se inicio a los 17 dfas/2.5 semanas despues de la inyeccion de RCAS-PDGF-B-HA. Para los estudios de punto del tiempo fijo, los ratones se sometieron a exploraciones de MRI a las 4-5 semanas despues de la inyeccion de RCAS-pDgF-B-HA, como se describio anteriormente (Transl Oncol 2, 89 (2009)).
Con el fin de determinar el volumen del tumor, las regiones de interes (ROI) se circunscribieron en imagenes ponderadas T2, y su area correspondiente en milfmetros cuadrados se multiplico por la altura de la rebanada de 0.7 milfmetros. El volumen total del tumor es la suma del volumen ROI en cada rebanada, y el volumen para la primera y ultima rebanadas en donde el tumor parece ir a la mitad para aproximarse al volumen de un trapezoide. Cuando el volumen del tumor estuvo en el intervalo de 4.5 a 40 milfmetros cubicos, los animales se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Una tercera cohorte de ratones con tumores mayores de 40 milfmetros cubicos, tambien se trato con BLZ945 (denotados como BLZ945 Grandes). No se incluyo una cohorte tratada con vehfculo del mismo tamano para esta cohorte que tenia la carga tumoral inicial mas grande, debido a que estos ratones no habrfan sido capaces de sobrevivir al punto final del estudio.
Sacrificio de ratones y cosecha de tejidos
Los ratones se sometieron a eutanasia en los puntos del tiempo definidos, como se describe en las leyendas de la figura, o cuando llegaron a ser sintomaticos por sus tumores, lo cual incluyo signos de mal emparejamiento, letargia, perdida de peso, jorobamiento, macrocefalea, o ataques.
Con el fin de aislar los tejidos para la congelacion instantanea en nitrogeno lfquido, los ratones se eutanizaron mediante asfixia con dioxido de carbono, o se anestesiaron completamente con avertina (2,2,2-tribromo- etanol, Sigma), y se dislocaron cervicalmente antes de la cosecha del tejido. Para la citometrfa de flujo, los ratones se anestesiaron completamente con avertina, y se perfundieron transcardialmente con 20 mililitros de PBS. Entonces se aislo el cerebro y el tumor se macrodisecciono a partir del tejido normal circundante. Para el analisis de proliferacion, los ratones se inyectaron intraperitonealmente con 100 miligramos/ gramo de bromo-desoxiuridina (BrdU; Sigma) 2 horas antes del sacrificio. Para aislar los tejidos para la histologfa congelada, los ratones se anestesiaron completamente con avertina, se perfundieron transcardialmente con 10 mililitros de PBS, seguido por 10 mililitros de para-formaldehfdo al 4 % en PBS (PFA). El cerebro se fijo posteriormente en PFA durante la noche a 4°C, mientras que los otros tejidos se crioconservaron en sacarosa al 30 % a 4°C. Despues de la fijacion posterior, el cerebro se transfirio entonces a sacarosa al 30 %, y se incubo a 4°C hasta que el cerebro se equilibro completamente y se sumergio hasta el fondo del tubo (tfpicamente de 2 a 3 dfas). Entonces todos los tejidos se empotraron en OCT (Tissue-Tek), y se utilizaron secciones de tejido criostaticas de 10 micras para todos los analisis subsiguientes.
Histologfa, inmunohistoqufmica, y analisis:
Para la calificacion de la malignidad del tumor, se llevo a cabo el tenido con hematoxilina y eosina (H&E), y los tejidos fueron calificados ciegamente por un neuropatologo independiente.
Para la inmunofluorescencia, se descongelaron las secciones congeladas de 10 micras de grosor, y se secaron a temperatura ambiente, y luego se lavaron en PBS. Para el protocolo de tenido estandar, las secciones de tejido se bloquearon en PNB al 0.5 % en PBS durante cuando menos 1 hora a temperatura ambiente, o durante toda la noche a 4°C, seguido por incubacion en el anticuerpo primario en PNB al 0.25 % durante 2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. La informacion del anticuerpo primario y las diluciones se enlistan en la Tabla 6. Luego las secciones se lavaron en PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con fluoroforo apropiado (Molecular Probes) en una dilucion de 1:500 en PNB al 0.25 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues de lavar en PBS, las secciones de tejido se contra-tineron con DAPI (5 miligramos/mililitro del suministro diluido a 1:5,000 en PBS) durante 5 minutos antes de montarse con el medio de montaje ProLong Gold Antifade (Invitrogen).
Para el analisis de angiogenesis y proliferacion, las secciones de tejido se sometieron primero a la recuperacion del antfgeno basada en el regulador de citrato sumergiendo en una solucion desenmascarante de antfgeno (0.94 % en volumen/volumen en agua destilada; Vector Laboratories), y pasando por microondas durante 10 minutos a la mitad de la potencia, seguido por enfriamiento hasta la temperatura ambiente durante cuando menos 30 minutos. Para el analisis de angiogenesis, los tejidos se lavaron luego en PBS, y se bloquearon con reactivo bloqueador de Ig de raton (Vector Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el analisis de proliferacion, despues de la recuperacion del antfgeno, las secciones de tejido se incubaron con HCl 2M durante 15 minutos a temperatura
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ambiente para desnaturalizar el ADN, y entonces en regulador de borato de sodio 0.1 neutralizante (pH de 8.5) durante 5 minutos. Despues de los lavados con PBS, se llevo a cabo el resto del tenido de acuerdo con el protocolo convencional.
Para el tenido para el analisis de fagocitosis, se descongelaron las secciones congeladas de 10 micras de grosor, y se secaron a temperatura ambiente, y luego se lavaron en PBS. Las secciones de tejido se bloquearon en PNB al 0.5 % en PBS durante cuando menos 1 hora a temperatura ambiente, seguido por incubacion en el anticuerpo primario anti-caspasa-3 disociada de conejo diluido a 1:500 en PNB al 0.5 % durante la noche a 4°C. Al dfa siguiente, las rebanadas se lavaron 6 veces durante 5 minutos en PBS antes de la incubacion con el anticuerpo secundario Alexa568 de cabra anti-conejo (1:500 en PNB al 0.5 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se lavaron entonces 6 veces durante 5 minutos en PBS y se bloquearon durante la noche a 4°C en un nuevo regulador de suero de burro al 5 %, albumina de suero bovino al 3 %, y PNB al 0.5 % en PBS. Al dfa siguiente, las rebanadas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con el siguiente conjunto de anticuerpos primarios: anti-Olig2 de conejo (1:200), y anti- CD11b de rata (1:200) diluidos en suero de burro al 5 %, albumina de suero bovino al 3 %, y PNB al 0.5 % en PBS. Las rebanadas se lavaron 6 veces durante 5 minutos en suero regulado con fosfato antes de la incubacion con los anticuerpos secundarios de burro anti-conejo Alexa647 (1:500), y de burro anti-rata Alexa488 (1:500) en PNB al 0.5 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se lavaron entonces 4 veces durante 5 minutos en PBS antes de tenirse con DAPI (5 miligramos/ mililitro del suministro diluido a 1:5,000 en PBS) durante 5 minutos, se lavaron dos veces mas en PBS durante 5 minutos, y se montaron con el medio de montaje ProLong Gold Antifade (Invitrogen). Tambien se llevo a cabo un co-tenido para CSF-1R (primer anticuerpo primario), e Iba1 (segundo anticuerpo primario) en serie de la misma manera, con la adicion de la recuperacion del antfgeno basada en el regulador de citrato al principio.
Las secciones de tejido se visualizaron bajo un microscopio Carl Zeiss Axioimager Z1 equipado con un Apotome. El analisis de tenido de inmunofluorescencia, numero de celulas, proliferacion, apoptosis, y estudios de co-localizacion se llevaron a cabo utilizando el software de analisis TissueQuest (TissueGnostics) como se describio anteriormente (Journal Immunol Methods 237, 39 (2000)).
Se generaron vistas de secciones de tejido de los gliomas tenidos para el analisis de angiogenesis mediante el software de adquisicion TissueGnostics, cosiendo entre si imagenes 200x individuales. Todos los parametros de la angiogenesis se cuantificaron utilizando MetaMorph (Molecular Devices), como se describio anteriormente (V. Gocheva y colaboradores, Biol Chem 391, 937 (2010)).
Para el analisis de fagocitosis, se adquirieron 15 campos de vision aleatoriamente seleccionados de adentro del tumor utilizando el objetivo de inmersion en aceite 63x (amplificacion total 630x), y el Apotome para asegurar que las celulas estuvieran en la misma seccion optica. Las celulas positivas se contaron manualmente utilizando el Volocity (PerkinElmer), y se discriminaron mediante la presencia de un nucleo DAPI+. Las celulas apoptoticas se contaron como aquellas que tenfan el tenido de caspasa-3 citoplasmica disociada (CC3)+ y los nucleos condensados. Se consideraba que una celula habfa sido tragada por un macrofago cuando estaba rodeada por un anillo de CD11b+ contiguo que encerrara cuando menos a dos tercios del borde de la celula. Los numeros de ratones analizados se especifican en las leyendas de la figura.
Aislamiento de protefna y Western blot
Los ratones se trataron con BLZ945 o con vehfculo, y se sacrificaron 1 hora despues de la dosis final, y se cosecharon los tumores. Las muestras se fraccionaron bioqufmicamente como se describe anteriormente. Las fracciones de membrana sinaptosomal se lisaron en regulador de lisis NP-40 (NP-40 al 0.5 %, Tris-HCl 50 mM [pH de 7.5], NaCl 50 mM, coctel inhibidor de proteasa Mini completo 1x (Roche), coctel inhibidor de fosfatasa PhosSTOP 1x (Roche)), y la protefna se cuantifico utilizando el ensayo BCA (Pierce). Los lisados de protefna se cargaron (90 micro-gramos/pista) sobre geles de SDS-PAGE, y se transfirieron a las membranas de PVDF para la inmunotransferencia.
Las membranas se sondearon con anticuerpos contra fosfo-CSF-1R Y721 (1:1000; Cell Signaling Technology), CSF-1R (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), o GAPDH (1:1000; Cell Signaling Technology), y se detectaron utilizando anticuerpos anti-conejo conjugados con HRP (Jackson Immunoresearch), utilizando deteccion de quimiluminiscencia (Millipore). Las bandas de los Western blots se cuantificaron en el intervalo dinamico utilizando el modulo de analisis de gel en el software ImageJ.
Los macrofagos primarios derivados de medula osea (BMDMs) se cultivaron en ausencia de CSF-1 durante 12 horas antes de la estimulacion con CSF-1 (10 nanogramos/mililitro) para los puntos del tiempo indicados en la Figura S2, en la presencia o en ausencia de BLZ945 67 nM. Los lisados de protefna entera se aislaron con regulador de lisis NP40 y se detectaron mediante Western blot como se describe anteriormente.
Preparacion de suspensiones celulares individuales y citometrfa de flujo
Para la investigacion de las poblaciones de macrofagos de cerebro mediante analisis de citometrfa de flujo o clasificacion, el tumor se digirio hasta una sola suspension celular mediante su incubacion con 5 mililitros de
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solucion de digestion de papafna (0.94 miligramos/mililitro de papafna [Worthington], EDTA 0.48 mM, 0.18 miligramos/mililitro de NAcety-L-cistefna [Sigma], 0.06 miligramos/ mililitro de ADNsa I [Sigma], se diluyo en Solucion de Sal Balanceada de Earl, y se le permitio activarse a temperatura ambiente durante cuando menos 30 minutos). En seguida de la digestion, la enzima se inactivo mediante la adicion de 2 mililitros de 0.71 miligramos/mililitro de ovomucoide (Worthington). La suspension celular se paso entonces a traves de una malla de 40 micras para remover el tejido no digerido, se lavo con regulador FACS (albumina de suero bovino (BSA) libre de IgG al 1 % en PBS [Jackson Immunoresearch]), y se centrifugo a una baja velocidad de 750 revoluciones por minuto (Sorvall Legend RT), para remover los desechos y obtener el aglomerado celular. Debido a que muchos epftopos de celulas inmunitarias son sensibles a la papafna, para la investigacion de la infiltracion de celulas inmunitarias mediante el analisis de citometrfa de flujo, los tumores se digirieron hasta una sola suspension celular mediante su incubacion durante 10 minutos a 37°C con 5 mililitros de 1.5 miligramos/mililitro de colagenasa III (Worthington), y 0.06 miligramos/mililitro de ADNsa I en Solucion de Sal Balanceada de Hanks 1x (HBSS) con calcio y magnesio.
La suspension celular se lavo entonces con PBS y se paso a traves de una malla de 40 micras para remover el tejido no digerido. Para remover el desecho de mielina, el aglomerado celular se volvio a suspender en 15 mililitros de Percoll al 25 % a temperatura ambiente, preparado a partir del suministro isotonico de Percoll (90 % de Percoll [Sigma], 10 % de HBSS 10x), y entonces se centrifugo durante 15 minutos a 1,500 revoluciones por minuto (rpm) (Sorvall Legend RT) con acelerador y freno ajustados en 1. El aglomerado celular se lavo entonces con HBSS 1x antes de volverse a suspender en el regulador FACS. Despues del recuento, las celulas se incubaron con 1 microlitro de Fc Block por cada millon de celulas durante cuando menos 15 minutos a 4°C. Las celulas entonces se tineron con los anticuerpos apropiados durante 10 minutos a 4°C, se lavaron con regulador FACS, y se volvieron a suspender en el regulador FACS que contenfa DAPI (5 miligramos/mililitro diluidos a 1:5000) para la exclusion de celulas vivas/muertas. Los anticuerpos utilizados para la citometrfa de flujo se enlistan en la Tabla 6.
Tabla 6. Lista de anticuerpos y fuentes.
Anticuerpo
Clon Vendedor Fluoroforos Dilucion
CD45
30-F11 BD Pharmingen FITC, APC, PE- Cy7 1:100-1:200
CD3e
145-2C11 BD Pharmingen PE-Cy7 1:250
Gr-1
RB6-8C5 BD Pharmingen FITC 1:200
CD4
GK1.5 BD Pharmingen PE 1:1000
CD11b
M1/70 BD Pharmingen A488, APC, PE 1:200
Ly6G
1A8 BD Pharmingen PE-Cy7 1:2000
F4/80
Cl:A3-1 Serotec PE 1:50
CD8a
53-6.7 Biolegend A488 1:1000
CD19
6D5 Biolegend PE 1:2000
Anticuerpo
Clon Vendedor Fluoroforos Dilucion
NK1.1
PK136 Biolegend APC 1:1000
CD206
MR5D3 Biolegend A488 1:50
Para el analisis, las muestras se ejecutaron en un BD LSR II (Becton Dickstein), y toda la compensacion y compuerta subsiguientes se llevaron a cabo en el software de analisis FlowJo (TreeStar). Para la clasificacion, las muestras se ejecutaron en un clasificador de celulas BD FACSAria (Becton Dickstein), y las celulas se 5 recolectaron en el regulador FACS. Las celulas entonces se centrifugaron y se volvieron a suspender en 500 microlitros de Trizol (Invitrogen) antes de la congelacion instantanea en nitrogeno lfquido y del almacenamiento a -80°C.
Derivacion de cultivos de glioma primario de raton, neuroesferas y lfneas celulares de glioma
Los tumores macrodiseccionados se digirieron hasta una sola suspension celular mediante incubacion 10 durante 8 a 12 minutos a 37°C como se describe anteriormente. La suspension celular se lavo con el Medio Basal Neural Stem Cell (NSC) (Stem Cell Technologies), y se centrifugo a baja velocidad (750 revoluciones por minuto (rpm), Sorvall Legend RT), para remover los desechos. Con el fin de derivar los cultivos de glioma primario de raton, el aglomerado celular se volvio a suspender en DMEM que contenfa suero bovino fetal al 10 % (Gibco). Estos cultivos primarios se utilizaron en el primer paso (P2-P3), y contenfan una mezcla de tipos 15 diferentes de celulas encontradas en los gliomas, incluyendo celulas tumorales, macrofagos, y astrocitos, como se determinaron mediante el tenido de inmunofluorescencia. Los cultivos de glioma primario se hicieron crecer durante 24 horas sobre portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina (BD Biocoat). Las celulas se fijaron entonces con PFA al 4 % en regulador de fosfato 0.1 M durante la noche a 4°C, se permeabilizaron con Triton-X al 0.1 % durante 5 minutos, y se bloquearon con PNB al 0.5 % durante cuando menos una hora. La 20 presencia de macrofagos, celulas tumorales y astrocitos se examino mediante tenido inmunofluorescente de CD11b (1:200), Nestin (1:500), y GFAP (1:1000), respectivamente, (Tabla 7).
Tabla 7. Lista de anticuerpos utilizados para el tenido.
Anticuerpo
Clon Vendedor Dilucion
CD31 de cabra anti-raton
— R&D Systems 1:100
Actina de musculo liso de raton anti- humano
1A4 DakoCytomation 1:100
Conejo anti-caspasa disociada 3 (Asp175) (CC3)
--- Cell Signaling Technology 1:500
CSF-1R de conejo anti-humano
C-20 Santa Cruz 1:200
Conejo anti-Iba1
--- Wako 1:1000
Conejo anti-protefna fluorescente verde (GFP)
--- Molecular Probes 1:200
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Anticuerpo
Clon Vendedor Dilucion
Conejo anti-Olig2
— Millipore/Chemicon 1:200
Nestina de raton anti-rata
— BD Pharmingen 1:500
CD11b de rata anti-raton
M1/70 BD Pharmingen 1:200
Rata anti-BrdU
BU1/75 (ICR1) Serotec 1:200
CD68 de rata anti-raton
FA-11 Serotec 1:1000
Pollo anti-GFAP
--- Abcam 1:1000
Para la formacion de neuroesferas, el aglomerado celular se volvio a suspender en un medio de neuroesferas consistente en Medio Basal NSC de raton, suplementos de proliferacion de NSC, 10 nanogramos/mililitro de EGF, 20 nanogramos/mililitro de FGF basico, y 1 miligramo/mililitro de Heparina (Stem Cell Technologies). Se agrego medio fresco cada 72 horas durante 2 semanas. Las neuroesferas primarias se recolectaron, se desaglomeraron mecanicamente hasta una sola suspension celular, y se propagaron pasandolas en serie. Para generar las lfneas celulares de glioma, las neuroesferas secundarias se disociaron hasta suspensiones celulares individuales, y se cultivaron en DMEM+ con suero fetal de becerro (FBS) al 10 % como una monocapa. Se derivaron multiples lfneas celulares de glioma a partir de ratones independientes, denotadas como GBM1-4 en la presente. Las celulas de glioma se infectaron con una construccion de pBabe-H2B- mCherry como se describe anteriormente (O. Florey y colaboradores, Nat Cell Biol 13, 1335 (2011)).
Aislamiento de macrofagos derivados de medula osea (BMDMs)
Para el aislamiento de medula osea, seguido por la derivacion de macrofagos, C57BL/6 WT, C57BL/6 U- actina-GFP o Nestin-Tv-a; los ratones Ink4a/Arf-/- se anestesiaron con Avertin (Sigma), y entonces se sacrificaron por medio de dislocacion cervical. Los femures y las tibias se cosecharon bajo condiciones esteriles a partir de ambas piernas y se inundaron. La medula se paso a traves de un cernidor de 40 micras, y se cultivo en bolsas de Teflon® de 30 mililitros (PermaLife PL-30) con 10 nanogramos/mililitro de CSF-1 de raton recombinante (R&D Systems). Las celulas de medula osea se cultivaron en bolsas de Teflon® durante 7 dfas, con medio que contenfa CSF-1 fresco, reemplazando el medio viejo cada tercer dfa, con el objeto de inducir la diferenciacion de los macrofagos.
Se adquirieron lfneas celulares adicionales de glioma U-87 MG (HTB-14) y lfneas celulares de microglia CRL- 2467 en ATCC. La lfnea celular U-87 MG se cultivo en DMEM+ suero bovino fetal (FBS) al 10 %. La lfnea celular CRL-2467 se cultivo en DMEM+ suero bovino fetal (FBS) al 10 % con 30 nanogramos/mililitro de CSF- 1 de raton recombinante.
Experimentos del medio acondicionado con celulas de glioma (GCM). El medio que se habfa acondicionado mediante las lfneas celulares tumorales de glioma en el medio sin suero durante 24 horas, se paso a traves de filtros de 0.22 micras para remover el desecho celular, y es referido en la presente como el medio acondicionado con celulas de glioma (GCM). El medio acondicionado con celulas de glioma (GCM) se utilizo para estimular los macrofagos derivados de medula osea (BMDMs) C57BL/6 WT o U-actina-GFP+ diferenciados. Los macrofagos de control recibieron el medio fresco que contenfa suero bovino fetal (FBS) al 10 % y 10 nanogramos/mililitro de CSF-1 de raton recombinante. Cuando fue indicado, los macrofagos derivados de medula osea (BMDMs) diferenciados se cultivaron en el medio acondicionado con celulas de glioma (GCM) que contenfa cualquiera de DMSO como el vehfculo, o bien BLZ945 67 nM, BLZ945 670 nM, o en el medio regular que contenfa 10 nanogramos/mililitro de CSF-1 de raton recombinante, y 10 nanogramos/mililitro de lL-4 (R&D Systems) durante 24 horas o 48 horas antes del analisis experimental.
Analisis de expresion de Mrc1/CD206 mediante citometrfa de flujo
Para los cultivos de glioma primario raton (que contenfan una poblacion mixta de celulas tumorales, los TAM, los astrocitos etc.), se cultivaron 1 x 106 celulas en DMEM + fBs al 10 % en la presencia de BLZ945 o DMSO como el vehfculo. Para los macrofagos derivados de medula osea (BMDMs), se cultivaron 1 x 106 celulas en DMEM complementado con CSF-1 de raton recombinante o medio acondicionado con celulas de glioma 5 (GCM) en la presencia de BLZ945 o DMSO como el vehfculo. Despues de 48 horas, las celulas se rasparon y se lavaron con regulador FACS. Las celulas se contaron y se incubaron con 1 microlitro de Fc Block (BD Pharmingen) por 106 celulas durante cuando menos 15 minutos a 4°C. Las celulas entonces se tineron con anticuerpos CD45 y CD11b durante 10 minutos a 4°C, y se lavaron con regulador FACS. Las celulas se fijaron y se permeabilizaron utilizando el kit BD Cytofix/CytopermMR (BD Biosciences) de acuerdo con las 10 instrucciones del fabricante. Subsiguientemente, las celulas se tineron con anticuerpo anti-CD206. Para el analisis, las muestras se ejecutaron en un BD LSR II (Becton Dickstein), y se llevo a cabo toda la compensacion y compuerta subsiguiente con el software de analisis FlowJo (TreeStar).
Analisis del ciclo celular:
Los macrofagos de control o previamente estimulados con el medio acondicionado con celulas de glioma 15 (GCM) derivados a partir de ratones IJ-actina-GFP+ se co-cultivaron en una proporcion de 1:1 con 1 x 105 celulas de glioma positivas para mCherry agotadas de suero (a partir de las lfneas celulares derivadas anteriormente) durante 48 horas en la presencia de BLZ945 670 nM o DMSO como el vehfculo. En seguida de la recoleccion de las celulas co-cultivadas tripsinizadas, los pozos se enjuagaron en medio adicional, y este volumen se recolecto para asegurar la cosecha de todos los macrofagos, los cuales se adhirieron 20 estrechamente a los platos de cultivo celular. Las muestras se lavaron entonces una vez con regulador FACS, seguido por incubacion durante 10 minutos a temperatura ambiente en el regulador de permeabilizacion (PIPES 10 mM, NaCl 0.1 M, MgCh 2 mM, Triton X-100 al 0.1 %, pH de 6.8) que contenfa 0.1 miligramos de DAPI (Invitrogen). Despues de la adquisicion en un citometro de flujo LSR II (BD), utilizando un dispositivo de laser UV (de 350 a 360 nanometros), se analizo el estado del ciclo cellar de las celulas tumorales de glioma 25 utilizando el programa Flow Jo Dean-Jett-Fox para el analisis del ciclo celular.
Ensayos de proliferacion
La velocidad del crecimiento celular se determino utilizando el kit de proliferacion celular MTT (Roche). Dicho de una manera breve, las celulas se emplacaron por triplicado en placas de 96 pozos (1 x 103 celulas/pozo para las lfneas celulares de glioma y 5 x 103 celulas/pozo para las celulas de macrofagos derivados de 30 medula osea (BMDMs) y CRL-2467), en la presencia o en ausencia de 6.7 a 6700 nM de BLZ945. El medio se cambio cada 48 horas. Las celulas de macrofagos derivados de medula osea (BMDMs) y CRL-2467 se complementaron con 10 nanogramos/mililitro y 30 nanogramos/ mililitro de CSF-1 de raton recombinante, respectivamente, a menos que se indique de otra manera. Se agregaron 10 microlitros de reactivo marcador MTT a cada pozo, y entonces se incubaron durante 4 horas a 37°C, seguido por la adicion de 100 microlitros 35 de reactivo de solubilizacion MTT durante la noche. La mezcla se volvio a suspender suavemente, y se midio la absorbencia a 595 nanometros y a 750 nanometros en un lector de placas SpectraMax 340pc (Molecular Devices).
Ensayo de formacion de neuroesferas secundarias
Las neuroesferas primarias se desaglomeraron hasta una sola suspension celular y se emplacaron 5 x 103 40 celulas en una placa de 6 pozos en el medio de neuroesferas, en la presencia de BLZ945 o DMSO como el vehfculo. El medio se cambio cada 48 horas. La formacion de neuroesferas secundarias se ensayo contando el numero de neuroesferas obtenidas despues de 2 semanas.
Aislamiento de ARN, sfntesis de ADNc, y PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN se aislo con Trizol, se trato con ADNsa, y se utilizaron 0.5 microgramos de ARN para la sfntesis del 45 ADNc. Se utilizaron sondas Taqman (Applied Biosystems) para Cd11b (Mm0043 4455_m1), Cd68 (Mm03047343_m1), Csf-1 (Mm00432688_m1), Csf-1r (Mm00432689_m1), Il34 (Mm00712774_m1), Mrc1 (Mm004851 48_m1), y Tv-a (a la medida), para la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Los ensayos se ejecutaron por triplicado, y la expresion se normalizo con ubiquitina C (Mm012012 37_m1) para cada muestra.
50 Microarreglos y perfilacion de expresion genetica
Todas las muestras se prepararon y se procesaron mediante la instalacion del nucleo genomico en MSKCC. El ARN se aislo utilizando Trizol, y la calidad se evaluo ejecutandose en un Bioanalizador Agilent. 75 nanogramos del ARN total se transcribieron inversamente y se marcaron utilizando el Kit de Expresion Genechip 3' IVT (Affymetrix). El ARNc resultante se hibrido en los chips Affymetrix MOE 430A 2.0. Los datos 55 de expresion brutos se analizaron utilizando GCOS 1.4 (Affymetrix). Los datos se normalizaron a una intensidad objetivo de 500 para tomar en cuenta las diferencias en la intensidad global del chip.
Analisis de microarreglos:
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Todos los analisis bioinformaticos se realizaron en R utilizando la Suite de paquetes Bioconductor. Se generaron los valores de expresion Promedio de Multi-Arreglo Robusto (RMA) utilizando el paquete 'affy', y se utilizo el cuantil normalizado (R. A. Irizarry y colaboradores, Nucleic Acids Res 31, e15 (2003); L. Gautier y colaboradores, Bioinformatics 20, 307 (2004). El paquete “lima” (G. K. Smyth, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, Artfculo 3 (2004)), para identificar los genes diferencialmente expresados entre las muestras tratadas con vehfculo y con BLZ945. La expresion diferencial se considero significativa en un valor de veces de cambio de +/-2 con un fndice de descubrimiento falso del 10 %. Se utilizo el analisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) como se describio anteriormente (15). Para el siguiente analisis y la comparacion con los conjuntos de datos humanos, los valores de expresion de raton se centraron en la media a traves de todas las muestras.
Metodo de regresion de Lasso para la identificacion de la firma genetica
Los datos de expresion de raton se normalizaron y se centraron en la media como se describe anteriormente. Se utilizaron los genes diferencialmente expresados para el analisis adicional. Se introdujo un modelo de regresion de Lasso para diferenciar entre las muestras tratadas con vehfculo y con BLZ945, utilizando el paquete 'glmnet' (J. Friedman y colaboradores, Journal of Statistical Software 33, 1 (2010)). El parametro de regularizacion para la regresion de Lasso se selecciono mediante validacion cruzada 4 veces.
Conjuntos de datos de pacientes
Los datos de expresion del TCGA se descargaron desde el portal de datos del TCGA, y todos los datos clfnicos se descargaron desde el portal de datos <
http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/ tcgaHome2.jsp>. Los datos clfnicos y de expresion para el conjunto de datos Rembrandt se descargaron desde <
https://caintegrator. nci.nih.gov/rembrandt/>. Los conjuntos de datos Freije (GSE4412), Murat (GSE7696), y Phillips (GSE4271) se descargaron a partir del NCBI <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/>. Para los conjuntos de datos Freije, solamente se consideraron las muestras que se ejecutaron en la plataforma HGU133A, debido a que las muestras de la plataforma HGU133B contenfan un traslape minimo con los conjuntos de datos restantes. Cada conjunto de datos se importo por separado utilizando el paquete 'Affy', y se generaron los valores de expresion de RMA. Todos los conjuntos de datos fueron de cuantil normalizado, y cada gen se centro en la media a traves de todos los pacientes.
Subtipificacion de pacientes no del TCGA
Con el fin de investigar las diferencias de sobrevivencia especffica de los subtipos en todos los conjuntos de datos publicamente disponibles, se utilizo un clasificador de subtipos descrito anteriormente (R. G. Verhaak y colaboradores, Cancer Cell 17, 98 (2010)) para introducir una maquina de vector de soporte (SVM). Se utilizaron los 840 genes utilizados por Verhaak y colaboradores para el analisis ClacNc para subclasificar el conjunto de datos. Subsiguientemente, los conjuntos de datos se subclasificaron para los genes que estaban presentes a traves de todos los conjuntos de datos de los pacientes descritos anteriormente. Los 776 genes restantes se utilizaron para introducir una SVM de multiples clases sobre las muestras de nucleos a partir del conjunto de datos del TCGA. La SVM se completo utilizando una funcion kernel de base radial Gaussiana utilizando el paquete 'kernlab' (A. Karatzoglou y colaboradores, J. Statistical Software, 11, 9 (2004)). Entonces esta SVM se utilizo para predecir el subtipo del resto de los pacientes del TCGA y conjuntos de datos publicos.
Clasificacion de pacientes
Se introdujo una SVM en los datos de expresion de raton con el fin de clasificar a los pacientes en la clasificacion de “Vehfculo” o en la clasificacion de “BLZ945”. Los datos de expresion de pacientes se subclasificaron para los genes comunes a traves de todos los conjuntos de datos y los genes que tienen homologos de raton conocidos. De una manera similar, los datos de expresion de raton se subclasificaron para los genes con homologos humanos que eran comunes a traves de todas las muestras de pacientes. Subsiguientemente, los datos de raton se subclasificaron para los genes diferencialmente expresados identificados utilizando el paquete 'limma'. Los datos humanos se subclasificaron para los homologos humanos de estos genes diferencialmente expresados. Esto condujo a una reduccion de caracterfsticas desde 257 genes diferencialmente expresados hasta 206 genes diferencialmente expresados con los homologos humanos conocidos a traves de todos los conjuntos de datos de pacientes. Entonces se utilizo el paquete 'kernlab' para introducir una SVM en los datos de expresion de raton utilizando una funcion kernel de vainilla. Entonces se utilizo esta SVM para predecir a los pacientes para ya sea el clasificador de “Vehfculo” o bien el clasificador de “BLZ945”.
Se empleo un planteamiento similar con el fin de clasificar a los pacientes con un modelo de regresion de Lasso. La subclasificacion de los datos de pacientes y de raton fue identica a aquella descrita anteriormente. En lugar de utilizar el paquete 'kernlab', el modelo de regresion de Lasso se introdujo utilizando el paquete 'glmnet'. Este modelo se utilizo entonces para predecir la clasificacion de pacientes ya sea en el clasificador de “Vehfculo” o bien en el clasificador de “BLZ945”. El estado de paciente G-CIMP se determino mediante la
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agrupacion jerarquica de los datos de metilacion de los pacientes (H. Noushmehr y colaboradores, Cancer Cell 17, 510 (2010)) como se describe a continuacion.
Estratificacion de los pacientes por estado de G-CIMP
Experimentalmente, parece ser que la ventaja de sobrevivencia ofrecida por la firma de tratamiento con “BLZ945” no se debio a un enriquecimiento de los pacientes con el Fenotipo Metilador de Isla CpG de Glioma (GCIMP), los cuales han demostrado anteriormente que estan asociados con una mayor sobrevivencia global (Noushmehr). De los 453 glioblastomas multiformes (GBMs) analizados a partir del conjunto de datos del TCGA, 263 tambien tuvieron datos de metilacion genomica, y se clasificaron en los grupos de metilacion como se describe anteriormente. De los 21 pacientes con el G-ClMP, 20 (95 %) se clasificaron en la clasificacion de “BLZ945”, lo cual muestra un fuerte enriquecimiento de las muestras de BLZ945 en los pacientes con el G- CIMP. A pesar de este enriquecimiento, el analisis de sobrevivencia de los pacientes pro-neurales que se sabfa que eran negativos para GCIMP (67/133 en total de pacientes pro-neurales) revelo que el grupo de la clasificacion de “BLZ945” mostro un aumento en la sobrevivencia de aproximadamente 10.8 meses (P = 0.014).
Mas aun, los modelos de riesgo proporcional cox demostraron que el aumento en la sobrevivencia mostrado por la clasificacion de “BLZ945” no era dependiente de los pacientes con el G-CIMP. La proporcion de riesgo asociada con la firma de BLZ945 fue significativa en los pacientes con y sin G-CIMP. Tambien, la proporcion de riesgo para el estrato de G-CIMP no fue significativa cuando la firma de BLZ945 tambien se consideraba en un modelo mixto. Por consiguiente, aunque los pacientes con el G-CIMP se enriquecen claramente para las muestras de clasificacion “BLZ945” simulada, el beneficio de sobrevivencia ofrecido por esta clasificacion no es dependiente del estado del G-CIMP.
Analisis de sobrevivencia:
El analisis de sobrevivencia se realizo utilizando el paquete de 'sobrevivencia' en R (T. Therneau, en el paquete R version 2.36-12. (2012)). Las proporciones de riesgo se determinaron utilizando la funcion 'coxph' del paquete de 'sobrevivencia'. Los pacientes se estratificaron basandose en la probabilidad del modelo de clasificacion de regresion de Lasso, el estado de G-CIMP, o ambos, como se indica. Los valores P se generaron utilizando la prueba de Wald.
Graficas para analisis de pacientes
Todas las curvas de sobrevivencia de Kaplan-Meier, los mapas de calor, y las graficas de volcan se generaron en R version 2.14.1 utilizando el paquete 'gplots' (G. R. Warnes y colaboradores, paquete R version 2.10.1, (2011)). Las graficas forestales de proporcion de riesgo se generaron en GraphPad Prism Pro5.
Presentacion de datos y analisis estadfstico
Los datos se presentan como promedios con su respectivo error estandar (SEM) o como graficas de dispersion estadfstica utilizando GraphPad Prism Pro5. Los datos numericos se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas no emparejadas, a menos que se observe de otra manera. Para las curvas de sobrevivencia, los valores P se obtuvieron utilizando la prueba Log Rank (Mantel-Cox), y se utilizo la prueba exacta de Fisher para la calificacion histologica del tumor. P = 0.05 se considero como estadfsticamente significativo.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de Formula (I):
    imagen1
    en donde R1 es
    o
    imagen2
    5
    en donde R' es Me o Et; y R2 es
    imagen3
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,
    10 para uso en el tratamiento de un tumor de cerebro en un sujeto mamffero.
  2. 2. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto de Formula (I) es:
    imagen4
  3. 3. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con la 15 reivindicacion 1, en donde el compuesto de Formula (I) es:
    imagen5
  4. 4. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tumor de cerebro es un glioma.
  5. 5. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con la 5 reivindicacion 4, en donde el glioma es glioblastoma multiforme.
  6. 6. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el tumor de cerebro es una metastasis de cerebro, astrocitoma (incluyendo glioblastoma), oligodendroglioma, ependimomas, o un glioma mixto.
  7. 7. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con cualquiera de 10 las reivindicaciones precedentes, cuando el compuesto se formula para su uso con un agente coterapeutico
  8. 8. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el agente coterapeutico se selecciona de un agente anti-angiogenico, bevacizumab con o sin irinotecano, nitrosoureas tales como Carmustina (BCNU), platinas, tales como cis-platino (cisplatina), agentes alquilantes, tales como temozolomida, inhibidores de cinasa de tirosina (gefitinib o
    15 erlotinib), Ucrafna, y canabinoides.
ES12720761.1T 2011-05-05 2012-05-04 Inhibidores de CSF-1R para el tratamiento de tumores de cerebro Active ES2622527T3 (es)

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