TW201912780A - 具有纖維化抑制作用之細胞層片 - Google Patents

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Abstract

提供骨髓單核細胞所組成之細胞層片中為了提高纖維化抑制作用之細胞層片及其製造方法。 一種細胞層片，其係由骨髓單核細胞所組成之細胞層片，該細胞層片係由骨髓單核細胞懸濁液將骨髓單核細胞層片化，使其縮小後，懸浮培養而成。

Description

具有纖維化抑制作用之細胞層片
本發明係關於用於再生醫療之細胞層片。具體而言，本發明係關於提高纖維化抑制活性之細胞層片。
「再生醫療」，係利用培養等增加的細胞，將不僅是機能且身體的構造恢復到原本的狀態，抑或盡可能恢復到與之接近的狀態之治療化為可能。對於為了增加細胞，有注射該細胞的方法。然而，在所定的組織中，為了使細胞持有的修復功能工作，有必要使移植的細胞一體化為組織使其固定。
細胞層片，係培養患者的組織或從確立的細胞株中採取的細胞，並作成層片狀。培養後增加的一定量之細胞分別結合形成單層的層片。細胞層片的下部由細胞外基質等之黏著蛋白質維持，因此不需進行外科上的縫合細胞層片即可植入移植組織。植入的細胞層片放出液性因子促進再生治癒。目前為止已實施角膜、心臟、食道等的人體移植、再生醫療，其被期待在今後應用範圍逐漸地擴大。
本案發明者，揭露使用有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物，使間葉系幹細胞及由患者骨髓而來之間葉系幹細胞分化成具有肝機能的細胞，將該分化之細胞層片化，重疊該層片複數片，對老鼠抑制了肝臟障礙。(專利文 獻1)
作為肝臟障礙的一症狀，可列舉組織的纖維化。肝臟一旦進入纖維化，會成為肝硬化、肝癌。此外，纖維化也會在肺、腎臟、心臟、皮膚等產生。根據非專利文獻1，記載關於纖維化治療之，吡非尼酮的臨床試驗之結果。
【先前技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】WO2012/141038 A1
【非專利文獻】
【非專利文獻1】Nobel et al.，Lancet.May 21；377(9779)：1760-9
關於纖維化治療的研究成果正在漸漸地進行，另一方面對纖維化的治療有效的治療藥物仍然很少，且藉由上述之化合物治療，會有根據患者的不同副作用會成為問題。因此，僅以往的纖維化抑制劑不足夠，必須確立不會成為副作用問題的再生醫療之治療法，特別係用細胞層片之治療法。
根據發明者前述之細胞層片係為了在人體中得到所定的治療效果，推斷將在直徑15公分的培養皿中培養而得的細胞層片重疊2片或3片者，適用於複數地方係必要的。
此外，上述文獻使用從間葉系幹細胞分化的肝細胞。分化之細胞層片中難以在全部的試樣中嚴密的管理、把握分化細胞數，因此如上述之將細胞層片作為製品之管理係需要勞力的。
如上述之情況，在再生醫療中，在目標檢體上的成本有增加的傾向，此事為再生醫療等製品的實現及普及的絆腳石。
本申請案發明者，為了解決上述課題而深入研究之結果，發現由骨髓單核球細胞而成之細胞層片中可使纖維化抑制作用提高之手段。
該方法為，將骨髓單核球細胞以有Wnt/β-連環蛋白抑制效果的化合物處理的情形下亦顯現出同樣的傾向，此情形下進一步發現纖維化抑制效果變強固，達成本案發明。
亦即，根據本發明的一態樣：提供一種細胞層片，其係由骨髓單核細胞所成之細胞層片，該細胞層片係由骨髓單核細胞的懸濁液將骨髓單核細胞層片化，使其縮小後，懸浮培養而成。
關於該細胞層片，骨髓單核細胞為黏著性骨髓單核細胞亦可。
關於該細胞層片，骨髓單核細胞為間葉系幹細胞亦可。
關於該細胞層片，將骨髓單核細胞層片化時，暴露在有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物中亦可，該化合物為IC-2亦可。
該細胞層片，纖維化抑制效果高，可適用於各種組織。
該細胞層片，MMP活性高，作為肝病治療用細胞層片係有用的。 本發明中，亦提供纖維化治療用積層細胞層片，其係積層該細胞層片而成。
此外，本發明中，亦提供有纖維化抑制作用之細胞層片的製作方法。該方法為，包含得到骨髓單核細胞之步驟，將骨髓單核細胞懸濁於培養液之步驟，將骨髓單核細胞的懸濁液播種至感溫性培養皿、培養之步驟，確認被培養的骨髓單核細胞已融合，將感溫性培養皿移動至32℃以下的環境下，得到細胞層片之步驟，將所得到之細胞層片懸浮培養之步驟。
關於該方法，骨髓單核細胞，為黏著性骨髓單核細胞亦可，間葉系幹細胞亦可。又，將該方法之骨髓單核細胞的懸濁液播種至感溫性培養皿、培養之步驟中，培養液包含有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物亦可。
關於該方法有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物為IC-2亦可。
關於該方法所得到的細胞層片，係可適用於各種組織。
關於該方法所得到的細胞層片，作為肝病治療用細胞層片係有用的。
本發明並無受理論拘束之意，但本發明之細胞層片，可認為層係層片化後維持單層的融合狀態，藉由使其縮小，細胞膜間的間隙連接變得強固的同時，以一定期間懸浮培養，藉由使構成細胞層片之細胞間的小分子代謝產物及離子等共有而使細胞間的活動強調者。
於此，在懸浮培養期間細胞層片的變質、劣化成為問題。例如，由骨骼肌成肌細胞形成之虛血性心臟疾病治療用細胞層片，係調整後於15℃至25℃下保存的情形，要求10小時以內適用於患者。本申請案發明者，將由骨髓單核細胞而成細胞層片如本發明記載所製作之情形，製作後最少要8小時，抑或24小時為止，於20℃、5%CO2環境下使之靜置的情形，亦確認到表現高MMP活性的細胞層片。
根據本發明，得到細胞層片中纖維化抑制效果高的細胞層片。
【圖1A】圖1A的結果，表示每個細胞的MMP-1(圖1A)的結果。明顯看出，比起胰蛋白酶處理後之細胞懸濁液層片化後進行懸浮培養之細胞層片之MMP-1，在高播種密度中漸漸變高。進一步，提高胞播種強度製作本發明之細胞層片的情形，明顯看出每個細胞的MMP-1之活性變高。藉由提高播種密度，每個細胞的MMP-1的活性提高係令人驚訝的結果。更進一步地，相對於當播種密度增加至4倍時胰蛋白酶處理之細胞懸濁液約上升4倍活性，本發明的細胞層片約上升6倍活性。另外，細胞播種密度高的細胞層片亦具有優異的物理性強度。
【圖1B】明顯看出，比起胰蛋白酶處理之細胞懸濁液亦層片化後進行懸浮培養之細胞層片之MMP-14，在高播種密度中漸漸變高。進一步，提高胞播種強度製作本發明之細胞層片的情形，明顯看出每個細胞的MMP-14之活性變高。藉由提高播種密度，每個細胞的MMP-14的活性提高係令人驚訝的結果。更進一步地，相對於當播種密度增加至4倍時胰蛋白酶處理之細胞懸濁液約上升4倍活性，本發明的細胞層片約上升5倍活性。另外，細胞播種密度高的細胞層片亦具有優異的物理性強度。
【圖2】表示使用黏著性骨髓單核細胞，進行一晚(8小時)懸浮培養步驟之細胞層片的MMP-1結果。藉由進行一晚懸浮培養，不論是以DMSO處理或 以IC-2處理中MMP-1的活性皆變高。雖未使用圖表示，但MMP-14中亦表示同樣的結果。又，從實施例1亦可看出，藉由提高播種密度而每個蛋白質的活性變高。進一步，此傾向比起用DMSO在用IC-2處理的細胞層片中更顯著。
【圖3】表示根據本發明之方法，藉由從來原為骨髓間葉系幹細胞所得到之細胞層片MMP-1及MMP-14活性增加。第0天係測量IC-2及DMSO處理前的樣品中MMP-1及MMP-14活性。此時細胞，沒有形成片狀。在層片化步驟中若使用DMSO及IC-2此等的活性會進一步提高，比起DMSO以IC-2處理的細胞層片之MMP-1和MMP-14活性較高。
<骨髓單核細胞>
本發明的細胞層片可由骨髓單核細胞製成。骨髓含有可分化成血管內皮細胞，心肌細胞、平滑肌細胞等之造血系、間葉系來源之幹細胞。
在特定條件下培養骨髓細胞時，黏著性細胞的基質細胞層附著到基質上並增殖。基質細胞層，係由纖維芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、內皮細胞及巨噬細胞等多樣的細胞型構成。在本發明中，骨髓單核細胞，係指藉由密度梯度離心分離法從骨髓液中分離的分類中的細胞群。亦可藉由將骨髓單核細胞繼代培養來增加基質細胞層的細胞並作成細胞層片。
骨髓單核細胞，可從人或動物骨髓採集，也可以從Lonza Japan股份有限公司等取得。
<細胞層片>
本發明的一個實施形態，係如上所述製作，由骨髓單核細胞所組成的細 胞層片。該細胞層片如後述實施例所說明，纖維化抑制活性高。
此外，本發明的一實施形態，係關於將由骨髓單核細胞組成之細胞層片用具有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物處理而成之細胞層片。該層片之特徵在於進一步提高了纖維化抑制活性。
此細胞層片亦可為肝臟表面移植用，但僅限可適用於沒有排斥反應之所有組織的纖維化抑制。
移植此細胞層片的情形，可移植1層或複數層。此外，移植的部位，可為1個或複數個地方。又，複數可為例如，2、3、4、5，或6亦可，且可為此等以上，或此等範圍內。
本發明之細胞層片與先前技術相比，提高纖維化抑制效果。纖維化抑制效果，可從提高基質金屬蛋白酶(MMP)活性，羥脯氨酸量及組織學的觀點來判斷。關於生物組織之纖維化的進展，已習知活性化的纖維母細胞(肝臟中的星狀細胞)積聚在纖維化部位，並產生大量的I型膠原蛋白。發明之細胞層片提高將此I型膠原蛋白分解的MMP-1及MMP-14之活性。
此外，本發明之一態樣中，細胞層片為骨髓單核細胞所組成之細胞層片。該層片只要不引起排斥反應，則可用於各種組織中之纖維化抑制。
<細胞層片的製作>
將骨髓單核細胞播種至含有培養基的感溫性培養皿中。作為培養基之例，有含有bFGF的DMEM/20%FBS。播種細胞的數量為，例如有1.3×104cell/cm2。此等可以因應燒瓶的大小、培養環境適當地改變，且其等在通常知識者所習知之範圍。培養基每4天更換一次，同時以37℃，5%CO2培養至細胞融合。
在本發明中，融合係指，播種之細胞與培養皿的淺底盤面緊密接觸而沒有間隙的狀態。在本發明中，融合的比例並不重要，目測淺底盤表面的70%至90%被細胞緊密地覆蓋及視為融合。又，於直徑為6cm的培養皿播種1.3×104cell/cm2的細胞，並在37℃、5% CO2下培養的情形，其在約8天內融合。原則上每4天進行一次培養基交換。
將融合的培養皿淺底盤，移至維持在32℃以下、5% CO2之培養箱內將細胞層片化。「層片化」，係意指將在37℃、5% CO2下於感溫性培養皿中培養8天的細胞層片移動至維持在32℃以下、5% CO2之培養箱中時，藉由感溫性培養皿的細胞黏著表面從疏水性變化為親水性細胞剝離，且可回收層片狀構造的細胞。因在該細胞層片的下部有細胞外基質等黏著性蛋白質維持，可將回收的細胞層片植入組織。
在本發明中，「維持在32℃以下」，係指將培養箱設定為不高於32℃。層片化的溫度與播種細胞不同，將黏著性骨髓單核細胞或間葉性幹細胞層片化時，設定為32℃即可，但處理具有Wnt/β-連環蛋白抑制作用之化合物的情形下，由於層片化需要時間，因此盡可能避免高溫的意義上在20℃下進行為佳。
在本發明的細胞層片的製造過程中，層片化的細胞收縮。例如，用直徑為6cm的感溫性培養皿層片化的細胞層片約有1cm的直徑。藉由縮小，可以較容易地調整適用於患部的細胞數量。在本發明中，收縮率並不重要，只要將本發明之一態樣之細胞層片複數重疊時不阻礙積層程度之大小的差異就沒有問題。
本發明的一個實施態樣，係控制播種密度以提高細胞層片中 每個細胞的MMP活性。在平板培養中，播種細胞數係根據播種細胞的增加容易性，及容器等的培養條件適當地選擇。例如，將間葉系幹細胞分化成肝細胞層片中，選擇以6cm的培養皿使細胞播種數成為9.0×103cells/cm2(專利文獻1)。如本發明之再生醫療細胞層片中，重要的是得到精確的單層層片，且適當地將其等積層以用於治療。將超過適切證明之播種細胞數進行播種，從得到此精確的單層細胞層片之觀點來看是伴隨著風險的。然而，本案發明者，在將播種細胞數提高之細胞層片中，發現MMP活性顯著提高。
在本發明的另一態樣中，在感溫性培養皿的培養期間，可將骨髓單核細胞暴露於有Wnt/β-連環蛋白抑制效果的化合物。在此情形下，播種的隔天，用含有所定量之有Wnt/β-連環蛋白抑制效果的化合物之培養基(DMEM/10%FBS)進行培養基交換。作為一例，如後部所述，若為IC-2，則濃度以30μM為佳。在播種的第5天同樣地在用含有Wnt/β-連環蛋白抑制效果的化合物之培養基進行培養基交換後，在播種8天後，以不含有Wnt/β-連環蛋白抑制化合物之培養基進行培養基交換，並移動至維持在32℃以下、5% CO2之培養箱內以將之層片化。
在本發明的另一態樣中，亦可在骨髓單核細胞以感溫性培養皿進行層片化前增加黏著性細胞分裂。作為得到該分裂之例，用含有20ng/ml的bFGF之培養基(DMEM/20%FBS)進行平板培養直到融合後，將淺底盤用PBS洗淨，可用胰蛋白酶將細胞由培養基燒瓶剝離並回收，藉由離心分離將上清液去除而得。懸濁於與骨髓單核細胞的同樣的培養基，播種於新的培養基。播種後，每4天以相同組成的培養基進行培養基交換。達到融合後，以PBS洗淨，用胰蛋白酶將細胞由培養皿剝離並回收，將所定的細 胞數播種於感溫性培養皿，得到細胞層片。因應必要，在感溫性培養皿中層片化前之黏著細胞分裂，亦可適當繼代，最多3繼代為本發明中最適當的範圍。
進一步，本發明之另一態樣中，繼代培養之黏著性細胞，於感溫性培養皿培養中暴露於Wnt/β-連環蛋白抑制化合物亦可。此情形下，播種的隔天，以含有所定量之有Wnt/β-連環蛋白抑制效果的化合物之培養基(DMEM/10%FBS)進行培養基交換。作為一例，如為後述的IC-2，30μM的濃度為佳。在播種的第5天同樣地在以含有Wnt/β-連環蛋白抑制效果的化合物培養基進行培養基交換後，在播種8天後，以不含有Wnt/β-連環蛋白抑制化合物之培養積進行培養基交換，並移動至維持在32℃以下、5% CO2之培養箱內以將之層片化。
<Wnt/β-連環蛋白抑制化合物>
本發明中，Wnt/β-連環蛋白抑制化合物，為包含日本特開2011-219435、WO2012/141038A1、WO2015/147107A1、WO2017/047762A1所記載之化合物。根據引用此等之文獻所記載之化合物援用本案說明書。
作為適當的化合物，為WO2012/141038A1中所記載之IC-2及其衍生物。作為適當的例子為從式(1)及式(2)所示化合物群中所選1種以上之化合物、其鹽或其等之溶劑化物。
(式中，R1、R2、R4、R5，及R6為，相同或互不相同，為H、鹵素、硝基、氰基、OH，可被取代的C1~C6烷基，可被取代的C2~C6烯基，可被取代的C1-C6烷氧基、芳基或雜芳基；R3及R7為，H，可被取代的C1-C6烷基，可被取代的C2-C6烯基；環A，為可被取代的芳基，或可被取代的雜芳基；m及q為，1至4的整數；n為，1至3的整數；p和r為，1至5的任何整數。
但是，不包含N-[(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基氨基]-2-苯氧基-苯甲醯胺。)
作為更適當的Wnt/β-連環蛋白抑制化合物之例，提供含有從式(1)及式(2)所示化合物群中所選1種以上之化合物、其鹽或其等之溶劑化物之分化誘導劑。或者，提供含有式(8)中所示化合物、其鹽或其等之溶劑化物之分化誘導劑。
(式中，R8，及R9為，相同或不相同，可被取代的C1-C6烷基，或可被取代的C2-C6烯基。)
上述化合物為一例，只要為此等的化合物的衍生物，具有Wnt/β-連環蛋白抑制效果之化合物，即為本發明所需之Wnt/β-連環蛋白抑制化合物。關於化合物是否具有Wnt/β-連環蛋白抑制效果，可藉由個種方法決定，例如，可以培養細胞中的螢光素酶活性為基準。
<懸浮培養>
在本發明中，如前述將從感溫性培養皿回收之細胞層片，懸浮培養。在縮小之細胞層片中的MMP活性足夠高且細胞層片的安定性沒有問題的範圍內進行懸浮培養的時間可在適當地改變。作為一例，可適當地選擇8小 時至24小時之間。本發明中的懸浮培養係指，將回收的細胞層片，不再黏著於容器，以懸浮狀態在培養液中靜置之意思。用於該步驟之培養液為層片化步驟中用的培養液為佳。經過懸浮培養的細胞層片，與層片化後之細胞層片一樣維持細胞外基質，可移植至別的細胞層片、基材，或疾病對象組織。
本發明者，藉由製作細胞層片時，將得到的細胞層片懸浮培養，發現細胞層片中的MMP活性顯著提高從而實現了本發明。如本發明所說明，MMP活性提高若係由骨髓單核細胞製作細胞層片的情形，細胞層片化步驟中，與暴露於具有Wnt/β-連環蛋白抑制作用之化合物的情形有同樣的傾向，但暴露於Wnt/β-連環蛋白抑制化合物所製作之細胞層片與從骨髓單核細胞製作的細胞層片相比，MMP活性較高。
<纖維化抑制效果的測量>
<MMP活性>
本案發明者，揭露使用由IC-2化合物分化的肝細胞層片，使慢性肝病之實驗老鼠的肝星細胞之活性獲得抑制(專利文獻1)。由此，本發明的發明者著眼於關於肝纖維化抑制的主要成分I型膠原蛋白的分解之基質金屬蛋白酶(MMP)基團，且發現MMP-1及MMP-14與慢性及急性肝臟疾病的纖維化具強烈關聯。(肝臟論壇2017年3月)。
在本發明中，MMP活性，藉由MMP切斷而產生螢光可根據使用FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)肽測量酵素活性來決定。
<羥脯氨酸的測量>
藉由均化器破碎冷凍肝組織片(細胞層片)，以得到破碎液。將該破碎液一暫時以氮氣暫時凍結，於室溫溶解後，使用超音波細胞破碎裝置 BioRuptur(COSMOBIO公司，東京，日本)進行超音波處理。於此破碎溶液加入等量之12N濃鹽酸進行水解處理。剩餘的破碎液用於溶液中之蛋白質質量的測量。水解處理後，於室溫冷卻後藉由吸量管將水解物細碎，於室溫、3000rpm下進行5分鐘的離心操作，將上清液置於1.5mL管中，藉由冷卻蒸發器(佐久間製作所，東京，日本)去除鹽酸。使用Hydroxyproline quantification kit(BioVision公司，加州，美國)測量羥脯氨酸。
破碎溶液中的蛋白質質量使用蛋白質測量濃縮色素試劑(Bio-Rad公司，加州，美國)，根據Bradford法測量。
<組織學檢查>
纖維化的抑制效果之組織學檢查藉由天狼星紅(Sirius Red)及Azan染色進行。
【實施例】
以下，藉由實施例說明本發明，惟本發明並非限定為此等實施例者。
【實施例1】
胰蛋白酶處理之細胞懸浮液與細胞層片之MMP活性及播種細胞數的加乘作用。
將來源為骨髓之間葉系幹細胞(UE7T-13細胞株)懸浮於DMED/10%FBS，於感溫性培養皿以及一般細胞培養皿各自播種使細胞播種密度分別成為3.6×104cells/cm2、5.4×104cells/cm2、7.2×104cells/cm2。4天後，將感溫性培養皿移動至32℃、5% CO2培養箱中，進行層片化。得到的細胞層 片用PBS洗淨3次後，在MMP活性測量試劑盒(SensoLyte(R)520 MMP-1 Assay Kit Fluorimetric，(ANASPEC公司：Cat#：AS-71150)及SensoLyte(R)520 MMP-14 Assay Kit Fluorimetric(ANASPEC公司：Cat#：AS-72025))的緩衝液中均質。播種在一般的培養皿之細胞分別，分散於0.025%胰蛋白酶/0.1mM EDTA，離心回收後，用PBS洗淨3次，用MMP活性測量的緩衝液均質。測量之MMP活性的結果如表1及圖1A以及1B所示。表1的結果為，表示每個細胞的MMP-1(圖1A)及MMP-14(圖1B)的結果。明顯的與胰蛋白酶處理之細胞懸浮液相比將層片化後進行懸浮培養之細胞層片之MMP-1及MMP-14，在高的播種密度中變得更高。進一步，明顯的看出將胞播種密度提高製成本發明之細胞層片的情形，每一個細胞的MMP-1活性變高。藉由提高播種密度，而提高每個細胞的MMP-1活性係令人驚訝的結果。更進一步，相對於當播種密度增加至4倍時胰蛋白酶處理之細胞懸浮液提升約4倍活性，本發明之細胞層片則提升5-6倍活性。此外，細胞播種密度高之細胞層片亦具有優異的物理強度。
【實施例2】
將黏著性骨髓單個核細胞(龍沙日本股份有限公司)懸浮於DMED/20%FBS，於感溫性培養皿各自播種使細胞播種密度分別成為1.8×104cells/cm2、3.6×104cells/cm2、5.4×104cells/cm2。播種隔天，將培養基更換為含有30μM的IC-2之DMEM/10%FBS。亦實施使用取代IC-2化合物的添加DMSO之培養基之態樣。添加IC-2及DMSO的4天後，再度以含有30μM的IC-2之培養基或含有DMSO之培養基分別進行培養基交換，7天後，將感溫性培養皿移動至20℃、5% CO2培養箱中，進行層片化。層片化後的細胞，在含有相同培養液之淺底盤中，在20℃、5% CO2條件下靜置一晚進行懸浮培養。懸浮細胞後的細胞層片用PBS洗淨3次後，在MMP活性測量試劑盒(SensoLyte(R)520 MMP-1 Assay Kit Fluorimetric，(ANASPEC公司：Cat#：AS-71150)及SensoLyte(R)520 MMP-14 Assay Kit Fluorimetric(ANASPEC公司：Cat#：AS-72025))的緩衝液中均質。備齊各自一定量的蛋白質量，測量MMP-1及MMP-14。DMSO及IC-2處理之細胞層片任一進行懸浮培養的情形MMP-1及MMP-14活性皆變高(圖中未示出)。MMP-1的結果如圖2所示，從此結果，可明顯看出藉由提高播種密度每個蛋白質的活性亦增加。進一步，這種傾向在用IC-2處理的細胞層片中比用DMSO處理更顯著。
【實施例3】
將來源為骨髓的間葉系幹細胞株(UE7T-13細胞株)懸浮於DMED/10%FBS，於感溫性培養皿播種使細胞播種密度成為3.6×104cells/cm2。播種隔天，更換培養基為含有15μM的IC-2之DMEM/10%FBS。亦使用取代IC-2化合物的添加DMSO之培養基進行培養基交換。播種4天後，再度以含有15μM的IC-2之培養基或含有DMSO之培養基分別進行培養基交換，8天後，將感溫性培養皿移動至20℃、5% CO2培養箱中，進行層片化。得到之細胞層片用PBS洗淨3次後，在MMP活性測量試劑盒(SensoLyte(R)520 MMP-1 Assay Kit Fluorimetric，(ANASPEC公司：Cat#：AS-71150)及SensoLyte(R)520 MMP-14 Assay Kit Fluorimetric(ANASPEC公司：Cat#：AS-72025))的緩衝液中均質，測量MMP-1及MMP-14活性。測量IC-2及DMSO處理前之細胞的MMP-1及MMP-14活性作為第0天。又，第0天時細胞沒有成為層片狀。備齊各自一定量的蛋白質量，測量之MMP活性之結果如圖3所示。
根據圖3，藉由細胞層片化細胞中的MMP-1及MMP-14活性會提高數倍，進一步明顯看出IC-2化合物較DMSO更加提高其活性。

Claims (17)

  1. 一種細胞層片，其係由骨髓單核細胞所組成之細胞層片，該細胞層片係由骨髓單核細胞懸濁液將骨髓單核細胞層片化，使其縮小後，懸浮培養而成。
  2. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，前述骨髓單核細胞為黏著性骨髓單核細胞。
  3. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，前述骨髓單核細胞為間葉系幹細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，包含將前述骨髓單核細胞層片化時，暴露在有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物中。
  5. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，前述有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物為IC-2。
  6. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，其纖維化抑制效果高。
  7. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，所得到之細胞層片，可適用於各種組織。
  8. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，其係肝臟疾病治療用細胞層片。
  9. 如申請專利範圍第1項所記載之細胞層片，其中，其基質金屬蛋白酶(MMP)活性很高。
  10. 一種纖維化治療用積層細胞層片，其特徵係由申請專利範圍第1項所記 載之細胞層片積層而成。
  11. 一種細胞層片之製造方法，其特徵係在具有纖維化抑制作用之細胞層片之製造方法中，由得到骨髓單核細胞之步驟，將骨髓單核細胞懸濁於培養液之步驟，將骨髓單核細胞的懸濁液播種至感溫性培養皿、培養之步驟，確認被培養的骨髓單核細胞已融合，將感溫性培養皿移動至20℃的環境下，得到細胞層片之步驟，將所得到之細胞層片懸浮培養之步驟，而成之細胞層片之製造方法。
  12. 如申請專利範圍第11項所記載之細胞層片之製造方法，其中，前述骨髓單核細胞為黏著性骨髓單核細胞。
  13. 如申請專利範圍第11項所記載之細胞層片之製造方法，其中，前述骨髓單核細胞為間葉系幹細胞。
  14. 如申請專利範圍第11項所記載之細胞層片之製造方法，其中，將前述骨髓單核細胞的懸濁液播種至感溫性培養皿、培養之步驟中，培養液包含有Wnt/β-連環蛋白抑制作用之化合物。
  15. 如申請專利範圍第11項所記載之細胞層片之製造方法，其中，前述有Wnt/β-連環蛋白抑制作用的化合物為IC-2。
  16. 如申請專利範圍第11項所記載之細胞層片之製造方法，其中，所得到的細胞層片，可適用於各種組織。
  17. 如申請專利範圍第11項所記載之細胞層片之製造方法，其中，所得到的細胞層片，係肝臟疾病治療用細胞層片。
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