JP6578621B2 - 血液関連疾患患者のリンパ節由来の間質細胞 - Google Patents
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Description
以下の発明は、以上の成果に基づくものである。
[1]以下のステップ(1)及び(2)を含む、リンパ増殖性疾患患者リンパ節由来のヒト間質細胞を調製する方法;
(1)リンパ増殖性疾患患者のリンパ節から採取した生検試料から、血球成分を除去するステップ;
(2)血清を添加した栄養培地で培養するステップ。
[2]プロテアーゼで処理した試料をステップ(2)の培養に供する、[1]に記載の方法。
[3]前記プロテアーゼがトリプシンである、[2]に記載の方法。
[4]前記栄養培地が、グルコースの含有量が多い高栄養培地である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]前記栄養培地がイスコフ改変ダルベッコ培地である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[6]前記血清の添加量が5%(v/v)〜20%(v/v)である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]前記リンパ増殖性疾患が悪性リンパ腫である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の方法。
[8]前記悪性リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、又は血管免疫芽球型T細胞リンパ腫である、[7]に記載の方法。
[9][1]〜[8]のいずれか一項に記載の調製方法で得られたヒト間質細胞。
[10]以下の(a)及び/又は(b)の特性を備える、ヒト間質細胞:
(a)リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の増殖を支持する;
(b)リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の治療抵抗性を高める。
[11]前記リンパ球が、リンパ節から採取されたリンパ球である、[10]に記載のヒト間質細胞。
[12][1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法で得られた細胞である、[10]又は[11]に記載のヒト間質細胞。
[13][9]〜[12]のいずれか一項に記載のヒト間質細胞と共培養することを特徴とする、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の培養方法。
[14]前記リンパ球が、以下の方法、即ち、
リンパ増殖性疾患患者から採取されたリンパ球を該リンパ球が免疫的に許容される非ヒト動物に移植し、該非ヒト動物内で培養した後、該非ヒト動物から分離すること、
によって得られた細胞である、[13]に記載の培養方法。
[15]以下のステップ(i)及び(ii)を含む、リンパ増殖性疾患の予防・治療に有効な物質のスクリーニング方法:
(i)[9]〜[12]のいずれか一項に記載のヒト間質細胞と、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球を、被験物質の存在下、共培養するステップ;
(ii)前記リンパ球に対する前記被験物質の有効性を判定するステップ。
[16]前記リンパ球が、以下の方法、即ち、
リンパ増殖性疾患患者から採取されたリンパ球を該リンパ球が免疫的に許容される非ヒト動物に移植し、該非ヒト動物内で培養した後、該非ヒト動物から分離すること、
によって得られた細胞である、[15]に記載のスクリーニング方法。
本発明の第1の局面は、リンパ増殖性疾患患者リンパ節由来のヒト間質細胞を調製する方法(以下、「本発明の調製方法」と呼ぶ)に関する。間質細胞(ストローマ細胞)は、細胞外マトリクスを産生して組織構造を支える細胞である。リンパ節における間質細胞は、免疫細胞の生存や機能等にも関与する。本発明によれば、リンパ増殖性疾患患者リンパ節由来のヒト間質細胞(線維芽細胞)を調製することができる。本明細書において「リンパ増殖性疾患患者リンパ節由来」とは、リンパ増殖性疾患患者のリンパ節から採取した生体材料を出発材料として調製されることを意味する。
(1)リンパ増殖性疾患患者のリンパ節から採取した生検試料から、血球成分を除去するステップ
(2)血清を添加した栄養培地で培養するステップ
後述の実施例に示す通り、本願発明者らは複数のリンパ増殖性疾患患者からリンパ節由来の間質細胞を調製することに成功した。また、検討を進め、当該間質細胞がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者、濾胞性リンパ腫患者、及びCastleman病患者のリンパ節から分離したB細胞の増殖を強く支持すること、更には当該間質細胞がリンパ腫細胞の治療抵抗性を高めることを明らかにした。これらの成果に基づき、本発明の第2の局面は、以下の(a)又は(b)の特性、或いは(a)と(b)の両方の特性を備えるヒト間質細胞を提供する。
(a)リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の増殖を支持する
(b)リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の治療抵抗性を高める
本発明は更に、本発明の調製方法で得られるヒト間質細胞の用途として、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の培養方法を提供する。本発明の培養方法では上記の調製方法で得られたヒト間質細胞(本発明のヒト間質細胞)を支持細胞として用いる。即ち、本発明の培養方法は、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球(以下、「患者リンパ球」と呼ぶ)を本発明のヒト間質細胞と共培養すること、によって特徴付けられる。本発明の培養方法は、マウス由来の間質細胞を支持細胞として用いた従来の培養方法に比して、生体内の微小環境をより模倣(再現)したものといえ、細胞増殖率の向上が望めることはもとより、それを利用して得られた知見は示唆に富み、治療法や診断法を開発するためのツールとしてより重要かつ有益である。
本発明は更に、本発明の培養法の利用形態の一つとして、リンパ増殖性疾患の予防・治療に有効な物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、生体内の微小環境を模倣した培養系(本発明の培養方法)を利用することから、信頼性や客観性等に優れた評価を行え、薬剤候補の効率的な同定を可能にする。
(i)本発明のヒト間質細胞と、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球を、被験物質の存在下、共培養するステップ
(ii)前記リンパ球に対する前記被験物質の有効性を判定するステップ
リンパ節生検では、一般に、患者から採取したリンパ節を70 μm孔のフィルターに押し当てて、透過した血球を診断に使用する。フィルターを透過しなかった残片から、間質細胞を採取することを試みた(図1)。残片を10 mLのPBSで洗浄後、1 mLの0.25%トリプシン-PBS溶液中、37℃で3〜5分間静置した。10%ウシ胎児血清と2 mMグルタミンを含むイスコフ改変ダルベッコ培地(シグマアルドリッチジャパン株式会社製)14 mLを加えてリンパ節残片ごと100 mm径のディッシュ(製品名:Falconセルカルチャーディッシュ、コーニングジャパン株式会社製)に移し、37℃、5%CO2の条件で培養した。蒸発分の培地を随時加えて培地量10 mL以上を維持し、紡錘形の接着細胞がディッシュの50〜70%を覆うまで培養を続けた(図2)。継代方法は293T等の接着細胞株の培養方法に準じて、トリプシンで剥離させた細胞懸濁液の半量を新しいディッシュに移すことで行った。
リンパ節の微小環境は、大別して、線維芽細胞、濾胞樹状細胞、血管内皮細胞の3要素で構成されており、表面抗原の発現で分類できる。研究の初期に得られた2例の濾胞性リンパ腫患者から得られた間質細胞をフローサイトメトリーで解析した結果、表面抗原の発現は下記の通りであり、いずれも線維芽細胞であることが分かった(図3)。尚、PDPNは、線維芽細胞の活性化に伴って発現が増加する表面抗原である。
線維芽細胞マーカー:ICAM-1陽性2例、VCAM-1陰性2例、PDPN陽性1例、陰性1例
濾胞樹状細胞マーカー:CD21陰性2例、CD35陰性2例
血管内皮細胞マーカー:CD31陰性2例
得られた間質細胞が期待どおり血液関連疾患の細胞に有利な環境を構築するか否かを、in vitro共培養系で検討した。まず、B細胞マーカーの抗CD19抗体を結合させた磁気ビーズを使い、血液関連疾患患者由来のリンパ節からB細胞を分離した。間質細胞3×104とB細胞1×105を24穴プレート内で共培養した。トリパンブルー非染色細胞を生存細胞として、共培養2、4日目の生存B細胞数を数えた。B細胞リンパ腫細胞、非腫瘍化B細胞のいずれも、既存のマウス間質細胞BLS4と共培養した場合よりも、取得に成功したヒト間質細胞と共培養した場合の方が高い生存率を示した(図4)。
得られた間質細胞が腫瘍細胞の治療抵抗性に寄与するかを、B細胞リンパ腫細胞株とPI3キナーゼ阻害剤を用いて検討した。10%ウシ胎児血清と2 mMグルタミンを含むRPMI―1640培地、または同培地で2〜3日間培養した間質細胞の培養上清を用いて、PI3キナーゼ阻害剤の希釈系列を作製した。この希釈系列中でB細胞リンパ腫細胞株を3日間培養し、生存細胞をアセトキシメチルエステル化Calceinで染色し、PI3キナーゼ阻害剤の有効濃度を比較した。バーキットリンパ腫細胞株Ramos、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株WILL2(和歌山県立医科大学、園木 孝志 博士から供与。Sonoki T et al., International Journal of Hematology 2009, 89(3), 400-402を参照)のいずれも、間質細胞の培養上清中で培養した方が、PI3キナーゼ阻害剤LY294002、idelalisibの有効濃度が増大した(図5)。つまり、取得に成功したヒト間質細胞は、B細胞リンパ腫細胞のPI3キナーゼ阻害剤に対する抵抗性(治療抵抗性)に寄与することが示唆された。
Claims (11)
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫又はcastleman病の患者リンパ節由来のヒト間質細胞を調製する方法;
(1)前記患者のリンパ節から採取した生検試料から、血球成分を除去するステップ;
(2)ステップ(1)後の試料をプロテーゼで処理した後、血清を添加した、グルコースの含有量が多い高栄養培地で培養するステップ。 - 前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項1に記載の方法。
- ステップ(2)のプロテアーゼ処理の際のトリプシン濃度が0.1%(w/v)〜0.5%(w/v)、処理時間が1分〜10分である、請求項2に記載の方法。
- 前記栄養培地がイスコフ改変ダルベッコ培地である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血清の添加量が5%(v/v)〜20%(v/v)である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の調製方法で得られたヒト間質細胞。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法で得られ、以下の(a)及び/又は(b)の特性を備えるヒト間質細胞:
(a)リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の増殖を支持する;
(b)リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の治療抵抗性を高める。 - 請求項6又は7に記載のヒト間質細胞と共培養することを特徴とする、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球の培養方法。
- 前記リンパ球が、以下の方法、即ち、
リンパ増殖性疾患患者から採取されたリンパ球を該リンパ球が免疫的に許容される非ヒト動物に移植し、該非ヒト動物内で培養した後、該非ヒト動物から分離すること、
によって得られた細胞である、請求項8に記載の培養方法。 - 以下のステップ(i)及び(ii)を含む、リンパ増殖性疾患の予防・治療に有効な物質のスクリーニング方法:
(i)請求項6又は7に記載のヒト間質細胞と、リンパ増殖性疾患患者由来のリンパ球を、被験物質の存在下、共培養するステップ;
(ii)前記リンパ球に対する前記被験物質の有効性を判定するステップ。 - 前記リンパ球が、以下の方法、即ち、
リンパ増殖性疾患患者から採取されたリンパ球を該リンパ球が免疫的に許容される非ヒト動物に移植し、該非ヒト動物内で培養した後、該非ヒト動物から分離すること、
によって得られた細胞である、請求項10に記載のスクリーニング方法。
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