CN109593711A - 扩增自然杀手细胞部份的扩增方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多种扩增一自然杀手(NK)细胞部分以用于移植入一对象的方法，以及特别是多种提供可移植的NK细胞部分的方法及多种使用它们的方案，所述方案可以应用在细胞移植及输注以用于治疗癌症及其他疾病。

Description

扩增自然杀手细胞部份的扩增方法及用途
技术领域
本发明是有关于扩增自然杀手(NK)细胞，选择扩增的NK细胞群用于移植到有需要的对象及所述合适的治疗用途，体外扩增的NK细胞部分用于所述临床环境中的移植，用于治疗血液恶性肿瘤(hematological malignancies)。本发明还设想了包含所述扩增的NK细胞部分的试剂盒。
背景技术
自然杀手(本文也简称为「NK」)细胞是参与免疫反应(immune reactions)的淋巴细胞(lymphoid cells)。这些细胞具有多种功能，特别是杀死肿瘤细胞，细胞经历致癌转化(oncogenic transformation)及在一活体内的其他异常细胞，并且是先天免疫监视机制的重要组成部分。用NK细胞过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)的临床经验强调需要更好的方法来同时保持有效及有效率地扩增NK细胞群，甚至增强它们的体内功能(杀伤力、运输、局部化、持久性及扩散)。
不像T细胞(T cells)，自然杀手(NK)细胞不需要一特定的肿瘤抗原(tumorantigen)的所述存在才能杀死癌细胞；相反的，他们对目标的识别是通过激活及抑制信号之间的所述平衡来调节的。自然杀手(NK)细胞杀死肿瘤细胞而不需要识别一肿瘤特定抗原的这种能力提供了优于T细胞的优势，并且使它们作为免疫疗法的效应物具有吸引力。近年来，NK细胞作为用于各种难治疗的血液恶性肿瘤及转移性实体瘤(metastatic solidtumors)患者的免疫疗法的一有希望的工具引起了相当大的关注。然而，尽管NK细胞能够独立于抗原识别而杀死癌细胞，但基于NK细胞的免疫疗法的全部治疗潜力尚未实现。迄今为止来自数个实验方案的结果主要限于部分反应，边际效能主要归因于输注的NK细胞数量相对较少，所述NK细胞在体内持久性短及/或体内功能差。因此，开发出有效扩增所述NK群体及增加所述体内过继输注所述NK细胞功能的体外培养方法，对于改善NK细胞的免疫疗法的所述临床适用性至关重要。
已经研究了几种用于NK细胞体外扩增(in-vitro expansion)及激活的方法。这些方法包括：培养富含隔夜PBMC的NK细胞及长期使用细胞因子，或用饲养细胞如：PBMC、遗传修饰的K562细胞共培养NK细胞(参见Malmberg等的US20150224143)，及人类疱疹病毒第四型转化的淋巴母细胞样细胞系(参见，例如：Lee等人的US20150152387)。已经描述了用于繁殖NK细胞的其他方法：Frias等人(Exp Hematol 2008；36：61至68)使用无血清培养基从基质细胞层的脐带血中选择NK祖细胞(CD7+CD34-Lin-CD56-)，用SCF、IL-7、IL-15、FL及IL-2诱导NK分化，产生增加数量的细胞毒性培养的NK细胞。Harada等人(Exp Hematol.2004；32：614至21)在一威尔姆氏肿瘤细胞系的细胞上生长NK细胞。Waldmann等人(US20070160578)描述了使用IL-15/R-配体激活剂的复合物从培养物中的全血、骨髓或脾细胞中增强NK及CD8-T细胞的增殖，以减少非期望的细胞因子产生。坎帕纳等人(US20090011498)描述了在表现IL-15及4-1BB的白血病细胞的所述存在下，用于移植的NK细胞的体外培养及激活，并且具有弱化或不存在的MHC-I或II的表现。Child等人(US20090104170)描述了在IL-2存在下，通过与经辐射的EBV转化的幼成淋巴细胞共培养的NK细胞的体外增殖及激活。使用另一种方法，Tsai(US20070048290)通过用经照射的3T3衍生的OP-9S细胞体外培养永生化的NK祖细胞，从造血干细胞产生连续的NK细胞系，用于研究及潜在的治疗应用(所有上述的参考文献通过引用并入本文)。
扩增的NK细胞群的治疗用途已经成为超过40项已完成、活跃、招募或授权的临床试验的所述主题(参见临床试验(dot)政府网站)，研究通过用于治疗各种癌症状况的不同方案以扩增NK细胞的应用，包含：血液恶性肿瘤及实体瘤。一般而言，已发现扩增的NK细胞群维持细胞毒性。然而，迄今为止的结果强调了设计NK扩增及治疗方案是困难的，这些方案不仅安全，而且足以有效标记不同形式的恶性肿瘤。
本发明人已经描述了用细胞因子及所述NAD前体烟酰胺培养的NK细胞的有效体外扩增及增强的功能，报告了在动物模型(参见PCT公开WO2011/080740及Frei等，Blood，2011；118：4035)中增加所述扩增的NK细胞至目标器官(例如：脾、骨髓及外周血)的定位及植入。
发明内容
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种制备一可移植的自然杀手(NK)细胞部分的方法，用于移植到一有需要的对象中，所述方法包括：
(a)获得与一对象为HLA单倍体相合或HLA错配的一CD3去除的NK细胞部分；
(b)在允许细胞增殖的多个条件下，体外培养所述CD3去除的NK细胞部分，其中所述多个条件包括提供用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺；
(c)在步骤(b)后8至10天用新鲜的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺补充给所述CD3去除的NK细胞部分，以生产一扩增的CD3去除的NK细胞部分；
(d)在步骤(b)后14至16天采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分；及
(e)洗涤并浓缩步骤(d)的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，
从而生产一可移植的NK细胞部分。
根据本发明的一些实施例，所述所述CD3去除的NK细胞部分是一人类NK细胞部分。
根据本发明的一些实施例，所述CD3去除的NK细胞部分来自分离术。
根据本发明的一些实施例，所述离体培养没有一饲养层。
根据本发明的一些实施例，所述血清是人类血清。
根据本发明的一些实施例，所述允许细胞增殖的多个条件包括提供10％的人类血清。
根据本发明的一些实施例，所述IL-15包括20奈克/毫升的IL-15。
根据本发明的一些实施例，所述烟酰胺包括5.0毫摩尔的烟酰胺。
根据本发明的一些实施例，所述方法包括：提供包括最小的必需细胞培养基质的多个营养成分。
根据本发明的一些实施例，所述NK细胞部分来自一HLA单倍体相合或HLA错配的捐赠者，所述捐赠者至少具有：
(a)HLA符合至少2/4第1类等位基因的A及B基因位的一以DNA中等分辨率为基准的第1类分型；以及
(b)不存在受体捐赠者特异的抗HLA抗体(平均荧光强度MFI≤1000)。
根据本发明的一些实施例，步骤(a)的所述NK细胞包括：至少40至90％的CD56+/CD3-细胞。
根据本发明的一些实施例，步骤(d)的所述采集包括：在步骤(b)后14天采集一扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第一部分，并且在步骤(b)后16天采集一扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第二部分。
根据本发明的一些实施例，所述第一部分包括：大约50％的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，以及所述第二部分包括：其余的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分。
根据本发明的一些实施例，步骤(e)产生的所述洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分具有于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
根据本发明的一些实施例，步骤(b)的所述培养是在多个烧瓶中以每瓶200至300×106个细胞的方式进行。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了根据本发明的所述方法制备的一可移植的NK细胞部分。
根据本发明的一些实施例，所述的可移植的NK细胞部分，其特征在于：所述可移植的NK细胞部分具有以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
根据本发明的一些实施例，所述的可移植的NK细胞部分，其特征在于：所述可移植的NK细胞部分被提供在一氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋中。
根据本发明的一些实施例，提供一可移植的NK细胞部分其特征在于具有以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种治疗一血液疾病于有需要治疗所述血液疾病的对象的方法，所述方法包括：
(a)向所述对象施用一抗癌单克隆抗体；
(b)向所述对象施用至少一免疫抑制剂；
(c)将一扩增的CD3去除的单倍体或一错配的NK细胞部分移植到所述对象中，其中所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞部分已经通过离体培养扩增，所述离体培养包含：用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺；以及
(d)向所述对象施用IL-2，从而治疗所述对象中的所述血液疾病。
根据本发明的一些实施例，所述对象及所述NK细胞部分是一人类对象及一人类NK细胞部分。
根据本发明的一些实施例，所述免疫抑制剂是一化学治疗免疫抑制剂及/或一放射线。
根据本发明的一些实施例，所述血液疾病是一血液恶性肿瘤。
根据本发明的一些实施例，所述血液疾病是一多发性骨髓瘤。
根据本发明的一些实施例，所述多发性骨髓瘤的特征是至少一种：
(a)第一次自体干细胞移植后2至18个月复发的疾病；
(b)异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病且没有活动性移植物对抗宿主疾病(GVHD)的证据；
(c)接受至少两种治疗方法后复发/难治疗的疾病，包含：一蛋白酶体抑制剂及一免疫调节药物(IMiD)；
(d)血清的IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白(M蛋白)大于或等于0.5克/分公升；以及
(e)尿液M蛋白大于或等于200毫克/24次收集量。
根据本发明的一些实施例，所述血液疾病是一非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。
根据本发明的一些实施例，所述NHL是CD20阳性B细胞的NHL。
根据本发明的一些实施例，所述NHL具有以下至少一种：
(a)传统治疗失败后的复发/难治疗的疾病；
(b)自体干细胞移植后至少60天复发的疾病；
(c)异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病且没有活性移植物对抗宿主疾病的证据，以及
(d)直径大于或等于1.5公分的可测量的疾病。
根据本发明的一些实施例，所述血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤及所述抗癌单克隆抗体是埃罗妥珠单克隆抗体(10毫克/公斤)。
根据本发明的一些实施例，所述血液恶性肿瘤是NHL，及所述抗癌单克隆抗体是利妥昔单克隆抗体(375毫克/平方公尺)。
根据本发明的一些实施例，步骤(a)执行三次。
根据本发明的一些实施例，步骤(d)包括：施用所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分的一第一剂量，两天后接着施用所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分的一第二剂量。
根据本发明的一些实施例，步骤(a)执行三次：在所述第一剂量之前9至11天、在所述第一剂量之前3天及在所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分的所述第一剂量之后的第11天。
根据本发明的一些实施例，所述步骤的NK细胞部分包括在1×107/公斤及5×108/公斤之间的扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞。
根据本发明的一些实施例，所述第一及第二剂量的所述结合包括：总量为2×107/公斤至2×108/公斤的扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞。
根据本发明的一些实施例：
(a)所述NK细胞部分的所述第一剂量及所述第二剂量包括：1×107/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，总剂量为2×107/公斤的扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，或
(b)所述NK细胞部分的所述第一剂量及所述第二剂量各自包括：5×107/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，总剂量为1×108/公斤的扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，或
(c)所述NK细胞部分的所述第一剂量及所述第二剂量各自包括：1×108/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，总剂量为2×108/公斤的扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞。
根据本发明的一些实施例，所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞部分施用于在提供用于所述移植的所述部分后不超过1小时的所述对象，并且在所述部分的最终产物释放后不超过10小时。
根据本发明的一些实施例，所述至少一免疫抑制剂包括：环磷酰胺及/或氟达拉滨。
根据本发明的一些实施例：
(i)所述至少一免疫抑制剂包括：环磷酰胺(40毫克/公斤)及氟达拉滨(25毫克/平方公尺)；及
(ii)在输注所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞前5天施用所述环磷酰胺，以及在获得输注包含扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞的所述药物前的第5、4及3天中的每一天施用所述氟达拉滨。
根据本发明的一些实施例中的所述方法，进一步包括：在输注所述扩增的CD3去除的NK细胞后施用6X106单位的IL-2：
(i)在输注所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或错配的NK细胞的当天；
(ii)在输注所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞之后的两天；以及
(iii)在输注所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞的第四天。
根据本发明的一些实施例中的所述方法包括：根据如本文详述的任一方法制备移植一可移植的NK细胞部分(NK cell fraction)。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法及材料可用于实践或测试本发明的实施方案，但下文描述了示例性方法及/或材料。如有冲突，将控制专利说明书，包括定义。另外，材料、方法及实施例仅是说明性的，并非旨在限制。
具体实施方式
本发明涉及扩增一自然杀手(NK)细胞部分以便植入一对象，同时保持或增强体外及/或体内细胞功能的方法。在一个实施例中，用一烟酰胺及/或其他烟酰胺部分及NK细胞生长因子体外培养NK细胞促进NK细胞群的所述生产，用作一治疗性体外扩增的NK细胞制剂。所述NK细胞制剂包括一扩增的功能性NK细胞群，所述扩增的功能性NK细胞群具有适于输注到一对象中的参数(例如：NK细胞与一还原的CD3+T细胞部分一起的强烈扩增)。特别是在这方面，本发明可用于提供可移植的NK细胞部分及其使用方案，所述使用方案可以应用于细胞移植及输注用于治疗癌症及其他疾病。非限制性的应用可以包括：同种异体过继免疫疗法及联合免疫疗法以及致敏剂及其他抗癌方式。
参考所述附加说明可以更好理解本发明的所述原则及操作。
在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应该理解，本发明不一定限于其应用于以下描述中阐述的细节。本发明能够具有其他实施例或者能够以各种方式实践或实施。
自然杀手(以下也简称为NK)细胞是参与免疫免应的淋巴细胞，表现出对肿瘤细胞的自然非MHC限制的细胞毒活性。因此，开发临床级的方案(例如：无基质层、最小细胞因子)，以有效体外扩增活的NK细胞的数量及有效的增加它们的功能，以及输注后归巢至淋巴结及其体内稳态增殖的可能性，可以改善用于治疗癌症状况的过继免疫疗法的所述成功率，所述癌症状况例如：固体瘤、血液恶性肿瘤及其相似物。
本发明提供了用于制备及表征适于移植的扩增的NK细胞部分的临床适当条件，如本文进一步描述，在临床的设置中，基于用超过一特定浓度的烟酰胺培养NK细胞。因此，在所述的实施例中，本发明提供临床上适当的培养条件，用于生产功能成熟的NK细胞的可移植的NK细胞部分，而不伴随诱导非NK细胞(例如：CD3+)的增殖，提供可移植的NK部分及其选择标准，以及作为用于治疗癌性疾病的数个临床方案，特别是血液恶性肿瘤的临床方案。
因此，根据本发明的一个实施例的一个方面，提供一种制备一可移植的NK细胞部分的方法，用于移植到需要所述方法的一对象中，所述方法包括：
(a)获得与一对象为HLA单倍体相合或HLA错配的一CD3去除的NK细胞部分；
(b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养所述CD3去除的NK细胞部分，其中所述多个条件包括提供用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺；
(c)在步骤(b)后8至10天用新鲜的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺补充给所述CD3的NK细胞部分，以生产一扩增的CD3去除的NK细胞部分；
(d)在步骤(b)后14至16天采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分；及
(e)洗涤并浓缩步骤(d)的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，
从而生产用于移植到所述对象的一可移植的NK细胞部分。
如本文所用，所述术语自然杀手(NK)细胞是指参与所述先天免应反应的大颗粒淋巴细胞。在功能上，NK细胞通过含有多种蛋白质的细胞质颗粒的胞吐作用，对多种目标有溶细胞活性，包含：穿孔素及颗粒蛋白酶。杀伤是在一接触依赖性、非吞噬的过程中触发的，所述杀伤不需要对一抗原进行预先致敏化。人类NK细胞的特征在于所述细胞表面的标记CD16及CD56的所述存在，以及所述T细胞受器(CD3)的所述存在。人类骨随细胞衍生的NK细胞的进一步特征在于CD2+CD16+CD56+CD3-表型，还含有所述T细胞受体zeta链[zeta(ζ)-TCR]，并且通常以NKp46、NKp30或NKp44为特征。非NK细胞例如：NKT细胞或CD8NKT细胞同时具有T细胞及NK细胞的数个特征及数个细胞表面的标记。在一个实施例中，本发明的所述方法用于体外增殖来自一细胞群的成熟NK细胞。如本文所用，所述术语「成熟NK细胞」定义为具有数个特征性表面标记及NK细胞功能的一定型NK细胞，并且缺乏进一步分化的所述潜力。如本文所用，成熟NK细胞包括但不限于：CD56bright细胞，所述CD56bright细胞可以增殖并产生丰富的细胞因子，CD56dim细胞表现出强大的细胞毒性，CD56brightCD94high及CD56dimCD94high细胞。在另一个实施例中，增殖NK祖细胞或NK祖细胞及成熟NK细胞的混合群体。CD56、CD3、CD94及其他标记的细胞表面的表现可以通过例如：FACS分析或免疫组织染色技术确定。
如本文所用，所述术语「祖细胞」是指能够分化及/或经历分化成一种或多种成熟效应细胞的一未成熟的细胞。淋巴组细胞包括，例如：能够产生所述B细胞、T细胞及NK细胞系的成熟细胞的多能造血干细胞。在所述B细胞谱系中(即，在产生成熟B细胞的所述发育途径中)，祖细胞还包括：以免疫球蛋白基因重新排列及表现为特征的pro-B细胞及pre-B细胞。在所述T细胞及NK细胞系中，[例如：CD34(+)CD45RA(hi)CD7(+)及CD34(+)CD45RA(hi)Lin(-)CD10(+)细胞]，以及胸腺内祖细胞，包括：双阴性(相对于CD4及CD8)及双阳性胸腺细胞(T细胞谱系)及定型NK细胞祖细胞。
本发明的NK细胞可以来自包括所述细胞的任一来源。NK细胞存在于许多组织中，并且可以例如：从淋巴结、脾、肝、肺、肠、蜕膜中获得，并且还可以从iPS细胞或胚胎干细胞(ESC)获得。通常，含有异质淋巴细胞群的脐带血、外周血、流动的外周血及骨髓用于提供大量用于研究及临床应用的NK细胞。
NK细胞移植的临床经验显示，同种异体NK细胞可成功植入宿主，活性移植物对抗宿主疾病(GVHD)的一发生率较低。当已知用于移植的所述候选者的所述身份(例如，所述「对象」)时，可以确定例如：HLA匹配(兼容性)的参数并用作一选择标准。
因此，根据特定的数个实施例，所述NK细胞部分是来自一HLA单倍体相合或HLA错配的捐赠者。所述NK细胞的捐赠者可以是相关或不相关的捐赠者。
在数个具体的实施例中，选择用于体外扩增的数个NK细胞，所述NK细胞来自数个捐赠者4个第一类HLA中的至少2个(第1类等位基因的HLA-A及HLA-B基因位的一以DNA中等分辨率为基准的第1类分型)，或4个第一类HLA中的3个(第1类等位基因的HLA-A及HLA-B基因位的一以DNA中等分辨率为基准的第1类分型)，或4个第一类HLA中的至少3个(第1类等位基因的HLA-A及HLA-B基因位的一以DNA中等分辨率为基准的第1类分型)基因位与所述对象。根据某些实施例，所述分离术的单位来自具有4个第一类HLA中至少2个的捐赠者(第1类等位基因的HLA-A及HLA-B基因位的一以DNA中等分辨率为基准的第1类分型)及不存在(平均荧光强度(MFI)≤1000)受体(宿主、对象)捐赠者特异的抗HLA抗体。MFI值代表所述抗体的所述量或滴度。通常，通过一微量细胞毒性测定法在所述NK细胞上测定第一类HLA(或主要组织兼容性复合物，MHC)的抗原，使用抗血清用于特异性HLAs、细胞毒性的补体及用于识别杀死细胞的一染剂。通常，第二类HLA由所述混合淋巴细胞反应(MLR)决定，测量混合淋巴细胞群培养后的淋巴细胞的增殖。在富含B细胞的微细胞毒性测定中，可以通过B细胞抗血清鉴定数个HLA DR抗原。抗血清可以被特异性单克隆抗体取代。
其他常见用于收集血液部分的方法是分离术，其中全血捐赠者通常通过离心分离血液成分(例如：血浆、白细胞及红细胞)，抽出选定的成分用于操作(例如：培养白细胞部分)，并将剩余的成分返回给所述捐赠者。分离术具有大量提供特定血液部分(例如：白细胞部分)而不消耗流体(例如：血浆)及其他血液成分的所述优点。分离术可以基于连续流动离心，所述离心需要一低的体外体积，或者基于所述血液的间歇流动离心，所述间歇流动离心以循环的方式分离所述成分，但是通常更耗时，并且特征在于所述对象的血液的更大的体外体积。许多合适的分离术的装置是市售的。通常，分离术适用于从所述捐赠者的所述周边血分离的所述血液成分。
因此，根据本发明的一个实施例的一个方面，所述方法包括：在NK细胞部分中培养来自分离术的CD3去除的NK细胞部分。在数个具体的实施例中，所述NK细胞部分来自使用一PCS2或MCS8150的汉尼帝克血液分离机(良卫公司，波士顿，麻萨诸塞州)从数个捐赠者获得的分离单元。在某些实施例中，所述NK细胞部分来自从所述捐赠者的周边血获得的数个分离单元。
在一些实施例中，NK细胞可以从新鲜细胞群培养，而其他实施例中培养的NK细胞来自储存的细胞群(例如：冻存及解冻的数个细胞)或预先培养的细胞群。
可以处理淋巴细胞部分，例如：「血沉棕黄层」或数个分离术单元，以丰富或纯化或分离特定确定的细胞群。所述术语「纯化」及「分离」不需要绝对的纯度；相反的，这些是作为相关术语。因此，例如，一纯化的淋巴细胞群是其中所述特定的细胞，所述特定的细胞比其源组织中的那些细胞更丰富。可以富集的基本上纯的淋巴细胞的一制剂，使得所述所需的细胞占所述制剂中存在的所述总细胞数的至少50％。在某些实施例中，基本上纯的细胞群占所述制剂中的总细胞数的至少60％、至少70％、至少80％，至少85％、至少90％或至少95％或更多。
用于丰富及分离淋巴细胞的方法是本领域熟知的，并且可以基于所述有需要的群体选择合适的方法。例如：在一种方法中，通过去除红血球细胞使所述源材料富含淋巴细胞。基于密度，红血球细胞与淋巴细胞及其他细胞分离。然后，可以选择性地回收富含淋巴细胞的部分。淋巴细胞及其祖细胞也可以通过使用分离培养基的离心来富集，所述分离培养基可从各种商业来源获得的一标准淋巴细胞分离培养基(LSM)。或者，可以使用各种基于亲和力的方法富集的淋巴细胞/祖细胞。许多抗体介导的亲和力的制备方法是本领域已知的，例如：抗体缀合的磁珠。淋巴细胞富集也可以使用市售的制剂进行，以负选择不需要的细胞，例如：FICOLL-HYPAQUETM及其他以密度梯度培养基制成用于整体淋巴细胞、T细胞或NK细胞的所述富集。
从血液、骨髓、淋巴细胞制剂(例如：分离单元)或组织样本中选择NK细胞的数个方法在本领域中是已知的(参见例如：Litwin等人的美国专利5,770,387)(所述专利的全部内容通过引用并入本文)。通常在单核细胞分离后，最常用的是基于CD56+细胞分离及纯化的方案及非NK细胞的去除，例如：CD3+、CD34+、CD133+及其相似物。可以采用两种或更多种方案的组合来提供具有来自非NK污染物的更高纯度的NK细胞群。所述NK细胞制剂的所述纯度对于临床应用具有重要意义，因为非NK细胞(例如：T细胞及NKT细胞)有助于抗原特异性反应，例如：GVHD，损害NK细胞移植的所述潜在益处。用于分离NK细胞的市售试剂盒包括：一步法(例如，来自加利福尼亚州的奥本的Miltenyi生技公司的CD56微珠及CD56+、CD56+CD16+分离试剂盒)。以及多步骤程序，包括去除或部分去除CD3+或去除非NK细胞抗体识别及去除T细胞(例如：OKT-3)B细胞、干细胞、树突状细胞，单核细胞，粒细胞及红细胞。因此，在某些实施例中，所述NK细胞群选择或富集NK细胞，并且可以是一CD3去除的NK细胞部分。在一些实施例中，所述CD3去除的部分包括：CD56+CD16+CD3-细胞及/或CD56+CD16-CD3-。在数个具体的实施例中，选择用于培养的NK细胞包括：至少40％的CD56+/CD3-细胞、至少50％的CD56+/CD3-细胞、至少60％的CD56+/CD3-细胞、至少70％的CD56+/CD3-细胞、至少80％的CD56+/CD3-细胞或至少90％的CD56+/CD3-细胞。在一些实施例中，选择用于培养的所述NK细胞包括：40％至90％的CD56+/CD3-细胞、50％至80％的CD56+/CD3-细胞、55至75％的CD56+/CD3-细胞、60％至70％的CD56+/CD3-细胞。在一些实施例中，选择用于培养的NK细胞包含40至90％的CD56+/CD3-细胞。
根据表型选择NK细胞的方法包括但不限于免疫检测及FACS分析。在数个具体的实施例中，所述NK细胞部分通过免疫磁性选择的方式去除CD3细胞，例如：使用一CliniMACS T细胞去除组(Miltenyi生技公司的LS去除组(162-01))。
在数个进一步的实施例中，处理所述CD3去除的NK细胞部分以除去任何痕量红细胞。因此，在一些实施例中，在CD3细胞去除后，所述NK细胞部分在培养之前经历红血球(RBC)裂解。在数个具体的实施例中，使用氯化铵钾(ACK)缓冲液(赛默飞世尔科技公司的Gibco培养基)完成红细胞裂解。
可以通过短期或长期培养体外培养的NK细胞。本发明人已经证明在与用细胞因子培养但具有小于0.1毫摩尔的烟酰胺及/或其他烟酰胺部分的细胞的相比(参见PCT公开WO2011/080740)之下，NK细胞可以与生长因子及烟酰胺及/或其他烟酰胺部分一起培养少至7天，或多达3周导致增强的、优先的增殖及/或所述NK细胞的功能。在制备用于移植的一临床上合适的NK细胞部分时，期望能够提供显着的体外NK细胞扩增，同时保留所述扩增的NK细胞部分在治疗上有利的功能，而不需要长时间的治疗。
因此，在数个具体的实施例中，所述CD3去除的NK细胞部分在14至16天的时间内培养。
根据本发明的这个方面，通过在体外提供具有细胞增殖条件的NK细胞及用一烟酰胺部分体外培养NK细胞，可以影响NK细胞的体外培养，从而在体外扩增所述NK细胞群。
如本文所用，「培养」包括提供NK细胞维持所需的所述化学及物理条件(例如：温度、气体)及生长因子。在一个实施例中，培养NK细胞包括：向所述NK细胞提供NK细胞增殖的数个条件。可以支持NK细胞增殖的化学条件的数个示例包括但不限于：缓冲液、营养素、血清、维生素及抗生素以及通常在生长(即培养)培养基中提供的细胞因子及其他生长因子。在一个具体的实施例中，细胞增殖的条件包括：营养素、血清及细胞因子。在一个实施例中，所述NK培养基包括：最小基本培养基(MEM)，例如：MEMα(以色列的Bet HaEmek公司)及血清。在一些实施例中，所述血清以所述培养基的2至20％、5至15％或5至10％提供。在数个具体的实施例中，所述血清是人类血清，以10％的培养基提供。在一个具体实施例中，培养基是包含10％人类AB血清(Sigma-Aldrich、圣路易，密苏里州)的MEMα。适用于本发明的其他基质包括但不限于：Glascow培养基(Gibco、卡尔斯巴德、加利福尼亚州)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich、圣路易、密苏里州)或DMEM(Sigma-Aldrich、圣路易、密苏里州)。值得注意的是，许多培养基含有烟酰胺作为一维生素补充剂，例如：MEMα(8.19微摩尔的烟酰胺)、RPMI(8.19微摩尔的烟酰胺)、DMEM(32.78微摩尔的烟酰胺)及Glascow培养基(16.39微摩尔的烟酰胺)，然而，本发明的所述方法涉及外源添加的烟酰胺，所述外源添加的烟酰胺补充包括所述培养基配方或者由培养基成分浓度的整体调整产生的烟酰胺及/或烟酰胺部分。
根据本发明的一些实施例，在允许细胞增殖的条件下，培养所述NK细胞包括：向所述细胞提供营养物、血清及细胞因子。在一些实施例中，至少一种生长因子包括：细胞因子及/或趋化因子。细胞因子及其他生长因子通常以0.5至100奈克/毫升或1.0至80奈克/毫升，再通常以5至750奈克/毫升，又通常以5.0至50奈克/毫升的浓度提供(可考虑高达10倍这样的浓度)，例如：可从美国纽泽西州的Perpo Rocky Hill科技公司购得，并且是市售的。在一个实施例中，允许细胞增殖的条件包括：提供所述细胞因子白细胞介素15(IL-15)。在数个具体的实施例中，所述CD3去除的NK细胞与20奈克/毫升的IL-15一起培养。
此外，在这方面应当理解，连续发现新的细胞因子，其中一些细胞因子可用于本发明的NK细胞增殖的所述方法。对于将细胞引入(或重新引入)一人类对象的数个应用，通常优选使用无血清制剂，例如：用于淋巴细胞培养的AIM V.RTM无血清培养基或MARROWMAX.RTM骨髓培养基。此类培养基的配方及补充剂可从商业来源获得，例如英贾森命技术有限公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。所述培养物可以补充氨基酸、抗生素及/或细胞因子以促进最佳存活率、增殖、功能及/或存活。
根据一个实施例，所述NK细胞部分与营养物、血清、一细胞因子(例如：IL-15)及烟酰胺及/或烟酰胺部分一起培养。如本文所用，术语「烟酰胺部分」是指烟酰胺以及衍生自烟酰胺、衍生物、类似物及代谢物的产物，例如：NAD、NADH及NADPH，其能够有效且优先地增强NK细胞的增殖及/或活化。可以筛选烟酰胺衍生物、类似物及代谢物，并通过添加如下文所述维持的NK培养物评估它们对培养物中体外NK增值的影响，除了功能测定，例如：杀灭及运动测定，或在设计用于高通量测定的自动筛选方案在本领域中是已知的。
如本文所用，术语「烟酰胺类似物」是指已知在上述或类似测定中与烟酰胺类起到类似作用的任何分子。烟酰胺类似物的数个代表性示例可包括但不限于：苯甲酰胺、烟酰硫胺(烟酰胺的所述硫醇类似物)、烟酸及α-氨基-3-吲哚丙酸。
术语「烟酰胺衍生物」进一步关于烟酰胺本身或烟酰胺类似物的任何结构衍生物。这些衍生物的示例包括但不限于：取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺及烟酰硫代酰胺及N取代的烟酰胺及烟酰胺、3-乙酰基吡啶及烟酸钠。在本发明的一个具体实施例中，所述烟酰胺部分是烟酰胺。
适用于本发明一些实施例的烟酰胺或烟酰胺部分的浓度通常为约0.5毫摩尔至约50毫摩尔、约1.0毫摩尔至约25毫摩尔、约1.0毫摩尔至约25毫摩尔、约2.5毫摩尔至约10毫摩尔、约5.0毫摩尔至约10毫摩尔。基于这些烟酰胺浓度对增殖和NK细胞功能的影响，烟酰胺的示例性有效浓度可为约0.5毫摩尔至约15毫摩尔、1.0毫摩尔至10.0毫摩尔，通常为2.5毫摩尔或5.0毫摩尔。根据本发明的一些实施例，提供的烟酰胺的浓度范围(毫摩尔)为约0.5、约0.75、约1.0、约1.25、约1.5、约1.75、约2.0、约2.25、约2.5、约2.75、约3.0、约3.25、约3.5、约3.75、约4.0、约4.25、约4.5、约4.75、约5.0、约5.25、约5.5、约5.75、约6.0、约6.25、约6.5、约6.75、约7.0、约7.25、约7.5、约7.75、约8.0、约8.25、约8.5、约8.75、约9.0、约9.25、约9.5、约9.75、约10.0、约11.0、约12.0、约13.0、约14.0、约15.0、约16.0、约17.0、约18.0及约20.0毫摩尔。考虑了所有有效的中间浓度。在具体的实施例中，允许增殖的条件包括1.0至10.0毫末耳的烟酰胺。在其他实施例中，允许增殖的条件包括5.0毫摩尔烟酰胺。
烟酰胺和/或烟酰胺部分的合适浓度可根据NK增殖及/或活性的任何测定来确定，例如：细胞培养或功能。与具有小于0.1毫摩尔的烟酰胺的「控制」培养物相比，适当浓度的烟酰胺是在培养物中「增强」使用或导致NK细胞增殖及/或功能净增加的一浓度，并且在相同的测定及相似的培养条件下(暴露于烟酰胺的持续时间、暴露于烟酰胺的时间)，测试来自所述相同的NK细胞来源(例如：脐带血、骨髓或外周血制剂)，。
在一些研究中，通过培养物与营养素、血清、细胞因子及烟酰胺的体外扩增的纯化NK细胞不需要在所述培养期间补充所述培养基或操作，而其他研究提倡在NK细胞培养期间，以不同的间隔进行培养基的补充(「再喂养」)。在本发明的某些实施例中，所述NK细胞部分在培养期间「再次喂养」。因此，在数个具体实施方案中，制备用于移植的所述可移植的NK细胞部分包括：在体外培养(步骤(b))开始后8至10天用新鲜营养素、血清、IL-15及烟酰胺补充所述CD3去除的NK细胞部分。在一些实施例中，在所述体外培养开始后8至9天、在所述体外培养开始后9至10天，或在开始培养CD3去除的NK细胞后8至10天之间提供补充。在一些实施例中，补充(或「再喂养」)包括：移除约30至80％、约40至70％或约45至55％的所述细胞部分的培养基，并用具有所述相同成分及水平的营养物、血清、细胞因子(例如：IL-15)及烟酰胺作为去除培养基的新鲜培养基的一相似(例如：相等的)体积。在一些实施例中，补充(或「再喂养」)包括：去除所述NK细胞部分培养物的约50％的所述培养基，并用具有所述相同成分及营养水平、血清，细胞因子(例如：IL-15)及烟酰胺的一相似(例如：相等的)体积的新鲜培养基替换所移除的培养基。在其他数个实施例中，再喂养后的培养体积在所述NK细胞培养(「接种」)开始时达到所述原始培养体积的大约两倍。
可以使用多种方法及装置培养NK细胞群。培养装置的选择通常基于培养的所述规模及目的。细胞培养的放大优选地涉及使用专用装置。用于大规模、临床级NK细胞生产的装置详细描述于例如：Spanholtz等人(PLoS ONE 2010；5：e9221)及Sutlu等人(细胞疗法2010年，早期在线1至12)。在一些实施例中，在数个烧瓶中进行培养所述NK细胞部分(例如：所述方法的步骤(b)及/或(c))，细胞密度为每瓶100至4000×106个细胞。在数个具体的实施例中，在数个烧瓶中进行培养NK细胞部分(例如：所述体外培养及/或「再喂养」的开始)，细胞密度为每瓶200至300×106个细胞。在某些实施例中，所述烧瓶是包含一透气膜的烧瓶，例如：所述G-Rex培养装置(G-Rex 100M或封闭系统G-Rex MCS，WolfWilson，St Paul MN)。
应当理解，所述培养瓶中细胞的所述密度随着培养持续时间内细胞的增殖而增加。因此，在一些实施例中，在培养的扩增过程中，所述NK细胞部分的所述NK细胞以每瓶100至4000×106个细胞、每瓶100至4000×106个细胞、每瓶100至4000X 106个细胞、每瓶100至4000×106个细胞、每瓶200至3000×106个细胞、每瓶300至2000×106个细胞，每瓶400至1000×106个细胞、每瓶250至800×106个细胞、每瓶100至600×106个细胞或每瓶150至500×106个细胞的细胞密度培养。在数个具体的实施例中，在烧瓶中培养的持续时间内，NK细胞部分的NK细胞以每瓶100至3000×106个细胞的细胞密度培养。
可以在有或没有数个饲养细胞或一饲养细胞层的情况下培养所述NK细胞。无饲养层的体外培养对培养细胞(包括NK细胞)的临床应用非常有利。因此，根据一个实施例，在没有饲养层或数个饲养细胞的情况下培养NK细胞群。
在某些实施例中，在所述NK细胞开始培养(步骤(b))后14至16天从培养物中收获所述CD3去除的NK细胞。细胞的采集可以通过释放附着的细胞(例如：「刮」培养容器的表面)或通过细胞采集装置手动进行，细胞采集装置设计成有效地将细胞从其培养容器中洗涤并自动收集细胞。在具体的实施例中，通过细胞采集装置(例如：G-Rex MCS的收获装置，WolfWilson，St Paul MN)从培养容器中采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分。
在一些实施例中，从培养物中采集扩增的NK细胞部分，所述培养物从所述培养容器中除去大部分或几乎所有细胞。在其他实施例中，所述扩增的CD3去除的NK细胞部分可以在两个或更多个步骤中进行采集，允许未采集的细胞保持在培养物中直到稍后采集。在某些实施例中，以两个步骤采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，包括：采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第一部分，然后采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第二部分。在采集所述第一及第二部分之间可以以数个小时、数天或更长的间隔进行采集所述两个部分。采集的两个部分可包括：大致相等的所述培养物部分(例如：等量的所述培养的NK细胞)，或者其中一个部分可包括：比另一个所述培养的NK细胞更大的一部分。在某些实施例中，采集包括：在步骤(b)(培养开始)后约14天采集所述扩增的CD3去除的NK细胞的一第一部分，并在约2天后采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第二部分。在一个具体实施方案中，在所述离体培养开始后14天采集所述第一部分，并在所述离体培养开始后16天采集所述第二部分。
在某些实施例中，所述第一及第二部分大致相等，即，所述第一(采集的)部分包括约50％的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分以及所述第二(采集的)部分包括所述扩增的CD3去除的NK细胞部分的所述剩余部分。
为了制备用于移植的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，需要洗涤培养基中的所述收获的细胞，评估关键参数并在临床合理的时间内将体积调节至适于输注的浓度。
采集后，可以使用一封闭系统的一自动化装置手动洗涤所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，或者优选用于临床应用。洗涤的细胞可以用一输注溶液进行重构(例如：一种示例性输注溶液包含8％毫克/公升的HSA及6.8％毫克/公升的葡聚糖-40)。在一些实施例中，重构在一封闭系统中进行。在一些实施例中，筛选所述输注溶液以适合与本发明的方法及组合物一起使用。用于选择合适的输注溶液的示例性标准包括：安全性测试，所述安全性测试表明没有细菌、酵母或霉菌生长、内毒素含量小于0.5活性单位/毫升，并且具有一透明的、无外来颗粒的外观。
如本文所用，术语「繁殖」或「增殖」是指生长，例如：细胞生长及细胞数量的增殖。如本文所用，繁殖及增殖涉及在所述孵育期间累积的NK细胞数量增加。显示所述NK细胞表型的细胞在体外或体内的繁殖是其刺激后的已知现象，例如：IL-2、人类疱疹病毒第四型转化的淋巴母细胞系等。
本领域熟知用于细胞增殖的测定，包括但不限于：克隆形成测定，所述克隆形成测定中的细胞以低密度接种及生长，并计数菌落，机械测定〔流式细胞术(例如：FACSTM)、碘化丙锭〕机械地测量细胞的数量，代谢测定(例如：掺入四唑盐，例如：XTT，MTT等)测量活细胞的数量，直接增殖测定(例如：溴脱氧尿苷，胸苷掺入及其相似物)测量生长种群的DNA合成。在一个实施例中，在培养物中接种NK细胞后的一预定时间，测量用于根据本发明的一有效浓度的烟酰胺及/或其他烟酰胺部分培养的NK细胞群的细胞增殖(例如：约10小时、12小时、约1、2、3、4、5、6、7天，约1、2、3、4、5周、2个月或更长的时间)通过FACS分析，使用抗CD56及抗CD3的标记物识别及定量所述群体中的CD56+CD3-NK细胞部分。与培养前的所述原始NK细胞部分相比，NK细胞的增殖可表示为NK细胞的倍数增加(例如：扩增或倍数扩增)。在一些实施例中，暴露于根据本发明的有效浓度的烟酰胺的NK细胞群具有至少2倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150倍、至少250倍、及至少500倍或更多的NK细胞群的倍数增加，在约5天、约7天、约12天、约14天、约16天、约18天、约21天、约25天、约30天或更多天之后培养。在另一个实施例中，通过FACSTM测定暴露于有效浓度的烟酰胺的NK细胞群的所述倍数扩增为至少约1.2倍、约1.3倍、约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍，约2.5倍，约2.75倍、约3.0倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍，比在相同条件下培养的NK细胞具有少于0.1毫摩尔的烟酰胺及/或其他烟酰胺部分。
如本文所用，术语「功能」或「NK细胞功能」是指归属于NK细胞的任何生物学功能。NK细胞功能的一非限制性列表包括例如：细胞毒性，细胞凋亡诱导，细胞运动，定向迁移，细胞因子及其他细胞信号反应，产生及分泌细胞因子/趋化因子，活化及抑制体外细胞表面分子的表达，移植宿主中的细胞归巢及植入(体内保留)，以及体内疾病或疾病过程的改变。在一些实施例中，通过暴露于烟酰胺及/或其他烟酰胺部分而增强的NK细胞的功能包括至少一种：CD62L表面标记物的升高的表现、升高的迁移反应及NK细胞的更高的细胞毒活性以及升高的归巢及输注的NK细胞的体内保留。
粘附及迁移分子例如：CD62L、CXCR-4、CD49e及其相似物的分析对于归巢/植入及移植中细胞的保留是重要的，而且是本领域熟知的。可以通过例如：流式细胞术、免疫检测、定量cDNA扩增、杂交及其相似物测定一细胞中的CD62L表达。在一个实施例中，通过将所述细胞暴露于一荧光标记的特异性抗人类CD62L单克隆抗体〔例如：来自BioLegend(圣地亚哥，加利福尼亚洲，美国)的PE，Cat No.304806的CD62L〕，以及通过荧光激活细胞分选(FACS)对细胞进行分选。
细胞迁移的测定是本领域熟知的。可以通过例如：迁移测定或间隙闭合测定来测定细胞的迁移。在诸如所述双室技术的迁移分析中，细胞通过一屏障(例如：过滤器)与一刺激物分离，并且以特定的间隔，通过计数来自所述原点的细胞损失、跨越所述屏障的细胞积聚或两者来检测细胞的迁移。在所述间隙闭合测定中，将细胞置于一可见间隙的所述外围(刻划的琼脂平板、围绕一圆圈等)并用一刺激物孵育。通过细胞计数、免疫检测、显微镜/形态计量学等可视化的细胞运动所应用的细胞之间的空间的闭合，以响应刺激。在一个实施例中，响应于SDF(250奈克/毫升)，通过所述「TranswellTM」迁移测定法测定不同NK细胞群的迁移潜力。
用于归巢及体内保留输注或移植细胞的测定法是本领域熟知的。如本文所用，所述术语「归巢」是指输注或移植的细胞在一宿主的目标器官中到达并存活的能力。例如：NK细胞的目标器官可以是所述淋巴组织，肝细胞的目标器官可以是肝实质、肺泡细胞的目标器官可以是肺实质等。如本文所用，术语「体内保留」(也称为「植入」)是指输注或移植的细胞在目标器官中增殖并保持存活的能力。用于测定所述移植的NK细胞的归巢及体内保留的动物模型包括但不限于：免疫缺陷的小型哺乳动物(例如：SCID及IL2Rγnull小鼠及其相似物)。所述SCID-Hu小鼠模型使用移植含有人类胎儿胸腺及肝组织或胎儿BM组织的C.B-17scid/scid(SCID)小鼠，并且提供用于评估移植的人类NK细胞保留及治疗潜力的一合适模型。也可以在数个人类宿主对象中评估移植细胞的归巢及体内保留。在一个实施例中，在经照射的NOD/SCID小鼠中测定归巢及体内保留，例如：输注约15×104个、约15×105个、约15×106个、约15×107个或更多的人类NK细胞；根据本发明，所述人类NK细胞用一有效浓度的烟酰胺培养，并且在输血后的一预定时间牺牲(例如：再输注后的约5小时、10小时、12小时，1、2、3、4、5、6、7天，1、2、3、4、5周，2个月、3个月、4个月或更长地时间)。在牺牲小鼠后，通过FACS评估脾、骨髓、外周血及其他器官的样品，所述FACS使用人类特异性抗体存在的人类NK细胞(CD56+CD45+)。体内保留的百分比表示为显示所述捐赠者表型的器官的细胞百分比(例如：人类细胞的CD45)。
细胞毒性测定(「细胞杀伤」)是本领域熟知的。用于重新定向杀伤测定的合适目标细胞的数个示例是癌细胞系、原发性癌细胞、实体瘤细胞、白血病细胞或病毒感染的细胞。特别地，可以使用K562、BL-2、colo250及原代白血病细胞，但是可以使用许多其他细胞类型中的任何一种并且是本领域公知的(参见，例如：Sivori等人(1997)J.Exp.Med.186：1129-1136；Vitale等人(1998)J.Exp.Med.187：2065-2072；Pessino等人(1998)J.Exp.Med.188：953-960；Neri等人(2001)Clin.Diag.Lab.Immun.8：1131-1135)。通过细胞存活率测定(例如：染剂排除、铬释放、CFSE)，代谢测定(例如：四唑盐)及直接观察来评估细胞杀伤。
一旦洗涤并浓缩所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，就可以评估扩增的部分在移植中的适用性。选择合适的可移植的NK细胞部分的典型标准包括：CD56+/CD3-细胞的百分比、细胞存活率、CD3+细胞部分的大小、内毒素的存在、微生物污染及其相似物。应注意，所述扩增的NK细胞部分的所述CD56+、CD3+及CD56+/CD3-细胞含量对于所述移植的NK细胞的成功植入是至关重要的，以及因此是进行体外扩增的一中心标准。因此，在数个具体实施例中，通过本发明方法的步骤(e)产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞级分的特征在于：约60％至约90％的CD56+/CD3-细胞，约68％至约85％的CD56+/CD3-细胞，约72％至约82％CD56+/CD3-细胞及约76至79％的CD56+/CD3-细胞。在一个实施例中，通过本发明方法的步骤(e)产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的特征在于：至少60％、至少64％、至少70％、至少74％、至少80％或至少85％的CD56+/CD3-细胞。在另一个实施例中，通过本发明方法的步骤(e)产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的特征在于：至少70％的CD56+/CD3-细胞。上文详细描述了根据CD56及CD3细胞标记物识别NK细胞的表型。
用于移植的细胞部分中同种异体T(CD3+)细胞的所述存在是有问题的，因为它们强烈增加GVHD的所述风险。因此，可移植的扩增的NK细胞部分的适合性的一重要参数是CD3+细胞的所述量或部分。因此，在特定实施例中，通过本发明方法产生的经洗涤和浓缩的扩增的NK细胞部分的特征在于：所述患者每公斤重量的CD3+细胞数在1.0×105个及1.0×106个之间。在进一步的实施例中，通过本发明的方法产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的特征在于：患者每公斤重量的CD3+细胞数少于7.0×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于6.5×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于6.0×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于5.5×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于5.0×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于4.5×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于4.0×105个、患者每公斤重量的CD3+细胞数少于3.5×105个或患者每公斤重量的CD3+细胞数少于3.0×105个。在一个实施例中，通过本发明的方法产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的特征在于：患者每公斤重量的CD3+细胞数少于7.0×105个。值得注意的是，通过本发明的方法产生的洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的CD3+部分，部分及含量的计算，以每公斤患者的重量表示，涉及移植的CD3+细胞的总量(例如：输注所述患者(即对象)。通过本发明方法的步骤(e)产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分中的CD3+细胞的所述部分、一部分或量也可以表示为CD56+/CD3-与CD3+细胞的一比率，或作为一体积(例如：CD3+细胞/毫升)或通过本发明的方法产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的重量部分(CD3+细胞/100克)。上文详细描述了CD3+细胞标记物的识别。
通过监测内毒素含量及细菌、真菌、病毒及支原体污染的存在，确保用于移植的扩增的CD3去除的NK细胞部分的无菌性及安全性。在一些实施例中，选择用于移植的扩增的NK细胞部分在洗涤及浓缩后具有不超过5活性单位/毫升的内毒素含量。在一些实施例中，用于移植的扩增的NK细胞部分的特征在于：在洗涤及浓缩后不含微生物(例如：革兰氏阳性微生物)。
在一些实施例中，适于移植的扩增的NK细胞部分的特征在于：存活率为约50％至约85％。在一些实施例中，扩增的NK细胞部分具有约55％、约60％、约63％、约65％、约68％、约70％、约75％、约78％、约80％，约82％、约选择83％、约84％至约85％的存活率或更高。在进一步的实施例中，选择用于体外扩增的NK细胞部分具有至少70％的通孔细胞。在另一个实施例中，适于移植的扩增的NK细胞部分的特征在于：洗涤及浓缩后至少70％的活细胞。在进一步的实施例中，适于移植的扩增的NK细胞部分具有至少85％的存活的细胞。
如本文所用，术语「存活率」是指活细胞及非活细胞之间的区别。细胞存活可以通过形态学变化或通过排除某些染剂或其他染剂的摄取集保留推断的膜渗透性及/或生理状态的变化来判断。细胞存活评估在本领域中是公知的，包括但不限于：测定(例如：染剂排除，铬释放)、代谢测定(例如：四唑盐)集直接观察。(Coder，D.，细胞计数中的现行方案，1997，John Wiley and Sons，Inc.，Unit 9.2,9.2.1-9.2.14)。
在一些实施例中，在NK细胞培养之前、在NK细胞培养期间、在采集第一及/或第二部分之后及/或在所述扩增的NK细胞部分的洗涤及浓缩之后，监测在样本中的CD56+/CD3-细胞部分、CD3+细胞部分、存活率、内毒素及微生物含量的所述参数。在一些实施例中，所述样品是从所述分离术单位中抽取，抽取的时机是在处理(100×106个细胞)，之前、柱后(CD3去除)预培养样品(10×106个细胞)、扩增后预洗涤(10毫升的样品)、在所述最终扩增、洗涤及浓缩的NK细胞产物(10×106个细胞)或其任何组合的第一次输注当天(第0天)及在所述最终扩增、洗涤及浓缩的NK细胞产物(10×106个细胞)或其任何组合的第二次输注当天(第2+天)。
因此，根据数个具体的实施例，通过本发明的方法产生的经洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分的特征在于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
满足上述标准的扩增的CD3去除的NK细胞部分可用于移植到有需要的对象(例如：患者)中。用于体外扩增(培养)、选择及制备上文描述的用于移植的NK细胞部分的任何方法，以及单独或以各种组合取得的它们的每个实施例可用于影响移植扩增的NK细胞部分的方法，如本节及后续章节所述。
因此，在一些实施例中，提供了一可移植的NK细胞部分，所述可移植的NK细胞部分根据本文所述用于制备一可移植的NK细胞部分的任何方法制备。在数个具体的实施例中，可移植的NK细胞部分的特征在于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
在一些实施例中，在洗涤及浓缩后，将可移植的NK细胞部分转移至容器(例如：用于转移至移植(输注)的所述位点)。在一些实施例中，所述容器是一培养袋。需要由惰性材料构成的培养袋，具有高透气性及水分流失率低、柔韧性及高透光性。在数个具体的实施例中，所述可移植的扩增的NK细胞部分被提供在一氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋中。
在其他实施例中，提供了可移植的人类NK细胞部分，其特征在于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
本发明的扩增的NK细胞部分可用于移植到有需要的对象中。
如本文所用，术语「移植」，在细胞疗法、过继转移、细胞免疫疗法及其相似方法的背景下，是指向对象施用具有预期治疗效果的细胞，优选施用于需要其的受试者，例如：作为一患者对一疾病或病症的治疗。由于这种细胞疗法包括：通过血管连接将所述治疗细胞部分引入对象体内，如本文所用，NK细胞的「移植」及「施用」等同于「输注」。通常，将治疗性细胞部分静脉滴注到所述对象中，例如：通过一中心静脉导管(例如：Hickman导管)。治疗细胞部分输注到对象中的速率可以通过一泵控制，或无辅助地由重力供给并且通过细胞系及入口导管之间的高度差来调节。在一些实施例中，通过重力供给静脉内移植(输注、施用)的扩增的NK细胞部分，无需一泵或数个泵及/或不使用数个过滤器。
在一些实施例中，需要移植的对象患有一血液疾病。在一些实施例中，所数对象患有一血液恶性肿瘤。在具体的实施例中，本文所述的扩增的NK细胞部分或方法治疗的血液恶性肿瘤是一多发性骨髓瘤及非霍奇金淋巴瘤。
因此，在一些实施例中，提供了治疗有此需要的对象的血液疾病的方法，所述方法包括：
(a)向所述对象施用一抗癌单克隆抗体；；
(b)向所述对象施用至少一种免疫抑制剂；
(c)将一扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部份移植到所述对象中，其中所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞部份已经通过体外培养扩增，所述离体培养包含：营养素、血清、IL-15及烟酰胺的用量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；以及
(d)向所述对象施用IL-2，从而治疗所述对象中的所述血液疾病。
如本文所用，「对象」或「患者」可以是任何哺乳动物，例如：人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、骆驼。在一个具体实施例中，所述对象是人类。在进一步的数个实施例中，所述对象是人类以及所述NK细胞部分是人类NK细胞部分。
如本文所用，「有需要的对象」是需要移植、输注、注入或植入本发明的所述NK细胞部分以治疗或改善一疾病、病症或病况的对象。在一个实施例中，所述对象已经(已被诊断患有)或患有一血液疾病。在一些实施例中，所述血液疾病是一细胞增殖性疾病。在其他实施例中，所述血液疾病是一血液恶性肿瘤。
如本文所用，术语「风险」或「概率」是指一发生的可能性。在一些实施例中，一个体发生的风险或概率(例如：NK细胞部分的植入或非植入、非复发死亡率及其相似物)是指通过接受治疗的组别与未经治疗的组别之间的比较数据计算的风险。在一些实施例中，增加或降低的风险或概率反映了治疗组及对照组之间关于所考虑的结果的所述差异。在一些实施例中，一特别发生或病症的风险或概率的增加或减少仅是相对的，并且不以数值表示。
如本文所用，术语「细胞增殖性病症」是指其中细胞的不受调节或异常的生长或两者，可导致不希望的病症或疾病的发展的病症，所述病症可能是或可能不是癌性的。本发明的示例性细胞增殖性疾病包括：细胞分裂失调的多种病症。如本文所用的术语「快速分裂的细胞」定义为以超过或大于相同组织内相邻或并列的细胞之间预期或观察到的速率分裂的任何细胞。一细胞增殖性疾病包括：癌前病变或癌症前病症。细胞增殖性疾病包括：癌症。在数个具体的实施例中，本文提供的方法用于治疗或减轻癌症的症状。所述术语「癌症」包括：实体瘤，以及血液肿瘤及/或恶性肿瘤。在数个具体的实施例中，血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施例中，本发明的方法及组合物及试剂盒可用于治疗所有年龄组的受试者。在数个具体的实施例中，对象或患者年龄大于18岁且小于70岁。
在一些实施例中，有需要的对象可具有多发性骨髓瘤。在进一步的实施例中，多发性骨髓瘤是(MM)，其特征在于以下标准中的至少一种：
(a)第一次自体干细胞移植后2至18个月复发的疾病；
(b)异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病且没有活性移植物对抗宿主疾病(GVHD)的证据；
(c)接受至少两种治疗方法后的复发/难治疗的疾病，所述治疗方法包含一蛋白酶体抑制剂及一免疫调节药物(IMiD)；
(d)血清的IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白(M蛋白)大于或等于0.5克/分公升；以及
(e)尿液M蛋白大于或等于200毫克/24次收集量。
在一些实施例中，多发性骨髓瘤的特征还在于：血清的IgE骨髓瘤蛋白(M蛋白)大于或等于0.5克/分公升，并且在NK治疗开始前不少于4周进行了血浆置换。在一些实施例中，有需要的对象患有多发性骨髓瘤，其特征在于多于一种本文所述的标准。
有需要的对象可以患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些实施例中，非霍奇金淋巴瘤是CD20阳性的B细胞NHL，通过流式细胞术或免疫组织化学确认CD20的表现。在数个进一步的实施例中，NHL的特征在于以下特征中的至少一个：(a)传统治疗失败后的复发/难治疗的疾病、(b)自体干细胞移植后至少60天复发的疾病、(c)异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病且没有活性移植物对抗宿主疾病的证据，以及(d)直径大于或等于1.5公分的可测量的疾病。在一些实施例中，有需要的对象具有NHL，其特征在于多于一种本文所述的标准。
在一些实施例中，可以根据以下标准进一步定义有需要的对象：Karnofsky指数的一表现评分为至少60％，并且适当的器官功能定义为：a、心脏功能：超声心动图，放射性核素扫描或心脏MRI检查左心室射血分数(LVEF)≥40％；b、肺部功能：室内空气氧饱和度至少为90％，肺功能检查显示FVC及FEV1≥50％的预测年龄及预测cDLCO≥50％；C、肾功能：肌酐清除率测试(通过Cockcroft-Gault方程)≥40毫升/分钟或肌酐≤1.5毫克/分公升；d、肝功能：总血清胆红素≤1.5倍上限的机构标准，肝转氨酶(ALT及AST)＜3倍机构正常范围的上限；血液学：总白血球(WBC)计数≥3000个/微升，绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1000个/微升，血小板计数≥75,000个/微升，血红蛋白≥8.0克/分公升(如果异常是由与疾病相关的骨髓涉及所引起，则可以免除)，及f、钙(仅适用于多发性骨髓瘤患者)：在入组治疗前2周内校正钙＜11.5毫克/分公升。
在一些实施例中，符合条件的对象应该能够在输注NAM-NK细胞之前至少3天停用泼尼松或其他免疫抑制药物(不包括制备方案的预先药物治疗)。具有潜在生育能力的性活跃女性及具有潜在生育能力的伴侣的男性可能被要求同意在治疗期间及治疗结束后4个月内使用有效的避孕措施。
在一些实施例中，可以排除对以下任何一种的治疗的考虑的对象：
1.高滴度的捐赠者特异性抗HLA抗体(MFI＞1000)；
2.活跃、未经治疗的中枢神经系统受累；
3.慢性淋巴细胞白血病(CLL/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，或高级别淋巴瘤(勃奇氏淋巴瘤/淋巴母细胞淋巴瘤)；
4.怀孕或哺乳；
5.对于患有多发性骨髓瘤的对象：有可能生育的妇女在开始治疗后14天内(在抗癌抗体施用开始前24小时)进行一阴性血清或尿液妊娠试验(最低灵敏度为25国际单位/升或相当于HCG的单位)；
6.标记的QT/QTc间隔的基线延长(例如：证明QTc间隔大于500毫秒)；
7.II级或更高级别的纽约心脏病学会功能分类标准(附录III)或严重的心律失常，可能增加细胞因子治疗的心脏并发症风险(例如：室性心动过速、频繁的心室异位或需要慢性治疗的室上性快速性心律失常)；
8.需要免疫抑制治疗的活动性自身免疫性疾病；
9.目前接受慢性药物治疗的严重哮喘病史(仅需吸入类固醇的轻度哮喘病史)；
10.筛查胸部X光或胸部CT扫描时时或进行性肺部浸润〔除非由肺科专家进行研究清除。在适当治疗1周后(假定或记录的真菌感染4周)，感染引起的浸润必须稳定/改善(相关的临床改善)〕；
11.主动且不受控制的细菌、真菌或病毒感染：所有先前的感染必须在最佳治疗后得到解决；
12.已知对本发明方法中使用的任何治疗剂的超敏反应；
13.仅适用于MM患者：在给予本发明的NK细胞部分之前2周内进行的放设置疗，4周内的手术或3周内的化疗(对于美法仑或单克隆抗体为6周)；
14.在开始用NK细胞部分治疗前14天内接受研究药物；
在一些实施例中，根据以下标准选择NK细胞的捐赠者(例如：用于识别HLA单倍体相合或HLA错配、相关或非相关的分离术的候选物)：
1.HLA单倍体相合或错配的相关捐赠者/受体，匹配(至少2/4第1类等位基因)的A及B基因位的一以最小的DNA中等分辨率为基准的第1类分型；以及不存在的对抗所述选择的捐赠者的抗HLA抗体的受体(平均荧光强度MFI≤1000)。；
2.12至70岁：应优先考虑年龄(＜35岁)，然后进行HLA匹配(单倍体相合及如果没有，然后完全不匹配的捐赠者)；
3.体重至少40公斤；
4.一般来说，由一评估医疗服务的提供者确定的良好健康状况；
5.充分的器官功能定义为：血液学：血红蛋白、白细胞、血小板在正常测试范围的上限和下限的10％(基于性别的血红蛋白)，肝脏：ALT＜2倍正常上限级肾脏：血清肌酐＜1.8毫克/分公升；
6.完成捐赠者的传染病筛查小组，包括：CMV抗体、B型肝炎表面抗原、B型肝炎核心抗体、C型肝炎抗体、HIV聚合酶连锁反应、HIV1/2抗体，HTLVA1/2抗体、快速血浆(RPR)密螺旋体、克氏锥虫(T Cruzi)，通过NAT、NAT及WNV(西尼罗河病毒)通过NAT或按照现在的小组对HCV进行HCV检测-必须对HIV及活动性B型肝炎呈阴性；
7.未怀孕-有生育潜力的女性必须在分离术后7天内进行阴性妊娠试验；
8.能够并愿意接受分离术；
9.自愿书面同意(如果捐赠者＜18岁，则使用同意书)。
在一些实施例中，有需要的对象接受骨髓清除疗法或调理方案。在数个具体的实施例中，在移植或给予本发明的组合物之前、同时及之后，对所述对象进行清髓治疗及调理方案。所述骨髓清除疗法或调理方案可包括：全身照射(TBI)、免疫疗法及化学疗法吉/或免疫抑制疗法。
为了促进肿瘤标记及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在一些实施例中，可以将疾病特异性单克隆抗体施用于有需要的对象。因此，在一些实施例中，其中血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤，将一种或多种MM特异性单克隆抗体(例如：埃罗妥珠单克隆抗体)给予有需要的对象。可用于本发明方法的埃罗妥珠单克隆抗体的示例性剂量是所述对象(患者)的10毫克/公斤重量。其中，血液恶性肿瘤是NHL，将一种或多种NHL特异性单克隆抗体(例如：利妥昔单抗)给予有需要的对象。可用于本发明方法的利妥昔单抗的示例性剂量是所述对象(患者)的375毫克/平方公尺。在数个具体的实施例中，疾病特异性单克隆抗体治疗包括以三个剂量施用单克隆抗体：在给予(输注、移植)所述NK细胞部分前10天的第一剂量，在NK细胞部分施用前3天的第二剂量(输注、移植)及第三剂量，以及施用后11天的最后剂量(输注、移植)，以及在一些实施例中，在给予(输注、移植)最终(第二)的所述NK细胞部分后约1周。在某些实施例中，所述疾病特异性单克隆抗体在所述第一剂量前9至11天、所述第一剂量前3天及所述第一剂量扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分后11天施用。
遵循输注，监测反应及单克隆抗体施用毒性的标准指南。埃罗妥珠单克隆抗体通常与输注前的一给药方案一起施用，包括：地塞米松、一H1阻滞剂，例如：二苯海拉明、一H2阻断剂，例如：雷尼替丁及对乙酰氨基酚，然后开始输注。
在一些实施例中，有需要的对象在施用(输注、移植)所述NK细胞部分之前接受免疫抑制治疗的一制备方案。合适的免疫抑制剂包括但不限于：烷化剂、嘌呤类似物、抗代谢物及其相似物。一些免疫抑制剂也被认为是化学治疗免疫抑制剂。在数个具体的实施例中，免疫抑制疗法包括：给予环磷酰胺及氟达拉滨。可用于本发明方法的环磷酰胺的一示例性剂量是所述对象(患者)的40毫克/公斤重量，并且可用于本发明方法的氟达拉滨的示例性剂量是所述对象(患者)的25毫克/平方公尺。在数个具体的实施例中，在施用(移植、输注)扩增的CD3去除的HLA-单倍体相合或HLA-错配的NK细胞之前5天施用环磷酰胺，并且在施用(移植，输注)所述扩增的CD3去除的HLA-单倍体相合或HLA-错配的NK细胞的前第5天，第4天和第3天的每一天施用氟达拉滨。或者，可以调节氟达拉滨及环磷酰胺的施用，使得在开始给予所述NK细胞部分之前2或3天完成所述最后一剂的所述免疫抑制剂。
根据本发明的数个方法，在一些实施例中，将NK细胞部分以两个剂量施用于有需要的对象中。在数个具体的实施例中，施用NK细胞部分包括：施用一第一剂量的所述扩增的CD3去除的HLA-单倍体相合或HLA-错配的所述NK细胞部分，两天后施用一第二剂量的所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞部分。
在一些实施例中，用于施用于对象(患者)的所述NK细胞部分包含：1×107/公斤至5×108/公斤，2×107/公斤至2×108/公斤，5×107/公斤至1×108/公斤，或2×107/公斤至2×107/公斤以及5×107/公斤扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞。在一些实施例中，结合的所述两种剂量包括总量为2×107/公斤至2×108/公斤的扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞。在一些实施例中，NK细胞部分的所述第一剂量及第二剂量各自包含1×107/公斤扩增的CD3去除的单倍体相和或错配的NK细胞，总剂量为2×107/公斤扩增的CD3去除的单倍相合或错配的NK细胞。在其他实施例中，所述NK细胞步分的所述第一剂量及所述第二剂量各自包含5×107/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，总剂量为1×108/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞步分的所述第一剂量及所述第二剂量各自包含：1×108/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞，总剂量为2×108/公斤扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞。
NK细胞部分的施用通常作为住院手术进行。本文所述的NK细胞部分的施用是通过输注进行的，并且在特定实施例中，NK细胞部分在可移植的NK细胞部分到达后1小时内输注到所述对象(患者)中，并且在洗涤及浓缩的扩增的CD3去除的NK细胞部分的最终产物释放后不迟于10小时。在数个具体的实施例中，洗涤及浓缩的扩增的CD3去除的NK细胞部分在室温下保持直至施用，并且在使用前不冷藏。
因此，在一些实施例中，所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞部分在提供用于移植的NK细胞部分后不超过1小时以及在NK细胞部分的最终产物释放后不超过10小时，施用于所述对象。在一些实施例中，所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分通过静脉内输注而不使用过滤器或泵施用于所述对象，每次输注的持续时间不少于15分钟且不多于60分钟。
在一些实施例中，有需要的对象在施用NK细胞部分后接受白细胞介素2(IL-2)的支持方案。
在一些实施例中，在初始NK细胞部分施用当天(移植)，以6个百万单位剂量(对于体重＜45公斤，所述IL-2剂量为3百万单位/平方公尺的患者)皮下(SC)施用IL-2；在第二次NK细胞部分施用(移植、输注)当天及第二次NK细胞部分施用(移植、输注)后两天，总共3次施用(移植、输注)。在一些实施例中，在所述NAM-NK细胞输注的第几天，在NAM-NK细胞之后不短于4小时施用IL-2。在某些实施例中，所述两种IL-2剂量作为NK细胞输注的住院治疗的一部分施用。所述第三种IL-2剂量可以在门诊病人的情况下施用。因此，在数个具体的实施例中，Il-2的施用包括：在输注扩增的CD3去除的NK细胞后施用6X106单位的IL-2：
(i)在输注所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或错配的NK细胞的当天，及
(ii)输注所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞后两天，及
(iii)输注所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞后四天。
此外，如果患者在所述第一次或第二次剂量下，经历了2级或更高的IL-2输注相关毒性，则IL-2的剂量可以保持长达48小时。如果毒性在48小时内达到1级或更好，可给予IL-2所有计划的剂量；但是，剩余剂量的施用应至少相隔24小时。
在一些实施例中，数个对象可以接受以下任何或所有：输注支持物(例如：二苯海拉明或右旋氯苯那敏、氢化可的松及对乙酰氨基酚)，支持性细胞因子(例如：G-CSF)，根据需要的血液制品、抗病毒、抗细菌、PCP及/或真菌预防、CMV、EBV及HHV6监测及根据需要的IV免疫球蛋白。
在一些实施例中，数个对象接受任何或所有血液疾病的额外治疗。所述治疗可以是选自免疫抑制治疗、化疗及放射治疗的治疗。
因此，在一些实施例中，提供了治疗有需要的对象的血液疾病的一方法，所述方法包括：
(i)获得与一对象为HLA单倍体相合或HLA错配的一CD3去除的NK细胞部分；
(ii)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养所述CD3去除的NK细胞部分，其中所述多个条件包括提供用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺；
(iii)在步骤(b)后8至10天用新鲜的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺补充给所述CD3的NK细胞部分，以生产一扩增的CD3去除的NK细胞部分；
(iv)在步骤(b)后14至16天采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分；
及
(v)洗涤并浓缩步骤(d)的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，
从而生产一可移植的NK细胞部分。
(vi)向所述对象施用一抗癌单克隆抗体；
(vii)向所述对象施用至少一种免疫抑制剂；
(viii)将(v)的扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分移植到有需要的对象中；及
(ix)向所述对象施用IL-2，
从而治疗所述对象的血液疾病。
在一些实施例中，将NK细胞部分输注溶液储存在袋中直至在8至20℃下使用(例如：移植、输注)。在一些具体实施例中，所述NK细胞部分的移植(施用、输注)之前在NK细胞移植当天对有需要的对象进行安全性评估，通常包括：身体检查、CBC、血液化学(例如：至少血清肌酐、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT及镁)，生命体征：体重、体温、血压、脉搏及呼吸频率，以及伴随药物的给药，包括：红细胞及血小板输注。
将所述扩增的NK细胞部分输注到有需要的对象中通常通过经由患者的中心静脉导管输注来进行，受到个体部位实践的限制。
本发明的治疗血液疾病的方法可用于治疗血液恶性肿瘤，包括但不限于：MM和NHL。如本文所用，术语「治疗血液疾病」或「治疗血液恶性肿瘤」是指减轻血液疾病的症状或体征。在一些实施例中，根据但不限于：评估症状随时间的减少、临床参数的改善、住院治疗的减少即复发或死亡风险的降低来评估治疗血液疾病或血液恶性肿瘤。
在一些实施例中，与输注未根据本文所述的方法培养和/或施用的NK细胞相比，本文所述的扩增的NK细胞部分的输注增加了输注的NK细胞在体内成功扩增的可能性。在一些实施例中，在输注后第7天及第14天测量体内扩增的所述成功率。
在其他实施例中，与输注未根据本文所述方法培养及/或施用的NK细胞相比，本文所述的扩增的NK细胞部分的输注增加了对象外周血中NK细胞的功能。在一些实施例中，在输注后第7天及第14天测量所述NK细胞的功能。
根据本发明方法的一些实施例，当输注未培养及/或施用的NK细胞时，输注本文所述所述的方法的扩增的NK细胞部分增加了NK细胞部分的有利于疾病反应输注的可能性。在一些实施例中，在第28天即输注后一年测量NK细胞功能。在具体的实施例中，血液恶性肿瘤是NHL，并且NHL的疾病应答标准根据国际工作组对NHL的反应标准进行评估(详情参见Cheson等人，JClin Oncol 2014；32：3059-68)。在进一步的具体实施例中，血液恶性肿瘤是MM，并且MM的疾病应答标准根据以下标准评估：
浆细胞白血病统一的反应标准：
严格的完全响应(sCR)：
除了CR(下面定义)之外，sCR还要求满足以下所有条件：
·流式细胞术检测骨髓中无恶性浆细胞
·流式细胞术检测外周血中无恶性浆细胞
·正常的自由轻链比(FLC)
完全响应(CR)：
CR需要以下所有条件：
一骨髓抽取的血浆细胞少于5％
·外周血中无浆细胞
·通过常规电泳及免疫固定在血清及尿液中不存在原始的单克隆副蛋白。
·没有髓外疾病
非常好的部分缓解(VGPR)：
VGPR要求以下所有方面：
·骨髓抽取物中的浆细胞少于5％
·外周血中无浆细胞
·血清单克隆副蛋白加副蛋白＜100毫克/24小时2的减少量大于或等于90％
·没有髓外疾病
部分响应(PR)：
部分响应需要以下所有条件：
·一骨髓吸出物中5％至25％的浆细胞
·外周血中1％至5％的浆细胞
·血清单克隆副蛋白减少50％以上，24小时尿单克隆副蛋白减少大于或等于90％加上小于200毫克/24小时3
·髓外疾病的所述尺寸减少大于或等于50％
稳定疾病(SD)：
不符合sCR，CR，VGPR，PR或进行性疾病(定义如下)标准的患者被认为患有稳定疾病(SD)：
·如果血清及尿液M蛋白质无法测量，则还需要正常的血清κ/λFLC比率。
·如果血清及尿液M蛋白质不可测量，则需要相关及未参与的FLC水平之间的差异大于或等于90％，取代所述M蛋白质。
·如果血清及尿液M蛋白质无法测量，则需要相关及未参与的FLC水平之间的差异大于或等于50％，所代所述M蛋白质。
进行性疾病：
CR或sCR的进展需要以下一项或多项：
·骨髓抽取物中浆细胞增加＞25％，或一绝对增加大于或等于10％
·外周血浆细胞绝对增加＞5％
·血清单克隆副蛋白水平增加＞25％，绝对增加量大于或等于5克/公升
·24小时尿蛋白电泳增加＞25％，绝对增加至少200毫克/24小时
·高钙血症
·裂解性骨病变明显增加
·髓外疾病的大小或数量明显增加。
在一些实施例中，本发明的制品、组合物级试剂盒还包含：用于将适于移植的扩增的NK细胞部分给予有需要的对象的说明书。
在本发明的制品、组合物或试剂盒的一些实施例中，适于移植到有需要的对象中的扩增的NK细胞部分包含至少7×108个总活NK细胞。在一些实施例中，适于移植到有需要的对象中的扩增的NK细胞部分包含：至少8×108个总活NK细胞、至少10×108个总活NK细胞、至少15×108个总活NK细胞、至少20×108个总活NK细胞或至少25×108总活NK细胞。
本发明的选定细胞群本身可以与从培养基中分离的含有所述选定细胞群的培养基一起提供，并与药学上可接受的载体以及可以促进细胞植入及/或器官功能的其他试剂组合(例如：免疫抑制剂、抗生素、生长因子)。因此，本发明的细胞群可以在药学上可接受的载体或稀释剂中施用，例如：无菌盐水及水性缓冲溶液。这些载体即稀释剂的使用是本领域熟知的。
如果需要，本发明的组合物可以存在于一包装或分配器装置中，例如：一FDA批准的试剂盒或制品，所述试剂盒或制品可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型(例如：细胞)。所述包装可以包括例如：金属或塑料箔，例如：一泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明。所述包装或分配器装置还可以附有一政府机构规定形式的通知，所述政府机构管理药品的所述制造、使用或销售，所述通知反映了所述机构批准用于人类或兽医给药的组合物的形式。例如：这种通知可包括美国食品即药物管理局批准的用于处方药或批准的产品插页的标签。如上文进一步详述的，还可以制备包含：在一药学上可接受的载体中，配制的本发明制剂的组合物，将所述组合物置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病症。
根据本发明的方法制备的细胞可以施用于所述受试者，或者在药物组合物中与合适的载体或赋形剂混合。
如本文所用，一「药物组合物」是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分，例如：生理学上合适的载体及赋形剂的制剂。一药物组合物的所述目的是促进一化合物向一生物体的施用。
在下文中，可互换使用的所述短语「生理学上可接受的载体」及「药学上可接受的载体」是指不会对一生物体造成显着刺激，并且不会消除所述施用的化合物的所述生物活性及性质的一载体或一稀释剂。这些短语包括：一佐剂。
本文中，术语「赋形剂」是指添加到一药物组合物中，进一步促进一活性成分施用的惰性物质。
用于配制及施用药物的数个技术可以在最新版的「Remington's PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA」中找到，其通过引用全部并入本文。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规的方式配制，所述载体包括：赋形剂及助剂，所述赋形剂及助剂有助于将所述活性成分加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配方取决于选择的所述给药途径。
用于注射，所述药物组合物的所述活性成分可以配制在水溶液中，优选地配置在生理上兼容的缓冲液中，例如：Hank溶液、Ringer溶液或生理盐缓冲液。
适用于本发明上下文的数个药物组合物包括：其中含有一有效量的活性成分以达到预期目的的组合物。更具体地，「治疗有效量」是指有效预防、缓解或改善病症(例如：白血病、多发性骨髓瘤)症状或延长所述受治疗的对象存活的活性成分(例如：扩增的CD3去除的NK细胞)的量。
确定一治疗有效量是在本领域技术人员的完全能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
本文所述的活性成分的毒性及治疗功效可通过体外标准药学方法、细胞培养物或实验动物测定。从这些体外及细胞培养测定及动物研究中获得的所述数据可用于配制用于人类的一系列剂量。所述剂量可根据所述使用的剂型及所用的给药途径而变化。所述个别的医生会根据患者的病情选择所述确切的配方、给药途径及剂量。(参见，例如：Fingl，E。等人(1975)，「The Pharmacological Basis of Therapeutics」，第1章，第1页。)
根据待治疗病症的严重程度及反应性，给药可以是单次或多次施用。当然，施用组合物的量取决于所治疗的受试者、痛苦的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。
如本文所用，术语「约」是指±10％。
术语「包括」、「包含」、「包括」、「包括」、「具有」及它们的缀合物表示「包括但不限于」。
术语「由...组成」表示「包括但限于」。
术语「基本上由...组成」是指组合物、方法或结构可包括其他成分、步骤及/或部分，但仅在附加成分、步骤及/或部分不实质上改变所述要求保护的组合物、方法或结构的所述基本及新颖特征的情况下。
如本文所用，所述单数形式「一」、「一个」及「所述」包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语「化合物」或「至少一种化合物」可包括：多种化合物，包括所述多种化合物的混合物。
在整个申请中，本发明的各种实施例可以以一范围格式呈现。应当理解，范围形式的所述描述仅仅是为了方便及简洁，不应该被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如：应该认为对诸如1至6的范围的描述具有特别公开的子范围，例如：从1到3、1到4、1到5、2到4、从2到6、从3到6等，在该范围内的个别数字，例如：1、2、3、4、5及6，无论范围的广度如何，这都适用。
无论何时在本文中指示的一数值范围，所述数值范围意图包括：在所指示的范围内的任何引用的数字(分数或积分)。所述短语「范围/在…范围」一第一指示数字及一第二指示数字及「范围/范围从」一第一指示数字「到」一第二指示数字在本文中可互换使用并且意味着包括第一及第二指示数字以及它们之间的所有分数及整数数字。
如本文所用，术语「方法」是指用于完成给定任务的方式、手段、技术及程序，包括但不限于：已知或易于从已知方式开发的那些方式、手段、技术及程序，或者由化学、药理学、生物学、生物化学及医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术及程序中容易地开发出来的那些方式、手段、技术及程序。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反的，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中所描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供或者在本发明的任何其他描述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的必要特征，除非所述实施例在没有那些组件的情况下不起作用。

Claims (41)

1.一种制备一可移植的自然杀手(NK)细胞部分的方法，其特征在于：所述方法包括步骤︰
(a)获得与一对象为HLA单倍体相合或HLA错配的一CD3去除的NK细胞部分；
(b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养所述CD3去除的NK细胞部分，其中所述多个条件包括提供用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺；
(c)在步骤(b)后8至10天用新鲜的多个营养成分、血清、IL-15及烟酰胺补充给所述CD3的NK细胞部分，以生产一扩增的CD3去除的NK细胞部分；
(d)在步骤(b)后14至16天采集所述扩增的CD3去除的NK细胞部分；及
(e)洗涤并浓缩步骤(d)的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，
从而生产一可移植的NK细胞部分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CD3去除的NK细胞部分是一人类NK细胞部分。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述CD3去除的NK细胞部分来自分离术。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：所述离体培养没有一饲养层。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述血清是人类血清。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述允许细胞增殖的多个条件包括提供10％的人类血清。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于：所述IL-15包括20奈克/毫升的IL-15。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述烟酰胺包括5.0毫摩尔的烟酰胺。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于：所述多个营养成分包括最小的必需细胞培养基质。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于：所述NK细胞来自一HLA单倍体相合或HLA错配的捐赠者，所述捐赠者至少具有：
(a)HLA符合至少2/4第1类等位基因的A及B基因位的一以DNA中等分辨率为基准的第1类分型；以及
(b)不存在受体捐赠者特异的抗HLA抗体(平均荧光强度MFI≤1000)。
11.如权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于：步骤(a)的所述NK细胞包括：至少40至90％的CD56+/CD3-细胞。
12.如权利要求1至11任一项所述的方法，其特征在于：步骤(d)的所述采集包括：在步骤(b)后14天采集一扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第一部分，并且在步骤(b)后16天采集一扩增的CD3去除的NK细胞部分的一第二部分。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述第一部分包括：大约50％的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分，以及所述第二部分包括：其余的所述扩增的CD3去除的NK细胞部分。
14.如权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于：步骤(e)产生的所述洗涤及浓缩的扩增的NK细胞部分具有于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
15.如权利要求1至14任一项所述的方法，其特征在于：步骤(b)的所述培养是在多个烧瓶中以每瓶200至300×106个细胞的方式进行。
16.一种可移植的自然杀手(NK)细胞部分，其特征在于：是根据如权利要求1至15任一项所述的方法所制备的。
17.如权利要求16所述的可移植的NK细胞部分，其特征在于：所述可移植的NK细胞部分具有以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
18.如权利要求15至17任一项所述的可移植的NK细胞部分，其特征在于：所述可移植的NK细胞部分被提供在一氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋中。
19.一种可移植的自然杀手(NK)细胞部分，其特征在于：所述可移植的NK细胞部分具有以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的存活率；
(c)输注时，患者每公斤重量的CD3+细胞数小于5.0×105个；
(d)输注时，患者每公斤重量的内毒素不超过5个活性单位；以及
(e)没有革兰氏阳性微生物。
20.一种制备用于治疗一有需要的对象的一血液疾病的一药物的一用途，其特征在于：所述用途通过以用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养素、血清、IL-15及烟酰胺进行离体培养，以扩增一CD3去除的单倍体相合或错配的自然杀手(NK)细胞部分而用于制备所述药物。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于：所述对象正在使用一抗癌单克隆抗体及至少一免疫抑制剂进行治疗。
22.如权利要求20或21所述的用途，其特征在于：所述对象以IL-2进行治疗。
23.如权利要求20至22任一项所述的用途，其特征在于：所述对象及所述NK细胞部分是一人类对象及一人类NK细胞部分。
24.如权利要求21至23任一项所述的用途，其特征在于：所述免疫抑制剂是一化学治疗免疫抑制剂及/或一放射线。
25.如权利要求20至24任一项所述的用途，其特征在于：所述血液疾病是一血液恶性肿瘤。
26.如权利要求20至25任一项所述的用途，其特征在于：所述血液疾病是一多发性骨髓瘤。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于：所述多发性骨髓瘤具有下述至少一种：
(a)第一次自体干细胞移植后2至18个月复发的疾病；
(b)异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病且没有活性移植物对抗宿主疾病(GVHD)的证据；
(c)至少两种治疗方法后的复发/难治疗的疾病，所述治疗方法包含一蛋白酶体抑制剂及一免疫调节药物(IMiD)；
(d)血清的IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白(M蛋白)大于或等于0.5克/分公升；以及
(e)尿液M蛋白大于或等于200毫克/24次收集量。
28.如权利要求20至24任一项所述的用途，其特征在于：所述血液疾病是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。
29.如权利要求28所述的用途，其特征在于：所述NHL是CD20阳性B细胞NHL。
30.如权利要求28所述的用途，其特征在于：所述NHL具有以下至少一种：
(a)传统治疗失败后的复发/难治疗的疾病；
(b)自体干细胞移植后至少60天复发的疾病；
(c)异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病且没有活性移植物对抗宿主疾病的证据，以及
(d)直径大于或等于1.5公分的可测量的疾病。
31.如权利要求21所述的用途，其特征在于：所述血液疾病是多发性骨髓瘤及所述抗癌单克隆抗体是埃罗妥珠单克隆抗体10毫克/公斤。
32.如权利要求21所述的用途，其特征在于：所述血液疾病是NHL，及所述抗癌单克隆抗体是利妥昔单克隆抗体375毫克/平方公尺。
33.如权利要求21至32任一项所述的用途，其特征在于：所述对象至少用三种剂量的所述抗癌单克隆抗体进行治疗。
34.如权利要求20至33任一项所述的用途，其特征在于：所述对象已经用一第一剂量的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分进行治疗，所述CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分是通过以用量为1.0mM至10mM的多个营养物、血清、IL-15及烟酰胺进行离体培养而扩增的。
35.如权利要求34所述的用途，其特征在于：所述对象已经用两种剂量的所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞部分进行治疗。
36.如权利要求20至35任一项所述的用途，其特征在于：所述NK细胞部分包括在1×107/公斤及5×108/公斤之间的扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞。
37.如权利要求35所述的用途，其特征在于：结合的所述两种剂量包括总量为2×107/公斤至2×108/公斤的扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞。
38.如权利要求21至37任一项所述的用途，其特征在于：所述至少一免疫抑制剂包括：环磷酰胺及/或氟达拉滨。
39.如权利要求38所述的用途，其特征在于：
(i)所述至少一免疫抑制剂包括：环磷酰胺40毫克/公斤及氟达拉滨25毫克/平方公尺；及
(ii)其中所述对象在获得所述扩增的CD3去除的单倍体相合或错配的NK细胞前的5天以环磷酰胺进行治疗，以及在获得输注包含扩增的CD3去除的HLA单倍体相合或HLA错配的NK细胞的所述药物前的第5、4及3天中的每一天施用所述氟达拉滨。
40.如权利要求22至39任一项所述的用途，其特征在于：所述对象获得三种剂量的6×106单位的IL-2。
41.如权利要求20至40任一项所述的用途，其特征在于：所述扩增的CD3去除的HLA单倍体相同或HLA错配的NK细胞包括：根据权利要求1至19任一项所述的方法制备的一可移植的NK细胞部分。
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