CN102317447A

CN102317447A - 用于筛选扩增的干细胞群的方法

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Publication number: CN102317447A
Application number: CN2010800073159A
Authority: CN
Inventors: 托尼·佩勒德; 多里特·哈拉蒂
Original assignee: Gamida Cell Ltd
Current assignee: Gamida Cell Ltd
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2010-05-05
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2030-05-05
Also published as: WO2010128510A1; CN102317447B; CA2760099A1; BRPI1007651A2; US20120141434A1; EP2427545A1

Abstract

本发明提供了一种筛选用于同种异体移植的扩增的造血干细胞的方法和标准，所筛选的细胞群具有高移入几率和积极的临床结果。

Description

用于筛选扩增的干细胞群的方法

技术领域和背景技术

本发明涉及一种筛选用于移植到需要其的受试者的造血细胞群的方法。将造血细胞群离体扩增，并且根据预定的标准筛选，以生产具有高移入概率的扩增的造血细胞群。该方法可以进一步包括筛选用于离体扩增的细胞群。本发明还涉及所筛选的用于移植的细胞群在临床环境中用于治疗血液疾病、创伤性损伤和癌症中的治疗用途。

脐带血、骨髓和其他富含造血细胞的组织是干细胞的重要来源，特别是在不能在合理的时间内找到匹配的非亲缘供体的情况下。使用脐带血的优势包括以下事实：其容易获得，携带较少的血源性传染病的传播风险以及可跨越HLA屏障移植，其中与来自亲缘或非亲缘供体的外周血或骨髓的相似的不匹配干细胞相比具有降低的移植物抗宿主病的风险。脐带血的另一重要优势为一旦鉴定之后利用其可获得可接受的脐带血单位的速度。

然而，造血细胞移植的主要临床局限性是较低数量的可获自诸如动员的外周血、骨髓移植物和脐带血的来源的造血干细胞/祖细胞。尽管脐带血比成人骨髓具有更高的祖细胞百分比，但是最终衍生自脐带血的固定细胞内含物代表主要的挑战，因为脐带血具有最低数量的所有来源的造血干细胞/祖细胞。移植的脐带血细胞还已表明具有较慢的移入时间以及较高的移入失败率，尽管在功能上，来自人脐带血的细胞表现出比来自骨髓或外周血的细胞以更少的细胞数量更好地移入免疫缺陷小鼠。大于1.7×10⁵个CD34⁺细胞/kg的CD34+细胞剂量成为一致被认为与移入率、中性粒细胞移入时间和存活率显著相关的一个因素。对于接受大于1.7×10⁵个CD34⁺细胞/kg的患者，移植相关死亡率为20％，而对于接收低于该阈值的细胞剂量的患者为75％。因此，推测通过用目前建议的细胞剂量和HLA差异(分别为多于2×10⁷个有核细胞/kg受体体重和6个HLA错配中的两个或更少)进行移植可以改善结果。

确实，在已经鉴定出合适的脐带血单位并且或者需要紧急移植或者不能获得合适的骨髓单位的情况下，目前开发的临床方案指向脐带血移植。临床试验的目的在于通过使用多种脐带血移植物加快移入，脐带血干细胞的离体扩增以及来自单倍体相同供体的CD34+细胞的共移植正处于不断发展中。有理由预期，在即将到来的数年内脐带血移植在成人和儿童患者中的使用将持续增加。

用于恶性血液病的同种异体造血干细胞移植

由于对HLA屏障的更好的理解和对患者外围-移植期辅助护理的改进，非亲缘供体造血干细胞移植的结果在过去二十年中已被大大改善。因此，用于非亲缘供体造血干细胞移植的适应症范围被扩大。如今，同种异体造血干细胞移植在多种高危恶性血液疾病中是一种治疗选项，或者甚至是治疗选择。

急性骨髓白血病(AML)

在过去二十年中同种异体造血干细胞移植在患有AML的患者中的最佳用途一直备受争论。对于处于第一次好转期的患者，一些研究表明同种异体移植与改善的生存率相关。与处于第一次好转期的患者相比，超过第一次好转期、处于复发期或具有原发性诱导失败的患者的结果较差。然而，研究表明同种异体移植对于这些患者是有用的挽救疗法。

急性淋巴细胞白血病(ALL)

临床试验表明对于患有高危ALL(Oh，H.，et al.Bone MarrowTransplant，1998；22：253-7)和费城染色体阳性ALL(Dombret，H.，et al.Blood；2002，100：2357-66)的成人中同种异体造血细胞移植优于自体移植或化疗。

利用常规疗法不可能在患有经历第一次复发的ALL患者中实现治愈，并且已证明利用造血细胞移植可提高生存率。当不能获得HLA-匹配的同胞，可以使用非亲缘供体，导致改善的无病生存率。

慢性骨髓白血病(CML)

已广泛验证了同种异体干细胞移植的效力；在许多中心甲磺酸伊马替尼被认为是用于缺乏HLA-相同同胞供体的患者的一线疗法。来自非亲缘供体的移植结果劣于HLA-相同同胞的患者。CML中的脐带血移植已描述在许多临床系列(丛集)中。

淋巴瘤

在过去二十年中已经使用高剂量化疗和自体移植管理(治疗)患有高危淋巴瘤的患者，然而，移植物对淋巴瘤作用的可能性使得用于淋巴瘤的同种异体移植更具有吸引力。存在一些利用该方法改善生存率的证据。研究已表明同种干细胞移植可使一些患者受益，取决于供体可获得性、疾病缓解和性能状况。

骨髓增生异常综合症(MDS)

已针对MDS研究了许多治疗策略。至今为止，干细胞移植是对这些患者具有治愈可能的唯一治疗。但是，由于MDS经常表现出拖延期并且许多患者已60岁或更老，所以成髓性干细胞移植仅适合其中一些患者。用于恶性血液病的脐带血移植

脐带血已被越来越多地用作患有恶性血液病患者的可替换的造血干细胞来源。至今为止，全世界已在儿童和成人中进行了超过6000例脐带血移植术。

脐带血受体中的较高的初次移植失败率和延迟的供体髓细胞恢复归因于低的移植物造血干细胞剂量，与骨髓或外周血供体移植物相比，其包含少于10倍的有核细胞和CD34+细胞。对于供体髓细胞移入时间具有预测价值的脐带血移植物变量包括冷藏和再输注的总有核移植物细胞含量、CD34含量和输注的克隆形成单位(CFU)。

与常规同种移植物相比，供体髓细胞移入是延迟的，并且在22-30天的范围内。移入的几率为65％-88％。尽管大多数采用在两个或更多个HLA位点处完全不同的移植物，但是急性II-IV级GvHD为35％至40％。无事件生存率落在较宽的范围(22％-62％)内。高外围移植死亡率部分归因于延迟的供体髓细胞恢复。同种移植亲缘脐带血的患者的移植结果与非亲缘脐带血移植物的结果相似或略微更好。

关于成人中的脐带血移植的数据是更有限的，并且尽管大多数研究的高危分布，两项最近的研究推断对于患有缺乏HLA-匹配的骨髓供体的急性白血病的成人而言，非亲缘脐带血是可接收的备选造血干细胞来源。白血病的复发率不存在差异。在脐带血受体中，结果在具有1个或2个HLA错配的移植物之间是相似的。

为了克服低数量干细胞和祖细胞的局限性，预期用生长因子的混合剂(鸡尾酒，cocktail)离体扩增脐带血干细胞和祖细胞。在早期和晚期作用细胞因子的组合的存在的情况下，用离体扩增的细胞进行的临床实验未被证明是有效的，因为由这些细胞因子的组合支持的扩增细胞主要包含晚期祖细胞和分化细胞。已证明包括SCF、血小板生成素(TPO)、G-CSF和IL-3的早期和晚期作用细胞因子的组合仅导致晚期(CD34)和早期(CD34CD38)祖细胞的微小的倍数扩增，这可能是由于晚期作用细胞因子主要将培养物驱向加速分化的事实。然而，仅用早期作用细胞因子(SCF、TPO、IL-6和FLT-3配体)培养脐带血细胞导致晚期和早期祖细胞二者更好和更长时间的扩增，这对于短期的早期三系(trilineage)移入是重要的。

本发明的发明人先前已证明了含有多胺铜螯合剂的离体培养物可增加来自脐带血的祖细胞的长期扩增和移入潜能(参见，例如美国专利第6,962,698、6,887,704、7,169,605和7,312,078号)。在培养过程中，铜螯合剂抑制细胞因子驱动的早期祖细胞分化的开始，导致CD34+CD38-和CD34+Lin-细胞的大量积累，其中对于更成熟的定型细胞[CD34+Lin-和CFU培养物(CFUc)]的增殖和分化没有作用。用多胺螯合剂TEPA对补充有早期作用细胞因子的脐带血培养物的三周处理导致延长的且广泛的CD34+细胞的离体扩增以及更高百分比的早期祖细胞(CD34+CD38-、CD34+CD38-Lin-)。在长期培养物中TNC、CFU-C和CD34+细胞扩增持续。与未处理的培养物相比，TEPA处理的培养物在NOD/SCID小鼠中的移入潜能增加。此外，与移植了未扩增细胞的小鼠相比，在移植了TEPA扩增细胞的小鼠中，移入的人祖细胞以及髓样和淋巴样细胞的百分数显著更高。这些结果充分表明铜螯合剂支持自我更新分裂周期而不损害造血干细胞的分化能力。

Peled等人(Cytotherapy，2004，6：344-55)已调整了用多胺铜螯合剂来离体培养扩增来自脐带血的造血祖细胞的方法以符合临床实践的标准，并且已证明了根据该修改的方法临床规模离体扩增造血祖细胞，并且将所述离体扩增的细胞移植到小鼠导致有效的长期移入。使用与未处理的脐带血组合的在输注前用铜螯合剂离体扩增的脐带血干细胞，本发明人已完成了接受高剂量化疗的10名急性白血病和淋巴瘤受试者的I/II期试验。

然而，Peled等人未提供用于在离体扩增之后筛选和排除造血祖细胞群以用于有效移入受体的临床可验证的方案。

因此，需要使能够在临床环境中鉴定适合用于移植入需要其的受体的离体扩增的造血细胞群的临床验证的方案。

发明内容

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞群的方法，该方法包括：(a)在给药前在扩增造血细胞的候选群中确定以下参数中的至少一个：(i)该群中CD34+细胞的比例；(ii)该群中总细胞的倍数扩增；(iii)该群中细胞的活力；以及(iv)活细胞的总数；和(b)根据所述参数中的至少一个的预定值筛选或排除候选群，由此筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞群。还提供了一种根据所要求的方法筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种在需要其的受试者中治疗血液疾病或病症的方法，该方法包括给予需要其的受试者通过以下方式筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群：(a)在给药前在扩增造血细胞的候选群中确定以下参数中的至少一个：(i)该群中CD34+细胞的比例；(ii)该群中总细胞的倍数扩增；(iii)该群中细胞的活力，以及(iv)活细胞的总数；和(b)根据所述参数中的至少一个的预定值筛选或排除候选群，由此在受试者中治疗和/或预防血液疾病。

根据本发明的一些实施方式，CD34+细胞的比例为总细胞的约3％至约10％并且可选地为总细胞的约3％至约5％。

根据本发明的另外的实施方式，CD34+细胞的比例为总细胞的约4％。

根据本发明的一些实施方式，所述群的总细胞的倍数扩增为约10至约70倍并且可选地约25至约60倍。

根据本发明的另外的实施方式，所述群的总细胞的倍数扩增为约50倍。

根据本发明的一些实施方式，在第21天培养时所述群中总细胞的活力为约65％至约95％，可选地在第21天培养时为约75％至约90％。

根据本发明的另外的实施方式，在第21天培养时所述群中总细胞的活力为约85％。

根据本发明的一些实施方式，所述扩增群的活细胞总数为约15×10⁶至约60×10⁶个活细胞，可选地约20×10⁶至约30×10⁶个活细胞。

根据本发明的另外的实施方式，所述扩增群的活细胞总数为约23×10⁶个活细胞。

根据本发明的一些实施方式，根据至少两个所述参数并且可选至少三个所述参数的数值来确定筛选。

根据本发明的另外的实施方式，根据所有四个所述参数的数值来确定筛选。

根据本发明的另外的实施方式，根据以下参数的数值来确定筛选：(i)CD34+细胞的比例为总细胞的约4％；(ii)该群的总细胞的倍数扩增为约50倍；(iii)在第21天培养时该群中总细胞的活力为约85％；以及(iv)扩增群的活细胞总数为约23×10⁶个活细胞。还提供了一种根据所要求的方法筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群。

根据本发明的一些实施方式，通过在细胞因子和铜螯合剂存在的情况下培养造血细胞通过离体增殖来扩增造血干细胞。

根据本发明的一些实施方式，所述细胞因子为早期作用细胞因子，其可以选自由以下构成的组：干细胞因子、FLT3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和血小板生成素。

根据本发明的另外的实施方式，所述细胞因子是干细胞因子、血小板生成素、白介素-6和FLT3配体。

根据本发明的一些实施方式，以50ng/ml的浓度提供所述细胞因子。

根据本发明的一些实施方式，所述铜螯合剂为四亚乙基五胺(TEPA)。

根据本发明的一些实施方式，以5μM的浓度提供四亚乙基五胺。

根据本发明的一些实施方式，将扩增的造血干细胞培养21天。

根据本发明的一些实施方式，扩增的造血干细胞群在扩增前包括至少1×10⁵个细胞。

根据本发明的一些实施方式，所述造血细胞群选自由脐带血、外周血和骨髓组成的来源。

根据本发明的另外的实施方式，所述造血细胞群为脐带血。

根据本发明的一些实施方式，所述脐带血是解冻的冷冻脐带血。

根据本发明的一些实施方式，在扩增前使造血细胞群富含造血干细胞。

根据本发明的另外的实施方式，在扩增前使造血细胞群富含CD34+或CD133+细胞。

根据本发明的一些实施方式，所述血液疾病选自由急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CLL)、何杰金氏淋巴瘤(HL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及骨髓增生异常综合症(MDS)组成的组。

根据本发明的另外的实施方式，治疗血液病的方法还包括在将细胞给予受试者之前将扩增的造血细胞与未扩增的造血细胞混合。所述扩增的和未扩增的造血细胞可获自相同的一个或多个脐带血单位。

根据本发明的一些实施方式，在扩增的造血干细胞群之前给予未扩增的造血细胞。

根据本发明的一些实施方式，在给予造血细胞之前用免疫抑制疗法治疗受试者。

根据本发明的另外的实施方式，在给予造血细胞之后用免疫抑制疗法治疗受试者。

根据本发明的一些实施方式，将扩增的造血细胞与用于血液病的另外治疗一起联合给予。所述另外的治疗可以选自由免疫抑制治疗、化疗和放疗组成的组。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种包括包装材料和所选的离体扩增的造血细胞群的制品，通过以下方式筛选适合于移植的造血细胞群：(a)在给药前在扩增造血细胞的候选群中确定以下参数中的至少一个：(i)该群中CD34+细胞的比例；(ii)该群中总细胞的倍数扩增；(iii)该群中细胞的活力，以及(iv)活细胞的总数；和(b)根据所述参数中的至少一个的预定值筛选或排除候选群；并且其中所述包装材料包括表明所述造血细胞群用于在需要其的受试者中治疗血液疾病或病症的标签或包装说明书。

根据本发明的一些实施方式，根据所述参数的以下数值进行筛选：(i)CD34+细胞的比例为总细胞的约4％；(ii)该群的总细胞的倍数扩增为约50倍；(iii)第21天培养时该群中总细胞的活力为约85％；以及(iv)扩增群的活细胞总数为约23×10⁶个活细胞。

除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属的技术领域中普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方式的实践或检测中可以使用与本文描述的那些相似或等价的方法和材料，但是下面描述示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，将以包括定义的专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅为示例性的并且不是限制性的。

具体实施方式

本发明涉及一种筛选用于移植入需要其的受试者中的造血细胞群的方法。具体地，根据预定的标准来筛选离体扩增的造血细胞群，以生产具有高移入几率的扩增的造血细胞群，用于治疗血液疾病、创伤性损伤和癌症。

在详细地阐述本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明的应用不一定受限于在以下描述中所列出的或通过实施例中所例证的细节。本发明还具有其他实施方式或以各种方式实践或实施。

同种造血干细胞移植对于患有血液疾病的患者而言是挽救生命的程序(手术)；但是该程序的广泛应用受到适当HLA-匹配的供体的可用性的限制。仅30％可能受益于该程序的患者具有HLA-匹配的同胞。通过全球登记处可为约75％的高加索患者鉴定出非亲缘匹配供体，但是对于匹配供体的长期研究会显著延迟移植。此外，更少的少数民族患者找到适合的HLA-匹配供体。脐带血越来越多地被用作干细胞的备选来源；然而，由于令人满意的造血重建所需的不足细胞剂量，其在成人和青少年患者中的应用受到限制。

因此，脐带血移植物常规地并且更成功地用于儿童移植环境中(根据推荐的阈值细胞剂量，库中仅20％的脐带血单位可以满足75kg的患者)。因此，接受脐带血移植的成人具有高风险的早期死亡率(高达40-60％的第100天死亡率)和由于延迟移入引起的感染以及更高的移入失败率。

具有更高数量的有核细胞和更高数量的CD34+细胞的移植物导致更高的存活几率。改善结果的策略包括使用两个单位用于移植并且共移植来自第三方供体的CD34或CD133-筛选的外周血干细胞和一个非亲缘供体脐带血单位。

为了解决低祖细胞剂量的问题，建议进行来自脐带血的细胞的离体扩增。迄今仍不清楚扩增技术是否能够提供可获自脐带血单一单位的祖细胞数量的可靠的、可重现的增加，从而导致成人患者中更优的移入率和整体存活率。对于目前可用的移植物制备方法的重要挑战是生成扩增的定型造血祖细胞群而不损害低分化祖细胞(CD34+CD38-或CD34+Lin-细胞)的数量的能力。在多胺铜螯合剂存在的情况下用早期作用细胞因子培养来自脐带血的造血干细胞和/或祖细胞导致对未分化的造血干细胞/祖细胞群的分化和扩增的显著抑制。近期的研究已表明在细胞因子和铜螯合剂存在的情况下离体扩增所需的造血细胞可适于移入需要其的受体的临床可接受的标准(Peled et al，Cytotherapy 2004；6：344)，并且移植了扩增的脐带血细胞的患者表现出改善的100天存活率，没有急性毒性，没有移植失败或早期死亡，并且没有继发性移植失败(di Lima et al，Bone Marrow Transplant，2008，January 21，Epub)。

本发明提供了用于筛选具有高的有效移入几率的扩增的造血细胞群的标准，所述标准包括CD34+细胞的比例、CD34+细胞的倍数扩增、所述群中细胞的活力以及活细胞的总数。所筛选的群可在临床环境中用于移植，用于治疗血液疾病、创伤性损伤和癌症。

因此，根据本发明的一个实施方式，提供了一种用于筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞和/或祖细胞的方法，该方法包括在给药前在扩增造血细胞的候选群中确定选自以下的至少一个参数：所述群中CD34+细胞的比例；所述群中总细胞的倍数扩增；所述群中总细胞的活力；以及所述扩增细胞群中活细胞的总数；和根据所述参数中的至少一个的预定值筛选或排除候选群；由此筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞群。

如本文中所使用的，术语“离体”是指从活的有机体中除去细胞并且在有机体外(例如在试管内、在细胞培养袋内等)增殖的过程。

如本文中所使用的，术语“体外”是指在有机体外处理在实验室中维持的源自一个或多个细胞系(例如胚细胞系等)的细胞的过程。这样的细胞系通常为永生化细胞。

如本文中所使用的，短语“细胞群”是指包括可能适合于移植的细胞群的同源或异源分离的细胞群。在本发明的一个实施方式中，至少一部分的本发明的该方面的细胞群在细胞表面上表达CD34和/或CD133。

如本文中所使用的，短语“干细胞”是指负责在组织或身体内生成细胞团的最早可更新的细胞群和极早期祖细胞二者，所述细胞稍微被更多分化但是还未定型并且可以容易地逆转成最早可更新细胞群的一部分。造血干细胞是可重新生成血液的细胞组分例如红细胞、白细胞、血小板等的干细胞。

如本文中所使用的，短语“非干细胞”、“非祖细胞”和“定型细胞”是指处于各种分化阶段的细胞，其通常不再保留逆转成为可更新细胞群的一部分的能力。离体培养干细胞、祖细胞和非干细胞、非祖细胞定型细胞的方法在细胞培养领域中是熟知的。就这一点而言，可参见例如Freshney，Wiley-Liss，N.Y.的教科书“Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique”(1994)，第三版，将其教导以引用方式并入本文。

如本文中所使用的，术语“活力”是指活细胞和非活细胞之间的区别。细胞活力可通过形态学变化或通过膜渗透性和/或从排阻某些染料或摄入并保留其他染料推断的生理状态的变化来判断。细胞活力测定在本领域中是熟知的，包括但不限于台盼蓝或碘化丙啶排阻和若丹明代谢染色(Coder，D.，Current Protocols in Cytometry，1997，John Wiley and Sons，Inc.，Unit 9.2，9.2.1-9.2.14)。

如本文中所使用的，术语“倍数增加”是指与扩增特定时间后计数的该相同细胞相比，扩增前存在于培养物中的所指细胞的比例。所指细胞的加倍例如为100％或1.0倍倍数增加。倍数增加可以涉及群中的所有细胞(例如总有核细胞)或细胞群中的任何亚群(例如，CD34+细胞)。

如本文中所使用的，术语“扩增”、“扩增细胞”或“扩增细胞群”是指与培养前或在另一之前的时间点的数量相比，在导致细胞或细胞群的数量增加的条件下培养的细胞。扩增可能涉及群中的所有细胞或涉及培养的细胞群内的特定亚群。扩增可表示为“倍数增加”、“百分数增加”等。

如本文中所使用的，术语“约”是指大于所指数值5％至小于所指数值5％范围内的数值。因此，例如“约50倍(50X)倍数增加”是指47.5倍(47.5X)至52.5倍(52.5X)范围内的倍数增加。

根据如所要求的本发明的一个实施方式，在细胞因子和铜螯合剂存在的情况下，通过以用于细胞增殖的条件培养造血细胞，通过离体增殖来扩增造血干细胞。以用于细胞增殖的条件培养离体生长的细胞包括为细胞提供营养物。

铜螯合剂的最终浓度可取决于具体应用在微摩尔或毫摩尔范围内。例如，在约0.1μM至约100mM内，优选在约4μM至约50mM内，更优选在约5μM至约40mM内。

根据本发明的一些实施方式，所述螯合剂为多胺螯合剂，例如但不限于乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、三乙烯二胺、四亚乙基五胺、氨乙基乙醇胺、氨乙基哌嗪、五乙烯六胺、三乙烯四胺-盐酸盐、四亚乙基五胺-盐酸盐、五乙烯六胺-盐酸盐、四乙基五胺、卡普多普瑞尔、青霉胺、N，N′-二(3-氨丙基)-1，3-丙二胺、N，N-二(2-氨乙基)-1，3-丙二胺、1，7-二氧杂-4，10-二氮杂环十二烷、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-5，7-二酮、1，4，7-三氮杂环壬烷三盐酸盐、1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷、1，4，8，12-四氮杂环十五烷或1，4，7，10-四氮杂环十二烷。在一个实施方式中，所述铜螯合剂为四亚乙基五胺。

根据本发明的另一实施方式，所述细胞因子为早期作用细胞因子，例如但不限于干细胞因子、FLT3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和血小板生成素。在一个实施方式中，所述细胞因子为包括干细胞因子、FLT3配体、白介素-6和血小板生成素的细胞因子的组合。另外并且可选地，可以加入晚期作用细胞因子，例如但不限于粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和促红细胞生成素。细胞因子的最终浓度可根据具体应用在毫克/毫升至约纳克/毫升的范围内。例如，细胞因子的浓度可以在约0.1ng/ml至约100μg/ml内，可选地在约1ng/ml至20μg/ml内，可选地在约5ng/ml至约1μg/ml内。在一个实施方式中，细胞因子浓度为50ng/ml/细胞因子。

应当理解，培养包括提供营养物、适合的生长培养基和适合于细胞生长的条件。能够支持细胞的适合的培养基包括MEM-α、HEM、DMEM、RPMI、F-12等。如果需要，所述培养基可以包含细胞代谢所需的添加剂例如谷氨酰胺和其他氨基酸、维生素、矿物质和有用的蛋白质例如转铁蛋白、血清(胎牛、马、牛)等。该培养基还可以包含用于防止酵母、细菌和真菌污染的抗生素，例如青霉素、链霉素、庆大霉素等。当培养细胞时，条件应接近生理条件(优选约6至约8的pH以及约30℃至约40℃的温度)。

在一个实施方式中，如所指出的，在包含最小必需培养基-α(MEM-α)，10％胎牛血清(FCS Hyclone，Logan，UT，USA)，细胞因子干细胞因子、FLT3配体、白介素-6和血小板生成素以及四亚乙基五胺的培养基中培养细胞。

可使造血细胞在培养基中生长较短(数天或数周)或较长(数周至数月)的时间。为了维持用于移植的细胞足够的活力，在为造血干细胞群提供显著扩增的机会的同时，可将细胞培养2-5周。在一个实施方式中，通过培养21天(3周)来扩增细胞。

适合于培养用于扩增的造血细胞群的许多容器在本领域中是熟知的，例如各种体积的细胞培养袋、烧瓶、生物反应器等。在一个实施方式中，将细胞培养在72ml的VueLife Teflon PEP细胞培养袋(American FluorosealCo.)中。

当脐带血是用于扩增的细胞的来源时，确保足量的用于扩增的细胞是重要的，从而提供制备足够大的用于成功移植的扩增造血干细胞群的潜力。因此，根据一个实施方式，在扩增前筛选用于扩增的脐带血单位包含至少20×10⁵/kg体重细胞，可选地至少10×10⁵/kg体重细胞并且可选地至少1×10⁵/kg体重细胞。不考虑具有少于1×10⁵/kg体重细胞的脐带血单位。

本发明的细胞群可以来自自体或非自体供体(同种或异种)。

根据所要求发明的一个实施方式，根据群中CD34+细胞的比例来筛选或排除扩增的造血干细胞群，其中排除离体扩增后具有少于至少10％CD34+细胞的群的移植适合性。在另一实施方式中，排除具有少于9％CD34+细胞，可替换地具有少于8％CD34+细胞，可替换地具有少于7％CD34+细胞，可替换地具有少于6％CD34+细胞，可替换地具有少于5％CD34+细胞，可替换地具有少于4％CD34+细胞以及可替换地具有少于3％CD34+细胞的扩增的造血干细胞群的移植适合性。在另一实施方式中，筛选用于移植的离体扩增的造血干细胞群具有至少4％CD34+细胞。

根据所要求发明的一个实施方式，根据所述群中总有核细胞的倍数扩增来筛选或排除扩增的造血干细胞群，其中排除离体扩增后具有少于至少10倍(10X)总有核细胞的倍数增加的群的移植适合性。在另一实施方式中，排除具有少于20倍(20X)总有核细胞的倍数增加，可替换地具有少于至少30倍(30X)总有核细胞的倍数增加，可替换地具有少于至少40倍(40X)总有核细胞的倍数增加，可替换地具有少于至少50倍(50X)总有核细胞的倍数增加，可替换地具有少于至少60倍(60X)总有核细胞的倍数增加的扩增的造血干细胞群的移植适合性。在另一实施方式中，筛选用于移植的离体扩增的造血干细胞群具有至少50倍(50X)或更大的总有核细胞的倍数增加。

根据所要求发明的另外的实施方式，根据所述群中总细胞的活细胞比例来筛选或排除扩增的造血干细胞群，其中排除离体扩增后具有少于至少90％活细胞的群的移植适合性。在另一实施方式中，排除具有少于85％活细胞，可替换地具有少于80％活细胞，可替换地具有少于75％活细胞，可替换地具有少于70％活细胞，可替换地具有少于65％活细胞，可替换地具有少于60％活细胞的扩增造血干细胞群的移植适合性。在另一实施方式中，筛选用于移植的离体扩增的造血干细胞群具有来自扩增细胞总数的至少70％或更多的活细胞。

在另一实施方式中，根据可用于输注的CD34+细胞的绝对数量来筛选或排除离体扩增的细胞群，所述绝对数量根据所述群中CD34+细胞的比例和该群中的活细胞总数的参数的组合来确定。在另一实施方式中，根据可用于输注的CD34+细胞的数量来筛选或排除离体扩增的细胞群，所述数量根据接种到培养物中的CD133+细胞的数量和扩增群中总有核细胞的倍数扩增的参数的组合来确定。

根据所要求发明的另一实施方式，根据所述群中活细胞的总数来筛选或排除扩增的造血干细胞群，其中排除离体扩增后具有少于至少60×10⁶个活细胞的扩增的造血干细胞群的移植适合性。在另一实施方式中，排除具有少于50×10⁶个活细胞，可替换地具有少于40×10⁶个活细胞，可替换地具有少于30×10⁶个活细胞，可替换地具有少于25×10⁶个活细胞，可替换地具有少于20×10⁶个活细胞，可替换地具有少于15×10⁶个活细胞的扩增的造血干细胞群的移植适合性。在另一实施方式中，筛选用于移植的离体扩增的造血干细胞群具有来自扩增细胞总数的至少23×10⁶个或更多的活细胞。

根据本发明，可根据选自所述群中CD34细胞的比例；所述群中总细胞的倍数扩增；所述群中总细胞的活力；以及所述扩增细胞群中活细胞总数中的每一个参数来筛选或排除扩增的细胞群，或者可替换地根据参数的组合来筛选或排除扩增的细胞群。因此，在本发明的另一实施方式中，可根据包括所述群中CD34+细胞的比例；所述群中总细胞的倍数扩增；所述群中总细胞的活力；以及所述扩增细胞中活细胞的总数的至少两个、可选至少三个或可选根据所有四个参数以它们的任意组合来筛选或排除离体扩增的细胞群。举例而言，经筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞群可包含具有至少4％CD34+细胞和至少50倍(50X)或更大的总有核细胞倍数增加的群，或者具有至少50倍(50X)或更大的总有核细胞倍数增加并且具有来自扩增细胞总数的至少23×10⁶个或更多的活细胞的群，或者具有至少4％CD34+细胞和至少50倍(50X)或更大的总有核细胞倍数增加以及来自扩增细胞总数的至少23×10⁶个或更多的活细胞的群。在一个实施方式中，根据所有四个所述参数筛选或排除离体扩增的细胞群，筛选用于移植的离体扩增的细胞群具有至少4％CD34+细胞和至少50倍(50X)或更大的总有核细胞的倍数增加和来自扩增细胞总数的至少70％或更多的活细胞以及来自扩增细胞总数的至少23×10⁶个或更多的活细胞。

在一个实施方式中，用于移植的细胞是干细胞和/或祖细胞，并且干细胞群的来源是未分级的单核细胞群，其未富集CD34+、CD133+或其他造血干细胞。在另一实施方式中，通过干细胞标记例如CD34+、CD34+/CD38-、CD133+、CD34+/Lin-和本领域中已知的其他干细胞标记来鉴定干细胞。在又一实施方式中，干细胞群的来源是通过根据干细胞标记的筛选富集了造血干细胞的干细胞。通常通过FACS或免疫磁性分离进行筛选，但是还可以通过核酸方法例如PCR(参见，下文中的材料和实验方法)进行筛选。胚胎干细胞以及它们的修复方法在本领域中是熟知的并且描述在例如Trounson AO(Reprod Fertil Dev(2001)13：523)、Roach ML(Methods Mol Biol(2002)185：1)和Smith AG(Annu Rev Cell Dev Biol(2001)17：435)中。成人干细胞是衍生自成人组织的干细胞并且在本领域中也是熟知的。分离或富集脐带血和成人干细胞的方法描述在例如Miraglia，S.et al.(1997)Blood 90：5013，Uchida，N.et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：14720，Simmons，P.J.et al.(1991)Blood 78：55，Prockop DJ(Cytotherapy(2001)3：393)，Bohmer RM(Fetal Diagn Ther(2002)17：83)和Rowley SD et al.(Bone Marrow Transplant(1998)21：1253)，Stem CellBiology Daniel R.Marshak(Editor)Richard L.Gardner(Editor)，Publisher：Cold Spring Harbor Laboratory Press，(2001)以及Hematopoietic Stem CellTransplantation.Anthony D.Ho(Editor)Richard Champlin(Editor)，Publisher：Marcel Dekker(2000)中。

例如，本发明的干细胞可来自选自由造血细胞、脐带血细胞和永生化外周血细胞组成的组中的来源。

根据本发明的另一示例性实施方式，提供了一种通过所要求的方法筛选的适合于移植的一个或多个扩增的造血细胞群。这样的筛选的细胞群可在筛选之后用于移植或保存备用。保存造血干细胞群的方法在本领域中是熟知的，例如超低温保存、冻干等(参见，Watts et al，Cryopreservation andFreeze-Drying Protocols，Methods in Molecular Biology，2007；368：237-259)。

在一个实施方式中，扩增细胞群包含离体扩增的造血干细胞群，其具有至少4％CD34+细胞和至少50倍(50X)或更大的总有核细胞的倍数增加以及来自扩增细胞总数的至少70％或更多的活细胞和来自扩增细胞总数的至少23×10⁶个或更多的活细胞。

根据本发明方法筛选的造血干细胞群可用于移植入需要其的受试者，例如患有血液疾病或病症的受试者。因此，根据所要求发明的另一方面，提供了一种在需要其的受试者中治疗血液疾病或病症的方法，该方法包括给予需要其的受试者通过以下方式筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群：(a)在给药前在扩增造血细胞的候选群中确定以下参数中的至少一个：(i)所述群中CD34+细胞的比例；(ii)所述群中总细胞的倍数扩增；(iii)所述群中所述细胞的活力，以及(iv)活细胞的总数；和(b)根据所述参数中的至少一个的预定值来筛选或排除候选群，由此在所述受试者中治疗和/或预防所述血液疾病。在一个实施方式中，所述扩增的细胞群包含离体扩增的造血干细胞群，其具有至少4％CD34+细胞和至少50倍(50X)或更大的总有核细胞的倍数增加以及来自扩增细胞总数的至少70％或更多的活细胞和来自扩增细胞总数的至少23×10⁶个或更多的活细胞。

下文总结了可根据本发明的教导实施的一些临床应用。

造血细胞移植：在具有完全消融骨髓的受体中恢复造血作用以及在常规的放疗或化疗之后提供缩短受体骨髓恢复的辅助措施。

最近的报导已证明了移植的或输注的干细胞增强非同源组织中而不是衍生所述干细胞的组织中的再生的能力。因此，筛选的细胞群可用于组织再生、再生药物、重建手术、组织工程、再生新组织和自然治愈患病的或受损的器官。

可在培养物中扩增之前、之中或之后将所筛选群的细胞进行遗传修饰。向新鲜的干细胞内转移基因的效率极低。离体保存并加工筛选的细胞群并且增强它们的归巢和移入潜能的能力可以提供增加的成功使用用于基因疗法的遗传修饰细胞移植的可能性。造血细胞的遗传操作的方法，例如使用逆转录病毒载体在本领域中是熟知的(参见，例如Larochelle et al，Semin.Hematol.2004；41：257-71)。

可通过根据本发明筛选的造血干细胞群的移植治疗或预防的血液疾病或病症包括但不限于白血病、镰状细胞病、骨髓增生异常综合症、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤文氏肉瘤、纤维组织增生性小圆细胞瘤、霍奇金病、非何杰金氏淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。

接受所筛选的造血干细胞群移植的候选者在移植之前、之中或之后可能需要处理或其他护理，例如但不限于在输注之前辅助消除患者疾病并且抑制免疫反应的成髓性或非成髓性剂量的化疗(环磷酰胺、白消安)和/或辐射、用于预防移植物抗宿主病(GVHD)的他克莫司和甲氨喋呤、用于辅助护理的抗生素和血液制品。

可以自身，与包含所述细胞群的培养基一起，与所述培养基分离以及与药用载体以及与可促进细胞移入和/或器官功能的另外的药剂(例如，免疫抑制剂、抗生素、生长因子)一起提供本发明的筛选的细胞群。因此，可在药用载体或稀释剂例如无菌盐水和含水的缓冲液中给予本发明的细胞群。这样的载体和稀释剂的使用在本领域中是熟知的。

如果期望，将本发明的组合物提供在包装或分配器中，例如FDA批准的试剂盒，其可包括包含所述活性成分(例如细胞)的一个或多个单位剂型。所述包装例如可以包含金属或塑料箔，例如铝箔包装。所述包装或分配器可附有给药说明。所述包装或分配器还可附有由管理药物的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，该通告可反映该机构批准用于人或兽给药的所述组合物的形式。这样的通告例如可包括由美国食品和药品监督管理局批准的用于处方药的标签或者经批准的产品说明书。还可制备包含配制在药用载体中的本发明的制剂的组合物，其置于适合的容器内并且标注用于指定病症的治疗，如上文另外详述的。

可将根据本发明的方法制备的细胞自身或在将其与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中给予受试者。

如本文中所使用的，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分例如生理学上可接受的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的在于辅助将化合物给予有机体。

在下文中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药用载体”是指不会对有机体引起明显的刺激并且不会破坏所给药化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语包括佐剂。

在本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步辅助活性成份的给药的惰性物质。

用于药物的制剂和给药的技术可在最新版的“Remington’sPharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA中找到，将其全部以引用方式并入本文。

因此用于根据本发明的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式进行配制，所述载体包括辅助将活性成分加工成可作为药物使用的制剂的赋形剂和佐剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。

对于注射，可将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选配制在生理相容的缓冲液例如Hank溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。

适合用于本发明背景中的药物组合物包括其中包含可有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地，“治疗有效量”是指可有效预防、缓解或改善疾病(例如白血病)的症状或延长被治疗受试者的存活时间的活性成分(例如扩增的造血干细胞)的量。

治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力之内，特别是根据本文提供的详细公开。

可通过标准的药学程序在体外、在细胞培养物中或实验动物中测定本文所述的活性成分的毒性和治疗效力。从这些体外和细胞培养物测定以及动物研究获得的数据可用于制定用于人的多种剂量。所述剂量可随着所使用的剂型和所采用的给药途径而变化。单独的医生考虑到患者的病症来选择确切的制剂、给药途径和剂量(参见，例如，Fingl，E.et al.(1975)，“ThePharmacological Basis of Therapeutics，”Ch.1，p.1.)。

根据预治疗病症的严重度和反应性，剂量可为单次给药或多次给药。然而，通常受试者接受单个移植，其中多个移植是极罕见的。但是，预给予的组合物的量当然将取决于被治疗的受试者、痛苦的严重度、给药方式、处方医师的判断等。

应当理解，为了清楚起见，描述在不同实施方式背景中的本发明的某些特征还可以组合提供在单个实施方式中。相反，为了简略起见，描述在单个实施方式中的本发明的各种特征还可以单独地或以任何合适的亚组合或适合地在本发明的任何其他所述实施方式中提供。不应认为在各种实施方式的背景中描述的某些特征是那些实施方式的必要特征，除非在没有这些要素的情况下无法实施该实施方式。

对于本领域中的普通技术人员来说，在考察下面的不是限制性的实施例之后，本发明的另外的目的、优点和新特征将变得显而易见。此外，如上文所述中以及如下文权利要求部分中所要求的本发明的各种实施方式和方面可在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考以下实施例，其与上面的描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。

通常，本文中使用的命名法和本发明中采用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术全面地阐述在文献中。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook et al.，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，″Current Protocols in Molecular Biology″，JohnWiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide toMolecular Cloning″，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson et al.，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren et al.(eds)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，Vols.1-4，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659 and 5,272,057中阐述的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；″Culture ofAnimal Cells-A Manual of Basic Technique″by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edition；″Current Protocols in Immunology″Volumes I-IIIColigan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，″Basic and Clinical Immunology″(8th Edition)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定广泛描述在专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771 and 5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，andHiggins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，andHiggins S.J.，eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide toMolecular Cloning″Perbal，B.，(1984)and″Methods in Enzymology″Vol.1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual″CSHL Press(1996)；其均通过引用结合在本文中，如同在本文中完全阐述的。其他的一般性参考文献提供在整个该文献中。其中的程序被认为在本领域中是熟知的并且为了方便读者而提供。其中包含的所有信息均通过引用并入本文。

实施例1

用离体扩增的脐带血的筛选群治疗恶性血液病

为了测定设定细胞群筛选标准对于在临床环境中成功进行来自脐带血的造血干细胞移植的作用，与接收单次未处理的(unmanipulated)脐带血单位移植的相似的受试者比较，在患有恶性血液病(AML、ALL、CML、MDS、HD或NHL)并与未扩增的脐带血细胞一起接受筛选的离体扩增的脐带血HSC移植的受试者中监测诸如移移入时间、百分比移入、副作用和存活率的结果。

材料和方法

受试者群

包括患有恶性血液病并且对其而言成髓性干细胞移植是目前建议的并且为可能挽救生命的治疗的受试者。仅使不具有足够的备选骨髓供体的成人和12岁及以上的青少年入选。

治疗组中包括的受试者标准为：

A：血液疾病，包括：

1.急性髓细胞白血病(AML)：第二次完全好转(CR2)期或后续完全好转期

或具有包括以下中的任何一个的高危特征的CR1：干细胞或双表型分类(AML-M0)、红白血病(AML-M6)、急性巨核细胞性白血病(AML-M7)、高危细胞遗传学或标准诱导疗法之后未达到CR或呈现出髓外病；

或BM中具有＜10％母细胞复发并且没有循环母细胞。

2.急性淋巴细胞性白血病(ALL)：CR2或后续CR

或具有以下高危特征的CR1，包括：高危细胞遗传学或在标准诱导疗法之后未达到CR或呈现有WBC升高(＜17岁，50,000或17岁，20,000)或呈现出髓外病。

或在BM中具有＜10％母细胞复发并且没有循环母细胞。

3.慢性髓细胞白血病(CML)：处于慢性第一期(CP1)并且对格列卫(Gleevec)具有抗性或耐受性

或处于CP2或后续CP；

或处于加速期。

4.何杰金氏病(HD)：对最后的化疗疗程敏感并且具有以下之一：

-第二次复发或

-自体移植失败或

-处于第一次复发并且由于广泛的骨髓累及不适合自体移植。

5.非何杰金氏淋巴瘤(NHL)：对最后的化疗疗程敏感并且具有以下之一：

-第二次复发或

-自体移植失败或

-处于第一次复发并且由于广泛的骨髓累及不适合自体移植。

6.具有中等2-或高危IPSS评分的骨髓增生异常综合症(MDS)

B：年龄＞12并且＜55

C：满足以下要求的脐带血单位的可用性：

1.在4、5、6/6HLA I型(HLA-A&HLA-B，低分辨率)和II型(HLA-DRB1，高分辨率)上匹配。

2.在低温贮藏前使脐带血单位经历体积减小并且以两个部分保存，其中较多的(或相等的)部分包含最少1.0×10⁷个总有核细胞/kg(解冻前)。

3.脐带血单位获自公用脐带血库，在那里遵循适用的地方性要求和规章检测它们的传染性药剂。

D：通过Kamofsky的受试者的行为评分为70％(13岁)或者LanskyPlay-行为评分为70％(年龄＜13)。

E：受试者具有足够的生理储备，包括：

1.左心室射血分数40％。

2.肺功能测试表明预测的50％的校正CO₂弥散量。

3.血清肌酸酐＜1.6mg/dl。

4.血清胆红素＜2.0x正常范围的上限。

5.SGPT(ALT)_3.0x正常范围的上限。

F：在移入失败的情况下受试者具有至少一个后备干细胞来源：

1.在移入失败的情况下受试者愿意接受骨髓收获或外周血祖细胞(PBPC)收集以备用(当临床上可适用时)。

2.受试者具有第二个脐带血单位作为可能的后备。

3.已鉴定出受试者的单倍体相同家族成员并且在移入失败的情况下同意(通过签署书面的知情同意书)捐献造血干细胞。

G.在了解受试者疾病的性质后受试者或监护人签署书面知情同意书并且在被告知备选治疗、潜在风险、利益和不适之后自愿同意治疗方案。

从治疗组中排除的受试者标准为：

A.从处理(除了羟基脲)前患者的最后一次放疗或化疗起少于21天

B.HIV阳性

C.怀孕或哺乳

D.未控制的细菌、真菌或病毒感染。

E.具有活动中枢神经系统(CNS)疾病的体征和症状的受试者。

F.合适的亲缘性和自愿的干细胞供体的可用性，所述供体在5或6/6抗原处被HLA-匹配。

G.先前的同种细胞移植。

H.对牛或任何产品过敏，这可能会干扰治疗。

I.入选另一临床实验或在最后30天期间接受研究性治疗。

受试者筛选

在鉴定了可接受的脐带血单位之后，在移植前3-5周筛选合格的受试者。使受试者或他/她的合法监护人完全知情并且签署书面知情同意书。筛选活动包括：

常规基线评价：

-病史，包括原发和伴发疾病以及合并用药，

以及之前的放疗和化疗进程。

-行为状态：Karnofsky量表(岁数＞13)或Lansky评分(13岁)。

-物理检查和生命体征(包括高度和体重)。

-常规实验室：CBC、血液化学、PT、PTT、尿分析、血清βHCG(女性)(来自筛选前最后一周的测试是可接受的)

-免疫表型分型—淋巴细胞亚型：CD3、CD4、CD8、CD19、CD16/56

-免疫球蛋白水平(IgG、IgA、IgM、IgE)

-胸腔X射线(来自筛选前最后一个月的测试是可接受的)。

疾病状态评价：

-BM(吸入/活检，如临床上指出的)形态学

-对于白血病或MDS：外周血和BM(吸入/活检，如临床上指出的)形态学：FACS测定、细胞遗传学和分子标记。

-对于NHL和HD CT腹部、骨盆和胸部(来自筛选前最后一个月的测试是可接受的)。

-窦CT(来自筛选前最后一个月的测试是可接受的)。

脐带血配型：

-受试者和脐带血单位ABO和Rh分型。

-受试者HLA I型和II型高分辨率分型。

-用于嵌合体实验室的外周血基线样品。

-适用时备用白细胞清除术/BM收获。

血清学筛选：

-HIV 1和2Ab、HTLV 1和2Ab、HbsAg、HbcAb、HCV Ab、HSV Ab、VZV Ab、EBV Ab、弓形病Ab、CMV Ab、牙科咨询(建议，可选)的血清学检测。

免疫表型分型—淋巴细胞亚型：CD3、CD4、CD8、CD19、CD16/56

免疫球蛋白水平(IgG、IgA、IgM、IgE)

生理储备评价：

-包括一氧化碳弥散量(DLCO)的肺功能测试(来自筛选前最后一个月的测试是可接受的)。

-12导线ECG(来自筛选前最后一个月的测试是可接受的)。

-超声心动描记术或具有左心室射血分数(LVEF)的MUGA(来自筛选前最后一个月的测试是可接受的)。

-对于具有自体干细胞备用的受试者，从受试者收获备用干细胞(白细胞清除术或BM)。

所有上述活动均在清髓性(骨髓根除，myeloablative)准备方案开始之前完成。

清髓性(myeloablative)处理

在脐带血移植之前用如下选择的三种清髓性方案之一对患者进行清髓性处理：

方案A：马法兰/噻替派/氟达拉滨/抗胸腺细胞球蛋白(Mel/Thio/Flu/ATG)：

处理的日程

-9水化疗法

-8马法兰140mg/m²，IV(静脉内注射)

-7噻替派10mg/kg，IV

-6氟达拉滨40mg/m²，IV

-5氟达拉滨40mg/m²，IV

-4氟达拉滨40mg/m²，IV

-3氟达拉滨40mg/m2，IV，ATG 1.50mg/kg，IV

-2ATG 1.25mg/kg，IV

-1ATG 1.25mg/kg，IV

方案B：白消安/环磷酰胺/ATG(Bu/Cy/ATG)：

建议基于药物动力学的白消安的剂量调整(方案B.1)，或者使用固定的剂量方案(方案B.2).

方案B.1：Bu/Cy/ATG，具有PK剂量调整的BU

处理的日程

-11水化疗法

-10白消安32mg/m²，IV

-9暂停

-8通过PK调整^*的白消安剂量至AUC 6,000，IV(3小时输注)

-7通过PK调整^*的白消安剂量至AUC 6,000，IV(3小时输注)

-6通过PK调整^*的白消安剂量至AUC 6,000，IV(3小时输注)

-5通过PK调整^*的白消安剂量至AUC 6,000，IV(3小时输注)

-4暂停

-3环磷酰胺60mg/Kg，IVATG 1.50mg/kg，IV

-2环磷酰胺60mg/Kg，IVATG 1.50mg/kg，IV

-1ATG 1.25mg/kg，IV

方案B.2：固定剂量的白消安(具有固定剂量BU的Bu/Cy/ATG)

治疗的日程

-9水化疗法

-8白消安130mg/m²，IV(3-小时输注)

-7白消安130mg/m²，IV(3-小时输注)

-6白消安130mg/m²，IV(3-小时输注)

-5白消安130mg/m²，IV(3-小时输注)

-4暂停

-3环磷酰胺60mg/Kg，IVATG 1.50mg/kg，IV

-2环磷酰胺60mg/Kg，IVATG 1.25mg/kg，IV

-1ATG 1.25mg/kg，IV

方案C：TBI/环磷酰胺/氟达拉滨/ATG(TBI/Cy/Flu/ATG)

除之前接受自体移植的患有HD的受试者之外，该方案还可用于所有受试者。

日程、药剂和给药途径

-10水化疗法(2L/m2/24小时)

-9FTBI^*150cGy x 2

-8FTBI^*150cGy x 2

-7FTBI^*150cGy x 2

-6FTBI^*150cGy x 2

-5环磷酰胺60mg/Kg/天，IV氟达拉滨30mg/m²，IV

-4环磷酰胺60mg/Kg/天，IV氟达拉滨30mg/m²

-3氟达拉滨30mg/m²，IV ATG 1.50mg/kg/天，IV

-2氟达拉滨30mg/m²，IV ATG 1.25mg/kg/天，IV

-1ATG 1.25mg/kg/天，IV

^*可将分次全身照射(FTBI)剂量分成每天一次或3X/天。最大总剂量不应超过1200cGy。

GVHD预防

在开始前第1天进行以下两种GvHD预防方案之一：

方案A

他克莫司/MMF：从开始前第2天直到第180天，他克莫司(KF506，普乐可复)0.03mg/kg/天IV或0.10-0.15mg/kg/天PO。

麦考酚酯(mycophenolate)(MMF)：从开始前第2天直到第100天，MMF的剂量为15mg/Kg，每日口服两次，其中最大剂量为1克每日两次(即，最大总日剂量为2克)。根据片剂大小来调整剂量。如果PO(口服)不耐受，则使用静脉内途径(具有相同的剂量)。

方案B

环孢菌素/MMF：从开始前第2天直到第180天，环孢菌素A(IV或PO)1.5mg/kg BID。麦考酚酯(MMF)：从第2天开始直到第100天，MMF的剂量为15mg/Kg，每日口服两次，其中最大剂量为1克每日两次(即，最大总日剂量为2克)。根据片剂大小来调整剂量。如果PO(口服)不耐受，则使用静脉内途径(具有相同的剂量)。

移植前基线评价

安全性评价

在移植前，如通过身体检查、CBC、血液化学、尿分析、生命体征(体温、血压、脉搏、呼吸频率和饱和度以及体重)、心脏状态(1导联检测器：在移植前，开始心脏监测(1-导联)并且持续直到筛选的扩增干细胞群移植后24小时)来评价受试者。

脐带血单位

将对其研究获得匹配脐带血单位的用于脐带血输注的潜在候选者鉴定为用于研究的筛选候选者。在低温贮藏前使脐带血单位经历体积减小并且以两部分进行冷冻保存。较多的(或相等的)部分具有至少1x10⁷个总有核细胞/kg受试者体重。要求至少4/6位点的HLA I型和II型匹配(低分辨率HLA-A和HLA-B，高分辨率HLA-DRB1)。脐带血单位获自公用库，在那里根据地方适用的要求和规章来检测它们的传染性药剂。

脐带血的离体扩增

将冷冻的脐带血单位保存在液氮中直到使用。将其分成两份，并且对较少的或相等的一份进行解冻，用10％w/v葡聚糖和5％w/v人血清白蛋白(Aventis，Bridgewater NJ，USA)洗涤。将细胞与0.15％w/v静脉内免疫球蛋白(IvIg，Baxter，Deerfield Il，USA)在室温下温育10分钟，离心并且再悬浮在包含0.4％柠檬酸钠、1％人血清白蛋白和0.2mg/ml rHu-DNase(Genentech，San Francisco，CA，USA)的PBS中。然后用CliniMACS CD133+磁性细胞分离剂(Miltenyi Biotech，Auburn，CA，USA)标记细胞并且根据制造商使用说明通过CliniMACS来分离。通过CD133筛选后，将细胞用台盼蓝染色、计数、测定CFUc并且进行免疫表型分型以确定纯度。然后在培养袋(American Fluoroseal Co.，Gaithersburg MD，USA)内以1×10⁴个细胞/ml的浓度将纯化的CD133+细胞培养在最小必需培养基-α(MEM-α)和10％胎牛血清(FCS，Hyclone Logan UT，USA)中，其包含最终浓度为50ng/ml的以下细胞因子：干细胞因子、TPO、IL-6和FLT-3(R&D Systems，Minneapolis MN，USA)以及5μM四亚乙基五胺(TEPA)(Sigma，St Louis，MO，USA)。如果富集之后回收的细胞数量等于或少于19×10⁴，则在72mlVueLife Teflon PEP细胞培养袋(American Fluoroseal Co)中进行扩增，并且如果细胞的数量在20至70×10⁴之间，则在270ml VueLife Teflon PEP细胞培养袋(American Fluoroseal Co)中进行扩增。

在空气中在5％CO₂的加湿气氛中在37℃下将培养物温育3周。每周用相同体积的新鲜培养基、FCS、生长因子和TEPA将培养物加满。在第3周，将细胞洗涤并重悬在100ml PBS/EDTA/人血清白蛋白输注缓冲液中。将输注缓冲液中扩增细胞的样品在活体染色(台盼蓝)后计数，测定CFUc并且进行免疫表型分型用于表面抗原分析(CD34、CD38、CD133)。如本文详述的，将细胞给予受体。在整个过程中检测等分试样的支原体、内毒素、无菌性和革兰氏染色。

未扩增脐带血的解冻和输注

将脐带血单位洗涤以除去DMSO，或者稀释至2.5％的最终DMSO浓度。如果洗掉了DMSO，则将冷冻的脐带血单位部分置于无菌的自封袋中。将该袋浸没在37℃的水浴中并且摇动直至几乎所有的冰晶溶解。向单位中缓慢注射10％葡聚糖-40(9.5ml)，然后注入5％人血清白蛋白(HSA)(9.5ml)。将该混悬液转移至150ml转移袋中并且用40ml的10％葡聚糖-40进一步稀释，然后离心。然后丢弃上清，并将脐带血细胞沉淀重悬在50ml包含50％的10％葡聚糖-40和50％的5％HSA的溶液中。测量并记录该样品的准确体积并且取一份以测量该部分中细胞的总数。取出另外的500μl样品以通过用荧光抗体标记并且通过FACS分析检测来测定CD34+和CD133+群的百分数。然后将脐带血混悬液转移到适合的输注袋内用于经受试者的中心静脉导管以1-3ml/min的速度输注(没有照射)。如果受试者出现胸部紧迫感或其他症状，在继续进行剩余输注之前需要短暂间歇(1-2分钟)。在完成脐带血输注之后需要维持水化(2.5-3.0ml/kg/hr)12小时。如果出现容量超负荷或减少的尿排出量，则可以给予利尿磺胺(0.5-1.0mg/kg/剂量)。

移植后随访和扩增的筛选HSC移植前的安全性评价

安全性评价包括：移植后第15、30、60分钟和第2、4和24小时的生命体征(体温、血压、脉搏、呼吸频率和饱和度)、CBC、血液化学、尿分析、心脏(1导联监测仪)和不良反应记录。

辅助细胞因子疗法起始：从第0天开始直到ANC＞2.5×10⁹/L，以5μg/kg/天的剂量每日SC给予G-CSF(粒细胞集落刺激因子，非格司亭)。

筛选的扩增HSC群的移植

进行质量控制检测，包括生物测定和安全性检测、内毒素和革兰氏染色检测。如果扩增的筛选HSC群不能满足任何安全性检测规格(内毒素含量和格兰式染色)，则将其销毁。但是，如果所筛选的扩增HSC群不能满足生物测定的规格，则可将其运至临床地点，并且可以使用。在通过具有管线过滤器的受试者中心静脉导管以1-3ml/min的速度输注之前，通过按压将扩增的筛选HSC袋充分但是温和地混合。当需要时，根据具体的扩增的筛选HSC群中内毒素的水平，将输注速率调节至较低的速率从而使内毒素输注不超过5Eu/kg/hr。如果待输注较大(或相等)体积的扩增的筛选HSC(＞15ml/kg)，则输注一半体积，接着间歇30分钟，然后输注剩余体积。在完成脐带血输注之后，维持水化(2.5-3.0ml/kg/hr)12小时。如果出现容量超负荷或尿排出量减少，则可以给予利尿磺胺(0.5-1.0mg/kg/剂量)。移植后的安全性评价包括第15、30、60分钟和第2、4和24小时的生命体征(体温、血压、脉搏、呼吸频率和饱和度)、CBC、血液化学、尿分析、心脏(1导联监测仪)和不良反应记录。

随访

在最后一次移植后在预定的日期随访访问标准评价和他克莫司/环孢菌素水平、免疫建立、不良反应、CMV和GvHD评价、骨髓和外周血评价(对于嵌合体，分子标记和细胞遗传学)、免疫分型、CT(仅淋巴瘤)。从骨髓吸入和外周血样品评价第+35天的移入。利用第+42天或之前宿主造血作用的证据，通过不存在供体造血作用来定义移植物排斥。

统计学

前述结果(具有10名受试者)表明接受扩增HSC的患者具有20％的第100天死亡率。NCBP和国际血液和骨髓移植研究(CIBMTR)登记处中心的组合结果(共431名年龄在12-55岁具有所述适应症(AML，ALL，HD，NHL)之一的脐带血移植受体)的初步分析显示在第100天46％的死亡率。保守起见，在我们的统计学功率计算中在历史对照组中我们使用43％作为第100天总体死亡率。

因此，与对照组中43％的死亡率相比，各种水平的移植的受试者的第100天死亡率(20％、25％、27％、30％)在5％显著性水平的双侧似然比检验的统计功效分别对应于让步比0.33、0.44、0.49和0.57。

移入失败监测是基于对中性粒细胞移入失败率超过17％的贝叶斯后验概率的计算(约为对照患者所经历的)。急性GvHD监测是基于对III-IV级GvHD率超过19％的贝叶斯后验概率的计算(约为对照患者所经历的)。基于第100天整体死亡率超过0.43的贝叶斯后验概率计算100天整体死亡率监测(约为对照患者所经历的)。

使用对数回归和似然比检验，整体显著性水平为单尾2.5％。这相当于双尾5％显著性水平。

扩增的造血细胞群的评价

基于未扩增的脐带血部分中的输注前计数来估算祖细胞/干细胞群的扩增参数。所测定的参数包括：

冷藏的总有核细胞：细胞剂量/kg受体体重

输注细胞：未扩增细胞和扩增的群：细胞剂量(总细胞)/kg受体体重。仅扩增细胞的倍数增加。

CD34+细胞：仅未扩增的细胞群：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重。扩增和未扩增部分：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重。仅扩增部分：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重；来自总细胞的百分数；倍数扩增。

CD133+细胞：仅未扩增的细胞群：细胞剂量/kg受体体重。扩增和未扩增部分：绝对细胞剂量；细胞剂量/Kg受体体重。仅扩增的细胞：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重；来自总细胞的百分数；倍数扩增。

CD38-细胞：仅扩增的细胞：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重。

CD38+细胞：仅扩增的细胞：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重。

CXCR4+细胞：仅扩增的细胞：绝对细胞剂量；细胞剂量/kg受体体重。

CFU细胞：仅扩增的细胞：细胞剂量/Kg受体体重。倍数增加。

使用回归分析，然后使所述参数与如本文详述的临床结果(移入时间、百分比移入、GvHD、毒性、100天、180天存活率、无病存活率、中性粒细胞移入、血小板移入、感染)相关。首先建立单变量关系，然后针对每一个临床结果，基于以下参数构建模型：(i)CD34+细胞的比例；(ii)总细胞的倍数扩增；(iii)第21天培养时总细胞的百分比活力；以及(iv)活细胞的总数。

结果

筛选对移入效力的作用以及在血液病中用扩增的造血脐带血干细胞群进行移植的临床结果

对接受未扩增和扩增的脐带血细胞群二者的患有恶性血液病的受试者与仅接受未扩增脐带血的受试者的临床结果(GvHD、毒性、100天、180天存活率、无病存活率、感染)和移入参数(移入时间、百分比移入、中性粒细胞移入、血小板移入)的比较表明加入的扩增HSC对移入效力的作用。根据CD34+细胞的比例、倍数扩增、总细胞活力和活细胞的总数来筛选扩增的脐带血群，并且其特征为CD34+细胞的比例为总细胞的约4％；群的总细胞的倍数扩增为约50倍；第21天培养时群中总细胞的活力为约85％；并且扩增群的活细胞总数为23×10⁶个活细胞，这预期产生更优的临床结果和改进的移入参数。

尽管已结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但是许多备选方案、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，预期包括属于所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的备选方案、修改和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以其整体通过引用而结合在本说明书中，正如具体并且单独指明每一个单独出版物、专利或专利申请以引用方式结合在本文中的程度。此外，本说明书中任何参考文献的引用或识别不应理解为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术获得。就所使用章节标题而言，它们不应被解释为必要的限制。

参考文献的列表

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Dombret，H.，et al.Blood；2002，100：2357-66

Larochelle et al，Semin.Hematol.2004；41：257-71

Oh，H.，et al.Bone Marrow Transplant，1998；22：253-7

Peled et al(Cytotherapy，2004，6：344-55

Claims

1.一种筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞群的方法，所述方法包括：

(a)在给药前在扩增造血细胞的候选群中确定以下参数中的至少一个：

(i)所述群中CD34+细胞的比例；

(ii)所述群中总细胞的倍数扩增；

(iii)所述群中所述细胞的活力；以及

(iv)活细胞的总数；和

(b)根据所述参数中的至少一个的预定值来筛选或排除所述候选群，

由此筛选适合于移植的离体扩增的造血干细胞群。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CD34+细胞的所述比例是总细胞的约3％至约10％。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CD34+细胞的所述比例是总细胞的约3％至约5％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CD34+细胞的所述比例是总细胞的约4％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述群的总细胞的所述倍数扩增是约10至约70倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述群的总细胞的所述倍数扩增是约25至约60倍。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述群的总细胞的所述倍数扩增是约50倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在第21天培养时所述群中总细胞的所述活力为约65％至约95％。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，在第21天培养时所述群中总细胞的所述活力为约75％至约90％。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，在第21天培养时所述群中总细胞的所述活力为约85％。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增的群的活细胞的所述总数是约15×10⁶至约60×10⁶个活细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增的群的活细胞的所述总数是约20×10⁶至约30×10⁶个活细胞。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增的群的活细胞的所述总数是约23×10⁶个活细胞。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选根据所述参数中的至少两个的值来确定。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选是根据所述参数中的至少三个的值。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选是根据所有四个所述参数的值。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选是根据所述参数的以下值：

(i)所述CD34+细胞的所述比例为总细胞的约4％；

(ii)所述群的总细胞的所述倍数扩增是约50倍；

(iii)在第21天培养时所述群中总细胞的所述活力为约85％；以及

(iv)所述扩增的群的活细胞的所述总数为约23×10⁶个活细胞。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，通过在细胞因子和铜螯合剂存在的情况下培养造血细胞通过离体增殖来扩增所述造血干细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述细胞因子是早期作用细胞因子。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述早期作用细胞因子选自由干细胞因子、FLT3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和血小板生成素组成的组。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述细胞因子是干细胞因子、血小板生成素、白介素-6和FLT3配体。

22.根据权利要求19所述的方法，其中，以50ng/ml的浓度提供所述细胞因子。

23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述铜螯合剂是四亚乙基五胺(TEPA)。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，以5μM的浓度提供所述四亚乙基五胺。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增的造血干细胞已被培养21天。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增的造血干细胞群在扩增前包括至少1×10⁵个细胞。

27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞群选自由脐带血、外周血和骨髓组成的来源。

28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞群是脐带血。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述脐带血是解冻的冷冻脐带血。

30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞群在扩增前已被富集造血干细胞。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述造血细胞群在扩增前已被富集CD34+或CD133+细胞。

32.根据权利要求1所述的方法筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群。

33.根据权利要求17所述的方法筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群。

34.一种在需要其的受试者体内治疗血液疾病或病症的方法，所述方法包括给予需要其的受试者通过以下筛选的适合于移植的扩增的造血干细胞群：

(i)所述群中CD34+细胞的比例；

(ii)所述群中总细胞的倍数扩增；

(iii)所述群中所述细胞的活力；以及

(iv)活细胞的总数；和

由此在所述受试者中治疗和/或预防所述血液疾病。

35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述筛选是根据所述参数的以下值：

(i)所述CD34+细胞的所述比例是总细胞的约4％；

(ii)所述群的总细胞的所述倍数扩增是约50倍；

(iv)所述扩增的群的活细胞的所述总数是约23×10⁶个活细胞。

36.根据权利要求34所述的方法，其中，通过在细胞因子和铜螯合剂存在的情况下培养造血细胞通过离体增殖来扩增所述造血干细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述细胞因子是早期作用细胞因子。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述早期作用细胞因子选自由干细胞因子、FLT3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和血小板生成素组成的组。

39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述细胞因子是干细胞因子、血小板生成素、白介素-6和FLT3配体。

40.根据权利要求39所述的方法，其中，以50ng/ml的浓度提供所述细胞因子。

41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述铜螯合剂是四亚乙基五胺(TEPA)。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，以5μM的浓度提供所述四亚乙基五胺。

43.根据权利要求36所述的方法，其中，所述扩增的造血干细胞已被培养21天。

44.根据权利要求36所述的方法，其中，所述血液疾病选自由急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CLL)、何杰金氏淋巴瘤(HL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及骨髓增生异常综合症(MDS)组成的组。

45.根据权利要求36所述的方法，所述方法进一步包括在将所述细胞给予所述受试者之前，将所述扩增的造血细胞与未扩增的造血细胞混合。

46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述扩增的造血细胞和所述未扩增的造血细胞获自相同的一个或多个脐带血单位。

47.根据权利要求45所述的方法，其中，在所述扩增的造血干细胞群之前给予所述未扩增的造血细胞。

48.根据权利要求36所述的方法，其中，在所述造血细胞的所述给予之前用免疫抑制治疗来治疗所述受试者。

49.根据权利要求36所述的方法，其中，在所述造血细胞的所述给予之后用免疫抑制治疗来治疗所述受试者。

50.根据权利要求36所述的方法，其中，将所述扩增的造血细胞与用于血液疾病的另外的治疗结合共给予。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述另外的治疗选自由免疫抑制治疗、化疗和放疗组成的组。

52.一种制品，包括包装材料和所筛选的离体扩增的造血细胞群，通过以下来筛选适合于移植的所述造血细胞群：

(i)所述群中CD34+细胞的比例；

(ii)所述群中总细胞的倍数扩增；

(iii)所述群中所述细胞的活力，以及

(iv)活细胞的总数；和

(b)根据所述参数中的至少一个的预定值来筛选或排除所述候选群；

并且其中，所述包装材料包括指明所述造血细胞群是用于在需要其的受试者中治疗血液疾病或病症的标签或包装说明书。

53.根据权利要求52所述的制品，其中，所述筛选是根据所述参数的以下值：

(i)所述CD34+细胞的所述比例是总细胞的约4％；

(ii)所述群的总细胞的所述倍数扩增是约50倍；

(iv)所述扩增的群的活细胞的所述总数是约23×10⁶个活细胞。