CN108350419A - 干细胞移植方法和干细胞移植组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开涉及造血干细胞或祖细胞移植领域。更具体地，提供了通过与内皮细胞共培养和共同施用来改善造血干细胞或祖细胞的扩增和植入的方法、组合物和试剂盒。该方法、组合物和试剂盒可用于治疗与由疾病或清髓治疗引起的造血功能缺陷相关的各种疾病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年7月20日提交的美国临时专利申请No.62/194,460的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
参考引用
为了仅允许通过引用并入的那些管辖权的目的，本发明公开中引用的所有参考文献通过引用整体并入本发明。此外，本发明引用或提及的任何产品的任何制造商提供的说明书或目录，通过引用并入本发明。通过引用结合到本发明中的文件或其中的任何教导可以用于本发明的实践中。
背景技术
领域
本发明涉及用于改善干细胞疗法的方法和组合物，具体涉及用于促进造血干细胞和祖细胞的扩增和植入、以及干细胞移植受体的造血系统的免疫重建的方法和组合物。
介绍
造血干细胞或祖细胞移植(Hematopoietic stem orprogenitor celltransplantation,HSCT)是各种血液疾病治疗手段的重要组成部分。一般来说，有两种类型的HSCT：自体移植和异体移植。自体移植涉及在清髓治疗后注入受体自身的细胞。自体细胞移植将移植物抗宿主病(GVHD)的风险降至最低，因而减少并发症。异体移植涉及注入供体干细胞，通常使用与受体的MHC匹配的供体。然而，匹配的无关供者(MUD)移植也与更强的移植物抗宿主反应有关，因此导致死亡率升高。
造血干细胞和/或祖细胞(hematopoietic stem and/or progenitor cells,HSPC)有三种主要来源：骨髓、外周血和脐带血。脐带血(UCB)是其他造血祖细胞来源(例如骨髓和动员外周血)的实用替代来源，用于相关和不相关的异基体造血干细胞移植。然而不幸的是，尽管脐带血容易获得并且移植物抗宿主病的发生率较低，但它也存在多细胞系细胞(例如嗜中性粒细胞、血小板、红细胞)的移植延迟的特点，而这些对于成功和临床上的免疫重建都具有重要意义。因此，虽然有望利用从脐带血中获得的HSPC治疗血液系统疾病，但是造血恢复的速率缓慢仍然是一个主要障碍(Laughlin等人，N.Eng.J.Med.351:22；2265-2275(2004))，并且植入效率仍然显著低于来自骨髓或外周血的HSC(Rocha等人，N.Eng.J.Med.351:22；2276-2285(2004))。
造血干细胞可以在包含细胞因子混合物的不同培养基组合物中扩增。干细胞扩增技术在本领域中是已知的，如美国专利6,326,198，美国专利6,338,942，美国专利第6,335,195号。小林等人和巴特勒(Butler)等人最近描述了通过用腺病毒E4ORF1基因对自原代人内皮细胞(EC)进行转导产生亲造血血管生态位，所述腺病毒E4ORF1基因最小程度地激活导致促造血存活和增殖信号的表达的Akt/Mtor途径(Kobayashi等人，Nature Cell Biology12,1046-1056(2010)；Butler等人，Blood 120,1344-1347(2012))。典型的HSPC/EC扩增程序使用初始的EC：HSPC比率为6：1至3：1，将HSPC共培养于保存在小细胞培养瓶中的单层EC上。24-48小时后，将HSPC移出并沉积在第二个烧瓶中的另一单层EC上，依此类推，直到获得所需数量的HSPC。然而，这种基于烧瓶的扩增的一个重大缺陷是开放事件的数量很高，每一个典型程序中多达1,800个，这大大增加了污染的风险。
目前对于能够在临床上有用地扩增人类CD34+HSPC以及其他造血元素的体外培养方法和系统仍然存在需求。需要能够产生大量某些骨髓元素的系统来提供足够量的元素用于人类治疗，例如骨髓移植、可输血的血液成分或基因疗法。这里描述的方法满足上述以及其他需求。
发明内容
本发明针对并成功地解决了本领域中长期存在的需求，通过在封闭系统生物反应器中使用至少25：1、50：1、100：1或500：1，或更优选的高达1000：1、2000：1或3000：1的初始EC/HSPC比率对HSPC与内皮细胞进行共培养从而提供空前水平的HSPC扩增。重要的是，HSPC和EC之间的相互作用在扩增过程中不受干扰，从而保持了HSPC和EC之间的连续的细胞间通讯，提高了扩增效率和总体产出。此外，与开放细胞培养环境(例如培养瓶)相比，开放事件的数量减少也大大降低了污染风险。
根据本发明所述的方法扩增的HSPC具有有益的药理学作用，特别是当与EC结合施用于HSCT受体时，其中在整个扩增和施用期间在HSPC和EC之间保持连续的相互作用。这些同种异体内皮细胞在血液循环和/或组织中的短暂存在提供了HSCT中有益的体内结果，例如增强的多谱系植入和更长的植入期，以及相对快速的初始植入，例如，通过嗜中性粒细胞计数进行检测。如本发明第一次所证实的，即使内皮细胞在与HSC共培养之前进行照射并且不能复制，情况也是如此。
因此，本发明一个方面涉及在有此需要的个体中进行干细胞移植的方法，其包括：(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中，其中在整个扩增步骤和输入步骤中HSPC和EC之间保持连续的相互作用。
本发明另一方面涉及包含HSPC和EC的组合物，其用于在有此需要的个体中的干细胞移植，其中所述干细胞移植包含本发明所述的方法。优选地，EC在整个扩增和输入步骤中持续地与HSPC相邻，如本发明所述和所示。更优选地，EC至少在扩增步骤期间与HSPC连续接触。
在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约200：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约300：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约400：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约500：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约600：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约700：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1000：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约2000：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约3000：1。
在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约10：1至约1：10。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约10：1至约1：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约9：1至约2：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比例为约8：1至约3：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约7：1至约4：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约6：1至约5：1。
本发明的另一方面涉及根据本发明所述的方法分离、扩增、保存和施用HSPC和内皮细胞的试剂盒或系统。
附图说明
本领域技术人员将会理解，附图仅用于说明的目的，并不意图以任何方式限制本发明教导的范围。
图1显示了经辐射照射效果的E4ORF1+工程化的EC的相位显微镜图像。在标准培养条件下收获EC并用E4ORF1转导。然后将细胞分成两个烧瓶并进一步培养至100％融合。一个容器未被处理(左图)，另一个容器用铯照射器用1500cGy照射(右图)。通过相差显微镜在两个烧瓶之间没有检测到差异。
图2显示在培养一周期间经辐照(下排)和未经辐照(上排)E4ORF1+工程化的EC的连续相显微镜图像。将两个细胞瓶培养至半融合，此时用铯照射器以1500cGy照射一个瓶(底部)。将两个烧瓶进一步培养一周，并在照射后第1、第5和第7天于相差显微镜下成像。
图3显示了在与经照射的(下排)和未经照射的(上排)E4ORF1+工程化的EC共培养的HSPC的相差显微镜图像。将纯化的来自脐带血的HSPC(CD34+)在6孔板中与未经照射及经1500cGy照射的E4ORF1EC的融合单层共培养。在细胞的11天扩增和连续传代结束时，获得原始培养孔(“母孔”，左栏)和通过连续传代产生的最后一孔(“最终孔”，右栏)的相差显微镜图像。
图4显示了HSPC与经照射的(底部小图)和未经照射的E4ORF1+工程化的EC(上图)的共培养物的流式细胞术数据。将纯化的来自脐带血的HSPC(CD34+)在具有经融合的单层辐照或未辐照的E4ORF1EC的6孔板中共培养。在11天扩增结束时，通过流式细胞术分析造血细胞。左栏显示了表达CD45(泛造血细胞表面标记)的细胞染色的结果。右图显示细胞双重染色CD34(HSPC阳性标记)和CD38(HSPC阴性标记)表达的结果。
图5显示了HSPC-E4ORF1+工程化的EC的短期(左图)和长期(右图)共培养和由此产生的EC磨损的代表性相差显微镜图像。将来自脐带血的纯化的HSPC(CD34+)在具有融合单层EC的6孔板中共培养。随着HSPC群体的扩增，非粘附细胞被轻轻去除并置于更大和新鲜的EC层上。对被称为“母孔”的原始孔补充加入培养液。大约每48小时对所有共培养的孔重复该过程。在共培养的7天期间，与相同扩增HSPC与新鲜铺板的E4ORF1与EC共培养仅1天(左图)相比，母孔中的E4ORF1+工程化EC被耗尽(右图)。
图6显示了具有连续E4ORF1+工程化的EC和HSPC接触的生物反应器中的总造血细胞扩增的量化结果，与单独的细胞因子的扩增和不连续的E4ORF1+工程化的EC和HSPC接触的扩增相比较。将来自脐带血的纯化的HSPC(CD34+)在单独的细胞因子的培养瓶中，在单层E4ORF1+工程化的EC的培养瓶中，或在预装有E4ORF1+工程化的EC的中空纤维生物反应器中扩增。在培养瓶中细胞因子单独扩增和E4ORF1+工程化的EC的扩增需要破坏培养过程以在扩增过程中冲洗和重新铺板细胞。在培养的第6天进行CD45+细胞群的细胞计数和流式细胞计数。
图7表示具有连续E4ORF1+工程化的EC和HSPC接触的生物反应器中的HSPC扩增的集落形成测定的定量结果，与仅用细胞因子的扩增和用不连续的E4ORF1+工程化的EC和与HSPC接触的扩增相比较。缩写“CFU”是指菌落形成单位。在多个显微镜视野中的菌落频率被用于外推总扩增种群中的CFU数量。
详细说明
定义
关于本公开，除非另外特别定义，否则本发明描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。因此，下列术语意在具有以下含义：
“同种异体”是指来自、起源于或作为同一物种的成员，其成员在遗传上相关、或在遗传上无关但在遗传上相似。“异体移植”是指细胞或器官从供体转移到受体，其中受体是与供体相同的物种。
“自体”是指来源于或源自同一个体或患者。“自体移植”是指收集和再移植个体自身的细胞或器官。
“定型髓样祖细胞”或“髓样祖细胞”或“MP”是指能够最终发展成髓样谱系的任何终末分化细胞的多能或单能祖细胞，而这些终末分化细胞通常不会分化成淋巴谱系的细胞。因此，“髓样祖细胞”是指骨髓谱系中的任何祖细胞。骨髓谱系的定向祖细胞包括本文定义的寡能CMP、GMP和MEP，但也包括单能红细胞祖细胞、巨核细胞祖细胞、粒细胞祖细胞和巨噬细胞祖细胞。髓细胞祖细胞的不同细胞群可通过其分化潜能与其他细胞区分开来，并且存在一组特征性的细胞标记物。
“普通髓样祖细胞”或“CMP”是指具有产生粒细胞/单核细胞(GMP)祖细胞和巨核细胞/红细胞(MEP)祖细胞能力的细胞。这些祖细胞具有有限的自我更新能力或不具有自我更新能力，但能够产生髓样树突状细胞，类红细胞系(myeloid erythroid)，红细胞系，巨核细胞，粒细胞/巨噬细胞，粒细胞和巨噬细胞。
如本发明所说的“连续相互作用”是指在本发明所述一个或多个处理步骤期间至少HSPC与EC之间的连续接近。在本发明中“接近”是指HSPC和EC在相同的培养基中共同存在，上述培养基例如是细胞培养基，输液培养基，或在扩增和输入步骤之间的任何可选步骤期间使用的任何培养基，可选步骤例如收获扩增的细胞群，或制备包含扩增细胞群的药物组合物。在一些实施方式中，在扩增和输入步骤组合的过程中HSPC和EC连续接近。换句话说，在整个扩增步骤中和在输入步骤完成之前，HSPC和EC同时存在于相同的培养基中。例如，在扩展步骤期间不会从扩展介质移除HSPC，例如，使HSPC与另外的EC接触。此外，在一些实施方式中，本发明所述的方法不包括任何纯化步骤，由此在输血步骤之前将内皮细胞从包含扩增的HSPC的扩增细胞群中移除。如本发明所说的“连续相互作用”还可以指在本发明所述的一个或多个处理步骤期间，HSPC与EC之间的连续接触。在一些实施方式中，HSPC和EC在扩增步骤期间连续接触。在这种情况下，HSPC和内皮细胞之间的“接触”一词是指其中HSPC和EC之间的距离≤500μm的空间关系。在一些实施方式中，HSPC与EC之间的距离≤400μm。在一些实施方式中，HSPC与EC之间的距离≤300μm。在一些实施方式中，HSPC与EC之间的距离≤200μm。在一些实施方式中，HSPC和EC之间的距离小于或等于执行扩张的血管的内径尺寸。
“培养”是指细胞或生物体在各种介质上或介质中的繁殖。“共培养”是指两种或更多种不同类型的细胞或生物体在各种培养基上或培养基中的繁殖，例如在一些实施方式中，可以共培养HSPC和内皮细胞。
当与细胞一起使用时，术语“工程化的”是指已被人工改造以产生所述表型的细胞(例如，E4ORF1+)，或表达所列举的核酸分子或多肽。术语“工程化的细胞”不意图包括天然存在的细胞，而是意图涵盖例如包含重组核酸分子的细胞，或人为地(例如通过遗传修饰)已经被人工改变的细胞，例如，以便它们表达它们原本不会表达的多肽，或者使得它们以比在非工程化的内皮细胞中观察到的高得多的水平表达多肽。
在细胞的上下文中的“扩增”是指特定细胞类型或细胞类型从初始细胞群体的数目增加，所述细胞类型可以是相同或不相同的。用于扩增的初始细胞不必与由扩增产生的细胞相同。例如，可以通过初始细胞群的生长和分化来产生扩增的细胞。从术语扩增中排除了用于表征细胞分化潜能的有限稀释测定法。
“遗传修饰”或“遗传修饰的”是指对细胞正常核苷酸的任何添加、删除或破坏。本发明的方法旨在包括外源或外源基因转移(或核酸序列转移)到HSPC或内皮细胞的任何遗传修饰方法。术语“遗传修饰”包括使用基因递送载体，包括但不限于转导(体内或体外核酸向受体的病毒介导的转移)，转染(分离的核酸的细胞摄取)，脂质体介导的转移和其他手段是本领域众所周知的。
“移植物抗宿主疾病”或“GVH”或“GVHD”是指当将不同MHC类别的淋巴细胞引入宿主时发生的细胞应答，导致淋巴细胞对宿主的反应。
“粒细胞/巨噬细胞祖细胞”或“GMP”是指来源于普通髓样祖细胞的细胞，其特征在于具有产生粒细胞和巨噬细胞的能力，但通常不产生类红细胞或骨髓谱系的巨核细胞。
“造血系疾病”是指任何血液紊乱，包括但不限于造血系统恶性肿瘤、血红蛋白病和免疫缺陷。
“造血干细胞或祖细胞”或“HSPC”涵盖本发明所定义的HSC以及能够最终分化成造血系统的所有细胞类型的多能非自我更新祖细胞，以及能够分化成造血细胞系统的某些细胞类型的寡能和单能祖细胞。HSPC包括本发明定义的CMP、MP、MEP和GMP。
“造血干细胞”或“HSC”是指能够最终分化为造血系统的，包括B细胞、T细胞、NK细胞、淋巴样树突细胞、髓样树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞和红细胞等在内的所有细胞类型的克隆形成的自我更新的多能细胞。如同造血系统的其他细胞一样，HSC通常通过一组特征性细胞标记物来定义。
“分离的”是指从其天然存在状态下与其相关的至少一种其他产物、化合物或组合物中分离的产物、化合物或组合物，无论是天然状态还是合成制备获得。
“标志物表型”是指鉴定细胞上的标志物或抗原以确定其表型(例如分化状态和/或细胞类型)。这可以通过免疫分型进行，免疫分型使用识别细胞上存在的抗原的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的，但通常选择与其他细胞标记物具有最小的交叉反应性。应该理解的是，某些细胞分化或细胞表面标记对于细胞来源的动物物种是独特的，而其他细胞标记在物种之间是共通的。即使在结构(例如氨基酸序列)中存在物种差异，这些定义物种之间的相同细胞类型的标记也被赋予相同的标记鉴定。细胞标记包括细胞表面分子，在某些情况下也称为细胞分化(CD)标记和基因表达标记。基因表达标记是指示细胞类型或分化状态的那些表达基因组。部分地，基因表达谱反映细胞表面标记，尽管它们可能包括非细胞表面分子。
“巨核细胞/红细胞祖细胞”或“MEP”是指来源于普通骨髓祖细胞的细胞，具有能够产生红细胞和巨核细胞的特点，但其通常不产生粒细胞、巨噬细胞或髓样树突状细胞。
“清髓性”或“清髓”是指通常通过暴露于细胞毒性剂或辐射造成的造血系统的损伤或破坏。清髓包括由高剂量细胞毒素剂或全身辐射破坏造血系统引起的完全清髓。还包括由非清髓性调理引起的不完全清髓状态。因此，非清髓性调理是不完全破坏个体的造血系统的治疗。
“自我更新”是指细胞分裂并产生具有与亲本细胞相同(例如，自我更新)特征的至少一个子细胞的能力。第二个子细胞可能致力于特定分化途径。例如，自我更新的造血干细胞分裂并形成一个子干细胞以及一个致力于在髓样或淋巴途径中分化的子细胞。定型祖细胞典型地丧失了自我更新能力，并在细胞分裂时产生显示更分化的(即限制的)表型的两个子细胞。
与细胞有关的“分选”是指基于物理特性和标志物分离细胞(例如使用侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)的分选或使用标记的抗体的荧光激活细胞分选(FACS))，或基于细胞标志物的存在的细胞分析，如不含分选的FACS(FACS without sorting)。
“干细胞”是指各种细胞类型的干细胞，如肌肉、上皮、神经和骨干细胞。更具体地说，本发明涉及HSPC。
除非另有说明，“个体”或“患者”可互换使用，指的是哺乳动物，例如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。
“基本上纯的细胞群”是指具有至少约50％，优选至少约75-80％，更优选至少约85-90％和最优选至少约95％的特定细胞标志物特征和分化潜能的细胞构成总细胞群。因此，“基本上纯的细胞群”是指含有少于约50％，优选少于约20-25％，更优选少于约10-15％，最优选少于约5％的细胞在指定的测定条件下不显示特定的标志物特征和分化潜能。
“治疗性基因”是指整个基因或只是该基因的功能活性片段。治疗性基因能够补偿患者由于缺陷或不存在的内源基因引起的缺陷。另外，治疗性基因可以是拮抗感染剂的产生或功能，拮抗病理过程，改善宿主的基因组成，促进植入或干细胞的治疗效力的基因。
“异基因”是指来源于或起源于不同物种的成员，例如人类和啮齿动物，人类和猪，人类和黑猩猩等等。“异种移植”是指细胞或器官从供体转移到受体，其中受体与供体是不同的物种。
造血干细胞或祖细胞的扩增
本发明公开描述了用于促进HSPC植入的方法、组合物和系统或试剂盒。一方面，提供了用于增强有需要的患者中的HSPC植入的方法，其包括将HSPC与EC共同培养并共注入，同时始终保持HSPC与EC之间的连续相互作用。如本文首次证明的，在整个扩增和输入步骤中保持HSPC和EC之间的连续相互作用提高了所得扩增HSPC的扩增和植入的效率，从而提高了免疫重建的速度和完整性，并且因此提高了接受HSPC移植物的移植患者的存活率。
造血干细胞是能够自我更新的多能干细胞，具有能够在允许条件下产生造血系统的所有细胞类型的特点。HSC自我更新是指HSC细胞分裂并产生至少一个具有与HSC相同的自我更新和分化潜能的子细胞的能力；也就是说，细胞分裂会产生更多的HSC。自我更新为造血系统的补充提供了一个连续的未分化干细胞来源。用于鉴定HSC的标记表型是本领域中通常已知的。对于人HSC，细胞标志物表型优选包括CD34+CD38-CD90(Thy1)+Lin-。对于小鼠HSC，示例性细胞标志物表型是Sca-1+CD90+(参见例如Spangrude,G.J.等人，Science 1:661-673(1988))或c-kit+Thylo Lin-Sca-1+(见Uchida,N.等人，J.Clin.Invest.101(5):961-966(1998))。可选的HSC标志物，如醛脱氢酶(参见Storms等，Proc.Nat’lAcad.Sci.96:9118-23(1999)，AC133(参见Yin等人，Blood 90:5002-12(1997)和CD150(SLAM)(参见KielCell 2005,121(7)1109-21))也可以发现有利的用途。
HSC可以从多种来源获得，包括骨髓、外周血、脐带血和其他已知具有造血和骨髓祖细胞的来源，包括肝脏，特别是胎儿肝脏。外周血和脐带血是HSC的丰富来源。使用本领域已知和通常实践的方法获得细胞。例如，在Sutherland等人，Bone Marrow Processing andPurging:APractical Guide(Gee,A.P.ed.),CRC Press Inc.(1991)中描述了制备骨髓细胞的方法。HSC也可以源自原始干细胞来源，如胚胎干细胞(Thomson等，Science 282:1145(1998))和生殖细胞(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726(1998))，使用适当的扩增和分化技术。
如本文一般性描述的，HSC细胞源自具有造血系统的任何动物物种。优选地，合适的动物是哺乳动物，包括但不限于啮齿动物、兔子、犬科动物、猫科动物、猪、马、牛、灵长类动物(例如人类)等。
本发明的一个方面涉及在有此需要的个体中干细胞移植的方法，其包括：(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中，其中在整个扩增步骤和输入步骤中在HSPC和EC之间保持连续的相互作用。
本发明的另一个方面涉及包含HSPC和EC的组合物，其用于在有此需要的个体中的干细胞移植，其中所述干细胞移植包括：(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中，其中在整个扩增步骤和输入步骤中在HSPC和EC之间保持连续的相互作用。
在一些实施方式中，HSPC是造血干细胞。在一些实施方式中，HSPC相对于个体是同种异体的。在一些实施方式中，HSPC是脐带血HSPC。在一些实施方式中，HSPC相对于个体是自体的。在一些实施方式中，HSPC是基因修饰的稳态骨髓来源的HSPC。
在一些优选的实施方式中，内皮细胞是经遗传修饰的。腺病毒早期4(E4)区域含有至少6个开放阅读框(E4ORF)。已显示整个E4区域调节血管生成并促进内皮细胞的存活，但不促进其增殖(参见例如Zhang等人(2004)，J.Biol.Chem.279(12):11760-66)。使用整个E4区在临床上或实验上诱导血管生成或促进内皮细胞的存活或增殖可能不是所希望的，因为一些E4ORF可能具有有害作用。例如，已知E4ORF6基因诱导凋亡(Yamano等人，(1999)J.Virol.73:10095-103)。而且，E4ORF具有免疫原性，因此给个体施用所有的E4ORF可能是不理想的。Rafii等人(WO2008089448)鉴定了E4ORF区域内可用于诱导血管生成和促进内皮细胞存活和增殖的序列。
转录因子(TF)的E-26(ETS)-家族中的一部分，包括ETV2(Lee等人，Cell stemcell,2:497-507(2008)；Sumanas等人，Blood,111:4500-4510(2008))，FLU(Liu等人，Current Bio.18:1234-1240(2008))和ERG(McLaughlin等人，Blood,98:3332-3339(2001))涉及调节血管发育和血管生成(De Val等，Dev Cell,16:180-195(2009)；Sato等人，CellStruct Funct,26:19-24(2001))。这些TF直接调节与EC发育和功能相关的基因的表达。成体EC表达几种ETS因子，例如FLU，ERG(同种型1和2)、ETS1、ETS2、Elfl、Elk1、VEZF和ETV6，而ETV2在胚胎发育期间瞬时表达，并且在成体EC中不存在(Kataoka等人，Blood,118:6975-6986(2011)；Lelievre等人，The International Journal OfBiochemistry and CellBiology,33:391-407(2001))。
在一些实施方式中，EC被工程化以表达腺病毒E4ORF1多肽(即它们是E4ORF1+工程化的内皮细胞)。在一些实施方式中，内皮细胞被工程化以表达一种或多种ETS家族转录因子，例如以上列出的那些(即，它们是ETS+工程化的内皮细胞)。在一些实施方式中，内皮细胞被工程化以表达ETS家族转录因子ETV2(即，它们是ETV2+工程化的内皮细胞)。在一些实施方式中，EC是E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞。在一些实施方式中，EC是E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞。在一些实施方式中，EC也是E4ORF6+。在一些实施方式中，EC包含编码ETS家族转录因子的重组核酸分子。在一些实施方式中，EC包含编码ETV2多肽的重组核酸分子。在一些实施方式中，EC包含编码腺病毒E4ORF1多肽的重组核酸分子。在一些实施方式中，EC包含编码腺病毒E4ORF6多肽的重组核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子呈质粒载体的形式。在一些实施方式中，核酸分子被整合到工程化EC的基因组DNA中。在一些实施方式中，EC是分化的EC。在一些实施方式中，EC是成体EC。在一些实施方式中，EC不是胚胎EC。在一些实施方式中，EC是人EC。在一些实施方式中，EC是主要的EC。在一些实施方式中，EC是人脐静脉EC(HUVEC)。
在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约200：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约300：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约400：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约500：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约600：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约700:1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约800：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约900：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1000：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1100：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1200：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1300：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1400：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为约1500：1。在一些实施方案中，初始EC/HSPC比率是约2000：1。在一些实施方案中，初始EC/HSPC比率为约3000：1。
在一些实施方式中，第一时间段为约1天至约24天。在一些实施方式中，第一时间段为约1天至约12天。在一些实施方式中，第一时间段是大约1天。在一些实施方式中，第一时间段是大约2天。在一些实施方式中，第一时间段是大约3天。在一些实施方式中，第一时间段为大约4天。在一些实施方式中，第一时间段是大约5天。在一些实施方式中，第一时间段是大约6天。在一些实施方式中，第一时间段是大约7天。在一些实施方式中，第一时间段为大约8天。在一些实施方式中，第一时间段是大约9天。在一些实施方式中，第一时间段是大约10天。在一些实施方式中，第一时间段是大约11天。在一些实施方式中，第一时间段是大约12天。在一些实施方式中，第一时间段是大约13天。在一些实施方式中，第一时间段是大约14天。在一些实施方式中，第一时间段是大约15天。在一些实施方式中，第一时间段是大约16天。在一些实施方式中，第一时间段是大约17天。在一些实施方式中，第一时间段是大约18天。在一些实施方式中，第一时间段是大约19天。在一些实施方式中，第一时间段是大约20天。在一些实施方式中，第一时间段是大约21天。在一些实施方式中，第一时间段是大约22天。在一些实施方式中，第一时间段是大约23天。在一些实施方式中，第一时间段是大约24天。在一些实施方式中，第一时间段是大约25天。在一些实施方式中，第一时间段是大约26天。在一些实施方式中，第一时间段是大约27天。在一些实施方式中，第一时间段是大约28天。
在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约10：1至约1：10。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约9：1至约1：9。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约8：1至约1：8。在一些实施例中，扩展的HSPC/EC比例为约7：1至约1：7。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约6：1至约1：6。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约5：1至约1：5。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比例为约4：1至约1：4。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约3：1至约1：3。在一些实施方式中，扩增HSPC/EC比率为约2：1至约1：2。在一些实施例中，扩展的HSPC/EC比率为约10：1至约1：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约9：1至约2：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比例为约8：1至约3：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约7：1至约4：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约6：1至约5：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约10：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比例是约9：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约8：1。在一些实施例中，扩展的HSPC/EC比例是大约7：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约6：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比例是约5：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约4：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约3：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约2：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约1：1。
在一些实施方式中，在扩增步骤期间，HSPC扩增约20倍至约30,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间，HSPC扩增约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约1000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约2,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约3,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间，HSPC扩增约3,500倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间，HSPC扩增约4,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约5,000倍。在一些实施方式中，HSPC在扩增步骤期间扩增约6000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约7,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约8,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约9,000倍。在一些实施方式中，在扩增步骤期间HSPC扩增约10,000倍。
在一些实施方式中，HSPC和EC之间的连续相互作用包括在扩增步骤期间HSPC和EC之间的连续接触，以及在扩增和输入步骤组合期间HSPC和EC的连续接近。在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括收获扩增的细胞群，并制备用于输血步骤的包含扩增的细胞群的药物组合物。在一些实施方式中，HSPC和EC之间的连续相互作用包括HSPC和EC在扩增、收获、药物组合物制备和输入的组合步骤期间的连续接近。在一些实施方式中，本文所述的方法不包含纯化步骤，由此在输入之前将内皮细胞与扩增的HSPC分离。在一些实施方式中，在第一时间段期间不存在人为作用或扩张的干扰。在一些实施方案中，在第一时间段期间添加补充细胞因子。在一些实施方式中，在第一时间段期间添加50ng/mL的血小板生成素(TPO)，Flt3(FMS相关的酪氨酸激酶3)配体和干细胞因子(SCF)。在一些实施方式中，扩增步骤包括不多于六个开放事件。
在扩增之前，可以对HSPC和EC进行选择和纯化，其可以包括阳性和阴性选择方法，以获得基本上纯的细胞群体。在一个方面，荧光激活细胞分选(FACS)(也称为流式细胞术)用于分选和分析不同的细胞群。具有对HSPC或EC群体特异性的细胞标志物的细胞用结合细胞标志物的抗体或典型地抗体混合物进行标记。针对不同标记物的每种抗体缀合至可检测分子，特别是可以与偶联于其他抗体的其他荧光染料区分开的荧光染料。标记的或“染色的”细胞流通过激发荧光染料的光源，检测细胞的发射光谱以确定特定标记抗体的存在。通过同时检测不同的荧光染料(在本领域中也被称为多色荧光细胞分选)，可以从细胞群中的其他细胞中鉴定并分离显示不同组细胞标记的细胞。其他FACS参数，包括(例如但不限于)侧向散射(SSC)，前向散射(FSC)和活体染料染色(例如使用碘化丙啶)允许基于大小和生存力选择细胞。HSPC的FACS分选和分析在以下专利中有描述：5,137,809，5,750,397，5,840,580，6,465,249；Manz，M.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:11872-11877(2002)；和Akashi，K.等人，Nature 404(6774):193-197(2000)。荧光激活细胞分选的基本指南在例如Shapiro,H.M.,Practical Flow Cytometry,4th Ed.,Wiley-Liss(2003)和Ormerod,M.G.,Flow Cytometry:A Practical Approach,3rd Ed.,Oxford University Press(2000)中给出了描述。
应该理解，细胞的纯化还包括本发明所述方法的组合。例如，典型的组合可以包括有效去除大量不需要的细胞和细胞物质的初始程序，如血细胞去除术(leukapharesis)。第二步可以包括通过对与底物结合的抗体的免疫吸附分离表达一个或多个祖细胞群共有的标记的细胞。例如，含有抗CD34抗体的磁珠能够结合并捕获通常表达CD34抗原的HSC、CMP和GMP细胞。提供不同细胞类型的更高分辨率的附加步骤，例如用一组特定细胞标记物的抗体进行FACS分选，可用于获得所需细胞的基本上纯的群体。另一种组合可涉及使用与抗CD34抗体结合的磁珠进行初始分离，然后用FACS进行另外一轮纯化。
实现扩增的场所是本领域技术人员熟知的，并且包括例如开放式细胞培养环境如培养瓶，以及闭孔培养环境，例如具有或不具有细胞粘附修饰的封闭系统波袋式生物反应器，和封闭系统微型生物反应器，例如包含中空纤维的微型生物反应器，或其他系统，或需要时允许细胞粘附的涂层。在一些实施方式中，场地是细胞扩增系统(TerumoBCT，Lakewood，CO)。
根据用于特定目的的常规程序按照经验确定实现治疗效果所需的细胞量。通常，为了治疗目的施用细胞，以药理学有效剂量给予细胞。“药理学有效量”或“药理学有效剂量”是指足以产生期望的生理效果或能够达到所需结果的量，特别是用于植入或个体的存活。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或紊乱的进展，而不管是否实现了改善。如上所定义的药理学有效剂量也应用于与细胞组合使用的治疗化合物，如下面进一步描述的。
造血干细胞移植物根据患者的年龄、体重和健康状况，适应症的性质和严重程度可以有较大变化。HSPC的合适剂量范围根据这些考虑而变化。在一些实施方式中，移植物将含有约1×106至约1.0×108个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约1.0×106到约1.0×108个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约1.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约2.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约3.0×106HSPCs/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约4.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约5.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约6.0x106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约7.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约8.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约9.0×106个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约1.0×107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约2.0x107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约3.0×107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约4.0×107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约5.0×107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约6.0x107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约7.0×107HSPCs/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群体包含约8.0×107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约9.0×107个HSPC/kg个体。在一些实施方式中，扩增的细胞群包含约1.0x108个HSPC/kg个体。
脐血单位是从一个胎盘和脐带收集的血液。脐血单位中有核细胞的数量是变化的。另外，脐带血单位中有核细胞的数量可能在冻融后减少。因此，在施用HSPC时，应当注意是在解冻之前或是之后测量有核细胞的数量。
通过本领域通常使用的方法将细胞移植入患者。优选的给药方法是静脉输注。如上所述，输注细胞的数量需要考虑诸如以下的因素，性别、年龄、体重、疾病或病症的类型、病症的阶段、细胞群中所需细胞的百分比(例如细胞的纯度)以及产生治疗益处所需的细胞数目。
细胞可以在一次输入中施用，或者通过在足以产生治疗效果的限定时间段内的连续输注来施用。当治疗涉及连续输注时，可以被输入不同的细胞群。如下面进一步描述的，药学上可接受的载体可以用于将细胞注入患者体内。这些典型地包括例如本领域已知的缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)或未补充的基础细胞培养基或培养基。
本发明所述的造血干细胞移植方法可用于治疗各种病症。在一些实施方式中，所述病症涉及由疾病或清髓性治疗引起的造血功能缺陷。在一些实施方式中，该病症是造血系统疾病。在一些实施方式中，病症是需要骨髓造血干细胞移植的病症。在一些实施方式中，所述病症是感染性或遗传性免疫缺陷。在一些实施方式中，该病症是感染性免疫缺陷症。在一些实施方式中，病症是HIV。在一些实施方式中，病症是遗传免疫缺陷。在一些实施方式中，所述病症是血液学疾病，包括影响T细胞的感染性疾病/遗传疾病(例如分别为HIV、SCID)和影响红细胞的遗传疾病(血红蛋白病)。在一些实施方式中，该病症是贫血症。在一些实施方式中，所述病症是范可尼贫血。在一些实施方式中，所述病症是造血系统恶性肿瘤。如本发明所用，“治疗”是指治疗性或预防性治疗，或对疾病、病症或不良状况的抑制性措施。治疗包括在疾病症状发作之前和/或临床表现或者疾病或病症的其他表现形式之后，以合适的形式施用受试细胞以减轻疾病严重性、停止疾病进展或消除疾病。预防疾病包括延长或延迟病症或疾病症状的发作，优选在对该病症具有增加的易感性的个体中实施疾病预防。在一些实施方式中，个体是人。
本发明进一步公开了在实体器官、细胞或组织移植领域中增强的HSCT方法。举例来说，但不作为限制，本公开进一步公开了用于心脏、肺、肝、肾、胰岛细胞、皮肤、内分泌器官或胰腺的移植的内皮细胞扩增的HSPC。
在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约15天至约35天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约20天至约30天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约20天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约21天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约22天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群体输入个体后约23天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约24天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约25天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群体输入个体后约26天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群体输入个体后约27天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约28天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约29天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约30天时，个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μl。
在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约5天至约20天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约5天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约6天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约7天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约8天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约9天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约10天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约11天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约12天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约13天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约14天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约15天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群体输入个体后约16天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约17天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约18天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约19天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约20天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约100/μl。
在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约10天至约25天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约10天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约11天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约12天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约13天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约14天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约15天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约16天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约17天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约18天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约19天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约20天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约21天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约22天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约23天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约24天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约25天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。
在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约100天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增细胞群输入个体后约200天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约300天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约400天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约500天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约600天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约700天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约800天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约900天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。在一些实施方式中，在将扩增的细胞群输入个体后约1,000天时，个体的循环血液中的绝对嗜中性粒细胞计数为至少约500个/μl。
辅助治疗
本发明所述的方法可以使用各种辅助治疗。一方面，辅助治疗包括抗真菌剂、抗细菌剂和抗病毒剂等。
在一个方面，辅助施用的药剂是抗真菌剂。真菌感染是接受清髓治疗和HSCT的患者面临的一个重要问题。植入延迟的受体和发生GVHD的患者通常存在真菌感染的高风险。真菌感染的类型是多种多样的，其中包括念珠菌病(例如克柔念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、热带假丝酵母)，曲菌病(例如烟曲霉、黄曲霉)，毛霉菌病(例如，根瘤菌、伞状犁头霉、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus))，隐球菌病，荚膜组织胞浆菌和粗球孢子菌。
用于辅助施用的抗真菌剂通常是全身抗真菌剂。这种类型的一种有用的抗真菌剂是来自多烯大环内酯类抗生素家族的两性霉素B。两性霉素B可用于各种制剂，包括作为与脱氧胆酸盐的复合物，在具有硫酸胆固醇酯的胶体悬浮液中，包封在由大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰甘油(distearoylphosphatidylglycerol)制成的脂质体中，和在本领域中已知的其它制剂。
另一种抗真菌剂是氟胞嘧啶，或叫氟化嘧啶。氟胞嘧啶被真菌脱氨基生成5-氟尿嘧啶，一种抗代谢物和DNA合成抑制剂。氟胞嘧啶通常用于隐球菌和念珠菌病的感染。尽管是单独使用的，氟胞嘧啶通常是与两性霉素B联合使用。
咪唑和三唑代表了一大类基于唑类的抗真菌剂。人们认为咪唑和三唑抑制甾醇14-α-脱甲基酶，导致麦角固醇的生物合成受损并破坏基于细胞膜的活性，如电子传递。基于唑类的抗真菌剂对抗某些类型的念珠菌病如白色念珠菌、光滑假丝酵母和念珠菌隐球菌等是有效的。适用于全身施用的示例性唑类抗真菌剂包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、益康唑、伏立康唑和特康唑等。
除真菌感染外，中性粒细胞减少症患者易感染各种细菌病原体。接受清髓治疗方案和HSCT的患者具有革兰氏阳性(例如链球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌和绿脓假单胞菌)的高细菌感染率。败血症是一种常见现象。另外，延迟植入和对包囊细菌(如肺炎链球菌或流感嗜血杆菌)的免疫应答恢复受损，也增加了GVHD移植受者的发病率。
辅助性抗菌疗法可以使用任何适用于特定细菌病原体的已知抗生素。这些包括广谱抗生素和更有针对性的抗菌化合物。适合于扩增的骨髓细胞的各种类型的抗菌剂包括(例如但不限于)喹诺酮类和氟喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素，氨基糖苷类，四环素类，大环内酯类及其各种同类物。示例性的喹诺酮化合物包括环丙沙星，氧氟沙星，司帕沙星，洛美沙星和莫西沙星。示例性的β-内酰胺抗生素包括青霉素(例如青霉素G，青霉素V)，氨苄西林，羧苄西林，甲氧西林，碳青霉烯和头孢菌素(例如头孢噻吩，头孢孟多，头孢克洛，头孢尼西，头孢替坦，头孢噻肟，头孢他啶，头孢唑肟，头孢吡肟)。示例性氨基糖苷包括新霉素，链霉素，卡那霉素，庆大霉素，妥布霉素，阿米卡星和奈替米星。示例性大环内酯类包括红霉素，克拉霉素，阿奇霉素和索立霉素。其他抗生素对于本领域技术人员也是显而易见的。
在清髓治疗的患者和HSCT中，病毒感染是另一个问题。一般而言，由清髓治疗引起的细胞介导免疫受损导致病毒感染的风险增加。许多这些感染由于血清阳性患者或血清阳性供体细胞中存在的潜伏病毒的再激活而引起。通常遇到的病毒包括巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，水痘带状疱疹病毒，疱疹病毒-6，EB病毒，腺病毒等等。作为细胞输注的辅助手段，选择的抗病毒化合物是适合于患者遇到的病毒的化合物。有用的抗病毒化合物包括例如但不限于阿昔洛韦，西多福韦，更昔洛韦，碘苷，喷昔洛韦，缬更昔洛韦，伐昔洛韦，阿糖腺苷，金刚烷胺，金刚乙胺，扎那米韦，福米韦生，咪喹莫特和利巴韦林。针对逆转录病毒的治疗剂包括核苷逆转录酶抑制剂(例如齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、拉米夫定)，非核苷逆转录酶抑制剂(例如奈韦拉平、依法韦仑、地拉夫定)和蛋白酶抑制剂(例如，沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、安普那韦和洛匹那韦)。
抗真菌剂、抗细菌剂和抗病毒剂可以用作预防以减少感染的发生或出现疾病。对于免疫抑制患者常见的真菌感染、血清阳性患者或血清阳性移植供体中的病毒感染尤其需要预防。因此，用于治疗目的的实施方式包括HSPC、MP细胞和抗真菌、抗细菌或抗病毒化合物的组合使用。
在另一个实施方式中，辅助施用的试剂是细胞因子或生长因子，其增强终末分化的骨髓细胞，特别是粒细胞，巨噬细胞，巨核细胞和红细胞的分化和动员。为了增强粒细胞发育，可以使用细胞因子C-CSF和GM-CSF。G-CSF有效加速HSCT中中性粒细胞的植入和生产。在另一个实施方式中，细胞因子或生长因子是血小板生成素(TPO)。TPO的施用增强移植的祖细胞的植入并促进巨核细胞和血小板的发育(Fox,N等人，J.Clin.Invest.110:389-394(2002)；Akahori,H.等人，Stem Cells 14(6):678-689(1996))。
本领域技术人员将会明白，多种载体和赋形剂以及施用途径可以用于辅助治疗。代表性的制剂技术尤其例如在Remington：The Science and Practice ofPharmacy,19thEd.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995)和Handbook of PharmaceuticalExcipients,3rd Ed,Kibbe,A.H.ed.,Washington DC,AmericanPharmaceuticalAssociation(2000)中进行教导。
药物组合物通常包含药学上可接受的载体和药理学有效量的化合物或其混合物或其合适的盐。药物组合物可以配制成散剂，颗粒剂，溶液剂，混悬剂，气雾剂，固体剂，丸剂，片剂，胶囊剂，凝胶剂，局部霜剂，栓剂，透皮贴剂和本领域已知的其它制剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包含本领域普通技术人员在配制药物组合物中已知的任何标准药学上可接受的载体。因此，化合物本身如药学上可接受的盐或作为缀合物存在时，可以制备成在药学上可接受的稀释剂中的制剂，例如盐水，磷酸盐缓冲液(PBS)，乙醇水溶液或葡萄糖，甘露醇，葡聚糖，丙二醇，油(例如植物油，动物油，合成油等)，微晶纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸钙，明胶，聚山梨醇酯80等，或作为适当赋形剂中的固体制剂。
药物组合物通常还进一步包含一种或多种缓冲剂(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)，碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白质，多肽或氨基酸如甘氨酸，抗氧化剂(例如抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠，丁基化羟基甲苯，丁基羟基茴香醚等)，抑菌剂，螯合剂如EDTA或谷胱甘肽，等使配方与受体的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质，包括悬浮剂，增稠剂，防腐剂，调味剂，甜味剂和着色化合物等均是适合的。
虽然本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可以用于组合物中，但是载体的类型通常将根据施用模式而变化。治疗组合物可以配制用于任何适当的施用方式，包括例如口腔、鼻腔、粘膜、直肠、阴道、局部、静脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌内施用。
本发明所述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶。通常以这样的方式密封这样的容器，以在使用之前保持制剂的无菌性和稳定性。一般而言，如上所述，制剂可以作为在油性或水性载体中的混悬剂，溶液剂或乳剂储存。或者，药物组合物可以在冷冻干燥条件下储存，仅需在使用之前立即加入无菌液体载体。
对对象施用的数量将取决于所施用的物质、施用目的，例如预防或治疗，宿主的状态，施用方式，施用次数，施用的间隔时间等。这些可以由本领域技术人员凭经验确定，并且可以根据治疗反应的程度进行调整。确定合适剂量时要考虑的因素包括但不限于，个体的大小和体重，个体的年龄和性别，症状的严重程度，疾病的阶段，试剂的递送方法，药剂的半衰期和药剂的功效。要考虑疾病的阶段包括疾病是急性的还是慢性的，属于复发或缓解期，以及疾病的进展性。
确定治疗有效量的给药剂量和次数在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以通过细胞培养或其他体外测定来估计初始有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以产生循环浓度或组织浓度，包括通过细胞培养测定确定的IC50的浓度。
试剂盒
本发明所述的方法可以通过用于增强HSPC植入的试剂盒来实施。试剂盒可以含有包括但不限于HSPC、EC，包括扩增和/或分离的细胞，和/或辅助治疗化合物，用于分离或扩增HSPC和EC的手段，用于向患者施用细胞的手段，或其任意组合。试剂盒可以任选地包含药学上可接受的载体，生理学上可接受的载体，使用说明，容器，施用的容器，抗体或其任意组合中的任一种或全部。标签通常伴随着试剂盒，并且包括任何书写或记录材料，其可以是电子或计算机可读形式(例如，盘、光盘、存储器芯片或磁带)，提供用于使用试剂盒内容的说明或其他信息。
除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学术，分子生物学，细胞培养，免疫学等的常规技，这些技术是本领域技术人员所熟知的。这些技术已在现有文献中完全公开，并且此处特别引用Sambrook,Fritsch and Maniatis eds.,“Molecular Cloning ALaboratory Manual,2nd Ed.,Cold Springs Harbor Laboratory Press,1989)；theseries Methods of Enzymology(Academic Press,Inc.)；andAntibodies:A LaboratoryManual,Harlow et al.,eds.,(1987)。
实施例
根据以下实施例可以进一步理解本发明教导的各个方面，其不应被解释为以任何方式限制本教导的范围。
实施例1：使用未经照射的EC扩增HSPC
未经照射的E4ORF1+工程化的EC具有增殖能力，能够在传统培养基中以1：4分裂传代约15-20次。在这种方法中，未经照射的E4ORF1+工程化的EC可以在平面培养皿中扩增到足够的数量至融合。细胞的数量取决于起始材料的数量和扩增的长度。例如，10天的扩增可能需要相当于3个6孔板(每个直径约35mm)的数量。E4ORF1+EC在完全生长培养基中培养直到在这些孔中融合。在融合时，将培养基转移至条件培养基。在条件培养基中24小时后，可将例如来自脐带血(UCB)的CD34+纯化细胞与细胞因子接种于预先接种E4ORF1+EC的孔内，每种细胞因子包含50ng/ml血小板生成素(TPO)，Fm相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)和干细胞因子(SCF)。两天后，收获培养基，将细胞沉淀并重新悬浮在含有新鲜细胞因子的培养基中，并分散到已经作为第一个预处理的另外两个孔中。被称为“母孔”或“母瓶”的第一孔也被重新添加含有细胞因子的培养基。这个过程每隔一天重复一次，直到第10天。此时，所有的孔都含有扩增的HSPC和E4ORF1+EC。在一些情况下，可以使用生物反应器，例如中空纤维生物反应器。中空纤维可以经装填(primed)，涂布(coated)，处理(conditioned)(例如，根据制造商的说明)，并在完全生长培养基中接种约5×107个E4ORF1+EC。生物反应器“喂食”细胞，并可允许扩增持续6天。此时，在生物反应器接近融合的情况下，用不含细胞因子的条件培养基置换培养基以置换血清(例如胎牛血清(FBS))，否则可能导致HSPC的过早分化。24小时后，E4ORF1+EC准备好接受HSPC。UCB样品可以在二甲基亚砜(DMSO)中作为红细胞(RBC)耗尽产物冷冻储存。在原始CD34+群体的纯化和扩增之前洗涤该细胞材料。为达到这个目的，样品在37℃的珠浴恒温箱中解冻。在目视检查剩余冰块时，将设备无菌焊接到MiltenyiProdigy装置或类似系统的流体装置上。细胞在此时与DNAse一起温育，因为解冻后任何非活细胞的核酸含量可能导致结块和沾黏。Miltenyi Prodigy装置或类似装置能够洗涤细胞以除去冷冻保存剂并进一步消耗RBC样品。当仍然在Miltenyi Prodigy装置中时，将细胞与CD34微珠孵育以纯化HSPC。最后进行洗涤步骤。然后将微珠结合的CD34+细胞注射到的Miltenyi CliniMacs装置或类似装置中以对有标记的CD34+细胞进行磁性纯化。预期可回收获得50-70％的CD34+细胞。
然后将纯化的CD34+级分注射到补充有细胞因子、SCF、TPO和Flt3L各50ng/ml的总共200ml的HSPC扩增培养基中。然后将该环境引入与E4ORF1+工程化的EC(扩展的第0天)相同的内室中的生物反应器中。在整个扩增过程中，HSPC扩增培养基(无细胞因子)通过外部腔室以约0.4ml/分钟的速率连续供给以用于交换的代谢物，并且在循环回路中以约30ml/分钟的速率循环，包括具有90％的N2、5％的O2和5％的CO2的气体交换模块。另外，在扩增的第2天和第4天，将各自添加有50ng/ml的细胞因子，SCF，TPO和Flt3L的200ml HSPC扩增培养基的团块加入到内部腔室中。在扩增的第6天之后停止扩增，此时收集整个细胞材料。
实施例2：用照射的EC扩增HSPC
E4ORF1+工程化的EC在接受有丝分裂灭活刺激(例如辐射或丝裂霉素C)后变得完全有能力扩增HSPC。为了利用有丝分裂灭活后的细胞，当细胞在融合处于其最终培养容器中时施用有丝分裂灭活刺激，并在转移到条件培养基之前，给予24小时在完整培养基中恢复。为了在生物反应器中使用有丝分裂灭活的细胞，使E4ORF1+工程化的EC，或ETV2+E4ORF1+工程化的EC，或E4ORF1+E4ORF6+工程化的EC，生长直到约有10亿个细胞。用有丝分裂灭活刺激物处理后，将细胞冷冻保存。然后将整个有丝分裂灭活的EC样品注入生物反应器中，并给予24小时附着时间。然后进行24小时的培养基的调节。然后将例如来自UCB的CD34+细胞引入与补充有细胞因子(50ng/ml TPO，Flt-3L，SCF)的E4ORF1+工程化的EC相同的生物反应器的隔室中。该时刻起，细胞不会彼此分离。在第2天和第4天，补充添加有细胞因子的200ml培养基团块被提供。收获条件和所有其他条件与实施例1相同。
实施例3：CFU分析
菌落形成单位或“CFU”是在体外模型中判断细胞多能性的手段。将已知数量的细胞铺板在甲基纤维素包被的培养烧瓶上，培养瓶中有限定的培养基(即，Methocult)。两周后，具有确定形态的菌落由推定的干细胞形成。这些菌落是可量化的，可以用来确定给定人群中的HPSC。生物反应器中的HSPC扩增率最高，随后是E4ORF1+EC的基于培养瓶的扩增，以及单独的细胞因子扩增提供的是最少量的HSPC扩增(参见图7)。
实施例4：流式细胞术
造血细胞要么来自新鲜分离的脐带血(未处理的)，来自仅用细胞因子扩增6天的细胞，来自在培养瓶中的E4ORF1+EC上扩增6天的细胞，或者在E4ORF1+EC上在中空纤维细胞生物反应器中扩增6天的细胞，都通过流式细胞仪分析。细胞群体同时染色CD34，CD45和CD38。每个参数都可以通过与特定于那些细胞表面抗原的抗体缀合的独特荧光团来区分。CD45-细胞被鉴定为E4ORF1+工程化的EC。CD45是泛造血标志物。与CD45+CD34-细胞相比，CD45+CD34+细胞在总CD45+群体中包含更原始的HSPC细胞群。CD45+CD34+CD38-细胞包含甚至更原始的HSPC群体。生物反应器中这些原始细胞群体的扩增率始终保持最高，随后扩增的是用基于培养瓶培养的E4ORF1+工程化EC，次之扩增的是用单独的细胞因子处理的细胞。
实施例4：移植扩增的HSPC
通过与E4ORF1+工程化的EC连续接触而扩增的HSPC可产生优异的可移植产物，例如与通过连续传代和重新铺板HSPC使得相互作用被破坏的扩增获得的HSPC相比较。通过消除这种干扰，以这种新颖方式扩增的HSPC可以导致淋巴、骨髓和红细胞谱系的更快移植，从而导致其各自的血细胞计数在清髓后恢复得更快。这应该也改善长期植入，作为E4ORF1+工程化的EC的扩增，假设其保持长期重新植入的干细胞的作用。通过与E4ORF1+工程化的EC持续接触进行的扩增也可能导致一名成人产生足够的HSPC材料，以从单个供体接受来自单个UCB单元的移植物，或者甚至将移植物多次输入到单个成年人中，或者用于从一个单一的UCB捐助者多次输入到多个成年人。预期的快速植入也可能带来一系列其他好处，包括可能减少住院时间，降低各级GVHD发生率，降低复发率，降低移植相关死亡率(TRM)，降低感染风险，减少移植失败，使用原本无法利用的更小的脐带血捐献的能力，增加获得稀有HLA类型的脐带血的UCB捐献，整体降低治疗成本，延长移植受体的寿命和/或移植受者的生活质量提高。
出于说明和描述的目的以上提供了本发明的具体实施例的前述描述。它们并不是穷尽性的或将本发明限制于所公开的精确形式，并且显然根据上述教导可以进行许多修改和变化。实施例的选择和描述是为了尽可能地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够最佳地利用本发明以及具有适合于预期的特定用途的各种修改的各种实施方式。
本发明引用的所有专利，专利申请，出版物和参考文献通过引用明确地并入，相当于将每个单独的出版物或专利申请被明确地和单独地通过引用并入本发明。
Claims (66)
1.一种在有需要的个体中进行干细胞移植的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和
(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中；
其中，在整个扩增步骤和输入步骤中，所述HSPC和EC之间保持连续的相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC是造血干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC相对于所述个体是同种异体的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述HSPC是脐带血HSPC。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC相对于所述个体是自体的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HSPC是基因修饰的稳态骨髓来源的HSPC。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC是血管EC。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC在扩增之前经有丝分裂灭活。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC是E4ORF1+工程化的EC。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC是E4ORF1+ETV2+工程化的EC。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述EC也是E4ORF6+。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述EC包含编码ETV2多肽的重组核酸分子。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述EC包含编码腺病毒E4ORF1多肽的重组核酸分子。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述EC包含编码腺病毒E4ORF6多肽的重组核酸分子。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸分子为质粒载体的形式。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸分子整合到所述工程化的EC的基因组DNA中。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是分化的EC。
18.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是成体EC。
19.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC不是胚胎EC。
20.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是人EC。
21.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是原代EC。
22.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是人脐静脉EC(HUVEC)。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始EC/HSPC比率为至少约200：1。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一时间段为约1天至约24天。
25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的细胞群包含约1.0×106至约1.0×108个HSPC/kg个体。
26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的HSPC/EC比率为约10：1至约1：10。
27.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC与EC之间的连续的相互作用包括在所述扩增步骤中所述HSPC与EC之间的连续接触，以及在所述扩增步骤和输入步骤中的所述HSPC与EC的连续接近。
28.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入所述个体约15天至约35天后，所述个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μL。
29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约5天至约20天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约100/μl。
30.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约10天至约25天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约500/μl。
31.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约1,000天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约500/μl。
32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体具有由清髓性治疗引起的造血功能障碍或选自以下的病症：血液病、需要骨髓造血干细胞移植的病症、感染性免疫缺陷病、影响T细胞的感染性疾病、HIV、遗传免疫缺陷、重症综合性免疫缺陷、影响红细胞的遗传疾病、贫血和范可尼贫血。
33.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体是人。
34.一种包含HSPC和EC的组合物，用于在有需要的个体中进行干细胞移植，其特征在于，所述干细胞移植包括根据权利要求1所述的方法。
35.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述HSPC是造血干细胞。
36.根据权利要求34或35所述的组合物，其特征在于，所述HSPC相对于所述个体是同种异体的。
37.根据权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述HSPC是脐带血HSPC。
38.根据权利要求34或35所述的组合物，其特征在于，所述HSPC相对于所述个体是自体的。
39.根据权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述HSPC是基因修饰的稳态骨髓来源的HSPC。
40.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述EC是血管EC。
41.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述EC在扩增之前经有丝分裂灭活。
42.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述EC是E4ORF1+工程化的EC。
43.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述EC是E4ORF1+ETV2+工程化的EC。
44.根据权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述EC也是E4ORF6+。
45.根据权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述EC包含编码ETV2多肽的重组核酸分子。
46.根据权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述EC包含编码腺病毒E4ORF1多肽的重组核酸分子。
47.根据权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述EC包含编码腺病毒E4ORF6多肽的重组核酸分子。
48.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述核酸分子为质粒载体的形式。
49.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述核酸分子整合到所述工程化的EC的基因组DNA中。
50.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述EC是分化的EC。
51.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述EC是成体EC。
52.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述EC不是胚胎EC。
53.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述EC是人EC。
54.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述EC是原代EC。
55.根据权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述EC是人脐静脉EC(HUVEC)。
56.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述初始EC/HSPC比率为至少约200：1。
57.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述第一时间段为约1天至约24天。
58.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述扩增的细胞群包含约1.0×106至约1.0×108个HSPC细胞/kg个体。
59.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述扩增的HSPC/EC比率为约10：1至约1：10。
60.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述HSPC与EC之间的连续的相互作用包括在所述扩增步骤中所述HSPC与EC之间的连续接触，以及在所述扩增步骤和输入步骤中的所述HSPC与EC的连续接近。
61.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入所述个体约15天至约35天后，所述个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μL。
62.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约5天至约20天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约100/μl。
63.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约10天至约25天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约500个/μl。
64.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约1,000天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约500个/μl。
65.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述个体具有由清髓性治疗引起的造血功能障碍或选自以下的病症：血液病、需要骨髓造血干细胞移植的病症、感染性免疫缺陷病、影响T细胞的感染性疾病、HIV、遗传免疫缺陷、重症综合性免疫缺陷、影响红细胞的遗传疾病、贫血和范可尼贫血。
66.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述个体是人。
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