CN106929469B - 间充质干细胞分化为表皮细胞的方法及试剂盒 - Google Patents

间充质干细胞分化为表皮细胞的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成，本发明采用自体来源丰富的间充质干细胞经过诱导分化后，得到数量充足的表皮细胞，该方法采用的诱导分化液能够显著提高见充质干细胞诱导分化为表皮细胞的诱导分化能力及专一性，并且显著降低了诱导分化的时间、提高了诱导分化后表皮细胞的存活率。

Description

间充质干细胞分化为表皮细胞的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于细胞分化技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法及试剂盒。
背景技术
表皮细胞具有多分化潜能，除再生皮肤的多层表皮结构外，还形成汗腺、毛发和毛囊等皮肤附属器官。因此，表皮细胞是构建组织工程化皮肤比较理想的种子细胞。但由于目前获取与纯化表皮细胞较为困难，从而妨碍了表皮细胞作为组织工程化皮肤种子细胞的应用。间充质干细胞亦具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为多种组织细胞，如肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、肺细胞、神经细胞等，是组织工程较为理想的种子细胞。最近研究表明：间充质干细胞具有分化为表皮细胞的潜能。例如：骨髓间充质干细胞体外诱导分化为表皮干细胞的研究(龙剑虹，等，中南大学学报，2006,06,32-38)公开了将骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮干细胞的方法，该方法是将骨髓间充质干细胞加入诱导分化的培养液中，进行培养，其中所述的诱导分化的培养液是含有20％胎牛血清、8μg/L EGF、50％HaCaT细胞上清液的DMEM培养液；此外一般的诱导分化的培养液中还需要加入其他生长因子、青霉素或抗生素等物质，现有技术公开的方法中所使用的诱导分化的培养液对间充质干细胞的诱导分化能力差，不利于表皮细胞的形成，分化专一性不强。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法利用了新的诱导分化液，有利于提高间充质干细胞分化为表皮细胞的专一性和分化能力。
本发明具体技术方法如下：
本发明提供一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10-25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1-3份、维生素C 0.5-1份、槲皮素5-10份、α-生育酚琥珀酸单酯2-5份、异银杏双黄酮10-15份、氢化卵磷脂1-3份和赖氨酸2-5份。
本发明采用自体来源的间充质干细胞经过诱导分化表皮细胞，所使用的诱导分化液能够提高间充质干细胞经过诱导分化表皮细胞的分化能力和专一性。
进一步的改进，所述分化组合物还包括重量份数为0.5-1份的麦芽糖醇、2-5份的磷酸二氢钾、1-3份的琼脂和2-3份的生物素。在分化组合物中加入麦芽糖醇、磷酸二氢钾、琼脂和生物素不但可以进一步提高诱导分化能力，并且还可以缩短诱导分化的时间，提高诱导分化效率。
进一步的改进，所述分化组合物还包括重量份数为1-3份的谷氨酸钠、0.2-0.5份的磷酯酰丝氨酸和2-5份的氯化硒。通过在分化组合物中加入氨酸钠、磷酯酰丝氨酸和氯化硒的混合物可以提高诱导分化液防止细菌感染的能力，有效抑制细菌滋生，保障诱导分化液的使用安全，提高分化方法中诱导分化过程的安全性，进而提高诱导后表皮细胞的存活率。
进一步的改进，所述方法还包括：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养。
进一步的改进，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养3-5天，每个一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞。
进一步的，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3-7.8mg/mL。
优选地，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5-10份、谷氨酰胺2-5份、白藜芦醇2-5份、维生素E 1-3份、普鲁兰2-5份和枸橼酸钠0.5-2份。
进一步的改进，所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5-7.5mg/mL。
优选地，所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5-10份、甲壳糖1-3份、硝酸铵0.5-1份、钼酸钠0.5-2份、川芎嗪2-5份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁2-5份。
优选的，所述细胞消化液为含0.25％胰酶的PBS缓冲液。
本发明通过选择二次培养的方法并选择不同的培养基来对间充质干细胞进行培养，显著提高了间充质干细胞的培养增殖速度和培养扩增数量。
本发明另一方面还提供一种间充质干细胞分化为表皮细胞的试剂盒，该试剂盒包括盒体和位于盒体内部的若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有诱导分化液、第一培养基、第二培养基和细胞消化液，所述所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10-25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1-3份、维生素C 0.5-1份、槲皮素5-10份、α-生育酚琥珀酸单酯2-5份、异银杏双黄酮10-15份、氢化卵磷脂1-3份和赖氨酸2-5份；所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3-7.8mg/mL；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5-7.5mg/mL。
本发明提供的间充质干细胞分化为表皮细胞的方法采用自体来源丰富的间充质干细胞经过诱导分化后，得到数量充足的表皮细胞，该方法采用的诱导分化液能够显著提高见充质干细胞诱导分化为表皮细胞的诱导分化能力及专一性，并且显著降低了诱导分化的时间、提高了诱导分化后表皮细胞的存活率。
具体实施方式
实施例1
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1份、维生素C0.5份、槲皮素5份、α-生育酚琥珀酸单酯2份、异银杏双黄酮10份、氢化卵磷脂1份和赖氨酸2份。
实施例2
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置7.5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为15mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1.5份、维生素C 0.6份、槲皮素60份、α-生育酚琥珀酸单酯3份、异银杏双黄酮12份、氢化卵磷脂1.5份和赖氨酸3份。
实施例3
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白3份、维生素C 1份、槲皮素10份、α-生育酚琥珀酸单酯5份、异银杏双黄酮15份、氢化卵磷脂3份、赖氨酸5份、麦芽糖醇1份、磷酸二氢钾5份、琼脂3份和生物素3份。
实施例4
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置6mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为20mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白2.5份、维生素C 0.7份、槲皮素7份、α-生育酚琥珀酸单酯4份、异银杏双黄酮13份、氢化卵磷脂2份、赖氨酸3.5份、麦芽糖醇0.5份、磷酸二氢钾2份、琼脂1份和生物素2份。
实施例5
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置8mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为12.5mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1.2份、维生素C 0.8份、槲皮素8份、α-生育酚琥珀酸单酯3.5份、异银杏双黄酮14份、氢化卵磷脂2.5份、赖氨酸4份、麦芽糖醇0.7份、磷酸二氢钾3份、琼脂1.5份、生物素2.2份、谷氨酸钠1份、磷酯酰丝氨酸0.2份和氯化硒2份。
实施例6
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置9mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为17.5mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白2.5份、维生素C 0.75份、槲皮素9份、α-生育酚琥珀酸单酯2.5份、异银杏双黄酮11份、氢化卵磷脂2.2份、赖氨酸2.5份、麦芽糖醇0.6份、磷酸二氢钾4份、琼脂2份、生物素2.5份、谷氨酸钠3份、磷酯酰丝氨酸0.5份和氯化硒5份。
实施例7
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置7.5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为20mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白2份、维生素C 0.7份、槲皮素7.5份、α-生育酚琥珀酸单酯3.5份、异银杏双黄酮12.5份、氢化卵磷脂1.5份、赖氨酸4.5份、麦芽糖醇0.8份、磷酸二氢钾3.5份、琼脂2.5份、生物素2.5份、谷氨酸钠2份、磷酯酰丝氨酸0.3份和氯化硒3.5份。
实施例8
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法与实施例1不同的是：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养3天，每个一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5份、谷氨酰胺2份、白藜芦醇2份、维生素E 1份、普鲁兰2份和枸橼酸钠0.5份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5份、甲壳糖1份、硝酸铵0.5份、钼酸钠0.5份、川芎嗪2份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁2份。
实施例9
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法与实施例3不同的是：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养5天，每个一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置10mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为7.8mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子10份、谷氨酰胺5份、白藜芦醇5份、维生素E 3份、普鲁兰5份和枸橼酸钠2份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置10mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为7.5mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清10份、甲壳糖3份、硝酸铵1份、钼酸钠2份、川芎嗪5份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁5份。
实施例10
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法与实施例5不同的是：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养4天，每个一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置7.5mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为7mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子7.5份、谷氨酰胺3份、白藜芦醇4份、维生素E 2份、普鲁兰3.5份和枸橼酸钠1份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置7.5mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清7份、甲壳糖2份、硝酸铵0.75份、钼酸钠1.5份、川芎嗪4份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁3份。
实施例11
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的试剂盒，该试剂盒包括盒体和位于盒体内部的若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有诱导分化液、第一培养基、第二培养基和细胞消化液，所述所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置7.5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为20mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白2份、维生素C0.7份、槲皮素7.5份、α-生育酚琥珀酸单酯3.5份、异银杏双黄酮12份、氢化卵磷脂2份和赖氨酸3.5份；所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为7mg/mL；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置7.5mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子7.5份、谷氨酰胺3份、白藜芦醇3.5份、维生素E 2份、普鲁兰3.5份和枸橼酸钠1份；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清7.5份、甲壳糖2份、硝酸铵0.7份、钼酸钠1份、川芎嗪3.5份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁3.5份。
对照例1
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子1份、维生素C 0.5份、青霉素5份、α-生育酚琥珀酸单酯2份、异银杏双黄酮10份、氢化卵磷脂1份和赖氨酸2份。
对照例2
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1份、维生素C0.5份、槲皮素5份、氢化卵磷脂1份和赖氨酸2份。
对照例3
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清20份、EGF8份、HaCaT细胞上清液50份。
对照例4
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白3份、维生素C 1份、槲皮素10份、α-生育酚琥珀酸单酯5份、异银杏双黄酮15份、氢化卵磷脂3份、赖氨酸5份、葡萄糖1份、琼脂3份和生物素3份。
对照例5
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白3份、维生素C 1份、槲皮素10份、α-生育酚琥珀酸单酯5份、异银杏双黄酮15份、氢化卵磷脂3份、赖氨酸5份、麦芽糖醇1份、磷酸二氢钾5份、阿拉伯胶3份。
对照例6
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置8mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为12.5mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1.2份、维生素C 0.8份、槲皮素8份、α-生育酚琥珀酸单酯3.5份、异银杏双黄酮14份、氢化卵磷脂2.5份、赖氨酸4份、麦芽糖醇0.7份、磷酸二氢钾3份、琼脂1.5份、生物素2.2份、谷氨酸钠1份、丝氨酸0.2份和氯化钠2份。
对照例7
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置8mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为12.5mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1.2份、维生素C 0.8份、槲皮素8份、α-生育酚琥珀酸单酯3.5份、异银杏双黄酮14份、氢化卵磷脂2.5份、赖氨酸4份、麦芽糖醇0.7份、磷酸二氢钾3份、琼脂1.5份、生物素2.2份、磷酯酰丝氨酸0.2份和氯化硒2份。
对照例8
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法与实施例1不同的是：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养3天，每个一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5份、谷氨酸2份、维生素E 1份、普鲁兰2份和枸橼酸钠0.5份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5份、甲壳糖1份、硝酸铵0.5份、钼酸钠0.5份、川芎嗪2份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁2份。
对照例9
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法与实施例1不同的是：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养3天，每个一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5份、谷氨酰胺2份、白藜芦醇2份、维生素E 1份、普鲁兰2份和枸橼酸钠0.5份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5份、甲壳糖1份、硝酸铵0.5份、钼酸钠0.5份。
对照例10
一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，该方法与实施例1不同的是：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养3天，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞，所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM 培养基水溶液的浓度为6.3mg/mL，所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5份、谷氨酰胺2份、白藜芦醇2份、维生素E 1份和枸橼酸钠0.5份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5份、麦芽糖1份、硝酸铵0.5份、氯化钠0.5份、川芎嗪2份和L-抗坏血酸-2-磷酸镁2份。
间充质干细胞向表皮细胞分化效果评价
1.分化效果比较
利用荧光定量PCR仪分别检测间充质干细胞经实施例1、实施例3、对照例1-5的方法进行诱导分化的0天、3天、5天和7天，表皮细胞中特异性蛋白CK10及CK19的表达情况，检测CK10及CK19的相对表达率(％)，结果见表1。
表1 表皮细胞中特异性蛋白CK10及CK19的相对表达率(％)
Figure DEST_PATH_GDA0001301059360000151
由上述结果可知，采用实施例1的方法对间充质干细胞进行诱导分化与对照例1-3的方法对比，实施例3的方法对间充质干细胞进行诱导分化与对照例4-5的方法对比，诱导分化为表皮细胞中的特异性蛋白CK-10及CK-19的相对表达率均明显较高，说明采用本发明提供的方法可显著提高间充质干细胞向表皮细胞的分化效果和诱导分化速度。
并且将实施例3与实施例1相比，采用实施例3的方法诱导分化表皮细胞的能够和速度显著高于实施例1，说明在分组组合物中加入麦芽糖醇、磷酸二氢钾、琼脂和生物素不但可以进一步提高诱导分化能力，并且还可以缩短诱导分化的时间，提高诱导分化效率。
安全性评价
1.诱导分化过程的安全性评价
取实施例5、对照例6、对照例7的方法中所使用的诱导分化液，均在温度为25℃±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下密闭保存12个月，检测诱导分化液中的细菌总数。
表2 诱导分化液中细菌总数统计
Figure DEST_PATH_GDA0001301059360000161
由上述结果可知，在诱导分化液中加入氨酸钠、磷酯酰丝氨酸和氯化硒的混合物可以提高诱导分化液防止细菌感染的能力，有效抑制细菌滋生，保障诱导分化液的使用安全，提高分化方法中诱导分化过程的安全性。
培养扩增效果评价
采取间充质干细胞，按照实施例8、对照例8-10的方法扩增培养，采用台盼蓝经典染色法对培养后的间充质干细胞进行计数，分别统计原代和第3代活间充质干细胞的数量，计算间充质干细胞的培养扩增倍数，结果见表3。
表3 间充质干细胞培养扩增效果评价
Figure DEST_PATH_GDA0001301059360000171
由上述结果可以得出，采用本发明提供的方法培养的间充质干细胞的扩增效果明显优于对照例8-10的方法，说明本发明提供的方法能够显著提高间充质干细胞的增殖速度和扩增倍数。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种间充质干细胞分化为表皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将间充质干细胞加入诱导分化液中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，进行诱导分化；所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10-25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1-3份、维生素C 0.5-1份、槲皮素5-10份、α-生育酚琥珀酸单酯2-5份、异银杏双黄酮10-15份、氢化卵磷脂1-3份和赖氨酸2-5份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化组合物还包括重量份数为0.5-1份的麦芽糖醇、2-5份的磷酸二氢钾、1-3份的琼脂和2-3份的生物素。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化组合物还包括重量份数为1-3份的谷氨酸钠、0.2-0.5份的磷酯酰丝氨酸和2-5份的氯化硒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在进行诱导分化之前对间充质干细胞进行扩增培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增培养具体步骤为：将原代间充质干细胞接种于第一培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行培养，8h后更换一半量的第一培养基，以后每隔4h更换2/3量的第一培养基，培养2天后，弃去未贴壁的细胞，将第一培养基更换成第二培养基，继续培养3-5天，每隔一天更换全量第二培养基，培养完毕后，加入细胞消化液消化4min，收集间充质干细胞；所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3-7.8mg/mL；第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5-10份、谷氨酰胺2-5份、白藜芦醇2-5份、维生素E 1-3份、普鲁兰2-5份和枸橼酸钠0.5-2份；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5-7.5mg/mL；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5-10份、甲壳糖1-3份、硝酸铵0.5-1份、钼酸钠0.5-2份、川芎嗪2-5份和L -抗坏血酸- 2-磷酸镁2-5份。
6.一种间充质干细胞分化为表皮细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体和位于盒体内部的若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有诱导分化液、第一培养基、第二培养基和细胞消化液，所述所述诱导分化液主要由分化组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述分化组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL；所述DMEM培养基水溶液的浓度为10-25mg/mL，所述分化组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：转铁蛋白1-3份、维生素C 0.5-1份、槲皮素5-10份、α-生育酚琥珀酸单酯2-5份、异银杏双黄酮10-15份、氢化卵磷脂1-3份和赖氨酸2-5份；所述第一培养基主要由第一培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为6.3-7.8mg/mL；所述第二培养基主要由第二培养组合物和DMEM培养基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第二培养组合物所用的DMEM培养基水溶液的体积为1mL，所述DMEM培养基水溶液的浓度为5-7.5mg/mL；所述第一培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：成纤维细胞生长因子5-10份、谷氨酰胺2-5份、白藜芦醇2-5份、维生素E 1-3份、普鲁兰2-5份和枸橼酸钠0.5-2份；所述第二培养组合物主要由如下重量份数的成分制备而成：胎牛血清5-10份、甲壳糖1-3份、硝酸铵0.5-1份、钼酸钠0.5-2份、川芎嗪2-5份和L -抗坏血酸- 2-磷酸镁2-5份。
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Patentee after: Huaxia (Qingdao) Biotechnology Co.,Ltd.

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