CN115851544B

CN115851544B - 一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法

Info

Publication number: CN115851544B
Application number: CN202211637133.0A
Authority: CN
Inventors: 卢美欢; 李利军; 仝泽方; 马英辉
Original assignee: Microbiology Institute Of Shaanxi
Current assignee: Microbiology Institute Of Shaanxi
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2042-12-16
Also published as: CN115851544A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法。属于微生物技术领域。包括：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)XG‑1，保藏编号为CCTCCNO：M2022399。本发明采用微生物发酵法生产富硒纳豆，不需要大规模种植富硒大豆，短时间内即能生产出富含有机硒和纳豆激酶的富硒纳豆，兼具多种功效，同时具有周期短、成本低、效率高的优点。本发明提供的富硒纳豆菌液体菌种可以直接用于工厂或者家庭的富硒纳豆制作，无需额外添加原料或改造设备，方便快捷，直接制成菌粉也可以作为保健品用于补硒、抗氧化、预防心脑血管疾病。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法。

背景技术

纳豆是一种传统发酵食品，是由大豆蒸煮后，经纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis natto)发酵而成，发酵后的纳豆富含纳豆激酶，具有纤溶活性，可以预防和治疗心脑血管疾病，此外还含有维生素K、异黄酮、不饱和脂肪酸、多肽等活性成分，具有抗氧化、防止骨质疏松、调节肠道菌群等功效。

硒是人体必需的微量元素之一，对人体具有重要的生理作用，主要是以硒酶、硒蛋白的形式存在于机体中，硒在其中发挥结构和酶的作用，参与机体的抗氧化防御、细胞信号转导等生命过程。因此补充适量的硒有助于身体健康，还具有提高免疫力和防癌的作用。硒在自然界中存在的形态主要为无机硒、有机硒和单质硒，其中无机硒(如亚硒酸盐)的毒性最大，直接摄入对人体的影响最大，有机硒具有毒性低、利用率好的优点，通过生物体将无机硒转化为有机硒，是开发天然、安全、营养保健食品的理想途径。

因此，能否提供一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法。

利用微生物法生产富硒纳豆容易形成纳米硒，而本发明可以精准控制纳豆中有机硒的含量，无机硒转化率高，且不产生纳米硒，在食用鲜纳豆的同时达到补硒的目的。本发明提供的枯草芽孢杆菌还可用于富硒纳豆菌种的制作和富硒多肽纳豆粉的生产。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

保藏信息：一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XG-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址，中国，武汉，武汉大学；保藏时间：2022年04月08日；保藏编号为CCTCC NO：M2022399

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XG-1，保藏编号为CCTCC NO：M2022399。

本发明还提供了基于上述的枯草芽孢杆菌制备的富硒纳豆菌液体菌种。

本发明还提供了一种用于制备上述富硒纳豆菌液体菌种的含硒液体培养基，包括：葡萄糖2～4％，豆汁20～30％，酵母浸粉1～2％，亚硒酸钠5～50mg/L。

优选的：包括：葡萄糖4％，酵母浸粉2％，豆汁20％，磷酸氢二钠0.3％，七水硫酸镁0.05％，亚硒酸钠10mg/L。

本发明还提供了一种上述的富硒纳豆菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌活化，得斜面种子；

(2)将斜面种子制备液体种子；

(3)将液体种子接种量接种至含硒液体培养基中，37℃、180～220rpm培养24h，得到富硒纳豆菌液体菌种。

优选的：步骤(1)具体为：将枯草芽孢杆菌转接至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，37℃培养18～24h，得到活化的斜面种子；步骤(2)具体为：将斜面种子转接至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180～220rpm摇瓶培养18h，得到液体种子。

本发明还提供了基于上述的富硒纳豆菌液体菌种制作富硒纳豆的方法，包括：精选非转基因大豆，浸泡，蒸煮，冷却后接入富硒纳豆液体菌种，搅拌均匀，发酵，得富硒纳豆。

优选的：非转基因大豆、富硒纳豆液体菌种的质量体积比为5kg：1L；浸泡的时间为8h；蒸煮的时间为1h；发酵：37℃恒温培养24h。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法，取得的技术效果：

现有富硒纳豆大多是通过富硒大豆制作成纳豆，依赖于大豆的天然富硒，而市场上富硒大豆少，难以满足富硒纳豆的原料需求。同时富硒大豆的生产周期长，容易受气候影响收成不稳定，生产成本高，由于土壤中硒含量的不均匀也容易导致富硒含量无法保证。因此，利用微生物转化方式生产富硒纳豆具有周期短、硒含量可控、产品质量稳定的优点。

本发明采用微生物发酵法生产富硒纳豆，不需要大规模种植富硒大豆，短时间内即能生产出富含有机硒和纳豆激酶的富硒纳豆，兼具多种功效，同时具有周期短、成本低、效率高的优点。本发明提供的富硒纳豆菌液体菌种可以直接用于工厂或者家庭的富硒纳豆制作，无需额外添加原料或改造设备，方便快捷，直接制成菌粉也可以作为保健品用于补硒、抗氧化、预防心脑血管疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的本发明工艺流程图。

图2附图为本发明提供的不同碳源对枯草芽孢杆菌菌数的影响图。

图3附图为本发明提供的不同氮源对枯草芽孢杆菌菌数的影响图。

图4附图为本发明提供的不同生长因子对枯草芽孢杆菌菌数的影响图。

图5附图为本发明提供的枯草芽孢杆菌在不同含硒液体培养基中的培养状态图，其中，亚硒酸钠浓度从左到右分别为20、50、100、300、500mg/L。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种枯草芽孢杆菌及其制作富硒纳豆的方法，工艺流程见图1。

实施例中未提及的方法为常规方法，例如：

富硒纳豆中的纳豆激酶活力测定。

1粗酶液的制备：

1.1纳豆固体发酵粗酶液的提取：

纳豆固体发酵后，在每克纳豆中加入质量分数为0.9％生理盐水5mL，4℃浸提4h，4500r/min离心20min，取上清液测酶活。

1.2纳豆液体发酵粗酶液的提取：

取培养72h的液体发酵培养基4000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清，即得粗酶液。

2纳豆激酶活测定

2.1试剂：

(1)生理氯化钠溶液：称取1.8g NaCl溶入200mL蒸馏水，溶解后制成0.9％的生理氯化钠溶液。

(2)pH为7.4磷酸缓冲液：称取14.32g磷酸氢二钠200mL蒸馏水定容，称取6.32g磷酸二氢钠用200mL蒸馏水定容，取162mL磷酸氢二钠溶液，38mL磷酸二氢钠溶液混合摇匀即为0.2mol/L的pH为7.4的磷酸缓冲液，备用。

(3)凝血酶(6BP)：150BP凝血酶加入25mL生理盐水，配成6BP凝血酶。

(4)尿激酶(400IU/mL)：1240IU/瓶尿激酶加入3.1mL生理盐水，配成400IU/mL尿激酶。

(5)纤维蛋白原：2mg/mL

(6)琼脂糖：1％

2.2方法

2.2.1琼脂糖—纤维蛋白板

称取琼脂粉1g放入100mL蒸馏水中，加热至煮沸即得1％的琼脂糖溶液，搅拌后将其放入55℃恒温水浴箱内降温。用分析天平准确称取适量纤维蛋白粉将其加入适量磷酸缓冲液中溶解，配成2mg/mL纤维蛋白原液。吸取10mL 55℃预热好的1％琼脂糖溶液于小三角瓶中，依次加入10mL 2mg/mL纤维蛋白原液，0.5mL凝血酶，将三种溶液迅速混合摇匀，然后倒入灭菌的平板内，静置冷却凝固为乳白色半透明的平板，4℃恒温放置，备用。用时按照样品个数用3mm打孔器打上若干个孔。

2.2.2尿激酶标准曲线

将尿激酶配制成100IU/mL标准品溶液，并稀释成80、60、40、20、10IU/mL的浓度梯度，然后各取10μL滴加到纤维蛋白平板的小孔上，37℃条件下孵育18h后，用游标卡尺测量形成透明圈2条相互垂直的直径，并计算其面积。以尿激酶活力单位(IU/mL)为横坐标，透明圈面积(mm²)为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.3纳豆激酶纤溶活性的测定

不同浓度的纳豆激酶粗酶液(纳豆一般稀释10倍即可)也各取10μL点样于琼脂糖—纤维蛋白板上，37℃恒温培养18h，用游标卡尺测量溶解圈的垂直直径，计算溶解圈的面积，根据标准曲线的线性回归公式计算纳豆激酶活力。

纳豆含水量量测定

称取纳豆20g，置于干燥培养皿中，80℃烘干至恒重，计算失水率。

未提及的原料为常规原料，在此不再一一赘述。

实施例1

富硒菌种制作

第一步，将保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XG-1转接至牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏：3.0g，蛋白胨：10.0g，NaCl：5.0g，琼脂：15～25g，水：1000mL，pH：7.4～7.6。)中，37℃培养18～24h，得到活化的斜面种子。

第二步，配牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏：3.0g，蛋白胨：10.0g，NaCl：5.0g，水：1000mL，pH：7.4～7.6。)，分装至250mL三角瓶中，121℃灭菌15min，将上述活化好的斜面种子转接至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180～220rpm摇瓶培养18h，得到液体种子。

第三步，配含硒液体培养基1L，其中葡萄糖2％，豆汁20％，酵母浸粉1％，磷酸氢二钠0.3％，七水硫酸镁0.05％，亚硒酸钠10mg/L。115℃灭菌15min。将上述液体种子按照2％接种量接种至含硒液体培养基中，37℃、180～220rpm培养24h，得到富硒纳豆菌液体菌种。

第四步，采用菌落计数法测定富硒纳豆菌菌种的菌数，结果为9.4×10⁹CFU/mL，纳豆激酶活力为145IU/mL，多肽含量为1.075mg/L。

实施例2

富硒纳豆制作

第一步，精选非转基因大豆5kg，浸泡8h，装入容器中进行蒸煮1h，冷却后接入富硒纳豆液体菌种1L，搅拌均匀，倒入发酵容器中，37℃恒温培养24h，即得富硒纳豆。

第二步，按照《SB/T 10528-2009纳豆》对上述纳豆进行质量检验，采用琼脂糖—纤维蛋白板法测定纳豆激酶活力，并采用氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93.2017)测定纳豆中有机硒的含量，结果见表1。

表1富硒纳豆理化指标测定

项目	测定值
		水分/100％	60
氨基酸态氮(以氮计)/(g/100g)	0.45
		纳豆激酶IU/g(干基)	467.2
有机硒/(μg/g)	0.448

实施例3

富硒菌种制作，将实施例1中的含硒液体培养基替换为以下培养基：葡萄糖3％，豆汁25％，酵母浸粉1.5％，磷酸氢二钠0.4％，七水硫酸镁0.075％，亚硒酸钠20mg/L。其他步骤与实施实例1相同。

富硒纳豆制作，同实施例2。

富硒纳豆质量测定

按照《SB/T 10528-2009纳豆》对上述纳豆进行质量检验，采用琼脂糖—纤维蛋白板法测定纳豆激酶活力，并采用氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93.2017)测定纳豆中有机硒的含量，结果见表2。

表2富硒纳豆理化指标测定

项目	测定值
		水分/100％	61
氨基酸态氮(以氮计)/(g/100g)	0.42
		纳豆激酶IU/g(干基)	442.3
有机硒/(μg/g)	0.956

实施例4

富硒菌种制作，将实施例1中的含硒液体培养基替换为以下培养基：葡萄糖4％，豆汁30％，酵母浸粉2％，磷酸氢二钠0.5％，七水硫酸镁0.1％，亚硒酸钠30mg/L。其他步骤与实施实例1相同。

富硒纳豆制作，同实施例2。

富硒纳豆质量测定

按照《SB/T 10528-2009纳豆》对上述纳豆进行质量检验，采用琼脂糖—纤维蛋白板法测定纳豆激酶活力，并采用氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93.2017)测定纳豆中有机硒的含量，结果见表3。

表3富硒纳豆理化指标测定

项目	测定值
		水分/100％	58
氨基酸态氮(以氮计)/(g/100g)	0.39
		纳豆激酶IU/g(干基)	440.8
有机硒/(μg/g)	1.392

实施例制备的富硒纳豆除了有补硒效果，还有纳豆激酶活力。

实施例5

含硒液体培养基优化

1.1材料

纳豆菌所用菌种为枯草芽孢杆菌XG-1，保藏编号为CCTCC NO：M2022399。

大豆购于市场。

1.2试验方法与结果

1.2.1单因子试验

1.2.1.1碳源

选取蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉5种不同的碳源，其他成分按液体培养基成分添加，接种枯草芽孢杆菌，培养24h进行菌数测定，结果见图2，葡萄糖作为碳源时菌数最多，为6.9×10⁹CFU/mL，因此选用葡萄糖作为培养基碳源。

1.2.1.2氮源

选取酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏3种不同的氮源，其他成分按液体培养基成分添加，接种枯草芽孢杆菌，培养24h进行菌数测定，结果见图3，酵母浸粉作为氮源时菌数最多，为7.2×10⁹CFU/mL，因此选用酵母浸粉作为培养基氮源。

1.2.1.3生长因子

选取豆芽汁和豆汁(豆汁制作方法：100g大豆浸泡至饱满，加入1L水磨浆，纱布过滤后弃渣取汁，即为豆汁；豆芽汁制作方法：200g豆芽加入1L水磨浆，纱布过滤后弃渣取汁，即为豆芽汁)2种不同的生长因子添加到培养基中，其他成分按液体培养基成分添加，接种枯草芽孢杆菌，培养24h进行菌数测定，结果见图4，豆汁作为生长因子时菌数最多，为8.2×10⁹CFU/mL，因此选用豆汁作为生长因子。

2.2正交试验

根据单因素试验，选取葡萄糖、酵母浸粉和豆汁设计3因素2水平正交试验，葡萄糖浓度分别为2％和4％，酵母浸粉浓度分别为1％和2％，豆汁添加量分别为20％和30％，结果见表4，分析结果见表5。极差分析显示，葡萄糖、酵母浸粉和豆汁对枯草芽孢杆菌生长的影响为酵母浸粉>葡萄糖>豆汁，当葡萄糖4％、酵母浸粉2％和豆汁20％时菌数最多，为9.5×10⁹(CFU/mL)。

表4正交试验结果

表5正交试验结果分析

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值
					葡萄糖	0.002	1	0.003	10.100
酵母浸粉	1.563	1	2.654	10.100
					豆汁	0.202	1	0.343	10.100
误差	1.77	3

实施例6

不同亚硒酸钠浓度的添加试验

在实施例5最优液体培养基基础上加入不同浓度亚硒酸钠，发酵24h，测有机硒和多肽含量，结果见表6。亚硒酸钠浓度在5mg/L时有机硒转化率最高，达到86.5％，随着亚硒酸钠浓度增大，硒转化率逐渐下降，多肽含量也呈现同样的变化趋势。同时，当亚硒酸钠浓度升高时，液体培养基颜色越来越红(见图5)，这是微生物解除硒毒性的一种有效机制，亚硒酸钠一部分形成有机硒(主要是硒蛋白)，其余则转为红色的纳米硒。亚硒酸钠浓度越高，形成的红色纳米硒越多，因此颜色越红。

当亚硒酸钠浓度≥50mg/L，有机硒转化率≤50％，因此选用添加5～50mg/L亚硒酸钠浓度的富硒纳豆菌种接种纳豆，接种量为10％，培养24h后测得有机硒含量分别为24、44.8、91.2、137.4、189.1、237.7μg/100g纳豆，硒转化率分别为100％、100％、99.5％、99.1％、98.3％、95.6％(见表7)。可见经过二次微生物发酵(第一次为液体发酵，第二次为固体发酵)，5～10mg/L亚硒酸钠转化率达到100％，20～30mg/L亚硒酸钠转化率达到99％以上，40-50mg/L亚硒酸钠转化率达到95％以上，毒性大大降低。

按照每人每日食用鲜纳豆100g计算，采用10～30mg/L亚硒酸钠浓度的富硒纳豆菌种接种纳豆，即可获得40～150μg/100g的富硒纳豆，而且有机硒含量达到99％以上，安全有效。

表6添加不同浓度亚硒酸钠后有机硒和多肽含量的测定

表7不同硒浓度的纳豆菌种接种纳豆后有机硒的测定

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种富硒纳豆菌液体菌种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌活化，得斜面种子；

(2)将斜面种子制备液体种子；

(3)将液体种子接种至含硒液体培养基中，37℃、180～220rpm培养24h，得到富硒纳豆菌液体菌种；

所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XG-1，保藏编号为CCTCC NO：M2022399。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：将枯草芽孢杆菌转接至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，37℃培养18～24h，得到活化的斜面种子；步骤(2)具体为：将斜面种子转接至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180～220rpm摇瓶培养18h，得到液体种子。

3.基于权利要求2中所述的富硒纳豆菌液体菌种在制作富硒纳豆中的方法，其特征在于，包括：精选非转基因大豆，浸泡，蒸煮，冷却后接入富硒纳豆液体菌种，搅拌均匀，发酵，得富硒纳豆。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述非转基因大豆、富硒纳豆液体菌种的质量体积比为5kg：1L；浸泡的时间为8h；蒸煮的时间为1h；所述发酵：37℃恒温培养24h。

5.基于权利要求1所述的制备方法得到的富硒纳豆菌液体菌种。

6.如权利要求1所述的一种富硒纳豆菌液体菌种的制备方法，其特征在于，所述含硒液体培养基包括：葡萄糖2～4％，豆汁20～30％，酵母浸粉1～2％，亚硒酸钠5～50mg/L。

7.如权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述含硒液体培养基包括：葡萄糖4％，酵母浸粉2％，豆汁20％，磷酸氢二钠0.3％，七水硫酸镁0.05％，亚硒酸钠10mg/L。