CN108034598B - 一种可同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的组合物 - Google Patents

一种可同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物。利用生物降解霉菌毒素是一种有效和安全的方法。本发明利用响应面回归设计，对地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌的组合条件进行优化，得出体积比达到1:1:1时，AFB1和ZEA的降解率达到最高，分别为45.49%和44.90%。之后再与黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶配伍，得到体积比达到3:2时，AFB1和ZEA降解率达到63.95%和73.51%。分别比之前单一复合益生菌降解率提高了40.58%和63.72%。试验结果表明，利用复合益生菌和黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶同时降解AFB1和ZEA两种霉菌毒素是一种有效的方法。

Description

一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物
技术领域
本发明涉及微生物的技术领域，更具体地说，涉及一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物。
背景技术
据联合国粮农组织（FAO）估计，全球每年约25%的粮食和饲料被霉菌毒素污染，平均2%的粮食不能食用。亚太地区大约有三分之一的饲料和饲料样品霉菌毒素检测呈现阳性。
这些粮食和饲料原料主要被黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮 (ZEA)、呕吐毒素 (DON)和伏马毒素B1(FB1)污染。2003年对中国的饲料原料和配合饲料中霉菌毒素的调查结果显示，有88%、84%、77%和60%的玉米中含有T-2毒素、黄曲霉毒素、烟曲霉毒素和赭曲霉毒素A。且所有的玉米中均含有呕吐毒素和玉米赤霉烯酮。90%以上的配合饲料中均含有6种以上的霉菌毒素。霉菌毒素污染不仅引发动物的中毒、疾病与死亡，也给粮食工业和畜牧业带来巨大的经济损失。
在粮食作物与饲料中检出率比较高及对人类与动物健康影响比较大的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮。黄曲霉毒素B1具有极强的致癌、致畸和致突变作用。动物采食被黄曲霉毒素B1污染的饲料后，会出现生长速度减缓，饲料利用率降低，肝脏病变、胃肠道损伤、免疫抑制等现象。
尤其值得注意的是，黄曲霉毒素及其代谢产物可在动物的肝、肾、肌肉、乳汁以及禽蛋等动物产品中残留，并通过食物链危害人类的健康。玉米赤霉烯酮则具有很强的生殖毒性，能够与雌激素受体产生竞争结合继而表现出雌激素活性，特别是对于雌性哺乳动物而言，会影响其乳房发育、抑制排卵，生殖周期紊乱，给养殖业带来很大的损失。
大多数情况下，真菌毒素对饲料和食物的污染是多种毒素的混合污染。例如，在同一种谷物中，黄曲霉毒素、烟曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮往往同时并存。因此，一种谷物在自然条件下不大可能只受一种真菌毒素污染。即使每种原料只含有一种真菌毒素，将众多原料配合成一种饲料，那么这种饲料就含有多种不同的真菌毒素。在过去的8年里，所检测的饲料和饲料原料中有72%被检测出至少有一种霉菌毒素的污染，而38%的饲料和饲料原料被检测出被多种霉菌毒素污染。
然而，目前国内外对多种霉菌毒素的联合毒性作用研究报道不多，由于缺乏这方面的基础研究，国内外科学家在制订饲料卫生标准的过程中，对霉菌毒素的限量要求往往仅能考虑单一或一类霉菌毒素的危害，而不能顾忌到多种霉菌毒素混合污染带来的联合毒性，因此存在极大的安全隐患。针对霉菌毒素国内外这样的现状，如何有效地消除和降低多种霉菌毒素的污染成为众多学者关注的目标。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，包括复合益生菌和黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶。
在某些实施方式中，所述黑曲霉经固态发酵产生霉菌毒素降解酶；
所述霉菌毒素降解酶与生理盐水混合制成霉菌毒素降解酶液。
在某些实施方式中，所述复合益生菌包括地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌。
在某些实施方式中，所述地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌的体积比为1：1：1。
在某些实施方式中，所述复合益生菌和霉菌毒素降解酶液的比例为1：2~5:2。
在某些实施方式中，所述复合益生菌和霉菌毒素降解酶液的比例为3:2。
在某些实施方式中，所述嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中培养；所述MRS液体培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸铵、MgSO4、MnSO4；
（2）加入Tween 80；
（3）调节pH，定容，灭菌，静置培养，备用。
在某些实施方式中，所述酿酒酵母接种于YPD液体培养基中培养；所述YPD培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖；
（2）定容，灭菌，振荡培养，备用。
在某些实施方式中，所述地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养；所述LB培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl；
（2）调pH，定容，灭菌，振荡培养，备用。
在某些实施方式中，所述霉菌毒素降解酶液的制备方法包括：
（1）挑取降解黄曲霉毒素B1的黑曲霉菌株，将其涂布于PDA固体培养基中，恒温培养至大量产生孢子时收获；
（2）在平皿中加入灭菌了的生理盐水，所述生理盐水中含Tween 80；
（3）刮下孢子，过滤以除去菌丝残体，调整孢子；
（4）接种黑曲霉孢子悬液于黑曲霉产酶固体发酵培养基，恒温培养后收获固体发酵培养物；
（5）将收获的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，振荡，静置，过滤，离心，除菌，备用。
与现有技术相比，本发明的目的在于提供一种能够抑制多种霉菌毒素混合污染带来的联合毒性的组合物。从而，增强粮食、饲料的安全性有效地消除和降低多种霉菌毒素的污染。
优选的，所述复合益生菌包括地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌。
需要理解的是，响应面回归试验设计采用中心组合试验设计（CCD），可以通过最少的试验来拟合响应模型，每个因素通常设置5个水平。该法能够在有限的试验次数下，对影响结果的因素及其交互作用进行评价，而且还能对各因素进行优化，以获得影响过程的最佳条件。
本发明通过响应面设计对三种益生菌的配比进行优化，得到三种菌的最优配比后再与黑曲霉固态发酵产生的霉菌毒素降解酶进行配伍，得出能够同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的益生菌与霉菌毒素降解酶组合的最佳配比。从而为多种霉菌毒素的同时生物降解提供依据。
本发明特殊的构建方法，其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为酿酒酵母与地衣芽孢杆菌降解AFB1条件优化响应面图；
图2为酿酒酵母与嗜酸乳杆菌降解AFB1条件优化响应面图；
图3为嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌降解AFB1条件优化响应面图；
图4地衣芽孢杆菌与酿酒酵母降解ZEA条件优化响应面图；
图5 嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌降解ZEA条件优化响应面图；
图6 嗜酸乳杆菌与酿酒酵母降解ZEA条件优化响应面图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过下述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
本发明提供了一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，包括复合益生菌和黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶。
进一步的，所述黑曲霉经固态发酵产生霉菌毒素降解酶；
所述霉菌毒素降解酶与生理盐水混合制成霉菌毒素降解酶液。
进一步的，所述复合益生菌包括地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌。
进一步的，所述地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌的体积比为1：1：1。
进一步的，所述复合益生菌和霉菌毒素降解酶液的比例为1：2~5:2。
进一步的，所述复合益生菌和霉菌毒素降解酶液的比例为3:2。
进一步的，所述嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中培养；所述MRS液体培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸铵、MgSO4、MnSO4；
（2）加入Tween 80；
（3）调节pH，定容，灭菌，静置培养，备用。
进一步的，所述酿酒酵母接种于YPD液体培养基中培养；所述YPD培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖；
（2）定容，灭菌，振荡培养，备用。
进一步的，所述地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养；所述LB培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl；
（2）调pH，定容，灭菌，振荡培养，备用。
进一步的，所述霉菌毒素降解酶液的制备方法包括：
（1）挑取降解黄曲霉毒素B1的黑曲霉菌株，将其涂布于PDA固体培养基中，恒温培养至大量产生孢子时收获；
（2）在平皿中加入灭菌了的生理盐水，所述生理盐水中含Tween 80；
（3）刮下孢子，过滤以除去菌丝残体，调整孢子；
（4）接种黑曲霉孢子悬液于黑曲霉产酶固体发酵培养基，恒温培养后收获固体发酵培养物；
（5）将收获的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，振荡，静置，过滤，离心，除菌，备用。
需要理解的是，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CGMCC 1.2919、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.3866、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC 1.265、黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 3.6249，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
仪器设备：立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安），BCM-1000型生物净化工作台（苏州净化），双层气浴振荡器（江苏金坛杰瑞尔电器），酶标仪,(Biotec-Elx800)加热磁力搅拌器（79-1 金坛市中大仪器），高速冷冻离心机，电子天平（AB204-N）等。
试剂：酵母浸粉，胰蛋白胨，蛋白胨，葡萄糖，氯化钠，磷酸氢二钾，无水乙酸钠，柠檬酸铵，吐温80，硫酸镁，硫酸锰，甲醇等，以上均为国产分析纯。
AFB1和ZEA均购于Sigma公司，纯度>99%。
AFB1和ZEA均用甲醇作溶剂，它们储备液浓度分别为：50μg/mL和500μg/mL。储备液使用前，利用0.22μm一次性滤器除菌。
黄曲霉毒素B1定量检测试剂盒：RIDASCREENRFAST Aflatoxin B1 30/15（R-Biopharm, Germany，货号：R1211）。
玉米赤霉烯酮定量检测试剂盒：RIDASCREENRFAST Zearalenon SC （R-Biopharm,Germany，货号：R5505）。
可以理解的是，目前，降低霉菌毒素的方法主要有三种：
（1）物理方法（包括高温处理、射线处理、吸附和萃取等）：目前生产中采用较多的是通过向饲料中加入硅铝酸盐、膨润土、蒙脱石、活性炭等来吸附霉菌毒素，但这类物质不仅吸附毒素的能力有限，而且还吸附营养物质，造成大量营养物质丢失。
（2）化学方法：主要是通过酸碱溶液或其它化合物对霉菌毒素进行处理，如臭氧处理、氨化作用以及与食品级添加剂发生反应，这些方法已被证实在降解毒素污染方面有一定的效果，但是破坏了饲料的营养价值和适口性，成本较高，并导致环境污染。
（3）生物解毒方法：是通过微生物发酵或者其产生的酶将霉菌毒素降解为低量或者无毒的物质，达到脱毒的目的，是一种安全、高效、环保的解毒方法。
本发明采用安全、高效、环保的解毒方法，即生物解毒方法。
需要理解的是，发明人利用Design-Expert 8.0.6软件，采用Central CompositeDesign（CCD）设计、模型拟合和数据分析。试验因素及水平见表1。
试验体系为10 mL。
对照组：5 mL生理盐水和5 mL MRS培养基混合而成；
试验组：不同体积的三种益生菌，加入5 mL MRS培养基，再加入生理盐水补足至5mL。
该设计共20个试验点，每个试验点做3个重复，每个重复设定霉菌毒素量为：AFB140 μg/L和ZEN 500 μg/L。
表1中心组合试验设计因素编码水平表
Figure 197532DEST_PATH_IMAGE001
为了体现自变量和因变量的关系，采用二次多项式方程进行拟合，预测二次多项方程式如下：
Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X1 2+β22X2 2+β33X3 2+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3
式中：Y是预测的毒素降解率（%）；X1、X2、X3是自变量，分别对应地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌的体积（mL）；β0是截距；β1、β2和β3是线性系数；β11、β22和β33是平方系数；β12、β23和β13是交叉系数。
两种毒素降解率的测定：
培养液上清液中AFB1和ZEA含量测定：将培养液混合均匀，用移液器吸取1 mL，13000 rpm条件下离心5 min，取离心后上清液用于AFB1和ZEA含量测定。按照表1试验设计的三因素五水平响应面设计进行试验，24 h后测得三种益生菌共培养对AFB1和ZEA的降解率，计算公式如下：
AFB1的降解率=（24小时后对照组测得的AFB1的含量-24小时后试验组测得的AFB1的含量）×100%/24小时后对照组测得的AFB1的含量
ZEA的降解率=（24小时后对照组测得的ZEA的含量-24小时后试验组测得的ZEA的含量）×100%/24小时后对照组测得的ZEA的含量
将试验结果输入Design-Expert软件进行分析，得出多元二次回归方程。两个响应值(AFB1的降解率和ZEN的降解率)，分别得出两个线性回归方程，从而得出降解AFB1和ZEA的最佳益生菌组合。
复合益生菌与黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶液配伍最优条件优化：
根据上述得到的复合益生菌对AFB1和ZEA的最优降解结果，选择对AFB1和ZEA的降解效果最好的组合，即地衣芽孢杆菌：酿酒酵母：嗜酸乳杆菌=1:1:1（体积比），作为与黑曲霉粗酶液配伍降解AFB1和ZEA试验的益生菌组合比例。
将复合益生菌与霉菌毒素降解酶液按表2的组合比例进行调配，添加相应比例的灭菌生理盐水和MRS空白培养基，使反应体系的最终体积均为10 mL，并使各组生理盐水和MRS培养基的比例相同。
加入AFB1和ZEA使其在体系中的最终浓度约为40 μg/L和500 μg/L，将其置于37℃恒温气浴振荡器中，180 rpm振荡培养24 h，沸水浴30 min终止反应。以相同体积的灭菌生理盐水和MRS空白培养基及加同等剂量的AFB1和ZEA作为空白对照。每个组做三个重复。
表2复合益生菌与霉菌毒素降解酶液配伍对AFB1和ZEA的降解的试验设计
Figure 895361DEST_PATH_IMAGE002
试验数据采用SPSS 20.0软件进行ANOVA方差统计分析，结果用平均值±标准差表示，以P< 0.05表示差异显著。
复合益生菌的优化组合及对AFB1和ZEA两种毒素同时降解的效果：根据DesignExpert 8.0.6 软件中Central Composite Design（CCD）试验设计，设计了20个试验点的响应面分析试验，对试验获得两种毒素降解率进行回归，建立响应面二次回归模型，寻求最优因素水平，试验结果与回归方程系数方差分析分别见表3和表4。利用Design Expert 8.0.6对数据进行多元回归拟合，得出回归模型方程及方差分析结果如下：
YAFB1=-0.31+1.36X1+0.41X2+0.05X3-0.60X1 2-0.32X2 2-0.21X3 2-0.17X1X2-0.03X1X3+0.29X2X3
YZEA=-0.19+0.25X1+0.82X2+0.07X3-0.22X1 2-0.39X2 2-0.04X3 2+0.07X1X2+0.16X1X3-0.09X2X3
对表3中的数据用Design Expert 8.0.6 软件做回归分析，得到AFB1和ZEA降解率的预测值。
由表4模型回归系数方差分析可知，试验建立的响应面回归模型分析结果P<0.0001，表明该模型拟合度很好，能够很好地表示两种毒素降解率与三种益生菌接种量之间的线性关系。
方差分析中RAFB1 2=0.9373，RZEA 2=0.9396，失拟项系数值PAFB1= 0.1，PZEA=0.2683均大于0.05,表明该方程拟合度较好，模型预测结果比较准确。图1~6表示出三种益生菌在降解AFB1和ZEA时两两的交互作用，其中酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的接种量对AFB1降解率影响显著 (P < 0.05)，单独嗜酸乳杆菌对AFB1降解率影响也达到了显著水平(P < 0.05)；同样地, 地衣芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的接种量对ZEA降解率影响显著(P < 0.05)。这表明本发明中考虑的三个因素对AFB1和ZEA的同时降解具有交互作用。
参见图1至图6，可知应用响应面分析试验设计得到的同时降解AFB1和ZEA的益生菌最优组合为：地衣芽孢杆菌：酿酒酵母：嗜酸乳杆菌（V:V:V）=1：1：1，采用试验所得的最佳益生菌配比，在37℃、180 rpm恒温气浴振荡摇床中培养24 h，所得AFB1降解率为45.49%，ZEA降解率为44.9%，与预测值47%和44%接近，验证该模型能较好地预测实际值。
复合益生菌与霉菌毒素降解酶液配伍对AFB1和ZEA两种毒素的降解效果：
根据上述得出降解AFB1和ZEA两种毒素的三种益生菌最佳配比为1:1:1，以此配比作为与霉菌毒素降解酶液配伍对AFB1和ZEA两种毒素降解效果的研究。
将益生菌组合与霉菌毒素降解酶液按照表2的组合比例进行调配。复合益生菌与霉菌毒素降解酶液组合降解AFB1和ZEA结果见表5，当复合益生菌与霉菌毒素降解酶液组合达到3:2时，AFB1和ZEA的降解率达到最高分别是63.95%和73.51%，比单一复合益生菌对AFB1和ZEA的降解率提高了40.58%和63.72%。
另外，单一的霉菌毒素降解酶液对AFB1和ZEA的降解率也达到了67.52%和74.22%，也不失为一种良好的AFB1和ZEA生物降解剂，但考虑到益生菌在动物生产中的益生作用，复合益生菌与霉菌毒素降解酶液组合将是最佳选择，对于AFB1和ZEA的同时降解及畜禽健康养殖具有非常重要的意义。
表3中心组合设计(CCD)参数与响应值AFB1和ZEA降解率（%）
Figure 162394DEST_PATH_IMAGE003
Figure 735196DEST_PATH_IMAGE004
表4响应面回归方程系数的方差分析
Figure 404074DEST_PATH_IMAGE005
Figure 272804DEST_PATH_IMAGE006
Figure 27134DEST_PATH_IMAGE007
表5益生菌组合与降解AFB1和ZEA粗酶液配伍对两种毒素降解的试验结果
Figure 764146DEST_PATH_IMAGE008
Figure 687799DEST_PATH_IMAGE009
注：同列中小写字母不同表示差异显著（P<0.05），同列中小写字母相同表示差异不显著（P>0.05）。
实施例1
嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中；
MRS培养基的组成：胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、K2HPO4 2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸铵2 g、MgSO4 0.2 g、MnSO4 0.05 g，用800 mL蒸馏水溶解后加入1 mL Tween 80，调pH为6.2~6.6，之后定容至1000 mL，在121℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min；37℃静置培养24小时后，备用。
酿酒酵母接种于YPD液体培养基中；
YPD培养基的组成：酵母提取物10 g、胰蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，之后定容至1000mL，在121℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min；在30℃、180 rpm条件下振荡培养24小时后，备用。
地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基中；
LB培养基的组成：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，用800 mL蒸馏水溶解后调pH为7.0，之后定容至1000 mL，在121℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20min；在37℃、180 rpm条件下振荡培养24小时后，备用。
霉菌毒素降解酶液的制备：挑取降解AFB1的黑曲霉菌株，将其涂布于PDA固体培养基中，置于30℃恒温培养至大量产生孢子时收获（大约96 h）。在平皿中加入适量灭菌生理盐水（含体积分数0.05%的Tween 80），用涂布棒将平皿上的孢子刮下，用4层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为1×108 cfu/mL。
然后接种12 mL黑曲霉孢子悬液于黑曲霉产酶固体发酵培养基（小麸麸42 g，玉米6 g，豆粕12 g，加入蒸馏水36 mL，搅拌均匀，高压灭菌），置于30℃恒温培养箱中培养5 d后收获，按照固液比为1:10的比例将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，30℃摇床振荡2h，静置5 h，之后用8层纱布过滤，然后将滤液10000 rpm离心5 min，最后用0.22μm滤膜过滤除菌后保存于4℃备用。
黄曲霉毒素B1降解酶的活力单位为284.3 U/L，具体定义为：在pH 7.0 和37℃的条件下，每分钟降解1 ng黄曲霉毒素B1为1个酶活单位。玉米赤霉烯酮降解酶的活力单位为31.0 U/L，具体定义为：在pH 7.0 和37℃的条件下，每分钟降解1 ng 玉米赤霉烯酮为1个酶活单位。
PDA固体培养基组成：葡萄糖 20.0 g、可溶性淀粉 6.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KH2PO4 1.0 g、酵母2 g、大豆蛋白胨5 g、琼脂粉15 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，在121℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌后倾倒固体平皿。
实施例2
嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中；
MRS培养基的组成：胰蛋白胨8 g、牛肉蛋白胨5 g、酵母提取物15 g、葡萄糖23 g、K2HPO4 1 g、乙酸钠4 g、柠檬酸铵1 g、MgSO4 0.1 g、MnSO4 0.03 g，用900 mL蒸馏水溶解后加入2 mL Tween 80，调pH为6.2~6.6，之后定容至1000 mL，在130℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌30 min；37℃静置培养18小时后，备用。
酿酒酵母接种于YPD液体培养基中；
YPD培养基的组成：酵母提取物8 g、胰蛋白胨25 g、葡萄糖15 g，之后定容至1000mL，在115℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min；在30℃、180 rpm条件下振荡培养24小时后，备用。
地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基中；
LB培养基的组成：胰蛋白胨15 g、酵母提取物8 g、NaCl 12 g，用800 mL蒸馏水溶解后调pH为7.0，之后定容至1000 mL，在125℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌15min；在37℃、150 rpm条件下振荡培养24小时后，备用。
霉菌毒素降解酶液的制备：挑取降解AFB1的黑曲霉菌株，将其涂布于PDA固体培养基中，置于30℃恒温培养至大量产生孢子时收获（大约96 h）。在平皿中加入适量灭菌生理盐水（含体积分数0.05%的Tween 80），用涂布棒将平皿上的孢子刮下，用6层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为1×108 cfu/mL。
然后接种12 mL黑曲霉孢子悬液于黑曲霉产酶固体发酵培养基（小麸麸32 g，玉米8 g，豆粕15 g，加入蒸馏水40 mL，搅拌均匀，高压灭菌），置于30℃恒温培养箱中培养5 d后收获，按照固液比为1:10的比例将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，30℃摇床振荡2h，静置5 h，之后用8层纱布过滤，然后将滤液10000 rpm离心5 min，最后用0.22μm滤膜过滤除菌后保存于4℃备用。
黄曲霉毒素B1降解酶的活力单位为284.3 U/L，具体定义为：在pH 7.0 和37℃的条件下，每分钟降解1 ng黄曲霉毒素B1为1个酶活单位。玉米赤霉烯酮降解酶的活力单位为31.0 U/L，具体定义为：在pH 7.0 和37℃的条件下，每分钟降解1 ng 玉米赤霉烯酮为1个酶活单位。
PDA固体培养基组成：葡萄糖 20.0 g、可溶性淀粉 6.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KH2PO4 1.0 g、酵母2 g、大豆蛋白胨5 g、琼脂粉15 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，在110℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌后倾倒固体平皿。
实施例3
嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中；
MRS培养基的组成：胰蛋白胨8 g、牛肉蛋白胨5 g、酵母提取物15 g、葡萄糖23 g、K2HPO4 1 g、乙酸钠4 g、柠檬酸铵1 g、MgSO4 0.1 g、MnSO4 0.03 g，用900 mL蒸馏水溶解后加入2 mL Tween 80，调pH为6.2~6.6，之后定容至1000 mL，在130℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌30 min；37℃静置培养18小时后，备用。
酿酒酵母接种于YPD液体培养基中；
YPD培养基的组成：酵母提取物5 g、胰蛋白胨25 g、葡萄糖15 g，之后定容至1000mL，在115℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min；在30℃、180 rpm条件下振荡培养24小时后，备用。
地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基中；
LB培养基的组成：胰蛋白胨10 g、酵母提取物4 g、NaCl 12 g，用800 mL蒸馏水溶解后调pH为7.0，之后定容至1000 mL，在125℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌15min；在37℃、150 rpm条件下振荡培养16小时后，备用。
霉菌毒素降解酶液的制备：挑取降解AFB1的黑曲霉菌株，将其涂布于PDA固体培养基中，置于30℃恒温培养至大量产生孢子时收获（大约96 h）。在平皿中加入适量灭菌生理盐水（含体积分数0.05%的Tween 80），用涂布棒将平皿上的孢子刮下，用2层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为1×108 cfu/mL。
然后接种12 mL黑曲霉孢子悬液于黑曲霉产酶固体发酵培养基（小麸麸32 g，玉米8 g，豆粕15 g，加入蒸馏水40 mL，搅拌均匀，高压灭菌），置于30℃恒温培养箱中培养5 d后收获，按照固液比为1:10的比例将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，30℃摇床振荡2h，静置5 h，之后用8层纱布过滤，然后将滤液10000 rpm离心10 min，最后用0.22μm滤膜过滤除菌后保存于4℃备用。
黄曲霉毒素B1降解酶的活力单位为284.3 U/L，具体定义为：在pH 7.0 和37℃的条件下，每分钟降解1 ng黄曲霉毒素B1为1个酶活单位。玉米赤霉烯酮降解酶的活力单位为31.0 U/L，具体定义为：在pH 7.0 和37℃的条件下，每分钟降解1 ng 玉米赤霉烯酮为1个酶活单位。
PDA固体培养基组成：葡萄糖 20.0 g、可溶性淀粉 5.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KH2PO4 2.0 g、酵母3 g、大豆蛋白胨2 g、琼脂粉10 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，在110℃、1.034×105 Pa条件下高压蒸汽灭菌后倾倒固体平皿。

Claims (6)

1.一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，其特征在于，包括复合益生菌和黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶；
所述复合益生菌包括地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌，所述地衣芽孢杆菌、酿酒酵母以及嗜酸乳杆菌的体积比为1：1：1；所述黑曲霉经固态发酵产生霉菌毒素降解酶；所述霉菌毒素降解酶与生理盐水混合制成霉菌毒素降解酶液；所述复合益生菌和霉菌毒素降解酶液的比例为1：2~5:2；
所述嗜酸乳杆菌、所述酿酒酵母、所述地衣芽孢杆菌、所述黑曲霉，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，所述嗜酸乳杆菌的保藏编号为CGMCC 1.2919、所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC 2.3866、所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC 1.265、所述黑曲霉的保藏编号为CGMCC 3.6249。
2.如权利要求1所述的一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，其特征在于：所述复合益生菌和霉菌毒素降解酶液的比例为3:2。
3.如权利要求2所述的一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，其特征在于：所述嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中培养；所述MRS液体培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸铵、MgSO4、MnSO4；
（2）加入Tween 80；
（3）调节pH，定容，灭菌，静置培养，备用。
4.如权利要求2所述的一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，其特征在于：所述酿酒酵母接种于YPD液体培养基中培养；所述YPD培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖；
（2）定容，灭菌，振荡培养，备用。
5.如权利要求2所述的一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养；所述LB培养基的制备方法包括：
（1）用蒸馏水溶解胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl；
（2）调pH，定容，灭菌，振荡培养，备用。
6.如权利要求2所述的一种可同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的组合物，其特征在于：
所述霉菌毒素降解酶液的制备方法包括：
（1）挑取降解黄曲霉毒素B1的黑曲霉菌株，将其涂布于PDA固体培养基中，恒温培养至大量产生孢子时收获；
（2）在平皿中加入灭菌了的生理盐水，所述生理盐水中含Tween 80；
（3）刮下孢子，过滤以除去菌丝残体，调整孢子；
（4）接种黑曲霉孢子悬液于黑曲霉产酶固体发酵培养基，恒温培养后收获固体发酵培养物；
（5）将收获的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，振荡，静置，过滤，离心，除菌，备用。
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