CN102613251B

CN102613251B - 一种发酵床霉菌抑制剂及其制备方法

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Publication number: CN102613251B
Application number: CN201210059010.3A
Authority: CN
Inventors: 燕淑海
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2032-03-08
Also published as: CN102613251A

Abstract

本发明公开了一种发酵床霉菌抑制剂及其制备方法，所述制剂由复合化学制剂和复合微生物菌剂组成，通过将有机物和无机物混合得到复合化学制剂，通过对微生物进行单菌种纯发酵后混合得到复合微生物菌剂；本发明的优点在于：所述抑制剂在发酵床中霉菌的清除率达90%以上，霉菌毒素吸附率为70%，减少了霉菌和霉菌毒素对禽类的危害，解决了畜禽饲养过程中，由于环境因素或饲料因素而造成的畜禽霉菌或霉菌毒素中毒问题，达到药物治疗之功效，从而改变畜禽肠道菌群平衡问题，解决了现在畜禽养殖中，抗生素滥用问题。

Description

一种发酵床霉菌抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种复合型的霉菌抑制剂，具体地说是一种针对禽类粪便发酵床的霉菌抑制剂及其制备方法，属于霉菌抑制剂领域。

背景技术

生态养殖的发展，促使了禽类发酵床的发展，但禽类粪便中水分很大，发酵床床体很低，所以很容易出现霉菌污染的现象。霉菌和霉菌毒素对畜禽的危害巨大，所以发酵床的霉菌抑制剂和霉菌毒素清除制剂的研究开发迫在眉睫。

国内发酵床禽养殖技术最近几年刚刚开始，在发酵床中防霉剂的研究方面还没有看到具体的报道。但对于饲料的防霉工作国内外都做了很大的工作，为预防饲料贮存期间营养成分损失，防止饲料霉变并延长贮存时间，当饲料水分含量高于13％时，一般在贮存时都会添加防霉剂，用以降低饲料中霉菌的数量，抑制霉菌毒素产生。防霉剂除了有机化学药物外，还从中草药中提取有效成分作为天然霉菌抑制剂来对原材料保鲜。目前，对于发酵床的霉菌抑制剂产品，市场上多为有机物或无机物，成分单一，抗冲击能力不强，处理效果不佳。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种发酵床霉菌抑制剂及其制备方法，该抑制剂是由有机物、无机物和微生物菌体混合搭配而成的针对发酵床霉菌抑制的复合物，对发酵床中产生的霉菌进行抑制，对霉菌产生的霉菌毒素进行吸附，减少霉菌和霉菌毒素对畜禽的危害，具有高强度抑制力和清除能力，发酵床霉菌中霉菌的清除率达90%以上，霉菌毒素吸附率为70%，且不影响发酵床中有益菌群的生长。

本发明的技术方案为：

一种发酵床霉菌抑制剂，由复合化学制剂和复合微生物菌剂组成；

所述复合化学制剂和复合微生物菌剂的质量g数与体积ml数比为1～3∶1；

所述复合化学制剂和复合微生物菌剂的复配质量体积比最佳为1∶1；

所述复合化学制剂，由硅藻土、双醋酸钠、碘化钾组成；所述硅藻土、双醋酸钠、碘化钾的质量比为3～6∶1～2∶1～2；其中，优选为3∶1∶1；

所述复合微生物菌剂由啤酒酵母菌（Sac-charomyces cerevisiae）菌液、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌液、德氏乳酸菌（L．Delbrueckii）菌液组成；所述啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液的体积比为1～2∶2～4∶3～6，其中，优选为1∶2∶3。

所述复合微生物菌剂为单菌种纯发酵，发酵后进行复配得到的。

上述发酵床霉菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）按照上述配比混合硅藻土、双醋酸钠、碘化钾，得到复合化学制剂；

（2）分别制备啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液；

所述啤酒酵母菌菌液的制备方法为：所需培养基为酵母膏 10.0g、蛋白胨 20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000ml；培养温度为28～38℃；好氧发酵24～48h，得到啤酒酵母菌菌液；

所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：所需培养基为蛋白胨 15.0g、牛肉膏 0.50g、葡萄糖 20.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水1000ml；培养温度为30～36℃；好氧发酵48～72h，得到枯草芽孢杆菌菌液；

所述德氏乳酸菌菌液的制备方法为：所需培养基为麦芽汁70mL、牛肉膏9.99g、酵母膏5.07 g、大豆蛋白粉 5.14 g、加水至1000ml、初始pH值为6.27；培养温度为38～42℃；好氧发酵48～72h，得到德氏乳酸菌菌液；

（3）按照上述体积比混合啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液，得到复合微生物菌剂；

（4）将上述步骤（1）得到的复合化学制剂和上述步骤（3）得到的复合微生物菌剂按照上述质量g与体积ml比的比例要求混合即可。

上述发酵床霉菌抑制剂的使用方法为：使用时，按照复合化学制剂和复合微生物菌剂的质量g与体积ml比为1～3∶1，按照污染发酵原料质量的0.2%，混匀拌到霉变的发酵床原料里，达到抑制霉菌生长和吸附霉菌毒素的效果。

硅藻土是由无定形的SiO₂ 构成的多孔材料，结构中无同质取代现象，因硅藻土的纳米微孔数多，其孔隙中含有一定量的有机物，增强了对霉菌毒素的亲和力。

双醋酸钠即双乙酸钠，分子内的单分子乙酸可以降低物质的pH值，并且与酯化合物相溶性较好，因而可以透过细胞壁，有效地渗透进入菌类组织的细胞中，干扰细胞间酶的相互作用，促使菌体蛋白质的变性，且改变细胞形态和结构，达到菌体脱水死亡目的，起到抗菌防腐的作用。

碘化钾能够增强组织的溶解和消化作用，抗真菌活性。

酵母菌主要和霉菌在营养与空间的竞争、对病原菌的直接寄生作用及诱导寄主产生抗病性，酵母细胞壁能吸附黄霉菌毒素，从而去除已存在的霉菌毒素。

枯草芽孢杆菌为拮抗病原微生物，能够维持和调整肠道微生态平衡；枯草芽孢杆菌可以产生有益代谢产物，使空肠内pH值下降，乳酸、丙酸、乙酸的含量上升，并且枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。

乳酸菌在培养过程中产生能够乳酸，从而抑制霉菌的生长及毒素的产生；乳酸菌的细胞壁能吸附黄霉菌毒素，从而去除已存在的霉菌毒素。

未来的防霉剂研究和开发应朝着优质高效、低成本的方向发展，从单一型向复合型发展，从化学合成防霉剂向天然防霉剂方向发展，防霉剂的载体由接触型向气雾型方向发展。因此，开发复合型天然防霉剂、菌体防霉剂和选择有利于防霉剂扩散的载体。提高防霉剂的使用效果，研制无毒副作用，无残留的绿色环保型饲料防霉剂将成为今后研究和开发的热点。

本发明的优点在于：发酵床中霉菌的清除率达90%以上，霉菌毒素吸附率为70%，减少了霉菌和霉菌毒素对禽类的危害，解决了畜禽饲养过程中，由于环境因素或饲料因素而造成的畜禽霉菌或霉菌毒素中毒问题，达到药物治疗之功效，从而改变畜禽肠道菌群平衡问题，解决了现在畜禽养殖中，抗生素滥用问题，用普通的化学药品和微生态制剂共同作用，解决了只有抗生素才能解决的问题，从而减少或不用抗生素，达到养殖的无抗标准；由于近年来饲料向生物无抗饲料发展，可作为生物饲料的核心料。

具体实施方式

实施例1

所述复合化学制剂和复合微生物菌剂的质量g数与体积ml数比为3∶1；

所述复合化学制剂，由硅藻土、双醋酸钠、碘化钾组成；所述硅藻土、双醋酸钠、碘化钾的质量比为6∶2∶1；

所述复合微生物菌剂由啤酒酵母菌（Sac-charomyces cerevisiae）菌液、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌液、德氏乳酸菌（L．Delbrueckii）菌液组成；所述啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液的体积比为1～2∶2～4∶3～6。

实施例2

一种上述实施例1所述发酵床霉菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）按照硅藻土、双醋酸钠、碘化钾的质量比6∶2∶1混合，得到复合化学制剂；

所述啤酒酵母菌菌液的制备方法为：所需培养基为酵母膏 10.0g 、蛋白胨 20.0g、葡萄糖 20.0g、蒸馏水1000ml；培养温度为 28～38℃；好氧发酵 24～48h，得到啤酒酵母菌菌液；

所述德氏乳酸菌菌液的制备方法为：所需培养基为麦芽汁70mL、牛肉膏9.99g、酵母膏5.07 g、大豆蛋白粉 5.14 g、加水至1000ml、初始pH值为6．27；培养温度为38～42℃；好氧发酵48～72h，得到德氏乳酸菌菌液；

（3）按照啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液的体积比1∶2∶6混合，得到复合微生物菌剂；

（4）将上述步骤（1）得到的复合化学制剂和上述步骤（3）得到的复合微生物菌剂按照质量g与体积ml比为3∶1混合即可。

实施例3

发酵床霉菌抑制剂的霉菌的清除率实验

一、仪器与设备

空气浴振荡器、蒸汽消毒器、电热恒温培养箱、表面皿、脱脂棉团、锥形瓶、接种环、电子天平。

二、实验材料

实验菌种：啤酒酵母菌（Sac-charomyces cerevisiae）（山东大学微生物研究所提供）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（山东大学微生物研究所提供）、德氏乳酸菌（L．Delbrueckii）（中国科学院微生物研究所提供）；

实验化学制剂：硅藻土、双醋酸钠、碘化钾；

培养基：饲料中霉菌总数的测定（GB\T13092-2006）中的高盐察氏培养基；

实验霉菌材料：霉变的发酵床原料。

三、实验方法

取霉变的发酵床原料2kg充分混匀，然后平均分成两份，其中一组为阳性对照组，另一组为空白对照组。在阳性对照组按照0.2%的比例将实施例2得到的复合化学制剂和复合微生物菌剂充分搅拌混匀，空白对照组中不加任何物质。将处理过得阳性对照组和空白对照组装三角瓶，在室温条件下，处理48h。若不添加任何防霉剂, 霉变发酵床原料的霉菌继续生长，若在霉变发酵床原料中添加防霉剂就会抑制其生长, 防霉效果越好对霉菌的生长抑制作用也越大。等待霉菌总数的试验测定，根据结果差值计算出该抑制剂对霉菌生长的霉菌抑制率。

四、实验步骤

1、取霉变的发酵床原料2kg充分混匀，然后平均分成两份，其中一组为阳性对照组，另一组为空白对照组。在阳性对照组按照0.2%的比例将实施例2得到的复合化学制剂和复合微生物菌剂充分搅拌混匀，空白对照组中不加任何物质。将处理过得阳性对照组和空白对照组装三角瓶，在室温条件下，处理48h；

2、48h后，以无菌操作称取实验霉菌材料检样各25g,分别放入两个含有225ml灭菌稀释液的玻璃三角瓶中，置振荡器上，摇荡30min，分别制出空白对照组和阳性对照组的1：10的稀释液；

3、用灭菌吸管吸取1：10的稀释液10ml，注入带玻璃珠的试管中，置微型混合器上混合3min,使霉菌孢子分散开；

4、用1mL无菌吸管吸取1：10样品均液1mL，缓慢加入盛有9mL无菌蒸馏水的无菌试管中，用振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液；

5、按照4操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管。根据对样品活菌数量的估计，选择适宜稀释度的样品均液，进行接种计数；

6、取100、l 000、10 000倍的稀释液各l ml入无菌平皿，每个稀释度做三个重复，再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45～50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在25～28℃恒温培养箱中倒置培养3d后开始观察。

五、实验结果

1、计数结果见下表：

分组	1	2	3	平均值
					阳性对照组	2.7×10⁴cfu/g	1.8×10⁴cfu/g	2.5×10⁴cfu/g	2.3×10⁴cfu/g
空白对照组	3.3×10⁵cfu/g	3.9×10⁵cfu/g	4.3×10⁵cfu/g	3.8×10⁵cfu/g

通过上面的数据显示：通过使用该霉菌抑制剂，霉菌的抑制率为93.95%；根据饲料卫生标准GB13078-2001(饲料通用标准)，猪饲料要求霉菌总数<4.5×104cfu/g，测定数值为2.3×104cfu/g，完全符合标准要求。

2、感官效果

阳性对照组：霉味消除，气味酸、甜、微香有酒味。

空白对照组：颜色褐色中存在霉白点，有刺鼻腐败味或霉味；结块。

实施例4

发酵床霉菌抑制剂的霉菌毒素吸附率实验

一、实验材料

实验化学制剂：硅藻土、双醋酸钠、碘化钾；

实验霉菌材料：霉变的发酵床原料。

二、实验方法

取霉变的发酵床原料2kg充分混匀，然后平均分成两份，其中一组为阳性对照组，另一组为空白对照组。在阳性对照组按照0.2%的比例将实施例2得到的复合化学制剂和复合微生物菌剂充分搅拌混匀，空白对照组中不加任何物质。将处理过得阳性对照组和空白对照组装三角瓶，在室温条件下，处理48h后，进行测定。在适宜的温度、湿度等条件下产生的霉菌，以曲霉菌属为主，黄曲霉毒素是霉菌毒素中，毒性最大、最致命的毒素，比较氰化物的毒性要强10倍以上。所以在本次测定霉菌毒素量测定黄曲霉的量，来检测该制剂的霉菌吸附的效果。

黄曲霉毒素的检测均采用进口ELISA试剂盒，操作程序和结果判定按照产品说明书规定进行。

三、实验结果

计数结果见下表：

分组	1	2	3	平均值
					阳性对照组	13μg/g	17μg/g	11μg/g	13.3μg/g
空白对照组	56μg/g	49μg/g	54μg/g	53μg/g

根据上面的数据显示：通过使用该霉菌抑制剂，黄曲霉菌毒素的吸附率和抑制率综合为74.91%。根据GB13078-2001《饲料卫生标准》，生长肥育猪、种猪配合饲料及浓缩黄曲霉毒素B1允许量≦20μg/g。测定数值为13.3μg/g，完全符合标准要求。

实施例5

所述复合化学制剂，由硅藻土、双醋酸钠、碘化钾组成；所述硅藻土、双醋酸钠、碘化钾的质量比为3∶1∶1；

所述复合微生物菌剂由啤酒酵母菌（Sac-charomyces cerevisiae）菌液、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌液、德氏乳酸菌（L．Delbrueckii）菌液组成；所述啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液的体积比为1∶2∶3。

实施例6

一种上述实施例5所述发酵床霉菌抑制剂的制备方法，制备方法同实施例2。

实施例7

发酵床霉菌抑制剂的霉菌毒素吸附率实验

本实验抑制剂为实施例5所述的抑制剂，方法同实施例3；

结果：霉菌的抑制率为97.95%。

实施例8

发酵床霉菌抑制剂的霉菌毒素吸附率实验

本实验抑制剂为实施例5所述的抑制剂，方法同实施例4；

结果：黄曲霉菌毒素的吸附率和抑制率综合为78.91%。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种发酵床霉菌抑制剂的制备方法，其特征在于：由复合化学制剂和复合微生物菌剂组成；

所述复合化学制剂和复合微生物菌剂的质量g与体积ml比为1∶1；

所述复合微生物菌剂由啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液组成；所述啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液的体积比为1∶2∶3；

所述发酵床霉菌抑制剂按照以下步骤制备：

（1）按照质量比称量硅藻土、双醋酸钠、碘化钾，并混合，得到复合化学制剂；

（3）按照啤酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、德氏乳酸菌菌液的体积比混合，得到复合微生物菌剂；

（4）将上述步骤（1）得到的复合化学制剂和上述步骤（3）得到的复合微生物菌剂按照质量g与体积ml比混合即可。