CN110055187A - 一种变形假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种变形假单胞菌及其应用。本公开的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的保藏编号为CGMCC No.14475。本公开还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有如上所述的变形假单胞菌作为有效成分。本公开还提供了如上所述的变形假单胞菌和如上所述的微生物菌剂在降解磺胺二甲嘧啶、处理禽畜养殖废弃物和修复抗生素污染中的应用。通过上述技术方案，本公开可以更加有效地去除磺胺二甲嘧啶。

Description

一种变形假单胞菌及其应用
技术领域
本公开涉及一种变形假单胞菌及其应用。
背景技术
抗生素长期被大量应用于人类临床、畜禽及水产养殖业，除了给人类带来巨大好处，也出现了滥用的状况，引起的耐药性问题、不良反应及其他危害已经越来越严重。大部分的抗生素没有被机体代谢而直接以原药或初级代谢产物的形态而排放到环境中，会造成土壤、水体环境中的抗生素含量过高，从而对环境微生物群落结构造成破坏性影响，诱发耐药菌或抗生素抗性基因产生，久而久之就会造成生态环境的失衡。我国是全球最大的抗生素生产国和使用国，年产抗生素原料药约21万吨，每年人均消费抗生素量为138g，是美国人均水平的10倍多，已成为世界上抗生素滥用情况最为严重的国家之一。
磺胺类药物是畜禽养殖业中常用的抗生素，具有化学性质稳定、抗菌谱广、价格低廉、毒性小、应用广等优点，广泛用于预防、治疗食源性动物疾病，并作为饲料添加剂促进动物生长。磺胺二甲嘧啶是常用磺胺类药物之一，适用于治疗溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌及某些革兰氏阴性杆菌等感染的疾病，药效持久。进入环境中的磺胺二甲嘧啶不易被降解，能在环境中长期存在，会导致诸如抗药性基因转移、破坏环境生态平衡等诸多问题，威胁到人类的生存和健康。
要解决抗生素的环境污染问题，除了从源头上规范抗生素的使用，减少用量，如何去除环境体系中残留的抗生素也是一个关键的问题。目前，抗生素残留污水的理化处理方法已有较多研究，包括高级氧化法、活性炭吸附法、低温等离子体技术和膜处理法等。但是这些理化方法存在一些缺陷，如成本高、管理复杂、去除效率，并且对固态介质中抗生素残留处理存在困难。
发明内容
为了克服现有抗生素污染处理方法存在的成本高、管理复杂、去除效率低以及固态介质中抗生素残留难以处理等缺陷，本发明提供了一种变形假单胞菌。
本发明的发明人分离了一株变形假单胞菌，发现其可以高效地去除磺胺二甲嘧啶，同时还具有优异地去除固态介质中抗生素残留的效果，可以实现磺胺二甲嘧啶类抗生素污染的高效处理及含有抗生素的禽畜养殖废弃物的处理和资源化利用，由此得到了本发明。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种变形假单胞菌，该变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的保藏编号为CGMCC No.14475。
本公开第二方面提供一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌。
可选地，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌的活菌数为109-1010cfu。
可选地，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基，或者为他们中两者或三者的组合。
本公开第三方面提供本公开第一方面的变形假单胞菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在降解磺胺二甲嘧啶中的应用。
本公开第四方面提供本公开第一方面的变形假单胞菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在处理禽畜养殖废弃物中的应用。
本公开第五方面提供本公开第一方面的变形假单胞菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在生物修复抗生素污染中的应用。
可选地，所述抗生素污染包括抗生素污染的土壤和/或抗生素污染的水体。
通过上述技术方案，本公开的保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌能够快速、高效地降解磺胺二甲嘧啶，去除率可达90％以上。该变形假单胞菌及含有该菌的微生物菌剂能够应用于被磺胺二甲嘧啶污染的水体、土壤环境的修复，以及畜禽养殖废弃物的处理，从而提高畜禽养殖废弃物资源化的安全性和使用范围。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的变形假单胞菌是本公开的发明人从采集自北京某生猪养殖场的农田土壤样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC No.14475，保藏日期为2017年7月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌(TT4)与其它变形假单胞菌属成员之间的进化分析(基于16S rDNA序列分析)。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的发明人从采集自北京某生猪养殖场的农田土壤样品中分离培养出一种新的菌种，经鉴定该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)，被命名为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年7月31日，保藏编号为CGMCC No.14475。
本公开第一方面提供一种变形假单胞菌，该变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)的保藏编号为CGMCC No.14475。
提取该保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌(TT4)基因组DNA，使用16srDNA基因通用引物进行PCR扩增，利用序列比对方法进行分子鉴定，将该菌鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)，命名为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，为：
GGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA
ACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTC
ACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGA
TTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCAC
GTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACC
TTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTG
CTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACAT
CTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCC
GAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTA
AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCG
GGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGG
CGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAAC
GGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGT
TTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCG
CCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACA
GGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTCGCCAGTTTTGGATGCA
GTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACGAACCACCTA
CGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATT
ACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGT
CAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCT
TTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTT
TCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGAC
CGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGAT
CGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGC
TCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACG
TATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAG
ATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAAGGAGCAAGCTCC
CGTCATCCGCTCGACTGC
基于16S rDNA序列分析，保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌(TT4)与其它变形假单胞菌属成员之间的进化分析如图1所示。
本公开的变形假单胞菌可以在常规的细菌培养基中存活并生长繁殖。本公开如上所述的变形假单胞菌是一株非常优异的抗生素降解菌，能够非常高效快速地降解磺胺二甲嘧啶。
本公开第二方面提供一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌。
其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌的活菌数可以为107-1011cfu，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌的活菌数可以为109-1010cfu。
根据本公开，所述培养基的种类可以为各种能够用于培养变形假单胞菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其可以含有1-5g/L的牛肉膏、5-20g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化钠和15-20g/L的琼脂。例如发酵培养基可以含有：40-150g/L的淀粉、0.5-8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和1-10g/L的氯化亚铁。
其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。
其中，变形假单胞菌的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将变形假单胞菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培养基(葡萄糖15g，淀粉1g，豆饼粉25g，硫酸锰1g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g，碳酸钙0.1g，pH 7.0-7.2)中接种2-5重量份的变形假单胞菌的菌液，37℃培养，直至变形假单胞菌的活菌数为(2-20)×107个/克。
其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌接种于培养基中进行培养。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌的活菌数可以为107-1011cfu，更优选为109-1010cfu。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或OD值观察法得到活菌的浓度。
培养后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，优选情况下，菌液通过包括无菌过滤、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为变形假单胞菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为28-37℃，培养时间可以为1-3天。
本公开第三方面提供本公开第一方面的变形假单胞菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在降解磺胺二甲嘧啶中的应用。其中，可以包括将本公开的变形假单胞菌和/或含有该菌的微生物菌剂施用于含有磺胺二甲嘧啶的液态介质和/或固态介质中，其中磺胺二甲嘧啶在介质中的浓度可在较大范围内变化，例如为10～80mg/kg。
本公开第四方面提供本公开第一方面的变形假单胞菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在处理禽畜养殖废弃物中的应用。
根据本公开，变形假单胞菌及其微生物菌剂在处理禽畜养殖废弃物中的应用方法没有特别的要求，例如包括降低禽畜养殖废弃物中的磺胺二甲嘧啶含量和/或将禽畜养殖废弃物资源化利用，具体地，可以包括将禽畜养殖废弃物进行堆肥发酵，具体地例如，可以为将畜禽养殖废弃物与本公开的变形假单胞菌和/或微生物菌剂按比例混合均匀，调整水分后将搅拌均匀的垫料堆积发酵。进一步地，相对于1kg畜禽养殖废弃物，变形假单胞菌的用量可以为108-1010cfu，优选为109-1010cfu。使用时，可以将畜禽养殖废弃物按比例堆积好，再将菌剂均匀地撒在畜禽养殖废弃物垫料上，充分混合直至完全混匀。其中，畜禽养殖废弃物可包括常规的禽畜粪便，例如为猪粪便、牛粪便、鸡粪和羊粪便中的一种或几种。用于发酵的畜禽养殖废弃物的C/N比可以为25～40，优选为28～35。进一步地，为了保证用于发酵的禽畜养殖废弃物的C/N比在适宜范围内，可以将秸秆、锯末、稻壳和麸皮中的至少一种与禽畜养殖废弃物混合堆肥发酵。
本公开第五方面提供本公开第一方面的变形假单胞菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在生物修复抗生素污染中的应用。
其中，抗生素污染可以包括抗生素污染的土壤和/或抗生素污染的水体。磺胺二甲嘧啶在抗生素污染的土壤中的浓度可在较大范围内变化，例如为10～80mg/kg；磺胺二甲嘧啶在抗生素污染的水体中的浓度可在较大范围内变化，例如为10～80mg/L。
以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。
实施例1
将上述保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌从保藏斜面接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0gL，NaCl 5.0gL，pH＝7.2-7.4。斜面的制作方法是在牛肉膏蛋白胨培养基中加2％的琼脂粉，混匀并加热溶解后，分装5mL培养基至20mL玻璃试管，旋紧试管塞，按7支试管一捆使用报纸或牛皮纸包扎好，于121℃高压灭菌30分钟。灭菌后，在超净工作上按一定倾斜度摆成斜面，凝固后待用。
所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为1010cfu。
对比例1
将购自鹤壁恒达生物科技有限公司的商品名称为猪粪发酵剂的嗜热、耐热细菌复合菌剂接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液待用。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为1010cfu。
对比例2
将与本申请的保藏编号为CGMCC No.14475的变形假单胞菌一起分离的1株变形假单胞菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，所得的菌液记为对比例2的种子液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后得到对比例2的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为1010cfu。
测试实施例1：测定菌株对磺胺二甲嘧啶的降解率
将斜面保藏的实施例1和对比例1～2的种子液分别接种到装有100mL酵母膏无机盐液体培养基(含20mg/L磺胺二甲嘧啶)的250mL三角瓶中，设置不加菌液的处理作为空白对照组。37℃、150rpm摇床振荡培养。24h后检测液体培养基中的磺胺二甲嘧啶的浓度，计算不同菌株的降解率，结果如表1所示。
降解率按照以下公式计算：
抗生素降解率(％)＝((Ct1-Ct2))×100/(Ct1-(Cck1-Cck2))
公式中：Ct1为实验处理组磺胺二甲嘧啶初始浓度；
Ct2为实验48h后处理组培养体系中磺胺二甲嘧啶的浓度；
Cck1为空白对照组的磺胺二甲嘧啶初始浓度；
Cck2为实验48h后空白对照组培养体系中磺胺二甲嘧啶的浓度。
表1
浓度(mg/L) 降解率(％)
实施例1 1.264 93.68
对比例1 4.724 76.38
对比例2 8.752 56.24
测试实施例2：测定菌株对禽畜养殖废弃物中磺胺二甲嘧啶的降解率
从生猪养殖场采取猪粪(磺胺二甲嘧啶残留量为52mg/kg)。称取20g猪粪样品置于9cm培养皿中，处理组是分别在培养皿中加入实施例1和对比例1～2的种子液以使每g猪粪样品中活菌数为109-1010cfu，混合均匀；空白对照组是在培养皿中加入4mL无菌水，混合均匀。盖上培养皿盖子，置于37℃培养箱培养3d后，取样测定处理组和对照组的磺胺二甲嘧啶的浓度，计算实施例和对比例各菌株对猪粪中磺胺二甲嘧啶的降解率，结果如表2所示。
表2
浓度(mg/mL) 降解率(％)
实施例1 16.48 68.31
对比例1 25.29 51.36
对比例2 29.23 43.78
测试实施例3：测定菌株对土壤中的磺胺二甲嘧啶的降解率
从北京顺义学义养殖有限公司采集土壤(磺胺二甲嘧啶残留量为28.36mg/kg)。处理组：分别将实施例1和对比例1～2的微生物菌剂加入到土壤样品中以使每kg土壤中活菌数为109-1010cfu，混合均匀；空白对照组是在培养皿中加入无菌水，混合均匀。置于培养皿中于37℃培养箱培养3d后，取样测定处理组和对照组的磺胺二甲嘧啶的浓度，计算实施例和对比例各菌株对土壤中磺胺二甲嘧啶的降解率，结果如表3所示。
表3
浓度(mg/kg) 降解率(％)
实施例1 7.98 71.86
对比例1 9.25 67.39
对比例2 11.28 60.24
测试实施例4：测定菌株对水体中的磺胺二甲嘧啶的降解率
从北京顺义学义养殖有限公司外的排污渠采集水样(磺胺二甲嘧啶残留量为12.9mg/L)。处理组：分别将实施例1和对比例1～2的微生物菌剂加入到河水样品中以使每L河水中活菌数为109-1010cfu，混合均匀；空白对照组是在培养皿中加入无菌水，混合均匀。置于培养皿中于37℃培养箱培养3d后，取样测定处理组和对照组的磺胺二甲嘧啶的浓度，计算实施例和对比例各菌株对水体中磺胺二甲嘧啶的降解率，结果如表4所示。
表4
浓度(mg/L) 降解率(％)
实施例1 0.87 93.26
对比例1 2.38 81.54
对比例2 4.43 65.63
由表1～表4的数据可知，与对比例1-2相比，实施例1使用保藏编号为CGMCCNo.14475的变形假单胞菌及含有该菌的微生物菌剂能够更快速有效地降解磺胺二甲嘧啶，对抗生素污染的水体、土壤即禽畜养殖废弃物均有较高的降解率。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (8)

1.一种变形假单胞菌，其特征在于，该变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的保藏编号为CGMCC No.14475。
2.一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，其特征在于，所述菌体含有保藏编号为CGMCCNo.14475的变形假单胞菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.14475的变形假单胞菌的活菌数为109-1010cfu。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基，或者为他们中两者或三者的组合。
5.权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在降解磺胺二甲嘧啶中的应用。
6.权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在处理禽畜养殖废弃物中的应用。
7.权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在生物修复抗生素污染中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述抗生素污染包括抗生素污染的土壤和/或抗生素污染的水体。
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