CN110591979A - 农药氧化乐果降解微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种农药氧化乐果降解微生物复合菌剂及其制备方法，所述复合菌剂包括革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY‑C13‑1‑8或革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY‑C13‑1‑8和杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）混合，还包括甘油、活性炭和高岭土，混合比例为1:1:(1.5‑2):3：(2.5‑3)。本发明涉及的菌体由专用液体培养基培养，该得到的复合菌剂可在原位降解农业土壤中残留的氧化乐果，对土壤中残留氧化乐果降解可达到75%以上，具有处理成本低、施工简单、不影响生产做业、无二次污染、对环境影响小等优点。

Description

农药氧化乐果降解微生物复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于土壤生物修复技术领域，具体涉及一种农药氧化乐果降解微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
化学农药作为保障农业丰收的重要手段，在农业生产中发挥着重要的作用。化学农药使用存在的主要问题是化学农药不合理使用、农产品中农药残留严重超标、防治成本高，对生态环境造成了严重污染，产生了大面积药害。
微生物修复是利用特定微生物体的代谢吸收、转化、清除或降解化学农药成分，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施，具有高效经济、无二次污染等特点。该技术已应用于各类污染领域，表现出了较高的应用价值，国内外有关行业部门专家认为是生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术，是农业污染修复的主要发展方向，也是解决化学农药污染土壤生态修复的有效手段。
氧化乐果（omethoate化学名：O,O-二甲基-S-[2-（甲胺基）-2-氧代乙基]硫代磷酸酯）是一种广谱有机磷杀虫、杀螨剂，在我国农业种植生产中广泛用于防治棉花、小麦、果树、蔬菜、高粱害虫。作用机理是通过内吸及外部接触毒性抑制生物乙酰胆碱酯酶活性，从而杀死害虫。理论上环境中的有机磷农药属易分解有机物，不易残留，但其中间降解物是持久性污染物，很难被完全降解。目前研究表明慢性接触氧化乐果，通过抑制AChE活性，导致神经损伤，诱发迟发性多发性神经病。氧化乐果亦有生殖毒性，改变人体内线粒体呼吸链中呼吸作用和产能过程中酶的活性，抑制免疫系统功能，导致组织细胞和DNA损伤及致癌作用。因此氧化乐果的残留问题应引起足够的重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种农药氧化乐果降解微生物复合菌剂及其制备方法，通过生物修复的方式对农药氧化乐果残留土壤进行有效修复。
本发明所采用的技术方案为：
农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，其特征在于：
所述复合菌剂包括革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8或革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8和杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）混合。
革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8及杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）的混合比例为1:1。
所述复合菌剂还包括甘油、活性炭和高岭土。
革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8、杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、甘油、活性炭和高岭土的混合比例为1:1:(1.5-2):3：(2.5-3)。
所述革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 18606。
如所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：对革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8菌体进行种子液体培养，获得革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液；
对杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌体进行种子液体培养，获得杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液；
步骤二：分别对革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8、杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）进行液体发酵；
步骤三：液体发酵物分别离心得到液体发酵菌体A、菌体B；
步骤四：将菌体A、菌体B与甘油、活性炭、高岭土按1:1:(1.5-2):3：(2.5-3)的质量比混合，制得农药氧化乐果降解微生物复合菌剂。
步骤一具体为：
制备液体发酵培养基a，并在121℃温度下灭菌20分钟，将革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8菌体无菌操作接入培养基a，置于温度28-30℃，摇瓶培养，160-180rpm，48-72小时，至发酵液中细胞生长至对数期，OD600达到1.5±0.4,获得革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液；
所述液体发酵培养基a的配方为：
酵母浸粉2.5-5克、蛋白胨2.5-5克、甘油2.5-5毫升、NaCl 2.5克、磷酸二氢钾2.5-5克，加水至 500毫升；
制备液体培养基b，并在121℃温度下灭菌20分钟，将杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌体无菌操作接入培养基b，置于温度28-30℃，160-180rpm，摇瓶培养24-48小时，至发酵液中细胞生长至对数期，OD600达到1.0±0.4, 获得杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液；
所述液体发酵培养基b的配方为：
酵母浸粉2.5-5克、蛋白胨2.5-5克、甘油2.5-5毫升、磷酸二氢钾2.5-5克、硫酸镁1-2.5克，加水至 500毫升。
步骤二具体为：
制备液体发酵培养基c，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5-10%的接种量加入步骤一所获得的革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液至培养基c，恒定温度28±4℃，搅拌速度160-180rpm，通风量0.25-0.29M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵48-72小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5-0.8×109个/毫升时终止发酵；
所述液体发酵培养基c的配方为：
蛋白胨250-280克、酵母膏200-250、液体石蜡150-200毫升、甘油100-150毫升、NaCl10-25克、磷酸二氢钾25-50克，加水至50升；
制备液体发酵培养基d，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5-10%的接种量加入步骤一所获得的杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液至发酵培养基d，恒定温度28±4℃，搅拌速度160-180rpm，通风量0.25-0.29M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵24-48小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5-1.0×109个/毫升时终止发酵；
所述液体发酵培养基d的配方为：
蛋白胨200-250克、酵母膏200-250、液体石蜡200-250毫升、磷酸二氢钾25-50克、硫酸镁10-25克，加水至50升。
步骤三具体为：
将步骤二获得的液体发酵物分别置于离心机，4000-6000转/分，离心15-20分钟，分离除去发酵液中水份，获得灰白色粘稠状细胞菌体A及菌体B。
步骤四具体为：
按照菌体A：菌体B：甘油的体积比1：1:（1.5-2）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀；再按照菌体A：菌体B：活性炭：高岭土体积比1：1：3：(2.5-3)的比例加入细度为300目的活性炭和高岭土，搅拌混合均匀，获得农药氧化乐果降解微生物复合菌剂。
本发明具有以下优点：
本发明是一种高效、经济的环境友好型土壤修复技术，核心技术是高效降解菌株的发酵和功能菌剂的制备，本发明使用的革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8及杀香鱼假单胞菌复合使用，对氧化乐果降解可达到75%以上。
本发明是操作简单、修复效果好、成本费用低、不影响农业生产的土壤修复技术，相比其他方法具有处理成本低、施工简单、无二次污染、对环境影响小等优点。对恢复农业土壤的生态平衡和生产力具有良好效果。生物修复技术在化学农药污染治理的应用，能有效改善农田土壤环境，同时，对于保护农产品安全，推动农产品的绿色化、有机化及农田土壤的可持续发展具有良好的经济、社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明涉及一种农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，所述复合菌剂包括革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8或革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8和杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）ZZY-12-2-2混合。革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8及杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）的混合比例为1:1。
所述复合菌剂还包括甘油、活性炭和高岭土。革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8、杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、甘油、活性炭和高岭土的混合比例为1:1:(1.5-2):3：(2.5-3)。
甘油既是革兰氏假单胞菌及杀香鱼假单胞菌的激活碳源（该类菌株可以以甘油作为碳源进行增殖），又是菌株的保护剂，在甘油的缓冲保护作用下有利于菌株的长期保藏及运输。活性炭的多孔性质有利于菌株的吸附，在施用过程中有利于菌株在土壤的定殖。甘油、活性炭及高岭土的混合物为革兰氏假单胞菌及杀香鱼假单胞菌营造了一个利于长期休眠及定殖的微环境，有利于异源微生物菌剂在不同土壤环境中发挥其降解氧化乐果的作用。
所述革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 18606。
所述杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）购买于陕西省微生物研究所，任何公众均可从该机构获得该菌种。
上述农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：对革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8菌体进行种子液体培养，获得革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液；
对杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌体进行种子液体培养，获得杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液；
步骤二：分别对革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8、杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）进行液体发酵；
步骤三：液体发酵物分别离心得到液体发酵菌体A、菌体B；
步骤四：将菌体A、菌体B与甘油、活性炭、高岭土按1:1:(1.5-2):3：(2.5-3)的质量比混合，制得农药氧化乐果降解微生物复合菌剂。
上述步骤中：
步骤一具体为：
制备液体发酵培养基a，并在121℃温度下灭菌20分钟，将革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8菌体无菌操作接入培养基a，置于温度28-30℃，摇瓶培养，160-180rpm，48-72小时，至发酵液中细胞生长至对数期，OD600达到1.5±0.4,获得革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液；
所述液体发酵培养基a的配方为：
酵母浸粉2.5-5克、蛋白胨2.5-5克、甘油2.5-5毫升、NaCl 2.5克、磷酸二氢钾2.5-5克，加水至 500毫升；
制备液体培养基b，并在121℃温度下灭菌20分钟，将杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌体无菌操作接入培养基b，置于温度28-30℃，160-180rpm，摇瓶培养24-48小时，至发酵液中细胞生长至对数期，OD600达到1.0±0.4, 获得杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液；
所述液体发酵培养基b的配方为：
酵母浸粉2.5-5克、蛋白胨2.5-5克、甘油2.5-5毫升、磷酸二氢钾2.5-5克、硫酸镁1-2.5克，加水至 500毫升。
步骤二具体为：
制备液体发酵培养基c，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5-10%的接种量加入步骤一所获得的革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液至培养基c，恒定温度28±4℃，搅拌速度160-180rpm，通风量0.25-0.29M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵48-72小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5-0.8×109个/毫升时终止发酵；
所述液体发酵培养基c的配方为：
蛋白胨250-280克、酵母膏200-250、液体石蜡150-200毫升、甘油100-150毫升、NaCl10-25克、磷酸二氢钾25-50克，加水至50升；
制备液体发酵培养基d，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5-10%的接种量加入步骤一所获得的杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液至发酵培养基d，恒定温度28±4℃，搅拌速度160-180rpm，通风量0.25-0.29M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵24-48小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5-1.0×109个/毫升时终止发酵；
所述液体发酵培养基d的配方为：
蛋白胨200-250克、酵母膏200-250、液体石蜡200-250毫升、磷酸二氢钾25-50克、硫酸镁10-25克，加水至50升。
步骤三具体为：
将步骤二获得的液体发酵物分别置于离心机，4000-6000转/分，离心15-20分钟，分离除去发酵液中水份，获得灰白色粘稠状细胞菌体A及菌体B。
步骤四具体为：
按照菌体A：菌体B：甘油的体积比1：1:（1.5-2）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀；再按照菌体A：菌体B：活性炭：高岭土体积比1：1：3：(2.5-3)的比例加入细度为300目的活性炭和高岭土，搅拌混合均匀，获得农药氧化乐果降解微生物复合菌剂。
实施例1：
步骤一：种子液培养
制备液体培养基a，将革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8菌体无菌操作接入培养基a，置于温度28℃，160rpm，摇瓶培养72小时，至发酵液中细胞生长至对数期，获得假单胞菌ZZY-C13-1-8种子液；
液体发酵培养基a的配方为：
酵母浸粉2.5克、蛋白胨5克、甘油2.5毫升、NaCl 2.5克、磷酸二氢钾2.5克，加水至 500毫升。
制备液体培养基b，将杀香鱼假单胞菌菌体无菌操作接入培养基b，置于温度28℃，160rpm，摇瓶培养48小时，至发酵液中细胞生长至对数期，获得假单胞菌种子液；
液体发酵培养基b的配方为：
酵母浸粉2.5克、蛋白胨2.5克、甘油5毫升、磷酸二氢钾2.5克、硫酸镁2.5克，加水至500毫升。
步骤二：菌种的液体发酵
制备液体发酵培养基c，并进行常灭菌处理后，无菌操作以10%的接种量加入步骤一所获得的革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8种子液至培养基c，恒定温度28℃，搅拌速度160rpm，通风量0.25M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵64小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.6×109个/毫升时终止发酵；
液体发酵培养基c的配方为：
蛋白胨250克、酵母膏250、液体石蜡150毫升、甘油100毫升、NaCl 25克、磷酸二氢钾25克，加水至50升。
制备液体发酵培养基d，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5%的接种量加入步骤一所获得的杀香鱼假单胞菌种子液至发酵培养基d，恒定温度28℃，搅拌速度160rpm，通风量0.25M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵48小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.6×109个/毫升时终止发酵；
液体发酵培养基d的配方为：
蛋白胨250克、酵母膏200、液体石蜡200毫升、磷酸二氢钾25克、硫酸镁10克，加水至50升。
步骤三：菌体细胞A、B分离
分别收集步骤二液体发酵液，用离心机5000转/分 离心15分钟，分离除去发酵液中水份，获得灰白色粘稠状菌体细胞；
步骤四：菌剂制备
将步骤三获得的菌体A、菌体B，按照菌体A：菌体B：甘油（体积比）=1：1:1.5的比例加入，并搅拌混合均匀。再按照菌体：活性炭：硅藻土（体积比）=1：1：0.8的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得固体制剂即目的产品。
实施例2：
步骤一 种子A制备：采用液体发酵培养基a，将革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8菌体无菌操作接入培养基a，置于温度30℃，180rpm，摇瓶培养60小时，至发酵液中细胞生长至对数期，获得假单胞菌ZZY-C13-1-8种子液；
液体发酵培养基a的配方为：
酵母浸粉2.5克、蛋白胨2.5克、甘油5毫升、NaCl 2.5克、磷酸二氢钾5克，加水至 500毫升。
种子B制备：采用液体发酵培养基b，将杀香鱼假单胞菌菌体无菌操作接入培养基b，置于温度30℃，180rpm，摇瓶培养48小时，至发酵液中细胞生长至对数期，获得假单胞菌种子液；
液体发酵培养基b的配方为：
酵母浸粉5克、蛋白胨5克、甘油5毫升、磷酸二氢钾5克、硫酸镁1克，加水至 500毫升。
步骤二具体为：
制备液体发酵培养基c，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5%的接种量加入步骤一所获得的革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8种子液至培养基c，恒定温度29℃，搅拌速度180rpm，通风量0.29M3/min，罐压0.08MPa，持续发酵72小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.8×109个/毫升时终止发酵。
液体发酵培养基c的配方为：
蛋白胨280克、酵母膏250、液体石蜡200毫升、甘油100毫升、NaCl 10克、磷酸二氢钾50克，加水至50升。
制备液体发酵培养基d，并进行常灭菌处理后，无菌操作以10%的接种量加入步骤一所获得的杀香鱼假单胞菌种子液至发酵培养基d，恒定温度28℃，搅拌速度160rpm，通风量0.25M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵24小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.8×109个/毫升时终止发酵；
液体发酵培养基d的配方为：
蛋白胨200克、酵母膏250、液体石蜡250毫升、磷酸二氢钾50克、硫酸镁25克，加水至50升。
步骤三菌体细胞A、B分离
具体为：将步骤二获得的液体发酵物分别置于用离心机4000转/分，离心20分钟，分离除去发酵液中水份，获得灰白色粘稠状细胞菌体A及菌体B；
步骤四具体为：
制剂制取：在步骤三获得了乳白色粘稠状菌体。按照菌体A：菌体B：甘油：体积比1：1:2的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：活性炭：硅藻土体积比1：1：1的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得固体制剂即目的产品。
实施例3：
步骤一具体为：
制备液体发酵培养基a，将革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8菌体无菌操作接入培养基a，置于温度30℃，180rpm，摇瓶培养72小时，至发酵液中细胞生长至对数期，获得假单胞菌ZZY-C13-1-8种子液；
液体发酵培养基a的配方为：
酵母浸粉3克、蛋白胨3克、甘油3毫升、NaCl 2.5克、磷酸二氢钾3克，加水至 500毫升。
制备液体培养基b，将杀香鱼假单胞菌菌体无菌操作接入培养基b，置于温度30℃，170rpm，摇瓶培养50小时，至发酵液中细胞生长至对数期，获得假单胞菌种子液；
液体发酵培养基b的配方为：
酵母浸粉3克、蛋白胨3克、甘油3毫升、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克，加水至 500毫升。
步骤二具体为：
制备液体发酵培养基c，并进行常灭菌处理后，无菌操作以8%的接种量加入步骤一所获得的革兰氏假单胞菌ZZY-C13-1-8种子液至培养基c，恒定温度32℃，搅拌速度180rpm，通风量0.29M3/min，罐压0.08MPa，持续发酵48小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.7×109个/毫升时终止发酵。
液体发酵培养基c的配方为：
蛋白胨280克、酵母膏200、液体石蜡150毫升、甘油100毫升、NaCl 10克、磷酸二氢钾25克，加水至50升。
制备液体发酵培养基d，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5%的接种量加入步骤一所获得的杀香鱼假单胞菌种子液至发酵培养基d，恒定温度28℃，搅拌速度160rpm，通风量0.25M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵36小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5×109个/毫升时终止发酵；
液体发酵培养基d的配方为：
蛋白胨200克、酵母膏200、液体石蜡200毫升、磷酸二氢钾25克、硫酸镁10克，加水至50升。
步骤三菌体细胞A、B分离
具体为：将步骤二获得的液体发酵物分别置于用离心机6000转/分，离心15分钟，分离除去发酵液中水份，获得灰白色粘稠状细胞菌体A及菌体B；
步骤四具体为：
制剂制取：在步骤三获得了乳白色粘稠状菌体。按照菌体A：菌体B：甘油：体积比1：1:1.8的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：活性炭：硅藻土体积比1：1：0.9的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得固体制剂即目的产品。
本发明涉及的菌剂对氧化乐果降解可达到75%以上该菌剂对其他有机磷农药亦保持高度耐受（1000mg/l 敌杀死，500mg/l敌敌畏）。该菌剂在对平均温度保持25-34℃，湿度25-30%，平均残留量在50mg/kg土壤条件下，每亩施用5kg，一个月之后土壤内氧化乐果残留量可下降75%以上。对于残留量高达200mg/kg的土壤该菌剂也能保持较高的降解效果。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，其特征在于：
所述复合菌剂包括革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8或革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8和杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）混合。
2.根据权利要求1所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，其特征在于：
革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8及杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）的混合比例为1:1。
3.根据权利要求2所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，其特征在于：
所述复合菌剂还包括甘油、活性炭和高岭土。
4.根据权利要求3所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，其特征在于：
革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8、杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、甘油、活性炭和高岭土的混合比例为1:1:(1.5-2):3：(2.5-3)。
5.根据权利要求4所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂，其特征在于：
所述革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 18606。
6.如权利要求5所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：对革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8菌体进行种子液体培养，获得革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液；
对杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌体进行种子液体培养，获得杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液；
步骤二：分别对革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8、杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）进行液体发酵；
步骤三：液体发酵物分别离心得到液体发酵菌体A、菌体B；
步骤四：将菌体A、菌体B与甘油、活性炭、高岭土按1:1:(1.5-2):3：(2.5-3)的质量比混合，制得农药氧化乐果降解微生物复合菌剂。
7.根据权利要求6所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：
步骤一具体为：
制备液体发酵培养基a，并在121℃温度下灭菌20分钟，将革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8菌体无菌操作接入培养基a，置于温度28-30℃，摇瓶培养，160-180rpm，48-72小时，至发酵液中细胞生长至对数期，OD600达到1.5±0.4,获得革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液；
所述液体发酵培养基a的配方为：
酵母浸粉2.5-5克、蛋白胨2.5-5克、甘油2.5-5毫升、NaCl 2.5克、磷酸二氢钾2.5-5克，加水至 500毫升；
制备液体培养基b，并在121℃温度下灭菌20分钟，将杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌体无菌操作接入培养基b，置于温度28-30℃，160-180rpm，摇瓶培养24-48小时，至发酵液中细胞生长至对数期，OD600达到1.0±0.4, 获得杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液；
所述液体发酵培养基b的配方为：
酵母浸粉2.5-5克、蛋白胨2.5-5克、甘油2.5-5毫升、磷酸二氢钾2.5-5克、硫酸镁1-2.5克，加水至 500毫升。
8.根据权利要求7所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：
步骤二具体为：
制备液体发酵培养基c，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5-10%的接种量加入步骤一所获得的革兰氏假单胞菌（Pseudomonas graminis）ZZY-C13-1-8种子液至培养基c，恒定温度28±4℃，搅拌速度160-180rpm，通风量0.25-0.29M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵48-72小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5-0.8×109个/毫升时终止发酵；
所述液体发酵培养基c的配方为：
蛋白胨250-280克、酵母膏200-250、液体石蜡150-200毫升、甘油100-150毫升、NaCl10-25克、磷酸二氢钾25-50克，加水至50升；
制备液体发酵培养基d，并进行常灭菌处理后，无菌操作以5-10%的接种量加入步骤一所获得的杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）种子液至发酵培养基d，恒定温度28±4℃，搅拌速度160-180rpm，通风量0.25-0.29M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵24-48小时，显微镜检测计数发酵液中细胞数达0.5-1.0×109个/毫升时终止发酵；
所述液体发酵培养基d的配方为：
蛋白胨200-250克、酵母膏200-250、液体石蜡200-250毫升、磷酸二氢钾25-50克、硫酸镁10-25克，加水至50升。
9.根据权利要求8所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：
步骤三具体为：
将步骤二获得的液体发酵物分别置于离心机，4000-6000转/分，离心15-20分钟，分离除去发酵液中水份，获得灰白色粘稠状细胞菌体A及菌体B。
10.根据权利要求9所述的农药氧化乐果降解微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：
步骤四具体为：
按照菌体A：菌体B：甘油的体积比1：1:（1.5-2）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀；再按照菌体A：菌体B：活性炭：高岭土体积比1：1：3：(2.5-3)的比例加入细度为300目的活性炭和高岭土，搅拌混合均匀，获得农药氧化乐果降解微生物复合菌剂。
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