CN109762782B - 一种促间充质干细胞生长的培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够促进间充质干细胞分裂生长的培养基，包括无血清的基础培养基及在其基础上增添的添加剂，添加剂包含木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A；木芙蓉提取物具有抗氧化及激活细胞活性，复配海藻多糖与黄芪甲苷可有效的促进细胞代谢生长；人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺与维生素A为干细胞生长提供必需的营养物质；血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子与人胰岛素生长因子等细胞因子共同促进干细胞迅速生长增殖；培养基不仅能够提高间充质干细胞的生长活力、缩短培养时间、促进细胞生长因子的表达，还可保持其分化潜能的干细胞活性；在日常培养中又不使干细胞进行分化，为科学研究提供便利。

Description

一种促间充质干细胞生长的培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞培养基技术领域，具体涉及到一种促进间充质干细胞生长的新型培养基及其制备方法。

背景技术

干细胞是一类具有多分化潜能及自我更新能力的原始未分化的细胞。根据干细胞的发育阶段可分为胚胎干细胞与成体干细胞，胚胎干细胞又被称之为“种子细胞”，可分化为各种类型的组织细胞；成体干细胞是存在于已分化组织中的未分化细胞，如神经系统的神经干细胞、血液循环系统中的血液干细胞、脂肪组织中的脂肪干细胞等。根据干细胞的分化潜能又可分为全能干细胞(如胚胎干细胞)、多能干细胞(如间充质干细胞)、单能干细胞(亦称之为专能干细胞，如造血干细胞)。

自1976年Freidenstein首次发现骨髓间充质干细胞后，后续的研究发现间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还具有造血支持、促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等多项潜能。因此，间充质干细胞被认为是最接近临床应用的干细胞产品。同时，间充质干细胞在科研界也被认为是继胚胎干细胞、造血干细胞之后的又一主要科研热点，是一种能够治疗多种系统疾病的“实用型干细胞”。其中，间充质干细胞中的脂肪干细胞被认为是《时代周刊》评为“当今最棒的50项发明之一”，可通过分泌一些细胞因子(例如HGF,TGF-β,VEGF,bFGF，PGF等)促进细胞的增殖生长，是21世纪最有效的抗衰老技术，可见间充质干细胞未来在医美行业的应用前景。

干细胞的应用大多数离不开体外培养，而干细胞体外培养的关键又在于培养液的选择。间充质干细胞的培养液大都是在基础培养基中添加血清，血清中包含多种不同分子量大小的蛋白成分，为细胞的生长增殖提供必要的营养因子。但是，动物源血清的添加，由于其成分复杂不清晰不仅会引入外源污染、细胞毒性及影响细胞培养标准化，在医疗方面也存在人体异源排斥反应以及影响细胞形态分化方向发生异变，在一定程度上也会影响细胞表达产物的分离与鉴定。目前，干细胞培养基的应用逐渐往无血清添加的方向转化，利用一些血清替代物进行添加。血清替代物虽然规避了血清潜在的弊端，但血清替代物组分繁多且价格成本较高，培养的细胞增殖速度慢，是科研及医疗应用亟需解决的主要问题。

发明内容

针对目前干细胞培养基存在一些不足，本发明意在提供一种促间充质干细胞生长的培养基及其制备方法，其成分明确、简单，且价格成本低的无血清干细胞培养基，并在一定程度上提高间充质干细胞的生长增殖速率。

本发明的技术方案如下：

一种促间充质干细胞生长的培养基，包括无血清的基础培养基及在其基础上增添的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包含木芙蓉提取物80-120ng/mL、海藻多糖30-50ng/mL、黄芪甲苷25-40ng/mL、人血白蛋白30-50μg/mL、转铁蛋白10-20μg/mL、谷氨酰胺3-5nM/mL、血小板衍生因子10-20ng/mL、表皮生长因子10-20ng/mL、成纤维生长因子10-18ng/mL、人胰岛素生长因子10-20ng/mL、维生素A 3-5ng/mL。

进一步，所述添加剂的成分以终浓度计，包含木芙蓉提取物80ng/mL、海藻多糖30ng/mL、黄芪甲苷25ng/mL、人血白蛋白30μg/mL、转铁蛋白10μg/mL、谷氨酰胺3nM/mL、血小板衍生因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、成纤维生长因子10ng/mL、人胰岛素生长因子10ng/mL、维生素A 3ng/mL。

进一步，所述添加剂的成分以终浓度计，包含木芙蓉提取物120ng/mL、海藻多糖50ng/mL、黄芪甲苷40ng/mL、人血白蛋白50μg/mL、转铁蛋白20μg/mL、谷氨酰胺5nM/mL、血小板衍生因子20ng/mL、表皮生长因子20ng/mL、成纤维生长因子18ng/mL、人胰岛素生长因子20ng/mL、维生素A 5ng/mL。

进一步，所述添加剂的成分以终浓度计，包含木芙蓉提取物110ng/mL、海藻多糖40ng/mL、黄芪甲苷30ng/mL、人血白蛋白45μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、谷氨酰胺4nM/mL、血小板衍生因子15ng/mL、表皮生长因子15ng/mL、成纤维生长因子15ng/mL、人胰岛素生长因子15ng/mL、维生素A 4ng/mL。

进一步，所述基础培养基为DMEM或F12培养基。

一种促间充质干细胞生长的培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)准确称取相应量的木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素E，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约20-30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10-15min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为6％-8％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.05-7.35。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

进一步，所述步骤(1)搅拌时间为30分钟。

进一步，所述步骤(1)继续搅拌10分钟。

进一步，所述步骤(2)向步骤(1)所得混合培养基中加入质量分数为7％的碳酸钠溶液。

进一步，所述步骤(2)调节培养基的pH至7.2。

采用上述技术方案，发明是在无血清的基础培养基中增添添加剂，添加剂包含木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A。其中木芙蓉提取物中富含植物胎盘素及植物性生长因子，不仅能够刺激干细胞的再生，改善细胞氧气供应，还可强化细胞对脂肪、蛋白质及碳水化合物等物质的吸收，从而增加细胞营养与机能；海藻多糖具有抗氧化作用，可降低干细胞内的氧分压，与木芙蓉复配可进一步促进细胞的增殖生长；黄芪甲苷可刺激干细胞分泌细胞生长因子，同时在培养基中额外加入主要细胞因子(血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子)低浓度组合可起到协同促进间充质干细胞的增殖作用，并延缓间充质干细胞在培养过程中的老化现象；人血白蛋白不仅可作为干细胞内的渗透压调节剂与自由基清除剂，还可运载生长因子为干细胞转运营养物质；转铁蛋白通过与细胞表面相应受体结合以转运铁元素，用于调节细胞内铁元素的代谢，还可通过与其他微量元素结合调节细胞的生长增殖；谷胱甘肽、人血白蛋白与维生素A相互联合，可进一步清除细胞内的自由基，维持多种蛋白与酶的完整结构，保持蛋白酶的酶活性，保证细胞的生物活性，并降低细胞凋亡概率。

相对于现有干细胞培养基，本发明的有益效果主要为：

1.本发明提供的培养基不含有血清，可避免免疫排斥反应、细胞毒性、病原体污染等弊端；

2.本发明首次采用木芙蓉提取物用于间充质干细胞的培养，并复配黄芪甲苷与细胞生长因子，不仅可使干细胞的生长增殖速度得到进一步的提高，同时在维持干细胞“干性”(多分化潜能与自我更新能力)的情况下延缓细胞衰老；

3.本发明组分明确简易、成本较低、制备工艺简单、操作方便，并能促进间充质干细胞的生长与增殖，减少扩增时间，有利于科学研究及医疗实验等体外干细胞的培养。

附图说明：

图1为本发明实施例1～实施例6细胞存活率统计图；

图2为本发明实施例1～实施例6细胞生长曲线图；

图3为本发明实施例1～实施例6细胞划痕面积曲线图；

图4为本发明试验三的利用细胞划痕方法检测实施例三的细胞生长图；

图5为本发明实施例1细胞生长因子表达柱状图；

图6为本发明实施例2细胞生长因子表达柱状图；

图7为本发明实施例3细胞生长因子表达柱状图；

图8为本发明实施例4细胞生长因子表达柱状图；

图9为本发明实施例5细胞生长因子表达柱状图；

图10为本发明实施例6细胞生长因子表达柱状图。

具体实施方式

以下通过附图1-10及具体实施方式对本发明做进一步解释说明，所描述的仅是本发明的部分实施实例，不对本发明的内容有所限制。本领域相关研究人员在没有做出任何创新性贡献的前提下所进行的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所用试剂材料，若无特殊说明，均可通过商业渠道获得。

实施例1一种促进间充质干细胞生长的培养基

所述干细胞培养基由基础培养基及添加剂组成，所加入的添加剂以终浓度计算，包括：木芙蓉提取物80ng/mL、海藻多糖30ng/mL、黄芪甲苷25ng/mL、人血白蛋白30μg/mL、转铁蛋白10μg/mL、谷氨酰胺3nM/mL、血小板衍生因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、成纤维生长因子10ng/mL、人胰岛素生长因子10ng/mL、维生素A 3ng/mL。

所述基础培养基为DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)或F12培养基。

培养基制备方法如下：

(1)准确称取相应量的木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为7％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.20。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

实施例2一种促进间充质干细胞生长的培养基

所述干细胞培养基由基础培养基及添加剂组成，所加入的添加剂以终浓度计算，包括：木芙蓉提取物120ng/mL、海藻多糖50ng/mL、黄芪甲苷40ng/mL、人血白蛋白50μg/mL、转铁蛋白20μg/mL、谷氨酰胺5nM/mL、血小板衍生因子20ng/mL、表皮生长因子20ng/mL、成纤维生长因子18ng/mL、人胰岛素生长因子20ng/mL、维生素A 5ng/mL。

所述基础培养基为DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)或F12培养基。

培养基制备方法如下：

(1)准确称取相应量的木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为7％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.20。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

实施例3一种促进间充质干细胞生长的培养基

所述干细胞培养基由基础培养基及添加剂组成，所加入的添加剂以终浓度计算，包括：木芙蓉提取物110ng/mL、海藻多糖40ng/mL、黄芪甲苷30ng/mL、人血白蛋白45μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、谷氨酰胺4nM/mL、血小板衍生因子15ng/mL、表皮生长因子15n_g/mL、成纤维生长因子15ng/mL、人胰岛素生长因子15ng/mL、维生素A 4ng/mL。

所述基础培养基为DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)或F12培养基。

培养基制备方法如下：

(1)准确称取相应量的木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为7％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.20。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

实施例4一种促进间充质干细胞生长的培养基

所述干细胞培养基由基础培养基及添加剂组成，所加入的添加剂以终浓度计算，包括：海藻多糖40ng/mL、黄芪甲苷30ng/mL、人血白蛋白45μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、谷氨酰胺4nM/mL、血小板衍生因子15ng/mL、表皮生长因子15ng/mL、成纤维生长因子15ng/mL、人胰岛素生长因子15ng/mL、维生素A 4ng/mL。

所述基础培养基为DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)或F12培养基。

所述添加剂不同的是没有添加木芙蓉提取物。

培养基制备方法如下：

(1)准确称取相应量的海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为7％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.20。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

实施例5一种促进间充质干细胞生长的培养基

所述干细胞培养基由基础培养基及添加剂组成，所加入的添加剂以终浓度计算，包括：木芙蓉提取物110ng/mL、银耳多糖40ng/mL、桔梗皂苷30ng/mL、人血白蛋白45μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、谷氨酰胺4nM/mL、血小板衍生因子15ng/mL、表皮生长因子15ng/mL、成纤维生长因子15ng/mL、人胰岛素生长因子15ng/mL、维生素A 4ng/mL。

所述基础培养基为DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)或F12培养基。

所述添加剂不同的是将海藻多糖替换为银耳多糖。

培养基制备方法如下：

(1)准确称取相应量的木芙蓉提取物、银耳多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为7％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.20。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

实施例6一种促进间充质干细胞生长的培养基

所述干细胞培养基由基础培养基及添加剂组成，所加入的添加剂以终浓度计算，包括：木芙蓉提取物110ng/mL、海藻多糖40ng/mL、桔梗皂苷30ng/mL、人血白蛋白45μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、谷氨酰胺4nM/mL、血小板衍生因子15ng/mL、表皮生长因子15ng/mL、成纤维生长因子15ng/mL、人胰岛素生长因子15ng/mL、维生素A 4ng/mL。

所述基础培养基为DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)或F12培养基。

所述添加剂不同的是将黄芪甲苷替换为桔梗皂苷。

培养基制备方法如下：

(1)准确称取相应量的木芙蓉提取物、海藻多糖、桔梗皂苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀约30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀。

(2)利用质量分数为7％的碳酸钠溶液对步骤(1)所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.20。

(3)将步骤(2)所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得新型培养基。

以上实施例的结果图，包括细胞存活率、细胞生长情况及生长因子表达量可知，实施例1—实施例3结果表明该培养基配方中各组分量具有一定配比，促进细胞生长的功效不随剂量的增加而加强，即非剂量依赖性；实施例3与实施例4主要区别在木芙蓉的添加与否，从结果图对比可知，木芙蓉对于该培养基的功效起着重要的作用；实施例5中将实施例3中的海藻多糖替换为银耳多糖，从实施例结果图可见，在该配方中多糖类选用海藻多糖可更好的凸显该培养基促进细胞生长的功效；同样的，实施例6中将实施例3中的黄芪甲苷替换为桔梗皂苷，从实施例结果图可见，在该配方中皂苷类选用黄芪甲苷也可较好的体现该培养基促进细胞生长的功效；综合上述实施例，对比剂量差异(实施例1-2)、组分类型(实施例4-6)与实施例3可知，实施例3中各组分的剂量及类型配比是该培养基的最优方案，可更好的体现促进间充质干细胞生长的功效。

试验一本发明对间充质干细胞生长存活率的影响

1.培养干细胞来源：来源于人体脂肪组织的干细胞

2.受试培养基：实施例1-6自制培养基

3.体外细胞培养方法：先将脂肪干细胞接种于T75培养瓶或其他细胞培养板(根据实验所需进行调整)中，接种密度控制在10％-15％之间，再将接种后的细胞放入恒温培养箱中培养(培养条件为37℃，5％CO₂)。

4.干细胞生长存活率检测方法：将培养至第5代的脂肪干细胞以接种密度控制在10³-10⁴之间，接种于96孔板中，37℃，5％CO₂继续培养3-5天；再往各孔细胞中添加20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

5.试验结果：利用MTT法检测实施例1-实施例6培养基对脂肪间充质干细胞存活率的影响，根据附图1结果图可见，实施例3相对于其他实施例的培养中干细胞存活率最高，说明本发明有利于间充质干细胞的生长存活。

试验二本发明对间充质干细胞生长增殖的影响

1.培养干细胞来源：来源于人体脂肪组织的干细胞

2.受试培养基：实施例1-6自制培养基

3.体外细胞培养方法：先将脂肪干细胞接种于T75培养瓶或其他细胞培养板(根据实验所需进行调整)中，接种密度控制在10％-15％之间，再将接种后的细胞放入恒温培养箱中培养(培养条件为37℃，5％CO₂)。

4.干细胞生长增殖检测方法：将培养至第5代的脂肪干细胞以接种密度约1x10⁴个细胞接种于T75细胞培养板上，每个实施例铺板7个，37℃，5％CO₂培养至相应的时间段(0,1,2,3,4,5,6d)，每培养至一个时间段时利用细胞计数仪对细胞数量进行统计计算。

5.试验结果：利用细胞计数方法对各实施例培养的细胞进行计数，根据附图2的曲线图可知，细胞培养第1天、第2天各实施例的细胞增长相似，但从第3天开始实施例3培养的干细胞数量明显高于其他实施例的细胞数，说明本发明具有促进间充质干细胞增殖的作用。

试验三本发明对间充质干细胞生长增殖的影响

1.培养干细胞来源：来源于人体脂肪组织的干细胞

2.受试培养基：实施例1-6自制培养基

3.体外细胞培养方法：先将脂肪干细胞接种于T75培养瓶或其他细胞培养板(根据实验所需进行调整)中，接种密度控制在10％-15％之间，再将接种后的细胞放入恒温培养箱中培养(培养条件为37℃，5％CO₂)。

4.干细胞划痕面积检测方法：首先用记号笔在6孔板的背面，用直尺衡量均匀的画横线，每隔0.5-1.0cm一道，横穿过孔，每孔至少画5条；再将培养至第5代的脂肪干细胞以接种密度控制在5x10⁵左右，接种于6孔板中，37℃，5％CO₂继续培养至细胞长至100％；然后，用无菌枪头或牙签，与细胞平面垂直，沿着板底横线进行划痕；利用PBS将漂浮的细胞冲洗掉，37℃，5％CO₂培养至相应时间段(0,12,24,36,48,60h)显微镜下观察拍照，利用imageJ软件进行划痕面积的统计计算。

5.试验结果：利用细胞划痕方法检测各实施例培养的细胞生长迁移情况，根据附图3的曲线图及附图4(实施例三培养的细胞不同时间的图)的细胞图可知，实施例3中干细胞的生长增殖最快，划痕后的开放区域随培养时间延长而变小，说明本发明具有促进间充质干细胞生长增殖的作用。

试验四本发明对间充质干细胞生长因子表达的影响

1.培养干细胞来源：来源于人体脂肪组织的干细胞

2.受试培养基：实施例1-6自制培养基

3.体外细胞培养方法：先将脂肪干细胞接种于T75培养瓶或其他细胞培养板(根据实验所需进行调整)中，接种密度控制在10％-15％之间，再将接种后的细胞放入恒温培养箱中培养(培养条件为37℃，5％CO₂)。

4.干细胞中细胞生长因子表达检测方法：将培养至第5代的脂肪干细胞以接种密度约4x10⁵个细胞接种于T75细胞培养板上，37℃，5％CO₂继续培养3-5天；收集细胞培养上清液，并取1x10⁶个细胞进行裂解，经低温离心后取裂解液上清；利用各细胞生长因子相应的Elisa试剂盒(PDGF,bFGF,KGF,TGF-β,HGF,VEGF)进行标曲建立及蛋白表达量测定。

5.试验结果：利用各细胞生长因子相应的Elisa试剂盒对干细胞上清液中各生长因子含量的检测，根据附图5-10的柱状图可知，实施例3培养的干细胞中PDGF,bFGF,KGF,TGF-β,HGF,VEGF的生长因子含量相对于其他实施例的含量均得到提高，说明本发明具有促进间充质干细胞分泌各生长因子的作用。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种促间充质干细胞生长的培养基，其特征在于，包括无血清的基础培养基及在其基础上增添的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，木芙蓉提取物80-120 ng/mL、海藻多糖30-50 ng/mL、黄芪甲苷25-40 ng/mL、人血白蛋白30-50 μg/mL、转铁蛋白10-20 μg/mL、谷氨酰胺3-5 nM/mL、血小板衍生因子10-20 ng/mL、表皮生长因子10-20 ng/mL、成纤维生长因子10-18 ng/mL、人胰岛素生长因子10-20 ng/mL、维生素A 3-5ng/mL。

2.根据权利要求1所述一种促间充质干细胞生长的培养基，其特征在于，包括无血清的基础培养基及在其基础上增添的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，木芙蓉提取物80ng/mL、海藻多糖30 ng/mL、黄芪甲苷25 ng/mL、人血白蛋白30μg/mL、转铁蛋白10μg/mL、谷氨酰胺3 nM/mL、血小板衍生因子10 ng/mL、表皮生长因子10 ng/mL、成纤维生长因子10ng/mL、人胰岛素生长因子10 ng/mL、维生素A 3 ng/mL。

3.如权利要求1所述一种促间充质干细胞生长的培养基，其特征在于，所述添加剂的成分以终浓度计，木芙蓉提取物120ng/mL、海藻多糖50 ng/mL、黄芪甲苷40 ng/mL、人血白蛋白50μg/mL、转铁蛋白20μg/mL、谷氨酰胺5 nM/mL、血小板衍生因子20 ng/mL、表皮生长因子20 ng/mL、成纤维生长因子18 ng/mL、人胰岛素生长因子20 ng/mL、维生素A 5 ng/mL。

4.根据权利要求1所述一种促间充质干细胞生长的培养基，其特征在于，所述添加剂的成分以终浓度计，木芙蓉提取物110 ng/mL、海藻多糖40 ng/mL、黄芪甲苷30 ng/mL、人血白蛋白45 μg/mL、转铁蛋白15 μg/mL、谷氨酰胺4 nM/mL、血小板衍生因子15 ng/mL、表皮生长因子15 ng/mL、成纤维生长因子15 ng/mL、人胰岛素生长因子15 ng/mL、维生素A 4 ng/mL。

5.根据权利要求1-4任意一项所述一种促间充质干细胞生长的培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM或F12培养基。

6.如权利要求1-4任意一项所述一种促间充质干细胞生长的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）准确称取相应量的木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷、人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子、维生素A，先将木芙蓉提取物、海藻多糖、黄芪甲苷加入到无血清基础培养基中，搅拌混匀20-30min；再将人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、血小板衍生因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、人胰岛素生长因子加入上述混匀溶液中，继续搅拌10-15min；最后，加入维生素A，并加以搅拌均匀；

（2）利用质量分数为6%-8%的碳酸钠溶液对步骤（1）所得混合培养基进行PH调节，将混合培养基的PH调至7.05-7.35；

（3）将步骤（2）所得混合培养基进行0.22μm滤膜过滤除菌，即可得培养基。

7.如权利要求6所述的一种促间充质干细胞生长的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）搅拌时间为30分钟。

8.如权利要求6所述的一种促间充质干细胞生长的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）继续搅拌10分钟。

9.如权利要求6所述的一种促间充质干细胞生长的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）向步骤（1）所得混合培养基中加入质量分数为7%的碳酸钠溶液。

10.如权利要求6所述的一种促间充质干细胞生长的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）调节培养基的pH至7.2。

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