CN113583949B

CN113583949B - 一种细胞培养基及其应用

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Publication number: CN113583949B
Application number: CN202110856899.7A
Authority: CN
Inventors: 张黎敏; 韩旭
Original assignee: Xinjiang Western Sai'ao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinjiang Western Sai'ao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2021-07-28
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-07-28
Also published as: CN113583949A

Abstract

本发明公开了一种细胞培养基及其应用，所述培养基包括基础培养基和添加因子，所述添加因子包括多糖和/或低聚果糖，所述的多糖包括大分子虫草多糖GPS，所述的低聚果糖为雪莲果提取低聚果糖。本发明还公开了该培养基在培养干细胞中的应用。本专利提供了一种用于培养干细胞的无血清培养基，解决了采用血清培养干细胞带来的风险问题。

Description

一种细胞培养基及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种细胞培养基及其应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可被诱导分化成多种类型的特化细胞，从而实现组织的修复与再生。理论上讲，在一定条件下，它可以定向分化成机体内的功能细胞，形成任何类型的组织和器官。干细胞从发育学角度，可分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，胚胎干细胞是一种高度未分化的细胞，它能分化成生命体的所有组织与器官。成体干细胞存在于成熟生命体的一些组织或器官中，具有修复和再生的能力。从分化潜能的角度上，干细胞分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。全能干细胞是指具有能分化成完整个体的潜能的干细胞；多能干细胞是有分化成多种类型细胞的能力。单能干细胞一般存在于成体组织器官中，能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。由组织工程等发展起来的细胞疗法、组织代替治疗方法以及基因治疗是当今医学领域乃至生命科学领域中的研究热点和前沿，为患者提供了有效的治疗方案。具有高度自我更新潜能和多分化方向的干细胞是细胞治疗和基因治疗的首选靶细胞。

干细胞的临床应用必然要面对一个关键环节——细胞的体外培养和扩增，细胞的体外培养需要最大限度的为细胞提供一个接近于其体内生长的环境，所以大多数动物细胞体外培养体系中，科研工作者都会提供类似体液环境的基础培养基、模拟体内环境的温度和二氧化碳浓度等条件，还有最重要的就是为细胞的生长和增殖提供必要的养分，故需要添加胎牛血清来供给营养。为细胞生长增殖提供营养物质是胎牛血清最主要的功能，同时，它还存在一些缺陷，比如动物血清极易携带病毒或支原体、成分复杂、批件差异大，不利于进行细胞稳定培养。还有一方面，血清的价格很昂贵，会存在供不应求，缺少固定的来源等一些问题。而在干细胞体外培养过程中，血清中不确定的成分及配比更是会导致干细胞的干性丢失并走向分化，所以我国也在《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》中明确说明在干细胞的体外培养体系中应尽量避免使用动物血清。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无血清的干细胞增殖用培养基。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种细胞培养基，其特征在于，所述的细胞培养基包括基础培养基和添加因子，所述的添加因子包括多糖和/或低聚果糖，优选多糖和低聚果糖。

进一步，所述的多糖包括富硒海藻多糖。

进一步，所述的富硒海藻多糖的浓度为25～35μg/mL。

本文所用的术语“低聚果糖”是指果糖低聚物。其可为长链或短链，具体取决于低聚果糖的聚合度(单体的数量)。

进一步，所述的低聚果糖为雪莲果提取低聚果糖。

进一步，所述的雪莲果提取低聚果糖的浓度为45～55μg/mL。

进一步，所述的多糖还包括虫草多糖。

进一步，所述的虫草多糖的浓度为8～12μg/mL。

进一步，所述的添加因子还包括胰岛素、L-谷氨酰胺、转铁蛋白、纤粘连蛋白、白蛋白、EGF、b-FGF、VEGF、PDGF-BB、IL-3、维生素B6、维生素B12和/或维生素C，优选为胰岛素、L-谷氨酰胺、转铁蛋白、纤粘连蛋白、白蛋白、EGF、b-FGF、VEGF、PDGF-BB、IL-3、维生素B6、维生素B12和维生素C。

进一步，所述的胰岛素的浓度为8～12μg/mL。

进一步，所述的L-谷氨酰胺的浓度为8～12mM。

进一步，所述的转铁蛋白的浓度为8～12μg/mL。

进一步，所述的纤粘连蛋白的浓度为85～115μg/mL。

作为白蛋白，具体而言，可举出卵清蛋白、猪来源白蛋白、牛来源白蛋白、人来源白蛋白等的天然来源的白蛋白或牛型、猪型、或者人型等的基因重组体的白蛋白等，可适宜地例示特别血清来源的白蛋白或人型的基因重组体白蛋白(重组体人白蛋白(rHSA))。在本发明的具体实施例中，所述的白蛋白为人血清白蛋白。

进一步，所述的人血清白蛋白的浓度为15～25mg/mL。

进一步，所述的EGF的浓度为8～12ng/mL。

进一步，所述的b-FGF的浓度为8～12ng/mL。

进一步，所述的VEGF的浓度为8～12ng/mL。

进一步，所述的PDGF-BB的浓度为4～6ng/mL。

进一步，所述的IL-3的浓度为13～17ng/mL。

进一步，所述的维生素B6的浓度为0.4～0.6mg/mL。

进一步，所述的维生素B12的浓度为0.5～0.7mg/mL。

进一步，所述的维生素C的浓度为3～5mM。

本发明所述的添加因子只要得到希望得到的效果，就也可为任何剂型，例如，溶液、固体、粉末状等。是固体或粉末状时，可使用适宜的缓冲液等溶解至希望得到的浓度而使用。

在本发明中使用的基础培养基中，可使用公知的，只要不抑制干细胞的增殖，就不特别限定，可举出例如DMEM、EMEM、IMDM(Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基)、GMEM(Glasgow氏MEM)、RPMI-1640、α-MEM、Ham氏培养基F-12、Ham氏培养基F-10、Ham氏培养基F12K、培养基199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy氏5A、Leibovitz氏L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth氏MB752/1、CMRL-1066、Williams氏培养基E、Brinster氏BMOC-3培养基、E8培养基(NatureMethods，2011,8,424-429)、ReproFF2培养基(ReproCELL公司)、及这些的混合培养基等。

进一步，所述的基础培养基为α-MEM。

本发明的培养基对于任何动物来源的干细胞的增殖均可适宜地使用。可使用本发明的培养基培养的干细胞，例如，是小鼠、大鼠、仓鼠、猪鼠等的啮齿类、兔等的兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等的有蹄目、狗、猫等的猫目、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的灵长类等来源的干细胞，优选为，是人来源的干细胞。

本说明书中，“干细胞”是指有自身复制能力及分化/增殖潜能的未成熟的细胞。在干细胞中，按照功能，干细胞可分为全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。全能干细胞是指有可向构成活体的全部的组织或细胞分化的能力的细胞。多能干细胞是指，虽非全部的种类，但有可向多种组织或细胞分化的能力的细胞。单能干细胞是指有可向特定的组织或细胞分化的能力的细胞。

作为全能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)等。通过由将体细胞的核核移植而培养制作的初期胚建立的干细胞也作为全能干细胞优选(Nature，385,810(1997)；Science，280,1256(1998)；Nature Biotechnology，17,456(1999)；Nature，394,369(1998)；Nature Genetics，22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96,14984(1999)；Nature Genetics，24,109(2000))。另外，由对细胞的应激或刺激衍生－挑选的全能干细胞也可作为全能干细胞的例举出。

作为多能干细胞，可举出间充质干细胞、造血系干细胞、神经系干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等的成体干细胞等。多能干细胞优选为间充质干细胞、所述的间充质干细胞包括但不限于骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞。在本发明的具体实施例中，所述的细胞为脐带间充质干细胞。

本发明第二方面提供了一种培养细胞的方法，所述的方法包括使用本发明第一方面所述的细胞培养基。

进一步，所述的细胞为干细胞。

进一步，所述的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。

进一步，所述的干细胞为多能干细胞。

进一步，所述的多能干细胞包括但不限于间充质干细胞、造血系干细胞、神经系干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞。

进一步，所述的多能干细胞为间充质干细胞。

进一步，所述的间充质干细胞包括但不限于骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞。

进一步，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

在干细胞的培养中使用的培养器只要是可培养干细胞的，就不特别限定，但可举出瓶、组织培养用瓶、皿、平皿、组织培养用皿、多联皿、微平板、微孔板、多联盘、多孔板、显微镜载玻片、室玻片、培养皿、管、托盘、培养袋、及滚瓶。

培养器可为细胞粘接性，也可为细胞非粘接性，根据目的适宜选择。细胞粘接性的培养器可为以使培养器的表面的与细胞的粘接性升高的目的，用细胞外基质(ECM)等的任意的细胞支持用基质包被的。

其他培养条件可适宜设定。例如，培养温度无特别限定，可为约30～40℃、优选为约37℃。CO₂浓度可为约1～10％、优选为约2～5％。氧分压可为1～10％。

进一步，采用所述方法培养细胞，可以提高细胞的分化效果。

进一步，所述的分化效果包括成脂分化效果、成骨分化效果。

进一步，采用本发明所述方法培养细胞，细胞接种后48h，细胞可增殖至5倍以上。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的细胞培养基在培养细胞中的应用。

进一步，所述的细胞为干细胞。

进一步，所述的干细胞为多能干细胞。

进一步，所述的多能干细胞为间充质干细胞。

进一步，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

培养物中的细胞一般会持续生长直到融合，此时接触抑制会导致细胞分裂和生长的停止。该细胞随后从基质或烧瓶中被分离出来，以及通过稀释到组织培养基中并重新接种的方式进行“分裂”或传代。细胞由此可以在培养期间被传代或分裂；优选它们以1∶2或更大的比例，优选1∶3，更优选1∶4，1∶5或更大比例。词语“传代”指包括获取细胞系的融合培养物，接种到新鲜培养基中，并培养细胞系直至实现融合或饱和。

本发明第四方面提供了一种糖类在制备细胞培养基中的应用，所述的糖类为多糖和/或低聚果糖，优选为多糖和低聚果糖。

进一步，所述的多糖包括富硒海藻多糖。

进一步，所述的富硒海藻多糖的浓度为25～35μg/mL。

进一步，所述的低聚果糖为雪莲果提取低聚果糖。

进一步，所述的雪莲果提取低聚果糖的浓度为45～55μg/mL。

进一步，所述的多糖还包括虫草多糖。

进一步，所述的虫草多糖的浓度为8～12μg/mL。

进一步，所述的细胞为干细胞。

进一步，所述的干细胞为多能干细胞。

进一步，所述的多能干细胞为间充质干细胞。

进一步，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

在本发明中，如果没有额外说明，所有添加因子的浓度均应理解为该添加因子在培养基中的终浓度。

本文说明性描述的发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，举例来说，术语“包括”应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和表达已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和表达时排除所示的以及所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的发明中所体现的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种细胞培养基，所述的细胞培养基包括基础培养基和添加因子，所述的添加因子包括多糖和/或低聚果糖。

本发明还提供了该细胞培养基在培养干细胞中的应用，解决了采用血清培养干细胞带来的风险问题。

附图说明

图1是间充质干细胞(MSC)生长曲线图；

图2是P4代MSC细胞生长形态图；

图3是流式细胞术检测CD29实验结果图；

图4是流式细胞术检测CD73实验结果图；

图5是流式细胞术检测CD90实验结果图；

图6是流式细胞术检测CD105实验结果图；

图7是实验组成脂、成骨分化实验结果图，其中，图A是成骨分化实验结果，图B是成脂分化实验结果；

图8是对比组成脂、成骨分化实验结果图，其中，图A是成骨分化实验结果，图B是成脂分化实验结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1脐带间充质干细胞培养基及培养方法

一、实验材料

脐带间充质干细胞培养基

1)基础培养基：α-MEM。

2)干细胞扩增因子：胰岛素8～12μg/mL、L-谷氨酰胺8～12mM、转铁蛋白8～12μg/mL、纤粘连蛋白85～115μg/mL、人血清白蛋白15～25mg/mL、EGF 8～12ng/mL、b-FGF 8～12ng/mL、VEGF 8～12ng/mL、PDGF-BB 4～6ng/mL、IL-313～17ng/mL、维生素B60.4～0.6mg/mL、维生素B120.5～0.7mg/mL、维生素C 3～5mM。

3)虫草多糖制备：以液料比20:1加入古尼虫草菌丝体和水，80℃水域浸提2h，以终浓度50％乙醇沉淀，离心，弃上清，得到虫草粗多糖。粗多糖复溶后，用AB-8弱极性大孔吸附树脂层析柱进行分离，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液。洗脱液用Sephadex G-100层析柱进行纯化，用蒸馏水洗脱，收集，冷冻干燥，得虫草多糖。

4)雪莲果低聚果糖制备：液料比20:1加入雪莲果和水，80℃水域浸提2h，以终浓度65％乙醇沉淀，离心，收集上清，浓缩，冷冻干燥，得到雪莲果低聚果糖。

5)富硒海藻多糖制备：以液料比15:1加入海藻和水，65℃水域浸提2h，以终浓度65％乙醇沉淀，离心，弃上清，得到海藻粗多糖。粗多糖复溶后，用AB-8弱极性大孔吸附树脂层析柱进行分离，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液。洗脱液用DEAE-SephadexA25层析柱进行纯化，用蒸馏水洗脱，收集，冷冻干燥，得富硒海藻多糖。

6)干细胞干性维持因子：虫草多糖8～12μg/mL(分子量3×10⁶D)、雪莲果提取低聚果糖45～55μg/mL、富硒海藻多糖25～35μg/mL，多糖为无菌冻干粉，使用前用10mLα-MEM培养基重溶后，加到完全培养基内。

7)干细胞干性维持培养基：α-MEM培养基+干细胞扩增因子+干细胞干性维持因子.

二、实验方法

(1)脐带间充质干细胞培养方法

1)把保存在冻存管中的脐带间充质干细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动2min溶解；

2)把复苏后的P1代脐带间充质干细胞吸到50mL离心管内，用2mL培养基润洗冻存管，将润洗培养基转移到离心管内，再加8mL培养基到离心管内，然后1 000g离心5分钟；

3)弃上清液，用干细胞干性维持培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；调整细胞密度1*10⁶，加2*10⁵细胞到T25的培养瓶中，再加入3mL上述干细胞干性维持培养基，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

4)将细胞放入37℃、5％C0₂培养箱中培养48小时；

5)48小时后，收获细胞，此时细胞为P2代，计数，计算增殖倍数；加0.6-0.8*10⁶细胞到T75的培养瓶中，再加入10mL上述干细胞干性维持培养基，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；将细胞放入37℃、5％C0₂培养箱中培养48小时；

6)48小时后，收获细胞，此时细胞为P3代，计数，计算增殖倍数；将收获细胞按照加细胞数0.6-0.8*10⁶/瓶，转移到T75的培养瓶中，再加入10mL上述干细胞干性维持培养基，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；将细胞放入37℃、5％C0₂培养箱中培养48小时；

7)48小时后，收获细胞，此时细胞为P4代，计数，计算增殖倍数；将收获细胞按照加细胞数0.6-0.8*10⁶/瓶，转移到T75的培养瓶中，再加入10mL上述干细胞干性维持培养基，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；将细胞放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时；

8)收获P5细胞，计数，计算增殖倍数；流式细胞术检测P5细胞。

三、实验结果

1)如图1、表1所示，采用本发明所述的培养基培养脐带间充质干细胞，细胞增殖水平较好。

表1细胞增殖数统计结果

	P1	P2	P3	P4	P5
						细胞数	2*10⁵	1.02*10⁶	5.31*10⁶	5.31*10⁶	12.75*10⁷
细胞增殖倍数		5.1	5.2	4.8	5.0

2)如图2所述，采用本发明所述的培养基培养脐带间充质干细胞，细胞生长形态较好。

3)如图3-6、表2所示，通过流式细胞术检测P5细胞表面标记水平，结果显示，脐带间充质干细胞的特征分子标志物表达量高。

表2流式细胞术检测结果

标记物	CD29	CD73	CD90	CD105
					百分比	99.82％	99.89％	99.77％	98.74％

实施例2不同添加因子对细胞增殖速率的影响

一、对比组

1、对比组1

除将干细胞干性维持因子中的雪莲果提取低聚果糖换成果糖，其余实验材料与实验方法均与实施例1中的实验组一致。

2、对比组2

除将干细胞干性维持因子中的富硒海藻多糖换成壳多糖，其余实验材料与实验方法均与实施例1中的实验组一致。

3、对比组3

除将干细胞干性维持因子中的雪莲果提取低聚果糖换成果糖，富硒海藻多糖换成D葡萄糖，其余实验材料与实验方法均与实施例1中的实验组一致。

二、对比实验结果：

如表3所示，采用实验组的培养方法培养脐带间充质干细胞，细胞增殖速率较高。

表3对比实验结果

实施例3干细胞干性维持因子对干细胞分化效果的影响

一、对比组

对比组A:除培养基中不含干细胞干性维持因子，对比组A的其余实验材料、实验方法均与实施例1中的实验组一致。

二、分化实验

通过分化实验，比较实验组与对比组A的细胞成脂、成骨分化效果。

三、实验结果

如图7、图8所示，实验组细胞成脂、成骨分化效果优于对比组A。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种细胞培养基，其特征在于，所述的细胞培养基包括基础培养基和添加因子，所述的添加因子包括多糖、低聚果糖、胰岛素、L-谷氨酰胺、转铁蛋白、纤粘连蛋白、人血清白蛋白、EGF、b-FGF、VEGF、PDGF-BB、IL-3、维生素B6、维生素B12和维生素C；

所述的多糖包括富硒海藻多糖、虫草多糖，所述的低聚果糖为雪莲果提取低聚果糖；

所述的富硒海藻多糖的浓度为25～35μg/mL，所述的雪莲果提取低聚果糖的浓度为45～55μg/mL，所述的虫草多糖的浓度为8～12μg/mL，所述的胰岛素的浓度为8～12μg/mL，所述的L-谷氨酰胺的浓度为8～12mM，所述的转铁蛋白的浓度为8～12μg/mL，所述的纤粘连蛋白的浓度为85～115μg/mL，所述的人血清白蛋白的浓度为15～25mg/mL，所述的EGF的浓度为8～12ng/mL，所述的b-FGF的浓度为8～12ng/mL，所述的VEGF的浓度为8～12ng/mL，所述的PDGF-BB的浓度为4～6ng/mL，所述的IL-3的浓度为13～17ng/mL，所述的维生素B6的浓度为0.4～0.6mg/mL，所述的维生素B12的浓度为0.5～0.7mg/mL，所述的维生素C的浓度为3～5mM；

所述的基础培养基为α-MEM。

2.一种培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括使用权利要求1所述的细胞培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用所述方法培养细胞，可以提高细胞的分化效果。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在，所述的分化效果包括成脂分化效果、成骨分化效果。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用所述方法培养细胞，细胞接种后48h，细胞可增殖至5倍以上。

6.权利要求1所述的细胞培养基在培养脐带间充质干细胞中的应用。

7.一种糖类在制备脐带间充质干细胞培养基中的应用，其特征在于，所述的糖类为多糖和低聚果糖，所述的多糖包括富硒海藻多糖、虫草多糖，所述的低聚果糖为雪莲果提取低聚果糖；

所述的富硒海藻多糖的浓度为25～35μg/mL，所述的雪莲果提取低聚果糖的浓度为45～55μg/mL，所述的虫草多糖的浓度为8～12μg/mL。