KR20110095550A - 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 생산효율을 높이는 배양배지 조성물 및 세포 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골세포, 골아세포, 지방세포, 신경세포 등 다방면의 세포로 분화가 가능한 제대 유래 중간엽 줄기세포의 배양 배지 조성물, 이를 이용한 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양방법 및 세포 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 배지 조성물은 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포에 특이적이고, EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염이 MSCEM (MSC expansion media)에 포함되어 있으며, 본 발명의 배지 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양방법은 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 성장률을 촉진시켜 생산효율을 높일 수 있다. 또한 본 발명의 방법에 의해 제대 유래 단핵세포로부터 얻어진 다분화능 중간엽 줄기세포는 세포 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 생산효율을 높이는 배양배지 조성물 및 세포 치료제 {A culture medium for improvement of production of mesenchymal stem cell from a porine umbilical cord and cell therapeutic agent}

본 발명은 중간엽 줄기세포의 생산효율을 높일 수 있는 배양배지 조성물, 배양방법 및 세포 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염 (ascorbic acid-2-phosphate)이 MSCEM (MSC expansion media)에 포함되어 있는 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 성장률 촉진용 배양배지 조성물, 이를 이용한 줄기세포 배양방법 및 세포 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다.

줄기세포는 분화능과 생성시기에 따라 크게 배아줄기세포 (embryonic stem cell)와 성체 줄기세포 (adult stem cell)로 구분될 수 있다. 인간 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나, 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화 능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 얻을 수 있어 윤리적인 문제가 적으나, 배아 줄기세포에 비하여 한정된 분화능력 (multipotency)을 가지고 있다.

대표적인 성체줄기세포에는 조혈모세포 (hematopoietic stem cells; HSCs) 와 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs) 가 있다. 조혈모세포에는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 반면, 중간엽 줄기세포는 연골 세포 (chondroblast), 골모세포 (osteoblast), 지방세포 (adipocyte), 신경세포 등의 중배엽성 조직의 세포로 분화하는 것으로 알려져 있다. 상기한 성체줄기세포의 분리 및 배양방법이 알려지면서 세포 치료제로서의 임상적 적용에도 관심이 고조되고 있으며, 줄기세포를 이용하여 파킨슨씨병, 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환이나 척추손상에 의한 사지마비, 간경화, 소아 당뇨병, 백혈병, 기타 만성질환 등과 같은 질환에 의해 파괴되어 부족한 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체요법 (cell replacement therapy) 이 효과적인 치료법으로 제시되면서 많은 연구가 진행되고 있다.

제대혈은 최근에 많은 양의 줄기세포를 가지고 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 제대는 골수와는 달리 분만과정에서 버려지는 제대 (umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다고 알려져 있다.

한편, 체외에서 인위적으로 동물 세포를 배양하기 위하여 배양 배지를 공급하려면, 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거로 한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주어야 한다. 따라서, 체액을 근거로 배양 배지 조성을 결정하고 이 결정된 배양 배지를 선택하여 혈청을 적정 비율로 세포에 맞게 첨가한 뒤 세포 배양에 이용되어야 한다. 특히, 돼지 제대 유래 줄기세포는 다른 동물에 비해 배양 조건이 까다롭고, 공지된 일반 배지에서는 세포 형태 (cell morphology) 가 완전히 퍼지는 현상이 일어나 중간엽 줄기세포로 전환되는 % 가 매우 낮게 나오는 바, 이에 대한 연구가 절실히 필요하다.

제대 유래 중간엽 줄기세포를 성공적으로, 그리고 다량으로 얻기 위해서는 분리된 제대 유래 단핵세포를 배양하는 단계에서의 배양 조성물이 매우 중요한 바, 보다 많은 양, 빠른 성장을 하는 줄기세포를 얻기 위한 배양 배지 조성물에 대한 연구가 필요한 상태이다.

이에 본 발명자들은 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 생산효율을 높이기 위해 예의 연구 노력한 결과, 돼지 제대 유래 단핵구 세포에서 빠르게 중간엽 줄기세포로 성장할 수 있는 최적의 배지 조성물을 찾아 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 생산효율이 높고, 줄기세포의 성장률을 촉진시켜주는 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명은 상기 배양 배지 조성물을 이용하여 제대 유래 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양방법으로 얻어진 다분화능 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 EGF, FGF 및 아스코르브산- 2 - 인산염 (ascorbic acid- 2-phosphate)을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대 유래 줄기세포임이 바람직하다.

상기 제대는 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대에서 채취하여 얻을 수 있다.

본 발명에서는 돼지로부터 분리된 제대를 사용하는 것이 바람직하다.

제대로부터 단핵세포를 분리하기 위해서 본 발명의 일 실시예에서는 돼지에서 제대를 채취하여 3% 항생제가 든 DPBS 로 혈액이 나오지 않을 때까지 씻어주고, 0.075% 콜라게나제 (collagenase) 가 든 배지에 씻은 제대를 37℃에서 인큐베이션 (incubation) 하였다. 그리고 상기 제대를 수술용 칼날로 다지고, 다시 인큐베이션 시켜서 단핵세포가 함유된 용액을 얻었다.

본 발명에서 사용된 용어 "배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외 (in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배지이다. 상기의 "중간엽 줄기세포"는 포유동물 유래의 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포에서 분리한 세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 세포형태 (예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등)로 분화가 가능한 세포이다.

상기의 "배양" 은 중간엽 줄기세포의 성장 및 증식을 포함하는 의미이다.

본 발명의 배양 배지 조성물은 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염이 여러 기본배지에 첨가되어 만들어 질 수 있다.

본 발명에서 상기 "기본배지"는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 배양 배지는 영양혼합물 (Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양 혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양 혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 예를 들면, F-12, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 등이 있으며, 바람직하게는 F-12 영양혼합물 (F-12 Nutrient Mixture), M199, MCDB media 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실험예에서는 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포의 성장속도를 빠르게 하기 위한 최적의 배지 조성물을 찾고자, MSCEM (MSC expansion media), 낮은 글루코즈 (low glucose) DMEM, DMEM/F12, 돼지 배양액 네 종류의 배지를 이용하여 이들을 각각 10% FBS 넣은 것과 FGF, EGF 및 아스코르브산을 넣은 것과 비교하는 실험을 하였다. 일반배지 low Glucose DMEM, DMEM/F12나 MSCEM의 배양액, MSCEM의 배지에 EGF+FGF+아스코르브산-2- 인산염을 넣은 조성에 따라 돼지 제대유래 줄기세포의 성장률을 살펴 본 결과, MSCEM 배지에 FGF, EGF 및 아스코르브산-2-인산염을 첨가한 배지 조성물에서 줄기세포가 효과적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염은, EGF 는 1 내지 3 ng/ml, FGF 는 1 내지 3 ng/ml, 아스코르브산-2-인산염은 0.1 내지 0.3 mM 로 포함되는 것이 바람직하다.

보다 바람직하게는, EGF 는 2 ng/ml, FGF 는 2 ng/ml, 아스코르브산-2-인산염은 0.2mM 로 포함되는 것이다 (실험예 1).

본 발명의 일 실험예에서는, EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양했을 때 동물 종별에 따른 줄기세포 성장률을 비교하였다. MSCEM 배지를 대조군으로 하고, MSCEM 에 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염을 포함하는 배지를 실험군으로 하여 돼지 제대유래 줄기세포, 개 지방 줄기세포, 고양이 지방 줄기세포를 배양하였다. 그 결과 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때 다른 동물보다 성장률이 매우 높음을 확인할 수 있었다. 또한 시간이 지날수록 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포는 본 발명의 배지에서 7일째 되는 날 세포 seeding 수에 비하여 약 42배의 증식을 보였으며, 고양이 지방줄기세포는 오히려 그 증식이 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 배양배지 조성물은 일반 배지에서 성장률이 낮은 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포에 특이적이다 (실험예 2).

본 발명의 또 다른 형태로서, 본 발명은 상기의 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염을 포함하는 제대 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물로 돼지 제대 유래 단핵세포를 배양하는 단계를 포함하는, 돼지 제대 유래 단핵세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 제공한다.

상기 중간엽 줄기세포는 동물의 배아줄기세포 또는 성체줄기세포에서 유래된 전분화능을 가진 세포이며, 바람직하게는 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포이다.

상기 배양은 돼지 제대 유래 단핵세포를 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염을 포함하는 제대 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물에 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 조건의 배양기에 배양한 다음 3일 후에 뜨는 세포를 제거하고 3~4일마다 배지를 교체하여 배양하였다. 배양된 세포의 약 80% 가 자랐을 때 0.5% 트립신-EDTA 로 세포를 떼어 내어 세포 부유액을 원심분리한 다음 세포수를 측정하였다 (실시예 1).

또한 본 발명은 CD90 에 대한 항체에는 양성반응, CD11R3 에 대한 항체에는 음성반응을 나타내는 면역표현형을 갖는 다분화능 중간엽 줄기세포를 제공한다.

상기 줄기세포는 본 발명의 분리 및 배양방법에 의해 분리되고 배양된 다분화능 중간엽 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법으로 분리된 세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 가지는지를 확인하기 위해 얻어진 세포의 표현 항원 발현 양상을 확인하였다 (실시예 2). 확인 결과, 중간엽 줄기세포 마커 CD90에 대한 항체에는 양성반응, 음성 대조군인 (negative control) CD11R3에 대한 항체에는 음성반응 (negative)을 나타내는 면역표현형을 갖고 있었다.

또한 본 발명의 분리 및 배양방법으로 분리된 중간엽 줄기세포는 다양한 세포로 분화될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 계대배양 세번째의 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. 배양배지 MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma)+0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 연골세포분화 전용 배지 [(ADMEM(Gibco)+5% FBS, 1% antibioitic(Gibco), 50uM L-ascorbate-2-phosphate, 1% ITS( Insulin 1g/L, Sodium selenate 0.6 mg/L, Transferrin 0.5g/L), 10-⁷ Dexamethason,10ng/mlhTGFbeta1(AcrisantibodiesGmbH)] 포함한 배양액에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4 주간 배양하였다. 분화 검정을 위해 Safranin-O/Fast green 조직화학 염색을 수행한 결과, 실험세포군에서 양성반응을 보였는 바, 본 발명의 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 3-1).

또한 본 발명의 일 실시예에서는 계대배양 세번째의 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. 배양배지 MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma)+0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 골세포 분화용액[ADMEM (Gibco) + 5% FBS + 1% antibioitic (Gibco), 100nM Dexamethason, 50 μM L-ascorbate-2-phosphate, 10 mM beta-glycolphosphate)에서 3주 동안 배양하였다. 골세포로의 분화 검정을 위해 Von Kossa 조직화학 염색을 통해 확인한 결과, 실험세포군에서 양성반응을 보여 본 발명의 중간엽 줄기세포가 골세포로 분화될 수 있음을 확인하였다 (실시예 3-2).

본 발명의 일 실시예에서는 지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세 번째의 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. 배양배지 MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma) +0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 파종 후 지방세포 분화용액 [ADMEM + 5% FBS+ 1% antibioitic (Gibco), 1 μM Dexamethasion, 10 μg/ml insulin, 100 μM Indomethacin, 0.5 μM 3-isobutyl-methylxanthine(IBMX)]에서 3주 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화 검증을 위해 세포내 지방 축적을 확인하기 위한 Oil-Red-O 조직화학 염색을 통하여 실험 세포군에서 양성반응을 보였는 바, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 지방세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 3-3).

또한 신경세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세 번째의 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma) +0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 파종 후 신경분화를 위해 1mM beta-mercaptoethanol (sigma, USA)이 포함된 일반 배지로 1일 동안 키운 후, 2mM beta-meracaptoethanol이 포함된 일반배지로 교체하고 3 시간 동안 배양하여 전-유도를 실시하였다. 전-유도 후에 5% FBS 대신에 N2 보충제(N2 supplements; Gibco, USA)가 포함된 ADMEM에 2% DMSO (sigma, USA), 200 uM butylated hydroxyanisole, sigma, USA), 10 uM 포스콜린 (Forskolin), 2mM 벨프로산(Sigma, USA) 및 10mM 염화칼륨(Sigma, USA)를 넣은 신경유도배지(Neuronal induction media)로 바꿔주어 배양하여 현미경으로 관찰하였다.

그리고 신경분화 확인을 하기 위해서 세포면역형광화학법을 수행하여 확인하였다. 그 결과 실험대조군과 비교하여 항체 tubulin-beta 3, 항체 GFAP의 발현을 관찰 할 수 있었다.

즉, 본 발명의 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 3-4).

아울러, 본 발명은 본 발명의 분리 및 배양방법으로 분리된 다분화능 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 임의의 투여경로에 의해서, 구체적으로는 복강 또는 흉강 투여, 피하 투여, 정맥 또는 동맥 혈관내 투여, 근육내 투여, 주사에 의한 국소 투여 등의 방법에 의해서 투여 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 통상의 방법에 기초하여 주사제, 현탁제, 유화제 등의 형태로 투여할 수 있고, 필요에 따라서 프로인트 완전 보조제 등의 보조제에 현탁되거나, 또는 BCG와 같은 보조제 활성을 갖는 물질과 함께 투여하는 것도 가능하다. 상기 조성물은 멸균되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 의한 세포 치료용 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체나 첨가제를 함유할 수 있는데, 유효성분 이외에 희석제 (예를 들어, 덱스트로즈, 솔비톨, 셀룰로즈, 글리신, 락토즈, 스쿠로즈, 만니톨), 결합제 (예를 들어, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 트라가칸스, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈), 붕해제 (예를 들어, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및 /또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 돼지 유래 세포치료제는 동물의 퇴행성 관절염, 신부전, 다발성관절염, 간질환, 아토피 피부염 등에 적용이 가능하며, 추후 사람에 대한 임상시험 결과에 따라서는 사람에 대한 이종세포치료제로의 가능성도 있다. 그 구체적인 적용예를 살펴보면,

본 발명에서의 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포는 호흡마취 한 개나 고양이등 포유동물의 무릎관절, trochlear groove에 연골의 일부를 제거하는 수술을 하여 관절염을 유발한 후, 형광 표지 된 줄기세포를 약 5 x 10⁶개를 PBS 100㎕에 부유시켜, 연골 결손부위에 직접 주입하는 단계와 10분간 정치시킨 후 봉합하고, 8주후, 육안적, 조직학적 방법을 통하여 줄기세포가 연골재생과 관절염 치료에 효과를 나타내었는지 평가하는 방법으로 관절염 치료를 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 지방세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 호로몬이나 내분비기질환의 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 연골세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골관절염 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 골형성 세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골결실 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 신경분화 세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 제대 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물은 중간엽 줄기세포의 성장률을 증가시킬 수 있어, 줄기세포 생산효율을 높일 수 있다. 또한 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 중간엽 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능하며, 이러한 분화된 조직의 세포는 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 bFGF 농도에 따라 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 EGF 농도에 따라 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Ascorbate-2-phosphate 농도에 따라 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 bFGF, EGF, Ascorbate-2-phosphate의 조합 배지에서의 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 나타낸 것이다.
도 5는 low DMEM 배지와 MSCEM 배지에서의 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DMEM/F12 와 MSCEM 배지에서의 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 MSCEM 배지와 돼지 배양액에서의 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 배지 종류에 따른 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 종 (Species) 에 따른 MSCEM 배지에 bFGF, EGF, Ascorbate-2-phosphate 를 첨가한 조성물이 중간엽 줄기세포의 성장률에 어떠한 영향을 미치는지 알아본 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 MSCEM 배지에 bFGF, EGF, Ascorbate-2-phosphate 를 첨가한 조성물 종별에 따라 중간엽 줄기세포의 성장률에 미치는 영향을 시간의 순서대로 나타낸 것이다.
도 11은 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화되었음을 나타내는 Safranin O stain 결과를 나타낸 것이다.
A: 분화되지 않은 세포 (대조군)
B: 분화된 세포 (실험군) (Scale bar= 200um)
도 12는 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포가 골아세포로 분화되었음을 나타내는 Von kossa stain 결과를 나타낸 것이다.
A: 분화되지 않은 세포 (대조군)
B: 분화된 세포 (실험군) (Scale bar= 200um)
도 13은 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포로 분화되었음을 나타내는 Oil-Red-O stain 결과를 나타낸 것이다.
A: 분화되지 않은 세포 (대조군)
B: 분화된 세포 (실험군) (Scale bar= 200um)
도 14는 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화되었음을 나타내는 항체 Beta-tubulin 3 면역염색결과를 나타낸 것이다.
A: 분화되지 않은 세포 (대조군)
B: 분화된 세포 (실험군)
C; 음성대조군 (Scale bar= 200um)
도 15는 종과 배양 배지에 따른 줄기세포의 자란 cell의 confocal 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
A: Low DMEM+10% FBS, Low DMEM+10%FBS+E+F+A
B: ADMEM10% FBS, ADMEM+10%FBS+E+F+A
C: DMEM/F1210% FBS, DMEM/F12+10%FBS+E+F+A
D: MSCEM. MSCEM+E+F+A

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아니고, 당업자에 의해 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 돼지 제대에서 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

1-1. 양돈장에서 돼지 제대 채취

모돈의 분만 시 제대가 땅에 닿지 않게 하여 멸균 장갑을 끼고 제대를 양쪽 멸균수술용 실로 끝을 묶은 다음 0.05% 클로로헥시딘 (chlorohexidine)으로 제대를 소독하고 멸균가위로 절단하였다. 5% 항생제 (penicillin, streptomycin 등)가 함유된 생리식염수 (saline)로 자른 제대를 씻은 후 3% 항생제가 든 DMEM에 제대를 넣어서 실험실로 이동시켰다.

1-2. 돼지 제대에서 줄기세포 분리 및 배양

실로 묶어 놓은 바깥쪽의 제대 부분을 제거하였다. 제거하고 남은 가운데 제대는 3% 항생제가 든 DPBS로 혈액 (blood)이 나오지 않을 때까지 씻었다. 제대를 반으로 갈라서 붙어 있는 동맥, 정맥의 핏줄은 모두 제거하였다. 0.075% 콜라게나제 (collagenase) (3% 항생제)가 든 배지에 씻은 제대를 넣어 37℃에서 약 20분 동안 인큐베이션 (incubation) 하였다. 그리고 이 제대를 수술용 칼날로 다졌다.

다져진 제대를 다시 37℃에서 약 2시간 동안 인큐베이션 (incubation) 하였다. 그리고 중간 중간에 한번씩 흔들어 주었다. 단핵세포가 함유된 용액을 0.2um 체에 걸러 제대 덩어리는 제거하였다. 단핵세포가 함유된 용액에 콜라게나제 (collagenase(sigma)를 함유 한 양의 2배로 하여 DMEM 배지를 첨가하였다. 그런 다음 2400rpm에 약 10분 동안 원심분리를 실시하였다. 그리고 펠렛 (pellet)이 딸려나가지 않도록 조심스럽게 상층액을 제거하였다. DPBS (3% 항생제)로 1번 씻어주었다. 그리고 RBS로 5분 동안 처리한 후 DPBS (3% 항생제)를 넣어 suction한 후 2400rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 그리고 DPBS (5% 항생제)로 2번 씻어준 후 배양하도록 하였다.

배양액 MSCEM^TM (Millipore-chmicon사) + 2ng/ml EGF (Sigma) + 1ng/ml FGF (Sigma) + 0.2mM 아스코르브산-2-인산염 (Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma))을 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 3일 후에 뜨는 세포는 제거하고 3~4일 마다 배지를 교체하여 배양하였다. 배양된 세포가 약 80% 정도 자랐을 때 0.5% 트립신-EDTA (Trypsin-EDTA (Gibco)로 세포를 떼어 내어 세포 부유액을 원심분리한 다음, 세포 수를 측정하고 생존력 (viability)을 검사한 후에 일부는 새 배양기에 계대 배양하였다. 나머지는 50% DMEM 배지에 40% 우태아 혈청 (FBS) 및 7~10% DMSO가 함유된 동결 보존액에 혼탁하여 액체 질소에 보관하였다.

<실험예 1> 배양 배지 조성물에 따른 줄기세포 성장률 비교

1-1. 성장인자 (Growth factor) 의 농도에 따른 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포 성장률 비교

성장인자 (Growth factor)인 bFGF, EGF와 아스코르브산-2-인산염 (Ascorbate-2-phosphate)의 농도에 따라 돼지 제대유래 줄기세포의 성장률을 검정하기 위한 실험으로, 대조군은 MSC의 전용 배지로 MSCEM (Millipore/chemicon; M)을 기본배지로 사용하였으며, 실험군 1은 기본배지에 bFGF (basic Fibroblast Growth Factor; FGF)를 0.1ng/ml~100ng/ml의 농도로 첨가하였고, 실험군 2는 기본배지에 rEGF (Epidermal Growth factor; EGF)를 0.1ng/ml~100ng/ml 농도로, 실험군 3은 기본배지에 AP (Ascorbate-2-Phosphate; A)를 1uM~1mM 농도로 첨가하였다. 계대배양 네 번째의 돼지 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 분리하여 세척된 단핵구 세포를 30종류의 배지가 각각 들어있는 6cm 디쉬 (dish)에 1x10⁵개의 세포를 접종하였다. 37℃와 5% CO₂를 유지하여 배양하였다. 2~3일 마다 한 번씩 배지를 갈아주며 배양하였으며, 7일 후에 세포를 harvest하여 세포성장률을 확인하였다.

그 결과, 실험군 1은 약 5ng/ml bFGF 농도에서 가장 좋은 효과의 성장률을 보였고 (도 1), 실험군 2에서는 2ng/ml EGF의 농도에서 (도 2), 실험군 3에서는 100uM/ml의 AP의 농도에서 가장 좋은 효과를 나타내었다 (도 3).

아스코르브산 농도에 따른 줄기세포 증식률을 표 1에 나타내었다.

배지 조성 농도	증식률 [1차] X105	증식률 [4차] X105	증식률 [5차] X105	비교 [1차] %	비교 [4차]	비교 [5차]
Control: MSCEM	3. 5	1.8	2.4	100	100	100
MSCEM +1uM AP	5.5	2.3	2.7	157	127	113
MSCEM +5uM AP	5.1	2.3	3	143	127	125
MSCEM +10uM AP	5.1	3.2	3.2	146	178	133
MSCEM +50uM AP	5	3.5	3.7	143	194	154
MSCEM +100uM AP	5	4	4.7	143	222	196
MSCEM +200uM AP	4	3.6	4.5	114	200	186
MSCEM +500uM AP	3.5	3.4	3.6	100	188	150
MSCEM +1mM AP	2	2.3	2.4	43	127	100
MSCEM +2mM AP	1.6	1.3	1.5	55	72	63

1-2. 성장인자들의 각각의 조합에 의한 돼지 제대 유래 줄기세포의 성장률 비교 실험

기본배지 MSCEM 배지에 E: 2ng/ml-rEGF, F: 2ng/ml-bFGF, A: 0.2mM ascorbic acid phosphate를 첨가하고, 첨가하지 않았을 때의 세포 성장률을 나타내었다. 약 10일 동안의 세포 성장률로 1x10⁴ seeding하여 성장률을 확인하였다. 1차의 실험을 보완하기 위해서 재실험을 해보았다. 2차 실험에서는 돼지 제대에서 분리한 세포를 1차보다 더 많은 양인 약 4x10⁴의 세포를 seeding 하여 약 9일 동안의 세포를 배양하여 harvest하여 세포의 수를 세어 그 비율을 측정한 것이다 (표2).

배지 조성	24well(1차)	Dish(6cm) (2차)	비교(1차)	비교(2차)	비교평균
1. MSCEM	7x104	2.5x105	1	1	1
2. MSCEM+EGF	1.8x105	4.3x105	2.5	1.7	2.1
3. MSCEM+FGF	2.6x105	6x105	3.7	2.4	3.05
4. MSCEM+EGF+FGF	2.7x105	7.1x105	3.8	2.8	3.3
5. MSCEM+A	2.2x105	5x105	3.1	2	2.55
6. MSCEM+E+F+A	2.9x105	9.3x105	4.1	3.8	3.95

표 1에서 볼 수 있듯이, MSC 배지 조성에 따른 성장률를 비교해보면, 대조군을 MSC배지로 했을 때 MSC배지에 EGF, FGF, Ascorbic acid phosphate를 함께 사용했을 경우에 가장 성장률이 효과적인 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 단독 첨가된 성분 중에서는 FGF만을 넣었을 때 가장 높은 성장률을 보였으며, FGF의 역할이 아주 중요한 것을 한 번 더 알 수 있었다 (도 4).

1-3. 종류가 다른 배지들간의 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포의 성장률 비교

(1) low DMEM 배지와 MSCEM 배지 조성별 실험

1x10⁵로 seeding 하여 8일 동안 배양한 후 세포를 harvest 하여 세포 수를 세었다. 그 결과는 표 3과 같다.

배지 조성	Cell 전체 수	비교
MSCEM	7x105	1
M+E+A	1.0x106	1.4
M+E+F+A	1.4x106	2
Low DMEM+10% FBS+E+A	4x105	0.5
Low DMEM+ 10%FBS+E+F+A	5x105	0.7

낮은 글루코즈 (low glucose) DMEM과 MSCEM의 EGF(E)와 Ascorbic acid-2-phosphate(A)의 영향에 대해서 알아본 결과 low DMEM에서는 5배의 증식률을 보였고 E와 F와 A를 함께 넣었을 경우와 별 차이가 없었다. 그리고 MSCEM에서는 E와 A만을 넣었을 경우는 약 10배의 증식이 있었고, E, F, A를 함께 넣었을 경우는 약 14배의 증식률을 보였다. 여기서 E와 A를 함께 넣어 사용하는 것 또한 MSC의 배지에서 더 효과적이라고 볼 수 있다 (도 5).

(2) DMEM/F12와 MSCEM의 배지 조성별 실험

DMEM배지에 E+A를 첨가하여 배양한 세포의 모양은 괜찮으나 MSCEM 배지보다는 그 성장률이나 증식률이 매우 낮은 것을 볼 수 있었다. 그리고 MSC+E+F+A의 세포 수가 다른 실험 보다 낮게 나온 이유는 세포들이 많이 뭉쳐 있어서 배지에 잘 녹아나지 않아 약간의 오차가 생긴 것으로 생각되었다. 따라서 MSC+E+F+A의 배지에서 돼지의 중간엽 줄기세포의 성장률이 가장 높게 나오는 것을 알 수 있었다. 또한 M+E+A 의 세포가 MSCEM+E+F+A의 세포보다는 낮으나 다른 것에 비하여 그 성장률이 높게 나오는 것을 알 수 있었다 (표 4, 도 6).

배지조성(seeding 8x104)	Cell totlal 수	비교
1. MSCEM	7x105	1
2. M+E+A	1.2x106	1.6
3. M+E+F+A	1.4x106	2
4. DMEM/ F12+10%FBS	1.5x105	0.21
5.DMEM/F12+10% FBS+E+F+A	2x105	0.3
6. DMEM/F12+10% FBS+E+A	2.8x105	0.4

(3) 돼지 배양액과 배지 조성별 실험

하기 표 5는 MSCEM 배지와 7일 배양한 돼지 제대유래 줄기세포 배양액에서 자라는 돼지 제대 유래 줄기세포 증식률을 비교한 것이다.

배지 조성	1차Cell 수	2차Cell 수	비교1차	비교2차
1.MSCEM 배지	1.2x106	3x105	1	1
2. 돼지제대유래 줄기세포배양액	9.4x105	1.8x105	0.8	0.6
3.M+E+F+A	2.9x106	6x105	2.2	2

Porcine 4의 Passage 3을 이용하여 cell을 1x10⁵cell로 seeding 하여 배양한 후 측정한 결과 MSCEM 배지의 세포 수보다 M+E+F+A배지에서 배양한 것이 약 2.2 배정도의 차이를 보였다. 이는 4일간의 배양에서 나온 수치로 이보다 긴 시간 동안의 배양을 했다면 더 많은 차이를 보일 수 있음을 알 수 있다. 그리고 기존의 돼지 줄기세포를 배양하고 난 후 수집한 배양액을 filtering한 것을 이용하여 오염원을 제거한 후 돼지 제대유래 줄기세포를 배양해 보았다. 그러나 기존의 MSCEM배지 보다 낮은 성장률을 보였다. 그러나 이것도 어느 정도 cell의 증식을 돕고 있다고 볼 수 있다.(도 7). 배양액에서의 증식은 아래 표 6에서와 마찬가지로 기존의 배지조성보다는 높은 성장률을 보이고 있음을 알 수 있다.

(4) 배지 5종류와의 비교 실험

다음 실험은 약 1.5x10⁵개의 세포를 각각의 배지에 seeding 하여 배양기에 약 4일간 배양하여 세포를 harvest한 후 세포수를 세어 표 6에 나타내었다.

배지 조성	Cell 전체 수	비교 (각각 배지간)	전체 배지간 비교
1. low DMEM+10% FBS	6x104	1	1
2. low DMEM+10% FBS+E+F+A	1.6x105	2.7	2.7
3. low DMEM+E+F+A	1.1x105	1.8	1.8
4. DMEM F/12+10% FBS	8x104	1	1.3
5. DMEM F/12+10% FBS+E+F+A	4x105	5	6.6
6. DMEM F/12+E+F+A	1x105	1.2	1.6
7. MSCEM 배양액(돼지)	1.8x105	1	3
8. MSCeM 배양액(돼지)+10% FBS	2x105	1.1	3.3
9. MSCEM 배양액(돼지)+E+F+A	6x105	3.3	10
10. MSCEM	3x105	1	5
11. M+E+F+A	8.1x105	2.6	13
12. M+10% FBS	5x105	1.6	8.1

그 결과, 각각 배지간의 조성 비율에 따라, FBS의 사용과 성장인자를 사용한 것과 이 둘을 같이 사용하였을 경우의 세포성장률을 실험하였다.

그리고 돼지의 배양액을 filtering 하여 모아서 배양을 시도해보았다. 그 결과(2) 10% FBS와 EGF, FGF, Ascorbic acid phosphate를 함께 넣은 low glucose DMEM (Lonza)배지는 10% FBS(1)만 넣은 기본배지 보다 약 2.7배의 성장률을 보였고, 그리고 FBS를 넣지 않은 세포의 성장률은 1.8배로 2번 보다는 낮으나 FBS만 넣은 1보다는 높음을 알 수 있었다. 그리고 4, 5, 6을 비교한 결과 5의 결과인 FBS만 사용한 것 보다 5배의 성장률을 알 수 있으며, 6번의 경우 4와 별 차이는 보이지 않았다. 그리고 7, 8, 9를 비교해 보면 9번의 경우 배양액에 FBS와 growth factor (EGF, FGF), ascorbic acid phosphate를 함께 사용한 것으로 7번 보다 3.3배, 8번 경우 1.1 배로 여기서 FBS를 넣은 것은 별반 차이를 보이지 않았다. 그리고 마지막으로 대조군으로 다시 FBS와 growth factor (EGF, FGF), ascorbic acid phosphate를 함께 넣어서 비교해 보았다. 기존의 MSCEM 배지만 사용한 것보다 약 2.6배로 높게 나오며, 여기에 10% FBS만 넣은 것은 약 1.6배로 앞서 언급한 것과 다른 기본배지 보다는 높게 나오는 것을 알 수 있었다.

따라서 돼지 제대 유래 MSC의 성장률을 배지에 따라 그리고 배지 조성에 따라 어떤지 확인 해본 결과 MSCEM 배지에서 low glucose DMEM 보다는 5배의 성장률을 확인 할 수 있었으며, 가장 잘 자라는 것을 알 수 있다. 그리고 DMEM F/12와 low glucose DMEM는 거의 차이를 보이지 않았다.

그리고 전체적으로 비교했을 경우는 MSC 배지에 FBS와 growth factor (EGF, FGF), ascorbic acid phosphate를 함께 넣은 것이 low glucose DMEM에 10% FBS를 넣어서 사용한 것 보다 약 13배의 증가된 성장률을 확인 할 수 있었다. 그리하여 돼지 제대 유래 MSC에 가장 적합한 배지 조성은 MSC 배지에 FBS와 growth factor (EGF, FGF), ascorbic acid phosphate를 함께 넣은 것이었다 (도 8).

또한 배지 조성에 따라 돼지 제대유래 줄기세포의 성장률을 보기위해 여러 가지 배지를 이용하여 배양해 보았다. 그리고 종에 따라서도 마차가지로 비교하여 보았다. 그 배지로는 low glucos DMEM +10% FBS, low glucos DMEM+10%FBS+E+F+A, ADMEM+10%FBS, ADMEM+10%FBS+E+F+A, DMEM/F12+10%FBS, DMEM/F12+10%FBS+E+F+A, MSCEM, MSCEM+E+F+A 총 8가지 배지 조성으로 2.5 dish에 2x10⁴ 씩 분주하여 2일동안 배양하여 conforcal 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 다른 종은 다양한 배지에서도 잘 자라는 것을 확인 할 수 있었고,특히 돼지 제대유래 줄기세포에서는 MSCEM+E+F+A에 가장 잘자라는 것을 확인 할 수 있었다. (도 15)

<실험예 2> 종(species) 에 따른 MSCEM 배지 조성에 따른 줄기세포 증식률 실험

2-1.

돼지 제대유래 줄기세포와 개 지방유래 줄기세포, 고양이 지방줄기세포와의 성장률 비교 실험을 실시하였다. 6cm 디쉬 (dish)에 세포 seeding을 1x10⁵의 양만큼 분주하여 7일 동안 배양한 다음 세포를 harvest 하여 그 수를 세었다 (도 9). 그 결과는 다음 표 7과 같다.

종	군	1차	2차	3차	4차	비교1차	비교 2차	비교3차	비교 4차	평균 cell 수 x105
돼지	대조	5.5 x105	7.6x105	6.3x105	5.5x105	100	100	100	100	6.2
돼지	실험	2.7X106	2x106	2.4x106	1.8x106	400	260	400	320	22.2
고양이	대조	1.8X106	4.4x105	1.0x106	2.2x105	100	100	100	100	8.7
고양이	실험	1.3X106	5.4x105	1.75x106	4.6x105	-30	122	175	209	10.2
개	대조	1.5X106	1.47x106	1.1x106	3x105	100	100	100	100	10.9
개	실험	2X106	1.8x106	3.5x106	5.8x105	130	122	300	193	11.8

2-2. 배지 조성에 따른 줄기세포의 증식률 시간별 확인 실험

(1) 실험조건 (표 8)

① 각 종마다 Passage는 5 로 통일

② 각 group 마다 반복수; 3

③ 날짜; 3일, 5일, 7일 마다 각각 cell harvest 하여 세포수 측정

④ 배지; 대조군(MSCEM), 실험군(MSCEM+bFGF+EGF+Ascorbic acid-2-phosphate)

⑤ 총 group 수; 18 group(C:대조군, T: 실험군)

⑥ 총 배양 수; 6well 9개(54well)

⑦ 각 well 당 줄기세포 배양 수; 2x10^4

종	3Day	5Day	7Day
돼지	C: MSCEM	C: MSCEM	C: MSCEM
	T: M+F+E+A	T: M+F+E+A	T: M+F+E+A
고양이	C: MSCEM	C: MSCEM	C: MSCEM
	T: M+F+E+A	T: M+F+E+A	T: M+F+E+A
개	C: MSCEM	C: MSCEM	C: MSCEM
	T: M+F+E+A	T: M+F+E+A	T: M+F+E+A

하기 실험조건에 따른 실험 결과를 표 9에 나타내었다.

종		Cell seeding X104	3Day 평균 X104	5Day 평균 X104	7Day 평균 X104	0D→3D 증식률 (비율)	0D→5D 증식률 (비율)	0D→7D 증식률 (비율)
돼지	C: MSCEM	2	7.87	18.7	32	3.93	9.35	16
	T: M+F+E+A	2	16.3	53	84	8.15	26.5	42
고양이	C: MSCEM	2	0.43	0.87	1.05	0.22	0.44	0.52
	T: M+F+E+A	2	0.52	1.42	1.75	0.26	0.71	0.86
개	C: MSCEM	2	1.2	1.84	0.97	0.6	0.92	0.46
	T: M+F+E+A	2	2.1	7.7	3.88	1.05	3.85	1.94

개별 조합에 따른 배지조성의 종별 실험을 한 결과 돼지 제대유래 줄기세포에 특이적으로 그 증식률이 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 돼지 제대는 7일째 되는 날 cell seeding 수에 비하여 약 42배의 증식을 보였으며, 고양이 지방줄기세포에서는 오히려 그 증식이 감소하여 0.86배로 감소함을 볼 수 있었다. 그리고 개 지방줄기세포 역시 약 1.94배로 5일째 까지는 증가하다가 7일째는 오히려 감소됨을 볼 수 있었다. 따라서 현 배지조성은 돼지 제대유래 줄기세포에 특이적으로 반응함을 알 수 있었다 (도 10).

<실시예 2> 유세포 분석기로 돼지 제대 유래 줄기세포의 세포 표면 특성 분석

본 발명의 방법으로 분리된 세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 가지는지를 확인하기 위해 얻어진 세포의 표현 항원 발현 양상을 확인하였다.

수득한 제대 유래 줄기세포를 PBS로 세척하고, 0.5% 트립신-EDTA (Trypsin-EDTA ; Gibco)를 사용하여 세포를 수거하고 5분 동안 1000rpm으로 원심분리 하였다. 상층액을 버린 후 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 시료 수만큼 2 x 10⁵세포를 분주하였다. 2 X10⁵ 세포수 / 100ul를 준비하여 PBS로 2회 세척하고 각 항체 (R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-cat monoclonal antibody) 10 ul 넣어 15분간 얼음에 암반응 시켰다. 인큐베이션 후에 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 뒤 세정액 (2mM EDTA, 0.5% BSA in PBS)으로 세척하고 1500rpm으로 7분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음 세정액 (2mM EDTA, 5% BSA in PBS)으로 2회 세척하고 마지막으로 유세포 분석용 PBS를 500ul 넣어서 유세포분석기(FACScan, Becton Dickinson)로 세포 표면 특성을 분석하였다.

분석에 사용한 항체는 단핵구 항원 (monocyte marker)인 CD90 (AbD Serotec), CD11R3 (AbD Serotec), CD44를 사용하였다.

확인 결과, 중간엽 줄기세포 마커 CD90에 대한 항체에는 양성반응, 음성 대조군인 (negative control) CD11R3에 대한 항체에는 음성반응 (negative)의 결과를 얻었다.

<실시예 3> 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포의 분화

상기와 같이, 세포 표면의 항원들의 발현 결과들로 미루어 볼 때, 제대에서 분리, 배양된 세포들이 중간엽 줄기세포임이 확인되었다. 본 발명자들은 본 발명의 조직 분쇄기법으로 분리한 세포들이 줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 알아보기 위한 또 다른 방법으로 분화실험을 실시하였다.

3-1. 연골세포 분화

연골세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세번째의 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal전용 세포용기에 파종하였다. 배양배지 MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma)+0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 연골세포분화 전용 배지[(ADMEM (Gibco)+5% FBS, 1% antibioitic (Gibco), 50uM L-ascorbate-2-phosphate, 1% ITS (Insulin 1g/L, Sodium selenate 0.6 mg/L, Transferrin 0.5g/L), 10-⁷Dexamethason,10ng/mlhTGFbeta1 (AcrisantibodiesGmbH)]를 포함한 배양액에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4주간 배양하였다. 연골세포로의 분화 검정을 위해 PBS로 2번 씻은 후에 포르말린으로 20분간 고정시킨 후 PBS로 2번 씻었다. 물기를 완전히 제거 후에 Safranin-O/Fast green 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 비교 세포군에서는 음성반응이었고, 실험 세포군에서는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 연골세포로 분화될 수 있음을 확인 할 수 있었다.

3-2. 골아세포 분화

골세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세번째의 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴ 세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. 배양배지 MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma)+0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 골세포 분화용액 [ADMEM(Gibco)+5% FBS+1% antibioitic(Gibco), 100nM Dexamethason, 50 μM L-ascorbate-2-phosphate, 10 mM beta-glycolphosphate)에서 3주 동안 배양하였다. 골세포로의 분화 검증을 위해 Von kossa 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과 도 12에 나타난 바와 같이 비교세포군에서는 음성반응이었고, 실험세포군에서는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 골아세포로 분화될 수 있음을 확인 할 수 있었다.

3-3. 지방세포로의 분화

지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세 번째의 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. 배양배지 MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma)+0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 파종 후 지방세포 분화용액 [ADMEM + 5% FBS+ 1% antibioitic (Gibco), 1 μM Dexamethasion, 10 μg/ml insulin, 100 μM Indomethacin, 0.5 μM 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX)]에서 3주 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화 검증을 위해 세포내 지방 축적을 확인하기 위한 Oil-Red-O 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과 도 13에서 나타난 바와 같이 비교세포군 에서는 음성반응이었고, 실험세포군에서는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 지방세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.

3-4. 신경세포 분화

신경세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세 번째의 돼지 제대유래 중간엽 줄기세포들을0.25% 트립신/1mM EDTA (Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2x10⁴세포를 커브슬립이 놓인 3.5cm confocal 전용 세포용기에 파종하였다. MSCEM^TM (Millipore-chmicon)+2ng/ml EGF (Sigma)+1ng/ml FGF (Sigma)+0.2mM Ascorbic acid-2-phosphate (Sigma)를 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 파종 후 신경분화를 위해 1mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol (sigma, USA)이 포함된 일반 배지로 1일 동안 키운 후, 2mM 베타-머캅토에탄올이 포함된 일반배지로 교체하고 3 시간 동안 배양하여 전-유도를 실시하였다. 전-유도 후에 5% FBS 대신에 N2 보충제(N2 supplements; Gibco, USA)가 포함된 ADMEM에 2% DMSO (sigma, USA), 200 uM butylated hydroxyanisole(sigma, USA), 10 uM 포스콜린 (Forskolin), 2mM 벨프로산(Sigma, USA) 및 10mM 염화칼륨(Sigma, USA)을 넣은 신경유도배지(Neuronal induction media)로 바꾸어 준 후 배양하여 현미경으로 관찰하였다.

그리고 신경분화 확인을 하기 위해서 세포면역형광 화학법에 의하여 확인하였다. 커버 슬립을 덮고, 4%(v/v) formalin 실온에서 30분 동안 고정한 후, 1 x PBS로 3번 세척해 주었다. 이어서 0.2% TritonX100을 10분 동안 처리하여 투여한 후 1 x PBS로 3번 세척하였다. 그리고 5% normal serum이 포함된 blocking 용액을 1시간 동안 처리하였다. 그 다음 4℃에서 blocking 용액으로 희석한 일차항체 tubulin-beta 3과 마우스 항체 GFAP-Alexa fluor 594를 상기의 중간엽 줄기세포와 하룻밤 동안 반응시켰고, 1xPBS로 3번 세척하였다. 항체 tubulin-beta 3은 blocking 용액에 1:500으로 희석한 Dylinght^®488결합 항 마우스(AbD serotec.USA)로 이차 항체를 1시간 동안 반응시켰고 항체 GFAP는 형광이 바로 사용되었다. 그리고 PBS에 1:2,500으로 희석한 DAPI (Sigma,USA)로 10분 동안 핵을 염색하였고, 1X PBS로 3번 세척한 후 공초점 현미경 (FluoView™ Confocal Microscope, Olympuse, Japan)으로 사진을 촬영하여 조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과 항체 tubulin-beta 3, 항체 GFAP의 발현을 관찰할 수 있었다.

Claims (10)

1. EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 돼지 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 EGF, FGF 및 아스코르브산-2-인산염이 MSCEM (MSC expansion media)에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 EGF 는 1 내지 3 ng/ml, FGF 는 1 내지 3 ng/ml, 아스코르브산-2-인산염은 0.1 내지 0.3 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 EGF 는 2 ng/ml, FGF 는 2 ng/ml, 아스코르브산-2-인산염은 0.2mM 로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 돼지 제대 유래 단핵세포를 배양하는 단계를 포함하는, 돼지 제대 유래 단핵세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법.
8. CD90에 대한 항체에는 양성반응, CD11R3 에 대한 항체에는 음성반응을 나타내는 면역표현형을 갖는 다분화능 중간엽 줄기세포.
9. 제 8항에 있어서, 상기 줄기세포는 6항의 방법에 의해 분리되고 배양되는 것을 특징으로 하는 다분화능 중간엽 줄기세포.
10. 제 8항의 다분화능 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료용 조성물.
    

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