CN103695369B - 脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法 - Google Patents

Abstract

一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，包括脐带清洗、破碎消化、流式细胞仪分选和扩增培养等步骤。本发明提供的脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，特别筛选并获得CD271⁺细胞，配合使用10v/v%自体血清并加入50ng/mlHSP90培养6天后获得。验证发现，由此培养出的细胞不但具有常规间充质干细胞的表面标志，而且细胞增殖能力也强于常规方法培养出的间充质干细胞。

Description

脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞的分离和培养方法，尤其涉及一种脐带间充质干细胞亚群的体外培养和扩增方法。

背景技术

干细胞（StemCells，SC）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括脐带血与骨髓。对哺乳动物来说，干细胞分为胚胎干细胞（EmbryonicStemCell，ESC）与成体干细胞（AdultStemCell，ASC）两大类，胚胎干细胞取自囊胚里的内细胞团；而成体干细胞则来自各式各样的组织。

成体干细胞，亦称成人干细胞，主要包括骨髓干细胞，脐带血干细胞及周边血干细胞。它们存在于成体特定的组织中，具有干原细胞形成先驱细胞，分化成具特定功能细胞的能力，例如：骨髓干细胞、造血干细胞和神经干细胞。

婴儿出生后遗留在胎盘和脐带中的血是干细胞的重要来源。脐带血中的造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤（如：急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和淋巴瘤等）、血红蛋白病（如：海洋性贫血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤（如：小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和进行性肌营养不良等）。自1988年脐血干细胞就用来治疗根达综合症、亨达综合症、和拉综合症和急性淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。截至2011年，脐带血不仅已能有效地治疗几十种难治性疾病和多种不治之症，而且它所能治疗的疾病种类还在不断地增加。自体储存的脐带血一旦需要使用时，不需配型，细胞活性强，无免疫排斥的危险，移植成活率高，治愈率高，医疗费用低。

在人脐带中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，MSCs还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。

目前常规培养间充质干细胞多用动物血清，动物血清因含有类似于体内环境条件下的多种促细胞生长营养成分和细胞因子，从而成为细胞培养的常规添加成分。常用血清为动物来源血清，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。

中国发明专利ZL200610067537.5公开了一种脐带间充质干细胞的制备方法，其步骤包括诸如：将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；再加入胰酶消化；消化液用筛网过滤，去除未消化组织；将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；离心；以及将细胞接种于培养基内进行培养等。

中国发明专利ZL201010568873.4公开了一种脂肪干细胞的分离培养方法，是将荧光激活流式细胞分类和磁激活细胞分选相结合分离培养高纯度脂肪干细胞的技术。分别采用免疫磁珠分选法（采用CD5、CD45R、CD11b、Anti-Gr-1及Ter-119为标记物）除去SVF细胞中的Lin+细胞，获得Lin-细胞群；和流式细胞分选法从获得的Lin-细胞群中富集CD271⁺Sca-1⁺细胞，得到脂肪干细胞；然后将获得的脂肪干细胞用含有LIF、FGF2的培养基培养；免疫磁珠分选法进行分选。

中国发明专利申请200910194915.X公开了一种脐带血间充质干细胞及其制备方法，分离并获取了具有成骨分化潜能的UCB-MSCs细胞亚群的干细胞。其技术手段主要涉及将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合后，通过流式细胞仪分选得到CD105阳性（CD105⁺）的脐带血间充质干细胞。该干细胞接种于医学上可接受的生物可降解材料，形成了骨移植物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，以提高细胞体外分离和扩增的数量。

本发明在现有的脐带血间充质干细胞分离和制备技术的基础上，对有关技术进行了改进，以适应对特定细胞标记的筛选的需要，配合使用同源血清培养后，在低氧环境下进行扩增，实现间充质干细胞的体外分离和大规模扩增制备。

本发明提供的一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：

先将清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05w/v%胶原酶于37℃消化后，清洗3次以上，而得脐带间充质细胞。用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育，之后用磷酸缓冲液清洗，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入二抗并孵育，再次用磷酸缓冲液液洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选。将所得到CD271⁺亚群细胞接种，加入浓度10v/v%的自体脐带血血清（含有浓度50ng/ml的热休克蛋白90），于37℃、5%CO₂扩增培养6天。

本发明提供的另一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：

脐带间充质细胞：

用清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05%胶原酶于37℃消化后，获得消化混合物。接着加入磷酸缓冲液清洗并于600g加速度离心15分钟，然后弃上清，再加入磷酸缓冲液，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，再经450g加速度离心10分钟，并重复4次，即得脐带间充质细胞。

细胞亚群的分选：

将获得的脐带间充质细胞记数，然后用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育30分钟；接着用磷酸缓冲液清洗后，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入荧光二抗，孵育30分钟；再次用磷酸缓冲液液洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选，得到CD271⁺亚群细胞。

细胞体外扩增培养：

CD271⁺亚群细胞接种，加入浓度10v/v%的自体脐带血血清（含有浓度50ng/ml的热休克蛋白90），于37℃、5%CO₂扩增培养6天。

本发明中，当磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）还含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素时，扩增所得细胞数量亦有显著增加。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，基于现有的间充质干细胞分离、培养和扩增技术，寻找到了显著提高冻存复苏后细胞培养数量的技术途径。

本发明通过人脐带间充质干细胞亚群的分离，得到了相对小亚群的间充质干细胞。在通过含有自体的脐带血血清的细胞培养基培养，进一步稳定了CD271⁺亚群细胞。最后在加入调节热休克蛋白90（HSP90）在细胞培养基中的使用浓度，以达到细胞体外扩增的最大数量。验证发现，由此培养出的细胞不但具有常规间充质干细胞的表面标志，而且细胞增殖能力也强于常规方法培养出的间充质干细胞。

附图说明

图1A为将分选获得的CD271^-MSC，采用含10v/v%FSB培养基培养3天后所呈现的间充质干细胞形态；

图1B为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10v/v%FSB培养基培养3天后所呈现的间充质干细胞形态；

图1C为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10v/v%自体脐带血血清培养基培养3天后所呈现的间充质干细胞形态；

图2A为将分选获得的CD271^-MSC，采用含10v/v%FSB培养基培养6天后所呈现的间充质干细胞形态；

图2B为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10v/v%FSB培养基培养6天后所呈现的间充质干细胞形态；

图2C为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10v/v%自体脐带血血清培养基培养6天后所呈现的间充质干细胞形态；

图3A为将分选获得的CD271^-MSC，采用含10v/v%FSB培养基培养9天后所呈现的间充质干细胞形态；

图3B为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10v/v%FSB培养基培养9天后所呈现的间充质干细胞形态；

图3C为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10v/v%自体脐带血血清培养基培养9天后所呈现的间充质干细胞形态；

图4A为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含10ng/mlHSP90的10v/v%FSB培养基培养6天后的细胞增殖情况；

图4B为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含25ng/mlHSP90的10v/v%FSB培养基培养6天后的细胞增殖情况；

图4C为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含50ng/mlHSP90的10v/v%FSB培养基培养6天后的细胞增殖情况；

图4D为将分选获得的CD271⁺MSC，采用含100ng/mlHSP90的10v/v%FSB培养基培养6天后的细胞增殖情况；

图5为将分选获得的CD271⁺MSC和CD271-MSC在10v/v%FBS培养下的增殖情况；

图6为将分选获得的CD271⁺MSC分别采用10v/v%FBS和10v/v%自体血清下培养的增殖情况；

图7为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml等浓度HSP90，对分选获得的CD271⁺MSC增殖的作用。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）公司。

实施例1

人脐带间充质干细胞的制备检测：

(1)将人脐带经过严格检测程序（ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等）确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm3-1.5mm3小碎块；

(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.05%的胶原酶10ml，置37℃消化1h获得消化后混合物；

(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素）至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；

(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素），重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复4次，即获得人脐带细胞；

(5)将获得人脐带细胞加入无菌流式细胞管，再加入CD34、CD14、CD45、CD90、CD29、CD、CD105和CD73荧光抗体，上流式细胞仪检测，表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19，鉴定为间充质干细胞。

实施例2

人脐带间充质干细胞CD271⁺细胞亚群和CD271^-细胞亚群在10v/v%FBS下的增殖培养：

(1)将人脐带经过严格检测程序（ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等）确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；

(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.05%的胶原酶10ml，置37℃消化1h获得消化后混合物；

(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素）至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；

(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素），重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复4次，即制备出准备用于流式细胞筛选的人脐带间充质干细胞；

(5)将获得的人脐带间充质干细胞加入无菌流式细胞管，在加入CD271⁺荧光抗体，上流式细胞仪，分选CD271⁺细胞亚群和CD271^-细胞亚群。

(6)将分选后的CD271⁺细胞亚群和CD271^-细胞亚群分成二组，每组按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10v/v%FBS（GibcoBRL,USA）的LG-DMEM（Gibco,USA）培养基，置37℃、5%CO₂培养箱培养，分别观察CD271-细胞亚群培养3天（图1A）、6天（图2A）和9天（图3A）和CD271⁺细胞亚群培养3天（图1B），6天（图2B），9天（图3B）细胞形态并计数（参见图5）。

实施例3

人脐带间充质干细胞CD271+细胞亚群在10v/v%人自体血清条件下的培养：

(1)将人脐带经过严格检测程序（ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等）确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；

(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.05w/v%的胶原酶10ml，置37℃消化1h获得消化后混合物；

(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素）至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；

(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素），重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复4次，即制备出准备用于流式细胞筛选的人脐带间充质干细胞；

(5)将获得的人脐带间充质干细胞加入无菌流式细胞管，在加入CD271⁺荧光抗体，上流式细胞仪，分选CD271⁺细胞；

(6)将分选后的CD271⁺细胞按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用10v/v%人自体来源脐带血血清作为培养基，置37℃、5%CO₂培养箱培养，分别观察培养3天（图1C）、6天（图2C）和9天（图3C）细胞形态并计数（参见图6）。

实施例4

人脐带间充质干细胞CD271+细胞亚群在10%人自体血清下分别加入10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/mlHPS90浓度培养细胞增殖情况：

(1)将人脐带经过严格检测程序（ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等）确认安全性后，由缓冲液反复冲洗，去除残留血液，用无菌刀具将其切割至约1mm³-1.5mm³小碎块；

(2)取小碎块10ml，置于50ml离心管中，加入0.05%的胶原酶10ml，置37℃消化1h获得消化后混合物；

(3)往消化后混合物中加入磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素）至充满50ml离心管，混匀，600g离心15min；

(4)弃上清，加入20ml磷酸缓冲液（pH=7.2-7.4，含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素），重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，450g离心10min，重复4次，即制备出准备用于流式细胞筛选的人脐带间充质干细胞。

(5)将收到到的人脐带间充质干细胞加入无菌流式细胞管，在加入CD271+荧光抗体，上流式细胞仪，分选CD271⁺细胞。

（6）将分选后的CD271⁺细胞分成四组，每组按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，分别用含10%自体来源人脐带血血清的LG-DMEM（Gibco,USA）培养基，置37℃、5%CO₂培养箱培养。同时在培养基中分别加入浓度分别为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的HPS90培养6天，细胞增殖情况参见图4A（10ng/ml）、图4B（25ng/ml）、图4C（50ng/ml）和图4D（100ng/ml），其细胞数量参见图7。由此可见，当HPS90浓度为50ng/ml时，培养6天后获得了最高的扩增细胞数量。

Claims (3)

1.一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：

先将清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05w/v％胶原酶于37℃消化后，清洗3次以上，而得脐带间充质细胞；用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育，之后用磷酸缓冲液清洗，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入二抗并孵育，再次用磷酸缓冲液清洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选；将所得到CD271⁺亚群细胞接种，加入浓度10v/v％的自体脐带血血清，于37℃、5％CO₂扩增培养6天；

所述的自体脐带血血清还含有浓度50ng/ml热休克蛋白90。

2.一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：

首先，脐带间充质细胞的获得：

用清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05％胶原酶于37℃消化后，获得消化混合物；接着加入磷酸缓冲液清洗并于600g加速度离心15分钟，然后弃上清，再加入磷酸缓冲液，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，再经450g加速度离心10分钟，并重复4次，即得脐带间充质细胞；

其次，细胞亚群的分选：

将获得的脐带间充质细胞记数，然后用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育30分钟；接着用磷酸缓冲液清洗后，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入荧光二抗，孵育30分钟；再次用磷酸缓冲液清洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选，得到CD271⁺亚群细胞；

最后，细胞体外扩增培养：

CD271⁺亚群细胞接种，加入浓度10v/v％的自体脐带血血清，于37℃、5％CO₂扩增培养6天；

所述的自体脐带血血清还含有浓度50ng/ml热休克蛋白90。

3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液还含有1w/v％青霉素和1w/v％链霉素。