CN115058391B

CN115058391B - 一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法

Info

Publication number: CN115058391B
Application number: CN202210989888.0A
Authority: CN
Inventors: 张学娟; 孙旭燕; 高宗圣
Original assignee: Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co ltd
Current assignee: Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co ltd
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115058391A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法。本发明的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其通过对人类脐带间充质干细胞进行低氧培养处理的相关工艺和质量控制标准进行明确，低氧处理结果显著增加了细胞存活期，显著提高了间充质干细胞中VEGF分泌水平，延长了细胞进入机体后可发挥效用作用的时间，进一步达到改善治疗效果的作用。

Description

一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是起源于生物体早期中胚层的一类多能干细胞，它们具有自我复制和向多种细胞系（向成脂、成软骨、成骨等）分化的潜能，是组织工程、再生医学和细胞治疗领域一种具有极高研究价值与应用前景的细胞类型。MSCs来源广泛，主要包括骨髓、脐带、脐带血、胎盘、外周血、牙髓、脂肪组织、肝脏和肺等，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）因为具有低免疫原性、易分离获取、少伦理争议等优点，在MSCs的研究中得到的应用越来越多。

研究表明间充质干细胞具有免疫调节功能，间充质干细胞可以分泌许多生物分子和介质，如细胞因子、外泌体等，这些分泌物质在细胞的免疫调节功能的发挥中起着重要作用，此外，MSCs可以抑制促炎细胞因子的分泌，可以调节树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞的细胞因子分泌，同时，其分泌的细胞因子可以诱导巨噬细胞向抗炎细胞的转变；MSCs具有较低的免疫原性，因为间充质干细胞缺乏细胞表面的HLA-DR和共同刺激分子抗原，如CD40、CD80和CD86等；以上特性赋予了MSCs在疾病中的许多治疗益处，如今，MSCs对病理性肺纤维化、脑缺血、急性肾功能衰竭、心肌梗死、急性肺损伤和阿尔茨海默病等等都有很好的治疗效果。

临床方面脐带间充质干细胞已经广泛应用于联合造血干细胞移植、自身免疫性疾病治疗、心血管疾病治疗、神经系统疾病治疗及缺血性疾病治疗。脐带间充质干细胞治疗已经从基础研究、动物实验逐步跨进了临床转化阶段，很多I、II期的研究也取得了鼓舞人心的成果，hUC-MSCs移植为许多疾病的治疗带来了希望，可以降低病死率，提高患者的生活质量。然而hUC-MSCs移植作为一项生物医学领域新技术，还不可避免面临许多问题比如：1、如何进一步确定hUC-MSCs的培养及鉴定标准；2.如何建立严格规范统一的hUC-MSCs质检标准；3.如何对hUC-MSCs的生物学功能稳定性和移植进入人体后的存活期进行加强。随着研究的深入，更多机理研究的数据在不断得到积累，通过对间充质干细胞进行低氧预处理后再移植在一些文献中有相关报道，但是，现有文献对于低氧处理的方式只做了笼统概述，低氧处理工艺细节性描述不详，低氧后的可用于移植细胞的质量控制标准不明确。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其通过对人类脐带间充质干细胞进行低氧培养处理的相关工艺和质量控制标准进行明确，低氧处理结果显著增加了细胞存活期，显著提高了间充质干细胞中VEGF分泌水平，延长了细胞进入机体后可发挥效用作用的时间，进一步达到改善治疗效果的作用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

A、将20%氧浓度条件下培养的P3代间充质干细胞收集后用培养基重悬；

B、传代培养至细胞汇合度达到60-70%时，将细胞转移至10%-1%氧浓度的低氧氧浓度条件下进行三阶段培养；

C、待细胞达到细胞汇合度达到90%后，使用溶媒收集细胞；

D、进行细胞因子检测，因子分泌浓度达到VEGF因子浓度高于1000pg/mL浓度的标准，即得到低氧型的间充质干细胞。

优选的，间充质干细胞的培养体系为无血清体系，无动物源成分。

优选的，间充质干细胞为人类脐带来源。

优选的，步骤A中，P3代间充质干细胞使用间充质干细胞培养体系进行重悬，吹打混匀，调整细胞终浓度为1×10⁵个/mL±1×10⁴个/mL。

优选的，步骤B中，传代培养的细胞接种浓度为2×10⁴个/cm²±1×10³个/cm² 。

优选的，步骤B中，低氧处理的方法具体为阶段性低氧处理，分为低氧阶段一：氧浓度为10%，处理时间2h；低氧阶段二：氧浓度为5%，处理时间4h；低氧阶段三：氧浓度为1%，培养至细胞可收集终点。

优选的，步骤C 中，收集细胞所用溶媒为0.9%生理盐水与人血清白蛋白组成，其中，人血清白蛋白所占体积分数为1%。

优选的，收获的间充质干细胞，其活率达到90%以上，细胞表型检测CD45，CD34，HLADR 为阴性，CD73，CD90，CD105为阳性且满足90%以上表达。

优选的，最终收获的细胞需进行细菌、真菌、内毒素、支原体、病毒项检测，并符合阴性结果。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

通过本发明的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法所收获的低氧培养型脐带间充质干细胞在细胞活率、细胞存活性能上显著提高，且细胞因子分泌水平显著提升，细胞移植后能更好地适应不同组织部位的低氧条件并发挥显著性治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为通过本发明的方法培养得到的低氧培养型脐带间充质干细胞的细胞存活数量比对图，包括低氧培养型脐带间充质干细胞（hypoxia-MSC）数量，常规培养方法（normal-MSC）的脐带间充质干细胞数量；

图2为通过本发明的方法培养得到的低氧培养型脐带间充质干细胞的细胞活率比对图，包括低氧培养型脐带间充质干细胞活率和常规培养方法的脐带间充质干细胞活率；

图3为不同批次低氧间充质干细胞的VEGF因子分泌水平示意图；

图4为低氧型间充质干细胞表型鉴定示意图；

图5为不同氧浓度下细胞VEGF因子分泌水平示意图；

图6为不同氧处理工艺下细胞功能性评价指标示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1：

首先，本实施例提供一种常规脐带间充质干细胞的培养方法，其包括以下过程：

（1）复苏冻存的P3代脐带间充质干细胞，在T75培养瓶中，使用间充质干细胞培养体系，于5% CO₂、37℃条件下进行培养至细胞汇合度达到100%；

（2）在培养瓶中加入2mL 胰酶，轻轻晃动培养瓶使酶液完全铺展于培养瓶底，将培养瓶置于37℃进行消化5min；

（3）轻轻拍打培养瓶壁，显微镜下观察细胞变圆并脱离培养瓶壁；

（4）使用移液管在培养瓶中加入10mL盐水，吹打混匀重悬细胞；

（5）细胞重悬后，用移液管吸取1mL重悬液进行细胞计数；

（6）收集细胞悬液于50mL离心管中；

（7）1200 rpm离心5min，弃掉上清，收集细胞沉淀并使用专门细胞溶媒进行重悬收集。

接下来，本实施例提供一种本发明的低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其包括以下步骤：

（2）收集细胞培养上清液于离心管中，-80℃冻存，以备后期进行细胞因子检测；

（3）用移液管吸掉剩余细胞培养上清液，收集于专门的回收瓶中；

（4）在培养瓶中加入2mL 胰酶，轻轻晃动培养瓶使酶液完全铺展于培养瓶底，将培养瓶置于37℃进行消化5min；

（5）轻轻拍打培养瓶壁，显微镜下观察细胞变圆并脱离培养瓶壁；

（6）使用移液管在培养瓶中加入10mL盐水，吹打混匀重悬细胞；

（7）细胞重悬后，用移液管吸取1mL重悬液进行细胞计数；（8）收集细胞悬液于50mL离心管中；

（9）1200rpm离心5min，弃掉上清，收集细胞沉淀；

（10）使用间充质干细胞培养体系重悬细胞，吹打混匀，调整细胞终浓度为1×10⁵/mL±1×10⁴/mL；

（11）按照2×10⁴个/cm²±1×10³个/cm² 细胞密度数接种于培养瓶中；

（12）于5% CO₂、37℃条件下进行培养，培养2天时间，此时细胞贴壁且汇合度基本达到60%；

（13）将培养箱氧浓度条件设置为10% 低氧浓度条件下进行培养2h，然后设置低氧浓度条件为5% 培养4h，最后设置氧浓度为1% ；

（14）培养2天左右时间，此时细胞汇合度基本达到90% ；

（15）在培养瓶中加入2mL 胰酶，轻轻晃动培养瓶使酶液完全铺展于培养瓶底，将培养瓶置于37℃进行消化5min；

（16）轻轻拍打培养瓶壁，显微镜下观察细胞变圆并脱离培养瓶壁；

（17）使用移液管在培养瓶中加入10mL盐水，吹打混匀重悬细胞；

（18）细胞重悬后，用移液管吸取1mL重悬液进行细胞计数；

（19）收集细胞悬液于50mL离心管中；

（20）1200rpm离心5 min，弃掉上清，收集细胞沉淀并使用专门细胞溶媒进行重悬；

（21）将悬好的细胞制剂转移至专用的细胞运输袋中，并进行相关的临床应用。

经过以上方法，得到的细胞数目及活性检测过程如下：

（1）收集低氧处理的脐带MSCs，溶媒重悬；

（2）使用移液器吸取20ul的脐带间充质干细胞制剂，按照1:1比例加入台盼蓝染色进行细胞计数，并进行活率检测；

（3）整个实验操作于超净工作台中进行，实验中注意使用75% 酒精进行消毒。

验证低氧培养的脐带间充质干细胞在细胞活性方面均显著高于常规培养的间充质干细胞，结果见图2。

流式细胞仪检测细胞表面标记物，具体过程如下：

（1）收集低氧处理的间充质干细胞，用生理盐水重悬并收集细胞于离心管中，用100μm筛网过滤，然后调整细胞密度至1×10⁶个/mL；

（2）取100μL的细胞悬液，然后加入20μL对应的流式抗体（ CD45，CD34，CD73，CD90，CD105，HLA-DR），室温下避光孵育15min；

（3）加入1mL的生理盐水重悬，然后1200rpm离心5min以洗涤去除抗体背景干扰；

（4）弃上清后加入400μL鞘液重悬，使用BD FACS Calibur流式细胞仪进行检测，然后进行数据分析。

验证低氧型脐带间充质干细胞在表型和功能方面并未发生改变，结果见图4。

低氧处理后的细胞在VEGF的分泌水平上得到加强，平均水平为1000pg/mL左右，不同批次的低氧处理组间存在差异，可能与细胞对低氧的反应性不同导致，VEGF的增强对于缺氧缺血性疾病产生显著性的治疗帮助。

VEGF细胞因子检测过程如下：通过VEGF细胞因子检测试剂盒进行相关因子含量检测，结果见图3。

表型结果显示细胞在进行低氧处理后依然保持原MSC的表型标志，未发生变化，结果见图4。

细胞体外存活检测，结果见图1、图2：(1)收集对照组、低氧组的MSCs，将不同实验组培养的细胞(5×10⁵细胞/cm²)接种到12孔板中，培养过夜使细胞贴壁；将培养基改为基础培养基(不含血清替代物和添加因子)，不换液，连续培养12天-15天，胰蛋白酶处理分离细胞，每隔3天用细胞计数仪进行计数，并通过血细胞计数仪进行计数对比。

由图1和图2结果可见，与常规培养对照组相比，低氧组细胞存活期显著延长20%左右，表明在经过低氧条件处理后，细胞耐受性能得到改善，能更好地适应环境。

实施例2：

本实施例提供一种脐带间充质干细胞的低氧工艺确定培养方法：

一、细胞复苏培养：（1）复苏冻存的P3代脐带间充质干细胞，在T75培养瓶中，使用间充质干细胞培养体系，于5% CO₂、37℃条件下进行培养至细胞汇合度达到100%；

（7）细胞重悬后，用移液管吸取1mL重悬液进行细胞计数；

（8）收集细胞悬液于50mL离心管中；

（9）1200rpm离心5min，弃掉上清，收集细胞沉淀；

（10）使用间充质干细胞培养体系重悬细胞，吹打混匀，调整细胞终浓度为1×10⁵个/mL±1×10⁴个/mL；

（11）按照2×10⁴个/cm²±1×10³个/cm²细胞密度数接种于培养瓶中；

（12）于5% CO₂、37℃条件下进行培养，培养2天时间，此时细胞贴壁且汇合度基本达到60% ；

低氧处理一：细胞培养在培养箱37℃+5% CO₂条件下，分别在氧水平(20%，10%，5%或1% O₂)低氧预处理MSCs 48h、72h，通过注入氮气建立培养条件（三气培养箱）。具体实验组如下：（实验结果见图5。）

不同氧浓度的摸索实验中，1%的氧浓度条件下细胞分泌VEGF因子水平是最高的，且分泌量随时间递增。

低氧处理二：

将细胞复苏培养部分的细胞放到培养箱，对照组直接调节氧气浓度为1%，培养3天时间；实验组培养箱氧浓度设置为10% 低氧浓度条件下进行培养2h，然后设置低氧浓度条件为5% 培养4h，最后设置氧浓度为1%；待培养3天左右时间，此时2组细胞汇合度基本达到90%；

消化细胞收集，用移液管吸取1mL重悬液进行细胞计数并检测相关上清中因子水平。每组设置三个平行。

参照实施例1进行细胞存活实验。

如附图6所示，不同氧处理工艺的比较实验中，采用直接低氧处理和阶段性低氧处理两种工艺方法，阶段性氧处理工艺条件下细胞的各项功能都有所加强，细胞活率增强20%，因子分泌水平增强60%，细胞存活期延长近30%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

A、将20%氧浓度条件下培养的P3代间充质干细胞收集后使用间充质干细胞培养体系重悬，吹打混匀，调整细胞终浓度为1×10⁵个/mL±1×10⁴个/mL；所述的间充质干细胞的培养体系为无血清体系，无动物源成分；所述间充质干细胞为人类脐带来源；

B、传代培养至细胞汇合度达到60-70%时，将细胞转移至10%-1%氧浓度的低氧氧浓度条件下进行三阶段培养；分为低氧阶段一：氧浓度为10%，处理时间2h；低氧阶段二：氧浓度为5%，处理时间4h；低氧阶段三：氧浓度为1%，培养至细胞可收集终点；传代培养的细胞接种浓度为2×10⁴个/cm²±1×10³个/cm²；

C、待细胞达到细胞汇合度达到90%后，使用溶媒收集细胞；收集细胞所用溶媒为0.9%生理盐水与人血清白蛋白组成，其中，人血清白蛋白所占体积分数为1%；

2.根据权利要求1所述的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，收获的间充质干细胞，其活率达到90%以上，细胞表型检测CD45、CD34、HLA-DR 为阴性，CD73、CD90、CD105为阳性且满足90%以上表达。

3.根据权利要求1所述的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，最终收获的细胞需进行细菌、真菌、内毒素、支原体、病毒项检测，并符合阴性结果。