CN111534484A - 一种制备cd106高表达间充质干细胞的方法、间充质干细胞及其应用和定向培养基 - Google Patents

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Abstract

一种制备CD106高表达间充质干细胞的方法，包括，第一步骤S1，获取足量脐带间充质干细胞(UC‑MSCs)，作为第一间充质干细胞；第二步骤S2，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养，得到第二间充质干细胞，所述定向培养基至少包括，IL‑1β：5‑15ng/mL，IL‑4：5‑15ng/mL，IFN‑γ：10‑30ng/mL。本发明中第二间充质干细胞80％以上比例细胞为表达CD106的UC‑MSCs，且不影响间充质干细胞相关免疫标志分子的表达，尤其是HLA‑DR不表达；第二间充质干细胞的体外成脂、成骨、成软骨分化能力部分增强，并且具有更好的成血管和抑制淋巴细胞增殖的能力，移植后可以增强再生障碍性贫血疾病模型小鼠的造血重建。

Description

一种制备CD106高表达间充质干细胞的方法、间充质干细胞及 其应用和定向培养基
技术领域
本发明总体涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种制备CD106 高表达间充质干细胞的方法、间充质干细胞及其应用和定向培养基。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cells，MSCs)具有造血支持和免疫调节的独特属性，并且在体外可定向诱导向成脂、成骨和成软骨分化，因此在组织修复和多系统疾病治疗中具有良好的应用前景。CD106，又称为血管细胞黏附分子-1(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)，作为一种跨膜糖蛋白，CD106的表达主要与免疫应答调节和促血管新生功能相关。
多种组织来源的MSCs均含有较低比例的CD106阳性细胞，例如骨髓、脐带、胎盘绒毛膜等。同时，在再生障碍性贫血骨髓来源的MSCs中， CD106含量异常低，存在多种生物学功能缺陷，尤其是免疫抑制功能显著降低。研究发现，高活性CD106阳性MSCs具有较强的免疫调节和促血管新生能力。因此，有效提高CD106在MSCs的表达丰度，将会使MSCs具有更强的免疫调节和促血管新生能力。
现有技术中记载，利用IL-1或IL-4均可刺激脐静脉血管内皮细胞系 HUVEC中CD106的表达(FEBS Letters 372(1995)194-198)。荷兰学者则利用IL-4和IFN-γ处理人的肺成纤维细胞，证实二者对于CD106的表达存在调控机制差异(Eur Respir J 1999；14:759–766)。2010年，Ren等学者发现，INF-γ刺激可促进小鼠骨髓来源间充质干细胞中CD106的表达，并进一步增强MSCs的免疫抑制功能，但是，采用上述方法时，或是整体CD106 的表达水平不高，或是生产效率低，或是会同时促进HLA-DR的表达丰度，导致影响免疫排斥方面的功能。
因此，提供一种制备间充质干细胞的方法，使CD106高表达且消除免疫排斥等副作用，是亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种制备CD106高表达间充质干细胞的方法，包括，第一步骤S1，获取足量脐带间充质干细胞(UC- MSCs)，作为第一间充质干细胞；第二步骤S2，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养，得到第二间充质干细胞，所述定向培养基至少包括， IL-1β：5-15ng/mL，IL-4：5-15ng/mL，IFN-γ：10-30ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β：10- 15ng/mL，IL-4：5-10ng/mL，IFN-γ：15-25ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β： 10ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：15ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β： 10ng/mL，IL-4：10ng/mL，IFN-γ：20ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述第一步骤S1包括，将脐带间充质干细胞(UC-MSCs)扩增传代，采用第3-8代，融合度范围为30-40％的细胞作为所述第一间充质干细胞。
根据本发明的一个实施方式，所述第一步骤S1中，扩增传代所述脐带间充质干细胞的扩增培养基包括，10％胎牛血清、DMEM-F12培养基、10 ng/ml EGF和4ng/ml bFGF。
根据本发明的一个实施方式，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养48小时以上。
根据本发明的一个实施方式，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养72小时。
根据本发明的一个实施方式，所述第二间充质干细胞的CD106阳性间充质干细胞比例达到80％以上。
根据本发明的一个方面，提供了一种定向培养基，所述定向培养基至少包括，IL-1β：5-15ng/mL，IL-4：5-15ng/mL，IFN-γ：10-30ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β：10- 15ng/mL，IL-4：5-10ng/mL，IFN-γ：15-25ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β： 10ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：15ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β： 10ng/mL，IL-4：10ng/mL，IFN-γ：20ng/mL。
根据本发明的另一个方面，提供了一种间充质干细胞，所述间充质干细胞采用上述方法制备。
根据本发明的再一个方面，提供了一种间充质干细胞在制药中的应用，所述间充质干细胞采用上述方法制备。
本发明中，经过所述定向培养基的培养后，最终获得的第二间充质干细胞，其中80％以上比例细胞为表达CD106的UC-MSCs，且不影响间充质干细胞相关免疫标志分子的表达(CD73、CD90、CD105、CD151、CD34、 CD45、HLA-DR)，尤其是HLA-DR不表达。相较于处理前的UC-MSCs，第二间充质干细胞的体外成脂、成骨、成软骨分化能力部分增强，并且在具有更好的成血管和抑制淋巴细胞增殖的能力，移植后可以增强再生障碍性小鼠模型小鼠的造血重建。重要的是，包括IL-6、IL-8、CCL2、CXCL2、 IDO-1在内的多种细胞因子，在上述制备的脐带来源CD106阳性MSCs中表达升高，而促炎因子TGF-β1表达显著降低。
附图说明
图1是一种制备CD106高表达丰度间充质干细胞的方法步骤示意图；
图2是脐带来源间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例对比图；
图3是脐带来源间充质干细胞中CD106阳性细胞的形态对比图；
图4是脐带来源间充质干细胞流式细胞表型对比图；
图5是脐带来源间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化染色对比图；
图6是脐带来源间充质干细胞中多种细胞因子和IDO-1的相对mRNA 表达比较，以及分泌到培养上清中的IL-6和TGF-β1蛋白表达浓度比较图；
图7是脐带来源间充质干细胞Matrigel体内移植成管实验对比图；
图8是脐带来源间充质干细胞治疗再生障碍性贫血小鼠的模式图和骨组织切片H&E染色对比；以及
图9是单独添加一种或两种细胞因子与本发明中按照特定配比同时加入三种细胞因子的对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，参考标号是指本发明中的组件、技术，以便本发明的优点和特征在适合的环境下实现能更易于被理解。下面的描述是对本发明权利要求的具体化，并且与权利要求相关的其它没有明确说明的具体实现也属于权利要求的范围。
图1示出了一种制备CD106高表达丰度间充质干细胞的方法步骤示意图。
如图1所示，一种制备CD106高表达丰度间充质干细胞的方法，包括，第一步骤S1，获取足量脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，作为第一间充质干细胞；第二步骤S2，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养，得到第二间充质干细胞，所述定向培养基至少包括，IL-1β：5- 15ng/mL，IL-4：5-15ng/mL，IFN-γ：10-30ng/mL。
本发明优选脐带来源的间充质干细胞作为原料，主要基于脐带来源的间充质干细胞具有更强的长期增殖、抗衰老和免疫调节的功能且无伦理学风险。由此产出的第二间充质干细胞具有更好的稳定性。本发明还可以采用其他来源的间充质干细胞作为原料，例如骨髓来源的间充质干细胞等。
在获取所述第一间充质干细胞时，将脐带间充质干细胞(UC-MSCs) 扩增传代，采用第3-8代。例如：将脐带组织分离培养制备的UC-MSCs接种至细胞培养瓶中，于UC-MSCs培养基(10％胎牛血清、DMEM-F12培养基、10ng/ml EGF和4ng/ml bFGF)中贴壁培养，每三天换液一次，至细胞融合度达到80％-90％；以0.25％胰蛋白酶消化UC-MSCs并按照1：3传代培养接种至细胞培养瓶中。
然后以1×105个细胞/孔的密度将UC-MSC接种入六孔板，贴壁培养24 小时。镜下观察MSC密度，当细胞融合度达到30-40％或40％-60％后取用。
UC-MSCs培养基是指基础培养基，可以采用10％胎牛血清、DMEM- F12培养基、10ng/ml EGF和4ng/ml bFGF，或者还可以采用现有的或将来发明的具有基础营养环境的其他基础培养基。
所述定向培养基是指在基础培养基的基础上增加一定量的细胞因子，所添加的细胞因子的种类及其含量范围为白介素IL-1β：5-15ng/mL，白介素 IL-4：5-15ng/mL，干扰素IFN-γ：10-30ng/mL。
例如，制备含有不同细胞因子的UC-MSCs培养基(10％胎牛血清、 DMEM-F12培养基、EGF和bFGF)，并向其中添加细胞因子：IL-1β：
10ng/mL，IL-4：10ng/mL，IFN-γ：20ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养48小时以上。
根据本发明的一个实施方式，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养72小时。
本发明中，将第一间充质干细胞在所述定向培养基中培养48小时即可较为明显的提高CD106阳性间充质干细胞比例，定向培养72小时则所述第二间充质干细胞的CD106阳性间充质干细胞比例可以达到80％以上。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种定向培养基，所述定向培养基至少包括，IL-1β：5-15ng/mL，IL-4：5-15ng/mL，IFN-γ：10-30ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β：10- 15ng/mL，IL-4：5-10ng/mL，IFN-γ：15-25ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β： 10ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：15ng/mL。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β：10ng/mL，IL-4：10ng/mL，IFN-γ：20ng/mL。
根据本发明的另一个方面，提供了一种间充质干细胞，所述间充质干细胞采用上述方法制备。
根据本发明的另一个方面，提供了一种间充质干细胞在制药中的应用，所述间充质干细胞采用上述方法制备。
本发明中，经过所述定向培养基的培养后，最终获得的第二间充质干细胞，其中80％以上比例细胞为表达CD106的UC-MSCs，且不影响间充质干细胞相关免疫标志分子的表达(CD73、CD90、CD105、CD151、CD34、 CD45、HLA-DR)，尤其是HLA-DR不表达。相较于处理前的UC-MSCs，第二间充质干细胞的体外成脂、成骨、成软骨分化能力部分增强，并且在具有更好的成血管和抑制淋巴细胞增殖的能力，移植后可以增强再生障碍性贫血疾病模型小鼠的造血重建。重要的是，包括IL-6、IL-8、CCL2、 CXCL2、IDO-1在内的多种细胞因子，在上述制备的脐带来源CD106阳性 MSCs中表达升高，而促炎因子TGF-β1表达显著降低。
根据本发明的一个实施方式，所述定向培养基至少包括IL-1β：10- 15ng/mL，IL-4：5-10ng/mL，IFN-γ：15-25ng/mL。
本发明中，尤其针对脐带来源的间充质干细胞，定向培养基中三种细胞因子的浓度范围在IL-1β：10-15ng/mL，IL-4：5-10ng/mL，IFN-γ：15- 25ng/mL时，所获得的第二间充质干细胞的性能更佳。
实施例1.
细胞培养与接种：将脐带组织分离培养制备的UC-MSCs接种至T25细胞培养瓶中，于UC-MSCs培养基(10％胎牛血清、DMEM-F12培养基、10 ng/ml EGF和4ng/ml bFGF)中贴壁培养，每三天换液一次，至细胞融合度达到80％-90％；以0.25％胰蛋白酶消化UC-MSCs并按照1：3传代培养接种至T25细胞培养瓶中。以1×105个细胞/孔的密度将UC-MSC接种入六孔板，贴壁培养24小时。
定向培养基的配制：提前准备含有不同细胞因子的UC-MSCs培养基 (10％胎牛血清、DMEM-F12培养基、EGF和bFGF)，其中添加的因子和终浓度分别为：IL-1β：10ng/mL，IL-4：10ng/mL，IFN-γ：20ng/mL。
定向培养：镜下观察MSC密度，当细胞融合度达到30-40％后，按照实验分组将原有的旧培养基更换为含有细胞因子的定向培养基，对照组细胞中不加入细胞因子，仅更换新的DMEM/F12完全培养液。
以流式细胞分析进行MSC免疫表型鉴定：收集未处理组(UC-MSCs培养基培养)和处理组(上述处理培养基培养)培养72小时的七管2×105细胞样品，以磷酸盐缓冲液(1×PBS)重悬到200μL。分别标记国际上通用的间充质干细胞鉴定的标记分子(CD73、CD105、CD151、CD34、CD45、 HLA-DR)和CD106，以BD公司FACS Calibur流式细胞分析仪进行检测和分析。
图2示出了脐带来源间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例对比图。
其中纵坐标为SSC(侧向角)，横坐标为CD106 PE的荧光强度。
如图2所示，左侧为处理前，间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为2.39％。右侧为处理后，间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为 79.5％。可见，相对于未处理的UC-MSCs(NT-MSCs)，处理的UC-MSC (添加IL-1β、IL-4和IFN-γ处理3天)中CD106阳性细胞比例明显提高。
图3示出了脐带来源间充质干细胞中CD106阳性细胞的形态对比图。
其中，左侧为处理前，右侧为处理后，如图3所示，处理前、后CD106 阳性细胞均呈现典型的长梭样细胞形态。本发明的定向培养基使得间充质干细胞保持了良好的稳定形态。
图4示出了脐带来源间充质干细胞流式细胞表型对比图。
在如4中，上方为处理前，下方为处理后，将间充质干细胞相关免疫标志分子的表达作出对比，包括，CD73、CD90、CD105、CD151、CD34、 CD45、HLA-DR。
流式细胞分析MSCs的免疫表型表明，上述未处理的和处理的UC- MSCs均高表达MSCs标志分子CD73、CD90、CD105、CD151比例均超过 95％，而CD34、CD45、HLA-DR比例均低于1％。可见，本发明的定向培养基不影响间充质干细胞相关免疫标志分子的表达。
图5示出了脐带来源间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化染色对比图。
其中，左侧为处理前，右侧为处理后，成脂(上方)、成骨(中间)和成软骨(下方)。
成脂肪、成骨和成软骨分化过程如下：按照5×104细胞/孔接种于六孔 Corning公司细胞贴壁培养板，待MSCs贴壁生长至细胞融合度达到80％- 90％，然后弃去UC-MSCs培养基进行下述体外诱导分化。
成脂分化诱导体系：体外诱导成脂分化采用更换Stem Cell公司 MensenCult成脂分化培养基，每隔3-4天更换一次新鲜的成脂分化培养基，连续培养至第21天。以10％中性甲醛室温固定细胞30分钟，随后弃去固定液，PBS清洗细胞3次。加入油红O染色液，37℃条件下染色30-60分钟后，弃去染色液，PBS清洗细胞3次。倒置显微镜下观察细胞，可见红染脂滴，随即拍照记录。
成骨分化诱导体系：体外诱导成骨分化采用更换Stem Cell公司 MensenCult成骨分化培养基，每隔3-4天更换一次新鲜的成骨分化培养基，连续培养至第21天。以甲醛：丙酮＝1:1的比例配制固定液，室温固定细胞 10分钟，加入0.5％茜素红染色液，37℃条件下染色30-60分钟后，弃去染色液，PBS清洗细胞3次。倒置显微镜下观察细胞，可见红染的矿物质结节，随即拍照记录。
成软骨分化诱导体系：体外诱导成骨分化采用更换Stem Cell公司 MensenCult成软骨分化培养基，每隔3-4天更换一次新鲜的成软骨分化培养基，连续培养至第21天。以4％多聚甲醛室温固定细胞30分钟后，去离子水清洗细胞2次。加入阿尔新蓝染色液，37℃条件下染色12小时，弃去染色液，去离子水清洗细胞2次。倒置显微镜下观察细胞，可见红染的矿物质结节，随即拍照记录。
如图5所示，体外成脂、成骨和成软骨分化特异性染色显示，处理后制备的CD106阳性UC-MSCs三系分化功能得到一定程度的增强。
图6示出了脐带来源间充质干细胞中多种细胞因子(IL-6，IL-8，IL- 10，TGF-β1)和IDO-1的相对mRNA表达比较，以及分泌到培养上清中的 IL-6和TGF-β1蛋白表达浓度比较，纵坐标为对应mRNA或蛋白(单位： pg/ml)的相对表达浓度；其中。左侧为处理前，右侧为处理后。
检测步骤如下：收集未处理组(UC-MSCs培养基培养)和处理组(上述处理培养基培养)培养72小时的七管2×105细胞和培养上清样本，分别进行MSCs表达和分泌细胞因子的检测。
MSCs表达的细胞因子检测：按照Trizol法提取细胞总mRNA。即按照使用说明书进行细胞总mRNA的提取。mRNA逆转录生成cDNA按照北京全式金公司
Figure BDA0002492786020000091
cDNA合成试剂盒完成此反应。MSCs表达的细胞因子检测使用国际上ABI公司SYBR Green PCR MasterMix完成PCR检测。根据ABI Q6软件分析扩增数据，使用2-ΔΔCT法进行定量分析。
MSCs分泌的细胞因子检测：MSCs培养上清中IL-6和TGF-β1的含量测定，按照酶联免疫吸附实验(ELISA)原理进行检测，均使用欣博盛公司试剂盒参照产品说明书进行检测。结果分析使用Microsoft公司Excel软件分析。
如图6所示，处理后相对于处理前间充质干细胞表达IL-6、IL-8和 IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
图7示出了脐带来源间充质干细胞Matrigel体内移植成管实验对比。
其中左侧为处理前，右侧为处理后。
MSCs成血管能力Matrigel体内移植检测过程：体内Matrigel血管新生实验，提前将实验所需的Matrigel置于4℃冰箱过夜融化。使用100μL 1× PBS重悬1×106个MSC，并与400μL融化的冰Matrigel混合。将MSC- Matrigel混合物注射入6周龄雌性裸鼠背侧皮下。第21天处死小鼠，取出 Matrigel块，测量组织块大小并拍照记录。随后10％中性甲醛固定48-72小时后，送至病理检测室制作石蜡切片，并进行H&E染色。正置显微镜下观察组织切片，并统计Matrigel块中新生血管的数目。
体内Matrigel移植实验显示，Matrigel块中可见形成典型的管状结构，制备的CD106阳性UC-MSCs体内成血管的功能得到部分增强。
图8示出了脐带来源间充质干细胞治疗再生障碍性贫血小鼠的模式图和骨组织切片H&E染色对比。其中，左侧为处理前，右侧为处理后。
MSCs体内移植治疗再生障碍性贫血小鼠模型检测采用以下步骤：再生障碍性贫血模型的建立采用8周龄雄性C57BL/6小鼠和CByB6F1小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)。
将CByB6F1受体小鼠随机分为四组：
(1)TBI(Total body irradiation)对照组：仅进行5Gy X射线照射；
(2)疾病模型组：再生障碍性贫血模型小鼠，不进行细胞移植；
(3)NT-MSC治疗组：再生障碍性贫血模型小鼠，移植未处理的UC- MSC；
(4)CD106阳性UC-MSC治疗组：再生障碍性贫血模型小鼠，移植上述CD106阳性的UC-MSCs。
疾病模型建立后第14天，处死各组小鼠，收集胸骨组织置于10％中性甲醛中固定48-72小时后，标本送至病理检测室制备石蜡切片，同时进行 H&E染色。
体内移植疾病模型小鼠实验显示，制备的CD106阳性UC-MSCs比处理前可以显著改善再生障碍性贫血骨髓造血重建。
实施例2.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：10ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：15ng/mL；CD34、 CD45、HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达 IL-6、IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为80.3％。
实施例3.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：5ng/mL，IL-4：5ng/mL，IFN-γ：10ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为72.6％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例4.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：15ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：30ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为81.4％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例5.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：5ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：10ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为81.4％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例6.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：15ng/mL，IL-4：5ng/mL，IFN-γ：10ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为78.6％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例7.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：5ng/mL，IL-4：5ng/mL，IFN-γ：30ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为76.6％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例8.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：15ng/mL，IL-4：5ng/mL，IFN-γ：30ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为77.4％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例9.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：15ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：10ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为80.7％；CD34、CD45、 HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达IL-6、 IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
实施例10.
在本实施例中，其他条件与实施例1相同，不同之处在于所述定向培养基至少包括IL-1β：5ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：25ng/mL。
得到间充质干细胞中CD106阳性细胞的比例为80.04％；CD34、 CD45、HLA-DR比例低于1％；s三系分化功能得到一定程度的增强；表达 IL-6、IL-8和IDO-1的水平以及分泌IL-6和TGF-β1的能力均得到提高。
对比例1.
图9示出了单独添加一种或两种细胞因子与本发明中按照特定配比同时加入三种细胞因子的对比图。
在脐带来源hUC-MSCs扩增培养基中，分别添加1种、2种或3种细胞因子处理hUC-MSCs 72小时，对于CD106阳性hUC-MSCs细胞群体产生比例的促进作用。
结果表明，单独或联合添加上述细胞因子均可在不同程度上提高hUC- MSCs中CD106阳性细胞群体的产生，但是，即使将IL-1β、IL-4、IFN-γ单独添加的效果叠加，或者将任一种的促进效果与其他两者混加的效果叠加，都不如本发明中的技术方案促进效果显著，因此，本发明的技术方案相对于三种细胞因子所起的促进效果的简单叠加来说，其效果更好，且克服了免疫排斥方面的缺陷。
本发明中，经过所述定向培养基的培养后，最终获得的第二间充质干细胞，其中80％以上比例细胞为表达CD106的UC-MSCs，且不影响间充质干细胞相关免疫标志分子的表达(CD73、CD90、CD105、CD151、CD34、 CD45、HLA-DR)，尤其是HLA-DR不表达。相较于处理前的UC-MSCs，第二间充质干细胞的体外成脂、成骨、成软骨分化能力部分增强，并且在具有更好的成血管和抑制淋巴细胞增殖的能力，移植后可以增强再生障碍性小鼠模型小鼠的造血重建。重要的是，包括IL-6、IL-8、CCL2、CXCL2、 IDO-1在内的多种细胞因子，在上述制备的脐带来源CD106阳性MSCs中表达升高，而促炎因子TGF-β1表达显著降低。
且细胞具有高免疫抑制和成血管活性，可用于制备和治疗移植物抗宿主病、再生障碍性贫血等自身免疫性疾病和血管性病变相关疾病的间充质干细胞制剂。
应该注意的是，上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制，并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求的范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。

Claims (10)

1.一种制备CD106高表达间充质干细胞的方法，包括，
第一步骤(S1)，获取足量脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，作为第一间充质干细胞；
第二步骤(S2)，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养，得到第二间充质干细胞，所述定向培养基至少包括，IL-1β：5-15ng/mL，IL-4：5-15ng/mL，IFN-γ：10-30ng/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，所述定向培养基至少包括IL-1β：10-15ng/mL，IL-4：5-10ng/mL，IFN-γ：15-25ng/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，所述定向培养基至少包括IL-1β：10ng/mL，IL-4：15ng/mL，IFN-γ：15ng/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，所述定向培养基至少包括IL-1β：10ng/mL，IL-4：10ng/mL，IFN-γ：20ng/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养48小时以上。
6.根据权利要求1所述的方法，将所述第一间充质干细胞在定向培养基中培养72小时。
7.根据权利要求1所述的方法，所述第二间充质干细胞的CD106阳性间充质干细胞比例达到80％以上。
8.一种定向培养基，所述定向培养基至少包括，IL-1β：5-15ng/mL，IL-4：5-15ng/mL，IFN-γ：10-30ng/mL。
9.一种间充质干细胞，所述间充质干细胞采用权利要求1-7所述的方法制备。
10.一种间充质干细胞在制药中的应用，所述间充质干细胞采用权利要求1-7所述的方法制备。
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