CN115025123A - 肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用。本发明的所述肝巨噬细胞调节剂包含肝源细胞的培养上清，所述肝源细胞的培养上清能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应。

Description

肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前最常见的慢性肝脏疾病之一。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的炎性亚型，在组织学上表现为：肝脂肪变性、小叶炎症、肝细胞球囊增生以及其他肝细胞受损，伴有或不伴有纤维化。在没有过量饮酒的情况下，发生与酒精性脂肪性肝炎(ASH)相似的组织学变化，并有可能发展为肝硬化及其并发症。
大量的实验和临床数据支持巨噬细胞在NAFLD和NASH的发生和发展中的核心作用。通常，巨噬细胞的活化通过在宿主免疫的早期吞噬病原体并分泌细胞因子或介体来起到保护作用。然而，持续刺激会导致细胞死亡，肝损伤和相关疾病。
目前尚无批准的NASH治疗方法。在NASH的所有方面中，尽管在了解疾病流行病学，病理生理学和确定治疗目标方面取得了稳步进展，但在治疗领域进展最为缓慢。即使在全球进行了多年的深入研究之后，目前也没有批准的药物可用于其治疗。
因此，有必要开发新型的肝巨噬细胞调节剂以解决现有技术中存在的上问题。
发明内容
本发明的目的在于一种肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用，以能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应对NASH起到治疗作用。
为实现上述目的，本发明的所述肝巨噬细胞调节剂包含肝源细胞的培养上清，所述肝源细胞的培养上清能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应。
优选的，所述肝源细胞的培养上清包含抑制成分，以抑制M1型巨噬细胞的炎性活化。
优选的，所述肝源细胞的培养上清包含促进成分，以促进M2型巨噬细胞产生。
优选的，所述肝源细胞的培养上清包含所述肝源细胞分泌的外泌体。
优选的，所述肝源细胞为肝前体细胞或肝前体样细胞。
优选的，所述肝巨噬细胞调节剂还包括重悬成分，所述重悬成分包括生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
本发明的所述肝巨噬细胞调节剂的制备方法包括：使用体外培养基对所述肝源细胞进行体外培养后，从得到的培养产物中获取所述肝源细胞的培养上清。
优选的，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12细胞培养基、HepX培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
优选的，所述肝源细胞的制备方法包括，使用肝细胞增殖培养基对原代肝细胞进行体外培养；所述肝细胞增殖培养基包括基础培养基、无血清添加物、血清类物质、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂和ROCK激酶抑制剂；
以占所述基础培养基的含量计，所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述血清类物质的含量不超过20％，所述无血清添加物的体积含量不超过2％。
优选的，所述肝细胞增殖培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
本发明所述肝巨噬细胞调节剂的体外应用包括将所述肝巨噬细胞调节剂与肝巨噬细胞模型进行共培养。
优选的，所述肝巨噬细胞模型为炎症细胞模型或修复型细胞模型。
附图说明
图1为实施例1的各肝前体相关标志物在HepLPCs细胞中的表达情况对比图；
图2为实施例1的经TEM培养基培养10天后得到的细胞进行明场拍照得到的HepLPCs的明场照片；
图3为实施例2采用流式细胞术对经小鼠GM-CSF诱导后得到的BMDMs进行细胞鉴定得到的总巨噬细胞占比分析结果；
图4为实施例2采用流式细胞术对经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定得到的M1型巨噬细胞占比分析结果；
图5为实施例2采用流式细胞术对Control组和DM+LPS组进行细胞鉴定得到的M1相关炎性基因表达情况对比图；
图6为实施例2对HepLPCs-CM+LPS组、Control组和DM+LPS组进行RNA提取和基因表达分析后得到的各组M1相关炎性基因表达情况对比图；
图7为实施例2对HepLPCs-CM+LPS组、Control组和DM+LPS组的细胞培养上清进行细胞因子浓度检测得到的M1相关炎性基因表达水平对比图；
图8为实施例3采用流式细胞术对经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定得到的M2型巨噬细胞占比分析结果；
图9为实施例3采用流式细胞术对Control组和DM+IL-4组进行细胞鉴定得到的M2相关炎性基因表达情况对比图；
图10为实施例3对HepLPCs-CM+IL-4、Control组和DM+IL-4组进行RNA提取和基因表达分析得到的各组M2相关炎性因子IL10的分泌情况对比图；
图11为实施例4的不同浓度外泌体与巨噬细胞BMDMs作用6小时后的DAPI核染后融合图；
图12为实施例4的Control组，DM+LPS组、CM+LPS组和EV+LPS组的M1相关炎性基因表达情况对比图；
图13为实施例5的Control组，DM+IL4组、CM+IL4组和EV+IL4组的M2相关炎性基因表达情况对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例提供了肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用，以能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应对NASH起到治疗作用。
本发明实施例的所述肝巨噬细胞调节剂包含肝源细胞的培养上清，所述肝源细胞的培养上清能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应。
一些实施例中，所述肝源细胞为肝前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为肝前体样细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝来源前体细胞或鼠肝来源前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝前体细胞或鼠肝前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝前体样细胞或鼠肝前体样细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞的培养上清包含抑制成分，以抑制巨噬细胞的炎性活化。
一些实施例中，所述肝源细胞的培养上清包含促进成分，以促进修复性巨噬细胞产生。
一些实施例中，所述肝源细胞的培养上清包含所述肝源细胞分泌的外泌体。
一些实施例中，所述肝巨噬细胞调节剂还包括重悬成分。
一些实施例中，所述重悬成分为生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
本发明实施例提供了所述肝巨噬细胞调节剂的制备方法包括：使用体外培养基对所述肝源细胞进行体外培养后，从得到的培养产物中获取所述肝源细胞的培养上清。
一些实施例中，所述体外培养基为基础培养基，所述基础培养基为HepX培养基、DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
一些实施例中，所述DMEM细胞培养基为高糖型DMEM细胞培养基。
一些实施例中，所述体外培养基由所述基础培养基，以及血清类物质和双抗的至少一种组成。
一些实施例中，所述体外培养基由所述基础培养基、血清类物质和双抗组成。其中，以占所述基础培养基的体积含量计，血清类物质的含量不超过20％，双抗的含量不超过2％。
一些实施例中，所述肝源细胞的制备方法包括，使用肝细胞增殖培养基对原代肝细胞进行体外培养。
一些实施例中，所述肝细胞增殖培养基由HepX培养基、无血清添加剂、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂、ROCK激酶抑制剂、青霉素-链霉素双抗和血清类物质组成。
一些实施例中，所述体外培养基和所述肝细胞增殖培养基中任意一种的血清类物质为动物源血清。
一些实施例中，所述体外培养基和所述肝细胞增殖培养基中任意一种中的动物源血清可以用血清替代物替换。
一些实施例中，所述血清替代物为无动物源成份的血小板及其衍生物。
一些实施例中，所述血清替代物为一磷酸鞘氨酸和吲哚乙酸。
一些实施例中，所述动物源血清为胎牛血清。
一些实施例的所述肝细胞增殖培养基中，以占HepX Basal培养基的含量计，无血清添加剂的体积含量不超过2％，肝细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，表皮细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，成纤维细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，抗坏血酸的含量为5-50微克/毫升，N-乙酰-L-半胱氨酸的含量为0.5-10微摩尔/升、TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-20微摩尔/升，Wnt信号通路激动剂的含量为1-5微摩尔/升，ROCK激酶抑制剂的含量为5-20微摩尔/升，青霉素-链霉素双抗的体积含量为1-3％，血清的体积含量为5-15％。
一些实施例的肝细胞增殖培养基中，使用前述的血清替代物替换血清成分。
一些实施例的肝源细胞培养方法包括：使用所述肝细胞增殖培养基对所述原代肝细胞进行培养直至汇合度不低于80％，然后对得到的细胞消化后进行传代培养。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，控制所述原代肝细胞的接种密度为0.5-1×105/cm2。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，每2-3天更换一次所述肝细胞增殖培养基。
本发明实施例提供了所述肝巨噬细胞调节剂的体外应用，包括将所述肝巨噬细胞调节剂与肝巨噬细胞模型进行共培养。
一些实施例中，所述肝巨噬细胞模型为炎症细胞模型或修复型细胞模型。
一些实施例中，所述炎症细胞模型中，M1型巨噬细胞标志物的表达占比不低于85％，即M1型巨噬细胞的数量占比不低于85％，满足炎症细胞模型建模要求。
一些实施例中，所述修复型细胞模型中，M2型巨噬细胞标志物的表达占比不低于90％，即M2型巨噬细胞的数量占比不低于90％，满足修复型细胞模型的建模要求。
本发明各实施例中，如无特别说明，细胞培养均在37摄氏度环境下且二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中进行。细胞培养使用的培养基以及处理细胞所使用的各类试剂，例如缓冲液使用前均经无菌化处理以及0.22微米滤器过滤以去除杂质。
本发明各实施例中涉及统计学分析的数据均为三次独立重复，实验数据以均值±标准差
Figure BDA0003537233160000081
表示。正态分布数据,对两组数据间差异分析使用Student’st-test统计法；多组数据比较分析使用one-wayANOVA，和Dunnett校正进行多重比较，必要时选用Tukey校正方法。偏态分布的数据,采用两组间Mann-Whitney U test统计法进行非参数统计分析。P值小于0.05为差异有统计学意义。所有数据均通过SPSS软件(25.0版)选取合适的统计分析方法进行分析。
以下通过具体的实施例进行详细说明：
实施例1
本实施例提供了第一种肝巨噬细胞调节剂，其制备方法如下：
S0：提供人原代肝细胞；
S1：使用肝细胞增殖培养基(简记为TEM培养基)对所述原代肝细胞进行培养直至汇合度不低于80％；
S2：将经所述步骤S1后得到的细胞消化后按1：3的比例进行传代培养；
S3：将TEM培养基更换为使用无血清的高糖DMEM培养基后，继续进行24小时的体外培养；
S4：所述体外培养结束后收集细胞上清，对所述细胞上清进行离心处理以去除细胞碎片得到培养上清，将所述培养上清作为所述第一肝巨噬细胞调节剂。
本实施例的所述步骤S0中，所述人原代肝细胞来源于上海瑞德肝脏有限公司。具体的，所述人原代肝细胞在经TEM培养前经Percoll密度梯度离心联合流式分选排除掉CD24阳性和EpCAM阳性的前体细胞。
本实施例的所述步骤S1的TEM培养基中，以占HepX Basal培养基的含量计，含有1％的无血清添加剂N2(100×)，1％的无血清添加剂B27(50×)，20ng/mL的HGF，20ng/mL的EGF，20ng/mL的FGF，1.25μM的N-乙酰-L-半胱氨酸，10μg/mL的抗坏血酸，1μM的TGF-β信号抑制剂A8301，3μM的Wnt信号通路激动剂CHIR99021，10μM的ROCK激酶抑制剂Y27632，2％的青霉素-链霉素双抗(100×)和10％的胎牛血清FBS组成。其中：HepX Basal培养基、N2、B27、青霉素-链霉素双抗来源于上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清FBS来源于以色列Biological Industries公司；HGF来源于美国Sino Biological公司；EGF和FGF来源于美国Peprotech公司；A8301、CHIR99021和Y27632来源于上海陶速生物科技有限公司。
所述步骤S1中，对所述原代肝细胞进行培养的步骤包括：将所述人原代肝细胞使用TEM培养基重悬后以0.5-1×105/cm2的密度接种于用VitronectinXFTM(来源于加拿大干细胞技术有限公司)包板的6孔板中进行培养。培养进行的过程中，每2-3天更换一次TEM培养基。
所述步骤S2中，将经所述步骤S1后得到的细胞消化后按1：3的比例进行传代培养的步骤包括：使用0.25％的Trypsin-EDTA(来源于美国Gibco公司)进行消化，并按照1:3的比例接种入新的培养皿中扩增培养到第三代并直至细胞汇合率达80％。
所述步骤S4中，对所述细胞上清在300g离心力下离心10分钟以去除细胞碎片，得到所述第一肝巨噬细胞调节剂。
本实施例通过流式细胞术对经所述步骤S2得到的人肝前体样细胞(HepLPCs)进行鉴别分析，得到图1所示的各肝前体相关标志物在HepLPCs细胞中的表达情况对比图。参照图1可知，HepLPCs表达了肝前体相关标志物CK19和CD24以及肝系标志物ALB，表现出肝前体细胞特性。造血干细胞抗原CD34和白细胞共同抗原CD45的表达水平小于2％，表现出低免疫原性。
本实施例对经TEM培养基培养10天后得到的细胞进行明场拍照，得到图2所示的HepLPCs的明场照片。参照图2可知，HepLPCs细胞呈梭形且贴壁生长，细胞长满视野且表现出高核/质比的肝前体细胞特征。
实施例2
本实施例提供了炎症细胞模型的建模方法，并对实施例1的第一种肝巨噬细胞调节剂(简记为HepLPCs-CM)与炎症细胞模型进行共培养，考察第一种肝巨噬细胞调节剂对M1型巨噬细胞的作用。
本实施例通过脂多糖LPS刺激巨噬细胞建立炎症细胞模型，具体过程包括：获取小鼠原代骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)，使用BMDM培养基重悬并接种后加入来源于近岸生物的小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，以对BMDMs进行为期7天的诱导分化直至细胞成熟，采用LPS对得到的成熟原代巨噬细胞进行6小时的体外定向极化诱导后消化巨噬细胞，得到炎症细胞模型。其中，LPS刺激的过程中控制LPS的浓度为100ng/mL。
具体的，将6～8周成年C57小鼠脊椎脱臼处死后取股骨髓腔中的骨髓团块；对上述骨髓团块经70μm细胞筛网过滤后在500g的离心力下离心5分钟后弃上清；用红细胞裂解液(来源于上海碧云天生物技术有限公司)重悬沉淀物后再次在500g的离心力下离心5分钟后弃上清得到二次沉淀物；用BMDM培养基对二次沉淀物进行反复的重悬和离心以充分洗涤沉淀中残余的红细胞裂解液以及细胞碎片。最后使用BMDM培养基对纯化后的细胞进行重悬后按(8～10)×105/孔接种入12孔板，接种时每孔加入小鼠GM-CSF并控制浓度为40ng/mL。接种完成后的6-8小时后，将细胞转移到新的培养皿中进行培养，每3天更换一次添加有40ng/mL小鼠GM-CSF的BMDM培养基直至培养至第7天，实现巨噬细胞的分化成熟。其中，BMDM培养基由500mL 1640培养液(来源于上海源培生物科技股份有限公司)、5％青霉素-链霉素双抗和10％FBS组成。
具体的，巨噬细胞分化成熟后，将培养基更换为含100ng/mL的LPS的BMDM培养基后进行6小时的培养，以完成体外定向极化诱导。
本实施例采用流式细胞术对经小鼠GM-CSF诱导后得到的BMDMs以及经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定，得到图3所示的总巨噬细胞占比分析结果以及图4所示的M1型巨噬细胞占比分析结果。参照图3和图4可知，经小鼠GM-CSF诱导后得到的BMDMs的巨噬细胞总表型标志物F4/80+的表达占比达到92.8％，即总巨噬细胞占比92.8％，符合BMDM实验细胞纯度；经LPS刺激6小时后得到的BMDMs中，M1表型标志物CD11c+以及F4/80+的表达占比为88.1％，即M1型巨噬细胞占比88.1％。可见BMDMs经本实施例的小鼠GM-CSF诱导分化以及LPS刺激后得到的炎症细胞模型中，M1型巨噬细胞占比满足纯度要求。
本实施例采用流式细胞术对未处理的BMDMs(Control组)以及经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs(DM+LPS组)进行细胞鉴定，得到图5所示的M1相关炎性基因表达情况对比图。参照图5，和对照组相比，经LPS刺激6小时后的BMDMs的M1相关基因表达水平均上调。其中，IL6表达水平上调为823.200±174.500，IL1β表达水平上调为8.389±0.029，iNOS表达水平上调为24.650±1.196。
本实施例将HepLPCs-CM与前述经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs共培养6小时得到HepLPCs-CM+LPS组，对HepLPCs-CM+LPS组、Control组和DM+LPS组进行RNA提取和基因表达分析，得到图6所示的各组M1相关炎性基因表达情况对比图。参照图5和图6，相对于阳性对照处理组DM+LPS，经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs经HepLPCs-CM共培养后，M1相关基因表达显著下调。其中，IL6表达水平下调为346.300±20.810，IL1β表达水平下调为11.290±0.10，iNOS表达水平下调为169.800±9.711。
本实施例对实验组、控制组和阳性对照处理组收集的细胞培养上清采用联科生物ELISA试剂盒进行细胞因子的浓度检测，得到图7所示的HepLPCs-CM+LPS组、Control组和DM+LPS组的细胞培养上清中M1相关炎性基因表达水平对比图。具体操作方法请参见试剂盒说明书。细胞培养上清的收集方法请参见实施例1，在此不做赘述。参照图7，相对于阳性对照处理组，经LPS体外定向极化诱导得到的BMDMs在经HepLPCs-CM处理后，上清中炎性因子分泌减少。其中，IL6分泌为138.700±32.130pg/(mL*105cell)，IL1β分泌为0.710±0.019pg/(mL*105cell)，iNOS分泌为0.095±0.001pg/(mL*105cell)。
目前，大量的实验和临床数据支持巨噬细胞在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发生和发展中的核心作用。巨噬细胞在不同因素诱导下可出现两种经典的细胞亚群，即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。二者功能截然不同。业内通常认为，M1型巨噬细胞促进炎症反应，通过产生大量促炎性细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、以及一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)介导机体的炎症反应。
从图6和图7以及各自的分析结果可知，HepLPCs-CM能够抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性活化，显著减低炎症相关因子的基因及分泌蛋白表达。
实施例3
本实施例提供了修复型细胞模型的建模方法，并对实施例1的第一种肝巨噬细胞调节剂(简记为HepLPCs-CM)与修复型细胞模型进行共培养，考察第一种肝巨噬细胞调节剂对M2型巨噬细胞的作用。
本实施例通过来源于近岸生物的白介素4(IL-4)刺激巨噬细胞建立修复型细胞模型，具体过程包括：小鼠原代骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的获取方法以及使用小鼠GM-CSF对BMDMs进行为期7天的诱导分化的方法请参见实施例2。采用IL-4对得到的成熟原代巨噬细胞进行6小时的体外定向极化诱导后消化巨噬细胞，得到修复型细胞模型。其中，IL-4刺激的过程中控制IL-4的浓度为40ng/mL。其余具体实验步骤请参见实施例2。
本实施例采用流式细胞术对经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs进行细胞鉴定，得到图8所示的M2型巨噬细胞占比分析结果。参照图3和图8可知，经IL-4刺激6小时后得到的BMDMs中，M2表型标志物CD206+以及巨噬细胞总表型标志物F4/80+的表达占比为97％，即M2型巨噬细胞占比97％。可见BMDMs经本实施例的小鼠GM-CSF诱导分化以及IL-4刺激后得到的修复型细胞模型中，M2型巨噬细胞占比满足纯度要求。
本实施例采用流式细胞术对未处理的BMDMs(Control组)以及经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs(DM+IL-4组)进行细胞鉴定，得到图9所示的M2相关炎性基因表达情况对比图。参照图9，和Control组相比，经IL-4刺激6小时后的BMDMs的M2相关基因表达水平均上调。其中，CD206表达水平上调为114.000±3.579，IL10表达水平上调为2.634±0.028，ARG1表达水平上调为53.260±8.083。
本实施例将HepLPCs-CM与前述经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs在BMDM培养基中共培养6小时得到HepLPCs-CM+IL-4组，对HepLPCs-CM+IL-4、Control组和DM+IL-4组进行RNA提取和基因表达分析，得到图10所示的各组M2相关炎性因子IL10的分泌情况对比图。参照图9和图10，相对于DM+IL-4，经IL-4体外定向极化诱导得到的BMDMs经HepLPCs-CM共培养后，检测上清中炎性因子IL10分泌增加。IL10分泌为108.052±0.472pg/(mL*105cell)。
业内通常认为M2型巨噬细胞主要产生免疫调节因子白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等，参与Th2细胞型免疫应答，抑制炎症和纤维化，在组织的修复过程中具有重要作用。从图9和图10以及各自的分析结果可知，HepLPCs-CM能够促进IL-4诱导的修复型M2巨噬细胞基因的表达以及抗炎因子IL-10小幅度的增高。
综合实施例2和3可知，HepLPCs-CM通过影响巨噬细胞亚群的变化，起到抑制炎症反应并促进组织修复的作用。
实施例4
本实施例对实施例1的HepLPCs-CM中的外泌体成分(简记为HepLPCs-Ex)进行了提取，并考察其对实施例2的炎症细胞模型的作用。
本实施例使用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒对实施例1的HepLPCs-CM中的外泌体成分进行提取，得到HepLPCs-Ex。具体的提取方法请参见试剂盒说明书。将提取得到的HepLPCs-Ex委托逍鹏生物进行NTA检测，结果表明提取的样本颗粒直径多集中于90-110nm之间，峰值在96nm。
本实施例使用DIL标记HepLPCs-Ex后与巨噬细胞BMDMs混合后培养，考察了不同时间和不同外泌体浓度条件下考察5×105个巨噬细胞BMDMs对外泌体的吞噬效率，发现随时间延长，巨噬细胞吞噬外泌体越多，且所加入外泌体浓度越高，巨噬细胞吞噬越多。本实施例进一步对混合培养6小时后的样本用DAPI进行核染以及软件融合分析，得到图11所示的不同浓度外泌体DAPI核染后融合图。巨噬细胞BMDMs的制备方法请参见实施例2。参照图11，外泌体浓度从1.3ug/uL增加至5.2ug/uL并混合培养6小时后，巨噬细胞对外泌体的吞噬效果均显著，且外泌体浓度越高，巨噬细胞吞噬效率越好。
本实施例在图11所示巨噬细胞对外泌体摄取情况指导下，控制BMDMs细胞数目为5×105个，外泌体浓度和HepLPCs-CM浓度均为1.3ug/uL。将HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex分别加入到炎症细胞模型混合后培养6小时，形成CM+LPS组和EV+LPS组，通过qPCR考察Control组，DM+LPS组、CM+LPS组和EV+LPS组的M1相关炎性基因表达情况，得到图12所示的各组M1相关炎性基因水平对比图。
参照图12，对照组DM+LPS组的M1相关炎性基因IL6、IL1β和iNOS的表达显著，通过HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex干预均能够使得上述M1相关炎性基因表达水平显著下降，且HepLPCs-Ex干预使得上述M1相关炎性基因表达水平下降的程度与HepLPCs-CM的干预效果相当。
综上所述，HepLPCs-CM中的外泌体HepLPCs-Ex作为抑制成分，能够抑制M1型巨噬细胞的炎性活化。
实施例5
本实施例考察了实施例4的外泌体成分HepLPCs-Ex对实施例3的修复型细胞模型的作用。
本实施例在图11所示巨噬细胞对外泌体摄取情况指导下，控制BMDMs细胞数目为5×105个，外泌体浓度和HepLPCs-CM浓度均为1.3ug/uL。将HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex分别加入到实施例3的修复型细胞模型混合后培养6小时，形成CM+IL4组和EV+IL4组，通过qPCR考察Control组，DM+IL4组、CM+IL4组和EV+IL4组的M2相关炎性基因表达情况，得到图13所示的各组M2相关炎性基因水平对比图。
参照图13，相较于对照组DM+IL4组的M2相关炎性基因CD206、IL10和ARG1的表达水平，通过HepLPCs-CM和HepLPCs-Ex干预均能够使得上述M2相关炎性基因表达水平上调，且HepLPCs-Ex干预使得上述M2相关炎性基因表达水平上调的程度与HepLPCs-CM的干预效果相当。
综上所述，HepLPCs-CM中的外泌体HepLPCs-Ex作为促进成分，能够促进修复型巨噬细胞的产生。

Claims (13)

1.一种肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，包含肝源细胞的培养上清，所述肝源细胞的培养上清能够调节肝巨噬细胞亚群介导的炎症损伤或组织修复反应。
2.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，所述肝源细胞的培养上清包含抑制成分，以抑制M1型巨噬细胞的炎性活化。
3.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，所述肝源细胞的培养上清包含促进成分，以促进M2型巨噬细胞的产生。
4.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，所述肝源细胞的培养上清包含所述肝源细胞分泌的外泌体。
5.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，所述肝源细胞为肝前体细胞或肝前体样细胞。
6.根据权利要求5所述的肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，所述肝前体细胞和所述肝前体样细胞的任意一种阳性表达CD24和EpCAM。
7.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂，其特征在于，还包括重悬成分，所述重悬成分包括生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
8.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂的制备方法，其特征在于，包括：
使用体外培养基对所述肝源细胞进行体外培养后，从得到的培养产物中获取所述肝源细胞的培养上清。
9.根据权利要求8所述的肝巨噬细胞调节剂的制备方法，其特征在于，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12细胞培养基、HepX培养基、William’s E细胞培养基、NeurobasalMedium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
10.根据权利要求8所述的肝巨噬细胞调节剂的制备方法，其特征在于，所述肝源细胞的制备方法包括，使用肝细胞增殖培养基对原代肝细胞进行体外培养；
所述肝细胞增殖培养基包括基础培养基、无血清添加物、血清类物质、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂和ROCK激酶抑制剂；
以占所述基础培养基的含量计，所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述血清类物质的含量不超过20％，所述无血清添加物的体积含量不超过2％。
11.根据权利要求10所述的肝巨噬细胞调节剂的制备方法，其特征在于，所述肝细胞增殖培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
12.根据权利要求1所述的肝巨噬细胞调节剂的体外应用，其特征在于，包括将所述肝巨噬细胞调节剂与肝巨噬细胞模型进行共培养。
13.根据权利要求12所述的肝巨噬细胞调节剂的体外应用，其特征在于，所述肝巨噬细胞模型为炎症细胞模型或修复型细胞模型。
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