JP7072770B2 - 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キットに関する。
再生医療の分野では、移植等に用いる細胞については、培養の過程及び最終製品の段階で、均質な細胞が得られているか否かを所定の品質管理試験により評価することが必要となる。現在行われている品質管理試験の多くにおいては、細胞自体を使用する必要があるため、評価によって貴重な細胞が失われるという不都合がある。また培養工程中に品質を迅速に評価することは難しい。
近年、塩基数が１７から２４の一本鎖ＲＮＡであるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）が注目されている。このｍｉＲＮＡは、自身と相補的な塩基配列をもったｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の翻訳を阻害する機能を有しており、幹細胞から組織細胞への分化において重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１）。また、このｍｉＲＮＡが血液中に存在しているという報告（非特許文献２）、組織がん細胞中に特定のｍｉＲＮＡが存在しているという報告（特許文献１）等があり、がん等の疾病に対する診断、それらの予後予測等に利用できる可能性があることも知られている。
一方、ｍｉＲＮＡを用いた従来技術として、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することで培養細胞を消費することなく培養細胞の評価やバイオマーカーのスクリーニングをすることができる手段が開示されている（特許文献２）。また、細胞の特性評価やプロファイリングのために、非コードＲＮＡ分子を使用する技術（特許文献３）や、癌遺伝子を導入して形質転換させた間葉系幹細胞の状態をモニタリングする指標としてｍｉＲＮＡを用いる技術（特許文献４）が開示されている。さらに、細胞の培養上清中に分泌されるｍｉＲＮＡの種類、量によって細胞の老化の程度を評価する方法も開発されている（特許文献５）。
Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００８；３６：１３５４－１３６９
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ２００８；１０５：１０５１３－８
本発明は、上述のような状況の中、移植等に用いる培養細胞の品質管理試験として、前記培養細胞を消費することなく、その培養細胞の品質をより安定的に評価することができる新規な方法を提供することを目的とする。
前記課題を解決するために、本発明者が種々検討した結果、細胞の培養上清中に分泌されるｍｉＲＮＡの種類、量を測定する際に特定のｍｉＲＮＡを内在性コントロールとすることにより、細胞の品質をより安定的に、且つより高い確度で評価することができることを見出した。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
［１］ｍｉＲＮＡを指標に細胞の品質を評価する方法であって、
前記細胞又は前記細胞の培養上清中の、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする、細胞の品質を評価する方法。
［２］前記細胞が、間葉系幹細胞である、［１］に記載の方法。
［３］前記ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐが、前記細胞又は前記細胞の培養上清中のエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記品質の評価が、配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを指標として行われる、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］培地中で細胞を培養する工程、
培養上清の一部をサンプリングする工程
サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、
回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、
ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、及び
ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを調整する工程
を含む、細胞の品質を評価する方法。
［６］ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として有する、細胞品質判定用キット。
［７］ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを少なくとも１つ有する、［６］に記載の細胞品質判定用キット。
［８］配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを少なくとも１つ有する、［７］に記載の細胞品質判定用キット。
前記細胞又は前記細胞の培養上清中の、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする、細胞の品質を評価する方法。
［２］前記細胞が、間葉系幹細胞である、［１］に記載の方法。
［３］前記ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐが、前記細胞又は前記細胞の培養上清中のエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記品質の評価が、配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを指標として行われる、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］培地中で細胞を培養する工程、
培養上清の一部をサンプリングする工程
サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、
回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、
ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、及び
ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを調整する工程
を含む、細胞の品質を評価する方法。
［６］ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として有する、細胞品質判定用キット。
［７］ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを少なくとも１つ有する、［６］に記載の細胞品質判定用キット。
［８］配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを少なくとも１つ有する、［７］に記載の細胞品質判定用キット。
本発明の方法によると、培養細胞自体を消費することなく、その培養細胞の品質を評価することができる。そのため、評価のためだけに別途培養細胞を用意する必要がなく、手間とコストを大幅に低減することができる。また、それに加えて、従来の方法と比較し、より安定的に、且つより高い確度で、培養細胞の老化の程度を評価することができる。したがって、本発明の方法は、移植、細胞治療等、培養細胞をヒトに投与して用いる際の培養細胞の品質管理試験として特に好適に用いることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
＜細胞の品質を評価する方法＞
本発明は、細胞又は細胞の培養上清中のｍｉＲＮＡを指標として細胞の品質を評価する方法において、特定のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする方法である。具体的には、ｍｉＲＮＡを指標に細胞の品質を評価する方法であって、前記細胞又は前記細胞の培養上清中の、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする方法である。なお、「内在性の指標とする」とは、内在性コントロール遺伝子として用いることを意味する。この内在性コントロール遺伝子は、リアルタイムＰＣＲにおいて標的遺伝子の発現量を補正する際に用いられる遺伝子である。採取したＲＮＡの品質や量、逆転写反応の効率による実験間のバラつきを補正できるため、より正確な評価を行うことができる。
本発明は、細胞又は細胞の培養上清中のｍｉＲＮＡを指標として細胞の品質を評価する方法において、特定のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする方法である。具体的には、ｍｉＲＮＡを指標に細胞の品質を評価する方法であって、前記細胞又は前記細胞の培養上清中の、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする方法である。なお、「内在性の指標とする」とは、内在性コントロール遺伝子として用いることを意味する。この内在性コントロール遺伝子は、リアルタイムＰＣＲにおいて標的遺伝子の発現量を補正する際に用いられる遺伝子である。採取したＲＮＡの品質や量、逆転写反応の効率による実験間のバラつきを補正できるため、より正確な評価を行うことができる。
ヒトに投与する細胞の品質管理のために、細胞の老化の程度を評価することは重要である。細胞は老化により機能の低下や老廃物の蓄積・排出等を引き起こす。そのため、ヒトに投与する細胞については、十分な機能を備えるだけでなく、患者に害を与えることがないように、老化がより進んだ細胞や、老化した細胞の比率が高い細胞集団ではないことを確認することが必要である。
ここで、「細胞の老化」とは、細胞レベルの加齢を指す。細胞は老化により、増殖能が減退して最終的には増殖がストップする。このような増殖能の減退等は、主に、ＤＮＡへの酸化損傷、及び、蛋白質及び脂質の酸化を原因として起こると言われている。また、細胞の老化には、細胞周期や細胞分裂、細胞分化等の変化を伴うことも知られている。
また、ここで、「細胞の品質を評価する」とは、細胞を、移植、細胞治療等のためにヒトに投与して用いた場合に、効果を奏するのに十分な品質を有しているか否か、安全性を有しているか、毒性を有しているか否か、細胞が均一性、均質性を有しているか否か、同等性を有しているか等を評価することであり、本発明においては、特に細胞の老化の程度を判定することにより行われる。なお、細胞への環境刺激、化学物質による種々の影響が、前記「細胞の老化」と同様の変化を細胞にもたらすものである場合には、本発明の方法は、このような細胞の状態を評価する方法としても用いることができる。本発明は、細胞の品質を評価することで、品質変化（老化等）していない細胞を選択する方法、及びこの方法によって選択される細胞も提供することができる。さらに、本発明の細胞の品質を評価する方法を用いて、細胞をモニターしながら品質変化（老化等）していない細胞の培養を継続する培養方法も提供する。品質変化（老化等）の指標となるｍｉＲＮＡを複数組み合わせて測定できるように、対応するプローブ等を含んだ細胞品質判定用のキットも提供できる。
（細胞）
本発明における細胞としては、インビトロ条件下で培養できる細胞であれば特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。また、インビトロ条件下で培養できるのであれば、哺乳動物より摘出した組織を形成する細胞であっても、インビトロで株化された細胞であってもよい。
本発明における細胞としては、インビトロ条件下で培養できる細胞であれば特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。また、インビトロ条件下で培養できるのであれば、哺乳動物より摘出した組織を形成する細胞であっても、インビトロで株化された細胞であってもよい。
インビトロ条件下で培養できる哺乳動物由来の細胞としては、例えば、幹細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞等）、組織前駆細胞、組織細胞（骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、樹状細胞等の免疫系細胞や白血球等を含む血液系細胞、線維芽細胞、肝臓細胞等）、がん細胞、がん由来細胞株等が挙げられる。なお、間葉系幹細胞としては、その由来によって例えば骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞等が挙げられる。
これらのうち、継代数が少ない短期間のうちに増殖能が低下してしまうような、品質変化（老化等）が比較的早く起こる細胞に対して、本発明の方法が極めて有効である。即ち、このような細胞に対して本発明の評価方法を適用すると、品質変化（老化等）が起こる前の細胞であることを確認して適切に治療に用いることができる。このように品質変化（老化等）が比較的早く起こる細胞としては、例えば、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞等が挙げられる。
（培養）
本発明における細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃～３７℃の温度、２％～７％ＣＯ２環境下、０．１％～２１％Ｏ２環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。
本発明における細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃～３７℃の温度、２％～７％ＣＯ２環境下、０．１％～２１％Ｏ２環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。
本発明の細胞の培養に用いる培地としては、当業者に従来公知のものを細胞の種類毎にそれぞれ選択して用いることができ、特に限定されない。このような培地は、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。これらの培地には、必要に応じて、さらに脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。
上記基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
上記血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。
上記脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸等が例示されるが、これらに限定されない。脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン等が例示されるが、これらに限定されない。アミノ酸は、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシンなどを含むがこれらに限定されない。タンパク質は、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン及びβ２－ミクログロブリン等が例示されるが、これらに限定されない。多糖は、グリコサミノグリカンが例示され、グリコサミノグリカンのうち特に、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等が例示されるが、これらに限定されない。増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が例示されるが、これらに限定されない。
上記培養によって得られる細胞を動物（好ましくはヒト）に投与するという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地を用いることが好ましい。このような培地は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社及びＲｏｈｔｏ社などから間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている。
（ｍｉＲＮＡ）
本発明の方法において、細胞の品質変化の指標として用いるｍｉＲＮＡとしては、細胞の品質変化に応じて細胞から分泌される量が変化するものであれば特に限定されない。また、このようなｍｉＲＮＡとしては、細胞の種類によってそれぞれ適切なものが選択され得る。例えば、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の品質変化の指標としては、配列表の配列番号１～９６に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡが好ましい。これらはいずれも、特開２０１６－１４４４３９号公報の実施例において、本出願人らによって細胞の老化に応じて培養上清中の存在量が変化することが具体的に確認されているものである。また、配列番号１、１２及び１３に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡについては、本発明の実施例において、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞だけでなく、ヒトの骨髄由来間葉系幹細胞及びヒトの臍帯由来間葉系幹細胞についても、その老化に応じて培養上清中の存在量が変化することが具体的に確認されている。
本発明の方法において、細胞の品質変化の指標として用いるｍｉＲＮＡとしては、細胞の品質変化に応じて細胞から分泌される量が変化するものであれば特に限定されない。また、このようなｍｉＲＮＡとしては、細胞の種類によってそれぞれ適切なものが選択され得る。例えば、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の品質変化の指標としては、配列表の配列番号１～９６に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡが好ましい。これらはいずれも、特開２０１６－１４４４３９号公報の実施例において、本出願人らによって細胞の老化に応じて培養上清中の存在量が変化することが具体的に確認されているものである。また、配列番号１、１２及び１３に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡについては、本発明の実施例において、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞だけでなく、ヒトの骨髄由来間葉系幹細胞及びヒトの臍帯由来間葉系幹細胞についても、その老化に応じて培養上清中の存在量が変化することが具体的に確認されている。
例えば、下記実施例に記載されるように、配列番号１～１３、１６～６９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９９（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７１３－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１７－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７９３－５ｐ（配列番号１８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１（配列番号１９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６８５－５ｐ（配列番号２０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７４３－５ｐ（配列番号２２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－３ｐ（配列番号２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ（配列番号２５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ（配列番号２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４３（配列番号２７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９８（配列番号２８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４－３ｐ（配列番号２９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８４（配列番号３０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ（配列番号３１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７８－５ｐ（配列番号３２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（配列番号３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｆ（配列番号３４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６５９ａ－３ｐ（配列番号３５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号３６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２８－５ｐ（配列番号３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－３ｐ（配列番号３８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２７－５ｐ（配列番号３９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５４（配列番号４０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ（配列番号４１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７－３ｐ（配列番号４２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ（配列番号４３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００（配列番号４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｇ－３ｐ（配列番号４５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ（配列番号４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９（配列番号４７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７３９（配列番号４８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８５（配列番号４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３５ｂ（配列番号５０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９６－５ｐ（配列番号５１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３２－５ｐ（配列番号５２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２７６（配列番号５３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ（配列番号５４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５６－５ｐ（配列番号５６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６８０－３ｐ（配列番号５７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０７４－５ｐ（配列番号５８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６５５－５ｐ（配列番号５９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８７（配列番号６０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９０－３ｐ（配列番号６１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７３８－３ｐ（配列番号６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９６（配列番号６３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｅ（配列番号６４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６０（配列番号６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３１（配列番号６６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２７（配列番号６７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６５（配列番号６８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９８（配列番号６９）は、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴って培養上清への分泌が減少するものである。また、配列番号１４、１５、７０～９６に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５（配列番号１４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３９－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７０（配列番号７０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２７８（配列番号７１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３０（配列番号７２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２８－５ｐ（配列番号７３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０６－３ｐ（配列番号７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３９－５ｐ（配列番号７５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９７－５ｐ（配列番号７６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２８４（配列番号７７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３２（配列番号７８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６８ｂ（配列番号７９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８７（配列番号８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５９（配列番号８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３９２（配列番号８２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１５（配列番号８３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３４（配列番号８４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ（配列番号８５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１６２－５ｐ（配列番号８６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０７（配列番号８７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５８７（配列番号８８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３２（配列番号８９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９５－３ｐ（配列番号９０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６２（配列番号９１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ（配列番号９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０５（配列番号９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９７（配列番号９４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２５－５ｐ（配列番号９５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５７（配列番号９６）は、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴って培養上清への分泌が増加するものである。
これらのうち、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化（品質）の指標として測定するｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７１３－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ（配列番号２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４－３ｐ（配列番号２９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８４（配列番号３０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２８－５ｐ（配列番号３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５４（配列番号４０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００（配列番号４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｇ－３ｐ（配列番号４５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ（配列番号４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９（配列番号４７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７３９（配列番号４８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８５（配列番号４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２７（配列番号６７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６５（配列番号６８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５（配列番号１４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８７（配列番号８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５９（配列番号８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１６２－５ｐ（配列番号８６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２５－５ｐ（配列番号９５）からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
中でも、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２８－５ｐ（配列番号３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５４（配列番号４０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００（配列番号４４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｇ－３ｐ（配列番号４５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７３９（配列番号４８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８５（配列番号４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２７（配列番号６７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８７（配列番号８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５９（配列番号８１）からなる群より選択される少なくとも１種がより好ましい。
更に、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｇ－３ｐ（配列番号４５）からなる群より選択される少なくとも１種が特に好ましい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ａ（配列番号１２）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ｂ（配列番号１３）については、本発明の実施例において、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞だけでなく、ヒトの骨髄由来間葉系幹細胞及びヒトの臍帯由来間葉系幹細胞についても、その老化に応じて培養上清中の存在量が変化することが具体的に確認されていることから、より特に好ましい。
細胞の品質変化の指標としては、ｍｉＲＮＡをいずれか１種類のみ測定してもよいし、複数種類測定してもよい。品質変化の指標となる特定のｍｉＲＮＡを複数測定できるように、必要な試薬を組み合わせた評価測定キットとして用いることもできる。
本発明におけるｍｉＲＮＡとしては、培養液中に細胞から直接分泌されるものでもよいし、細胞から放出されるエクソソーム中に含まれる形で培養液中に放出されるものでもよい。細胞の品質変化の評価には、細胞から放出されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡを測定することが好ましい。細胞から放出されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡを測定することにより、精度よく細胞の品質変化の程度を評価することができる。
本発明の方法において、細胞の品質を判定する際に、内在性コントロール（内在性の指標）として用いるｍｉＲＮＡとしては、細胞の品質に応じて細胞から分泌される量が変化し難いものが用いられ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが好ましい。なお、ｍｉＲ－１００－５ｐはＰＬＫ１などの細胞周期や細胞増殖に関わる遺伝子を標的とし、ｍｉＲ－２１－５ｐはリボソームタンパク質ＲＰＳ７や、ＢＣＬ２など一連のがん抑制遺伝子を標的としているとの報告がある。多様な組織に高発現しており、分化や増殖、がん化、代謝等に関わる多機能ｍｉＲＮＡ遺伝子群である、Ｌｅｔ－７ファミリーに属するｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐは、ユビキチン・プロテアソームシステムに関わるユビキチン転移酵素ＣＤＣ３４も標的とするとの報告がある。ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの核酸配列は、それぞれ配列番号９７、９８、９９として、配列表に記載したとおりである。
以下に、本発明の方法を各工程に分けて、具体的に説明するが、以下に示す方法に限定されないが、例えば、培地中で細胞を培養する工程、培養上清の一部をサンプリングする工程、サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、及びｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを調整する工程、品質変化のレベルを測定する工程、品質が変化した細胞を検出する工程を含む。
（ｉ）培養工程
細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃～３７℃の温度、２％～７％ＣＯ２環境下、０．１％～２１％Ｏ２環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。
細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃～３７℃の温度、２％～７％ＣＯ２環境下、０．１％～２１％Ｏ２環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。
（ｉｉ）特定の時期に培養上清の一部をサンプリングする工程
細胞の品質を評価したい細胞について、継代１日後～５日後、好ましくは１日後～４日後、より好ましくは１日後～３日後、さらに好ましくは２日後～３日後に、細胞もしくは、培養上清の一部をサンプリングする。サンプリングする細胞量、もしくは上清の液量は、その後の分析に十分な量であれば特に制限されない。なお、細胞の品質の評価の際の基準値を算出するために、品質が変わる以前の細胞増殖能等を十分に保持している状態の細胞についても細胞もしくは培養上清のサンプリングをすることができる。
細胞の品質を評価したい細胞について、継代１日後～５日後、好ましくは１日後～４日後、より好ましくは１日後～３日後、さらに好ましくは２日後～３日後に、細胞もしくは、培養上清の一部をサンプリングする。サンプリングする細胞量、もしくは上清の液量は、その後の分析に十分な量であれば特に制限されない。なお、細胞の品質の評価の際の基準値を算出するために、品質が変わる以前の細胞増殖能等を十分に保持している状態の細胞についても細胞もしくは培養上清のサンプリングをすることができる。
（ｉｉｉ）サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程
エクソソームの回収は、当業者に公知の多くの方法を用いて行われ得る。一般には、超遠心分離法を用いた方法が広く用いられるが、市販のエクソソーム単離キット（Ｔｏｔａｌ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等）を用いることもできる。
エクソソームの回収は、当業者に公知の多くの方法を用いて行われ得る。一般には、超遠心分離法を用いた方法が広く用いられるが、市販のエクソソーム単離キット（Ｔｏｔａｌ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等）を用いることもできる。
（ｉｖ）回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程
エクソソームからｍｉＲＮＡを抽出するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のｍｉＲＮＡ抽出用キット（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ等）を用いることもできる。
エクソソームからｍｉＲＮＡを抽出するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のｍｉＲＮＡ抽出用キット（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ等）を用いることもできる。
（ｖ）ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程
本工程は、内在性コントロール（内在性の指標）としてのｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、及び細胞の品質評価の指標となるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を少なくとも含む
本工程は、内在性コントロール（内在性の指標）としてのｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、及び細胞の品質評価の指標となるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を少なくとも含む
抽出した全ｍｉＲＮＡ中の内在性コントロールとなるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ）、並びに上述したような細胞の品質評価の指標となるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のｍｉＲＮＡ用のマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＤｅｓｉｇｎＩＤ ０４６０６４等）を用いることで、複数種のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを確認することができる。また、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等）を用いることでもそれぞれのｍｉＲＮＡの発現レベルを確認することができる。
（ｖｉ）各ｍｉＲＮＡの発現レベルを調整する工程
本工程では、上記工程（ｖ）で得られた品質評価の指標となるｍｉＲＮＡの発現レベルの実験値を、内在性コントロールとなるｍｉＲＮＡの実験値により補正して調整することにより、実験間のバラつきを補正することができる。
本工程では、上記工程（ｖ）で得られた品質評価の指標となるｍｉＲＮＡの発現レベルの実験値を、内在性コントロールとなるｍｉＲＮＡの実験値により補正して調整することにより、実験間のバラつきを補正することができる。
（ｖｉｉ）品質変化のレベルを測定する工程
細胞の品質変化によって増減することが判明している上記特定のｍｉＲＮＡについて、そのｍｉＲＮＡの発現レベルを、品質変化が起こる以前の細胞が分泌するｍｉＲＮＡの発現レベル（基準値）と比較して、品質変化（老化等）の程度を評価することができる。また、基準値以外に、それぞれの細胞、ｍｉＲＮＡの種類毎に適切な閾値を決め、その値を超える、又は下回る値になった場合には、品質変化（老化等）の程度が激しくヒトへの投与には不向きである等との判断をすることもできる。
細胞の品質変化によって増減することが判明している上記特定のｍｉＲＮＡについて、そのｍｉＲＮＡの発現レベルを、品質変化が起こる以前の細胞が分泌するｍｉＲＮＡの発現レベル（基準値）と比較して、品質変化（老化等）の程度を評価することができる。また、基準値以外に、それぞれの細胞、ｍｉＲＮＡの種類毎に適切な閾値を決め、その値を超える、又は下回る値になった場合には、品質変化（老化等）の程度が激しくヒトへの投与には不向きである等との判断をすることもできる。
（ｖｉｉｉ）品質が変化した細胞を検出する工程
本工程は、本発明の方法による品質の評価を確認するために、品質が変化した細胞を検出する工程である。品質が変化した細胞（老化細胞等）を検出するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現検出キット（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いることもできる。
本工程は、本発明の方法による品質の評価を確認するために、品質が変化した細胞を検出する工程である。品質が変化した細胞（老化細胞等）を検出するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現検出キット（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いることもできる。
（細胞品質判定用キット）
本発明の細胞品質判定用キットは、測定対象又は測定原理等に応じた種々の構成をとることができる。本発明のキットの構成要素として、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐを内在性の指標として含んでおればよく、さらに、例えば、上記内在性の指標となるｍｉＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の増幅用プライマーセット（ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセット）、細胞の品質変化に伴って培養上清中の発現が増減するｍｉＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の増幅用プライマーセット、及びＤＮＡチップ等で使用するハイブリダイゼーション用のプローブを変化の指標として、含むことができる。このような細胞の品質変化に伴って培養上清中の発現が増減するｍｉＲＮＡとしては、例えば、配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡが挙げられる。
本発明の細胞品質判定用キットは、測定対象又は測定原理等に応じた種々の構成をとることができる。本発明のキットの構成要素として、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐを内在性の指標として含んでおればよく、さらに、例えば、上記内在性の指標となるｍｉＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の増幅用プライマーセット（ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセット）、細胞の品質変化に伴って培養上清中の発現が増減するｍｉＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の増幅用プライマーセット、及びＤＮＡチップ等で使用するハイブリダイゼーション用のプローブを変化の指標として、含むことができる。このような細胞の品質変化に伴って培養上清中の発現が増減するｍｉＲＮＡとしては、例えば、配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡが挙げられる。
さらに、本発明のキットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。なお、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。このような標識物質としては、例えば、６－カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’－ヘキサクロロー６－カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ社）及び６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（Ｒｏｘ）等が挙げられる。
以下に本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
［間葉系幹細胞の継代数と老化の関係の検討］
凍結保存されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＡＴ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７７）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７４）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７１）を恒温槽（３７℃）にて融解し、細胞懸濁液を調整した。培養フラスコ（７５ｃｍ２、ＣＯＲＮＩＮＧ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．３２９０）に間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）を８ｍＬ入れ、それぞれの細胞懸濁液を加え、１ｍＬの間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）で、２回共洗いを行った。細胞を播種した培養フラスコを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内に入れ静置した。１７時間静置後、細胞の生着を確認し、培地交換を行った。培養フラスコ内の培地を５０ｍＬ遠沈管に回収した後に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でフラスコ内を洗浄した。ＰＢＳを除去後、２ｍＬのトリプシン（ロート社製）を加えて、細胞を剥離して、遠沈管に回収した。細胞数を測定する為、細胞懸濁液を一部取り、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ０．４％（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．１５２５０）と１：１で混合し、細胞計数盤（ワケンカウンター、ワケンビーテック社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＷＣ２－１００Ｓ）により細胞数をカウントした。細胞懸濁液を必要分採取し、遠心分離を行い、上清を取り除き、３．７５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋで継代を行った。
［間葉系幹細胞の継代数と老化の関係の検討］
凍結保存されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＡＴ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７７）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７４）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７１）を恒温槽（３７℃）にて融解し、細胞懸濁液を調整した。培養フラスコ（７５ｃｍ２、ＣＯＲＮＩＮＧ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．３２９０）に間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）を８ｍＬ入れ、それぞれの細胞懸濁液を加え、１ｍＬの間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）で、２回共洗いを行った。細胞を播種した培養フラスコを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内に入れ静置した。１７時間静置後、細胞の生着を確認し、培地交換を行った。培養フラスコ内の培地を５０ｍＬ遠沈管に回収した後に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でフラスコ内を洗浄した。ＰＢＳを除去後、２ｍＬのトリプシン（ロート社製）を加えて、細胞を剥離して、遠沈管に回収した。細胞数を測定する為、細胞懸濁液を一部取り、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ０．４％（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．１５２５０）と１：１で混合し、細胞計数盤（ワケンカウンター、ワケンビーテック社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＷＣ２－１００Ｓ）により細胞数をカウントした。細胞懸濁液を必要分採取し、遠心分離を行い、上清を取り除き、３．７５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋで継代を行った。
２、４、６、及び９若しくは１１継代目におけるヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞の細胞形態（ＵＣＭＳＣ）を顕微鏡（オリンパス社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＫＸ４１Ｎ－３２ＰＨ）により観察した（図１～３）。また、４、６及び９若しくは１１継代目における各細胞をＳＡ－β－ｇａｌ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ （β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ （ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．））により、βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｖｔｏｓｉｄａｓｅ）で、染色を行い、顕微鏡により観察した（図４～６）。さらに、各２００細胞あたりに含まれる、βガラクトシダーゼにより染色された死細胞数を計測した（図７）。４、６及び１１継代目における細胞増殖能（ＰＤＬ）を下記式（１）により計測した（図８）。なお、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞については１１継代目ではなく、９継代目で評価を行った。
図１～３に示すように、継代数が進むに従い、細胞の伸長化が進み、細胞の形態が変化することが明らかとなった。また、図４～７に示すように、継代数が進むに従い、死細胞が増えることが明らかとなった。さらに、図８に示すように継代数が進むに従い、細胞増殖能が低くなることも明らかとなった。以上より、いずれの間葉系幹細胞でも、継代数が進むにしたがっては老化が進んでいることが明らかとなった。
（実施例２）
［間葉系幹細胞の内在性マーカーの検討］
実施例１と同様に、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＡＴ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７７）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７４）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７１）を、各３サンプルずつ、間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）を用いて２、４及び６継代並びに、９、１０、若しくは１１継代培養して、培養フラスコ内の各継代時における培地（培養上清とも言う）を５０ｍＬ遠沈管に回収した。得られた培養上清から、エクソソーム回収キット（Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ製、ＣａｔＮｏ．４４７８３５９）を用いて、エクソソームを回収した。その後エクソソーム中のｍｉＲＮＡを、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従い抽出した。得られたｍｉＲＮＡからＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（５０ ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ａ２８００７）を用いてｃＤＮＡを合成し、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐのリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ５ｍｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、 ＣａｔＮｏ．４４４４９６３）、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、 ＣａｔＮｏ．Ａ２５５７６））を実施した。
［間葉系幹細胞の内在性マーカーの検討］
実施例１と同様に、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＡＴ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７７）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７４）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７１）を、各３サンプルずつ、間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）を用いて２、４及び６継代並びに、９、１０、若しくは１１継代培養して、培養フラスコ内の各継代時における培地（培養上清とも言う）を５０ｍＬ遠沈管に回収した。得られた培養上清から、エクソソーム回収キット（Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ製、ＣａｔＮｏ．４４７８３５９）を用いて、エクソソームを回収した。その後エクソソーム中のｍｉＲＮＡを、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従い抽出した。得られたｍｉＲＮＡからＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（５０ ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ａ２８００７）を用いてｃＤＮＡを合成し、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐのリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ５ｍｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、 ＣａｔＮｏ．４４４４９６３）、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、 ＣａｔＮｏ．Ａ２５５７６））を実施した。
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞の各３サンプルにおける、２、４及び６継代及び、９、１０、若しくは１１継代におけるｍｉＲ－１００－５ｐの発現は、図９に示すように、継代を経ても安定しており、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＣａｎｄｉｄａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｃｏｒｅは、０．８６であり、継代を経たサンプルにおいても発現が安定していることが示された。同様に、ｍｉＲ－２１－５ｐの発現（図１０）及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの発現（図１１）を検討したところ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの発現も継代を経ても安定しており、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＣａｎｄｉｄａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｃｏｒｅは、それぞれ、０．８８及び１．１７であり、継代を経たサンプルにおいても発現が安定していることが示された。以上の結果より、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐは、間葉系幹細胞の内在性マーカーとして有用であることが示された。
（実施例３）
［間葉系幹細胞の老化の検討］
実施例２と同様に、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＡＴ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７７）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７４）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７１）を、各３サンプルずつ間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）を用いて２、４及び６継代及び、１１継代培養して、各培養上清からエクソソームを回収した後、エクソソーム中のｍｉＲＮＡを、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従い抽出後、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１２６０ａ、ｍｉＲ－１２６－ｂ及びｍｉＲ１２９０のマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＤｅｓｉｇｎＩＤ ０４６０６４）を実施した。
［間葉系幹細胞の老化の検討］
実施例２と同様に、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＡＴ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７７）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ１２９７４）及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ、Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ社製、ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１２９７１）を、各３サンプルずつ間葉系幹細胞用無血清培地（ロート社製）を用いて２、４及び６継代及び、１１継代培養して、各培養上清からエクソソームを回収した後、エクソソーム中のｍｉＲＮＡを、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従い抽出後、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１２６０ａ、ｍｉＲ－１２６－ｂ及びｍｉＲ１２９０のマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＤｅｓｉｇｎＩＤ ０４６０６４）を実施した。
ｍｉＲ－１２６０ａ、ｍｉＲ－１２６－ｂ及びｍｉＲ１２９０の継代数による発現量の変化、“２－ΔΔＣｔ“を下記式（２）～（４）より算出し、その結果を図１２～１４に示した。ｍｉＲ－１００－５ｐを内在性マーカーとして用いることにより、老化マーカーであるｍｉＲ－１２６０ａ、ｍｉＲ－１２６－ｂ及びｍｉＲ１２９０における、サンプル間でのＲＮＡ量や逆転写効率の補正が行え、より正確な評価を行う事ができることが示された。同様に、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐを内在性マーカーとして評価した結果を、図１５～１７及び、図１８～２０に示した。ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐを内在性マーカーとした場合にも、老化マーカーであるｍｉＲ－１２６０ａ、ｍｉＲ－１２６－ｂ及びｍｉＲ１２９０の評価をより正確に行う事ができることが示された。以上より、間葉系幹細胞の老化を評価する際に、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐを間葉系幹細胞の内在性マーカーとして評価することが、有用であることが明らかとなった。
PDL=log2（培養終了時の細胞数/培養開始時の細胞数）・・・（１）
ΔCt=Ct(Target)-Ct（Internal Control）・・・（２）
ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(Passage2)・・・（３）
2^(-ΔΔCt)=各Lotにおける2の-ΔΔCt乗の平均値・・・（４）
ΔCt=Ct(Target)-Ct（Internal Control）・・・（２）
ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(Passage2)・・・（３）
2^(-ΔΔCt)=各Lotにおける2の-ΔΔCt乗の平均値・・・（４）
本発明の方法によると、培養細胞自体を消費することなく、その培養細胞の品質を評価することができる。そのため、評価のためだけに別途培養細胞を用意する必要がなく、手間とコストを大幅に低減することができる。また、それに加えて、従来の方法と比較し、より安定的に、且つより高い確度で、培養細胞の老化の程度を評価することができる。したがって、本発明の方法は、移植、細胞治療等、培養細胞をヒトに投与して用いる際の培養細胞の品質管理試験として特に好適に用いることができる。
Claims (8)
- ｍｉＲＮＡを指標に間葉系幹細胞の品質を評価する方法であって、
前記間葉系幹細胞又は前記間葉系幹細胞の培養上清中の、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標とすることを特徴とする、間葉系幹細胞の品質を評価する方法。 - 前記間葉系幹細胞が、脂肪由来、骨髄由来又は臍帯由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐが、前記間葉系幹細胞又は前記間葉系幹細胞の培養上清中のエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記品質の評価が、配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを指標として行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
- 培地中で間葉系幹細胞を培養する工程、
培養上清の一部をサンプリングする工程
サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、
回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、
ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、及び
ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを調整する工程
を含む、間葉系幹細胞の品質を評価する方法。 - ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを内在性の指標として有する、間葉系幹細胞品質判定用キット。
- ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを少なくとも１つ有する、請求項６に記載の間葉系幹細胞品質判定用キット。
- 配列番号１～９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを少なくとも１つ有する、請求項７に記載の間葉系幹細胞品質判定用キット。
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