JP2016144439A

JP2016144439A - 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット

Info

Publication number: JP2016144439A
Application number: JP2015056546A
Authority: JP
Inventors: 里枝武田; Rie Takeda; 強石井; Tsutomu Ishii; 孝広落谷; Takahiro Ochitani
Original assignee: NAT CANCER CT; NATIONAL CANCER CENTER; Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: NAT CANCER CT; NATIONAL CANCER CENTER; Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2016-08-12
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: JP6694240B2

Abstract

【課題】移植等に用いる培養細胞の品質管理試験として、前記培養細胞を消費することなく、その培養細胞の老化の程度を評価することができる新規な方法の提供。
【解決手段】細胞の培養上清中のｍｉＲＮＡを指標として、前記細胞の老化を評価する方法であり、前記ｍｉＲＮＡが、特定な配列の塩基配列からなるｍｉＲＮＡより選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡであり、培養上清中のエクソソームに含まれる、ｍｉＲＮＡであり、前記細胞が脂肪由来間葉系幹細胞で無血清培地による培養である、方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞の老化を評価する方法、及び細胞の老化判定キットに関する。

再生医療の分野では、移植等に用いる細胞については、培養の過程及び最終製品の段階で、均質な細胞が得られているか否かを所定の品質管理試験により評価することが必要となる。現在行われている品質管理試験の多くにおいては、細胞自体を使用する必要があるため、評価によって貴重な細胞が失われるという不都合がある。また培養工程中に品質を迅速に評価することは難しい。

近年、塩基数が１７から２４の一本鎖ＲＮＡであるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）が注目されている。このｍｉＲＮＡは、自身と相補的な塩基配列をもったｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の翻訳を阻害する機能を有しており、幹細胞から組織細胞への分化において重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１）。また、このｍｉＲＮＡが血液中に存在しているという報告（非特許文献２）、組織がん細胞中に特定のｍｉＲＮＡが存在しているという報告（特許文献１）等があり、がん等の疾病に対する診断、それらの予後予測等に利用できる可能性があることも知られている。

一方、ｍｉＲＮＡを用いた従来技術として、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することで培養細胞を消費することなく培養細胞の評価やバイオマーカーのスクリーニングをすることができる手段が開示されている（特許文献２）。また、細胞の特性評価やプロファイリングのために、非コードＲＮＡ分子を使用する技術（特許文献３）や、癌遺伝子を導入して形質転換させた間葉系幹細胞の状態をモニタリングする指標としてｍｉＲＮＡを用いる技術（特許文献４）が開示されている。

特開２００９−１００６８７号公報国際公開２０１１／００１９０６号特表２０１３−５３５９７９号公報特表２０１３−５０９１７９号公報

Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８；３６：１３５４−１３６９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００８；１０５：１０５１３−８

本発明は、上述のような状況の中、移植等に用いる培養細胞の品質管理試験として、前記培養細胞を消費することなく、その培養細胞の老化の程度を評価することができる新規な方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明者が種々検討した結果、細胞の培養上清中に分泌されるｍｉＲＮＡの種類、量が細胞の老化の程度に応じて変化することを見出した。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。

（１）細胞の培養上清中のｍｉＲＮＡを指標として、前記細胞の老化を評価する方法。
（２）前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡである、（１）記載の方法。
（３）前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１、４、６、１２〜１４、１６、２１、２６、２９、３０、３７、４０、４４〜４９、６７、６８、８０、８１、８６及び９５の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡである、（２）記載の方法。
（４）前記ｍｉＲＮＡが、前記培養上清中のエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡである、（１）から（３）のいずれか記載の方法。
（５）前記細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞である、（１）から（４）のいずれか記載の方法。
（６）前記細胞の培養が、無血清培地による培養である、（１）から（５）のいずれか記載の方法。
（７）無血清培地中で細胞を培養する工程、
特定の時期に培養上清の一部をサンプリングする工程、
サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、
回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、及び
ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程
を含む、細胞の老化を評価する方法。
（８）前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程において測定するｍｉＲＮＡが、配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種である、（７）記載の方法。
（９）前記配列番号１〜１３、１６〜６９の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルが所定の基準値よりも低い場合、及び／又は配列番号１４若しくは１５、７０〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの発現レベルが所定の基準値より高い場合に、前記細胞の老化の程度が高いと評価する、（８）記載の方法。
（１０）配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを少なくとも１つ有する、細胞老化判定用キット。

本発明の方法によると、培養細胞自体を消費することなく、その培養細胞の老化の程度を評価することができる。そのため、評価のためだけに別途培養細胞を用意する必要がなく、手間とコストを大幅に低減することができる。本発明の方法は、移植、細胞治療等、培養細胞をヒトに投与して用いる際の培養細胞の品質管理試験として特に好適に用いることができる。

脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴うｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ）の発現レベルの変化を示す図である。脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴うｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ）の発現レベルの変化を示す図である。脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴うｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０）の発現レベルの変化を示す図である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、細胞の培養上清中のｍｉＲＮＡを指標として、前記細胞の老化を評価する方法である。ヒトに投与する細胞の品質管理のために、細胞の老化の程度を評価することは重要である。細胞は老化により機能の低下や老廃物の蓄積・排出等を引き起こす。そのため、ヒトに投与する細胞については、十分な機能を備えるだけでなく、患者に害を与えることがないように、老化がより進んだ細胞や、老化した細胞の比率が高い細胞集団ではないことを確認することが必要である。

ここで、「細胞の老化」とは、細胞レベルの加齢を指す。細胞は老化により、増殖能が減退して最終的には増殖がストップする。このような増殖能の減退等は、主に、ＤＮＡへの酸化損傷、及び、蛋白質及び脂質の酸化を原因として起こると言われている。また、細胞の老化には、細胞周期や細胞分裂、細胞分化等の変化を伴うことも知られている。

また、ここで、「老化を評価する」とは、細胞の老化の程度を判定することを意味する。なお、細胞への環境刺激、化学物質による種々の影響が、前記老化と同様の変化を細胞にもたらすものである場合には、本発明の方法は、このような細胞の状態を評価する方法としても用いることができる。本発明は、細胞の老化を評価することで、老化していない細胞を選択する方法、及びこの方法によって選択される細胞も提供することができる。さらに、本発明の細胞の老化を評価する方法を用いて、細胞をモニターしながら老化していない細胞の培養を継続する培養方法も提供する。老化の指標となるｍｉＲＮＡを複数組み合わせて測定できるように、対応するプローブ等を含んだ細胞老化判定用のキットも提供できる。

（細胞）
本発明における細胞としては、インビトロ条件下で培養できる細胞であれば特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。また、インビトロ条件下で培養できるのであれば、哺乳動物より摘出した組織を形成する細胞であっても、インビトロで株化された細胞であってもよい。

インビトロ条件下で培養できる哺乳動物由来の細胞としては、例えば、幹細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞等）、組織前駆細胞、組織細胞（骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、線維芽細胞、肝臓細胞等）、がん細胞、がん由来細胞株等が挙げられる。なお、間葉系幹細胞としては、その由来によって例えば骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞等が挙げられる。

これらのうち、継代数が少ない短期間のうちに増殖能が低下してしまうような、老化が比較的早く起こる細胞に対して、本発明の方法が極めて有効である。即ち、このような細胞に対して本発明の評価方法を適用すると、老化が起こる前の細胞であることを確認して適切に治療に用いることができる。このように老化が比較的早く起こる細胞としては、例えば、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞等が挙げられる。

（培養）
本発明における細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。

本発明の細胞の培養に用いる培地としては、当業者に従来公知のものを細胞の種類毎にそれぞれ選択して用いることができ、特に限定されない。培養後の細胞をヒトに投与するという観点から、動物血清を含まない無血清培地であることが好ましい。なお、培養後の細胞をヒト等に投与する目的以外に用いる場合には、培地中に動物由来の血清が含有されていてもよい。

前記無血清培地としては、添加剤としての動物血清を含まない培地であればよく、特に限定されない。公知の基本培地に、動物血清を除くその他添加剤を含有した組成を有するものを用いることができる。基本培地の組成は、培養するべき細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓＦ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等が挙げられる。

基本培地に加えるその他の添加剤としては、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類及び炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の哺乳動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。

アミノ酸類としては、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。

無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。

他の添加剤としては、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の増殖因子；ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５'−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン等が挙げられる。

本発明の方法に用いられる、間葉系幹細胞に好適な無血清培地としては、例えば、当業者に公知な基本培地に、添加剤としてインスリン、トランスフェリン、ＰＤＧＦ及びｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク性因子を添加したものが挙げられる。この無血清培地は、抗酸化剤、動物血清アルブミン、界面活性剤等をさらに含有してもよい。

（ｍｉＲＮＡ）
本発明の方法において、細胞の老化の指標として用いるｍｉＲＮＡとしては、細胞の老化に応じて細胞から分泌される量が変化するものであれば特に限定されない。また、このようなｍｉＲＮＡとしては、細胞の種類によってそれぞれ適切なものが選択され得る。例えば、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化の指標としては、配列表の配列番号１〜９６に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡが好ましい。これらはいずれも、下記実施例において、細胞の老化に応じて培養上清中の存在量が変化することが具体的に確認されているものである。

例えば、下記実施例に記載されるように、配列番号１〜１３、１６〜６９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９９（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４６（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７１３−３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１７−５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７９３−５ｐ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１３１（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６８５−５ｐ（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７４３−５ｐ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４４３（配列番号２７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９８（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４−３ｐ（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８４（配列番号３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８５−３ｐ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７７８−５ｐ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｆ（配列番号３４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５９ａ−３ｐ（配列番号３５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号３６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７２８−５ｐ（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０７−３ｐ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２７−５ｐ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ（配列番号４１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７−３ｐ（配列番号４２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−５ｐ（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１００（配列番号４４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−３ｐ（配列番号４５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６９（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７３９（配列番号４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８５（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５ｂ（配列番号５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９６−５ｐ（配列番号５１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６３２−５ｐ（配列番号５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２７６（配列番号５３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２４−５ｐ（配列番号５４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４−５ｐ（配列番号５５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ（配列番号５６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８０−３ｐ（配列番号５７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ（配列番号５８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５５−５ｐ（配列番号５９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８７（配列番号６０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９０−３ｐ（配列番号６１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７３８−３ｐ（配列番号６２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９６（配列番号６３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｅ（配列番号６４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０（配列番号６５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３１（配列番号６６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２７（配列番号６７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６５（配列番号６８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９８（配列番号６９）は、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴って培養上清への分泌が減少するものである。また、配列番号１４、１５、７０〜９６に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７５（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９−５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７０（配列番号７０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２７８（配列番号７１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１３０（配列番号７２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８−５ｐ（配列番号７３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６−３ｐ（配列番号７４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３９−５ｐ（配列番号７５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６９７−５ｐ（配列番号７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８４（配列番号７７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１３２（配列番号７８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６８ｂ（配列番号７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８７（配列番号８０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５９（配列番号８１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３９２（配列番号８２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１５（配列番号８３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５３４（配列番号８４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ（配列番号８５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ（配列番号８６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０７（配列番号８７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５８７（配列番号８８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５３２（配列番号８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９５−３ｐ（配列番号９０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６２（配列番号９１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６３−３ｐ（配列番号９２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０５（配列番号９３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９７（配列番号９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号９５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５７（配列番号９６）は、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化に伴って培養上清への分泌が増加するものである。

これらのうち、ヒトの脂肪由来間葉系幹細胞の老化（品質）の指標として測定するｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４６（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７１３−３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４−３ｐ（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８４（配列番号３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７２８−５ｐ（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１００（配列番号４４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−３ｐ（配列番号４５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６９（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７３９（配列番号４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８５（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２７（配列番号６７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６５（配列番号６８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７５（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８７（配列番号８０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５９（配列番号８１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ（配列番号８６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号９５）からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。

中でも、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４６（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７２８−５ｐ（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１００（配列番号４４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−３ｐ（配列番号４５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７３９（配列番号４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８５（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２７（配列番号６７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８７（配列番号８０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５９（配列番号８１）からなる群より選択される少なくとも１種がより好ましい。

更に、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４６（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−３ｐ（配列番号４５）からなる群より選択される少なくとも１種が特に好ましい。

細胞の老化の指標としては、ｍｉＲＮＡをいずれか１種類のみ測定してもよいし、複数種類測定してもよい。老化の指標となる特定のｍｉＲＮＡを複数測定できるように、必要な試薬を組み合わせた評価測定キットとして用いることもできる。

本発明におけるｍｉＲＮＡとしては、培養液中に細胞から直接分泌されるものでもよいし、細胞から放出されるエクソソーム中に含まれる形で培養液中に放出されるものでもよい。細胞の老化の評価には、細胞から放出されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡを測定することが好ましい。細胞から放出されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡを測定することにより、精度よく細胞の老化の程度を評価することができる。

以下に、本発明の方法を各工程に分けて、具体的に説明するが、以下に示す方法に限定されない。

本発明の、細胞の老化を評価する方法は、以下の工程を含む。
（ｉ）無血清培地中で細胞を培養する培養工程、
（ｉｉ）特定の時期に培養上清の一部をサンプリングする工程、
（ｉｉｉ）サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、
（ｉｖ）回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、及び
（ｖ）ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程

本発明の方法は、さらに、
（ｖｉ）老化細胞を検出する工程を含んでいてもよい。

（ｉ）培養工程
本工程においては、無血清培地中で細胞を培養する。細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。なお、培養は、細胞の全培養期間に渡って無血清培地を用いて行われてもよいし、ｍｉＲＮＡの測定のために回収する培養上清についてのみ無血清培地としてもよい。ここで、用いる無血清培地については、前記（培養）の項での説明を適用できる。

（ｉｉ）特定の時期に培養上清の一部をサンプリングする工程
細胞の老化の程度を評価したい細胞について、継代１日後〜５日後、好ましくは１日後〜４日後、より好ましくは１日後〜３日後、さらに好ましくは２日後〜３日後に、培養上清の一部をサンプリングする。サンプリングする液量は、その後の分析に十分な量であれば特に制限されない。なお、細胞の老化の評価の際の基準値を算出するために、老化が起こる以前の細胞増殖能等を十分に保持している状態の細胞についても培養上清のサンプリングをすることができる。

（ｉｉｉ）サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程
エクソソームの回収は、当業者に公知の多くの方法を用いて行われ得る。一般には、超遠心分離法を用いた方法が広く用いられるが、市販のエクソソーム単離キット（Ｔｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等）を用いることもできる。

（ｉｖ）回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程
エクソソームからｍｉＲＮＡを抽出するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のｍｉＲＮＡ抽出用キット（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ等）を用いることもできる。

（ｖ）ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程
抽出した全ｍｉＲＮＡ中のいくつかのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のｍｉＲＮＡ用のマイクロアレイ（ＡｇｉｌｅｎｔＤｅｓｉｇｎＩＤ０４６０６４等）を用いることで、複数種のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを確認することができる。また、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙｓ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等）を用いることでもそれぞれのｍｉＲＮＡの発現レベルを確認することができる。

細胞の老化によって増減することが判明している特定のｍｉＲＮＡについて、そのｍｉＲＮＡの発現レベルを、老化が起こる以前の細胞が分泌するｍｉＲＮＡの発現レベル（基準値）と比較して、老化の程度を評価することができる。また、基準値以外に、それぞれの細胞、ｍｉＲＮＡの種類毎に適切な閾値を決め、その値を超える、又は下回る値になった場合には、老化の程度が激しくヒトへの投与には不向きである等との判断をすることもできる。

（ｖｉ）老化細胞を検出する工程
本工程は、本発明の方法による老化の評価を確認するために、老化細胞を検出する工程である。老化細胞を検出するためには、当業者に公知の多くの方法を用いることができる。また、市販のＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現検出キット（ＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いることもできる。

（細胞老化判定用キット）
本発明の細胞老化判定用キットは、測定対象又は測定原理等に応じた種々の構成をとることができる。本発明のキットの構成要素として、例えば、細胞の老化に伴って培養上清中の発現が増減するｍｉＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の増幅用プライマー、及びＤＮＡチップ等で使用するハイブリダイゼーション用のプローブを含むことができる。このような細胞の老化に伴って培養上清中の発現が増減するｍｉＲＮＡとしては、本発明の細胞の老化を評価する方法において指標として採用するｍｉＲＮＡが好ましい。具体的には、配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡである。

さらに、本発明のキットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。なお、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。このような標識物質としては、例えば、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＪａｐａｎ社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等が挙げられる。

以下に本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［脂肪由来間葉系幹細胞の調製及び培養］
３人の提供者からの脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＰＴ−５００６、Ｌｏｎｚａ社）を、無血清培地にて馴化した後、２〜５日おきに継代しながら培養を行った。

［ｍｉＲＮＡサンプルの調製及び解析］
（マイクロアレイ）
前記脂肪由来間葉系幹細胞について、４回継代後、６回継代後、１１回継代後のそれぞれ３日目に、培養上清を各フラスコから１００ｍＬずつサンプリングした。前記各継代ステージ（４回継代、６回継代、１１回継代）でサンプリングした培養上清から市販の試薬（Ｔｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてエクソソームを回収した。その後エクソソーム中のｍｉＲＮＡを、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従い抽出後、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ（ＡｇｉｌｅｎｔＤｅｓｉｇｎＩＤ０４６０６４）を実施した。結果のまとめを下記表１に示した。各数値は、各継代数における、ｍｉＲＮＡの発現レベルの比を表している。

下記表１中の表記の説明を以下に示す。
Ｐ６／Ｐ４：６回継代後（Ｐ６）の培養上清中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、４回継代後（Ｐ４）の培養上清中のｍｉＲＮＡの発現レベルで除した値のＬｏｇ値
Ｐ１１／Ｐ６：１１回継代後（Ｐ１１）の培養上清中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、６回継代後（Ｐ６）の培養上清中のｍｉＲＮＡの発現レベルで除した値のＬｏｇ値
Ｐ１１／Ｐ４：１１回継代後（Ｐ１１）の培養上清中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、４回継代後（Ｐ４）の培養上清中のｍｉＲＮＡの発現レベルで除した値のＬｏｇ値
ｕｐ：継代回数が増えるに従って（細胞の老化の度合いが増すに従って）、培養上清中に含まれる量が増加するｍｉＲＮＡであることを示す。
ｄｏｗｎ：継代回数が増えるに従って（細胞の老化の度合いが増すに従って）、培養上清中に含まれる量が減少するｍｉＲＮＡであることを示す。

脂肪由来間葉系幹細胞は、４回継代後（Ｐ４）前後までは十分な増殖能を示したが、継代回数が増えていくにつれて増殖速度が遅くなった。１１回継代後（Ｐ１１）前後になるとほとんど増殖が見られなくなった。各培養上清について、マイクロアレイで合計２００６種類のｍｉＲＮＡの発現レベルを確認したところ、表１に示したｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ、及び表２〜表４に示したｍｉＲＮＡの培養上清中の発現レベルは、細胞の増殖能の低下と共に顕著に減少した。逆に、表１に示したｍｉＲＮＡのうちｈｓａ−ｍｉＲ−１２７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９−５ｐ、及び表５に示したｍｉＲＮＡの培養上清中の発現レベルは顕著に増加した。なお、全２００６種類のうち、１２２６種類のｍｉＲＮＡでは、発現レベルが検出限界以下であるか、または老化に伴う変化がほとんど見られなかった。

（定量的リアルタイムＰＣＲ）
前記マイクロアレイの結果、細胞の老化に伴って発現が顕著に減少する結果が得られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ（配列番号１３）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０（配列番号１）について、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙｓ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、さらに詳細に発現レベルを確認した。結果を図１〜３にそれぞれ示すように、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０の発現は、脂肪由来間葉系幹細胞の継代回数が増えるに従って（老化に伴って）、顕著に減少することが確認できた。

本発明の方法によると、培養細胞自体を消費することなく、その培養細胞の老化の程度を評価することができる。そのため、評価のためだけに別途培養細胞を用意する必要がなく、手間とコストを大幅に低減することができる。本発明の方法は、移植等、培養細胞をヒトに投与して用いる際の培養細胞の品質管理試験として好適に用いることができる。

Claims

細胞の培養上清中のｍｉＲＮＡを指標として、前記細胞の老化を評価する方法。
前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡである、請求項１記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１、４、６、１２〜１４、１６、２１、２６、２９、３０、３７、４０、４４〜４９、６７、６８、８０、８１、８６、及び９５の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡである、請求項２記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡが、前記培養上清中のエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡである、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
前記細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞である、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
前記細胞の培養が、無血清培地による培養である、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
無血清培地中で細胞を培養する工程、
特定の時期に培養上清の一部をサンプリングする工程、
サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する工程、
回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する工程、及び
ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程
を含む、細胞の老化を評価する方法。
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程において測定するｍｉＲＮＡが、配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種である、請求項７記載の方法。
前記配列番号１〜１３、１６〜６９の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルが所定の基準値よりも低い場合、及び／又は配列番号１４若しくは１５、７０〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの発現レベルが所定の基準値より高い場合に、前記細胞の老化の程度が高いと評価する、請求項８記載の方法。
配列番号１〜９６の塩基配列からなるｍｉＲＮＡの群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを少なくとも１つ有する、細胞老化判定用キット。