CN110191966B

CN110191966B - 评价细胞的分化状态的方法

Info

Publication number: CN110191966B
Application number: CN201780083785.5A
Authority: CN
Inventors: 相原祐希
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: AU2017394729A1; WO2018135288A1; JP2018113924A; US20190338359A1; CN110191966A; JP6629770B2; AU2017394729B2; AU2017394729A2; EP3572524A1; EP3572524A4

Abstract

提供一种不会破坏分化诱导后的细胞、能够高灵敏度地检测多能干细胞的方法。本发明提供一种评价细胞培养液中的细胞的分化状态方法，其测定多能干细胞的分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA，基于miRNA测定值评价所述细胞培养液中的细胞的分化状态。本发明提供一种多能干细胞的检测方法，其包含下述工序：测定多能干细胞的分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA的工序；基于miRNA测定值检测所述细胞培养液的多能干细胞的工序。

Description

评价细胞的分化状态的方法

技术领域

本发明涉及评价细胞的分化状态的方法。

背景技术

在再生医疗中，进行使多能干细胞分化为期望的细胞的操作。但是，即使通过分化诱导操作，也不一定所有多能干细胞都进行分化，有时多能干细胞会残存。如果在残留有多能干细胞的状态下进行细胞移植，则有可能由所移植的细胞产生肿瘤。因此，需要评价培养基中的细胞的分化状态。

作为在分化诱导操作后检测hiPSCs(human induced pluripotent stem cell；人iPS细胞)的技术，已知非专利文献1中所述的方法。非专利文献1中记载了下述方法：在分化诱导操作后采集部分细胞并进行RNA提取，通过qRT-PCR测定LIN28 mRNA的表达量；基于该测定结果检测残存的hiPSCs。但是，再生医疗中所制备的细胞均很珍贵，如非专利文献1那样为了评价分化细胞的品质而消耗部分细胞的破坏性检查是不优选的。作为非破坏性检查的一例，可列举非专利文献2中所述的方法。非专利文献2中记载了下述方法：以存在于分化诱导操作后的培养上清中的过糖基化足萼糖蛋白为指标，来检测残存的多能干细胞。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Kuroda,et al.,PLoS ONE,2012,May,Volume 7(5),e37342

非专利文献2:Tateno,et al.,SCIENTIFICREPORTS,2014,4,4069

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于，提供不会破坏细胞、能够高灵敏度地检测多能干细胞的方法。

用于解决课题的手段

本发明提供一种评价细胞培养液中的细胞的分化状态的方法，其测定多能干细胞的分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA，基于miRNA测定值评价上述细胞培养液中的细胞的分化状态。本发明人新发现多能干细胞向细胞外释放miR302/367簇的miRNA，发现通过测定细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA可以评价细胞的分化状态。

本发明提供一种评价分化状态未知的细胞的分化状态的方法，其为评价从多能干细胞向分化细胞分化的分化状态的方法，其中，取得已知包含多能干细胞的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA测定值、已知不含多能干细胞而包含分化细胞的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA测定值、和包含分化状态未知的细胞的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA测定值，对这些测定值进行比较，从而评价分化状态未知的细胞的分化状态。

本发明提供一种多能干细胞的检测方法，其包含下述工序：测定多能干细胞的分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA的工序；基于miR302/367簇的miRNA测定值检测上述细胞培养液的多能干细胞的工序。

本发明提供一种miRNA测定方法，其包含下述工序：在细胞培养液中对多能干细胞进行分化诱导的工序；和，取得分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的液相级分中的miR302/367簇的miRNA的测定值的工序。

发明的效果

根据本发明，提供实质上不会破坏细胞、能够高灵敏度地检测多能干细胞的方法。

附图说明

图1是示出实施例1的结果的图表。

图2是示出实施例2中的miR302a的测定结果的图表。

图3是示出实施例2中的miR302b的测定结果的图表。

图4是示出实施例2中的miR302c的测定结果的图表。

图5是示出实施例2中的miR302d的测定结果的图表。

图6是示出实施例2中的miR367的测定结果的图表。

图7是示出比较例1中的miR371的测定结果的图表。

具体实施方式

本实施方式的方法中使用的试样为对多能干细胞进行分化诱导时所使用的细胞培养液的液相级分。该液相级分为分化诱导操作的过程中和/或分化诱导操作后的细胞培养液的液相级分。在本说明书中，“细胞培养液”是收容于培养器的用于细胞培养·分化的液体培养基，包含培养基和多能干细胞和/或分化细胞。“液相级分”是指分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的溶液部分的全部或一部分，实质上不含细胞。

多能干细胞是具有分化成源自外胚层、内胚层及中胚层的细胞的能力(分化多能性；pluripotency)且具有增殖能力的干细胞。可列举例如：人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、源自通过核移植而得的克隆胚胎的胚胎干细胞(ntES细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)等。

iPS细胞是通过将特定的重编程因子(DNA或蛋白质)导入皮肤细胞等体细胞而制作的、具有多分化能力和增殖能力的干细胞。ES细胞是源自哺乳动物囊胚的内部细胞块的干细胞，是具有多分化能力和增殖能力的干细胞。ntES细胞是由源自克隆胚胎的囊胚内部细胞块建立的ES细胞，其中，所述克隆胚胎是将未受精卵的核置换为体细胞的核而得到的。ntES细胞具有与ES细胞几乎相同的性质。EG细胞是由胎生期的原始生殖细胞建立的、具有与ES细胞同样的多能性的细胞，可通过在LIF、bEGF、干细胞因子(stem cell factor)等物质的存在下培养原始生殖细胞从而建立。

多能干细胞可以是从生物体采集的多能干细胞，也可以是对由生物体采集的分化细胞进行重编程而人工制备的细胞。从再生医疗研究·临床适用的观点出发，优选为人工制备的细胞。多能干细胞的来源没有特别限定。优选为人、猴、狗、猫、马、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、绵羊、猪、牛等哺乳动物来源。

分化诱导是指：用包含诱导干细胞的分化的因子的培养基培养多能干细胞而使其分化的操作。作为细胞培养液，可以使用公知的培养基。可列举例如：IMDM培养基、Medium199培养基、EMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、MEF-CM、StemPro(商标)34(Invitrogen公司)、Essential 8(商标)(Thermo Fisher Scientific公司)、hPSC Growth Medium DXF(商标)(宝生物公司)、StemFit AK02N(商标)(宝生物公司)、这些的混合培养基等。

作为分化诱导因子，可以根据分化细胞的种类而使用公知的物质。细胞培养液除了包含分化诱导因子以外，还可以包含细胞的增殖·维持所必需的成分。可列举例如：血清、白蛋白、转铁蛋白、Knockout Serum Replacement(KSR公司)、N2补充剂(Invitrogen公司)、B27补充剂(Invitorogen公司)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(商标)(Invitorogen公司)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、ROCK抑制剂、Wnt信号抑制剂等。

分化诱导的方法没有特别限制，通常使用悬浮培养、粘附培养或将这些组合使用。悬浮培养是指：在相对于培养器无粘附性的条件下进行的培养。悬浮培养中，细胞未必需要分散在细胞培养液中，也可以是细胞沉降到培养器的底部。悬浮培养中使用的培养器没有特别限制，可列举例如烧瓶、培养皿、平板、室、管等。悬浮培养中使用的培养器优选为非细胞粘附性的。培养器优选为疏水性的材质或者表面以用于防止细胞粘附的涂敷剂(例如，聚甲基丙烯酸羟基乙酯共聚物等)被覆。

粘附培养是指：将多能干细胞粘附于支撑体而进行的培养。作为支撑体，使用培养器。粘附培养中使用的培养器没有特别限定。粘附培养中，可以使用与悬浮培养中使用的培养器同样的培养器，培养器的表面优选被使细胞粘附的涂敷剂(也被称为细胞培养基质、粘附基质等)覆盖。作为使细胞粘附于培养器的表面的涂敷剂，可例示明胶、层粘连蛋白、胶原蛋白、聚-D-赖氨酸、聚鸟氨酸、纤连蛋白、玻连蛋白等。也可以使用包含层粘连蛋白511-E8片段的iMatrix-511(nippi公司)等市售品。另外，作为支撑体，也可以使用公知的支架。通过使用支架，多能干细胞以支架为立足点而增殖，从而能够进行三维培养。作为这种支架，可以使用市售品，可列举例如Matrigel(商标)(康宁公司)、QGel(商标)MT 3DMatrix(QgelSA公司)、3-DLife Biomimetic(Cellendes公司)、Puramatrix(3D MATRIX公司)、alvetex(reinnavate公司)等。

培养条件可根据多能干细胞的种类、分化细胞的种类适宜调整。例如培养温度优选为约30～40℃、二氧化碳浓度优选为约1～10％。

在本实施方式的方法中，采集细胞培养液的液相级分来作为miRNA测定的试样。从细胞培养液中取得液相级分方法没有特别限定。

在通过悬浮培养进行分化诱导时，可对包含细胞的细胞培养液进行离心，取得离心后的上清来作为本实施方式的液相级分。由于细胞会在细胞培养液中沉降，因此也可以使细胞分散后从培养器下部取得液相级分。将包含细胞的细胞培养液用过滤器过滤而分离成包含细胞的级分和液相级分，从而可以取得液相级分。在所取得的液相级分中可能混入了细胞的情况下，可以进一步通过离心分离、过滤器等分离·除去细胞。

在通过粘附培养进行分化诱导的情况下，细胞会粘附于培养器的底部，因此可以通过吸管等抽吸培养器的液相级分。当液相级分中可能存在从底部剥离的细胞时，可以对液相级分进行离心分离而分离·除去细胞。

通过分化诱导操作得到的细胞只要是通过使多能干细胞分化而失去多能性(pluripotency)的细胞则没有特别限定。在本说明书中，将使多能干细胞分化而得到的细胞称为“分化细胞”。作为分化细胞的例子，可列举造血干细胞等具有多分化潜能(multipotency)的细胞、神经干细胞等具少向性(oligopotency)的细胞、前体细胞等具有单能性(unipotency)的细胞、终末分化细胞等。在本说明书中，将不具有分化能力的细胞称为“终末分化细胞”。作为终末分化细胞的例子，可列举皮肤、视网膜、角膜、内外耳、脑、脊髓、末梢神经、肾上腺髓质(源自外胚层的细胞)、真皮、骨骼肌、骨、软骨、肾脏、血细胞、血管内皮、肾上腺皮质(源自中胚层的细胞)、胃、肝脏、胰脏、肠、甲状腺(源自内胚层的细胞)等细胞。

成为本实施方式的测定对象的miRNA为miR302/miR367簇的miRNA。编码人的miR302及miR367的基因簇在基因组上位于LARP7基因的内含子，且形成miR302/miR367簇。在本说明书中，“miR302/367簇的miRNA”是指由这些基因转录出的miRNA。miR302形成包含miR302a、miR302b、miR302c及miR302d的家族，也被称为miR302家族。miRNA由在基因转录之后经由pri-miRNA及pre-miRNA而成熟。在本实施方式中，优选测定成熟miRNA。miR302a、miR302b、miR302c及miR302d的成熟miRNA的核苷酸序列如序列号1～4所示。另外，miR367的成熟miRNA的核苷酸序列如序列号5所示。需要说明的是，编码这些miRNA的基因分别在GenBank数据库中如表1那样进行公开。

[表1]

基因	GenBank登录号
		miR302a基因	NR_029835.1
miR302b基因	NR_029857.1
		miR302c基因	NR_029858.1
miR302d基因	NR_029859.1
		miR367基因	NR_029860.1

miRNA的测定方法没有特别限制，可以使用公知的方法。可列举例如：利用探针的杂交的测定法、利用核酸扩增法的测定法、利用质量分析法的测定法、利用测序的测定法等。作为利用探针的杂交的测定法，可列举例如：微阵列法、Northern杂交法、RNase保护分析等。作为利用核酸扩增法的测定法，可列举例如定量RT-PCR法、定量RT-LAMP法等。作为定量RT-PCR法，可列举例如SYBR(商标)Green法、TaqMan(商标)法等。由于扩增对象即miRNA短，因此在利用核酸扩增的方法中通常使用茎环引物、poly(A)添加法等。

在本实施方式中，基于miR302/miR367簇的miRNA的测定值来检测多能干细胞。miR302/miR367簇的miRNA具有在多能干细胞的细胞内与特定的mRNA结合、抑制其翻译为蛋白质的功能，因此而知晓其存在于细胞内。但是，并不知晓其会释放到多能干细胞的细胞外。在分化细胞，miR302/miR367簇的miRNA不表达，因此可以基于液相级分中的miR302/miR367簇的miRNA的测定值检测多能干细胞。

在本说明书中，“测定值”是反映miRNA的液相级分中的存在量的值。可以列举例如光学测定值(荧光强度、浊度、吸光度等)、光学测定值达到规定的基准值时的反应循环数或反应时间、使用标准曲线算出的miRNA的定量值(拷贝数、质量、浓度)等。规定的基准值可以根据表示miRNA存在量或浓度的值的种类适宜设定。例如，在使用定量RT-PCR法的情况下，可以以规定的循环数为基准值设定核酸扩增反应显示指数扩增时的荧光强度的变化量。

分化诱导操作到完成为止通常需要几小时～几个月。在一实施方式中，将分化诱导开始后且分化诱导完了前、即分化诱导时的细胞培养液的液相级分供于miRNA测定。这种情况下，通过检测残存的多能干细胞可以监控分化诱导操作中的多能干细胞的分化状态。例如，通过在分化诱导开始前和分化诱导中测定miR302/miR367簇的miRNA并对测定值进行比较，可以评价分化的进行状况。更具体而言，当分化诱导开始前和分化诱导中的miR302/miR367簇的miRNA测定值没有大的变化时，判定分化诱导没有较好地进行，可以中断分化操作。在分化诱导中检测不到miR302/miR367簇的miRNA时，判断多能干细胞已全部分化，可以结束分化诱导操作。

在另一实施方式中，可以在分化诱导中的多个时刻测定miR302/miR367簇的miRNA并对测定值进行比较，从而监控分化的进行状况。具体而言，可以在分化诱导中的第1时刻从细胞培养液中采集液相级分并测定miR302/miR367簇的miRNA，取得第1测定值，在分化诱导中的第2时刻从细胞培养液采集液相级分并测定miR302/miR367簇的miRNA，取得第2测定值，对第1测定值和第2测定值进行比较来评价分化状况。

在另一实施方式中，将结束了分化诱导操作后的细胞培养液的液相级分供于miRNA测定。即使分化诱导操作本身结束，多能干细胞也不一定全部分化，可能有较少的残留。如上所述，这种残存的多能干细胞有形成肿瘤的风险，因此，作为分化诱导操作结束后的细胞团的品质检查，进行残存多能干细胞的检测。该检测结果例如可以用于肿瘤化风险的判定等。在肿瘤化风险的判定中，例如从分化诱导后的液相级分检测miR302/miR367簇的miRNA，当判定多能干细胞残存，可判定为分化诱导后的细胞形成肿瘤的风险高。这种情况下，可进行中断移植、进一步继续进行分化诱导等判断。当判定为不残存多能干细胞时，可判定为分化诱导后的细胞形成肿瘤的风险低。这种情况下，可进行向生物体移植分化诱导后的细胞等判断。

在另一实施方式中，可以在分化诱导中及分化诱导结束后进行多能干细胞的检测。这种情况下，可以进行分化诱导中的分化状况的监控、和分化诱导后细胞的品质检查。

在上述任一实施方式中，在分化诱导时将培养基更换为新培养基的情况下，均可以将旧培养基供于miRNA测定。

在本说明书中，“检测”包括：定性判定多能干细胞是否存在、对多能干细胞进行定量、及半定量地检测多能干细胞的存在量。半定量的检测是指：将多能干细胞的存在量以“-”“+”“++”(阴性、弱阳性、强阳性)等方式阶梯型地示出。

在判定多能干细胞是否存在时，例如可以将液相级分中的miR302/miR367簇的miRNA测定值与规定阈值进行比较。当miR302/miR367簇的miRNA测定值为阈值以上时，可以判定为多能干细胞存在；当低于阈值时，可以判定多能干细胞不存在。

在对多能干细胞进行定量时，例如可以基于标准曲线由液相级分中的miR302/miR367簇的miRNA测定值计算多能干细胞的个数。

在对多能干细胞进行半定量检测时，可通过与多个阈值进行比较来进行判定。例如，当小于第1阈值时，可判定为不存在多能干细胞、即“-”，当为第1阈值以上且小于第2阈值时，可判定为存在少量多能干细胞、即“+”，当为第2阈值以上时，可判定为“++”。

优选在实施本实施方式的方法之前预先设定本实施方式中使用阈值。例如，可以分别准备多个包含多能干细胞的细胞培养液的液相级分和不含多能干细胞的细胞培养液的液相级分，对各个液相级分测定miR302/miR367簇的miRNA，将阈值设定在能够以最高的精度对多能干细胞是否存在进行分类的值处。

实施本实施方式的方法时，还可以制备已知包含多能干细胞的细胞培养液的液相级分(阳性对照)、已知不含多能干细胞的细胞培养液的液相级分(阴性对照)、和不知晓多能干细胞是否存在的细胞培养液的液相级分(未知样品)，测定各个液相级分中的miR302/miR367簇的miRNA。当未知样品中的miRNA测定值与阴性对照中的miRNA测定值相比更接近阳性对照中的miRNA测定值时，可以判定为未知样品是由存在多能干细胞的细胞培养液制备的。当未知样品中的miRNA测定值与阳性对照中的miRNA测定值相比更接近于阴性对照中的miRNA测定值时，可以判定为未知样品是由不存在多能干细胞的细胞培养液制备的。

另一实施方式为含有能检测miR302/miR367簇的miRNA的寡核苷酸探针、寡核苷酸引物或这两者的试剂或试剂盒。这些寡核苷酸可以是与平板、粒子等固相结合的。在使用寡核苷酸引物测定成熟miRNA时，由于成熟miRNA的核苷酸长度短，因此可以使用茎环引物作为正向引物和/或反向引物。试剂盒可以包含缓冲液等其它试剂。

另一实施方式为寡核苷酸探针或寡核苷酸引物的、用于制造上述miRNA测定的试剂或试剂盒的用途。

本发明包括测定miR302/367簇的miRNA的方法。在该方法的一实施方式中，在细胞培养液中对多能干细胞进行分化诱导。测定该分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的液相级分中所含的miR302/367簇的miRNA。

以下通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。

实施例1：iPS细胞的培养上清和癌细胞的培养上清中的miR302测定值的比较

(1)测定样品的制备

在用细胞培养基质iMatrix-511(nippi公司制)涂敷了内部的75cm²烧瓶(康宁公司制)中添加细胞培养液Essential 8(Gibco公司制)15mL。向其中添加iPS细胞(10⁵cells/1.5mL)，粘附培养1天。培养后回收上清。

同样地对大肠癌细胞株HCT116(10⁵cells/1.5mL)进行1天粘附培养。将培养液以1500g离心10分钟，回收上清。

将回收的上清50μL和阴性对照(不含细胞的、未供于细胞培养的Essential 8)50μL作为测定样品。

(2)miR302测定

使用High Pure miRNA isolation kit(Roche Diagnostics公司制)由各测定样品回收总RNA。使用总RNA 1μL进行定量RT-PCR，分别测定miR302a、miR302b、miR302c及miR302d。使用TaqMan(商标)MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan(商标)MicroRNA Assays及TaqMan(商标)Universal Master Mix II、Applied Biosystems(商标)7500fast(Thermo Fisher Scientific公司制)按照随附的说明进行定量RT-PCR。

(3)结果

将结果示于图1。图1的图表的纵轴为将Ct值40设为表达量1时的miR302的相对表达量。由图1可知，由阴性对照及大肠癌细胞的培养上清中未检测到miR302，而从iPS细胞的培养上清中可以检测到miR302a、miR302b、miR302c及miR302d中的任一者。

实施例2：iPS细胞的培养上清、血管内皮细胞(来自iPS细胞)的培养上清、血管内皮细胞(细胞株)的培养上清中的miR302/367簇的miRNA测定值的比较

(1)测定样品的制备

对于iPS细胞的培养上清，与实施例1同样进行。在用细胞培养基质fibronectin(Invitorogen公司制)涂敷了内部的75cm²烧瓶(康宁公司制)中，添加细胞培养液VascuLife VEGF Medium Complete Kit(Kurabo公司制)15mL。向其中添加由iPS细胞分化而成的血管内皮细胞即iCell(商标)Endotherial Cells(Cellular DynamicsInternational公司制)(10⁵cells/1.5mL)，粘附培养1天。培养后，将培养液以1500g离心10分钟，回收上清。

同样地培养血管内皮细胞株HUVEC(10⁵cells/1.5mL)，对培养液进行离心，回收上清。

将回收的上清50μL和阴性对照(不会细胞的、未供于细胞培养的VascuLife VEGFMedium)50μL作为测定样品。

(2)miRNA测定

使用实施例2(1)中制备的测定样品，与实施例1同样地进行miR302及miR367的miRNA测定。

(3)结果

将结果示于图2～6。图2～6分别为示出miR302a～d及miR367的miRNA测定值的图表。图表的纵轴为将Ct值45设为表达量1时的miRNA的相对表达量。由图2～6可知，在阴性对照的情况下未检测到miRNA。血管内皮细胞HUVEC为细胞株，不含多能干细胞。从HUVEC的培养上清未检测到miRNA。从iPS细胞的培养上清中检测到了miR302a、miR302b、miR302c、miR302d及miR367中的任一者，且显示高的测定值。从由iPS细胞分化诱导而成的iCellEndotherial Cells的培养上清中检测到比iPS细胞的培养上清低的表达量。iCellEndotherial Cells的随附文件记载的纯度为98％(血管内皮细胞标志物的表达率)。以上的结果表明，在向血管内皮细胞的分化诱导操作结束后，可检测到未分化的残存的iPS细胞。

比较例1：iPS细胞的培养上清、血管内皮细胞(来自iPS细胞)的培养上清、血管内皮细胞(细胞株)的培养上清中的miR371、miR372、miR373测定值的比较

比较例1中，对作为多能干细胞标志物而已知的miR371、miR372及miR373的表达量进行比较。miR371、miR372及miR373的成熟miRNA的核苷酸序列如序列号6～8所示。

(1)测定样品制备

与实施例2同样地制备测定样品及阴性对照。

(2)miRNA测定

使用实施例3(1)中制备的测定样品，与实施例2同样地进行miR371、miR372及miR373的miRNA测定。

(3)结果

将miR371的测定结果示于图7。图7为示出miR371的miRNA测定值的图表。图表的纵轴为将Ct值45设为表达量1时的miRNA的相对表达量。由图7可知，从由iPS细胞分化诱导出的iCell Endotherial Cells的培养上清中检测不到miRNA，从iPS细胞的培养上清中检测到少量miRNA。另外，任一培养上清中均未检测到miR372及miR373。

由实施例及比较例的结果可知，即使是作为多能干细胞标志物而已知的分子，也存在被释放到细胞外的分子和不释放到细胞外的分子。实施例中发现miR302/367簇的miRNA为被释放到细胞外的分子，并且验证了其可以作为表示细胞的分化状态的标志物来使用。

序列表

<110> 希森美康株式会社

<120> 评价细胞的分化状态的方法

<130> PCT-1022

<150> JP2017-007366

<151> 2017-01-19

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

uaagugcuuc cauguuuugg uga 23

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

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<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

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<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

uaagugcuuc cauguuugag ugu 23

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

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<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

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<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23

Claims

1.一种评价细胞培养液中的细胞的分化状态的方法，其

测定多能干细胞的分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的培养上清中的miR302/367簇的miRNA，

基于miRNA测定值和规定阈值的比较结果，评价所述细胞培养液中的细胞的分化状态。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多能干细胞为iPS细胞、ES细胞、ntES细胞或EG细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述miRNA测定值为miR302a测定值、miR302b测定值、miR302c测定值、miR302d测定值、miR367测定值或这些中的至少两种的合计值。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，利用定量RT-PCR法测定所述测定值。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，

当所述miRNA测定值为所述阈值以上时，判定为所述细胞培养液中包含多能干细胞，

当所述miRNA测定值低于所述阈值时，判定为所述细胞培养液中不含多能干细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，由所述miRNA测定值计算所述细胞培养液中的多能干细胞数。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述miRNA测定包括：

所述多能干细胞的分化诱导时的第1时刻的miRNA测定；

所述多能干细胞的分化诱导时的第2时刻的miRNA测定。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多能干细胞为对由生物体采集的分化细胞进行重编程而制备的细胞。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述miRNA为序列号1～5中记载的miRNA。

10.一种评价分化状态未知的细胞的分化状态的方法，其为评价由多能干细胞向分化细胞分化的分化状态的方法，其取得：

已知包含多能干细胞的细胞培养液的培养上清中的miR302/367簇的miRNA测定值、

已知不含多能干细胞而包含分化细胞的细胞培养液的培养上清中的miR302/367簇的miRNA测定值、和

包含分化状态未知的细胞的细胞培养液的培养上清中的miR302/367簇的miRNA测定值，

对这些测定值进行比较，从而评价所述分化状态未知的细胞的分化状态。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述多能干细胞为对由生物体采集的分化细胞进行重编程而制备的细胞。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述miRNA为序列号1～5中记载的miRNA。

13.一种多能干细胞的检测方法，其包含下述工序：

测定多能干细胞的分化诱导时和/或分化诱导后的细胞培养液的培养上清中的miR302/367簇的miRNA的工序；

基于miRNA测定值检测所述细胞培养液的多能干细胞的工序。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述多能干细胞为对由生物体采集的分化细胞进行重编程而制备的细胞。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述miRNA为序列号1～5中记载的miRNA。