CN115210365A - 多能标志物在检测污染的残留未分化多能干细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过检测细胞群体中一种或多种标志物的表达来针对污染的残留未分化干细胞筛查该细胞群体的方法，当PSC分化成三种胚层中的任一种的特化细胞时，所述表达被有效沉默。

Description

多能标志物在检测污染的残留未分化多能干细胞中的应用
技术领域
本发明总体上涉及干细胞领域，如人胚胎干细胞领域。提供了在衍生自PSC的分化细胞的体外细胞群体中检测多能干细胞(PSC)的方法。
背景技术
干细胞在医学中的应用正受到密切关注，以期减轻、潜在地逆转和/或治愈目前只有有限治疗或没有治疗可用的病况。用于这样的治疗的干细胞产品可以衍生自人PSC，例如但不限于胚胎干细胞或诱导的PSC。人PSC主要是未分化的细胞，具有增殖并分化为人体许多更特化的细胞的潜力。已经开发了用于获得干细胞衍生的分化细胞以供治疗各种病况的确立的方法，包括用于提供腹侧中脑多巴胺能细胞(ventral midbrain dopaminergiccells)、视网膜色素上皮(RPE)细胞、神经视网膜细胞、含有β细胞的胰岛和心肌细胞的方案。然而，这样的方案通常不是完全有效的，并且经常产生包含预期细胞以及可能适用于或可能不适用于最终医药产品的其他细胞类型的细胞群体。此外，对于某些治疗，施用完全分化或成熟的细胞可能不可行。在这些情况下，细胞的分化在体外并未完全完成，因为随后打算使细胞在施用至患者后在体内进一步成熟。根据成熟度水平，医药产品可能仍然含有小部分具有高增殖能力的处于有丝分裂阶段的细胞。其中分化细胞尚未完全成熟的干细胞衍生群体可包含处于不同发育阶段的细胞的混合物。即使对于根据预期获得完全成熟的细胞的分化方案而衍生的细胞群体，细胞的子集可能仍然处于有丝分裂阶段或甚至可能是多能的。
当旨在提供对患者安全的治疗时，如果用于给药的干细胞衍生产物包含具有增殖并发育成几乎任何细胞类型的固有潜力的PSC和/或PSC样细胞，则是不理想的。主要的担心是细胞增殖无法控制的风险，其可潜在地发育成畸胎瘤或恶性肿瘤或癌症样状态。
分化方案以及可选的纯化过程的持续发展可产生高纯度的细胞群体。尽管如此，为了确保患者安全并遵守卫生当局的规定，仍需要对干细胞衍生产物进行质量控制，以验证产物没有被残留的未分化细胞，特别是PSC或PSC样细胞污染。
若干遗传标志物(及其编码的蛋白质)在人PSC中得到了很好的表征。当PSC分化为特定的胚层并进一步分化为更特化的细胞类型时，细胞的基因表达将发生变化。这提示使用遗传标志物来确定细胞的类型和成熟度。标识人PSC的多种标志物是已知的。取决于PSC分化成的细胞类型，许多在多能阶段表达的标志物将在某种程度上变成静止的。这可用于鉴定分化细胞的细胞群体中的PSC。然而，对于不同的细胞类型，被沉默的多能标志物的表达时机和程度不同，这使得检测PSC的通用方法成为难题。此外，多能细胞是由不同多能标志物的共表达来定义的，而仅使用一种特定基因作为标志物来评估多能性可能提供假阳性结果，这可导致丢弃实际上不含残留PSC的分化细胞批次。本发明人发现，确认的多能性标志物如OCT4(POU5F1)、SOX2、NANOG和LIN28A也可以在已分化并失去多能性的细胞中表达。
因此，本发明的一个目的是克服上述挑战，特别是，一个目的是提供用于检测细胞产品中污染的残留未分化PSC的稳健方法，其中该方法导致假阳性的风险很低。另一个目的是，所提供的方法可以在用于获得不同干细胞衍生产物的各种方案中应用，即适用于跨越三种胚层和处于不同成熟阶段的多种细胞类型。
发明内容
如上概述的目的通过本发明的方面来实现。另外，本发明还可以解决其他问题，这从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出。
在本发明的第一方面，提供了针对污染的残留未分化干细胞筛查细胞群体的方法，其包括检测所述细胞群体中标志物的表达的步骤，其中所述标志物选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3。本发明人已经发现，当干细胞失去多能性时，这些特定标志物的表达被有效地沉默。对于PSC向跨越三种不同胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的多种不同细胞类型的分化同样如此，这使得所述方法非常适合于干细胞衍生产物的通用测试。特定标志物被沉默到导致极低数目的假阳性的水平。在一实施方案中，检测标志物ZSCAN10的表达。本发明人已经证明，该标志物在多种分化细胞中高度下调。因此，单独筛查ZSCAN10标志物非常适合于并且足以鉴定药物产品中残留的未分化细胞。
在另一方面，提供了包含衍生自PSC的分化细胞的细胞群体，其中所述细胞群体缺乏表达一种或多种选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的标志物的细胞。在特定实施方案中，所述细胞群体缺乏表达ZSCAN10的细胞。
附图说明
图1显示了对各种多能标志物的qPCR分析，特别是hESC相对于hESC衍生的RPE细胞的差异倍数。
图2显示了关于ZSCAN10、DPPA5和OCT4的Ct值。
图3显示了在40个循环的qPCR反应结束后，当产物在琼脂糖凝胶中运行时，RPE样品的ZSCAN10、OCT4和DPPA5的条带。
图4显示了对hESC掺加(spiked-in)样品的ZSCAN10表达的qPCR分析。(A)和(B)显示了与掺加hESC在hESC衍生的RPE细胞中的比例相关的Ct值。
图5显示了两个不同RPE批次中ZSCAN10表达的qPCR分析。
图6显示了对hESC掺加样品中的ZSCAN10表达的巢式PCR。(A)显示了巢式PCR的第一轮扩增。(B)显示了第二轮PCR。
图7显示了如通过qRT-PCR测定的，hESC与BC-DS之间(左侧)和hESC与BC-DP之间(右侧)候选标志物的表达变化倍数。
图8显示了如通过ddPCR测定的，hESC与BC-DS之间(A)和hESC与BC-DP之间(B)的LIN28A和ZSCAN10的表达变化倍数。
图9显示了随着cDNA输入量的增加，ddPCR反应中BC-DS和BC-DP的LIN28A和ZSCAN10转录物拷贝数。
图10显示ZSCAN10拷贝增加，与掺加到BC-DP中的hESC的比例呈线性关系。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。说明书中的任何用语均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。
在整个本申请中，当涉及细胞分化过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个或多于一个。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。
一般而言，除非另有说明，否则“第0天”是指方案的起始，这是通过例如但不限于将干细胞涂板(plating)或将干细胞转移到培养箱，或在转移干细胞之前使干细胞在其当前的细胞培养基中与化合物接触来进行的。通常，方案的起始是通过将未分化的干细胞转移到不同的细胞培养基和/或容器，例如但不限于通过涂板或孵育，和/或首先以启动分化过程的方式使未分化的干细胞与影响未分化干细胞的化合物接触。
在下文中，通过非限制性实施方案和实例更详细地描述了本发明的方法。提供了针对PSC或PSC样细胞筛查细胞群体的方法。“多能干细胞”(PSC)应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的未分化细胞。根据分化潜能，干细胞包括诸如PSC、专能(multipotent)干细胞、单能干细胞等亚群。PSC是指能够在体外培养并具有分化成属于三种胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何细胞谱系的潜能的干细胞。专能干细胞是指具有分化为多种类型的组织或细胞(但不是所有种类)的潜能的干细胞。单能干细胞是指具有分化成特定组织或细胞的潜能的干细胞。PSC可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。PSC的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、EG细胞(胚胎生殖细胞)、诱导多能干细胞(iPSC)等。从间充质干细胞(MSC)获得的Muse细胞(多谱系分化持续应激细胞)和从生殖细胞(例如睾丸)产生的GS细胞也包括在PSC中。iPSC是一种类型的PSC，其可以直接从成体细胞生成。通过引入特定组的多能性相关基因的产物，可以将成体细胞转化为PSC。胚胎干细胞可以通过培养来自卵裂球的细胞或胚泡的内细胞团而产生。这类细胞可以在不破坏胚胎的情况下获得。胚胎干细胞可从给定的组织机构获得，也可以商购获得。
如本文所用的，纯化步骤之前和之后的β样细胞将分别被称为β细胞原料药(BC-DS)和β细胞药物产品(BC-DP)。
在本发明的第一方面，提供了针对污染的残留未分化干细胞筛查细胞群体的方法，其包括检测所述细胞群体中标志物的表达的步骤，其中所述标志物选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3。
如本文所用的，术语“细胞群体”是指定义的一组细胞，其可以是体外的或体内的。通常，该组细胞将在体外分离到容器中。在优选的实施方案中，根据本发明的方法在体外进行。在一实施方案中，体外容器是合适的基底，如微孔。
如本文所用的，术语“污染的残留未分化干细胞”是指细胞群体中的PSC亚群，其已经经历了旨在将细胞群体分化成没有多能特性的分化细胞的分化方案。
如本文所用的，术语“筛查”是指检查细胞群体中是否存在具有特定基因型或表型如多能性的一种或多种细胞的行为。基因型和表型可以基于标志物的表达来确定。
如本文所用的，术语“标志物”是指由细胞进行的天然存在的可鉴定的表达，其可以与该细胞的某些特性相关。在优选的实施方案中，标志物是遗传表达或蛋白质组表达，其可以被检测并与细胞的身份相关联。这些标志物可以通过基因来指代。这可以容易地翻译成相应mRNA和蛋白质的表达。
如本文所用的，关于标志物的术语“表达”是指在细胞中缺乏或存在可被检测到的分子。在一实施方案中，表达的分子是mRNA或蛋白质。因此，在一实施方案中，在转录组学(transcriptomic)和/或蛋白质组学(proteomic)水平上检测并任选地鉴定PSC。在一实施方案中，该标志物是基因的遗传表达，该基因可与干细胞的多能性相关。可以在任何合适的水平上，例如在mRNA或蛋白质水平上检测标志物的表达。本领域技术人员将容易理解，可以通过标志物的阳性或阴性表达来定义细胞，即细胞的特性和状态可以基于某种标志物的表达及其缺乏而同等地关联。当提及具体标志物时，表达的存在或缺乏可以分别用+(加号)或-(减号)符号来表示。
如本文所用的，关于表达的术语“检测”是指测量信号以确定细胞群体中是否存在污染的残留未分化干细胞。根据该方法的“检测”并不意味着必须获得阳性信号，如果细胞群体不包含任何污染的残留未分化干细胞，则不会获得阳性信号。可以使用任何合适的信号来确定PSC的存在，例如通过从例如荧光分子发射光来确定PSC的存在。许多技术可容易地用于检测并任选地鉴定细胞群体中的标志物。在一个实施方案中，使用多组学(bulk)RNA-seq(RNA测序)分析来筛查细胞群体。如本文所用的，当提及筛查时，术语“多组学(bulk)”是指分析标志物在细胞群体中而不是单个细胞中的表达。
如本文所用的，“LIN28A”是指被表示为Lin-28同源物A的基因。该基因是未分化的人胚胎干细胞的标志物。
如本文所用的，“POU5F1”是指被表示为POU结构域，5类，转录因子1的基因。该基因也可以被称为OCT4。该基因是未分化的人胚胎干细胞的标志物。
如本文所用的，“SOX2”是指被表示为SRY(性别决定区Y)-框2的基因。该基因是未分化的人胚胎干细胞的标志物。然而，SOX2也在发育中的神经干细胞中普遍表达。
如本文所用的，“NANOG”还可指被表示为同源框转录因子NANOG的基因。该基因是未分化的人胚胎干细胞的标志物。
如本文所用的，“ZSCAN10”是指被表示为“含锌指和SCAN结构域10”的基因。已经报道该基因编码用于调节PSC的转录因子。它在未分化的人和小鼠胚胎干细胞、胚泡的内细胞团中表达，并在分化时下调。ZSCAN10被认为通过与已确定的多能性标志物SOX2和OCT4相互作用来维持ESC多能性。
如本文所用的，“DPPA5”是指被表示为“发育多能性相关5”的基因。已经报道该基因编码可能在控制细胞多能性和早期胚胎发生中起作用的蛋白质。因此，该基因的表达被认为是参与维持胚胎干细胞多能性的PSC的特异性标志物。它被认为在无饲养层(feeder-free conditions)条件下的人PSC自我更新和细胞重编程中起重要作用。
如本文所用的，“FOXD3”是指被表示为“叉头框D3”的基因。多项研究提示，Foxd3参与了胚胎发育中从幼稚(naive)PSC到始发(primed)PSC的转变。以前，FOXD3被证明是维持小鼠胚胎干细胞的多能性所需要的。
在一个实施方案中，检测选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的两种或更多种标志物的表达。在另一个实施方案中，检测标志物ZSCAN10和DPPA5的表达。在另一个实施方案中，检测标志物ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的表达。在优选的实施方案中，检测标志物ZSCAN10的表达。
在一个实施方案中，使用细胞群体的多组学分析，通过标志物ZSCAN10、DPPA5或FOXD3中任一种的阳性表达来确定细胞群体中存在污染的残留未分化干细胞。在进一步的实施方案中，该多组学分析是通过RNA-seq分析进行的。
在一实施方案中，所述细胞群体包含衍生自PSC的分化细胞。如本文所用的，关于干细胞的术语“分化细胞”是指PSC，其已经经历了细胞从未分化状态进展到特定分化状态的过程，即从未成熟状态进展到较成熟状态(less immature state)或成熟状态的过程。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经成熟或完全分化。因此，“分化细胞”被认为是先前曾经被归类为PSC但允许分化成某种胚层的细胞类型的细胞。
因此，在一实施方案中，所述方法包括将PSC分化成衍生自PSC的分化细胞的细胞群体的初始步骤。本领域普通技术人员将容易理解，如本文所用的，术语“分化”是指使PSC经受使细胞从未分化状态进展到分化状态的方法。通常，分化PSC的步骤包括在特定条件下培养细胞以及/或者使细胞与某些因子接触。
在一实施方案中，所述PSC是人PSC。在进一步的实施方案中，所述PSC是人胚胎干细胞。
在一实施方案中，所述分化细胞选自腹侧中脑多巴胺能细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、神经视网膜细胞、含有β细胞的胰岛和心肌细胞。本领域技术人员将认识到用于将PSC分化为上述细胞类型的合适方法。例如，用于获得腹侧中脑多巴胺能细胞的方案在专利申请WO2016/162747中公开。根据成熟水平，腹侧中脑多巴胺能细胞可以表达标志物FOXA2、LMX1B、OTX2、EN1、PITX3和TH中的一种或多种。用于获得RPE细胞的方案由Osakada等人(J Cell Sci.2009年9月1日；122(Pt 17):3169-79.doi:10.1242/jcs.050393.2009年8月11日电子发表.“In vitro differentiation of retinal cells from humanpluripotent stem cells by small-molecule induction”)或Kuroda等人(Stem CellRes.2019年8月；39:101514.doi:10.1016/j.scr.2019.101514.2019年7月25日电子发表.“Robust induction of retinal pigment epithelium cells from human inducedpluripotent stem cells by inhibiting FGF/MAPK signaling″)公开。根据成熟水平，RPE细胞可以表达标志物MITF和RPE65中的一种或多种。用于获得神经视网膜祖细胞的方案由Xie等人(PLoS One.2014年11月17日；9(11):e112175.doi:10.1371/journal.pone.0112175.eCollection 2014.“Differentiation of retinal ganglion cells andphotoreceptor precursors from mouse induced pluripotent stem cells carryingan Atoh7/Math5 lineage reporter”)或专利申请WO 2019/078781公开。根据成熟水平，神经视网膜细胞可以表达标志物OTX2。用于获得含有β细胞的胰岛的方案由Robert等人(StemCell Reports.2018年3月13日；10(3):739-750.doi:10.1016/j.stemcr.2018.01.040.2018年3月1日电子发表.“Functional Beta Cell Mass fromDevice-Encapsulated hESC-Derived Pancreatic Endoderm Achieving MetabolicControl”)或Bukys等人(J Stem Cell Transplant Biol.2016年9月21日；2(1).doi:10.19104/jorm.2017.109.“Xeno-Transplantation of macro-encapsulated islets andPluripotent Stem Cell-Derived Pancreatic Progenitors withoutImmunosuppression”)或专利申请WO 2017/144695公开。β细胞可以通过标志物NKX6.1+/INS+/GCG-的表达来定义。用于获得心肌细胞的方案由Yap等人(Cell Rep.2019年3月19日；26(12):3231-3245.e9.doi:10.1016/j.celrep.2019.02.083.“In Vivo Generation ofPost-infarct Human Cardiac Muscle by Laminin-Promoted CardiovascularProgenitors”)或Fernandes等人(Stem Cell Reports.2015年11月10日；5(5):753-762.doi:10.1016/j.stemcr.2015.09.011.“Comparison of Human Embryonic StemCell-Derived Cardiomyocytes,Cardiovascular Progenitors,and Bone MarrowMononuclear Cells for Cardiac Repair”)公开。
本发明人使用单细胞RNA-seq分别分析了RPE细胞、神经视网膜祖细胞、腹侧中脑多巴胺能祖细胞、含有β细胞的胰岛和心肌细胞的细胞群体。这些细胞群体都不含表达标志物ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的细胞。在PCS细胞群体的比较分析中鉴定了表达这些标志物的细胞。
在一个实施方案中，所述细胞群体是体外的。最常见的是，用于筛查的细胞群体将是旨在用于治疗的分化细胞的体外干细胞衍生产物。在一个实施方案中，该细胞群体由活检物(biopsy)提供。这样的活检物可以直接从患者获得并在体外进行分析以筛查PSC。
在一实施方案中，所述方法包括鉴定细胞群体中的残留PSC或PSC样细胞的步骤。如本文所用的，术语“PSC样细胞”是指已经失去多能性但仍与PSC共享一些特性的细胞，所述特性例如是一些基因表达、增殖能力或与PSC相似的任何其他特征。术语“鉴定”是指确立或指示在检测到细胞群体中某些标志物的表达与该细胞群体的特定细胞之间的强联系。在一实施方案中，通过单细胞测序来检测并任选地鉴定残留PSC或PSC样细胞。在一个实施方案中，使用荧光激活细胞分选(FACS)筛查细胞群体。
在另一方面，提供了包含衍生自PSC的分化细胞的细胞群体，其中所述细胞群体缺乏表达一种或多种选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的标志物的细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞群体缺乏表达ZSCAN10的细胞。
在一实施方案中，与掺加(spike-in)参考细胞群体相比，所述细胞群体的标志物ZSCAN10、DPPA5和FOXD3中一种或多种的表达的检测值低于混合在分化细胞中的hPSC的0.1％、0.01％或0.001％。在另一个实施方案中，与掺加参考细胞群体相比，所述细胞群体的标志物ZSCAN10中一种或多种的表达的检测值低于混合在分化细胞中的hPSC的0.1％、0.01％或0.001％。
如本文所用的，术语“缺乏”被定义为一种或多种选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的表达标志物的阴性检测。在一实施方案中，所述检测方法是根据实施例1。在优选的实施方案中，所述细胞群体已经根据本发明第一方面的方法进行了筛查。
特定实施方案
现在通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明的方面：
1.针对污染的残留未分化干细胞筛查细胞群体的方法，其包括检测所述细胞群体中标志物的表达的步骤，其中所述标志物选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3。
2.根据前述实施方案所述的方法，其中检测选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的两种或更多种标志物的表达。
3.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中检测标志物ZSCAN10和DPPA5的表达。
4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中检测标志物ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的表达。
5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中检测标志物ZSCAN10的表达。
6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含衍生自PSC的分化细胞。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述PSC是人PSC。
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述PSC是人胚胎干细胞。
9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括将PSC分化成衍生自所述PSC的分化细胞的细胞群体的初始步骤。
10.根据实施方案6至9中任一项所述的方法，其中所述分化细胞选自腹侧中脑多巴胺能细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、神经视网膜细胞、含有β细胞的胰岛和心肌细胞。
11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是体外的。
12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体由活检物提供。
13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括鉴定所述细胞群体中的残留PSC或PSC样细胞的步骤。
14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在转录组学和/或蛋白质组学水平上检测并任选地鉴定残留PSC或PSC样细胞。
15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其在检测所述标志物的步骤之前包括扩增cDNA的步骤。
16.根据实施方案15所述的方法，其中使用RT-PCR、qPCR或ddPCR或其组合来扩增cDNA(互补DNA，从单链RNA合成的DNA)。
17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体使用荧光激活细胞分选(FACS)进行筛查。
18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体使用多组学分析进行筛查。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述多组学分析是通过RNA-seq进行的。
20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体通过单细胞分析进行筛查。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述单细胞分析是通过单细胞RNA测序进行的。
22.包含衍生自PSC的分化细胞的细胞群体，其中所述细胞群体缺乏表达一种或多种选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的标志物的细胞。
23.根据实施方案22所述的细胞群体，其中所述群体缺乏表达ZSCAN10的细胞。
24.根据实施方案22和23中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体已经根据实施方案1至21中任一项的方法进行了筛查。
25.根据实施方案22至24中任一项所述的细胞群体，其中所述PSC是人PSC。
实施例
以下是用于实施本发明的方案的非限制性实施例。
实施例1：单细胞RNA测序(scRNAseq)分析
通过单细胞RNA-seq来分析未分化细胞(hESC)和分化细胞的群体。表1显示了每个群体中表达特定基因的细胞数目。使用10X提供的cellranger软件对单细胞测序数据进行预处理并映射到人类基因组中，随后对自动检测到的细胞进行过滤，以去除最有可能是死细胞的细胞(基因或UMI计数低，线粒体基因含量高)或潜在的双联体(基因/UMI计数高)。此外，在少于3个细胞中检测到(计数>0)的特征(基因)从下游分析中忽略(去除)。由于scRNAseq中每个细胞的测序深度较低，因此使用1UMI的检测限进行标志物评估。
实施例2：未分化细胞和分化细胞的单细胞RNA-seq
在hPSC群体中检测到所有标志物。此外，与多能性相关的常见标志物，即LIN28A、POU5F1、SOX2和NANOG，都在分化细胞群体的一些细胞中检测到。SOX2是在外胚层谱系中表达的已知标志物，对于多巴胺能祖细胞、神经视网膜和RPE祖细胞，这通过大量细胞表达该标志物而得到证实。然而，对于分化的群体，在任何细胞中均未检测到POU5F1、SOX2和NANOG的组合表达，这表明不存在多能细胞。
在分化细胞群体的任何细胞中均未检测到标志物DPPA5、ZSCAN10或FOXD3。
表1.使用单细胞RNA-seq分析所分析的，表达的遗传标志物的细胞计数
Figure BDA0003824679300000141
nd：未测定；mesDA：中脑多巴胺能祖细胞；NR：神经视网膜祖细胞；RPE：视网膜色素上皮细胞；hESC：人胚胎细胞系1和2。
实施例3：从hESC向RPE细胞分化期间，标志物的单细胞RNA-seq分析
在将hESC分化为RPE细胞的方案的不同阶段对细胞进行单细胞分析。表2的结果清楚地表明，标志物DPPA5、ZSCAN10和FOXD3在分化过程的早期被有效地沉默，而标志物POU5F1、SOX2和NANOG在该方案的后期仍然在一些细胞中表达。在第30天，具有POU5F1、SOX2和NANOG组合表达的细胞不再能被检测到。在同一时间点，标志物DPPA5、ZSCAN10和FOXD3中的每一种不再能被检测到。
表2.RPE细胞分化期间的单细胞RNA-seq分析
Figure BDA0003824679300000151
nd：未测定
实施例4：从hESC向神经视网膜细胞分化期间，标志物的单细胞RNA-seq分析
在将hESC分化为神经视网膜细胞的方案的不同阶段对细胞进行单细胞分析。表3的结果清楚地表明，标志物DPPA5、ZSCAN10和FOXD3在细胞分化早期被有效地沉默，而标志物POU5F1、SOX2和NANOG在该方案的后期仍然在一些细胞中表达。在第20天，具有POU5F1、SOX2和NANOG组合表达的细胞不再能被检测到。在同一时间点，标志物DPPA5、ZSCAN10和FOXD3中的每一种不再能被检测到。
表3.神经视网膜细胞分化期间的单细胞RNA-seq分析
Figure BDA0003824679300000161
nd：未测定
实施例5：定量实时PCR(qRT-PCR)，用以检测残留的人类多能干细胞
在传统的qRT-PCR(或简称为qPCR)中，在PCR反应过程中，在序列的扩增之后出现荧光(Higuchi等人,Biotechnology(N Y).1992年4月；10(4):413-7.doi:10.1038/nbt0492-413)。通常进行qPCR以量化靶序列的绝对量或比较样品之间靶序列的相对量。该技术通过在扩增过程中发射的靶标特异性荧光信号来实时监测靶标的扩增。我们使用qPCR分析在hESC、hESC衍生的RPE细胞(RPE)中以及在掺加了不同比例的hESC的RPE细胞中比较了OCT4的表达水平与ZSCAN10和DPPA5的表达水平。
表4.用于qPCR的引物。
Figure BDA0003824679300000162
Figure BDA0003824679300000171
简而言之，使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen,74104)，按照制造商的说明(包括DNAse I处理)，从每个条件1.5x106个细胞中提取RNA。使用SuperScriptTMIV VILOTMMasterMix(Invitrogen，11756050)将500ng RNA转化为cDNA。cDNA以1:10稀释，并且每次反应使用1ul。Power SYBRTMGreen PCR Master Mix(applied biosystems，4367659)用于在viia7实时PCR系统中运行的qPCR。在qPCR中，阈值线是检测水平或反应达到高于背景水平的荧光强度时的点。Ct(循环阈值)是扩增曲线与阈值线之间的交叉点(Bustin等人,Clin Chem.2009年4月；55(4):611-22.doi:10.1373/clinchem.2008.112797)。使用ddCt(delat-delta Ct)方法并使用GAPDH表达(管家基因)作为内源性对照，计算相对于RPE表达的变化倍数。简而言之，对于每个样品，最初通过从GAPDH的Ct值中减去目的基因的Ct值来计算dCt。随后，由于我们希望将所有值都相对于RPE细胞的表达水平进行归一化，因此从每个其他样品的dCt中减去RPE样品关于每个基因的dCt，以便计算ddCt。最后，使用公式2^(-ddCt)计算变化倍数。
在测试的基因中，ZSCAN10显示出hESC相对于RPE细胞的最高差异倍数(图1)。除此之外，RPE细胞还显示出关于ZSCAN10和DPPA5的Ct值超过30(图2)，并且在40个循环的qPCR反应结束后，当产物在凝胶中运行时，不产生可见的条带(图3)。相反，OCT4似乎在RPE样品中非常高度地表达，Ct值为25，并且在凝胶中产生的条带与那些含有hESC的样品具有相似的强度。上述结果支持以下观点：ZSCAN10以及(潜在地)DPPA5代表了将要与巢式PCR方法一起用于检测最终RPE产物中的多能细胞的良好候选者。
qPCR分析揭示，Ct值与RPE细胞中掺加hESC的比例相关地呈线性增加(图4A)，最高达0.01％的比例(图4B)。图5显示了两个不同批次的hESC衍生RPE细胞(RPE)之间的比较。qPCR分析揭示，在两个独立的RPE分化(分化1和2)中，RPE细胞的Ct值与掺加hESC的比例(0.01％和0.001％)相关地增加。
实施例6：针对ZSCAN10标志物的巢式RT-PCR，用以检测残留的人类多能干细胞
巢式RT-PCR(或巢式PCR)涉及在连续两个反应中使用两对引物，在此期间，第一轮的产物用作第二轮扩增的模板。第一个反应的扩增子包含第二个反应的靶标。巢式PCR的优点是靶序列的大量扩增，同时减少非特异性产物的机会(或出现)(Green等人,Cold SpringHarb Protoc.2019年2月1日；2019(2).doi:10.1101/pdb.prot095182)。我们开发了基于ZSCAN10标志物的巢式PCR测定，作为一种简单而灵敏的检测痕量hESC cDNA的方法，其将显示在hESC衍生的RPE(RPE)细胞中残留多能污染物的存在。
为了使用该技术评估在衍生的RPE细胞中残留hESC的存在，选择的标志物需要在未分化细胞中高度表达，而在分化细胞中完全不存在。
简而言之，使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，74104)，按照制造商的说明(包括DNAse I处理)，从每个条件1.5x106个细胞中提取RNA。使用SuperScriptTMIV VILOTMMasterMix(Invitrogen，11756050)将500ng RNA转化为cDNA。RT-样品(RT minus samples)在没有SuperScript酶的情况下进行处理，以检测样品中可能的基因组DNA污染。对于第一次PCR，每个反应使用1ul 1:10稀释的cDNA。对于第二个PCR产物，将第一个PCR产物稀释500倍，并且每个反应使用1ul。模板cDNA用Platinum II Hot start主混合物(mastermix)进行扩增，每轮30个循环，根据制造商的建议使用2步方案。
表5.用于巢式PCR的引物。
Figure BDA0003824679300000191
如图6A所示，在使用针对ZSCAN10基因的外部引物的巢式PCR的第一轮扩增中，我们仅在hESC样品中获得了可检测的条带。然而，在使用对每个样品的第一次PCR中产生的产物的一部分和这对内部引物进行第二轮PCR之后，我们对所有测试的掺加比例(0.01％和0.001％)都得到饱和色(saturated)条带，但在RPE样品中只有褪色的条带(图6B)。这些结果表明，与其他细胞相比，在RPE细胞条件下，ZSCAN10cDNA的量明显较低。一轮低循环数PCR与连续qPCR的组合可能是提高检测灵敏度及获取更多定量数据的方式。
实施例7：针对ZSCAN10标志物的数字小液滴PCR，用以检测残留的人类多能干细胞
我们开发了专注于ZSCAN10标志物的数字小液滴PCR(ddPCR)测定。在数字小液滴PCR反应中，在物理上分离的水-油乳液小液滴中进行具有45个扩增循环的终点PCR(Hindson等人,Anal Chem.2011年11月15日；83(22):8604-10.doi:10.1021/ac202028g.)。与传统的qRT-PCR(其中在PCR反应过程中，序列扩增之后出现荧光)(Higuchi等人,Biotechnology(N Y).1992年4月；10(4):413-7.doi:10.1038/nbt0492-413)相比，ddPCR测量反应后阳性和阴性小液滴的分布。基于泊松分布分析，ddPCR无需标准曲线即可确定扩增子的绝对浓度。除此优势外，ddPCR与qRT-PCR相比还具有更高的灵敏度和准确性，并且由于终点读数而无需评估扩增效率。
出于同样的原因，ddPCR已被用于细胞治疗领域，用以评估不同细胞类型的致瘤风险。Kuroda及其同事首次采用这项技术，使用多能性标志物LIN28A评估其心肌细胞中残留的hiPSC(Kuroda等人,Regen Ther.2015年10月27日；2:17-23.doi:10.1016/j.reth.2015.08.001)。Piao及其同事采用ddPCR，使用标志物POU5F1(也称为OCT4)评估其多巴胺神经元中残留的hESC(Piao等人,Cell Stem Cell.2021年2月4日；28(2):217-229.e7.doi:10.1016/j.stem.2021.01.004)。除其他传统的多能性标志物外，我们测试了这两种标志物对于评估含有胰岛素的胰腺β样细胞批次中的残留hPSC的适用性。向这些β样细胞类型分化的过程需要20到30天，正如不同小组在文献中所描述的那样(Pagliuca等人,Cell.2014年10月9日；159(2):428-39.doi:10.1016/j.cell.2014.09.040；Rezania等人,Nat Biotechnol.2014年11月；32(11):1121-33.doi:10.1038/nbt.3033)。
评估候选标志物对评估分化细胞类型中污染hESC水平的适用性的最重要参数是hESC与分化细胞类型之间的表达的变化倍数。为此，我们最初通过qRT-PCR评估了hESC、BC-DS和BC-DP中不同标志物的表达水平：经典的多能性标志物OCT4、NANOG和SOX2(Boyer等人,Cell.2005年9月23日；122(6):947-56.doi:10.1016/j.cell.2005.08.020)，以上提及的标志物LIN28A(Kuroda等人,Regen Ther.2015年10月27日；2:17-23.doi:10.1016/j.reth.2015.08.001)，以及我们新发现的候选标志物ZSCAN10。所有样品中这些标志物的表达都相对于广泛使用的管家基因ACTB和PPIA的几何平均值进行归一化(Panina等人,SciRep.2018年6月7日；8(1):8716.doi:10.1038/s41598-018-26707-8)。对于所有样品，除了BC-DP中的ZSCAN10(在这种情况下实时PCR仪器无法检测到信号)外，浓度都可以计算出来。将hESC中所有标志物的所得表达值除以BC-DS和BC-DP中的相应表达值，以生成图7。在BioRad CFX384 qRT-PCR仪器上使用基于探针的PCR测定对样品进行分析。将表达相对于ACTB和PPIA的几何平均值进行归一化。请注意，对于ZSCAN10无法计算hESC与BC-DP之间的表达变化倍数，因为BC-DP中的表达低于qRT-PCR仪器的LLOD(检测下限)。
图7的左侧显示，OCT4和LIN28A都不是用于评估BC-DS中的hESC污染水平的合适标志物，因为表达变化倍数太低。例如，当遵循Kuroda及其同事针对LIN28A提出的原则(Kuroda等人,Regen Ther.2015年10月27日；2:17-23.doi:10.1016/j.reth.2015.08.001)时，在最大灵敏度为37个BC-DS细胞中的1个hESC的情况下，表达变化倍数为37的OCT4仅可用来排除在BC-DS样品中不存在hESC。相比之下，ZSCAN10是一种好得多的标志物，其表达变化倍数为1406。此外，图7还显示，对于所有标志物，hESC与BC-DP之间的表达变化倍数都大于hESC与BC-DS之间的表达变化倍数。这一观察结果与以下观点一致：BC-DS与BC-DP之间的纯化步骤消除了增殖脱靶细胞群体。与OCT4相比，LIN28A是用于评估BC-DP中的hESC污染物的合适候选标志物。由于观察到通过qRT-PCR无法检测到BC-DP中ZSCAN10的表达，因此我们假设ZSCAN10的表达变化倍数优于LIN28A的表达变化倍数。为了证实这一假设，我们通过比qRT-PCR具有更高灵敏度的ddPCR分析了hESC、BC-DS和BC-DP(图8)。在BioRad qRT-PCR仪器上使用基于探针的PCR测定对样品进行分析。将表达相对于ACTB和PPIA的几何平均值进行归一化。请注意，对于ZSCAN10无法计算hESC与BC-DP之间的表达变化倍数，因为BC-DP中的表达低于qRT-PCR仪器的LLOD。该分析证实了我们的假设，因为它表明ZSCAN10的表达变化倍数远大于LIN28A的表达变化倍数。因此，我们得出以下结论：与LIN28A相比，ZSCAN10是用于评估BC-DS和BC-DP两者中的残留hESC的更好选择。据我们所知，至少有三篇出版物在致瘤性测定的背景下将LIN28A描述为多能性标志物(Artyuhov等人,Mol Biol Rep.2019年12月；46(6):6675-6683.doi:10.1007/s11033-019-05100-2；Kuroda等人,PLoS One.2012；7(5):e37342.doi:10.1371/journal.pone.0037342；Kuroda等人,Regen Ther.2015年10月27日；2:17-23.doi:10.1016/j.reth.2015.08.001)，但ZSCAN10则没有。
为了确认ZSCAN10作为用于评估BC-DS和BC-DP的候选标志物的适用性，我们将针对这些样品的cDNA输入从每个ddPCR反应50ng总RNA的当量——Kuroda及其同事也使用的典型量(Kuroda等人,Regen Ther.2015年10月27日；2:17-23.doi:10.1016/j.reth.2015.08.001)——增加到225ng(图9)。该图显示了与以总RNA的当量描述的cDNA输入相关的，每个标准20μL ddPCR反应中这些转录物的绝对拷贝数。该分析显示，与LIN28A转录物拷贝数相比，BC-DS和BC-DP中ZSCAN10转录物的绝对拷贝数较低。除了图8中显示的表达差异倍数外，这进一步支持了ZSCAN10作为用于评估残留hPSC的新型标志物的适用性。
最后，我们希望确认ZSCAN10作为一种新标志物在掺加实验中的适用性。为此，我们将定义的细胞数的hESC混合到BC-DP中，裂解细胞以进行RNA提取，并为ZSCAN10反应执行ddPCR。图10显示了ZSCAN10拷贝数与掺加hESC的比例之间几乎完美的线性关系。应当注意的是，y轴显示了相对于cDNA输入的量进行归一化的ZSCAN10值。为了使拷贝数符合所用BioRad ddPCR设置的可接受的动态范围，这种归一化是必要的。我们可以确认ZSCAN10可用于检测污染的hESC，至0.01％的LLOD(即10,000个BC-DP细胞中的1个hESC)。我们期望通过两种方式进一步提高灵敏度：(1)通过增加RNA输入，我们将在每个反应中呈现更多的细胞，以及(2)通过使用微流体技术而不是系列稀释，我们将减少低百分比掺加样品中的错误，从而降低LLOD。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。

Claims (15)

1.针对污染的残留未分化干细胞筛查细胞群体的方法，其包括检测所述细胞群体中标志物的表达的步骤，其中所述标志物选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3。
2.根据前述权利要求所述的方法，其中检测选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的两种或更多种标志物的表达。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测标志物ZSCAN10和DPPA5的表达。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测标志物ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的表达。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测标志物ZSCAN10的表达。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含衍生自PSC的分化细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含选自腹侧中脑多巴胺能细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、神经视网膜细胞、β细胞和心肌细胞的分化细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述PSC是人胚胎干细胞。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是体外的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体由活检物提供。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体使用多组学分析进行筛查。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多组学分析是通过RNA-seq进行的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体使用qPCR、巢式PCR、ddPCR或其组合进行筛查。
14.包含衍生自PSC的分化细胞的细胞群体，其中所述细胞群体缺乏表达一种或多种选自ZSCAN10、DPPA5和FOXD3的标志物的细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞群体，其中所述细胞群体已经根据权利要求1至13中任一项所述的方法进行了筛查。
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