WO2018043170A1 - 判定システム及び判定方法 - Google Patents

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WO2018043170A1
WO2018043170A1 PCT/JP2017/029722 JP2017029722W WO2018043170A1 WO 2018043170 A1 WO2018043170 A1 WO 2018043170A1 JP 2017029722 W JP2017029722 W JP 2017029722W WO 2018043170 A1 WO2018043170 A1 WO 2018043170A1
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WO
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culture solution
cells
serum
culture
cultured
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PCT/JP2017/029722
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English (en)
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謙太郎 高垣
漆畑　直樹
秀輝 種村
幸司 小出
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Ａｏｆ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a culture solution (or medium) used for culturing cells (for example, derived from fat). More specifically, the present invention relates to a technique for determining whether serum is included in a culture solution.
  • the heterologous antigen is taken up by the cells to be cultured in the culture solution, and the immune reaction occurs when administered. There is a risk of waking up. There is also the risk of infection from pathogens in the serum.
  • serum is known to have different components depending on the lot, and when culturing with serum, the problem is that the culture process is heterogeneous.
  • the characteristics of cells cultured in a culture medium containing serum depend on the serum mixed in the culture medium, there is a problem that the range of characteristics of the cultured cells is widened.
  • a culture solution that does not contain serum in order to eliminate the above-mentioned disadvantages, it is preferable to use a culture solution that does not contain serum (so-called “serum-free medium”).
  • serum-free medium a culture solution that does not contain serum
  • a culture solution that does not include serum in many cases, it is difficult to determine whether the culture medium is low in stability or stability (culture medium including serum).
  • a “culture medium that does not include serum” which is highly safe and stable. Nevertheless, no technology has been proposed at present to easily and reliably determine whether a culture solution does not contain serum.
  • Patent Document 1 As another conventional technique, a technique for detecting the amount of nucleic acid in a sample using polymerase chain reaction (PCR) has been proposed (for example, see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 the related art (Patent Document 1) does not aim to determine whether or not the culture solution contains serum.
  • the present invention has been proposed in view of the above-mentioned problems of the prior art, and the culture solution (medium) used for cell culture is a “culture solution not containing serum” or “culture containing serum”. It is an object of the present invention to provide a determination system and a determination method that can easily and reliably determine whether the liquid is “liquid”.
  • the determination system (100) of the present invention includes: A storage device (1: container) for storing a culture solution to be judged whether or not it contains serum; An interferon ⁇ supply device (2: an interferon ⁇ dropping unit) that supplies interferon ⁇ to the culture solution stored in the storage device (1); A mixing device (3) for uniformly mixing the culture solution in the storage device (1) and interferon ⁇ , A cell supply device (4: cell supply unit or pipette, etc.) for supplying cells to be cultured in a culture solution (culture solution mixed with interferon ⁇ in a mixing device); A culture container (5: constant temperature unit) for storing a storage device (1) for storing a culture solution supplied with cells to be cultured in a constant environment (for example, in a 37 ° C., 5% CO 2 environment).
  • An analyzer (6: for example, a flow cytometer or an imaging cytometer) for analyzing the fluorescence intensity in the cultured cells;
  • the judging device (7) has a function of determining whether or not a human type 2 antigen-presenting molecule (for example, HLA-DR) is expressed, and when the human type 2 antigen-presenting molecule is not expressed, It is characterized by having a function of determining that serum is not included and a function of determining that serum is included in the culture medium when a human type 2 antigen-presenting molecule is expressed.
  • a human type 2 antigen-presenting molecule for example, HLA-DR
  • a part of the cultured cell is recognized between the culture vessel (5) and the analyzer (6) to recognize a fluorescently labeled human type 2 antigen-presenting molecule.
  • An antibody processing unit (11) having a function of treating with a negative control antibody (negative control antibody) that treats a part of cultured cells with an antibody (eg, anti-HLA-DR antibody) and does not recognize any molecule Is preferably arranged.
  • the determination method of the present invention includes: Storing a culture solution to be determined whether or not it contains serum in a storage device (1: container); Supplying interferon ⁇ to the culture solution stored in the storage device (1) by the interferon ⁇ supply device (2: interferon ⁇ dropping unit); A step of uniformly mixing the culture solution in the storage device (1) and the interferon ⁇ by the mixing device (3); Supplying cells to be cultured in a culture solution (culture solution mixed with interferon ⁇ in a mixing device) by a cell supply device (4: cell supply unit: pipette, etc.); In the culture vessel (5: constant environment unit), the storage device (1) that stores the culture solution supplied with the cells to be cultured is left standing in a constant environment (for example, in a 37 ° C., 5% CO 2 environment).
  • culturing the cells Determining whether a human type 2 antigen-presenting molecule (eg, HLA-DR) is expressed in the cultured cells; Determining that serum is not included in the culture medium when the human type 2 antigen-presenting molecule is not expressed; It is characterized by having a step of determining that serum is included in the culture medium when a human type 2 antigen-presenting molecule is expressed.
  • a human type 2 antigen-presenting molecule eg, HLA-DR
  • the time for culturing the cells (the time for culturing the cells in the culture vessel 5) is 12 hours or more (in the step of culturing the cells Is preferably 12 hours or longer), and particularly preferably 48 hours or longer.
  • the concentration of interferon ⁇ is 100 units / ml or more, and preferably 400 units / ml or more.
  • a human type 2 antigen-presenting molecule eg, HLA-DR
  • a part of the cells cultured in the culturing step Is treated with a fluorescently labeled antibody that recognizes a human type 2 antigen-presenting molecule (for example, an anti-HLA-DR antibody) and partially treated with a negative control antibody that does not recognize any molecule (negative control antibody)
  • a process antibody treatment process
  • the cell of the present invention is cultured using a culture solution not containing serum, and human type 2 antigen-presenting molecule (eg, HLA-DR) is not expressed even when interferon ⁇ is added.
  • the present invention having the above-described configuration, after interferon ⁇ is added and, for example, fat-derived mesenchymal stem cells are cultured, human type 2 antigen presentation in the stem cells (for example, fat-derived mesenchymal stem cells) Whether or not serum is contained in the culture medium can be determined by measuring whether or not the molecule HLA-DR is expressed.
  • HLA-DR which is a type of antigen-presenting molecule
  • a type 2 antigen-presenting molecule for example, HLA-DR
  • HLA-DR a type 2 antigen-presenting molecule
  • no type 2 antigen-presenting molecule eg, HLA-DR
  • the culture medium is cultured in the culture medium. It is possible to discriminate whether the cells (for example, adipose-derived mesenchymal stem cells) are cells cultured in the presence of serum.
  • the cells for example, adipose-derived mesenchymal stem cells
  • stem cell administration therapy cells cultured in the presence of serum are at high risk of being contaminated with infections, etc., so patients treated with such stem cells are more likely to suffer from infections, etc. It is.
  • the above-mentioned culture broth does not contain serum (because it is a so-called “serum-free medium”)
  • the cells to be cultured in the culture broth will not be taken up with foreign antigens and administered to patients. In some cases there is no risk of an immune response.
  • the cells are cultured in a culture solution that does not contain serum, the characteristics of the cultured cells do not depend on the serum, and the range of cell characteristics is wider, unlike in the case of a culture solution that includes serum. Is prevented.
  • the culture medium using bovine serum is identified. Unlike the prior art (technique for measuring Neu5Gc), it can also be determined whether or not the cells are cultured using human serum.
  • type 2 antigen-presenting molecules may be expressed in the cultured cells. It was revealed.
  • the cells of the present invention are cultured in a culture solution that does not contain serum, foreign antigens are not taken up and there is no possibility of causing an immune reaction when administered. In addition, there is no infection caused by pathogens mixed in serum. Furthermore, the culture process is homogeneous and the range of characteristics of the cultured cells is not widened.
  • FIG. 6 Shows fluorescence intensity characteristics of cells cultured in a culture solution to which human serum is added but interferon ⁇ is not added, and (D) is fluorescence of cells cultured in a culture solution to which human serum and interferon ⁇ are added. Shows strength characteristics. It is a characteristic view which shows the fluorescence intensity characteristic of the cell culture
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing fluorescence intensity characteristics of cells cultured for 48 hours in a culture solution in which interferon ⁇ is added to a culture solution mixed with serum in the same manner as in FIG. FIG. It is a figure which shows the experimental result which measured whether the human type 2 antigen presentation molecule
  • the determination system 100 shown in FIG. 1 includes a storage device 1 (container), an interferon ⁇ supply device 2 (interferon ⁇ dropping unit), a mixing device 3 (including manual pipetting), and a cell supply device 4 (cell supply unit: pipette).
  • a storage device 1 container
  • interferon ⁇ supply device 2 interferon ⁇ dropping unit
  • mixing device 3 including manual pipetting
  • cell supply device 4 cell supply unit: pipette
  • a culture vessel 5 represents a constant environment unit
  • an analysis device 6 fluorescence intensity analysis unit
  • a determination device 7 determination unit: an information processing device having a calculation function such as a PC.
  • symbol CF represents a culture solution
  • symbol SC represents a cell to be cultured (for example, adipose-derived mesenchymal stem cell)
  • symbol CC represents a cultured cell (for example, a fat-derived mesenchymal stem cell).
  • the storage device 1 stores the culture medium CF (culture medium to be determined whether to include serum) supplied from the culture medium supply unit 8. In the process until the cells are cultured (until a predetermined time elapses in step S2 in FIG. 2), the culture solution CF to be determined is stored in the storage device 1 (container).
  • the interferon ⁇ supply device 2 (interferon ⁇ dripping unit) has a function of supplying interferon ⁇ to the culture solution CF (culture medium to be determined) stored in the storage device 1.
  • HLA-DR which is a human type 2 antigen-presenting molecule
  • the mixing device 3 has a function of uniformly mixing the culture solution CF in the storage device 1 and the interferon ⁇ supplied to the culture solution CF.
  • the mixing device 3 is a conventionally known device, and includes a placement portion 3A for placing the accommodation device 1 and a motion portion 3B for applying a horizontal reciprocating motion to the placement portion 3A. 1 has a function of uniformly mixing the culture solution CF and interferon ⁇ in the storage device 1.
  • the term “mixing device” is used not only for the electric device as described above but also for manual pipetting by an operator.
  • the cell supply device 4 (cell supply unit) supplies the cells SC to be cultured in the culture solution CF (culture medium to be determined) mixed with interferon ⁇ by the mixing device 3.
  • fat-derived mesenchymal stem cells are used as the cells SC to be cultured.
  • the cell supply device 4 also includes not only an automatic device but also a case where an operator uses a pipette or the like.
  • the culture vessel 5 (constant environment unit) is suitable for culturing cells when the storage device 1 that stores the culture solution CF (determination target) supplied with the cells SC to be cultured is stored and left standing. Provide and maintain a safe environment.
  • a culture environment at a temperature of 37 ° C. and 5% CO 2 is maintained in the culture vessel 5.
  • the culture solution CF (culture solution to be determined) mixed with interferon ⁇ and supplied with the cells SC to be cultured is accommodated and left in a culture environment at a temperature of 37 ° C. and 5% CO 2. Then, the cells SC are cultured.
  • An antibody processing unit 11 is disposed between the culture vessel 5 and the analyzer 6 (fluorescence intensity analysis unit), and cells cultured in the culture vessel 5 are supplied to the antibody processing unit 11.
  • a part of the cells supplied from the culture vessel 5 is processed with an antibody that recognizes a fluorescently labeled anti-human type 2 antigen-presenting molecule (for example, an anti-HLA-DR antibody), and one of the cells is processed. It has a function of treating the part with a negative control antibody (negative control antibody) that does not recognize any molecule.
  • a negative control antibody negative control antibody
  • the cells treated with the anti-HLA-DR antibody showed a fluorescence intensity characteristic as shown by characteristic B2 in FIG. 4 (B), and the cells treated with the negative control antibody FIG. 4B shows a fluorescence intensity characteristic as indicated by characteristic B1 in FIG.
  • characteristic B2 in FIG. 4
  • FIG. 4B shows a fluorescence intensity characteristic as indicated by characteristic B1 in FIG.
  • the analyzer 6 fluorescence intensity analysis unit
  • the analyzer 6 is a conventionally known apparatus (for example, a flow cytometer or an imaging cytometer) having a function of measuring and analyzing the fluorescence intensity in a cell, and is a cell cultured in the culture vessel 5.
  • a certain cell CC is analyzed by the analyzer 6.
  • the determination device 7 determines the analysis result of the analysis device 6, determines the fluorescence intensity characteristic of the cell CC, and the human type 2 antigen-presenting molecule (for example, HLA-DR) is expressed in the cultured cell CC. It has a function of determining whether or not serum is contained in the culture solution.
  • the flow cytometer corresponds to the analysis device 6 in FIG. 1, while the imaging cytometer corresponds to a combination of the analysis device 6 and the determination device 7 in FIG.
  • the determination device 7 is an information processing device having a calculation function such as a PC, and analyzes the analysis result of the analysis device 6 to determine the fluorescence intensity characteristic of the cultured cell CC.
  • a type 2 antigen-presenting molecule for example, HLA-DR
  • the determination device 7 includes a main body portion 7A and a display portion 7B, and has a function of displaying the determined fluorescence intensity characteristics and other analysis results and determination results on the display portion 7B.
  • a human type 2 antigen-presenting molecule for example, HLA-DR
  • step S1 a culture solution to be determined whether or not it contains serum is supplied from the culture solution supply unit 8 to the storage device 1, and interferon ⁇ is supplied to the culture solution stored in the storage device 1 by the interferon ⁇ supply device 2. Supply.
  • the accommodation apparatus 1 which accommodated the culture solution which supplied interferon (gamma) is mounted in the mounting part 3A of the mixing apparatus 3, a reciprocating motion is provided to the accommodation apparatus 1, and a culture solution and interferon (gamma) are mixed uniformly.
  • the mixing in step S1 may be manual pipetting.
  • step S1 the cell supply device 4 supplies fat-derived mesenchymal stem cells, which are cells to be cultured, to the culture solution mixed with interferon ⁇ . Furthermore, in step S ⁇ b> 1, the storage device 1 that stores the culture solution (culture solution to be determined) supplied with the cells to be cultured is stored in the culture vessel 5. Then, in a state where the storage device 1 is housed and left in the culture container 5, the culture container 5 is maintained in a constant environment (for example, in a 37 ° C., 5% CO 2 environment) to start cell culture.
  • a constant environment for example, in a 37 ° C., 5% CO 2 environment
  • step S2 the elapsed time from the start of the culture is measured, and it is determined whether or not a predetermined time has elapsed.
  • the predetermined time has elapsed (step S2 is “Yes”)
  • the process proceeds to step S3.
  • the predetermined time has not elapsed (step S2 is “No”)
  • the process returns to step S2, and the loop of “No” in step S2 is repeated.
  • step S3 it is determined whether or not a human type 2 antigen-presenting molecule (HLA-DR) is expressed in cells cultured after a predetermined time (adipose-derived mesenchymal stem cells).
  • HLA-DR human type 2 antigen-presenting molecule
  • the “determination” in step S3 is performed by the determination device 7 based on the result of the fluorescence intensity analysis of the analysis device 6.
  • HLA-DR human type 2 antigen-presenting molecule
  • the cells are treated with an antibody that recognizes an anti-human type 2 antigen-presenting molecule (for example, an anti-HLA-DR antibody), and the rest of the cells are treated with a negative control antibody that does not recognize any molecule (negative control antibody).
  • an antibody that recognizes an anti-human type 2 antigen-presenting molecule for example, an anti-HLA-DR antibody
  • a negative control antibody that does not recognize any molecule (negative control antibody).
  • the cells treated by the antibody treatment unit 11 are cells cultured in a culture solution containing serum, the treated cells are analyzed by flow cytometry or imaging cytometry.
  • the cells treated with the anti-HLA-DR antibody showed a fluorescence intensity characteristic as shown by characteristic B2 in FIG. 4B (step S3 is “Yes”), and the cells treated with the negative control antibody were FIG. 4B shows a fluorescence intensity characteristic as indicated by characteristic B1 (step S3 is “No”).
  • step S3 If it is determined in step S3 that human type 2 antigen-presenting molecule (HLA-DR) is expressed in the cultured cells (step S3 is “Yes”), the process proceeds to step S4. On the other hand, when it is determined that the human type 2 antigen-presenting molecule (HLA-DR) is not expressed in the cultured cells (step S3 is “No”), the process proceeds to step S5.
  • HLA-DR human type 2 antigen-presenting molecule
  • step S4 based on the determination result (step S3 is “Yes”) that “the human type 2 antigen-presenting molecule (HLA-DR) is expressed in the cultured cells”, the culture solution (the culture solution to be determined) ) Is determined to contain serum.
  • step S5 based on the determination result (step S3 is “No”) that “the human type 2 antigen-presenting molecule (HLA-DR) is not expressed in the cultured cells” in step S3, It is determined that serum is not included in the (culture medium to be determined).
  • the time for culturing cells in the culture vessel 5 (predetermined time in step S2) after adding interferon ⁇ to the culture medium (culture medium to be determined) is described with reference to FIGS. As will be described later, it is 12 hours or longer (the time for culturing the cells in the step of culturing the cells is 12 hours or longer), and it is particularly preferable to culture for 48 hours or longer.
  • the concentration of interferon ⁇ is 100 units / ml or more, particularly preferably about 400 units / ml, as will be described later with reference to FIGS.
  • the adipose-derived mesenchymal stem cells are cultured at a temperature of 37 using a culture solution sold by the applicant and not containing serum (trade name “sf-DOT”). After culturing in a 5% CO 2 environment at 5 ° C., the cultured stem cells (adipose-derived mesenchymal stem cells) were stained with a fluorescently labeled anti-HLA-DR antibody, and then the fluorescence intensity was measured by flow cytometry. When measured, the characteristics as shown in FIG. 3 to 9, the horizontal axis indicates the fluorescence intensity, and the vertical axis indicates the parameter relating to the number of the corresponding cells. In FIG. 3 (A), interferon ⁇ is not added and HLA-DR is not expressed.
  • interferon ⁇ (Prospec) was added to the same culture medium used in the experiment that obtained the characteristics of FIG. 3A (culture medium without serum: trade name “sf-DOT”: sold by the applicant).
  • the product name “IFN- ⁇ ” sold by the company is used in the illustrated embodiment), and the adipose-derived mesenchymal stem cells are cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment using the culture solution to which the interferon ⁇ is added.
  • the cultured and cultured stem cells (adipose-derived mesenchymal stem cells) were stained with a fluorescently labeled anti-HLA-DR antibody, and then the fluorescence intensity was measured by flow cytometry.
  • FIG. 3 (B) even when interferon ⁇ is added to a culture solution not containing serum, expression of HLA-DR, which is a human type 2 antigen-presenting molecule, is not induced.
  • FIG. 4 shows the result of fluorescence intensity measurement by flow cytometry after staining with a fluorescently labeled anti-HLA-DR antibody.
  • FIG. 4A shows the fluorescence intensity characteristics when no interferon ⁇ is added to the culture medium.
  • the characteristics shown in FIG. 4 (A) are similar to the characteristics shown in FIGS. 3 (A) and 3 (B), and expression of HLA-DR, which is a human type 2 antigen-presenting molecule, is not induced.
  • FIG. 4 (B) shows the case where the stem cells are cultured by adding interferon ⁇ to a culture solution (indicated by “ ⁇ MEM + 10% FCS”) in which 10% fetal bovine serum is added to the ⁇ MEM culture solution.
  • the characteristics of fluorescence intensity are shown.
  • the characteristic curve B1 shows the fluorescence characteristics of the cells treated with the negative control antibody
  • the characteristic curve B2 shows the fluorescence characteristics of the cells treated with the anti-HLA-DR antibody. Since the characteristic curves B1 and B2 can be clearly distinguished, It can be judged from FIG. 4 (B) that HLA-DR was expressed.
  • FIG. 5 shows a culture solution sold by the applicant, which does not include serum (trade name “sf-DOT”), and adipose-derived mesenchymal stem cells were treated at a temperature of 37 ° C. After culturing in a 5% CO 2 environment, the cultured stem cells (adipose-derived mesenchymal stem cells) were stained with a fluorescently labeled anti-HLA-DR antibody, and the fluorescence intensity was measured by flow cytometry. Experimental results are shown.
  • FIG. 5 (A) shows fluorescence labeling of cells cultured in a culture solution containing 10% fetal bovine serum but not interferon ⁇ added to a serum-free culture solution (trade name “sf-DOT”).
  • FIG. 5A shows the fluorescence-labeled anti-HLA ⁇ for the cells cultured in a culture solution to which fetal bovine serum and interferon ⁇ were added (culture solution not containing serum: trade name “sf-DOT”). It is the experimental result which measured the fluorescence intensity by flow cytometry after dyeing with DR antibody and a negative control antibody.
  • sf-DOT serum-labeled anti-HLA ⁇
  • HLA-DR a human type 2 antigen-presenting molecule
  • FIG. 5C shows fluorescence labeling of cells cultured in a culture solution containing 10% human serum but no interferon ⁇ added to a serum-free culture solution (trade name “sf-DOT”). It is the experimental result which measured the fluorescence intensity by flow cytometry, after dyeing
  • expression of HLA-DR which is a human type 2 antigen-presenting molecule, is not induced.
  • FIG. 5 (D) shows the anti-HLA-DR antibody labeled with fluorescence for cells cultured by adding human serum and interferon ⁇ to a serum-free culture solution (trade name “sf-DOT”).
  • HLA-DR a human type 2 antigen-presenting molecule
  • FIGS. 5 (C) and 5 (D) it was revealed that HLA-DR is expressed in human serum as well as bovine serum (fetal bovine serum) by addition of interferon ⁇ . . This indicates that cells cultured in a culture medium supplemented with serum express HLA-DR, a human type 2 antigen-presenting molecule, regardless of the origin of the serum, if interferon ⁇ is added. It was.
  • FIG. 6 shows the fluorescence intensity characteristics of cells cultured for 12 hours in a culture solution in which interferon ⁇ is added to a culture solution containing serum ( ⁇ MEM + 10% FCS, 10% fetal bovine serum mixed).
  • FIG. 6 shows a characteristic 6-1 that is a fluorescence intensity characteristic when treated with a negative control antibody and a fluorescence intensity characteristic 6-2 that is stained with a fluorescently labeled anti-HLA-DR antibody. .
  • the fluorescence intensity in the characteristic 6-1 when stained with the fluorescently labeled anti-HLA-DR antibody is slightly smaller than the fluorescence intensity in the characteristic 6-1 when treated with the negative control antibody. It was strong. This is a characteristic indicating that HLA-DR, which is a human type 2 antigen-presenting molecule, is expressed, as in the data of FIG. 4 (B).
  • the characteristic curve indicating that HLA-DR is expressed was not clearly expressed when the culture time was 11 hours or less. From this, it was found that the cells should be cultured for 12 hours or more after the addition of interferon ⁇ when determining whether or not the culture solution contains serum. Further, in the experiment of FIG. 6, the concentration of interferon ⁇ is 100 units / ml, but if the concentration of interferon ⁇ is less than that (95 units / ml or less in the inventors' experiment), HLA-DR is expressed. The characteristic curve indicating that this was not clearly expressed. Therefore, it was found that the concentration of interferon ⁇ should be 100 units / ml or more.
  • FIG. 7 also shows the fluorescence intensity characteristics of cells cultured for 12 hours in a culture solution in which interferon ⁇ is added to a culture solution ( ⁇ MEM + 10% FCS mixed with fetal calf serum) mixed with serum, as in FIG.
  • the concentration of added interferon ⁇ is 400 units / ml. Comparing FIG. 6 and FIG. 7, the characteristic indicating that HLA-DR is expressed is clearer in FIG. From FIG. 7, it was found that the concentration of interferon ⁇ is preferably 400 units / ml or more.
  • FIG. 8 also shows the fluorescence intensity characteristics of cells cultured in a culture solution in which interferon ⁇ is added to a culture solution ( ⁇ MEM + 10% FCS, 10% fetal bovine serum mixed) mixed with serum, as in FIG. 6.
  • the culture time is 48 hours, and the concentration of added interferon ⁇ is 100 units / ml. Comparing FIG. 6 and FIG. 8, the characteristic indicating that HLA-DR is expressed is clearer in FIG. From comparison between FIG. 6 and FIG. 8, it was found that the culture time is preferably 48 hours or more.
  • FIG. 9 shows the fluorescence intensity characteristics of cells cultured in a culture solution in which interferon ⁇ is added to a culture solution ( ⁇ MEM + 10% FCS, 10% fetal bovine serum mixed) mixed with serum.
  • the culture time is 48 hours, and the concentration of added interferon ⁇ is 400 units / ml. Comparing FIG. 6 to FIG. 9, the expression of HLA-DR is most obvious in FIG. 6 to 9, it was found that the culture time is preferably 48 hours or more, and the interferon ⁇ concentration is preferably 400 units / ml or more.
  • RNA was extracted from cells and then reverse transcription was performed to prepare cDNA.
  • the reverse transcription reaction is based on 1 ⁇ g of RNA, and the 5 ′ end is phosphorylated with a 6- mer or 9- mer deoxyribonucleotide mixture having a random sequence (deoxyribonucleotide mixture: 4 6 or 4 9 sequences are possible).
  • reverse transcriptase trade name “PrimeScript TM II Reverse Transcriptase” sold by Takara Bio Inc.
  • a PCR reaction was performed using the obtained cDNA to determine whether HLA-DR, a human type 2 antigen-presenting molecule, was expressed.
  • HLA-DR a human type 2 antigen-presenting molecule
  • the following were mixed.
  • 2 ⁇ l of a conditioner PCR Buffer: for mixing 1/10 of the reaction solution
  • 1 ⁇ l of nucleic acid mixture (trade name “dNTP Mixture” sold by Takara Bio Inc.)
  • 0.4 ⁇ l of forward primer (5 ⁇ M) final concentration: 0.1 ⁇ M
  • 0.4 ⁇ l of reverse primer (5 ⁇ M) final concentration: 0.1 ⁇ M
  • CDNA derived from 25 ng RNA CDNA derived from 25 ng RNA.
  • the primer sequences are as follows.
  • the forward primer is aggcacatcgctcagacac
  • Reverse primer is gcccaatacgaccacaatcc It is.
  • the forward primer is gggaaaagccaccactggaaaa
  • the reverse primer is aaaacagatgaggacgtgtgg It is.
  • a general thermal cycler 95 cycles of 15 seconds, 60 ° C for 1 minute, and 25 cycles of reaction.
  • the symbol “FBS” indicates a culture solution containing fetal bovine serum in the same manner as the symbol “FCS”, and the symbol “FBS_IFN ⁇ ” represents a sample obtained by adding interferon ⁇ to the culture solution containing fetal bovine serum.
  • the symbol “HS” indicates a culture solution containing human serum
  • the symbol “HS_IFN ⁇ ” indicates a sample obtained by adding interferon ⁇ to a culture solution containing human serum.
  • the white band in the descending “HLA-DR” indicates that HLA-DR, which is a human type 2 antigen-presenting molecule, was expressed.
  • a white band is shown in FBS_IFN ⁇ obtained by adding interferon ⁇ to fetal bovine serum and HS_IFN ⁇ obtained by adding interferon ⁇ to human serum.
  • HLA-DR a human type 2 antigen-presenting molecule
  • the presence or absence of serum in the culture medium is determined based on whether or not HLA-DR is expressed as a type 2 antigen-presenting molecule.
  • human type 2 antigen-presenting molecules other than HLA-DR are used. This includes the case where it is determined whether or not the culture solution contains serum depending on whether or not HLA-DQ or HLA-DP is expressed.
  • whether or not the type 2 antigen-presenting molecule (HLA-DR) is expressed is measured by flow cytometry.
  • the present invention is not limited to flow cytometry.
  • the present invention it is possible to determine whether or not the culture solution used for culturing mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord, bone marrow, amniotic membrane, dental pulp, and placenta includes serum. Alternatively, the present invention can also be applied when culturing various cells other than stem cells.
  • Storage device (container) 2.
  • Interferon gamma supply device (interferon gamma dropping unit) 3 ... Mixing device 3A ... Placement unit 3B ... Movement unit 4 ...
  • Cell supply device (cell supply unit) 5 ... Culture container (constant environment unit) 6 ... Analyzer (fluorescence intensity analysis unit), 7 ... Judgment device (judgment unit) 7A: Main unit 7B: Display unit 8: Culture solution supply unit 100: Determination system CC: Cultured cell CF ... Culture solution SC ... Cell to be cultured

Abstract

本発明は、細胞の培養に用いられる培養液（培地）が「血清を包含しない培養液」であるのか或いは「血清を包含する培養液」であるのかを、簡易に且つ確実に判定することが出来る判定システム及び判定方法の提供を目的としている。そのため、血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置（１）と、インターフェロンγ供給装置（２）と、混合装置（３）と、培養液に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置（４）と、細胞が供給された培養液を恒環境下で静置して収容する培養容器（５）と、培養細胞の蛍光強度を分析する分析装置（６）と、分析結果を解析する判断装置（７）備え、判断装置（７）はヒトの２型抗原提示分子が発現したか否かを判定する機能と、発現していない場合には培養液に血清が包含されないと判定する機能と、発現した場合には培養液に血清が包含されると判定する機能を有している。

Description

判定システム及び判定方法
　本発明は、細胞（例えば脂肪由来）の培養に用いられる培養液（或いは培地）に関する。より詳細には、本発明は培養液に血清が包含されているか否かを判定する技術に関する。
　各種疾病に幹細胞を投与する治療が効果的であることが、近年、広く知られている。その際に、幹細胞を安全且つ効率的に培養することが必要である。そして幹細胞投与以外の分野においても、細胞を安全且つ効率的に培養する必要性が存在する。
　細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養するに際しては、培養液中に培養するべき細胞を投入して、所定の環境（例えば３７℃、５％ＣＯ２の環境）で保存することにより行われるのが一般的である。
　ここで、上述した培養液が血清を含んでいると（所謂「血清培地」であると）、培養液中で培養されるべき細胞に異種抗原が取り込まれてしまい、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがある。
　また、血清中に混入した病原体による感染症の恐れも存在する。さらに、血清はロットにより成分が異なることが知られており、血清を用いて培養を行う際には培養工程が不均質であることが問題となる。
　それに加えて、血清を含む培養液で培養される細胞の特性が当該培養液中に混在する血清に依存するため、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうという問題も存在する。
　上述した不都合を解消するためには、血清を包含しない培養液（所謂「無血清培地」）を用いることが好ましい。
　しかし、現状で市販されている培養液の中には、血清含有量が比較的少ないものを「低血清培地」等と表記して販売しているケースも存在している。そのため、医療機関や研究機関の様に細胞を培養するために細胞培養液を購入する者（ユーザー）にとって、安全性、安定性が高い培養液（血清を包含しない培養液）であるか、安全性、安定性が低い培養液（血清を包含する培養液）であるかを判定することが困難な場合が多い。
　特に（幹細胞投与等の）医療分野で細胞を培養する場合には、培養液の安全性、安定性が高い「血清を包含しない培養液」を使用したいという要請が非常に強い。それにもかかわらず、血清包含しない培養液であるか否かを簡易に且つ確実に判定する技術は、現状では提案されていない。
　その他の従来技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてサンプル中の核酸の量を検出する技術が提案されている（例えば特許文献１参照）。
　しかし、係る従来技術（特許文献１）は培養液が血清を包含するか否かを判定することを目的とはしていない。
国際公開第２００６／１０２５６９号公報
　本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり、細胞の培養に用いられる培養液（培地）が「血清を包含しない培養液」であるのか或いは「血清を包含する培養液」であるのかを、簡易に且つ確実に判定することが出来る判定システム及び判定方法の提供を目的としている。
　本発明の判定システム（１００）は、
　血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置（１：容器）と、
　収容装置（１）に収容された培養液にインターフェロンγを供給するインターフェロンγ供給装置（２：インターフェロンγ滴下ユニット）と、
　収容装置（１）内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する混合装置（３）と、
　培養液（混合装置でインターフェロンγと混合された培養液）に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置（４：細胞供給ユニット或いはピペット等）と、
　培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置（１）を恒環境下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２環境下）で静置して収容する培養容器（５：恒環境ユニット）と、
　培養された細胞における蛍光強度を分析する分析装置（６：例えば、フローサイトメーター或いはイメージングサイトメーター）と、
　分析装置の結果を解析する判断装置（７：判断ユニット：例えばＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置）を備え、
　判断装置（７）はヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する機能を有していることを特徴としている。
　本発明の判定システム（１００）において、前記培養容器（５）と前記分析装置（6）との間に、培養された細胞の一部を、蛍光標識されたヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体）で処理し、且つ、培養された細胞の一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する機能を有する抗体処理ユニット（１１）を配置することが好ましい。
　また本発明の判定方法は、
　血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容装置（１：容器）に収容する工程と、
　インターフェロンγ供給装置（２：インターフェロンγ滴下ユニット）により収容装置（１）に収容された培養液にインターフェロンγを供給する工程と、
　混合装置（３）により収容装置（１）内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する工程と、
　細胞供給装置（４：細胞供給ユニット：ピペット等）により培養液（混合装置でインターフェロンγと混合された培養液）に培養するべき細胞を供給する工程と、
　培養容器（５：恒環境ユニット）内で、培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置（１）を恒環境下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２環境下）で静置して細胞を培養する工程と、
　培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定する工程と、
　ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する工程と、
　ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する工程を有していることを特徴としている。
　本発明の判定システム（１００）及び判定方法において、インターフェロンγを添加した後、細胞を培養する時間（培養容器５において細胞を培養する時間）は１２時間以上であり（細胞を培養する工程で細胞を培養する時間は１２時間以上であり）、特に４８時間以上培養することが好ましい。
　そして本発明の判定システム（１００）及び判定方法において、インターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌ以上であり、特に４００ユニット／ｍｌ以上であるのが好ましい。
　また本発明の判定方法において、培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定する工程では、前記培養する工程で培養された細胞の一部を、蛍光標識されたヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体）で処理し、且つ、一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する工程（抗体処理工程）を有することが好ましい。
　また本発明の細胞は、血清が包含されていない培養液を用いて培養され、インターフェロンγを添加してもヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現しないことを特徴としている。
　上述の構成を具備する本発明によれば、インターフェロンγを添加し、例えば脂肪由来の間葉系幹細胞を培養した後に、当該幹細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）においてヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現したか否かを測定することで、培養液中に血清が含まれているかどうかを判定することができる。
　換言すれば、本発明において、培養液に血清が包含されている場合に、当該培養液にインターフェロンγを添加して、細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養すると、当該細胞において２型抗原提示分子の一種であるＨＬＡ－ＤＲが発現するので、当該細胞を培養した結果、２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現すれば培養液中に血清が包含されていると判定され、２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現しなければ培養液中に血清が包含されていないと判定される。
　そのため本発明によれば、細胞を培養するための培養液が成分として血清を包含するか否かを、容易且つ確実に判定することが可能である。
　上述した様に、本発明によれば培養液に血清が含まれているか否かを容易且つ確実に判定することが出来るので、培養液を本発明により判定することによって、当該培養液で培養された細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）が、血清存在下で培養された細胞であるか否かを識別することが出来る。
　幹細胞投与治療において、血清存在下で培養された細胞は感染症等に汚染される危険性が高いので、その様な幹細胞が投与された患者は感染症等に罹患する可能性が高くなり、危険である。本発明により血清存在下で培養された細胞であるか否かを識別することにより、感染症発症等の危険性が少ない幹細胞を患者に投与することが出来て、幹細胞投与における安全性をさらに向上することが出来る。
　さらに、上述した培養液が血清を含んでいないため（所謂「無血清培地」であるため）、培養液中で培養されるべき細胞に異種抗原が取り込まれてしまうことがなく、患者に投与した場合には免疫反応を起こしてしまう恐れがない。
　さらに、血清を含まない培養液で細胞を培養するので、血清を包含する培養液の場合とは異なり、培養された細胞の特性は血清に依存することが無く、細胞の特性の幅が広くなってしまうことが防止される。
　これに加えて、本発明によれば、培養液にヒト血清及び／又は動物（例えば牛）の血清を混合したか否かを判定することが出来るので、ウシ血清を用いた培養液を識別する従来技術（Ｎｅｕ５Ｇｃを測定する技術）とは異なり、ヒト血清を使用して培養された細胞であるか否かをも判定することが出来る。
　さらに本発明により、血清が包含される培養液でインターフェロンγを添加して幹細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養すると、当該培養された細胞において２型抗原提示分子が発現することが明らかになった。
　また本発明の細胞は、血清が包含されていない培養液で培養されているため、異種抗原が取り込まれてしまうことはなく、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがない。また、血清中に混入した病原体による感染症も存在しない。さらに、培養工程が均質であり、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうこともない。
本発明の実施形態のブロック図である。 本発明の実施形態における判定の手順を示すフローチャートである。 血清を含まない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す特性図であり、（Ａ）はインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｂ）はインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す。 血清を混入した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す特性図であり、（Ａ）はインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｂ）はインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す。 血清を含まない培養液にウシ胎児血清を添加して培養した細胞と、ヒト血清を添加して培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図であり、（Ａ）はウシ胎児血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｂ）はウシ胎児血清及びインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｃ）はヒト血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｄ）はヒト血清及びインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す。 血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図である。 図６と同様に血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図であって、インターフェロンγの添加量が図６よりも多い場合の特性図である。 血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で４８時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図である。 図８と同様に血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で４８時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図であって、インターフェロンγの添加量が図８よりも多い場合の特性図である。 ＰＣＲ法を用いて血清を混入した培養液で培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子ＨＬＡ－ＤＲが発現したか否かを測定した実験結果を示す図である。
　以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
　最初に図１、図２を参照して、本発明の実施形態に係る判定システム及び判定方法について説明する。
　図１において、全体を符号１００で示す判定システム１００において、細胞の移動（或いは判定工程の順序）が矢印で表示されている。図１で示す判定システム１００は、収容装置１（容器）、インターフェロンγ供給装置２（インターフェロンγ滴下ユニット）、混合装置３（手動によるピペッティングを含む）、細胞供給装置４（細胞供給ユニット：ピペット等）、培養容器５（恒環境ユニット）、分析装置６（蛍光強度分析ユニット）、判断装置７（判断ユニット：例えばＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置）を備える。
　図１において、符号ＣＦは培養液、符号ＳＣは培養するべき細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）、符号ＣＣは培養した細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を表す。
　判定システム１００において、収容装置１（容器）は、培養液供給ユニット８から供給される培養液ＣＦ（血清を包含するか否かを判定するべき培養液）を収容する。細胞が培養されるまでの工程（図２のステップＳ２で所定時間が経過するまで）では、判定対象である培養液ＣＦは収容装置１（容器）内に収容された状態となる。
　インターフェロンγ供給装置２（インターフェロンγ滴下ユニット）は、収容装置１に収容された培養液ＣＦ（判定対象の培養液）に対してインターフェロンγを供給する機能を有している。
　図示の実施形態では、培養液ＣＦにインターフェロンγを添加し、脂肪由来の間葉系幹細胞を培養した後に、当該幹細胞においてヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現したか否かを測定することにより、培養液中に血清が含まれているかどうかを判定することができる。
　混合装置３は、収容装置１内の培養液ＣＦと培養液ＣＦに供給されたインターフェロンγを均一に混合する機能を有する。混合装置３は従来公知の装置であり、収容装置１を載置する載置部３Ａと、載置部３Ａに水平方向の往復運動を付与する運動部３Ｂを有しており、混合に際して収容装置１を往復運動せしめ、以て、収容装置１内の培養液ＣＦとインターフェロンγを均一に混合する機能を有している。
　なお本明細書において、「混合装置」なる文言は、上述した様な電動装置のみならず、オペレータの手動によるピペッティングを包含する趣旨で用いられている。
　細胞供給装置４（細胞供給ユニット）は、混合装置３でインターフェロンγと混合された培養液ＣＦ（判定対象の培養液）に培養するべき細胞ＳＣを供給する。実施形態では、培養するべき細胞ＳＣとして、脂肪由来の間葉系幹細胞を使用している。細胞供給装置４についても、自動装置のみならず、オペレータがピペット等を使用する場合を包含する趣旨である。
　培養容器５（恒環境ユニット）は、培養するべき細胞ＳＣが供給された培養液ＣＦ（判定対象）を収容している収容装置１が収容され、静置された際に、細胞の培養に適切な環境を提供、維持する機能を有している。図示の実施形態では、培養容器５内では温度３７℃、５％ＣＯ２の培養環境が維持されている。
　培養容器５では、インターフェロンγが混合し、培養するべき細胞ＳＣが供給された培養液ＣＦ（判定対象の培養液）が収容され、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養環境下に静置されて、細胞ＳＣが培養される。
　培養容器５と分析装置６（蛍光強度分析ユニット）の間には、抗体処理ユニット１１が配置されており、培養容器５で培養された細胞は、抗体処理ユニット１１に供給される。抗体処理ユニット１１では、培養容器５から供給された細胞の一部を、蛍光標識された抗ヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体）で処理し、当該細胞の一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する機能を有している。
　後述するように、血清を含む培養液で培養された細胞を、例えば抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で処理し、且つ、ネガティブコントロール抗体で処理し、その様な処理がされた細胞を分析装置６、例えばフローサイトメーター或いはイメージングサイトメーターで分析すると、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ２で示す様な蛍光強度特性を示し、ネガティブコントロール抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ１で示す様な蛍光強度特性を示す。
　換言すれば、抗体処理ユニット１１を設けることにより、図３以降で説明する蛍光強度特性を用いて培養液に血清が包含されているか否かを判定するに際して、判定の対象となる細胞における蛍光強度特性が、ＨＬＡ－ＤＲの発現が誘導されなかった場合の特性と同時に表示される。
　分析装置６（蛍光強度分析ユニット）は、細胞における蛍光強度を計測し、分析する機能を有する従来公知の装置（例えばフローサイトメーター、イメージングサイトメーター）であり、培養容器５で培養された細胞である細胞ＣＣが分析装置６で分析される。分析装置６による分析の結果、細胞ＣＣの蛍光強度特性を把握することが出来る。
　判断装置７（判断ユニット）は、分析装置６の分析結果を解析し、細胞ＣＣの蛍光強度特性を決定し、培養された細胞ＣＣにヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否か、すなわち培養液中に血清が包含されているか否かを判定する機能を有している。なお、フローサイトメーターは図１における分析装置６に相当するが、イメージングサイトメーターは図１における分析装置６と判断装置７とを組み合わせに相当する。
　判断装置７はＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置であって、分析装置６の分析結果を解析し、培養された細胞ＣＣの蛍光強度特性を決定する機能と、当該蛍光強度特性からヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定する機能と、培養された細胞ＣＣにヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液ＣＦには血清が包含されていないと判定する機能と、培養された細胞ＣＣにヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液ＣＦには血清が包含されていると判定する機能を有している。
　また、判断装置７は、本体部７Ａと表示部７Ｂを有し、表示部７Ｂに決定された蛍光強度特性その他の分析結果、判断結果を表示する機能を有している。図示はされていないが、情報処理装置に代えてオペレータにより「培養液ＣＦには血清が包含されているか否か」を判定することが可能であり、本明細書における「判断装置」という文言はその様な場合を包含する趣旨で用いられている。
　なお、分析結果である蛍光強度特性からヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定する手法に関しては、図３～図９を参照して後述する。
　次に、図示の実施形態において、培養液が血清を包含するか否かの判定手順（工程）を、主として図２のフローチャートを参照して説明する。
　ステップＳ１では、血清を包含するか否かを判定するべき培養液を培養液供給ユニット８から収容装置１に供給し、収容装置１に収容された培養液にインターフェロンγ供給装置２によりインターフェロンγを供給する。
　そして、インターフェロンγを供給した培養液を収容した収容装置１を混合装置３の載置部３Ａに載置し、収容装置１に往復運動を付与して培養液とインターフェロンγを均一に混合する。なお、上述した様に、ステップＳ１における混合は手動によるピペッティングであっても良い。
　またステップＳ１では、インターフェロンγと混合された培養液に対し、細胞供給装置４により、培養するべき細胞である脂肪由来の間葉系幹細胞を供給する。
　さらに、ステップＳ１では培養するべき細胞が供給された培養液（判定対象の培養液）を収容した収容装置１を、培養容器５内に収容する。そして、培養容器５内に収容装置１を収容、静置した状態で、培養容器５を恒環境下（例えば３７℃、５％ＣＯ２環境下）で維持して、細胞の培養を開始する。
　ステップＳ２では、上記培養開始からの経過時間を計測し、所定時間を経過したか否かを判断する。所定時間を経過した場合（ステップＳ２が「Ｙｅｓ」）、ステップＳ３に進む。一方、所定時間を経過していない場合（ステップＳ２が「Ｎｏ」）、ステップＳ２に戻り、ステップＳ２における「Ｎｏ」のループを繰り返す。
　次のステップＳ３では、所定時間経過して培養された細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定する。ステップＳ３における「判定」は、分析装置６の蛍光強度分析の結果に基づき、判断装置７で行う。
　ステップＳ３におけるヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かを判定するに際しては、先ず、ステップＳ２で培養された細胞の一部を、蛍光標識されたヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体）で処理し、一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する。図１をも参照して述べると、培養容器５で培養された細胞を抗体処理ユニット１１に供給し、抗体処理ユニット１１において、培養容器５から供給された細胞の一部を、蛍光標識された抗ヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体）で処理し、当該細胞の残りをどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する。
　そして抗体処理ユニット１１で処理された細胞が血清を含む培養液で培養された細胞であれば、当該処理がされた細胞をフローサイトメトリー或いはイメージングサイトメトリーにより分析する。
　その結果、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ２で示す様な蛍光強度特性を示し（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）、ネガティブコントロール抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ１で示す様な蛍光強度特性を示す（ステップＳ３が「Ｎｏ」）。
　ステップＳ３において、培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現したと判定された場合（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）は、ステップＳ４に進む。
　一方、培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現していないと判定された場合（ステップＳ３が「Ｎｏ」）には、ステップＳ５に進む。
　ステップＳ４では、「培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現した」との判定結果（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）に基づいて、培養液（判定対象の培養液）には血清が包含されていると判定する。
　一方、ステップＳ５では、ステップＳ３における「培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現していない」との判定結果（ステップＳ３が「Ｎｏ」）に基づき、培養液（判定対象の培養液）には血清が包含されていないと判定する。
　図示の実施形態で、培養液（判定対象の培養液）にインターフェロンγを添加した後、培養容器５において細胞を培養する時間（ステップＳ２における所定時間）は、図６から図９を参照して後述する様に、１２時間以上であり（細胞を培養する工程で細胞を培養する時間は１２時間以上であり）、特に４８時間以上培養することが好ましい。
　そしてインターフェロンγの濃度は、図６から図９を参照して後述する様に、１００ユニット／ｍｌ以上であり、特に４００ユニット／ｍｌ程度であるのが好ましい。
　図示の実施形態において、出願人が販売している培養液であって、血清を包含していない培養液（商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）を用いて、脂肪由来の間葉系幹細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、当該培養した幹細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測すると、図３（Ａ）で示す様な特性を示す。図３～図９において、横軸は蛍光強度を示し、縦軸は該当する細胞の個数に関するパラメータを示している。
　図３（Ａ）ではインターフェロンγは添加されておらず、ＨＬＡ－ＤＲは発現していない。
　一方、図３（Ａ）の特性を得た実験で使用された培養液と同一の培養液（血清を含まない培養液：商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」：出願人が販売）にインターフェロンγ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社販売の商品名「ＩＦＮ－γ」を図示の実施形態では使用）を添加し、当該インターフェロンγを添加した培養液で脂肪由来の間葉系幹細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、培養された幹細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した。その結果、図３（Ｂ）で示す様な特性を示した。
　図３（Ｂ）で示す様に、血清を含まない培養液にインターフェロンγを添加しても、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲの発現は誘導されない。
　間葉系幹細胞の培養に古典的に用いられているαＭＥＭ培養液に１０％（本明細書では全て容積％）のウシ胎児血清を添加した培養液によって培養された脂肪由来の間葉系幹細胞を、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した結果を、図４で示す。
　図４（Ａ）は、上記培養液にインターフェロンγを添加していない場合の蛍光強度の特性が示されている。図４（Ａ）で示す特性は図３（Ａ）、（Ｂ）で示す特性と同様であり、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現は誘導されない。
　一方、図４（Ｂ）には、αＭＥＭ培養液に１０％のウシ胎児血清を添加した培養液（符号「αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ」で示す）にインターフェロンγを添加して、上記幹細胞を培養した場合の蛍光強度の特性が示されている。
　図４（Ｂ）で示す特性では、特性曲線Ｂ１はネガティブコントロール抗体で処理した細胞の蛍光特性を示しており、特性曲線Ｂ２は抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で処理した細胞の蛍光特性を示している。特性曲線Ｂ１、Ｂ２は明瞭に区別することが出来るので、
図４（Ｂ）からＨＬＡ－ＤＲが発現したと判断出来る。
　図５は、出願人が販売している培養液であって、血清を包含していない培養液（商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）を用いて、脂肪由来の間葉系幹細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、当該培養した幹細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果を示している。
　図５（Ａ）は血清を含まない培養液（商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）に１０％のウシ胎児血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ａ）では、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現は誘導されていない。一方、図５（Ｂ）は、ウシ胎児血清及びインターフェロンγを添加した培養液（血清を含まない培養液：商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）で培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ｂ）から明らかな様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現している。
　図５（Ａ）及び図５（Ｂ）の実験結果から、この実験で用いられた血清を包含していない培養液（商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）の成分によりＨＬＡ－ＤＲの発現が抑えられている訳ではなく、この培養液に血清を添加した場合にはＨＬＡ－ＤＲの発現が誘導されることが明らかになった。
　図５（Ｃ）は、血清を含まない培養液（商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）に１０％のヒト血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ｃ）では、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現は誘導されていない。
　一方、図５（Ｄ）は、血清を含まない培養液（商品名「ｓｆ－ＤＯＴ」）にヒト血清及びインターフェロンγを添加して培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ｄ）から明らかな様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現している。
　図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）の実験結果から、ウシ血清（ウシ胎児血清）と同様に、ヒト血清においても、インターフェロンγの添加により、ＨＬＡ－ＤＲが発現することが明らかになった。このことから、血清の由来に拘らず、インターフェロンγを添加すれば、血清を添加した培養液で培養された細胞は、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲを発現することが示された。
　発明者は、インターフェロンγを添加した後の培養時間と、インターフェロンγの濃度について実験を行った。インターフェロンγとしては、Ｐｒｏｓｐｅｃ社販売の商品名「ＩＦＮ－γ」を、実験で使用した。そしてインターフェロンγの濃度のパラメータである「ユニット」も、当該インターフェロンγ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社販売の商品名「ＩＦＮ－γ」）における「ユニット」である。
　図６では、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、ウシ胎児血清を１０％混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
　図６において、ネガティブコントロール抗体で処理された場合の蛍光強度特性である特性６－１と、蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色を行った場合の蛍光強度特性６－２を示している。蛍光標識された抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色を行った場合の特性６－１における蛍光強度は、ネガティブコントロール抗体で処理された場合の蛍光強度特性６－１の蛍光強度よりも、僅かではあるが強かった。このことは、図４（Ｂ）のデータと同様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現していることを示す特性である。
　明示はしないが、発明者の実験では、培養時間が１１時間以下ではＨＬＡ－ＤＲが発現していることを示す特性曲線は明瞭には発現しなかった。そのことから、培養液が血清を包含するか否かを判定する際には、インターフェロンγを添加した後、細胞を１２時間以上培養するべきであることが判明した。
　また、図６の実験において、インターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌであるが、インターフェロンγの濃度がそれ未満（発明者の実験では９５ユニット／ｍｌ以下）であると、ＨＬＡ－ＤＲが発現していることを示す特性曲線は明瞭に発現しなかった。従って、インターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌ以上にするべきことが判明した。
　図７も図６と同様に、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、牛胎児血清を混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
　図７では、添加したインターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌである。図６と図７を比較すれば、図７の方がＨＬＡ－ＤＲが発現していることを示す特性は明瞭である。
　図７から、インターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌ以上であることが好ましいことが判明した。
　図８も図６と同様に、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、牛胎児血清を１０％混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
　図８では、培養時間が４８時間であり、添加したインターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌである。図６と図８を比較すれば、図８の方がＨＬＡ－ＤＲが発現していることを示す特性は明瞭である。
　図６と図８の比較から、培養時間は４８時間以上が好ましいことが判明した。
　図９も図８と同様に、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、牛胎児血清を１０％混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
　図９では、培養時間が４８時間であり、添加したインターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌである。図６～図９を比較すれば、図９においてＨＬＡ－ＤＲの発現が最も明瞭である。
　図６～図９から、培養時間は４８時間以上が好ましく、インターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌ以上が好ましいことが判明した。
　発明者が行った実験によれば、ＰＣＲにより、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲの発現を示すことが出来た。
　発明者が行った実験では、細胞よりＲＮＡを抽出した後、逆転写反応を行ってｃＤＮＡを調整した。逆転写反応は、１μｇのＲＮＡをもとに、ランダムな配列を有する６ｍｅｒまたは９ｍｅｒのデオキシリボヌクレオチド混合物（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ：４６個または４９個の配列が可能）で５´末端がリン酸化されているものをプライマーとして、逆転写酵素（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」）を用いて行った。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現したか否かを測定した。
　ＰＣＲによりＨＬＡ－ＤＲの発現するために、下記を混合した。
　酵素（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ」）の５ユニット／μリットルのものを０．１μリットル（最終濃度：０．０２５ユニット／μリットル）、
　調整剤（ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ：反応液の１／１０だけ混合用）を２μリットル、
　核酸混合液（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ」）を１μリットル、
　フォワードプライマー（５μＭ）を０．４μリットル（最終濃度：０．１μＭ）、
　リバースプライマー（５μＭ）を０．４μリットル（最終濃度：０．１μＭ）、
２５ｎｇのＲＮＡに由来するｃＤＮＡ。
　ここで、プライマーの配列は以下の通りである。
　図１０において、内部標準として用いられた遺伝子（全てにおいて発現する遺伝子：図１０における符号「ＧＡＰＤＨ」）において、
　フォワードプライマーは　ａｇｃｃａｃａｔｃｇｃｔｃａｇａｃａｃ
　リバースプライマーは　ｇｃｃｃａａｔａｃｇａｃｃａａａｔｃｃ
である。
　一方、遺伝子ＨＬＡ－ＤＲにおいて、
　フォワードプライマーは　ｇｇａｃａａａｇｃｃａａｃｃｔｇｇａａａ
リバースプライマーは　ａａａｃａｇａｔｇａｇｇａｃｇｔｔｇｇｇ
である。
　一般的なサーマルサイクラーを用いて、
　９５℃　１５秒
　６０℃　１分
を１サイクルとして、２５サイクル反応を行った。
　ＰＣＲ反応液のうち、１０μリットルを染色試薬（株式会社バイオクラフト製の商品名「ＧＲＧｒｅｅｎ　Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ」）１０μリットルと混合した後、アガロースゲル電気泳動に供した。
　アガロースゲル電気泳動の後、分析装置（ＧＥヘルスケア社製の商品名「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ４０００」）を用いた結果、図１０で示す様なバンドを検出した。
　図１０において、符号「ＦＢＳ」は符号「ＦＣＳ」と同様にウシ胎児血清を包含する培養液を示しており、符号「ＦＢＳ＿ＩＦＮγ」はウシ胎児血清を包含する培養液にインターフェロンγを添加したサンプルを示す。そして符号「ＨＳ」はヒト血清を包含する培養液を示し、符号「ＨＳ＿ＩＦＮγ」はヒト血清を包含する培養液にインターフェロンγを添加したサンプルを示す。
　図１０において、下行「ＨＬＡ－ＤＲ」において、白いバンドはヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現したことを示している。ウシ胎児血清にインターフェロンγを添加したＦＢＳ＿ＩＦＮγと、ヒト血清にインターフェロンγを添加したＨＳ＿ＩＦＮγには白いバンドが示されている。
　図１０で結果を示す実験により、ＰＣＲによっても、血清を含有する培地であれば、インターフェロンγを添加することにより、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現することが確認された。
　これに加えて発明者の実験によれば、血清含有量が低い培養液（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製造の商品名「ＭｅｓｓｅｎＰｒｏ　ＲＳ」においても、インターフェロンγを添加すると、図４（Ｂ）、図５（Ｂ）、図７～図９と同様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＲが発現することが確認された。
　図示の実施形態はあくまでも例示であり、本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではないことを付記する。
　例えば図示の実施形態では、２型抗原提示分子としてＨＬＡ－ＤＲが発現したか否かにより培養液の血清の有無を判定したが、本発明では、ＨＬＡ－ＤＲ以外のヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ－ＤＱ或いはＨＬＡ－ＤＰが発現したか否かにより、培養液が血清を包含するか否かを判断する場合を包含する。
　また図示の実施形態では、２型抗原提示分子（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現したか否かについてはフローサイトメトリーで計測しているが、本発明はフローサイトメトリーに限定されるものではなく、ＰＣＲ法、その他のヒトの２型抗原提示分子の発現の有無を計測することが出来る測定手法を用いる場合を包含する。
　さらに、図示の実施形態では脂肪由来の間葉系幹細胞を培養する場合について説明しているが、臍帯由来、骨髄由来、羊膜由来、歯髄由来、胎盤由来の間葉系幹細胞であっても同様であり、本発明は臍帯由来、骨髄由来、羊膜由来、歯髄由来、胎盤由来の間葉系幹細胞の培養で使用される培養液が血清を包含するか否かを判断することが出来る。或いは、幹細胞以外の各種細胞を培養する場合においても、本発明を適用することが出来る。
１・・・収容装置（容器）
２・・・インターフェロンγ供給装置（インターフェロンγ滴下ユニット）
３・・・混合装置
３Ａ・・・載置部
３Ｂ・・・運動部
４・・・細胞供給装置（細胞供給ユニット）
５・・・培養容器（恒環境ユニット）
６・・・分析装置（蛍光強度分析ユニット）、
７・・・判断装置（判断ユニット）
７Ａ・・・本体部
７Ｂ・・・表示部
８・・・培養液供給ユニット
１００・・・判定システム
ＣＣ・・・培養した細胞
ＣＦ・・・培養液
ＳＣ・・・培養するべき細胞

Claims (5)

  1. 　血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置と、
    　収容装置に収容された培養液にインターフェロンγを供給するインターフェロンγ供給装置と、
    　収容装置内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する混合装置と、
    　培養液に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置と、
    　培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置を恒環境下で静置して収容する培養容器と、
    　培養された細胞における蛍光強度を分析する分析装置と、
    　分析装置の結果を解析する判断装置を備え、
    　判断装置はヒトの２型抗原提示分子が発現したか否かを判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する機能を有していることを特徴とする判定システム。
  2. 　培養容器において細胞を培養する時間は１２時間以上である請求項１の判定システム。
  3. 　血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容装置に収容する工程と、
    　インターフェロンγ供給装置により収容装置に収容された培養液にインターフェロンγを供給する工程と、
    　混合装置により収容装置内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する工程と、
    　細胞供給装置により培養液に培養するべき細胞を供給する工程と、
    　培養容器内で、培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置を恒環境下で静置して細胞を培養する工程と、
    　培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子が発現したか否かを判定する工程と、
    　ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する工程と、
    　ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する工程を有していることを特徴とする判定方法。
  4. 　細胞を培養する工程で細胞を培養する時間は１２時間以上である請求項３の判定方法。
  5. 　血清が包含されていない培養液を用いて培養され、インターフェロンγを添加してもヒトの２型抗原提示分子が発現しないことを特徴とする細胞。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541769A (ja) * 2005-06-03 2008-11-27 アンブレツクス・インコーポレイテツド 改善されたヒトインターフェロン分子及びそれらの使用
JP2013018756A (ja) * 2011-07-13 2013-01-31 Sapporo Medical Univ 間葉系幹細胞の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤
JP2016144439A (ja) * 2015-01-30 2016-08-12 ロート製薬株式会社 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541769A (ja) * 2005-06-03 2008-11-27 アンブレツクス・インコーポレイテツド 改善されたヒトインターフェロン分子及びそれらの使用
JP2013018756A (ja) * 2011-07-13 2013-01-31 Sapporo Medical Univ 間葉系幹細胞の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤
JP2016144439A (ja) * 2015-01-30 2016-08-12 ロート製薬株式会社 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRIFFITHS C.E.M. ET AL.: "Gamma interferon induces different keratinocyte cellular patterns of expression of HLA-DR and DQ and intercellular adhesion molecule-I (ICAM-I) antigens", BR. J. DERMATOL., vol. 120, 1989, pages 1 - 7 *
HUGHES D.A. ET AL.: "Fish oil supplementation inhibits the expression of major histocompatibility complex class II molecules and adhesion molecules on human monocytes1-3", AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL NUTRITION, vol. 63, 1996, pages 267 - 272, XP055604121 *

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