JP2008541769A - 改善されたヒトインターフェロン分子及びそれらの使用 - Google Patents

改善されたヒトインターフェロン分子及びそれらの使用 Download PDF

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クヌーセン，ニツク
ダニエル，トーマス・オー
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バツセル，スチユアート
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Abstract

修飾されたヒトインターフェロンポリペプチド及びその使用が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ」と題された２００５年６月３日に出願された米国仮特許出願６０／６８７，１７３号及び「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ」と題された２００５年１２月２１日に出願された米国仮特許出願６０／７５３，３７５号の優先権を主張し、これらの明細書は、それらの全体が本明細書中に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸で修飾されたインターフェロンポリペプチドに関する。
成長ホルモン（ＩＦＮ）スーパー遺伝子ファミリー（Ｂａｚａｎ， Ｆ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９０）；Ｍｏｔｔ， Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｉ．Ｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ， Ｏ．ａｎｄ ＩｈＩｅ， Ｊ．Ｎ．（１９９６）ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＢＹ ＴＨＥ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ）は、類似の構造的特徴を有するタンパク質の群を成す。タンパク質の本ファミリーの各メンバーは、４ヘリックスバンドルを含む。なお同定されるべきファミリーのさらなるメンバーがなお存在するが、ファミリーの幾つかのメンバーには、以下のもの：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、εインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＩＦＮスーパー遺伝子ファミリー」）が含まれる。ＩＦＮスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般に、制限されたアミノ酸又はＤＮＡ配列の同一性を有するという事実に関わらず、ＩＦＮスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、類似の二次構造及び四次構造を有する。構造的特徴の共有により、遺伝子ファミリーの新規メンバーは容易に同定することが可能である。ＩＦＮα−２の一般的構造は、図１に示されている。
インターフェロンは、ウイルスによって侵入された細胞、又はある種の他の物質に曝露された細胞によって放出される、比較的小さな一本鎖糖タンパク質である。現在、インターフェロンは、１）白血球インターフェロン（インターフェロン−α、α−インターフェロン、ＩＦＮ−α）、２）繊維芽細胞インターフェロン（インターフェロン−β、β−インターフェロン、ＩＦＮ−β）及び３）免疫インターフェロン（インターフェロン−γ、γ−インターフェロン、ＩＦＮ−γ）と表記される３つの主要なクラスにグループ分けされている。ウイルス感染に応答して、リンパ球は、主に、（オメガインターフェロン、ＩＦＮ−ωとともに）α−インターフェロンを合成するが、繊維芽細胞の感染は、通常、β−インターフェロンの産生を誘導する。ＩＦＮα及びＩＦＮβは、約２０から３０％のアミノ酸配列相同性を有する。ヒトＩＦＮ−βに対する遺伝子はイントロンを欠如し、ヒトＩＦＮ−αと２９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードしており、これらは、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β遺伝子が共通の先祖から進化したことを示唆している（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８５ ５４７−５４９（１９８０））。これに対して、ＩＦＮ−γは、分裂促進因子に応答して、リンパ球によって合成される。ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮωは、ＭＨＣクラスＩ抗原発現を誘導することが知られており、Ｉ型インターフェロンと称されるのに対して、ＩＦＮγはＭＨＣクラスＩＩ抗原発現を誘導し、ＩＩ型インターフェロンと称される。「Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）２２：９２９−７９」（この全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。）は、インターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−ε、−κ、−ω、−δ、−τ及び−γ）並びにリミチン、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ２９などのインターフェロン様分子並びにこれらの分子によって使用されるリガンド、受容体及びシグナル伝達経路など、クラス２αヘリックスサイトカインを記載する。インターフェロンは異なる種を有し、多くの対立遺伝子バリアントを有する。さらに、新規活性及び変異配列を有するインターフェロンが、様々な疾病を有する患者から得られる細胞から単離されている。
ＩＦＮαの異なる種をコードする異なる多数の遺伝子が同定されている。αインターフェロンはＩ及びＩＩという２つの主要なクラスに属し、各々が複数の異なるタンパク質を含有する（Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， １７９−１９０（１９９０）；Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８７， ４０１−４０８（１９８０）；Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８４， ３１６−３２０（１９８０）；Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９， １３４３−１３４７（１９８０）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９０， ２０−２６（１９８１）；Ｌａｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２， １１５９−１１６２（１９８１）；Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５６， ４６７−４８６（１９８２）；Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ２９９， ７−２８（１９８２）；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１， ２４３５−２４３９（１９８４）；Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，７６８（１９８５））。様々なＩＦＮ−α種には、ＩＦＮ−αＡ（ＩＦＮ−α２）、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣ、ＩＦＮ−αＣｌ、ＩＦＮ−αＤ（ＩＦＮ−αｌ）、ＩＦＮ−αＥ、ＩＦＮ−αＦ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＦＮ−αＨ、ＩＦＮ−αＩ、ＩＦＮ−αＪｌ、ＩＦＮ−αＪ２、ＩＦＮ−αＫ、ＩＦＮ−αＬ、ＩＦＮ−α４Ｂ、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７４、ＩＦＮ−α７６、ＩＦＮ−α４ａ）、ＩＦＮ−α８８及びこれらの対立遺伝子が含まれる。Ｔｒｏｔｔａらは、「“Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ａｌｆａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ”Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ３４：１２３１−１２４６（２０００）（参照により、この全体が本明細書中に組み込まれる。）において、ヒトＩＦＮα遺伝子ファミリー及びタンパク質のメンバー並びに免疫調節、抗増殖、抗ウイルス及び抗微生物活性などの本ファミリーの生物学的活性について記載している。Ｔｒｏｔｔａらによって挙げられたインターフェロンタンパク質には、ＩＦＮα１（ＩＦＮＡ１遺伝子から得られる。）、ＩＦＮαＤ、ＩＦＮα２（ＩＦＮα２ｂ）、ＩＦＮαＡ（ＩＦＮα２ａ）、ＩＦＮα２ｃ、ＩＦＮα４ａ（ＩＦＮα７６）、ＩＦＮα４ｂ、ＩＦＮα５、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮα６１、ＩＦＮα６、ＩＦＮακ、ＩＦＮα５４、ＩＦＮα７、ＩＦＮａＪ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮα８、ＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＢ、ＩＦＮαｃ、ΨＩＦＮα１０、ΨＩＦＮαＬ、ＩＦＮα６Ｌ、ＩＦＮα１３、ＩＦＮα１４、ＩＦＮαＨ、ＩＦＮαＨ１、ＩＦＮα１６、ＩＦＮαｗＡ、ＩＦＮαＯ、ＩＦＮα１７、ＩＦＮα１、（ＩＦＮＡ１７遺伝子から得られる。）、ＩＦＮα８８、ＩＦＮα１（ＩＦＮＡ２１遺伝子から得られる。）、ＩＦＮαＦ及びΨＩＦＮαＥが含まれる。Ｔｒｏｔｔａらは、本ファミリーにおけるタンパク質の組換えバージョンに関連する産生、性質決定、品質確保、生物学的活性並びに臨床的安全性及び有効性の問題についても論述している。放出試験及び物理化学的性質決定検査についても論述されている。ＩＦＮα２１、ＩＦＮα４、ＩＦＮα１０及びＩＦＮα３は、以前に記載されたその他のインターフェロンタンパク質である。
当初、インターフェロンは、インターフェロン産生を増加させるための誘導剤を場合によって用いて、バフィーコート白血球及び繊維芽細胞など、天然に存在する採取源から得られた。インターフェロンは、組換えＤＮＡ技術によっても生産された。
組換えＩＦＮαＡのクローニング及び発現（ＩＦＮα２としても知られるＩＦＮαＡ）は、「Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８７， ４１１（１９８０）」によって記載された。ＩＦＮαＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ及びＬのアミノ酸配列は、コードするヌクレオチド配列とともに、Ｐｅｓｔｋａによって、Ａｒｃｈｉｖ．ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２１，１（１９８３）に記載されている。成熟したＩＦＮβのクローニング及び発現は、「Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０５７，（１９８０）」によって記載されている。成熟したＩＦＮγのクローニング及び発現は、「Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９５， ５０３（１９８２）」によって記載されている。ＩＦＮωは、「Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５， ７６８（１９８５）」によって記載されている。ＩＦＮτは、「Ｗｈａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９， １０８６４−８（１９９４）」によって同定及び開示されている。
インターフェロンは、抗ウイルス、免疫制御及び抗増殖特性などの様々な生物活性を有しており、癌及び様々なウイルス疾患などの疾患の治療のための治療剤として使用される。クラスとして、インターフェロンαは、細胞増殖の様々な種類を阻害することが示されており、癌、特に、白血病などの血液の悪性腫瘍を頻繁に伴う様々な細胞増殖疾患の治療に特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌腫、膀胱癌及び卵巣癌に対して抗増殖活性を示した（Ｂｏｎｎｅｍ， Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ３：５８０；Ｏｌｄｈａｍ， Ｒ．Ｋ．（１９８５） Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０：７１）。
さらに、インターフェロン−αは、中枢神経系において、重要な神経制御機能を有し得る。構造的及び機能的類似性が、ＩＦＮαとエンドルフィンの間で示されている。ＩＦＮα分子が免疫及びオピオイド様効果を媒介する異なるドメインを含有していること、並びにμオピオイド受容体がＩＦＮαの鎮痛効果に関与し得ることが報告されている。インターフェロン−αの三次構造の鎮痛ドメインが記載されており、これは、該分子の１２２番目のＴｙｒ残基の周囲に位置しており、Ｐｈｅ残基３６、３８及び１２３が含まれる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１０８：６４−６７及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ（２００１） １２（４）：８５７−８５９、参照により、本明細書に組み込まれる。）。具体的には、Ｗａｎｇらは、残基３６におけるインターフェロン−α変異体（Ｆ３６Ｓ）が鎮痛活性の完全な喪失及び抗ウイルス活性の低下をもたらすことを見出した。別のＩＦＮ−α変異体（Ｆ３８Ｓ）は、鎮痛活性の完全な喪失及び抗ウイルス活性のほぼ完全な喪失をもたらした。研究されてきたＩＦＮαの他の変異体には、Ｆ３８Ｌ及びＹ１２９Ｓが含まれる。Ｗａｎｇらは、ヒトＩＦＮαによって誘導された発熱を調査する研究においてこれら２つの変異体を記載しており、ＩＦＮα療法のこの副作用が、ＩＦＮαのオピオイド受容体との相互作用及びプロスタグランジンＥ２のその後の誘導によって媒介されることを見出した（Ｊ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００４） １５６：１０７−１１２）。ＩＦＮとオピオイド受容体間の相互作用を調節することは、受容体の本ファミリーが関与する副作用を防止するために、新規ＩＦＮ治療薬の開発において重要であり得る。プロスタグランジンは、発熱、睡眠／覚醒サイクル及び疼痛の知覚など（これらに限定されない。）の中枢神経系機能を調節する。プロスタグランジンは、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の酵素活性によって産生される。
ＩＦＮ−αの投与は、うつ病などの多数の神経精神病的副作用ももたらし得る（Ｗｉｃｈｅｒｓ ａｎｄ Ｍａｅｓ， Ｒｅｖ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４）２９（１）：１１−１７）。ＷｉｃｈｅｒｓとＭａｅｓは、セロトニン（５−ＨＴ）脳神経伝達及び酵素ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）の誘導が関与していることを示している。他の仮説には、酸化窒素及びＩＦＮによる可溶性ＩＣＡＭ−１の誘導が含まれる。ＩＦＮがこのような副作用を引き起こす機序を調節することは、新規ＩＦＮ治療薬の開発において重要であり得る。
市販のＩＦＮ産物の具体例には、ＩＦＮγ−１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ））、ＩＦＮβ−ｌａ（Ａｖｏｎｅｘ（Ｒ）及びＲｅｂｉｆ（Ｒ））、ＩＦＮβ−ｌｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ））、ＩＦＮａｌｆａｃｏｎ−１（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（Ｒ））、ＩＦＮα−２（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ））、ＩＦＮα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ））、Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ））及びＰｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ））が含まれる。ＩＦＮタンパク質のＰＥＧ化されたバージョンの産生に伴う問題の幾つかが、「Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５４７−５７０」及び「Ｐｅｄｄｅｒ， Ｓ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００３；２３ Ｓｕｐｐｌ １ ：１９−２２」が記載されている。Ｗａｎｇらは、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）の位置異性体を性質決定し、Ｐｅｄｄｅｒらは、ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）をＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）と比較し、使用されたＰＥＧ化の化学の脆弱性及び製剤化に対する効果について記載している。ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）は、抗ウイルス活性が異なる特異的イソフォームである、９つの同定可能なイソフォームから構成される（Ｆｏｓｅｒ ｅｌ ａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊ ２００３；３：３１２）。現在市販されているＩＦＮ産物の数に関わらず、インターフェロン治療薬に対しては、未だ充足されていない要求がなお存在する。特に、現行のＩＦＮ治療薬に見出される１つ又はそれ以上の副作用を調節するインターフェロン治療薬が興味深い。
親水性ポリマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略される。）の共有結合は、タンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子を含む、多くの生物活性分子の水溶性、生物学的利用性を増加させ、血清半減期を増加させ、治療半減期を増加させ、免疫原性を調節し、生物学的活性を調節し、又は循環時間を延長する方法である。ＰＥＧは、医薬中で、人工のインプラント上で、及び生体適合性、毒性の欠如及び免疫原性の欠如が重要であるその他の用途において広く使用されてきた。ＰＥＧの所望される特性を最大化するために、生物活性分子に付着される１又はそれ以上のＰＥＧポリマーの総分子量及び水和状態は、親分子の生物活性に悪影響を与えずに、増加された水溶解度及び循環半減期などの、ＰＥＧポリマーの付着に典型的に付随する有利な特性を付与するのに十分に高度でなければならない。
ＰＥＧ誘導体は、リジン、システイン及びヒスチジン残基、Ｎ末端及び炭水化物部分などの反応性の化学官能基を通じて、生物活性分子に頻繁に連結される。タンパク質及び他の分子は、しばしば、ポリマー付着に対して利用可能な反応性部位の限られた数を有する。しばしば、ポリマー付着を介した修飾に最も適した部位は、受容体結合において重要な役割を果たし、分子の生物学的活性の保持に必要である。その結果、生物活性分子上のこのような反応性部位へのポリマー鎖の無差別な付着は、しばしば、ポリマー修飾された分子の生物学的活性の著しい減少又は完全な喪失さえ引き起こす。Ｒ．Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７。標的分子に所望の利点を付与するのに十分なポリマー分子量を有する結合体を形成するために、従来のアプローチは、典型的には、分子への多数のポリマーアームをランダムに付着させることにより、親分子の生物活性の減少又は完全な喪失のリスクを増加させる。
タンパク質にＰＥＧ誘導体を付着させるための部位を形成する反応性部位は、タンパク質の構造によって規定される。タンパク質（酵素を含む。）は、一般構造Ｈ２Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨを有するα−アミノ酸の様々な配列から構成される。１つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ））に連結してアミド結合を形成し、アミド結合は、−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−（下付き文字「ｎ」は、数百又は数千に等しくなり得る。）として表すことが可能である。Ｒによって表される断片は、タンパク質の生物活性のための及びＰＥＧ誘導体の付着のための反応性部位を含有することが可能である。
例えば、アミノ酸リジンの場合には、ε位置及びα位置中に−ＮＨ２部分が存在する。ε−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下で、反応に利用できる状態にある。ＰＥＧを用いたタンパク質誘導体化の分野の技術の多くは、タンパク質中に存在するリジン残基のε−ＮＨ２部分に付着させるためのＰＥＧ誘導体を開発することに向けられてきた。「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”， Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ， ２００３， ｐｐ．１−１７」。しかしながら、これらのＰＥＧ誘導体は全て、タンパク質の表面上に存在するしばしば多数のリジン残基の中から選択的に取り付けることができないという共通の限界を有している。これは、タンパク質活性にとってリジン残基が重要である事例（例えば、酵素活性部位中に存在する。）において、又は受容体結合部位の場合におけるように、他の生物学的分子とのタンパク質の相互作用を媒介する上でリジン残基が役割を果たす事例において著しい限界であり得る。
タンパク質のＰＥＧ化のための既存の方法の等しく重要な第二の困難は、ＰＥＧ誘導体が所望でない残基以外の残基と望ましくない副反応を引き起こし得るということである。ヒスチジンは、構造的に−−Ｎ（Ｈ）−−として表される反応性イミノ部分を含有するが、ε−−ＮＨ２と反応する多くの化学的に反応性の種も、−−Ｎ（Ｈ）−−と反応し得る。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、構造的に−ＳＨとして表される遊離のスルフヒドリル基を有する。幾つかの例では、リジンのε−ＮＨ２基に誘導されたＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジン又は他の残基とも反応する。これは、ＰＥＧ誘導化された生物活性分子の複雑で、不均一な混合物を与え、標的とされている生物活性分子の活性を破壊するリスクをもたらし得る。化学的官能基をタンパク質内の単一部位に導入できるようにした後、明確に確定され、且つ予測可能な、タンパク質表面上の特異的部位において、１つ又はそれ以上のＰＥＧポリマーを生物活性分子に選択的に結合させることを可能とするＰＥＧ誘導体を開発することが望ましい。
リジン残基に加えて、システイン、ヒスチジン及びＮ末端を含む他のアミノ酸側鎖を標的とする活性化されたＰＥＧ試薬の開発に向けて、本分野では多大な努力が注力されてきた。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）及び「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”， Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ， ２００３， ｐｐ．１−１７」を参照されたい。システイン残基は、部位特異的変異誘発及び本分野において公知の他の技術を用いて、タンパク質の構造中へ、部位選択的に導入することが可能であり、その結果得られる遊離のスルフヒドリル部分は、チオール反応性官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応することが可能である。しかしながら、遊離のスルフヒドリル基の導入が、得られるタンパク質の発現、折り畳み及び安定性を複雑化し得るという点で、このアプローチは複雑である。従って、スルフヒドリル及びタンパク質中に典型的に見出される他の化学的官能基と同時に適合的でありつつ（すなわち、これらとの望ましくない副反応に関与しない。）、タンパク質への、１つ又はそれ以上のＰＥＧポリマーの選択的カップリングを可能とする、生物活性分子中に化学的官能基を導入するための手段を有することが望ましい。
本分野の標本から明らかなように、タンパク質の側鎖（特に、リジンのアミノ酸側鎖上の−ＮＨ２部分及びシステイン側鎖上の−ＳＨ部分）へ付着させるために開発されたこれらの誘導体の多くは、これらの合成及び使用において問題があることが判明している。ある場合には、加水分解に供せられ、従って、水性環境中（血流中など）で分解し、損傷し、又はその他不安定にするタンパク質との不安定な結合を形成する。ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）中の結合の安定性の考察については、「Ｐｅｄｄｅｒ， Ｓ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００３ ；２３ Ｓｕｐｐｌ １：１９−２２」を参照されたい。ある場合には、さらに安定な結合を形成するが、結合が形成される前に加水分解に供せられ、これは、タンパク質が付着可能となる前にＰＥＧ誘導体上の反応性基が不活化され得ることを意味する。ある場合には、幾分毒性であり、従って、インビボでの使用にはより適していない。ある場合には、反応が遅すぎて実際に有用ではない。ある場合には、タンパク質の活性に関わる部位に付着することによって、タンパク質活性の喪失をもたらす。ある場合には、それらが付着する部位において特異的ではなく、これも、所望の活性の喪失及び結果の再現性の欠如をもたらすことも可能である。ポリ（エチレングリコール）部分でタンパク質を修飾することに伴う困難を克服するために、より安定であるか（例えば、米国特許第６，６０２，４９８号（参照により、本明細書中に組み込まれる。））、又は分子及び表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（米国特許第６，６１０，２８１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。））が開発されている。安定な化学結合を形成するために選択的に反応するように求められるまで、生理的環境中で化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体に対する必要性が本分野において明確に存在する。
最近、タンパク質の部位特異的な修飾に付随する制約の多くを克服することを約束する、タンパク質科学における全く新しい技術が報告された。具体的には、原核生物であるエシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，（２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００）及び真核生物サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、Ｊ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成装置に新しい成分が付加され、これによって、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、インビボでタンパク質に取り込むことが可能となった。この方法を用いて、光親和性標識及び光異性化可能なアミノ酸、光架橋アミノ酸（例えば、Ｃｈｉｎ， Ｊ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１０２０−１１０２４；及びＣｈｉｎ， Ｊ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７参照）、ケトアミノ酸、重原子含有アミノ酸及びグリコシル化されたアミノ酸など、新しい化学的、物理的又は生物学的特性を有する多数のアミノ酸が、アンバーコドンＴＡＧに応答して、Ｅ．コリ及び酵母中のタンパク質中に、効率的に及び高い精度で取り込まれている。例えば、「Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ， ＆ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ３（１１）：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．，（２００２）， ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４；ａｎｄ， Ｌ．Ｗａｎｇ， ＆ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．， １ ：１−１１。全ての参考文献は、これらの全内容が参照により組み込まれる。これらの研究は、タンパク質中に見出されず、遺伝的にコードされた２０個の共通アミノ酸中に見出される官能基の全てに対して化学的に不活性であり、並びに効率的及び選択的に反応して安定な共有結合を形成するために使用され得るケトン基、アルキン基及びアジド部分などの化学的官能基を選択的及び定型的に導入することが可能であることを示した。
遺伝的にコードされていないアミノ酸をタンパク質中に取り込ませる能力によって、リジンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの、天然に存在する官能基に対する価値ある代替物を提供することができる化学的官能基の導入が可能となる。ある種の化学的官能基は、遺伝的にコードされる２０の共通アミノ酸中に見出される官能基に対して不活性であるが、明瞭且つ効率的に反応して安定な結合を形成することが知られている。例えば、アジド及びアセチレン基は、銅の触媒量の存在下、水性条件中で、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応を行うことが本分野において公知である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈａｍ．６７：３０５７−３０６４；ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１ ：２５９６−２５９９」を参照されたい。タンパク質構造中にアジド部分を導入することによって、例えば、タンパク質中に見出されるアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑且つ効率的に反応して環化付加産物を形成する官能基を取り込ませることが可能である。重要なことに、アセチレン部分の不存在下では、アジドは、他のタンパク質側鎖の存在下及び生理的条件下において、化学的に不活性で、非反応性のままである。
本発明は、とりわけ、インターフェロンポリペプチドの活性及び産生に伴う問題に対処し、並びに改善された生物学的又は薬理学的特性（改善された治療的半減期及び／又は１つ若しくはそれ以上の生物学的活性の調節など）又は現行のＩＦＮ治療薬に見出される副作用を有するインターフェロンポリペプチドの産生にも対処する。
発明の簡単な要約
本発明は、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを提供する。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも１つのさらなるｈＩＦＮポリペプチドに連結されている。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、リンカーによって水溶性ポリマーに連結され、又は水溶性ポリマーに結合される。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は二官能性ポリマーである。幾つかの実施形態において、二官能性ポリマーは、第二のポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、第二のポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドである。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸置換を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸は、天然にコードされていないアミノ酸である。
幾つかの実施形態において、以下のように、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮ中の二次構造に対応する以下の領域の１つ又はそれ以上中の任意の位置に取り込まれる。１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（Ｄ及びＥへリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅへリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）（配列番号２又は配列番号１、３、他のインターフェロン又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン中の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮの以下の位置：（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸など）の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシ末端）の１つ又はそれ以上において（但し、これらに限定されない。）置換される。幾つかの実施形態において、一つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮ中の以下の位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２、又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に取り込まれる。幾つかの実施形態において、１つ又は以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮ中の以下の位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に取り込まれる。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３４、７８、１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３又は他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）など（但し、これらに限定されない。）、これら又はその他の位置の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、カルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１、３中の対応するアミノ酸）など（但し、これらに限定されない。）、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸が、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、以下の位置：３４、７８、１０７（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、以下のアミノ酸位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸へ、ＩＦＮポリペプチドへ連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、以下のアミノ酸位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、ＩＦＮポリペプチドへ連結される。幾つかの実施形態において、位置：３４、７８、１０７（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸が、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、アンタゴニストを与える以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された予定の部位及び所望される活性に応じて、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして、作用し得る可能性がある。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７又はこれらの何れかの組み合わせ（ｈＩＦＮ；配列番号２又は配列番号１若しくは３、若しくは他の任意のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）に１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸置換を有するｈＩＦＮポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２又は配列番号１若しくは３又は他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸のように）ｈＩＦＮの以下の位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４の１つ又はそれ以上において置換されるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はｈＩＦＮの位置３８（配列番号２又は配列番号１若しくは３又は他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）において置換される。幾つかの実施形態において、位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４など（但し、これらに限定されない。）（配列番号２又は配列番号１若しくは３又は他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）を含む、これら又は他の位置の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の以下の位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシル末端）の１つ又はそれ以上（但し、これらに限定されない。）において置換され、及び１つ又はそれ以上の天然のアミノ酸置換。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸はＰＥＧに連結されている。一実施形態において、天然のアミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｙである。幾つかの実施形態において、天然のアミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｅである。幾つかの実施形態において、天然のアミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｓである。一実施形態において、非天然アミノ酸置換は位置１０７であり、天然のアミノ酸置換はＲ１４９Ｙである。一実施形態において、非天然アミノ酸置換は位置１０６であり、天然のアミノ酸置換はＲ１４９Ｙである。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされているアミノ酸の置換は、ｈＩＦＮ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の以下の位置：１０、１６、１３、７９、８３、８５、８６、８７、９０、９１、９３、９４、９６、１２０、１２１、１２４、１２５、１２８、１４９など（但し、これらに限定されない。）の１つ又はそれ以上に位置する。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸の置換は、以下の置換（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上：Ｇ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓなど（但し、これらに限定されない。）である。幾つかの実施形態において、天然のアミノ酸置換は、位置１（Ｎ末端）に位置する。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮ（配列番号２中の、又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の以下の位置：１０７、７８、３４の１つ又はそれ以上において置換される。幾つかの実施形態において、これらの位置：１０７、７８、３４の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている。
リミチン配列中に見出される１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ｈＩＦＮポリペプチド中に置換され得る（ハイブリッドリミチン／ｈＩＦＮポリペプチド）。例には、前パラグラフに記載されている天然アミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、インターフェロンポリペプチド中に見出されるアミノ酸の組は、リミチン配列中に見出されるアミノ酸の組によって置換され得る。アミノ酸の組は、連続するアミノ酸又は分子の異なる部分に存在するアミノ酸を含み得るが、ポリペプチドの構造的な特徴若しくは生物学的活性に関与するものである。マウスリミチン分子は、他のＩＦＮαタンパク質に比べて、改善されたＣＦＵ−ＧＭ毒性プロファイルを有する。ヒトＩＦＮα−２ａをリミチンタンパク質配列と並置することによって、３０％のアミノ酸同一性が示された。５０％の配列保存も観察された。特に、Ｃ及びＤヘリックス間のリミチン配列中（Ｃ及びＤヘリックス間のループ中）に顕著な欠失が観察された。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）中に以下の置換を有する「ＨＶ」変異体が作製された。すなわち、Ｄ７７−Ｄ９４が、マウスリミチン配列ＨＥＲＡＬＤＱＬＬＳＳＬＷＲＥＬＱＶと置換されている。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）中に以下の置換を有する「ＣＤ」変異体が作製された。すなわち、Ｖ１０５−Ｄ１１４が、ＧＱＳＡＰＬＰと置換されている。リミチン由来のループ領域がヒトＩＦＮα−２ａタンパク質に置換されたこのハイブリッド分子（「ＣＤ」変異体）は、ＷＨＯＩＦＮ標準として、均等な抗ウイルス活性を有することが見出された。１つ又はそれ以上のアミノ酸に加えて、ｈＩＦＮポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドの何れかの１つ又はそれ以上の位置に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結され得、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーに直接結合され得る。ＨＶ又はＣＤ変異体中の天然のアミノ酸置換に加えて、１つ又はそれ以上のさらなる天然のアミノ酸置換がｈＩＦＮポリペプチド中に見出され得る。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結された、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結された、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び１つ又はそれ以上の天然にコードされているアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結された、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換Ｇ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓの１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、１０７及び１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、１０７及び１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、並びに以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、並びに以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、並びに以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結又は結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４、１５８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４、１５８（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結又は結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結又は結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５又はこれらの何れかの組み合わせ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された部位及び所望される活性に応じて、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして、作用し得る可能性がある。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７又はこれらの何れかの組み合わせ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）に１つ又はそれ以上の置換を有するものが含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ又は以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸のように）ｈＩＦＮの以下の位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４の１つ又はそれ以上において置換されるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はｈＩＦＮの位置３８（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）において置換される。幾つかの実施形態において、位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４など（但し、これらに限定されない。）を含む、これら又は他の位置の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸及び天然にコードされているアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されており、ｈＩＦＮポリペプチドは１つ又はそれ以上の天然にコードされているアミノ酸置換を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドはｈＩＦＮポリペプチド受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの安定性と比べて、ｈＩＦＮポリペプチド受容体の安定性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの免疫原性と比べて、ｈＩＦＮポリペプチドの免疫原性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの血清半減期または循環時間と比べて、ｈＩＦＮポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する置換、付加又は欠失を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮのｈＩＦＮポリペプチド受容体立体構造と比べて、ｈＩＦＮポリペプチド受容体立体構造を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮのｈＩＦＮポリペプチド受容体の下流シグナル伝達現象と比べて、ｈＩＦＮポリペプチド受容体の１つ又はそれ以上の下流シグナル伝達現象を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮのｈＩＦＮポリペプチド受容体結合速度論と比べて、ｈＩＦＮポリペプチド受容体結合速度論を調節する置換、付加又は欠失を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの水性溶解度と比べて、ｈＩＦＮポリペプチドの水性溶解度を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの溶解度と比べて、宿主細胞中で産生されたｈＩＦＮポリペプチドの溶解度を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの発現又は合成と比べて、宿主細胞中でのｈＩＦＮポリペプチドの発現又はインビトロでの合成を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮのプロテアーゼ耐性と比べて、ｈＩＦＮポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、受容体のオピオイドファミリーの１つ又はそれ以上のメンバーとの相互作用を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、５−ＨＴ脳神経伝達を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の誘導を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、現行のＩＦＮ治療薬に見出される副作用など（但し、これらに限定されない。）、ＩＦＮの生物学的活性の１つ又はそれ以上を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加又は欠失を持たない対応するｈＩＦＮの毒性と比べて、調節された毒性を有する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、ＩＦＮに見出される１つ又はそれ以上の副作用を調節する水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含み、調節された毒性を有する。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を持たない対応するｈＩＦＮの抗ウイルス活性と比べて、調節された抗ウイルス活性を有する置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を持たない対応するｈＩＦＮの免疫原性と比べて、調節された免疫原性を有する置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を持たない対応するｈＩＦＮの抗腫瘍活性と比べて、調節された抗腫瘍活性を有する置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を持たない対応するｈＩＦＮの抗感染活性と比べて、調節された抗感染活性を有する置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を持たない対応するｈＩＦＮの感染性因子に対する予防活性と比べた場合に、感染性因子に対する調節された予防活性を有する、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を持たない対応するｈＩＦＮの腫瘍予防活性と比べて、調節された腫瘍予防活性を有する置換、付加、欠失又は天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を使用し得るが、但し、少なくとも１つの置換は、天然にコードされていないアミノ酸を使用する。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸残基は、アジド基を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、アルキン基を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストである。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、天然にコードされていないアミノ酸と、及び１つ又はそれ以上の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子とを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮポリペプチドの部位ＩＩ領域（ＡＣヘリックス−バンドルフェース、ヘリックスＡのアミノ末端領域とヘリックスＣの一部を包含するタンパク質の領域）内に存在する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドアンタゴニストが、第二のｈＩＦＮポリペプチド受容体分子に結合できないようにすることによって、ｈＩＦＮポリペプチド受容体の二量体化を妨げる。
本発明は、配列番号２１又は２２に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含む、単離された核酸も提供する。幾つかの実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オクレコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、五塩基コドン及び四塩基コドンからなる群から選択される。
本発明は、水溶性ポリマーに連結されたｈＩＦＮポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたｈＩＦＮポリペプチドを、天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性リンカーと接触させることを含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない水溶性ポリマーに対して反応性を示す。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性を示す。
幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されたｈＩＦＮポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基は、アミド結合を通じて、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されたｈＩＦＮポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される。
幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されたｈＩＦＮポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、アジド部分を含むポリ（エチレン）グリコール分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されたｈＩＦＮポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、アルキン部分を含むポリ（エチレン）グリコール分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１と約１００ｋＤａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は分岐したポリマーである。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分岐ポリマーの各分岐は、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、又は１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドに連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジドン、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基はカルボニル部分を含み、水溶性ポリマーはアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基はアルキン部分を含み、水溶性ポリマーはアジド部分を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基はアジド部分を含み、水溶性ポリマーはアルキン部分を含む。
本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドと、及び医薬として許容される担体とを含む組成物も提供する。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。
本発明は、セレクターコドンを含むｈＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。幾つかの実施形態において、細胞は、天然にコードされていないアミノ酸を、ｈＩＦＮポリペプチド中に置換するために、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む。
本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、ｈＩＦＮポリペプチドの発現を許容する条件下で、ｈＩＦＮポリペプチドをコードする１又はそれ以上のポリヌクレオチド、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を培養すること、並びに細胞及び／又は培地からｈＩＦＮポリペプチドを精製することを含む。
本発明は、ｈＩＦＮポリペプチドの治療的半減期、血清半減期又は循環時間を増加させる方法も提供する。本発明は、ｈＩＦＮポリペプチドの免疫原性を調節する方法も提供する。本発明は、ｈＩＦＮポリペプチドの毒性を調節する方法も提供する。本発明は、現行のＩＦＮ治療の副作用を調節する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然に存在するｈＩＦＮポリペプチド中の１つ又はそれ以上の何れかのアミノ酸を、天然にコードされていないアミノ酸と置換することと、及び／又はｈＩＦＮポリペプチドをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子に連結することとを含む。
本発明は、本発明のｈＩＦＮ分子の有効量を用いて、このような治療を必要としている患者を治療する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドと、及び医薬として許容される担体とを含む医薬的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。
本発明は、少なくとも一つのアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸によって置換されていることを除き、配列番号１、２、３又は何れかの他のｈＩＦＮポリペプチド配列又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン中に示されている配列を含むｈＩＦＮポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
本発明は、医薬として許容される担体と、及び配列番号１、２、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド配列又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン中に示されている配列を含むｈＩＦＮポリペプチドとを含み、少なくとも一つのアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸によって置換されている、医薬組成物も提供する。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、糖質部分を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、糖質部分を介して、ポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、リンカー、ポリマー又は生物活性分子は、糖質部分を介して、ｈＩＦＮポリペプチドに連結されている。
本発明は、共有結合によって、ｈＩＦＮポリペプチドの単一のアミノ酸に連結された水溶性ポリマーを含むｈＩＦＮポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸は、ポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸である。
本発明は、少なくとも一つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー、又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸の官能基を通じて前記ポリペプチドに付着されている、ｈＩＦＮポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、モノＰＥＧ化されている。本発明は、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸に結合された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記天然にコードされていないアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボソームによって取り込まれる、ｈＩＦＮポリペプチドも提供する。
別の実施形態において、１つ又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、別の分子（ＰＥＧを含むが、これに限定されない。）に結合させることによって、非天然アミノ酸への結合のために使用された一意的な化学的反応のために、実質的に精製されたｈＩＦＮが得られる。１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮの、別の分子（ＰＥＧなど）への結合は、実質的に純粋なｈＩＦＮを提供するための結合工程の前又は後に行われる他の精製技術とともに行ってもよい。
定義
本発明は、本明細書に記載されている具体的な方法、プロトコール、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、従って、変化し得ることを理解しなければならない。本明細書で使用されている用語は、具体的な実施形態を記載するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定する意図ではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解しなければならない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。従って、例えば、「ｈＩＦＮ」という表記は、１つ又はそれ以上のこのようなタンパク質を表し、当業者に公知のこれらの均等物などを含む。
別段の定義がなければ、本明細書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本発明の実施又は検査においては、あらゆる方法、装置及び本明細書に記載されているものと類似又は均等な材料を使用可能であるが、ここでは、好ましい方法、装置及び材料が記載されている。
本明細書に挙げられている全ての公報及び特許は、例えば、刊行物中に記載された、本明細書に記載されている発明に関連して使用され得る構築物及び方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に論述されている刊行物は、専ら、本願の出願日より前の開示である理由のみにより提供される。先の発明に基づいて又は何らかの理由により、本発明者らがこのような開示の日付に先行する権利を有しないことを認めるものと何も解釈されるべきではない。
「実質的に精製された」という用語は、それが天然に存在する環境中、すなわち、野生型細胞で又は組換え的に産生されたｈＩＦＮの場合には宿主細胞中で通常ｈＩＦＮに伴い、又はｈＩＦＮと相互作用する成分を実質的に又は本質的に含み得ないｈＩＦＮを表す。細胞物質を実質的に含まないことができるｈＩＦＮポリペプチドには、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（乾燥重量に対して）の莢雑タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。ｈＩＦＮポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％又はそれ以下で存在し得る。ｈＩＦＮポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ又はそれ以下で、培地中に存在し得る。従って、本発明の方法によって作製された「実質的に精製された」ｈＩＦＮポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって測定された場合に、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％又はそれ以上の純度レベルを有し得る。
「組換え宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、挿入のために使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）又は組換え宿主細胞を作製するための本分野で公知の他の方法にかかわらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を表す。外来ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター、例えば、プラスミドとして維持されることができ、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
本明細書中で使用する場合、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、Ｅ．コリ又はシュードモナス宿主細胞及び細胞含有物を含む何らかの宿主細胞を支持し得るか、又は含有し得る、あらゆる培養用培地、溶液、固体、半固体又は強固な支持体を含む。従って、本用語は、宿主細胞をその中で増殖させている培地、例えば、ｈＩＦＮポリペプチドがその中に分泌されている培地（増殖工程前又は後の培地を含む。）などを包含し得る。本用語は、ｈＩＦＮポリペプチドが細胞内で産生され、ｈＩＦＮポリペプチドを放出するために宿主細胞が溶解又は破壊される場合など、宿主細胞可溶化液を含有する緩衝液又は試薬も包含し得る。
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「還元剤」は、スルフヒドリル基を還元状態に保ち、分子内又は分子間ジスルフィド結合を還元する全ての化合物又は物質として定義される。適切な還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン、（２−アミノエタンチオール）及び還元されたグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。様々な還元剤が本発明の方法及び組成物における使用に適していることが、当業者に自明である。
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる全ての化合物又は物質として定義される。適切な酸化剤には、酸化されたグルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化されたジチオスレイトール、酸化されたエリスリトール及び酸素が含まれるが、これらに限定されない。様々な酸化剤が本発明の方法における使用に適していることが、当業者に自明である。
「変性剤」又は「変性試薬」とは、本明細書中で使用する場合、タンパク質の可逆的な折り畳み解除を引き起こす、あらゆる化合物又は物質として定義される。変性剤又は変性試薬の強度は、具体的な変性剤又は変性試薬の特性及び濃度の両方によって決定され得る。適切な変性剤又は変性試薬は、カオトロプ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質又は２つ若しくはそれ以上のこのような薬剤の組み合わせであり得る。適切なカオトロプには、尿素、グアニジン及びチオシアン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。有用な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム、又はポリオキシエチレンエーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどの強い界面活性剤、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−２，３−（ジオレイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどの穏やかな陽イオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム）、又はスルホベテイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルファート（ＣＨＡＰＳ）及び３−（３−クルルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）を含む（これらに限定されない。）双性イオン界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノール又はイソプロパノールなどのＣ２−Ｃ４アルカノール）、又は（低級アルカンジオール（特に、エチレングリコールなどのＣ２−Ｃ４アルカンジオール）などの水混和性有機溶媒は、界面活性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールなどの天然リン脂質又は合成リン脂質誘導体又はジヘキサノイルホスファチジルコリン若しくはジヘプタノイルホスファチジルコリンなどの合成リン脂質誘導体若しくはバリアントであり得る。
本明細書に使用される「再折り畳み」は、ポリペプチドを含有するジスルフィド結合を、不適切に折りたたまれ、又は折り畳み解除された状態から、ジスルフィド結合に関して固有の高次構造又は適切に折りたたまれた高次構造へと転換する任意のプロセス、反応又は方法を記載する。
本明細書において使用される「同時折り畳み」とは、互いに相互作用して、折り畳み解除されたポリペプチド又は不適切に折り畳まれたポリペプチドを、適切に折り畳まれた固有のポリペプチドに変換させる少なくとも２つのポリペプチドを使用する再折り畳みプロセス、反応又は方法を具体的に表す。
本明細書において使用される「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」には、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、ＩＦＮε若しくはＩＦＮτ又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン（米国特許第４，４１４，１５０号；同第４，４５６，７４８号；同第４，７２７，１３８号；同第４，７６２，７９１号、同第４，９２９，５５４号；同第５，０９６，７０５号；同第４，６９５，６２３号；同第４，６１４，６５１号；同第４，６７８，７５１号；同第４，９２５，７９３号；同第５，４６０，８１１号；同第５，１２０，８３２号；同第４，７８０，５３０号；同第４，９０８，４３２号；同第４，９７０，１６１号；同第４，９７３，４７９号；同第４，９７５，２７６号；同第５，０９８，７０３号；同第５，２７８，２８６号；同第５，６６１，００９号；同第６，３７２，２０６号；同第６，４３３，１４４号；同第６，４７２，５１２号；同第６，５７２，８５３号；同第６，７０３，２２５号；同第６，２００，７８０号；同第６，２９９，８６９号；同第６，３００，４７５号；同第６，３２３，００６号；同第６，３５０，５８９号；同第５，７０５，３６３号；同第５，７３８，８４５号；同第５，７８９，５５１号；同第６，１１７，４２３号；同第６，１７４，９９６号；同第５，５４０，９２３号；同第５，５４１，２９３号；同第５，５４１，３１２号；同第５，５５４，５１３号；同第５，５９３，６６７（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなど）並びに、その生物活性に関わらず、及び組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から作製されるかどうかを問わない。）、インビトロ、インビボ、核酸分子のマイクロインジェクション、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法に関わらず、ＩＦＮ類縁体、ＩＦＮイソフォーム、ＩＦＮ模倣体、ＩＦＮ断片、ハイブリッドＩＦＮタンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント、バリアント、スプライスバリアント及び変異タンパク質など（但し、これらに限定されない。）、インターフェロンの少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチド及びタンパク質が含まれるものとする。ＩＦＮの具体例には、ＩＦＮγ−１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ））、ＩＦＮβ−ｌａ（Ａｖｏｎｅｘ（Ｒ）及びＲｅｂｉｆ（Ｒ））、ＩＦＮβ−ｌｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ））、コンセンサスＩＦＮ、ＩＦＮａｌｆａｃｏｎ−１（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（Ｒ））、ＩＦＮα−２（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ））、ＩＦＮα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ））、Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ））、Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ））、ＩＦＮ類縁体、ＩＦＮ変異体、変化を受けたグリコシル化されたヒトＩＦＮ及びＰＥＧ結合されたＩＦＮ類縁体が含まれるが、これらに限定されない。内在性ヒトＩＦＮの発現のために修飾された細胞の具体例は、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４１ ：３０６（１９８７）；米国特許第６，６１０，８３０号；同第６，４８２，６１３号；同第６，４８９，１４４号；同第６，１５９，７１２号；同第５，８１４，４８５号；同第５，７１０，０２７号；同第５，５９５，８８８号；同第４，９６６，８４３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ＧＨファミリーメンバーの発現については、米国特許第６，７１６，６０６号、同第６，３７９，６６１号；同第６，００４，５４８号；同第５，８３０，７０５号；同第５，５８２，８２３号；同第４，８１０，６４３号；及び同第６，２４２，２１８号（参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照されたい。
「ヒトＩＦＮ（ｈＩＦＮ）」又は「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語は、上記インターフェロン又はＩＦＮ及び天然に存在するｈＩＦＮの少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。「ｈＩＦＮポリペプチド」又は「ｈＩＦＮ」という用語には、天然に存在するヒトＩＦＮの、医薬として許容される塩及びプロドラッグ、及び前記塩のプロドラッグ、多形、水和物、溶媒和物、生物学的に活性な断片、生物学的に活性なバリアント及び立体異性体並びに天然に存在するヒトＩＦＮのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそのポリペプチド融合物も含まれる。ｈＩＦＮポリペプチドの例には、例えば、米国特許第４，６０４，２８４号；同第５，５８２，８２４号；同第６，５３１，１２２号；同第６，２０４，０２２号；同第６，１２０，７６２号；同第６，０４６，０３４号；同第６，０３６，９５６号；同第５，９３９，２８６号；同第５，９０８，６２６号；同第５，７８０，０２７号；同第５，７７０，１９１号；同第５，７２３，１２５号；同第５，５９４，１０７号；同第５，３７８，８２３号；同第４，８９８，９３１号；同第４，８９２，７４３（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ末端、カルボキシル末端又は両方に追加のアミノ酸を含む融合物は、「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語によって包含される。典型的な融合物には、例えば、分泌シグナルペプチドを欠如するｈＩＦＮの成熟形態又はその一部の組換え発現から得られたｈＩＦＮのＮ末端にメチオニンが連結されたメチオニルＩＦＮ、精製のための融合物（ポリヒスチジン又はアフィニティーエピトープが含まれるが、これらに限定されない。）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合物が含まれるが、これらに限定されない。「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語には、リミチン又はその他のインターフェロン様サイトカインから得られる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するハイブリッド分子も含まれる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，３７３号は、成長ホルモン及びそれらの各受容体分子に対する変化した結合特性を有する抗体断片バリアントなどの新規タンパク質を選択するための方法を記載している。本方法は、線状ファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のカルボキシ末端ドメインに、目的のタンパク質をコードする遺伝子を融合することを含む。完全長及び成熟形態に対する天然に存在するｈＩＦＮ核酸及びアミノ酸配列は、単一アミノ酸バリアント又はスプライスバリアントなどのバリアントとして知られている。
コンセンサスインターフェロンは、１６６個のアミノ酸を含有する組換え１型インターフェロンである。コンセンサスＩＦＮは、幾つかの天然αインターフェロンの配列を走査し、各対応する位置において最も頻繁に観察されたアミノ酸を割り当てることによって得られた。コンセンサスＩＦＮは、インビトロアッセイにおいて、等しい質量を基礎として、ＩＦＮα−２ａ及びα―２ｂと比較すると、通例、５から１０倍高い生物活性を示す（Ｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９９６； １６：４８９−９９）。
修飾されたｈＩＦＮポリペプチドは、異なるインターフェロン分子に見出される１つ又はそれ以上の特性又は生物学的活性を示し得る。例えば、ＩＦＮα−２ａアミノ酸配列から作製され、及びＰＥＧ化されていない、又はＰＥＧ化された１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、ＩＦＮβに見出される１つ又はそれ以上の生物活性を示し得る。１つのこのような活性は抗増殖活性であり得る。
完全な完全長の天然に存在するＩＦＮα−２ａアミノ酸配列並びに成熟した天然に存在するＩＦＮα−２ａアミノ酸配列については、それぞれ、本明細書の配列番号１及び配列番号２を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３と、又はインターフェロンポリペプチド又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカインの他の何れかの配列と実質的に同一である。ｈＩＦＮ変異体及び変異体ｈＩＦＮポリペプチドをコードする核酸分子は周知であり、米国特許第６，３３１，５２５号；第６，０６９，１３３号；第５，９５５，３０７号；第５，８６９，２９３号；第５，８３１，０６２号；第５，０８１，０２２号；第５，００４，６８９号；第４，７３８，９３１号；第４，６８６，１９１号（参照により、明細書中に組み込まれる。）に開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。ｈＩＦＮ変異体の例には、米国特許第６，５１４，７２９号及び同第５，５８２，８２４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
インターフェロンは、抗ウイルス、免疫制御及び抗増殖特性などの様々な生物活性を有しており、癌及び様々なウイルス疾患などの疾患の治療のための治療剤として使用される。インターフェロンαは、細胞増殖の様々な種類を阻害することが示されており、癌、特に、白血病などの血液の悪性腫瘍を頻繁に伴う様々な細胞増殖疾患の治療に特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌腫、膀胱癌及び卵巣癌に対して抗増殖活性を示した（Ｂｏｎｎｅｍ， Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ３：５８０； Ｏｌｄｈａｍ， Ｒ．Ｋ．（１９８５） Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０：７１）。
ＩＦＮαは、ウイルス感染の様々な種類に対して有用である（Ｆｉｎｔｅｒ， Ｎ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｄｒｕｇｓ ４２（５）：７４９）インターフェロンαは、ヒト乳頭腫ウイルス感染、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染に対して活性を示している（Ｆｉｎｔｅｒ， Ｎ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．， １９９１， 上記； Ｋａｓｈｉｍａ， Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ ９８：３３４； Ｄｕｓｈｅｉｋｏ， Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３（Ｓｕｐｐｌｅ．２）：Ｓ１９９； Ｄａｖｉｓ， Ｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３２１ ：１５０１）。ある種の自己免疫疾患及び炎症性疾患の発病におけるインターフェロン及びインターフェロン受容体の役割も調査されている（Ｂｅｎｏｉｔ， Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（３）：７０７）。さらに、インターフェロンαは、有毛細胞白血病、腎臓細胞癌腫、基底細胞癌腫、悪性黒色腫、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、尖形コンジローマ、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性Ｄ型肝炎及び慢性非Ａ非Ｂ／Ｃ型肝炎などの疾病の治療に使用するために承認を受けている。
インターフェロンは、全身性紅斑性狼瘡、ベーチェット病及びインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ，Ｉ型糖尿病とも称される）などの様々な自己免疫疾患の発病に関与していると推定される。ＩＦＮ−αのβ細胞発現が膵島炎及びＩＤＤＭを引き起こし得ることがトランスジェニックマウスモデルで実証されており、及びＩＤＤＭの治療のためにＩＦＮ−αアンタゴニスト（抗体を含む。）が提唱されている（ＷＯ９３／０４６９９、１９９３年３月１８日に公開）損なわれたＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−α産生が、多発性硬化症（ＭＳ）患者において観察されている。多くのＡＩＤＳ患者の血清中に、ＩＦＮ−αが検出されており、ＡＩＤＳ患者由来の分裂促進因子で刺激された単核細胞の懸濁液中で、ＩＦＮ−γの産生が大幅に抑制されていることが報告されている。概説として、例えば、「Ｃｈａｐｔｅｒ １６， “Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， Ｅｄｗａｒｄ ｄｅ Ｍａｅｙｅｒ（１９８８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）」を参照されたい。α及びβインターフェロンが、急性ウイルス性疾患である帯状疱疹において使用されてきた（Ｔ．Ｃ．Ｍｅｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９８， ９８１−９８７（１９７８）； Ｅ．Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ７， ２１０−２１２（１９８４））、慢性ウイルス感染症、例えば、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎感染症（Ｒ．Ｌ．Ｋｎｏｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４（１０）：１２７３−９（１９８４）； Ｍ．Ａ．Ｆａｅｒｋｋｉｌａｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔ，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．６９， １８４−１８５（１９８５））の治療において使用されてきた。ｒＩＦＮα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ（Ｒ）、Ｒｏｃｈｅ）は、有毛白血球及びＡＩＤＳ関連カポジ肉腫の治療のための使用を適応症とする注射製剤である。組換えＩＦＮα−２ｂ（ＩｎｔｒｏｎＡ（Ｒ）、Ｓｈｅｒｉｎｇ）は、有毛細胞白血病、尖形コンジローマの選択された症例、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、慢性Ｃ型肝炎及びある種の患者における慢性Ｂ型肝炎感染症の治療に対して承認を受けている。様々な疾病を治療するためにＩＦＮαの複数のサブタイプの組成物も使用されている（Ｍｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（Ｒ）， Ｖｉｒａｇｅｎ．Ｉｎｃ．）。ＩＦＮγ１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ） Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｉｎｃ．）は、慢性肉芽腫疾患及び悪性骨粗鬆症の治療に対して市販されている。
Ｉ型ＩＦＮの生物活性は開示されており、本分野において公知であり、例えば、Ｐｆｅｆｆｅｒ， Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（ｓｕｐｐｌ ９），Ｓ９−６３−Ｓ９−６９（１９９７）及び米国特許第６，４３６，３９１号；同第６，３７２，２１８号；同第６，２７０，７５６号；同第６，２０７，１４５号；同第６，０８６，８６９号；同第６，０３６，９４９号；同第６，０１３，２５３号；同第６，００７，８０５号；同第５，９８０，８８４号；同第５，９５８，４０２号；同第５，８６３，５３０号；同第５，８４９，２８２号；同第５，８４６，５２６号；同第５，８３０，４５６号；同第５，８２４，３００号；同第５，８１７，３０７号；同第５，７８０，０２１号；同第５，６２４，８９５号；同第５，４８０，６４０号；同第５，２６８，１６９号；同第５，２０８，０１９号；同第５，１９６，１９１号；同第５，１９０，７５１号；同第５，１０４，６５３号；同第５，０１９，３８２号；同第４，９５９，２１０号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出すことが可能である。関連出願は、２００５年１０月６日に、ＵＳ２００５／０２２０７６２号として公開され、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願（参照により、本明細書に組み込まれる。）である。
ＩＦＮαは、サイトカイン遺伝子の多様なヘリックス−バンドルスーパーファミリーのメンバーである（Ｓｐｒａｎｇ， Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８１５−８２７）。ヒトインターフェロンαは、アミノ酸レベルで８５から９８％の配列同一性を有する、直列に重複した２０を超える非対立遺伝子のファミリーによってコードされている（Ｈｅｎｃｏ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８５：２２７−２６０）。ヒトＩＦＮβは、１６６個のアミノ酸残基からなる約２２ｋＤａの分子量を有する制御ポリペプチドである。ヒトＩＦＮβは、ウイルス感染又は他の因子への曝露に応答して、体内の多くの細胞中で、特に繊維芽細胞中で産生され得る。ＩＦＮβは多量体の細胞表面受容体に結合し、産生的受容体結合は、細胞内現象のカスケードをもたらし、抗ウイルス、抗増殖及び免疫調節として分類することが可能な効果を順次生じるＩＦＮβ誘導性遺伝子の発現に至る。
ヒトＩＮＦβのアミノ酸配列は公知であり、例えば、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｇｅｎｅ １０：１１−１５， １９８０」、並びにＥＰ８３０６９、ＥＰ４１３１３及び米国特許第４，６８６，１９１号（参照により、本明細書に組み込まれる。）によって報告された。それぞれ、ヒト及びマウスＩＦＮβに対して結晶構造が報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１８１３−１１８１８， １９９７； Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５３：１８７−２０７， １９９５；米国特許第５，６０２，２３２号；同第５，４６０，９５６号；同第５，４４１，７３４号；同第４，６７２，１０８号；参照により、本明細書に組み込まれる。）。ヒト及びマウスＩＦＮβは、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５４：１２０３−１２０６， １９９８に概説されている。ＩＦＮβのバリアントが報告されている（ＷＯ ９５／２５１７０， 米国特許第６，５７２，８５３号、米国特許第５，５４５，７２３号、米国特許第４，９１４，０３３号、ＥＰ２６０３５０、米国特許第４，５８８，５８５号、米国特許第４，７６９，２３３号、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ， ＤＮＡ Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．２ １９８７ ｐｐ．１１９−１２８，Ｒｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３， Ｎｏ．１４， ｐｐ．８００３−８００８（参照により、本明細書に組み込まれている。）。ＣＨＯ細胞中でのＩＦＮβの発現が報告されている（米国特許第４，９６６，８４３号、米国特許第５，３７６，５６７号及び米国特許第５，７９５，７７９号、参照により、本明細書に組み込まれる。）。特定のグリコシル化パターンを有するＩＦＮβ分子及びそれらの調製方法が報告されている（ＥＰ２８７０７５及びＥＰ５２９３００）。
ＩＦＮβの市販調製物は、多発性硬化症を有する患者の治療のために、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ）（インターフェロンβ１ｂとも称され、これは、グリコシル化されておらず、組換え細菌細胞を用いて産生され、Ｎ末端メチオニン残基及びＣ１７Ｓ変異の欠失を有する。）並びにＡｖｏｎｅｘ（Ｒ）及びＲｅｂｉｆ（Ｒ）（インターフェロンβ１ａとも称され、これは、グリコシル化されており、組換え哺乳類細胞を用いて産生される。）の名称で販売されており、悪化率を低減させる上で有効であることが示されており、プラセボ処理された患者と比べて、より多くの患者が、長期間にわたって、悪化しない状態を保つ。さらに、身体障害の蓄積率が減少する（Ｎｅｕｒｏｌ．５１ ：６８２−６８９， １９９８）。
構造及び機能に関するＩＦＮβＩａ及びβ１ｂの比較は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．１５：６４１−６４９，１９９８」に記載されている。ＩＦＮβは、多発性硬化症（再発後、進行する中枢神経系の炎症性変性疾患）の進行を遅延させることが示されている。ＩＦＮβは、白血球の増殖及び抗原提示に対して阻害的効果を有し得る。ＩＦＮβは、抗炎症性表現型に対してサイトカイン産生のプロファイルを調節し得る。ＩＦＮβは、Ｔ細胞マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することによってＴ細胞の遊走を低下させることが可能である。これらの活性は、ＭＳ中でのＩＦＮβの機序を共同で説明するものと思われる（Ｎｅｕｒｏｌ．５１ ：６８２−６８９， １９９８）。
ＩＦＮβは、骨肉腫、基底細胞癌、子宮頸部形成異常、膠細胞腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、乳癌、黒色腫並びに乳頭腫ウイルス、ウイルス性肝炎、性器ヘルペス、帯状疱疹、ヘルペス性角膜炎、単純ヘルペス、ウイルス性脳炎、サイトメガロウイルス肺炎及びライノウイルスなどのウイルス性感染症の治療のために使用され得る。注射部位反応、発熱、寒気、筋肉痛、関節痛及びその他のインフルエンザ様症候など、ＩＦＮβの現行の調製物の使用には、様々な副作用が伴う（Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １９：８８３−８９３，１９９７）。
現行のＩＦＮβ製品に伴う多くの副作用、ＩＦＮβ製品に伴う頻繁な注射、ＩＦＮβの所望される治療効果を妨げる中和抗体が生じるリスク及び増強された治療効果を伴う、より最適な治療的ＩＦＮβレベルが得られる可能性に鑑みれば、改善されたＩＦＮβ様分子に対する必要性が明らかに存在する。
インターフェロン治療を受けている患者に見出されるさらなる副作用には、疲労、頭痛及び発熱、拒食症、骨髄抑制及び好中球減少症などのインフルエンザ様症候が含まれる。これらなどの副作用は、治療の停止又は投薬量の低下を必要とし得る。「Ｊｏｎａｓｃｈ， Ｅ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００１； ６：３４−５５」（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。ＩＦＮα２ａ療法は、血小板減少症を含む他の随伴された毒性を有する。ＩＦＮαの現行療法の最も一般的な副作用には、発熱、頭痛、悪寒及び筋肉痛がある。用量低下をもたらす副作用は、最も一般に、貧血及び好中球減少症など、骨髄抑制の血液学的帰結である。ＩＦＮの有害な効果は、ＩＦＮ／リバビリンの併用療法においてさえ問題となる。ＰＥＧ化されたインターフェロンα（ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）又はＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ））とＲｉｂａｖｉｒｉｎ（Ｃｏｐｅｇｕｓ（Ｒ））の併用は、ＨＣＶ療法における現行の治療の標準である。さらに、ＨＣＶ遺伝子型１（１ａ又は１ｂ）を有する患者は、ＨＣＶ遺伝子型２又は３より、併用療法に応答する可能性がずっと低いことが示されている。また、これらの併用治療計画は、高いウイルス量を有する患者では、著しく有効性が劣ることが明らかとなっている。従って、改善されたＩＦＮ様治療薬に対する必要性が明らかに存在する。
他のインターフェロン（ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−τ）及び４つのインターフェロン様サイトカイン（リミチン、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９）が記載されている。インターフェロン及びインターフェロン様分子の、受容体分子との相互作用並びにそれらの生物学的活性及び臨床適用は、Ｐｅｓｔｋａ， Ｓ．らによって、「“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ， ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｌｉｋｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００４ Ｄｅｃ；２０２：８−３２」（参照により、本明細書に組み込まれる。）記載されている。Ｉ型受容体鎖ＩＦＮαＲ１及びＩＦＮαＲ２は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びリミチンを含む多数のインターフェロンによって使用されている。ＩＦＮαＲ１の遺伝子コード配列は、最初、「Ｕｚｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９０； ６０：２２５」（参照により、本明細書に組み込まれる。）によってクローニングされた。ＩＦＮαＲ１は１００ｋＤａタンパク質であるのに対して、ＩＦＮαＲ２は２つの異なる形態で存在する。ＩＦＮαＲ２の２つの形態は、同一の遺伝子から得られ、異なってスプライシングされた産物として生じる（Ｌｕｔｆａｌｌａ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９５； １４：５１００； Ｄｏｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５； ２７０：２１６０６； ａｎｄ Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９４； ７７：３９１、参照により、本明細書に組み込まれる。）。短い形態（ＩＦＮＡＲ２ｂ）は、５１ｋＤａの分子量を有し、長い形態（ＩＦＮＡＲ２ｃ）は９０から１００ｋＤａである。従って、受容体複合体の２つの形態が存在し、ＩＦＮαＲ１はＩＦＮＡ２ｂ又はＩＦＮＡＲ２ｃを伴う「Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４； ２６９：５６６０」（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、受容体の両種類は、シグナルを伝達し、インターフェロンの生物学的効果を媒介することを示した。ＩＦＮは、他の経路に加えて、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路を使用する。
リミチン（インターフェロン−ζ）は、マウスにおいてのみ見出されており、骨髄単球性白血球細胞株の増殖を阻害する能力に基づいて単離された（Ｏｒｉｔａｎｉ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０００ ６（６）：６５９−６６６、参照により、本明細書に組み込まれる。）。リミチン（配列番号２３）は、ある種のリンパ造血系細胞株（Ｂリンパ球産生）を死滅させ、又はその増殖を停止させることが知られているが、赤血球生成又は骨髄造血に対しては殆ど影響を与えないことが示されている。
１８２アミノ酸タンパク質の配列分析は、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βに対する相同性を示しており（１６６の重複するアミノ酸中で、３１．９％及び２５．９％同一）及びアミノ末端における残基の疎水性の群を示した。参照により組み込まれる「Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３ Ｓｅｐ；７７（１７）：９６２２−３１」は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって感染した細胞を用いたリミチンの抗ウイルス活性並びにマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）に感染した細胞中での斑形成の研究を記載している。
抗ウイルス効果のためのシグナル伝達経路の差、抗ウイルス効果自体の差及び骨髄抑制効果の差など（これらに限定されない。）、リミチンとＩＦＮαなどのインターフェロンとの差が論述されている。「Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３ Ｓｅｐ；７７（１７）：９６２２−３１」を参照のこと。「Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００４； ３２：７９７−８０５」（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、抗ウイルス、免疫調節、抗腫瘍及び骨髄抑制活性を測定するアッセイ並びにインビボ研究において、リミチン及びＩＦＮ−αの間に見出された差を記載している。リミチンは、骨髄毒性から抗ウイルス活性を分離させることが見出された。
１３の異なるαインターフェロンが、単一の対を成すα／β二鎖受容体複合体を通じて異なる信号を伝達する。同じ受容体複合体を通じて媒介された１つ又はそれ以上のシグナル伝達経路に関与する成分の調節は、ｈＩＦＮポリペプチドの抗ウイルス効果の最適化及び有毒な副作用の調節を与え得る。多数の分子が、下流のシグナル伝達経路に関与している。これらの分子のタンパク質発現を阻害したＣｒｋＬ及びＣｒｋＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｐｌａｔａｎｉａｓらによって使用され、骨髄細胞（ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅ）の増殖に対するＩＦＮα又はＩＦＮγの阻害を逆転させることが明らかとなった。ＩＦＮαは、ＳＴＡＴ１経路を活性化させることが知られており、ノックアウトマウス研究は、ウイルス感染と闘う上で、ＳＴＡＴ１シグナル伝達カスケードが重要であることを指摘する。Ｄｕｒｂｉｎら（Ｃｅｌｌ．１９９６ Ｆｅｂ ９；８４（３）：４４３−５０）は、ＳＴＡＴ１ノックアウトに対してホモ接合のマウスは、無菌環境で育てられなければ、自然発生的にウイルス感染症を発症することを示した。さらに、ＳＴＡＴ５及びＣｒｋＬを通じたシグナル伝達は、最終的に、増殖阻害的シグナルを生成するのに必要であり得るＲＡＰ１タンパク質の活性化をもたらす。ＳＴＡＴ３のリン酸化も、測定され得る。
様々な参考文献が、ポリマー結合又はグリコシル化によるポリペプチドの修飾を開示している。「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語には、ＰＥＧなどのポリマーに結合されたポリペプチドが含まれ、システイン、リジン又は他の残基の１つ又はそれ以上のさらなる誘導体化から構成され得る。さらに、ｈＩＦＮポリペプチドは、リンカー又はポリマーが接合されているアミノ酸が本発明の非天然アミノ酸であり得るか、又はリジン若しくはシステインへの結合など、本分野で公知の技術を用いて天然にコードされているアミノ酸へ結合され得るリンカー又はポリマーを含み得る。
固有のＩＦＮｐ又はそのＣ１７Ｓバリアントのポリマー修飾が報告されている（ＥＰ ２２９１０８、米国特許第５，３８２，６５７号；ＥＰ ５９３８６８；米国特許第４，９１７，８８８号及びＷＯ９９／５５３７７、参照により、本明細書に組み込まれる。）。米国特許第４，９０４，５８４号は、少なくとも１つのリジン残基が欠失され、又は他の何れかのアミノ酸残基で置換されている、ＰＥＧ化された、リジン除去されたポリペプチドを開示している。ＷＯ９９／６７２９１号は、タンパク質上の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されており、及び該タンパク質がタンパク質への結合を達成するのに十分な条件下でＰＥＧと接触される、タンパク質にＰＥＧを結合する方法を開示している。ＷＯ９９／０３８８７号は、システイン残基がポリペプチドの指定された領域中に位置する非必須アミノ酸残基で置換されている、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化されたバリアントを開示している。ＰＥＧ化されたＩＦＮ分子の例には、米国特許第６，５２４，５７０号；同第６，２５０，４６９号；同第６，１８０，０９６号；同第６，１７７，０７４号；同第６，０４２，８２２号；同第５，９８１，７０９号；同第５，９５１，９７４号；同第５，９０８，６２１号；同第５，７３８，８４６号；同第５，７１１，９４４号；同第５，３８２，６５７号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。ＩＦＮβは、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドの一例として挙げられている。ＷＯ００／２３１１４号は、グリコシル化及びＰＥＧ化されたＩＦＮβを開示している。ＷＯ００／２３４７２号は、ＩＦＮβ融合タンパク質を開示している。ＷＯ００／２６３５４号は、対応する親ポリペプチドと比べて、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位を含む、アレルギー誘発性が低減された、グリコシル化されたポリペプチドバリアントを製造する方法を開示している。ＩＦＮβは、米国特許第５，２１８，０９２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている技術に従って修飾することが可能な多くのポリペプチドのうちの一例として開示されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１８，０９２号は、固有ポリペプチドに比べて、少なくとも１つの追加の炭水化物鎖を導入するために、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び他のポリペプチドを修飾することを開示している。
「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語には、何れかのアミノ酸位置がグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドのＮ−結合型又はＯ結合型グリコシル化形態などのグリコシル化されたｈＩＦＮも含まれるが、これらに限定されない。これらの形態には、配列番号１の１２９位又は配列番号２若しくは３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチドの均等な位置にＯ結合型グリコシル化部位を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない（Ａｄｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＣｈｅｍ．１ ２７６：５１１（１９９１））。
単一のヌクレオチド変化を含有するバリアントも、ｈＩＦＮポリペプチドの生物学的に活性なバリアントとして考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語には、化学的手段によって連結された、又は融合タンパク質として発現された、１つ若しくはそれ以上の何れかのｈＩＦＮポリペプチド又は他のあらゆるポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド若しくはあらゆる種類の他の生物活性分子のｈＩＦＮポリペプチドヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体及び例えば、特異的な欠失又は他の修飾を含有するが、生物活性をなお維持するポリペプチド類縁体も含まれる。
本明細書に記載されているｈＩＦＮ中のアミノ酸位置に対する全ての表記は、別段の記載（すなわち、比較が配列番号１、３又はその他のｈＩＦＮ配列又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカインに基づいていると記載されている場合）がなければ、配列番号２中の位置に基づいている。当業者であれば、配列番号１、２、３又は他の何れかのＩＦＮ配列若しくはリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン中の位置に対応するアミノ酸位置は、ｈＩＦＮ融合物、バリアント、断片などの他の何れかのｈＩＦＮ分子又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン中に容易に同定可能であることが自明である。配列番号１、２、３又は他のＩＦＮ配列又はリミチンなどのインターフェロン様サイトカイン配列中の位置と対応する、タンパク質中の特定の位置を整列及び同定するために、例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列整列プログラムを使用することが可能である。配列番号１、２、３又は他のＩＦＮ配列に関して本明細書に記載されているアミノ酸の置換、欠失又は付加は、本明細書に記載され又は本分野で公知のｈＩＦＮ融合物、バリアント、断片、リミチンなどのインターフェロン様サイトカインなどの対応する位置の置換、欠失又は付加も表すものとして、本発明によって明示的に包含される。
「ｈＩＦＮポリペプチド」又は「ｈＩＦＮ」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＩＦＮポリペプチドを包含する。本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸修飾とともに、１つ又はそれ以上の天然アミノ酸を用いた修飾から構成され得る。例えば、ｈＩＦＮポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸置換及びＮ末端に位置する最初のアミノ酸への、天然アミノ酸置換を含み得る。アゴニスト活性を増加する置換、ポリペプチドの溶解度を増加する置換、プロテアーゼ感受性を減少させる置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換などの（これらに限定されない。）、ｈＩＦＮポリペプチドの生物活性の１つ又はそれ以上を調節する置換など（これらに限定されない。）、天然に存在するｈＩＦＮポリペプチド中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語によって包含される。
ヒトＩＦＮアンタゴニストは、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５又はこれらの何れかの組み合わせ（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮ配列中の対応するアミノ酸）に置換を有するものが含まれ（但し、これらに限定されない。）、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された部位及び所望される活性に応じて、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして、作用し得る。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７又はこれらの何れかの組み合わせ（ｈＩＦＮ；配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）に置換を有するものが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮアンタゴニストは、ＩＦＮをアンタゴニストとして作用させる、領域１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（Ｄ及びＥへリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅへリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）中に少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部内の残基が含まれる。他の実施形態において、上掲の置換は、ｈＩＦＮポリペプチドを、ｈＩＦＮアンタゴニストにすさらなる置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮアンタゴニストは、ｈＩＦＮ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換又は欠失をさらに含む。例えば、付加、置換又は欠失は、ｈＩＦＮの１つ又はそれ以上の特性又は活性を調節し得る。例えば、付加、置換又は欠失は、ｈＩＦＮポリペプチド受容体に対する親和性を調節し、受容体の二量体化を調節し（増加又は減少させることを含むが、これらに限定されない。）、ｈＩＦＮ受容体結合後の下流シグナル伝達減少を調節し、受容体の二量体を安定化し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、プロテアーゼによる切断を調節し、用量を調節し、放出若しくは生物学的利用可能性を調節し、現行のＩＦＮ治療に見出される１つ若しくはそれ以上の副作用を調節し、毒性を調節し、精製を促進し、又は投与の具体的経路を改善若しくは改変し得る。同様に、ｈＩＦＮポリペプチドは、本ポリペプチドの検出（ＧＦＰを含むが、これに限定されない。）、精製又は他の形質を改善する、プロテアーゼ切断配列、反応性の基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓを含むが、これらに限定されない。）又はアフィニティーを基礎とした他の配列（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない。）又は連結された分子（ビオチンを含むが、これに限定されない。）を含み得る。
「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語には、天然にコードされていないアミノ酸側鎖を介して、同一若しくは別異の天然にコードされていないアミノ酸側鎖に、天然にコードされているアミノ酸側鎖に直接的に連結されたもの又はリンカーを介して間接的に連結されたものなど（これらに限定されない。）、連結されたホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体も包含される。典型的なリンカーには、小有機化合物、ポリ（エチレングリコール）又はポリデキストランなどの様々な長さの水溶性ポリマー又は様々な長さのポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
「天然にコードされていないアミノ酸」とは、２０の共通アミノ酸うちの１つ又はパイロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）又はセレノシステインでないアミノ酸を表す。「天然にコードされていないアミノ酸」という用語と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「不天然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、並びに様々にハイフンが付されたそのバージョン及びハイフンが付されていないそのバージョンである。「天然にコードされていないアミノ酸」という用語には、天然にコードされているアミノ酸（２０の共通アミノ酸又はパイロリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない。）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体は、成長しているポリペプチド鎖中に翻訳複合体によって本来取り込まれないアミノ酸も含まれるが、これに限定されない。このような天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン及びＯ−ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に付着させることが可能なあらゆる分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付着させることが可能なあらゆる分子を表す。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミンなどのぺプチド若しくはタンパク質又はペプチドの血清半減期を増加させるその他の部分が含まれるが、これらに限定されない。
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学的反応基」及び「化学的反応部分」という用語は、分子の異なる、確定可能な部分又は単位を表すために、本分野及び本明細書において使用されている。前記用語は、化学の分野において若干同義的であり、何らかの機能又は活性を発揮し、他の分子と反応する分子の部分を表すために本明細書において使用される。
本明細書において「結合」又は「リンカー」という用語は、化学反応の結果として通常形成される基又は結合を表すために使用され、典型的には、共有結合である。加水分解に対して安定な結合とは、該結合が水中で実質的に安定であり、生理的条件下を含む（これに限定されない。）有用なｐＨ値で、長期にわたって、おそらくは永久に水と反応しない結合を意味する。加水分解に対して不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が、水又は例えば、血液などの水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が１つ又はそれ以上の酵素によって分解可能であることを意味する。本分野で理解されているように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の１つ又はそれ以上との間のリンカー基中に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸又は活性化されたＰＥＧカルボン酸の、生物活性因子上のアルコール基との反応によって形成されたエステル結合は、一般に、生理的条件下で加水分解されて、前記因子を放出する。加水分解によって分解可能な他の結合には、カルボナート結合；アミンとアルデヒドの反応から得られたイミン結合；アルコールとホスファート基との反応によって形成されたリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応産物であるアセタール結合；フォルマートとアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（ＰＥＧなどのポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とペプチドのカルボキシル基によって形成されるペプチド結合；及びホスホルアミダイト基（ポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれるが、これらに限定されない。
「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性因子」という用語は、本明細書中で使用する場合、以下に限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物及びヒトを含む（但し、これらに限定されない。）、生物系、生物に関連する、経路、分子もしくは相互作用の何らかの物理的又は生化学的特性に影響を与え得るあらゆる物質を意味する。特に、本明細書中で使用する場合、生物活性分子には、以下に限定されないが、ヒトもしくは他の動物における疾患の、診断、治療、緩和、処置もしくは予防のための、又は、その他、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を促進するためのあらゆる物質が含まれる。生物活性分子の例には、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子又は分子、顔料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが含まれる。本発明とともに使用するのに適した生物活性因子のクラスには、以下に限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などが含まれる。
「二官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つの別個の官能基を含むポリマーを表す。第一の生物活性成分と、二官能性リンカーと、及び第二の生物活性成分とを含む結合体を形成するために、ある生物活性成分上の基と反応する１つの官能基と、第二の生物成分上の基と反応する別の基とを有する二官能性リンカーを使用することができる。ペプチドに様々な化合物を付着させるための数多くの手順及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、第４，６５９，８３９号、第４，４１４，１４８号、第４，６９９，７８４号；第４，６８０，３３８号及び第４，５６９，７８９号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。「多官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つ又はそれ以上の別個の官能基を含むポリマーを表す。二官能性ポリマー又は多官能性ポリマーは、あらゆる所望の長さ又は分子量であってもよく、ｈＩＦＮに連結された１つ又はそれ以上の分子とその受容体又はｈＩＦＨとの間に特定の所望されるスペース又は立体構造を提供するように選択され得る。
置換基が、左から右へ書かれた慣用の化学式によって特定されている場合、それらは、右から左へ構造を書くことによって得られる化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、構造−ＯＣＨ２−と等価である。
「置換基」という用語は、以下に限定されないが、「非妨害置換基」を含む。「非妨害置換基」は、安定な化合物を生じる基である。適切な非妨害置換基又はラジカルには、以下に限定されないが、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルカリール、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、ｍは１から８である。）、アリール、置換されたアリール、置換されたアルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換された複素環基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、各ｍは１から８である。）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、これらの塩などが含まれる。各Ｒは、本明細書中で使用する場合、Ｈ、アルキルもしくは置換されたアルキル、アリールもしくは置換されたアリール、アラルキル又はアルカリールである。
「ハロゲン」という用語には、フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素が含まれる。
「アルキル」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、別段の断りがない限り、直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状炭化水素基又はこれらの組合せを意味し、完全に飽和、モノ又はポリ不飽和であり得、指定の炭素原子数を有する（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する。）、二価及び多価の基を含み得る。飽和炭化水素基の例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体及び異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１又はそれ以上の二重結合又は三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、以下に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル及びより高級な相同体及び異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、別段の注記がない限り、「ヘテロアルキル」など、下記でさらに詳細に定義するアルキルの誘導体を含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ぶ。
「アルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、アルカン由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、構造−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられ、さらに、「ヘテロアルキレン」として下記で述べる基が含まれる。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１から２４個までの炭素原子を有し得るが、１０個又はそれ以下の炭素原子を有する基が、本明細書に記載されている方法及び組成物の具体的な実施形態である。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル又はアルキレン基であり、一般に、８個又はそれ以下の炭素原子を有する。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、これらの慣用の意味で使用され、分子の残りの部分にそれぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子を介して結合するアルキル基を指す。
単独で又は別の用語と一部として組み合わされた「ヘテロアルキル」という用語は、別段の記載がなければ、表記の炭素原子数と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも一つの複素原子とからなり、窒素原子及び硫黄原子が場合によって酸化されていてもよく、窒素複素原子が場合によって四級化されていてもよい、安定な直鎖若しくは分枝鎖若しくは環状炭化水素基又はそれらの組み合わせを意味する。複素原子Ｏ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置又はアルキル基が分子の残部に付着される位置に配置され得る。例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれるが、これらに限定されるものではない。最大２個の複素原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ−（ＣＨ３）３のように、連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、同一又は別異の複素原子が、鎖末端の一方又は両方を占めることも可能である（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどを含むが、これらに限定されない。）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれている方向によって連結基の配向は示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、単独で又は他の用語と組み合わせて、別段の断りがない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状形態を表す。従って、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルには、飽和、及び部分的に不飽和及び完全に不飽和の環結合が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、複素原子は、複素環が分子の残部に付着されている位置を占めることが可能である。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、以下に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、本用語は、二環式及び三環式の環構造を包含する。同様に、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキル由来の二価の基を意味し、「シクロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、シクロアルキル由来の二価の基を意味する。
本明細書中で使用する場合、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒中で可溶性であるあらゆるポリマーを指す。ｈＩＦＮポリペプチドへの水溶性ポリマーの結合は、非修飾形態に比べて、増加若しくは調節された血清半減期、又は増加若しくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、凝集及び多量体の形成、改変された受容体結合、改変された受容体二量体化又は多量体化などの調節された物理的会合特性、調節された毒性及び現行のＩＦＮ治療薬に見出される副作用を含むＩＦＮの１つ又はそれ以上の生物学的活性の調節を含む（これらに限定されない。）変化をもたらすことが可能である。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有していてもよく、又は有していなくてもよく、以下に限定されないが、１もしくはそれ以上のｈＩＦＮポリペプチド又は１もしくはそれ以上の生物活性分子を含む他の物質へのｈＩＦＮの付着のためのリンカーとして利用され得る。適切なポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はそれらのアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載（本明細書中に参照により組み込む。）。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（以下に限定されないが、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む。）、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールとそれらの誘導体とのコポリマー、ポリビニルエチルエーテル及びα−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど又はそれらの混合物が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール及び血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」又は「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びそれらの誘導体を指す。「ポリアルキレングリコール」という用語は、直鎖及び分岐ポリマーの両方、並びに０．１ｋＤａと１００ｋＤａの間の平均分子量を包含する。他の例示的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）」など、供給業者のカタログに列記されている。
「アリール」という用語は、別段の断りがない限り、単環又は多環式（１から３環を含むが、これらに限定されない。）であり得、一緒に縮合するか又は共有結合している、ポリ不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１から４個までの複素原子を含有し、窒素及び硫黄原子が場合によって酸化されており、並びに窒素原子が場合によって四級化されているアリール基（又は環）を表す。ヘテロアリール基は、複素原子を通じて分子の残部に付着させることが可能である。アリール及びヘテロアリール基の非限定例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが含まれる。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下に記載されている許容される置換基の群から選択される。
簡略のため、他の用語と組み合わせて使用される場合（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含むが、これらに限定されない。）、「アリール」という用語は、上記定義のアリール及びヘテロアリール環の両方を含む。従って、「アリールアルキル」という用語は、アリール基がアルキル基（炭素原子（メチレン基を含むが、これに限定されない。）が、例えば、酸素原子によって置換されたアルキル基（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むが、これらに限定されない。）に付着された基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが含まれるが、これらに限定されない。）を含むものとする。
上記各用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」を含むが、これらに限定されない。）は、表記されている基の置換された形態及び置換されていない形態の両方を含むものとする。基の各種類に対する典型的な置換基が、以下に記載されている。
アルキル及びヘテロアルキル基に対する置換基（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む。）は、０から（２ｍ’＋１）（ｍ’は、このような基の中の炭素原子の総数である。）までの範囲の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される様々な１つ又はそれ以上の基とすることができるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、これらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３が含まれるが、これらに限定されない。）、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できるであろう。
アルキル基に対して述べた置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基に対する置換基は、様々であり、以下に限定されないが、０から芳香環系における開放された価数の総数の範囲の数の、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル（Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。）から選択される。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。
本明細書において使用される、「調節された血清半減期」という用語は、修飾されていないその形態に比した、修飾されたｈＩＦＮの循環半減期の正又は負の変化を意味する。血清半減期は、ｈＩＦＮの投与後の様々な時点に血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を測定することによって測定される。血清濃度と時間の相関関係は、血清半減期の計算を可能とする。望ましくは、増加された血清半減期は、少なくとも約２倍を有するが、これより小幅な増加も有用であり得、例えば、これにより、満足のいく投与計画を可能とするか、又は毒性の影響を避けることができる。幾つかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍である。
「調節された治療半減期」という用語は、本明細書中で使用する場合、その非修飾形態と比較して、ｈＩＦＮの治療的有効量の半減期が正又は負に変化することを意味する。治療半減期は、投与後に、様々な時間点で分子の薬物動態及び／又は薬力学特性を測定することにより測定される。増加された治療的半減期は、望ましくは、特定の有益な投薬治療、特定の有益な総投薬を可能とし、又は所望でない効果を回避する。幾つかの実施形態において、効力の増強、その標的に対する修飾された分子の増加又は減少した結合、プロテアーゼなどの酵素による分子の増加若しくは減少した分解、又は別のパラメーターの増加若しくは減少又は非修飾分子の作用機序の結果、治療半減期が延びる。
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に対して適用される場合、核酸若しくはタンパク質が自然の状態でそれとともに随伴している細胞成分の少なくとも１つを、該核酸若しくはタンパク質が実質的に含まないことを表し、又はそのインビボ若しくはインビトロ産生の濃度より大きなレベルまで核酸若しくはタンパク質が濃縮されていることを表す。これは、均質な状態であり得る。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態、又は溶液（水溶液を含むが、これに限定されない。）とすることができる。単離された物質は、さらなる医薬として許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物の成分であり得る。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析的化学技術を用いて測定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、該遺伝子に隣接し、対象遺伝子とは別のタンパク質をコードする読み取り枠から分離されている。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で実質的に一つのバンドを生じることを表す。特に、「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％又はそれ以上純粋であることを意味し得る。
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを表す。別段の制限がなければ、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別段の制限がなければ、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオアート、ホスホロアミダートなど）を含む、オリゴヌクレオチド類縁体も表す。別段の記載がなければ、ある核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない。）及び相補的配列並びに明示的に記されている配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つ又はそれ以上（又は全て）のコドンの三番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９： ５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０： ２６０５−２６０８（１９８５）；ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８： ９１−９８（１９９４））。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、本明細書において互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドに対する記載は、ペプチドという記載及びタンパク質という記載に対しても等しく適用され、逆も同様である。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用されるこれらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、あらゆる長さ（完全長タンパク質を含む。）のアミノ酸鎖を包含する。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣体を表す。天然にコードされているアミノ酸は、２０の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにパイロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類縁体は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合されているα炭素を有する化合物を表す。このような類縁体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基礎的化学構造を保持する。
本明細書では、アミノ酸は、一般的に知られている三文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている一文字記号の何れかによって表記され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受容されている一文字コードによって表記され得る。
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に対して適用される。ある核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を表し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の配列を表す。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が任意の与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって指定されている全ての場所で、該コドンは、コードされているポリペプチドを変化させずに、任意の対応する記載されているコドンへと変化させることができる。このような核酸の変化は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。本発明において、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、該核酸の全ての可能なサイレント変異も記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）、機能的に同一の分子を生成するために修飾することが可能なことを認識できる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載された配列に含意される。
アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされている配列中の単一アミノ酸又はアミノ酸の僅かな割合を変化し、付加し、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する、各置換、欠失又は付加は、変化が、あるアミノ酸の欠失、有るアミノ酸の付加、又はあるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらす「保存的に修飾されたバリアント」であることを認める。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表が、当業者に公知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、さらに、本発明の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子であり、これらを除外するものではない。
機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表が、当業者に公知である。以下の８つの群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）参照）。
「同一の」又はパーセント「同一性」という用語は、２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列を指す。以下の配列比較アルゴリズム（又は当業者が利用可能なその他のアルゴリズム）の一つを用いて、又は手で整列し、目で調べることによって測定された場合に、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたり、最大の一致度を比較し、並列したときに、当該配列が、同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの一定パーセント（すなわち、指定された領域にわたって、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の同一性）を有すれば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補物も表す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって、又は７５ないし１００アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって存在し、又は、明記されていない場合には、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの配列全体わたって存在することが可能である。
配列比較の場合、典型的には、ある配列が基準配列として作用し、該配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、サブ配列座標を指定し、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを使用することが可能であり、又は別のパラメータを指定することが可能である。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２０から６００まで、通常は約５０から２００まで、より一般的には約１００から１５０までからなる群から選択される連続する位置の数の任意の１つのセグメントに対する表記を含み、その中で、２つの配列は最適に配列された後に、配列は連続位置の同数の基準配列に対して比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当業者に公知である。以下に限定されないが、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は手動でのアラインメント及び目視（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５、補遺）などによって、比較のための配列の最適アラインメントを行うことができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、それぞれ、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ３３８９−３４０２」及び「Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５： ４０３−４１０」に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を通じて、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで公に頒布されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ；ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）、１０の予測値（Ｅ；ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低複雑度」のフィルターをオフにして行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一指標は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で一致が偶発的に生じ得る確率の指標を与える。例えば、基準核酸に対して試験核酸を比較した場合に、最少合計確率が約０．２未満、又は約０．０１未満、又は約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似していると考えられる。
「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」という用語は、その配列が複雑な混合物中に存在する場合には（全細胞又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むが、これらに限定されない。）、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子が、あるヌクレオチド配列のみに結合し、二重鎖を形成し、又はハイブリダイズすることを表す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本分野で公知であるように、低いイオン強度と高い温度の条件下での、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ若しくはその他の核酸模倣体の配列又はこれらの組み合わせのハイブリダイーゼションを表す。典型的には、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複雑な混合物（全細胞又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。）中のその標的サブ配列にハイブリダイズするが、複雑な混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい手引きは、「Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）」に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨで、特異的な配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５ないし１０℃低いように選択される。Ｔｍとは、（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有されるので）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０ないし８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、短いプローブ（１０ないし５０ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約３０℃、長いプローブの場合（５０ヌクレオチド超を含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性信号は、バックグラウンドの少なくとも２倍、場合によってバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であり得る。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃で温置する５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、又は６５℃で温置し、０．２×ＳＳＣ中で洗浄し、６５℃の０．１％ＳＤＳ中で洗浄する５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳとすることができる。このような洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分又はそれ以上行うことが可能である。
本明細書において使用される、「真核生物」という用語は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などを含むが、これらに限定されない。）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含むが、これらに限定されない。）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などの系統発生学的ドメインで真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を表す。
本明細書中で使用する場合、「非真核生物」という用語は、非真核の生物を指す。例えば、非真核生物は、真正細菌（以下に限定されないが、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）系統発生ドメイン又は古細菌（以下に限定されないが、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラクス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルケオグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ユーロピルム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）系統発生ドメインなどを含む。）に属することが可能である。
本明細書で使用される「患者」という用語は、動物を表す。幾つかの実施形態において、治療、観察又は実験の対象である哺乳動物、及び別の実施形態においてはヒトを表す。
本明細書において使用される「有効量」という用語は、治療されている、疾病、症状又は疾患の症候の１つ又はそれ以上をある程度緩和する、投与されている修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドの量を指す。本明細書に記載されている修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的、強化的及び／又は治療的処置のために投与することが可能である。
「強化する」又は「強化すること」という用語は、所望の効果の強度又は持続時間の何れかを増加又は延長させることを意味する。従って、治療薬の効果を促進するということに関して、「強化すること」という用語は、系において他の治療薬の強度又は持続時間、効果を増大又は延長させる能力を表す。本明細書において使用される「強化有効量」とは、所望の系において、別の治療剤の効果を強化するのに十分な量を表す。患者に使用される場合、この使用に対して有効な量は、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存する。
本明細書において使用される「修飾された」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学的構造に対する変化、ポリペプチドの翻訳時修飾又は翻訳後修飾など、あるポリペプチドに対して施された任意の変化を表す。「（修飾された）」形態という用語は、論述されているポリペプチドが場合によって修飾されていること、すなわち、論述されているポリペプチドは修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいことを意味する。
「翻訳後修飾された」という用語は、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後、このようなアミノ酸に起こる、天然又は非天然アミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語は、一例に過ぎないが、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（無細胞翻訳系など）、インビボ翻訳後修飾及びインビトロ翻訳後修飾を包含する。
予防的な適用では、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、ある疾病、疾患又は症状が発生しやすく、又はその他該疾病、疾患又は症状に対してリスクがある患者に投与される。このような量は、「予防的有効量」であると定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態、体重などにも依存する。このような予防的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
「保護された」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる、「保護基」又は部分の存在を指す。保護基は、保護されている化学的に反応性のある基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（例えば、メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど。）であり得る。本分野において公知の他の保護基も、本明細書に記載されている方法及び組成物中で又は本明細書に記載されている方法及び組成物とともに使用することができ、Ｎｖｏｃ及びＭｅＮｖｏｃなどの光解離性基が含まれる。本技術分野で公知のその他の保護基もまた、本明細書に記載されている方法及び組成物において、または本明細書に記載されている方法及び組成物とともに使用し得る。
例として、ブロッキング／保護基は、以下から選択され得る。
Figure 2008541769
他の保護基は、「Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９９」に記載されている（その内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
治療的な適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、疾病、症状又は疾患に既に罹患している患者に、該疾病、疾患又は症状の症候を治癒し、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。このような量は、「治療的有効量」であると定義され、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存する。このような治療的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
「治療する」という用語は、予防的及び／又は治療的処置の何れかを表すために使用される。
本明細書に記載されている天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドには、天然に通常見出される原子量又は質量数とは異なる原子量又は質量数を有する原子によって置換された１つ又はそれ以上の原子で同位体標識された化合物が含まれ得る。本発明の化合物中に取り込まれ得る同位体の例には、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、８Ｆ、３６Ｃｌなどの、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素及び塩素などの同位体が含まれる。本明細書中に記載されている同位体標識されたある種の化合物、例えば、その中に３Ｈ及び１４Ｃなどの放射性同位体が取り込まれている化合物は、薬物及び／又は基質の組織分布アッセイにおいて有用であり得る。さらに、重水素、すなわち、２Ｈなどの同位体での置換は、より大きな代謝安定性、例えば、増加したインビボ半減期又は減少した投薬の必要性に起因するある種の治療的な利点を与えることができる。
ジアステレオマー、鏡像異性体及び混合物を含む（これらに限定されない。）全ての異性体が、本明細書中に記載されている組成物の一部と考えられる。追加の又はさらなる実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、所望の効果（所望の治療効果を含む。）を生じさせるためにその後使用される代謝物を産生させるのに必要な生物に投与した際に代謝される。さらなる又は追加の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドの活性な代謝物である。
幾つかの状況において、天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在し得る。さらに、本明細書中に記載されている天然にコードされていないアミノ酸ポリペプチドは、溶媒和されていない形態で、及び水、エタノールなどの医薬として許容される溶媒で溶媒和された形態で存在することが可能である。溶媒和された形態も、本明細書に開示されていると考えられる。当業者は、本明細書中の化合物の幾つかが数個の互変異性形態で存在できることを認める。このような互変異性体形態の全てが、本明細書中に記載された組成物の一部と考えられる。
別段の記載がなければ、本分野の技術に属する質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ，タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用法が使用される。
詳細な説明
Ｉ．序論
本発明において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むインターフェロン分子が提供される。本発明のある種の実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するｈＩＦＮポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾は、特定の反応基に対して適切であることが当業者に公知である化学の方法を利用した、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類縁体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、回転脱水ラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレートする基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、量子ドット、ナノ点立つ物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せなどの（これらに限定されない。）、第二の反応性基を含む分子を、第一の反応性基を含む少なくとも１つの非天然アミノ酸へ付着させることを含む。例えば、第一の反応性基はアルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（プロパルギル基は、アセチレン部分と称される場合もある。）を含み（これに限定されない。）、前記第二の反応性基はアジド部分であり、［３＋２］環状付加化学方法が使用される。別の例において、第一の反応基はアジド部分であり（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて、など。）、第二の反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたＩＦＮポリペプチドのある種の実施形態では、少なくとも一つの翻訳後修飾を含む少なくとも一つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない。）が使用され、この場合、少なくとも一つの翻訳後修飾は糖質部分を含む。ある種の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞又は非真核細胞中、インビボで行われる。リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又はその他の分子は、分子をポリペプチドに付着させ得る。分子は、ポリペプチドへ、直接連結され得る。
ある一定の実施形態において、タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、別の宿主細胞種によっては通常行われない。ある一定の実施形態において、タンパク質は、ある真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、非真核細胞によっては通常行われない。翻訳後修飾の例には、以下に限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（オリゴ糖は（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）などを含むが、これに限定されない。）のアスパラギンへの付着を含む。別の実施形態において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む。）の、セリン又はスレオニンへの結合を含む。ある一定の実施形態において、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含むことができる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現のために５’−最適化された真核生物分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ Ａ分泌シグナル配列及びファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ ＧＩＩＩ及びＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）及びトランスポゾン由来のシグナル配列ｂｌａが挙げられる。
目的のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、又は１０若しくはそれ以上の非天然アミノ酸を含有することが可能である。非天然アミノ酸は、同一又は別異とすることが可能であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能である。ある種の実施形態において、タンパク質の天然に存在する様式中に存在する、少なくとも１つ、但し、全部より少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換される。
本発明は、天然にコードされていない少なくとも１つのアミノ酸を含む、ＧＨスパー遺伝子ファミリーのメンバーを基礎とする方法及び組成物を提供する。ｈＩＦＮ中に天然にコードされていない少なくとも１つのアミノ酸を導入することによって、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸など（これに限定されない。）との特異的化学反応を伴うが、一般に存在する２０アミノ酸とは反応しない結合化学の適用が可能となる。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに連結されている。本発明は、ケトン、アジド又はアセチレン部分など（これに限定されない。）、天然に取り込まれる２０個のアミノ酸中に見出されない官能基又は置換基を含有するアミノ酸など（これらに限定されない。）、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、セレクターコドンに応答してタンパク質中に、選択的に取り込み、それらのアミノ酸を、適切に反応性を有するＰＥＧ誘導体でその後修飾することを含む、ＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質を選択的に修飾する極めて効率的な方法を提供する。一旦取り込まれれば、次いで、このアミノ酸側鎖は、天然にコードされていないアミノ酸中に存在する官能基又は置換基に適していることが当業者に公知の化学方法を使用することによって修飾することができる。多様な公知の化学方法が、水溶性ポリマーをタンパク質中に取り込むために本発明において使用するのに適している。このような方法には、それぞれ、アセチレン又はアジド誘導体など（これらに限定されない。）とのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｐａｄｗａ．Ａ．ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｖｏｌ．４，（１９９１） Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ， Ｂ．Ｍ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ， Ｒ．ｉｎ １．３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｖｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８４） Ｅｄ．Ｐａｄｗａ， Ａ．， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．１−１７６参照）。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加方法は、求核置換反応ではなく、環化付加を含むので、タンパク質は、極めて高い選択性で修飾することが可能である。該反応は、Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することによって、優れた立体選択性（１，４＞１，５）を有する水性条件において、室温で実施することが可能である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈａｍ．６７：３０５７−３０６４；ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１ ：２５９６−２５９９」を参照されたい。［３＋２］環化付加を通じて本発明のタンパク質に付加され得る分子には、アジド又はアセチレン誘導体など（これらに限定されない。）の適切な官能基又は置換基を有する実質的に全ての分子が含まれる。これらの分子は、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アセチレン基を有する非天然アミノ酸、又は、ｐ−アジド−フェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アジド基を有する非天然アミノ酸に付加されることが可能である。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化から得られる５員環は、還元環境では、一般に可逆的でなく、水性環境中では長期間、加水分解に対して安定である。従って、様々な物質の物理的及び化学的特性は、本発明の活性なＰＥＧ誘導体を用いて、要求される水性条件下で修飾することができる。さらに重要なことに、アジドとアセチレン部分は互いに対して特異的であるので（及び、例えば、遺伝子によってコードされた２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない。）、タンパク質は、極めて高い選択性で、１つ又はそれ以上の特異的な部位において修飾されることが可能である。
本発明は、ＰＥＧ誘導体の水溶性且つ加水分解に対して安定な誘導体及び１つ又はそれ以上のアセチレン又はアジド部分を有する関連の親水性ポリマーも提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答して、タンパク質中に選択的に導入されたアジド部分との結合に対して高度に選択的である。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答し、タンパク質中に選択的に導入されるアセチレン部分との結合に対して高度に選択的である。
より具体的には、アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジド及びこれらのアジドの誘導体を含むが、これらに限定されない。アルキル及びアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。アセチレン部分は、アルキル及びアリールアセチレン並びにそれぞれの誘導体を含む。アルキル及びアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。
本発明は、他の物質（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、回転脱水ラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質などを含むが、これらに限定されない。）とともに、多様な官能基、置換基又は部分を有する物質の結合体を提供する。本発明には、アジド又はアセチレン部分を有する物質の、対応するアセチレン又はアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との結合体も含まれる。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能性を有する非遺伝的コードアミノ酸を含有するタンパク質中の位置において、生物活性分子へ結合させられることが可能である。ＰＥＧと生物活性分子を結合させる連結には、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加産物が含まれるが、これに限定されない。
ＰＥＧは、生物材料の表面を修飾するために使用できることが本分野では十分に確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号、Ｍｅｈｖａｒ， Ｒ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．， ３（１）：１２５−１３６（２０００）参照、これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。本発明には、１つ又はそれ以上の反応性アジド又はアセチレン部分を有する表面と、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化結合を介して、該表面に結合された本発明のアジド又はアセチレン含有ポリマーの１つ又はそれ以上とを含む生物材料も含まれる。生物材料及び他の物質は、その後の反応に利用可能なアジド又はアセチレン部分を残すために、カルボン酸、アミン、アルコール又はチオール部分を含む結合を介してなど、アジド又はアセチレン結合以外の結合を介して、アジド又はアセチレン活性化されたポリマー誘導体に結合することも可能である。
本発明には、本発明のポリマーを含有するアジド及びアセチレンを合成する方法も含まれる。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアジド部分を有するように、一つの末端にアジド部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アセチレンは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、一つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。
より具体的に、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を受けて、より反応性の高い部分（メシラート、トレシラート、トシラート又はハロゲン脱離基など）をその上に有する置換されたポリマーを生成する。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子及び他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者に公知である。得られた置換されたポリマーは、次いで、反応を受けて、ポリマーの末端にあるアジド部分を、さらに反応性の高い部分に置換する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、且つアジド部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアジドを有する連結剤と反応する。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシラート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどの求核及び求電子部分は、当業者に公知である。
より具体的に、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を受けて、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲン又は他の活性化された脱離基を除去する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、且つアセチレン部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアセチレンを有する連結剤と反応する。有機合成におけるハロゲン部分、活性化された脱離基、求核及び求電子部分の使用並びにＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者にとって十分に確立されている。
本発明は、ＰＥＧ及びアジド又はアセチレン部分を含有するＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマーを含む（これらに限定されない。）他の物質を修飾されたタンパク質に付加するために、タンパク質を選択的に修飾する方法も提供する。アジド及びアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、生体適合性、安定性、溶解度及び免疫原性の欠如が重要であるが、一方、同時に、本分野で既に公知であるタンパク質にＰＥＧ誘導体を付着するさらに選択的な手段を与えながら、表面及び分子の特性を修飾するために使用することが可能である。
ＩＩ．成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリー
以下のタンパク質には、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質（Ｂａｚａｎ， Ｆ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９０）；Ｂａｚａｎ， Ｊ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１３（１９９２）；Ｍｏｔｔ， Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｉ．Ｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ， Ｏ．ａｎｄ ＩｈＩｅ， Ｊ．Ｎ．， ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ ＢＹ ＴＨＥ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ（１９９６））：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、αインターフェロン、βインターフェロン、εインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）が含まれる。本遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、遺伝子クローニング及び配列決定を通じて、将来同定されることが理解される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般に、限定的なアミノ酸又はＤＮＡ配列の同一性を有するという事実に関わらず、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、類似の二次構造及び四次構造を有する。共有された構造的特徴によって、遺伝子ファミリーの新たなメンバーを容易に同定することが可能となり、本明細書に記載されている非天然アミノ酸方法及び組成物が同様に当てはまる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの間の構造的相同性の程度に鑑みれば、天然にコードされていないアミノ酸は、本発明を用いて、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆるメンバー中に取り込まれ得る。タンパク質の本ファミリーの各メンバーは、４ヘリックスバンドルを含む。ファミリーメンバーＩＦＮα−２の一般構造が図１に示されている。
Ｇ−ＣＳＦ（Ｚｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１４：４３５（１９９２）；Ｚｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：８４５３（１９９４）；Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５１６７（１９９３））、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １５４：１７７９−１７８２（１９９１）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２４：１０７５−１０８５（１９９２））、ＩＬ−２（Ｂａｚａｎ， Ｊ．Ｆ．ａｎｄ ＭｃＫａｙ， Ｄ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１３（１９９２）、ＩＬ−４（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１１０２９−１１０３５（１９９１）；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７３−１６７７（１９９２））及びＩＬ−５（Ｍｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：１７２−１７６（１９９３））を含む多数のサイトカインの構造が、Ｘ線回折及びＮＭＲ研究によって決定されており、著しい一次構造相同性の欠如にも関わらず、ＧＨ構造との顕著な保存を示している。ＩＦＮは、モデリング及び他の研究に基づいて、このファミリーのメンバーであると考えられている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１５：３４１（１９９５）；Ｍｕｒｇｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：６２（１９９３）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１４５３（１９９６）；Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２７４：６６１（１９９７））。ＥＰＯは、モデリング及び変異誘発研究に基づいて、このファミリーのメンバーであると考えられている（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９８３−１５９９３（１９９３）；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２８３９−２２８４６（１９９４））。現在では、上記サイトカイン及び成長因子の全てが、１つの巨大な遺伝子ファミリーを含むと考えられている。
類似の二次構造及び四次構造を共有していることに加え、本ファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために細胞表面受容体をオリゴマー化しなければならないという特性を共有している。ＧＨ及びＥＰＯを含む（これらに限定されない。）幾つかのＧＨファミリーメンバーは、受容体の単一種類を結合し、ホモ二量体を形成する。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６を含む（これらに限定されない。）他のファミリーメンバーは、受容体の２種類以上を結合し、受容体に、ヘテロ二量体又はこれより高次の凝集物を形成する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０８；Ｐａｏｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）， ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１９４２−１９５１；Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５））。変異誘発研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカイン及び成長因子が、複数の（通例、２個の）受容体結合部位を含有し、それらのコグネート受容体を順次結合する（Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ９３：９４７１−９４７６））。ＧＨ同様に、これらの他のファミリーメンバーに対する一次受容体結合部位は、主に、４つのαヘリックス及びＡ−Ｂループ中に存在する。受容体結合に関与するヘリックスバンドル中の具体的アミノ酸は、ファミリーメンバーの間で異なる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーと相互作用する細胞表面受容体の多くは、構造的に関連しており、第二の巨大マルチ遺伝子ファミリーを構成する。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの様々なメンバーの変異研究から到達される一般的な結論は、αヘリックスを連結しているループは、一般的に、受容体結合に関与していない傾向があるということである。特に、短いＢ−Ｃループは、全てではないとしても、ほとんどのファミリーメンバーにおいて、受容体結合に対して不可欠でないように見受けられる。この理由のため、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーにおいて本明細書中に記載されているように、Ｂ−Ｃループは、天然にコードされていないアミノ酸で置換され得る。Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（及びＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０様メンバーのＤ−Ｅループ）も、天然に存在しないアミノ酸で置換され得る。ヘリックスＡに対して近位にあり、及び最終ヘリックスに対して遠位にあるアミノ酸も、受容体結合に関与していない傾向があり、天然に存在しないアミノ酸を導入するための部位であり得る。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７個又はこれより多いアミノ酸など（これらに限定されない。）、ループ構造中のあらゆる位置において置換される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていない１つ又はそれ以上のアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７個又はこれより多いアミノ酸内で置換される。
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びβインターフェロンなど（これらに限定されない。）、ＧＨファミリーのある種のメンバーは、Ｎ結合型及び／又はＯ結合型の糖を含有する。タンパク質中のグリコシル化部位は、ほとんど専ら、ループ領域中に存在し、αヘリックスバンドル中には存在しない。ループ領域は、一般に、受容体結合に関与しないので、及びループ領域は、糖基の共有付着のための部位であるので、これらは、天然に存在しないアミノ酸置換をタンパク質中に導入するための有用な部位であり得る。タンパク質中のＮ−結合型及びＯ−結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸は表面に露出されているので、天然に存在しないアミノ酸置換に対する部位であり得る。従って、天然のタンパク質は、これらの部位においてタンパク質に付着された嵩高い糖基を許容することが可能であり、グリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、将来発見される可能性がある。ＧＨスーパー遺伝子の新規メンバーは、予測されるタンパク質配列のコンピュータ補助された二次及び四次構造解析を通じて、並びに特定の標的に結合する分子を同定するように設計された選択技術によって同定することが可能である。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、典型的には、非ヘリックスアミノ酸（ループ領域）によって結合された４つ又は５つの両親媒性ヘリックスを有する。本タンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、それらのＮ末端に疎水性シグナル配列を含有し得る。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのこのような後に発見されるメンバーも、本発明に含まれる。関連出願は、２００５年８月１８日に、ＷＯ０５／０７４６５０号として公開され、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｏｕｒ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｂｕｎｄｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ」と題された国際特許出願である。
従って、成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーの記述は、例示のために及び一例として提供されているものであり、本明細書に記載されている方法、組成物、戦略及び技術の範囲に対して限定されるものではない。さらに、本出願におけるＧＨ及びＩＦＮポリペプチドという表記は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆるメンバーの例として総称を使用することが意図される。従って、ｈＩＦＮポリペプチド又はタンパク質に関して本明細書に記載されている修飾及び化学は、本明細書に具体的に列記されているものを含む、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆるメンバーに対して等しく適用できることが理解される。
ＩＩＩ．本発明とともに使用するための一般的な組み換え核酸方法
本発明の多くの実施形態において、関心のあるｈＩＦＮポリペプチドをコードする核酸を単離し、クローニングし、多くの場合は、組み換え法を用いて変更を施す。以下に限定されないが、タンパク質発現に対して、又はバリアント、誘導体、発現カセットもしくはｈＩＦＮポリペプチド由来のその他の配列の生成中に、このような実施形態を使用する。幾つかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種プロモーターに操作可能に連結させる。ｈＩＦＮの単離及び宿主細胞中でのＩＦＮの産生は、例えば、米国特許第６，４８９，１４４；６，４１０，６９７号；同第６，１５９，７１２号；同第５，９５５，３０７号；同第５，８１４，４８５号；同第５，７１０，０２７号；同第５，５９５，８８８号；同第５，３９１，７１３号；同第５，２４４，６５５号；同第５，１９６，３２３号；同第５，０６６，７８６号；同第４，９６６，８４３号；同第４，８９４，３３０号；同第４，３６４，８６３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
親ポリペプチド（配列番号２（ｈＩＦＮ）に示されているアミノ酸配列を有するが、これらに限定されない。）のアミノ酸配列に基づき、次いで、適切なアミノ酸残基の導入（即ち取り込み又は置換）又は除去（即ち欠失又は置換）が為されるようにヌクレオチド配列を変化させて、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し得る。従来の方法に従い、部位特異的変異誘発法により、ヌクレオチド配列を都合よく修飾し得る。あるいは、以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成装置を用いることによるもの（所望するポリペプチドのアミノ酸配列に基づきオリゴヌクレオチドを設計し、好ましくは、組み換えポリペプチドを産生させる宿主細胞において好適であるコドンを選択する。）を含む化学合成により、ヌクレオチド配列を調製し得る。例えば、所望するポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ、ライゲーション又はライゲーション連鎖反応により組み立て得る。例えば、Ｂａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号（これらを本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
本発明は、遺伝子組み換えの分野での通常の技術を利用する。本発明で役立つ一般的方法を開示する基礎的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
分子生物学技術を記載する一般的教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．ＩｎｃとＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同出版（１９９９まで補充あり。）（「Ａｕｓｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は、変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター及び、以下に限定されないが、非天然アミノ酸、オルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルシンテターゼ及びこれらの組合せなどのタンパク質産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子又はポリヌクレオチドの生成など、多くのその他の関連のある話題を記載している。
様々な目的のために（以下に限定されないが、新規シンテターゼ又はｔＲＮＡの作製、ｔＲＮＡ分子を変異させるため、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作成するため、シンテターゼのライブラリを作製するため、セレクターコドンを作製するため、関心のあるタンパク質又はポリペプチド中に非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するためなど。）、変異誘発法の様々なタイプが本発明において使用される。これらには、以下に限定されないが、部位特異的、ランダム点変異誘発法、相同的組み換え、ＤＮＡシャッフル又はその他の繰り返し用いられる変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを用いた変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発法、ホスホロチオアート修飾されたＤＮＡ変異誘発法、ギャップのある二本鎖ＤＮＡなどを用いた変異誘発法又はそれらの何らかの組合せが含まれる。さらなる適切な方法としては、ポイントミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を用いた変異誘発法、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発法、トータル遺伝子合成による変異誘発法、二本鎖切断修復などが挙げられる。以下に限定されないがキメラ構築物を含むものなどの、変異誘発法もまた本発明に含まれる。一実施形態において、天然に存在する分子又は変更もしくは変異を施された天然に存在する分子の既知の情報（以下に限定されないが配列、配列比較、物理特性、三次又は四次構造、結晶構造などを含む。）により、変異誘発を導くことができる。
本明細書中で見出される教科書及び例は、これらの手段を記載する。さらなる情報は、以下の文献中で引用される次の刊行物及び参考文献において見出すことができる：Ｌｉｎｇら、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．及びＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｕｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら、Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＮｃｉＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら、Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ及びＦｒｉｔｚ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｓｅ／ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋｍａｒ及びＫｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｏｍら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ 「ｓｈｏｔ−ｇｕｎ」ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記の方法の多くにおけるさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１５４巻（これも、様々な変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題に対する有用な対照について述べている。）。で見出すことができる。
例えば、本発明の変異導入（例えば、シンテターゼのライブラリーを変異させ、又はｔＲＮＡを変化させる。）において使用するためのオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えば、「Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：６１５９−６１６８（１９８４）」に記載されているような自動化された合成装置を用いて、「Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２，（１９８１）」によって記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成される。
本発明はまた、真核宿主細胞、非真核宿主細胞及びオルソゴナルｔＲＮＡ／ＲＳペアを介した非天然アミノ酸のインビボ取り込みのための生物に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は、以下に限定されないが本発明のベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。）などの、本発明のポリヌクレオチドを含む構築物を用いて遺伝子操作（以下に限定されないが、形質転換、形質導入又は形質移入など。）されている。例えば、オルソゴナルｔＲＮＡに対するコード領域、オルソゴナルｔＲＮＡシンテターゼ及び誘導体化されるべきタンパク質は、所望の宿主細胞中で機能的である遺伝子発現調節要素に作用可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、微生物、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又は結合されたポリヌクレオチドの形態であり得る。電気穿孔（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子のマトリクス内又は表面上の何れかに核酸を有する小粒子による高速弾丸貫入（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７））などを含む標準的方法により、細胞及び／又は微生物中にベクターを導入する。
例えば、スクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞の選択などの作業に対して適切なように改変された従来の栄養培地中で、工作された宿主細胞を培養することができる。これらの細胞は、場合によっては、トランスジェニック生物中で培養することができる。その他の有用な参考文献としては（以下に限定されないが細胞単離及び培養に関する（例えば続く核酸単離に関する）ものなどを含む。）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそこで引用されている文献；Ｐａｙｎｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ならびに、Ａｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．が挙げられる。
標的核酸を細胞に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、そのいずれも本発明で使用することができる。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの受容細胞の融合、電気穿孔、発射体射撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）及びウイルスベクターによる感染（下記でさらに述べる。）などが含まれる。細菌細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅するために使用することが可能である。対数増殖期まで細菌を増殖させ、細菌内のプラスミドを当技術分野で公知の様々な方法により単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）。さらに、細菌からのプラスミド精製のために、キットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＴＭ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ、何れもＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈより；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ；及びＱｉａｇｅｎからＱＩＡｐｒｅｐＴＭ）。次に、単離され精製されたプラスミドをさらに工作して、他のプラスミドを生成させ、細胞を形質移入するか、又は生物に感染させるために関連ベクターに組み込むために使用する。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、場合によっては、少なくとも１個の独立したターミネーター配列、真核もしくは原核生物又は両方においてカセットの複製を可能にする配列（以下に限定されないが、シャトルベクターを含む。）及び原核生物及び真核細胞系両方に対する選択マーカーを含有する一般的発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞又は好ましくはこの両方での複製及び組み込みに適切である。Ｇｉｌｉｍａｎ及びＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６（１）１０−１４：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（全て先述）を参照のこと。クローニングに有用な、細菌及びバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより与えられている（例えば、Ｔｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）、ＡＴＣＣにより出版。）。配列決定、クローニング及び分子生物学のその他の態様に対するさらなる基本的手段ならびに基礎となる理論的考察はまた、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ 第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹで見出すことができる。さらに、基本的にあらゆる核酸（及び標準的又は非標準的であれ、実際にはあらゆる標識された核酸）を、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、ｍｃｒｃ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで利用可能。）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで利用可能。）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで利用可能。）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及びその他の多くの業者などの、あらゆる様々な市販ソースから特別注文又は通常注文することができる。
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを広げる。例えば、セレクターコドンには、以下に限定されないが、ユニークな３個の塩基コドン、ナンセンスコドン、例えば、停止コドン（以下に限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン又はオパールコドン（ＵＧＡ）などを含む。）、非天然コドン、４又はそれ以上の塩基コドン、レアコドンなどが含まれる。当業者にとって当然のことながら、少なくともｈＩＦＮポリペプチドの一部をコードする１つのポリヌクレオチド中に、以下に限定されないが、１つ又はそれ以上、２又はそれ以上、３又はそれ以上、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上など、所望する遺伝子又はポリヌクレオチド中に導入することができる、セレクターコドンの様々な数が存在する。
ある実施形態において、本方法は、インビボで１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を取り込むための停止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、以下に限定されないが、ＵＡＧを含む停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、所望する非天然アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによりアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。以下に限定されないがＴＡＧを含む停止コドンを関心のあるポリペプチドの関心のある部位に導入するために、従来の部位特異的変異誘発法を使用することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９８８）、５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７９１−８０２を参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び関心のあるポリヌクレオチドをコードする核酸をインビボで組み合せる場合、非天然アミノ酸をＵＡＧコドンに反応して取り込ませ、特定の位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを与える。
真核宿主細胞を顕著に撹乱することなく、インビボでの非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（以下に限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含む。）と真核放出因子（以下に限定されないが、ｅＲＦを含む。）（これは、停止コドンに結合し、リボソームからの成長しているペプチドの放出を開始させる。）との間の競合に依存するので、以下に限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを向上させることなどにより、抑制効率を調節することができる。
非天然アミノ酸は、レアコドンによってもコードされ得る。例えば、インビトロタンパク質合成反応において、アルギニン濃度が減少すると、稀なアルギニンコドンＡＧＧは、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによって、Ａｌａを挿入するのに効率的であることが判明している。例えば、「Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：７９３９（１９９３）」を参照のこと。この場合、合成ｔＲＮＡは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で微少な種として存在する、天然のｔＲＮＡ Ａｒｇと競合する。幾つかの生物は、全てのトリプレットコドンを使用するとは限らない。ミクロコッカス・ルテウス中の割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロ転写／翻訳抽出物中にアミノ酸を挿入するために使用されている。例えば、「Ｋｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．， ２５：４６８５（１９９７）」を参照のこと。本発明の成分は、これらのレアコドンをインビボで使用するために生成することができる。
セレクターコドンはまた、延長したコドン（以下に限定されないが、４又はそれ以上の塩基コドン、例えば、４、５、６又はそれ以上の塩基コドンを含む。）も含有する。４塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５個の塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特性には、フレームシフト抑制に基づく、延長されたコドンを用いることが含まれる。４又はそれ以上の塩基コドンは、以下に限定されないが１又は複数の非天然アミノ酸などを同じタンパク質に挿入することができる。例えば、以下に限定されないがアンチコドンループ（例えば少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループ）を有する特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含む、変異されたＯ−ｔＲＮＡの存在下で、４又はそれ以上の塩基コドンを１個のアミノ酸として読む。他の実施形態において、以下に限定されないが、少なくとも４塩基のコドン、少なくとも５塩基のコドン又は少なくとも６塩基以上のコドンなどの、アンチコドンループを解読できる。２５６個の可能な四塩基コドンが存在するので、４又はそれ以上の塩基コドンを用いて、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ 「Ｓｈｉｆｔｙ」Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９を参照のこと。
例えば、インビトロ生合成法を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、四塩基コドンが使用されてきた。例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９；及びＨｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：３４を参照のこと。ＣＧＧＧ及びＡＧＧＵを使用して、２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロでストレプトアビジンに２−ナフチルアラニン及びリジンのＮＢＤ誘導体を同時に取り込ませた。例えば、Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１２１９４を参照のこと。インビボ実験において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＵＣＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ Ｌｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドンを抑制する能力を調べ（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る。）、０又は−１フレームでの解読がほとんどなく、１３％から２６％の効率で、クアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）ＵＡＧＡが、ＵＣＵＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ Ｌｅｕにより解読され得ることが分かった。Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５を参照のこと。ある実施形態において、本発明にて、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく延長コドンを使用することができ、他の不必要な部位で、ミスセンス、リードスルー及びフレームシフト抑制を減少させることができる。
ある一定の系に対して、セレクターコドンはまた、天然の３塩基コドンのうち１個を含み得、内在性の系は、天然塩基コドンを使用しない（又は稀にしか使用しない。）。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いている系及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
セレクターコドンは、場合によっては、非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対はさらに、既存の遺伝子アルファベットを拡張する。１つの余分な塩基対により、６４から１２５にトリプレットコドン数が増加する。第三の塩基対の特性には、安定で、選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる、ＤＮＡへの高忠実度の効率的な酵素的取り込み及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な連続したプライマー伸長が含まれる。方法及び組成物に対して適応させることができる非天然塩基対の記述としては、例えば、「Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２」が挙げられる。「Ｗｕ，Ｙ．， ｅｔ ａ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連する刊行物は、下記に列記されている。
インビボ利用の場合、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応するトリホスファートを形成する。さらに、増加した遺伝情報は安定であり、細胞性酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒら及びその他による以前の研究は、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋペアにおけるものとは異なる水素結合パターンを利用しており、最も価値ある例は、ｉｓｏ−Ｃ：ｉｓｏ−Ｇペアである。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２を参照のこと。これらの塩基は通常、ある程度天然塩基と誤対合し、酵素的に複製することはできない。Ｋｏｏｌ及び共同研究者らは、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合を置換して、塩基対の形成を推進できることを明らかにした。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ及びＫｏｏｌ、（１９９８）ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６，２８２５を参照のこと。上記の要求全てを満足させる非天然塩基対を開発する目的で、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ及び共同研究者らは、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、研究を行った。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対合が、天然塩基対よりも安定で、Ｅ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のＫｌｅｎｏｗ断片により、ＤＮＡに効率的に取り込まれ得ることが分かっている。例えば、ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：３２７４を参照のこと。ＫＦにより、生物機能に十分効率的かつ選択的に、３ＭＮ：３ＭＮ自己対合を合成することができる。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：８８０３を参照のこと。しかし、両塩基とも、さらなる複製に対して連鎖停止剤として作用する。変異ＤＮＡポリメラーゼは最近、ＰＩＣＳ自己対合を複製するために使用できることが分かった。さらに、７ＡＩ対合を複製することができる。例えば、Ｔａｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １２３：７４３９を参照されたい。Ｃｕ（ＩＩ）を結合した際に安定なペアを形成する、新規メタロ塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙもまた開発されている。Ｍｅｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：１０７１４を参照のこと。延長コドン及び非天然コドンは、天然コドンに対して本質的にオルソゴナルなので、本発明の方法は、それらに対するオルソゴナルｔＲＮＡを生成させるためにこの特性の長所を利用することができる。
所望するポリペプチド中に非天然アミノ酸を取り込むために、翻訳回避系を使用することもできる。翻訳回避系では、大きな配列を遺伝子中に取り込むが、タンパク質に翻訳されない。この配列は、リボソームがその配列を跳び越すよう誘発し、挿入の下流で翻訳を開始するきっかけとして働く構造を含有する。
ある一定の実施形態において、本発明の方法及び／又は組成物における、関心のあるタンパク質又はポリペプチド（又はその一部）が核酸によりコードされる。典型的には、核酸は、少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個又はそれ以上のセレクターコドンを含有する。
当業者にとって周知であり、本明細書中に記載の方法を用いて、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子に対して変異誘発を行い、例えば、非天然アミノ酸の取り込みのための１つ又はそれ以上のセレクターコドンを含むようにすることができる。例えば、関心のあるタンパク質に対する核酸に対して変異誘発を行い、１又は複数のセレクターコドンを含むようにし、それにより１又は複数の非天然アミノ酸が取り込まれるようにする。本発明は、あらゆるこのようなバリアント（以下に限定されないが、変異体、例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むあらゆるタンパク質の型など）を含む。同様に、本発明はまた、対応する核酸、即ち、１又は複数の非天然アミノ酸をコードする１又は複数のセレクターコドンを有する何らかの核酸も含む。
ｈＩＦＮポリペプチドなどの目的タンパク質をコードする核酸分子に対して容易に変異誘発を行い、ポリペプチドの何れかの所望の位置にシステインを導入し得る。反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質又は多岐にわたるその他の分子を関心のあるタンパク質に導入するために、システインは広く使用されている。ポリペプチドの所望の位置にシステインを取り込むのに適切な方法は、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により本明細書中に組み込む。）に記載のもの及び標準的変異誘発技術など、当業者に周知である。
ＩＶ．天然にコードされていないアミノ酸
非常に多岐にわたる天然にコードされていないアミノ酸が本発明における使用に適切である。天然にコードされていないアミノ酸のあらゆる数を、ｈＩＦＮポリペプチド中に導入することができる。一般に、導入された天然にコードされていないアミノ酸は、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸（即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）に対して実質的に化学的に不活性である。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、効率的かつ選択的に２０種類の一般的なアミノ酸では見られない官能基（以下に限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基など）と反応し、安定な結合体を形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、ポリマー（以下に限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、あるいは、アルキン部分を含有する第二のポリペプチドを含む。）と反応し、アジド及びアルキン官能基の選択的反応を引き起こす安定な結合体を形成し、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物を形成することができる。
α−アミノ酸の一般構造を以下に示す（式Ｉ）：
Figure 2008541769
天然にコードされていないアミノ酸は、典型的には、上記で挙げた式（式中、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸で使用されるもの以外の何らかの置換基であり、本発明での使用に適切であり得る。）を有するあらゆる構造である。本発明の天然にコードされていないアミノ酸は、典型的には、側鎖の構造のみが天然アミノ酸と異なるので、天然にコードされていないアミノ酸は、天然に存在するポリペプチドにおいてアミド結合が形成されるのと同様にして、以下に限定されないが天然又は天然にコードされていないのものを含む他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかし、天然にコードされていないアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、場合によっては、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など又はこれらのあらゆる組合せを含む。本発明での使用に適切であり得る関心のあるその他の天然に存在しないアミノ酸には、以下に限定されないが、光活性化可能な架橋を含むアミノ酸、回転脱水標識されたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有又は非共有相互作用するアミノ酸、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換されたセリンなどグリコシル化されたアミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換されたアミノ酸、化学切断可能及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長された側鎖を有するアミノ酸（以下に限定されないが、ポリエーテル又は、約５を超える、又は約１０炭素を超える（これらに限定されない。）長鎖炭化水素など）、炭素結合された糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１又は複数の毒性部分を含むアミノ酸が含まれる。
本発明における使用に適切であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である天然にコードされていないアミノ酸の例としては、以下に限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド及びアルキン反応基を有するものが挙げられる。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、糖部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸と糖との間の天然に存在するＮ−又はＯ−結合が、一般に天然では見られない共有結合（以下に限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含む。）により置換されている例が挙げられる。このようなアミノ酸の例としてはまた、天然に存在するタンパク質では一般に見られない糖、例えば、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどが挙げられる。
本明細書中で与えられる天然にコードされていないアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓの部門、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。場合によっては、本明細書中で与えるように、又は当業者にとって公知の標準的方法を用いて、市販されていないものを合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。また、米国特許７，０４５，３３７号及び２００３／０１０８８８５（参照により本明細書中に組み込む。）も参照のこと。新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸もまた、場合によっては、以下に限定されないが、式ＩＩ及びＩＩＩの構造で示されるような修飾された骨格構造を含む。
Figure 2008541769
 （式中、Ｚは、典型的には、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み；Ｘ及びＹは、同じ又は異なり得、典型的には、Ｓ又はＯを含み、並びにＲ及びＲ’は、場合によっては同じ又は異なり、典型的には、式Ｉを有する非天然アミノ酸に対して上記Ｒ基に対する構成成分の同じ一覧ならびに水素から選択される。）。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、場合によっては、式ＩＩ及びＩＩＩにより示されるように、アミノ又はカルボキシル基中に置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸には、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシラートが含まれ、以下に限定されないが、一般的な２０種類の天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖などを有する。さらに、α炭素における置換には、場合によっては、以下に限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などの、Ｌ、Ｄ又はα−α−２置換アミノ酸が含まれる。他の構造的代替物には、プロリン類似体ならびに、３、４、６、７、８及び９員環のプロリン類似体などの環状アミノ酸、置換されたβ−アラニン及びγ−アミノ酪酸などのβ及びγアミノ酸が含まれる。
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づいており、本発明での使用に適切である。チロシン類似体としては、以下に限定されないが、パラ−置換されたチロシン、オルト−置換されたチロシン及びメタ置換されたチロシンが挙げられ、置換されたチロシンとしては、以下に限定されないが、ケト基（以下に限定されないが、アセチル基など）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖もしくは分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などが挙げられる。さらに、多置換されたアリール環も想定される。本発明での使用に適切であり得るグルタミン類似体としては、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換された誘導体、環状誘導体及びアミド置換されたグルタミン誘導体が挙げられる。本発明での使用に適切であり得るフェニルアラニン類似体の例としては、以下に限定されないが、パラ−置換されたフェニルアラニン、オルト−置換されたフェニルアラニン及びメタ−置換されたフェニルアラニンが挙げられ、置換基としては、以下に限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（以下に限定されないがアセチル基を含む。）、ベンゾイル、アルキニル基などが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸の具体例としては、以下に限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化されたフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニ、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」と題されたＷＯ２００２／０８５９２３に記載されている。また、さらなるメチオニン類似体について、Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ ９９：１９−２４（参照により、本明細書中に組み込まれる。）も参照のこと。
ある実施形態において、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンなど）を含むｈＩＦＮポリペプチドの組成物が提供される。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン及び、以下に限定されないが、タンパク質及び／又は細胞などを含む様々な組成物も提供される。ある態様において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、さらにオルソゴナルｔＲＮＡを含む。以下に限定されないが、オルソゴナルｔＲＮＡに対してアミノアシル結合を介して共有結合で、オルソゴナルｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに対して共有結合で、など、オルソゴナルｔＲＮＡに非天然アミノ酸を（以下に限定されないが、共有結合により）結合させることができる。
タンパク質に取り込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分は、様々な長所を提供し、タンパク質の様々な工作が可能となる。例えば、ケト官能基はユニークな反応性を有するので、これによりヒドラジン−又はヒドロキシルアミン含有試薬のあらゆる数を用いて、タンパク質をインビトロ及びインビボで選択的に修飾することができるようになる。重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データを位相整合するのに有用であり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的導入によっても、重原子の位置を選択的かつ柔軟に選択できる。光反応性非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ベンゾフェノン及びアリールアジド（以下に限定されないがフェニルアジドなど）側鎖を有するアミノ酸など）により、例えば、タンパク質の効率的なインビボ及びインビトロ光架橋連結が可能になる。光反応性非天然アミノ酸の例としては、以下に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。次に、光反応基を与える時間的制御の励起により、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を随意に架橋することができる。一つの例において、以下に限定されないが、核磁気共鳴及び振動分光法などを使用した、局所構造及びダイナミクスのプローブとして、同位体標識したもの（以下に限定されないがメチル基など）で、非天然アミノのメチル基を置換することができる。アルキニル又はアジド官能基により、例えば、［３＋２］付加環化反応を介して、分子を用いてタンパク質を選択的に修飾できるようになる。
アミノ末端でポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸において使用されるもの以外の何れかの置換基であるＲ基及び、α−アミノ酸に通常存在するＮＨ２基とは異なる第二の反応性基から構成され得る（式Ｉ参照。）。同様の非天然アミノ酸を、α−アミノ酸に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第二の反応性基とともに、カルボキシル末端で取り込むことができる（式Ｉ参照。）。
本発明の非天然アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸で利用できないさらなる特徴を提供するように選択又は設計され得る。例えば、非天然アミノ酸は、例えば、その中にそれらが取り込まれるタンパク質の生物学的特性を修飾するように、場合によって設計又は選択され得る。例えば、タンパク質中に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性：毒性、生体内分布、溶解度、安定性、例えば、熱的安定性、加水分解安定性、酸化的安定性、酵素分解に対する耐性など、精製及び加工の促進、構造特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒活性、酸化還元電位、半減期、（例えば、共有又は非共有的に）他の分子と反応する能力などを場合により修飾し得る。
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適切な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）又はＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書中で与えるようにして、又は様々な刊行物で与えるようにして、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、場合によっては合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について述べているさらなる刊行物としては、例えばＷＯ２００２／０８５９２３（題名「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」；Ｍａｔｓｕｏｋａら、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．及びＫｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．及びＣｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．及びＦｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１２３９−１２４６；Ｂａｒｔｏｎら、（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら、（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。また、米国特許公開、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ」と題された米国特許公開（参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照のこと。
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、特に求核付加又はアルドール縮合反応を介して分子（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性分子など。）を連結するための様々な反応が可能となる。
典型的なカルボニル含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、及びＲ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、及びＲ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、及びケトン部分がアルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（参照により、本明細書中に組み込む。）。当業者は、その他のカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を含有するポリペプチドを化学的に修飾して、反応性カルボニル官能基を生じさせる。例えば、隣接アミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から、結合反応に有用なアルデヒド官能基を生じさせることができる。生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリン又はスレオニン（通常存在するか、又は化学的もしくは酵素的消化により曝露され得る。）を使用し、過ヨウ素酸を用いて穏やかな酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能基を生じさせることができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）を参照のこと。しかし、当技術分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定されている。
本発明において、隣接ヒドロキシル及びアミノ基を有する天然にコードされていないアミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチドに取り込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成させるための反応条件は、典型的には、ポリペプチド内の他の部位で酸化を避けるために穏やかな条件下でメタ過ヨウ素酸ナトリウムのモル過剰を添加することを含む。酸化反応のｐＨは、典型的には、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム約１．５モル濃度過剰量を添加し、続いて、暗所で約１０分間温置することを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
水溶液中で、穏やかな条件下にて、カルボニル官能基を選択的にヒドラジン−、ヒドラジド−、ヒドロキシルアミン−又はセミカルバジド含有物質と反応させて、生理的条件下で安定な、対応するヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾン結合をそれぞれ形成させることができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。さらに、カルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾が可能となる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照のこと。
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド反応基
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドなどの求核基を含有する天然にコードされていないアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性ポリマーを用いたものなど）結合体を形成させるための様々な求電子基との反応が可能となる。
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド含有アミノ酸の例は、以下のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキルもしくは置換されたアリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであり、又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
幾つかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１存在せず、及びＸはＮである。幾つかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、及びＸは存在しない。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、及び酸素原子は、アリール環上のアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）基に対してパラ位にある。
ヒドラジド−、ヒドラジン−及びセミカルバジド含有アミノ酸が市販されている。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製することが可能である。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド官能基を有する天然にコードされていないアミノ酸を含有するポリペプチドを効率的かつ選択的に反応させることができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｒｎ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジド官能基のユニークな反応性により、２０種類の一般的アミノ酸上に存在する求核基（以下に限定されないが、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基又はリジン及びＮ末端のアミノ基を含む。）と比較して、アルデヒド、ケトン及びその他の求電子基に対するそれらの反応性が顕著に高くなる。
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる。）基を含有する天然にコードされていないアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧはその他の水溶性ポリマーなどとの）結合体を形成するための、様々な求電子基との反応が可能となる。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジドのように、アミノオキシ基の求核性が高まることにより、アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応できるようになる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｒｎ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８３９−３８９９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｎｇ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）を参照のこと。しかし、ヒドラジン基との反応により生じるものが対応するヒドラゾンである一方、オキシムは、通常、ケトンなどのカルボニル含有基とアミノオキシ基との反応に由来するものである。
典型的なアミノオキシ基含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であり又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、及びＹは存在する。幾つかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０であり、並びにＹは存在しない。
容易に入手できるアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン及びスレオニン）からアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ及びＲ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）を参照。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸などのある一定のアミノオキシ含有アミノ酸が天然源から単離された（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．ら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０：１６３５−１６４１（１９９７）。当業者は、その他のアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。
Ｄ．アジド及びアルキン反応基
アジド及びアルキン官能基のユニークな反応性により、ポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾にこれらの官能基が非常に有用となる。有機アジド、特にアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）アジド及びアルキンは、一般に、通常の反応化学状態に対して安定である。特に、アジド及びアルキン官能基の両者とも、天然に存在するポリペプチドで見られる２０種類の一般的アミノ酸の側鎖（即ちＲ基）に対して不活性である。しかし、近接近させた場合、アジド及びアルキン基の「バネ仕掛け」のような性質が現れ、それらは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応し、対応するトリアゾールを生成させる。例えば、Ｃｈｉｎ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）を参照のこと。
Ｈｕｉｓｇｅｎの付加環化反応は、求核置換ではなく、選択的付加環化反応を含むので（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｖｏｌ．４，（Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，ら編、１９９１）、ｐ．１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−ＤｉＰＯＬＡＲ ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｐａｄｗａ，Ａ．編、１９８４）、ｐ．１−１７６）、アジド及びアルキン含有側鎖を有する天然にコードされていないアミノ酸の取り込みによって、生じるポリペプチドが天然にコードされていないアミノ酸の位置で選択的に修飾を受けることができるようになる。アジド又はアルキン含有ｈＩＦＮポリペプチドを含む付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で、インシトゥ、触媒量で、Ｃｕ（ＩＩ）（以下に限定されないが、ＣｕＳＯ４の触媒量の形態など）を添加することにより、室温にて、水性条件下で行うことができる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）を参照のこと。典型的な還元剤としては、以下に限定されないが、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋及び加電圧などが挙げられる。
ある場合においては、アジドとアルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が所望とされる場合、ｈＩＦＮポリペプチドは、アルキン部分を含有する天然にコードされていないアミノ酸を含み、アミノ酸に付着させる水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。あるいは、逆の反応を行うこともできる（即ち、アミノ酸上のアジド部分及び水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分を用いる。）。
アリールエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーとアジド官能基とを選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンが隣接するエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成させる。例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、２００７−２０１０（２０００）を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（以下に限定されないが、２−アミノ−６−アジド−Ｌ−ヘキサン酸を含む。）又はアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）の何れかであり得る。
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーの例は、次のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリール基であり得る。）。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。）本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、それらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３が含まれるが、これらに限定されない。）など、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できるであろう。
チオエステルを含有し、及びアリールホスフィン部分で適切に官能化されている水溶性ポリマーとアジド官能基を選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンがチオエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成させる。チオエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーは、次のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、ｎは１から１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、及びＷは、水溶性ポリマーである。）。
典型的なアルキン含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキルもしくは置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであり、又は存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、及びアセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり；ＸはＯであり、ｍは１であり、及びプロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する（すなわち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１及びＸは存在せず、並びにｍは０である（即ち、プロパリルグリシン）。
アルキン含有アミノ酸は市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸を標準的方法に従い調製することができる。例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）に記載のようにして、例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを合成することができ、Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）に記載のようにして、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンを合成することができる。当業者は、その他のアルキン含有アミノ酸を調製することができる。
典型的なアジド含有アミノ酸は、次のように表すことができる。
Figure 2008541769
 （式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、及びアジド部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施形態において、ｎは０から４であり、並びにＲ１及びＸは存在せず、及びｍ＝０である。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、及びβ−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
アジド含有アミノ酸は市販されている。例えば、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）から４−アジドフェニルアラニンを入手することができる。市販されていないアジド含有アミノの場合、以下に限定されないが、適切な脱離基（以下に限定されないが、ハロゲン化物、メシラート、トシラートなど。）の置換を介するか、又は適切に保護化ラクトンの開環を介するなど、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、比較的容易にアジド基を調製することができる。例えば、ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
Ｅ．アミノチオール反応基
β−置換されたアミノチオール官能基のユニークな反応性により、チアゾリジンの形成を介した、ポリペプチド及びアルデヒド基を含有する他の生物分子の選択的修飾に、これらの官能基が非常に有用となる。例えば、Ｊ．Ｓｈａｏ及びＪ．Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８３９−３８９９を参照のこと。幾つかの実施形態において、β−置換されたアミノチオールアミノ酸をｈＩＦＮポリペプチド中に取り込み、次いで、アルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応させることができる。幾つかの実施形態において、チアゾリジンの形成を介して、水溶性ポリマー、薬物結合体又はその他のペイロードをβ−置換されたアミノチオールアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドに結合させることができる。
非天然アミノ酸の細胞性取り込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは、以下に限定されないが、タンパク質への取り込みなど、非天然アミノ酸を設計し選択する際に通常考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の電荷密度は高いので、これらの化合物は細胞透過性である可能性は少ないことが示唆される。天然アミノ酸は、タンパク質を利用した輸送系の回収を介して真核細胞に取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞により取り込まれるかを評価するスクリーニングを迅速に行うことができる。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ」と題された米国特許公開２００４／０１９８６３７号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）における毒性アッセイ；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ９６：４７８０−４７８５を参照のこと。取り込みは様々なアッセイを用いて容易に分析できるが、細胞への取り込み経路に適した非天然アミノ酸の設計に対する代替手段は、インビボでアミノ酸を生成させるために生合成経路を与えることである。
非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸及び他の化合物の産生に対して、多くの生合成経路が細胞において既に存在する。特定の非天然アミノ酸に対する生合成法が天然には（以下に限定されないが、細胞においてなど）存在し得ないが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、新しい酵素を添加するか、又は既存の宿主経路を改変することにより、場合によっては非天然アミノ酸に対する生合成経路を宿主細胞において生じさせる。さらなる新しい酵素は、場合によっては天然に存在する酵素又は人工的に生じさせた酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（ＷＯ２００２／０８５９２３、題名「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」における実施例で与えられるように。）は、他の生物からの既知の酵素の組合せの添加に依存する。これらの酵素に対する遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞の形質転換を行うことによって、これらの酵素に対する遺伝子を真核細胞中に導入することができる。細胞中で発現させる場合、遺伝子は、所望する化合物を合成するための酵素的経路を与える。場合によっては添加される酵素のこのタイプの例は、下記の実施例で与える。例えばＧｅｎｂａｎｋにおいて、さらなる酵素の配列が記載されている。人工的に生じさせた酵素もまた、場合によっては同様に細胞中に添加される。このようにして、細胞の機構及び細胞のリソースを操作して非天然アミノ酸を産生させる。
生合成経路での使用のための、又は既存経路を進化させるための新規酵素を産生させるために、様々な方法を利用できる。例えば、以下に限定されないが、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能）により開発されたものなど、繰り返して用いられる組み換えを場合によっては使用して、新規酵素及び経路を開発する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１を参照のこと。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈＴＭを、場合によっては、以下に限定されないが、細胞中にＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生成させるために経路を操作することなど、代謝経路操作のために使用する。この技術により、以下に限定されないが機能的ゲノム科学並びに分子進化及び設計などにより同定されたものなどの新しい遺伝子及び組合せを用いて、宿主生物において既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能）もまた、以下に限定されないが新しい経路を作るためなど、遺伝子ライブラリ及び遺伝子経路の迅速なスクリーニングのための技術を提供する。
典型的には、操作を行った本発明の生合成経路を用いて産生される非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質生合成に十分な濃度（以下に限定されないが、天然の細胞量など）であるが、他のアミノ酸の濃度に影響を与えない、又は細胞リソースを枯渇させない程度に産生される。このようにしてインビボで産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路対して所望される酵素を産生させるのに使用される遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞を形質転換し、非天然アミノ酸が生成されたら、リボソームタンパク質合成及び細胞増殖の両方に対して非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、インビボ選択を場合によっては使用する。
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
以下に限定されないが、タンパク質構造及び／又は機能の変化の適合化、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分（以下に限定されないが、タンパク質アレイに対してなど）への標的化、生物活性分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透性の調節（例えば腫瘍）、能動輸送の調節、組織、細胞又は臓器特異性又は分布の調節（例えば、肝臓）、免疫原性の調節、プロテアーゼ耐性の調節など、様々な目的で非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。シグナル伝達の変化は、ｈＩＦＮの部位特異的ＰＥＧ化を通じて達成し得る。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された特性、又は完全に新しい触媒若しくは生物物理学的特性を有することが可能である。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性を場合によっては変更する：毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒能、半減期（以下に限定されないが、血清半減期など）、他の分子との反応能（以下に限定されないが、共有又は非共有的な反応など）など。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（以下に限定されないが、抗体など）及び、以下に限定されないが、タンパク質構造及び機能の研究などに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２を参照のこと。
本発明の一態様において、組成物は、少なくとも１個の、以下に限定されないが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０若しくはそれ以上などの、非天然アミノ酸を有する少なくとも１個のタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然のアミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能であるなど（これに限定されない。）、同一又は別異とすることが可能である。別の態様において、組成物は、少なくとも１個の、しかし、総数より少ない、タンパク質に存在する特定のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。２以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得る（以下に限定されないが、タンパク質は、非天然アミノ酸の２つ又はそれ以上の異なる型を含むか、又は同じ非天然アミノ酸２個を含み得る。）。３以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じもの、異なるもの、又は、同じ種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の異なる非天然アミノ酸との組合せであり得る。
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドは、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物及び方法を用いて産生された少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する、ポリペプチド又はタンパク質も含む。賦形剤（以下に限定されないが、医薬として許容される賦形剤を含む。）もまた、タンパク質とともに存在し得る。
真核生物細胞中で、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドを生産することによって、タンパク質又はポリペプチドは、典型的には、真核生物の翻訳後修飾を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１個の非天然アミノ酸及び真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、原核生物細胞によっては行われない。例えば、翻訳後修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある態様において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（以下に限定されないが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）など）のアスパラギンへの結合を含む。真核生物タンパク質のＮ結合型オリゴ糖の幾つかの例を列挙する表１を参照（図示されていないさらなる残基も存在し得る。）別の態様において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン若しくはＧａｌＮＡｃ−スレオニン結合による、又はＧｌｃＮＡｃ−セリン若しくはＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む。）の、セリン又はスレオニンへの結合を含む。
Figure 2008541769
さらに別の態様において、翻訳後修飾は、前駆体（カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインシュリン、プロインシュリン、プレプロオピオメラノコルチン、プロ−オピオメラノコルチンなどが含まれるが、これらに限定されない。）のタンパク質分解プロセシング、マルチサブユニットタンパク質へのアセンブリーもしくは巨大分子アセンブリー、細胞の別の部位（以下に限定されないが、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官へ、又は分泌経路を通じて、などを含む。）への変換を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。米国特許第４，９６３，４９５号及び第６，４３６，６７４号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、ｈＧＨポリペプチドの分泌を改善するように設計された構築物を詳述している。
非天然アミノ酸の１つの長所は、これが、さらなる分子を付加するために使用できるさらなる化学部分を与えることである。真核又は非真核細胞においてインビボで、又はインビトロで、これらの修飾を行い得る。したがって、ある一定の実施形態において、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸によるものである。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾のために現在使用されている殆どの反応は、以下に限定されないが、ヒスチジン又はシステイン側鎖とのα−ハロケトンの反応など、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間での共有結合形成を含む。これらの事例での選択性は、タンパク質中の求核残基の数及び接近可能性により決定される。本発明のタンパク質において、非天然ケト−アミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物とのインビトロ及びインビボでの反応など、より選択的な他の反応を使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７を参照のこと（これらは全て、参照により、本明細書に組み込まれる。）。これにより、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体及び細胞毒性分子を含む多数の試薬による、事実上あらゆるタンパク質の選択的標識が可能となる。「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題された米国特許第６，９２７，０４２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）も参照されたい。アジドアミノ酸を通じた（これを含むが、これに限定されない。）翻訳後修飾は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結（トリアリールホスフィン試薬を用いることを含むが、これに限定されない。）を通じて行うことも可能である。例えば、「Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ， ＰＮＡＳ ９９：１９−２４」を参照されたい。
本発明は、タンパク質の選択的修飾のための別の高効率の方法を提供するが、この方法は、以下に限定されないが、セレクターコドンに反応してアジド又はアルキニル部分をタンパク質に含有させるなど、非天然アミノ酸の遺伝的取り込みを含む。次に、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）Ｐａｄｗａ，Ａ．編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６を参照。）などにより、以下に限定されないが、アルキニル又はアジド誘導体などをそれぞれ用いて、これらのアミノ酸側鎖を修飾することができる。この方法は、求核置換ではなく付加環化を含むので、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することにより、優れた位置選択性（１，４＞１，５）で、水性条件下、室温にてこの反応を行うことができる。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈａｍ．６７：３０５７−３０６４； ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１ ：２５９６−２５９９」を参照されたい。使用できる別の方法は、テトラシステインモチーフを用いた、ビスヒ素化合物における配位子交換である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２を参照のこと。）。
［３＋２］付加環化を通じて本発明のタンパク質に付加され得る分子には、アジド又はアルキニル誘導体を有する実質的にあらゆる分子が含まれる。分子には、以下に限定されないが、色素、蛍光、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（以下に限定されないが、ポリエチレングリコールの誘導体など）、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、レジン、ビーズ、第二のタンパク質又はポリペプチド（又はさらなるもの。）、ポリヌクレオチド（以下に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物などが含まれる。これらの分子は、アルキニル基を有する非天然アミノ酸（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンが含まれるが、これに限定されない。）又はアジド基を有する非天然アミノ酸（それぞれ、ｐ−アジド−フェニルアラニンが含まれるが、これに限定されない。）に付加することが可能である。
Ｖ．遺伝的にコードされないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドのインビボ生成
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、天然に存在する系ではコードされていないアミノ酸を付加し、又は置換するために修飾されたｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを用いて、インビボで生成することが可能である。
天然に存在する系でコードされていないアミノ酸を使用する、ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを生成させるための方法は、例えば、米国特許第７，０４５，３３７号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（これらを参照により本明細書中に組み込む。）で述べられている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性である、シンテターゼ及びｔＲＮＡとは独立に機能する（したがって、「オルソゴナル」と呼ばれることがある。）翻訳機構を生成させることを含む。通例、この翻訳系は、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。通例、Ｏ−ＲＳは、この翻訳系中に少なくとも１個の天然に存在しないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、この系において他のｔＲＮＡにより認識されない少なくとも１個のセレクターコドンを認識する。したがって、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、この系で産生されたタンパク質に天然にコードされていないアミノ酸を挿入し、それにより、コードされたポリペプチドの位置においてアミノ酸を「置換」する。
特定の合成アミノ酸をポリペプチド中に挿入するために、多岐にわたるオルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが当技術分野で述べられており、これらは一般に本発明での使用に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、Ｗａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）で述べられている。代表的なＯ−ＲＳ又はその一部はポリヌクレオチド配列によりコードされ、米国特許第７，０４５，３３７号及び２００３／０１０８８８５号（それぞれ、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されているアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子もまた、米国特許第７，０４５，３３７号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ系の例は、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅに対するＯ−ＲＳ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に開示されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１４から１６及び２９から３２、並びにアミノ酸配列、配列番号：４６から４８及び６１から６４が挙げられる。本発明での使用に適切なＯ−ｔＲＮＡ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に開示されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１から３が挙げられる。特定の天然にコードされていないアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルＬ−ｔＲＮＡシンテターゼペアのその他の例は、米国特許第７，０４５，３３７号（第１０／１２６，９２７号）（参照により本明細書中に組み込む。）で記載されている。Ｓ．セレビシエにおいてケト及びアジド含有アミノ酸の両方を取り込む、Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
幾つかの他のオルソゴナル対が報告されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中への非天然アミノ酸の取り込みの可能性に関して、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｔＲＮＡに由来するグルタミル（例えば、Ｌｉｕ， Ｄ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ．（１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４７８０−４７８５参照）、アスパルチル（例えば、Ｐａｓｔｒｎａｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，（２０００） ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３：２２７７−２２８６参照）及びチロシル（例えば、Ｏｈｎｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ．Ｊｐｎ．） １２４：１０６５−１０６８；及びＫｏｗａｌ， Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８−２２７３参照）系及びシンテターゼが記載されている。Ｅ．コリのグルタミル（例えば、Ｋｏｗａｌ， Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８−２２７３参照）及びチロシル（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｈ．， ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ， Ｐ．（１９９０） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１６３３−１６４１参照）シンテターゼに由来する系が、Ｓ．セレビシアエでの使用について記載されている。哺乳動物細胞における、インビボでの３−ヨード−Ｌ−チロシンの取り込みのために、Ｅ．コリのチロシル系が使用されている。「Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９」を参照されたい。
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、天然にコードされていないアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含む。あらゆるコドンを使用できるが、一般に、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞において殆ど使用されないか、又は全く使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、代表的なコドンには、停止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４又はそれ以上の塩基のコドン及び、殆ど使用されないか又は全く使用されないその他の天然の３塩基コドンが含まれる。
当技術分野で公知の変異誘発法（以下に限定されないが、部位特異的変異誘発法、カセット変異誘発法、制限選択変異誘発法などを含む。）を用いて、配列をコードするｈＩＦＮポリヌクレオチド中の適切な位置に特異的セレクターコドンを導入することができる。
天然にコードされていないアミノ酸を取り込むために使用できる、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及びオルソゴナルＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成させるための方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。天然にコードされていないアミノ酸のインビボ取り込みのための方法及び組成物は、米国特許第７，０４５，３３７号（第１０／１２６，９２７号）（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。生物のインビボ翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択する方法もまた、米国特許第７，０４５，３３７号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。「Ｓｉｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｅｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題されたＰＣＴ公報ＷＯ０４／０３５７４３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、ケトアミノ酸を取り込むためのオルソゴナルＲＳ及びｔＲＮＡ対を記載している。「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」と題されたＰＣＴ公報ＷＯ０４／０９４５９３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、真核生物の宿主細胞中に、天然にコードされていないアミノ酸を取り込むためのオルソゴナルＲＳ及びｔＲＮＡ対を記載している。
少なくとも１つの組み換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を作製する方法は、（ａ）以下に限定されないが、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィリス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの原核生物又は真核生物などを含む、第一の生物から、少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては変異体の）ＲＳのライブラリを作製すること、（ｂ）天然にコードされていないアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーに対してＲＳ（場合によっては変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）し、それにより活性のある（場合によっては変異体）ＲＳのプールを提供することと；及び／又は（ｃ）（場合によってはネガティブ選択によって）天然にコードされていないアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（以下に限定されないが、変異体ＲＳを含む。）に対するプールを選択して、それにより少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを提供すること、を含み；少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳが天然にコードされていないアミノ酸を伴うＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
ある実施形態において、ＲＳは、不活性なＲＳである。活性ＲＳに対して変異誘発を行うことにより、不活性ＲＳを生成させることができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６又は少なくとも約１０若しくはそれ以上のアミノ酸に対して、以下に限定されないがアラニンなどの、異なるアミノ酸へと変異誘発を行うことにより不活性ＲＳを生成させることができる。
以下に限定されないが、タンパク質三次元ＲＳ構造に基づいた合理的設計又は、無作為もしくは合理的設計技術でのＲＳヌクレオチドの変異誘発などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて、変異体ＲＳのライブラリを作製することができる。例えば、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、多様性を生成する組み換え変異誘発、キメラ構築、合理的設計により、及び本明細書中に記載の、又は当技術分野で公知のその他の方法により、変異体ＲＳを生成させることができる。
ある実施形態において、以下に限定されないが、天然にコードされていないアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下でオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するものなど、活性のあるメンバーに対してＲＳ（場合によっては変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）することには、ポジティブ選択及びスクリーニングマーカー（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子など）、ＲＳ（場合によっては変異体）のライブラリを複数の細胞に導入すること（ポジティブ選択及び／又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個の、以下に限定されないがアンバー、オーカー又はオパールコドンなどの、セレクターコドンを含む。）；選択物質の存在下で複数の細胞を増殖させること；ポジティブ選択もしくはスクリーニングマーカーにおいて少なくとも１個のセレクターコドンを抑制することにより、選択及び／又はスクリーニング物質の存在下で生存している（又は特異的反応を示す）細胞を同定すること（これにより、活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールを含有するポジティブに選択された細胞のサブセットを提供する。）を含む。場合によっては、選択及び／又はスクリーニング物質濃度を変化させることができる。
ある態様において、ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。場合によっては、ポジティブ選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子であり、セレクターコドンは、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。別の態様において、正のスクリーニングマーカーは、蛍光又は発光性のスクリーニングマーカー又は親和性を利用したスクリーニングマーカー（以下に限定されないが、細胞表面マーカーなど）を含む。
ある実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合によっては変異体）に対するプールをネガティブに選択又はスクリーニングすることには、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーを、ポジティブ選択又はスクリーニングからの活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールとともに、第二の生物の複数の細胞に導入すること（このネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含む（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子（以下に限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）を含む。）。）；並びに天然にコードされていないアミノ酸及びスクリーニング又は選択物質を補充した第一の培地において生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、天然にコードされていないアミノ酸及び選択又はスクリーニング物質を補充しない第二の培地中で生存できないか又は特異的反応を示さない細胞を同定すること、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを伴う、生存細胞又はスクリーニングされた細胞を与える。例えば、適切なＯ−ＲＳ組み換え体の決定において、ＣＡＴ同定プロトコールは、場合によっては、ポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして機能する。例えば、１又は複数の天然にコードされていないアミノ酸の存在下、又は非存在下の何れかで、場合によっては、ＣＡＴを含有する（少なくとも１個のセレクターコドンを含む）クローンのプールを増殖プレート上に複製する。したがって、天然にコードされていないアミノ酸を含有するプレート上で専ら増殖するコロニーは、組み換えＯ−ＲＳを含有するとみなされる。ある態様において、選択（及び／又はスクリーニング）物質の濃度が変化する。ある態様において、第一及び第二の生物は異なる。したがって、第一及び／又は第二の生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。他の実施形態において、スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
別の実施形態において、活性（場合によっては変異体）ＲＳに対するプールをスクリーニング又は選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択など）することは、活性のある変異体ＲＳのプールをポジティブ選択段階（ｂ）から単離すること；ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する（以下に限定されないが、毒性マーカー遺伝子（以下に限定されないが、少なくとも１個のセレクターコドンを含む、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子など）を含む。）。）及び活性のある（場合によっては変異体）ＲＳのプールを第二の生物の複数の細胞に導入すること；並びに天然にコードされていないアミノ酸が補充されていない第一の培地中で生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、天然にコードされていないアミノが補充されている第二の培地中で生存できないか又は特異的スクリーニング反応を示さない細胞を同定すること、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ（この少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸に対して特異的である。）を伴う、生存細胞又はスクリーニングされた細胞を提供する。ある態様において、少なくとも１個のセレクターコドンとは、約２又はそれ以上のセレクターコドンを含む。このような実施形態には、場合によっては、少なくとも１個のセレクターコドンが２又はそれ以上のセレクターコドンを含む場合並びに第一及び第二の生物が異なる（以下に限定されないが、各生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。）場合が含まれ得る。また、いくつかの態様には、ネガティブ選択マーカーが、（少なくとも１個のセレクターコドンを含む）リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子を含む場合も含まれる。他の態様には、スクリーニングマーカーが、場合によっては、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む場合が含まれる。本明細書中の実施形態において、スクリーニング及び／又は選択には、場合によっては、スクリーニング及び／又は選択ストリンジェンシーの変更が含まれる。
ある実施形態において、少なくとも１つの組み換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生成させるための方法はさらに、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離すること；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二のＯ−ＲＳのセット（場合によっては変異）を生成させること；並びに（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含む変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すこと、を含み得る。場合によっては、以下に限定されないが少なくとも約２回など、段階（ｄ）−（ｆ）を繰り返す。ある態様において、以下に限定されないがランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、組み換え又はそれらの組合せなどの、変異誘発により、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二の変異Ｏ−ＲＳのセットを生成させることができる。
上述の方法における、以下に限定されないが、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方などの、選択／スクリーニング段階のストリンジェンシーは、場合によっては、選択／スクリーニングストリンジェンシーを変更することを含む。別の実施形態において、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方は、レポーターを使用することを含み、この場合、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によりレポーターを検出するか、又は発光によりレポーターを検出する。場合によっては、ファージディスプレイなどで、レポーターを細胞表面に提示し、天然にコードされていないアミノ酸又は類似体に関する親和性又は触媒活性に基づき、選択する。ある実施形態において、ファージディスプレイなどで、変異されたシンテターゼを細胞表面に表示する。
組み換えオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生成させるための方法は、（ａ）第一の生物から、以下に限定されないがサプレッサーｔＲＮＡなどの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製すること；（ｂ）第一の生物からのＲＳの非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリの、選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択など）又はスクリーニングを行うことと（これにより、ｔＲＮＡ（場合によっては変異体）のプールが与えられる。）；並びに（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対してｔＲＮＡ（場合によっては変異体）のプールを選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含み；この少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。ある実施形態において、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、及び／又は、天然及び／又は非天然塩基のユニークな３塩基コドンを含む、又はナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドンもしくはオパール停止コドンである。ある実施形態において、組み換えＯ−ｔＲＮＡは、オルソゴナルが向上している。当然のことながら、ある実施形態において、Ｏ−ｔＲＮＡは、改変の必要なく、場合によっては、第二の生物から第一の生物に持ち込まれる。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり、場合によっては、以下に限定されないが、原核生物（以下に限定されないが、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）など）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、場合によっては、天然にコードされていないアミノ酸によりアミノアシル化され、この場合、この天然にコードされていないアミノ酸は、天然に又は遺伝子操作によりインビボで生合成される。天然にコードされていないアミノ酸は、場合によっては、少なくとも第一又は第二の生物用の増殖培地に添加される。
ある態様において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される（場合によっては変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリの選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択を含む）又はスクリーニングを行うこと（段階（ｂ））は、第二の生物由来の複数の細胞に毒性マーカー遺伝子（この場合、この毒性マーカー遺伝子は、セレクターコドンの少なくとも１つ（又は毒性もしくはスタティック（ｓｔａｔｉｃ）物質の産生を導く遺伝子又は生物にとって必須の遺伝子（このようなマーカー遺伝子は少なくとも１個のセレクターコドンを含む。））を含む。）及び（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのライブラリを導入すること；生存細胞を選択すること（この場合、生存細胞は、少なくとも１つのオルソゴナルｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを含有する。）を含む。例えば、比較比率細胞密度アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
別の態様において、毒性マーカー遺伝子は、２又はそれ以上のセレクターコドンを含み得る。この方法の別の実施形態において、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、このリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含む。場合によっては、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２つ又はそれ以上のアンバーコドンを含み得る。
ある実施形態において、導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー遺伝子（この正のマーカー遺伝子は、薬物耐性遺伝子（以下に限定されないが、Ｏ−ＲＳとともに、少なくとも１つのアンバー停止コドンなどのセレクターコドンの少なくとも１つを含むβ−ラクタマーゼ遺伝子など）又はその生物に必須の遺伝子又は毒性物質の解毒を導く遺伝子を含む。）及び（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを第二の生物由来の複数の細胞に導入することと；以下に限定されないが抗生物質を含む、選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させた、生存している又はスクリーニングされた細胞を同定することと（これにより少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを与える。）を含み、この少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１個のセレクターコドンに応答して、正のマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する。別の実施形態において、選択及び／又はスクリーニング物質の濃度が変更される。
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳのペアを生成させるための方法が与えられる。方法は、（ａ）第一の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製することと；（ｂ）第一の生物由来のＲＳ非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリをネガティブに選択又はスクリーニングすることと（これにより、（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールが与えられる。）；（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすること（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含む。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。この方法はまた、（ｄ）第三の生物からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては変異体）ＲＳのライブラリを作製することと；（ｅ）天然にコードされていないアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーに対して変異体ＲＳのライブラリを選択又はスクリーニングすること（これにより、活性（場合によっては変異体）ＲＳのプールが与えられる。）；（ｆ）天然にコードされていないアミノ酸非存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性な（場合によっては変異体の）ＲＳに対して前記プールをネガティブに選択又はスクリーニングすること（これにより、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアが与えられる。）を含み、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、天然にコードされていないアミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ及び少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを含む。この方法により生成された特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアには、以下に限定されないが、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなどが含まれ得る。さらに、このような方法は、第一及び第三の生物が同じである（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）など）場合を含む。
第二の生物のインビボでの翻訳系において使用するためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択するための方法もまた本発明に含まれる。この方法は、マーカー遺伝子、ｔＲＮＡ及び、第一の生物から単離された、又はこれに由来する、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第二の生物由来の細胞の第一のセットに導入すること；マーカー遺伝子及びｔＲＮＡを第二の生物由来の２つ組の細胞セットに導入すること；２つ組の細胞セットにおいて生存できない第一のセットにおける生存細胞に対する選択を行うか、又は２つ組の細胞セットにおいてこのような反応を与えられない、特異的なスクリーニング応答を示す細胞に対するスクリーニングを行うこと、を含み、この場合、第一のセット及び２つ組の細胞セットを選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させ、生存細胞又はスクリーニングされた細胞は、第二の生物のインビボでの翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを含む。ある実施形態において、比較及び選択又はスクリーニングを行うことは、インビボ相補性アッセイを含む。選択又はスクリーニング物質の濃度は変更することができる。
本発明の生物は、様々な生物及び様々な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり得る。ある実施形態において、生物は、場合により、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの（これらに限定されない。）原核生物である。あるいは、生物は、場合によって、植物（単子葉植物又は双子葉植物などの複雑な植物を含むが、これらに限定されない。）、藻類、原生生物、真菌（酵母などを含むが、これに限定されない。）、動物（哺乳動物、昆虫、節足動物などを含むが、これらに限定されない。）などを含む（これらに限定されない。）真核生物を含む。別の実施形態において、第二の生物は、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの（これらに限定されない。）原核生物である。あるいは、第二の生物は、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物細胞などを含む（これらに限定されない。）真核生物とすることが可能である。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は異なる。
ＶＩ．ｈＩＦＮポリペプチドにおける天然に存在しないアミノ酸の位置
本発明は、一つ以上の天然に存在しないアミノ酸のｈＩＦＮポリペプチド中への取り込みを想定する。ポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において、一つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸が取り込まれ得る。「保存的」置換（以下に限定されないが、疎水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、大きなアミノ酸の大きなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換など。）を行うことにより、及び／又は活性に必要のない位置に非天然アミノ酸を位置に挿入することにより、これを遂行することができる。
ｈＩＦＮの領域は、以下のように表すことが可能であり、ここにおいて、ｈＩＦＮ中のアミノ酸位置は、配列番号２に従う：１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（Ｄ及びＥへリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅへリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）。
様々な生化学的及び構造的アプローチを利用して、天然にコードされていないアミノ酸を用いた置換を行うための所望の部位を、ｈＩＦＮポリペプチド内に選択することができる。当業者にとって当然のことながら、ポリペプチド鎖のあらゆる位置が、天然にコードされていないアミノ酸を取り込むための選択に適切であり、選択は、合理的設計に基づくか、又は、何らかの所望の目的のための、又は所望の目的なしの、ランダム選択によるものであり得る。所望の部位の選択は、以下に限定されないが、アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、二量体又は多量体形成などの、何らかの所望の特性又は活性を有するが、ネイティブ分子と比較して活性又は特性に変化がないｈＩＦＮ分子を産生するためのもの、又は、溶解性、凝集又は安定性などのポリペプチドの何らかの物理的又は化学的特性を操作するためのものであり得る。例えば、当技術分野で公知の点変異分析、アラニンスキャニング又はホモローグスキャニング法を用いて、ｈＩＦＮの生物活性に必要とされるポリペプチド中の位置を同定することができる。ＩＦＮについては、例えば、「Ｄｉ Ｍａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ ２０２：１４４５（１９９４）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１３：１４３（１９９８）；Ｒｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂ．Ｃ．２７３：８００３（１９９８）」を参照のこと。米国特許第５，５８０，７２３号；第５，８３４，２５０号；第６，０１３，４７８号；第６，４２８，９５４号；及び第６，４５１，５６１号（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、標的物質との、ポリペプチドの活性に影響を与える活性ドメインを同定することによって、ｈＩＦＮなどのポリペプチドの構造及び機能を構造的に分析するための方法を記載している。アラニン又はホモローグスキャニング変異誘発により生物活性に重要と同定されるもの以外の残基は、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した天然にコードされていないアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。あるいは、生物活性に重要と同定される部位もまた、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した天然にコードされていないアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。別の代替法は、ポリペプチド鎖の各位置において天然にコードされていないアミノ酸で単純に連続した置換を行い、ポリペプチドの活性に対する影響を観察することであろう。あるいは、現行のＩＦＮ治療薬に見出される副作用を含むＩＦＮの生物活性の１つ又はそれ以上を調節する残基は、天然にコードされていないアミノ酸による置換に対する優れた候補であり得る。このような副作用には、好中球減少症が含まれるが、これに限定されない。あるいは、毒性を調節する残基は、天然にコードされていないアミノ酸による置換の優れた候補であり得る。このような残基には、受容体のオピオイドファミリーの１つ又はそれ以上の要素と相互作用する残基及び／又はインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの誘導を調節するための残基が含まれ得るが、これらに限定されない。抗ウイルス活性を改善する残基は、天然にコードされていないアミノ酸による置換の優れた候補であり得る。保持された又は改善された抗ウイルス活性及び／又は調節された副作用及び／又は調節された毒性を有する改善されたｈＩＦＮポリペプチドを提供するために、リミチンから得られる領域又は部位をＩＦＮα中に取り込んだキメラｈＩＦＮポリペプチドを設計し得る。ｈＩＦＮ中の１つ又はそれ以上の残基は、リミチン中に見出される１つ又はそれ以上の残基で置換され得る。Ｃ−Ｄループ中の１つ又はそれ以上の残基は、天然にコードされていないアミノ酸での置換又はその他の修飾（リミチン中に見出される残基によるＩＦＮ中の残基の置換など（但し、これらに限定されない。））に対する優れた候補であり得る。ｈＩＦＮ中のＣ−Ｄループ中の残基の大半は、リミチン中に見出される残基で置換され得る。ｈＩＦＮ中の置換に適したリミチン由来の残基は、配列間、三次元構造、二次構造、１つ若しくはそれ以上の生物活性又はリミチン及びｈＩＦＮの受容体結合の比較を行うことによって決定され得る。当業者にとって当然のことながら、何らかのポリペプチドへの非天然アミノ酸による置換を行う位置を選択するための、あらゆる手段、技術又は方法が本発明での使用に適切である。
天然にコードされていないアミノ酸による置換を許容する可能性があるタンパク質の領域を決定するために、欠失を含有するｈＩＦＮポリペプチドの天然に存在する変異体の構造及び活性も可能である。同様に、プロテアーゼ消化及びモノクローナル抗体は、ｈＩＦＮ受容体を結合するために必要とされるｈＩＦＮの領域を同定するために使用することが可能である。天然にコードされていないアミノ酸による置換基を許容できない可能性がある残基が一旦除去されれば、残りの位置の各々における提案された置換の影響は、ｈＩＦＮ及びその受容体又は結合対の構造から調べることが可能である。ｈＩＦＮのＸ線結晶及びＮＭＲ構造は、タンパク質及び核酸の巨大分子の三次元構造データを含有する集中管理されたデータベースであるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（１ＲＨ２及び１ＩＴＦを含む。）（ＰＤＢ，Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおいて、ｒｃｓｂ．ｏｒｇ並びに米国特許特許第５，６０２，２３２号；同第５，４６０，９５６号；同第５，４４１，７３４号；同第４，６７２，１０８号（参照により、本明細書に組み込まれる。）においても入手可能である。三次元構造データが利用できなければ、ポリペプチドの二次及び三次構造を調査するモデルを作製し得る。従って、当業者は、天然にコードされていないアミノ酸で置換できるアミノ酸位置を容易に同定できる。
幾つかの実施形態において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、ポリペプチドのヘリックス又はβシート二次構造を破壊しないタンパク質の領域中に位置する一つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。
天然にコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的な残基は、その受容体に結合した又は結合していないｈＩＦＮポリペプチドの三次元結晶構造、二次、三次又は四次構造によって予測されるように、受容体結合領域である可能性がある領域（部位Ｉ及び部位ＩＩを含むが、これらに限定されない。）から除外される残基であり得、完全に又は部分的に溶媒曝露され得、近くの残基と最小限の又は非水素結合相互作用を有し、近くの反応性残基へ最小限度で曝露され得、及び高度に柔軟であり（Ｃ−Ｄループを含むが、これに限定されない。）、又は構造的に堅固である（Ｂヘリックスを含むが、これに限定されない。）領域中に存在し得る。天然にコードされていないアミノ酸の取り込みの残基は、現行のＩＦＮ治療薬に見出される副作用を含むＩＦＮの生物活性の１つ又はそれ以上を調節する残基を調節する残基であり得る。天然にコードされていないアミノ酸の取り込みの残基は、毒性を調節する残基であり得る。このような残基には、オピオイド受容体ファミリーの１つ又はそれ以上の要素への結合に関与する残基及び／又はインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの誘導を調節する残基が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮ中の二次構造に対応する以下の領域の１つ又はそれ以上に取り込まれ、又は置換され、ここにおいて、ｈＩＦＮ中のアミノ酸位置は、ｈＩＦＮの領域は、配列番号２に従って、１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（Ｄ及びＥへリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅへリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）である。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮの以下の位置：（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の何れかのＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸など）の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシ末端）の１つ又はそれ以上において（但し、それらに限定されない。）置換される。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮ中の以下の位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２、又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に取り込まれる。幾つかの実施形態において、１つ又は以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮ中の以下の位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に取り込まれる。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６２（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３４、７８、１０７（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）など（但し、これらに限定されない。）、これら又はその他の位置の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、位置：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、カルボキシ末端）（配列番号２又は他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）など（但し、これらに限定されない。）のこれら又はその他の位置における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、１つ又はそれ以上のアミノ酸位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）へ連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の位置：６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、以下の位置：３４、７８、１０７（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸が、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ＩＦＮポリペプチドの以下のアミノ酸位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸へ連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、以下のアミノ酸位置：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上において、ＩＦＮポリペプチドへ連結される。幾つかの実施形態において、これらの位置：３４、７８、１０７（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸が、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、アンタゴニストを提供する以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された予定の部位及び所望される活性に応じて、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして、作用し得る可能性がある。ヒトＩＦＮアンタゴニストは、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７又はこれらの何れかの組み合わせ（配列番号２又は配列番号１若しくは３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）に１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有するｈＩＦＮポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ又は以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２又は配列番号１若しくは３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸のように）ｈＩＦＮの以下の位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４の１つ又はそれ以上において置換されるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はｈＩＦＮの位置３８（配列番号２又は配列番号１若しくは３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）において置換される。幾つかの実施形態において、位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４など（但し、これらに限定されない。）（配列番号２又は配列番号１若しくは３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）、これら又は他の位置の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮの以下の位置：（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸など）の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシル末端）及び１つ又はそれ以上の天然のアミノ酸置換の１つ又はそれ以上において（但し、それらに限定されない。）置換される。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は水溶性ポリマーに結合される。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧに結合される。一実施形態において、天然アミノ酸置換はＲ１４９Ｙである。幾つかの実施形態において、天然のアミノ酸置換はＲ１４９Ｅである。幾つかの実施形態において、天然のアミノ酸置換はＲ１４９Ｓである。一実施形態において、非天然アミノ酸置換は位置１０７に位置し、天然のアミノ酸置換はＲ１４９Ｙである。一実施形態において、非天然アミノ酸置換は、位置１０６に位置し、天然アミノ酸置換はＲ１４９Ｙである。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸の置換は、ｈＩＦＮ（配列番号１又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の以下の位置：１０、１６、１３、７９、８３、８５、８６、８７、９０、９１、９３、９４、９６、１２０、１２１、１２４、１２５、１２８、１４９など（但し、これらに限定されない。）の１つ又はそれ以上に位置する。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされているアミノ酸の置換は、以下の置換（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上：Ｇ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓなど（但し、これらに限定されない。）である。幾つかの実施形態において、天然のアミノ酸置換は、位置１（Ｎ末端）に位置する。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２におけるような、又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）ｈＩＦＮ以下の位置の１つ又はそれ以上：１０７、７８、３４の１つ又はそれ以上において置換される。幾つかの実施形態において、これらの位置：１０７、７８、３４の１つ又はそれ以上における天然にコードされていないアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている。
リミチン配列中に見出される１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ｈＩＦＮポリペプチド中に置換され得る（ハイブリッドラミチン／ｈＩＦＮポリペプチド）。例には、前パラグラフに記載されている天然アミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、インターフェロンポリペプチド中に見出されるアミノ酸の組は、リミチン配列中に見出されるアミノ酸の組によって置換され得る。アミノ酸の組は、連続するアミノ酸又は分子の異なる部分に存在するアミノ酸を含み得るが、ポリペプチドの構造的な特徴若しくは生物学的活性に関与する。マウスリミチン分子は、他のＩＦＮαタンパク質に比べて、改善されたＣＦＵ−ＧＭ毒性プロファイルを有する。ヒトＩＦＮα−２ａをリミチンタンパク質配列と並置することによって、３０％のアミノ酸同一性が示された。５０％の配列保存も観察された。特に、Ｃ及びＤヘリックス間のリミチン配列中（Ｃ及びＤヘリックス間のループ中）に顕著な欠失が観察された。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）中に以下の置換を有する「ＨＶ」変異体が作製された。すなわち、Ｄ７７−Ｄ９４が、マウスリミチン配列ＨＥＲＡＬＤＱＬＬＳＳＬＷＲＥＬＱＶと置換されている。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）中に以下の置換を有する「ＣＤ」変異体が作製された。すなわち、Ｖ１０５−Ｄ１１４が、ＧＱＳＡＰＬＰと置換されている。リミチン由来のループ領域がヒトＩＦＮα−２ａタンパク質に置換されたこのハイブリッド分子（「ＣＤ」変異体）は、ＷＨＯＩＦＮ標準として、均等な抗ウイルス活性を有することが見出された。１つ又はそれ以上のリミチンアミノ酸に加えて、ｈＩＦＮポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドの何れかの１つ又はそれ以上の位置に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結され得、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーに直接結合され得る。ＨＶ又はＣＤ変異体中の天然のアミノ酸置換に加えて、１つ又はそれ以上のさらなる天然のアミノ酸置換がｈＩＦＮポリペプチド中に見出され得る。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結された、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結された、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３又は何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、１つ又はそれ以上の天然にコードされているアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーに連結された、以下の位置：６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２又は配列番号１、３若しくは何れかの他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、以下の天然にコードされているアミノ酸置換Ｇ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓの１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、１０７及び１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７及び１０８の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、７８、８７及び１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、７８、８７及び１０７（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結された１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：３７、４５、４６、８９及び１０７の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに結合された１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、及び以下の天然にコードされているアミノ酸置換：Ｔ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結又は結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４、１５８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２３、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４、１５８（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結又は結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、以下の位置：２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４（配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、水溶性ポリマーに連結又は結合された、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、アンタゴニストを与える以下の位置：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５又はこれらの何れかの組み合わせ（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された部位及び所望される活性に応じて、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして、作用し得る。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７又はこれらの何れかの組み合わせ（ｈＩＦＮ；配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）に１つ又はそれ以上の置換を有するものが含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ又は以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸のように）ｈＩＦＮの以下の位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、１２、１３、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４の１つ又はそれ以上において置換されるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はｈＩＦＮの位置３８（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）において置換される。幾つかの実施形態において、位置：３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４など（但し、これらに限定されない。）、これら又は他の位置における天然に存在しないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸置換及び天然にコードされているアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されており、ｈＩＦＮポリペプチドは１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸置換を含む。
天然にコードされていない多様なアミノ酸が、ｈＩＦＮポリペプチド中の所定の位置に対して置換され、又はｈＩＦＮポリペプチド中の所定の位置に取り込まれることが可能である。一般に、具体的な天然にコードされていないアミノ酸は、その受容体を伴うｈＩＦＮポリペプチドの三次元結晶構造の調査、保存的置換に対する選好性（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニン又はＯ−プロパルギルチロシンなど、アリールをベースとした天然にコードされていないアミノ酸）及びｈＩＦＮポリペプチド中への導入を希望する特異的な結合化学（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーを用いたＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加、又はアリールエステルを有し、続いて、ホスフィン部分を取り込む水溶性ポリマーを用いたアミド結合形成を実施することを望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、取り込みのために選択される。
ある実施形態において、本発明はさらに、タンパク質中に非天然アミノ酸を取り込むこと（この非天然アミノ酸は、第一の反応基を含む。）；及び第二の反応性基を含む分子（以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、回転脱水ラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質を含む。）と、タンパク質を接触させること、を含む。第一の反応性基が第二の反応性基と反応して、［３＋２］付加環化を介して非天然アミノ酸に分子を付着させる。ある実施形態において、第一の反応基は、アルキニル又はアジド部分であり、第二の反応性基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第一の反応性基は、アルキニル部分（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおいて、など）であり、第二の反応性基はアジド部分である。別の例において、第一の反応性基はアジド部分であり（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて、など）、第二の反応性基はアルキニル部分である。
ある場合において、天然にコードされていないアミノ酸置換は、ｈＩＦＮポリペプチド内の他の付加、置換又は欠失と組み合わされて、ｈＩＦＮポリペプチドの他の生物学的特性に影響を与える。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ｈＩＦＮポリペプチドの安定性（以下に限定されないが、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性など。）が向上するか、又はｈＩＦＮポリペプチド受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性が向上し得る。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ｈＩＦＮポリペプチドの溶解性（以下に限定されないが、Ｅ．コリ又はその他の宿主細胞で発現させた場合など。）が増加し得る。幾つかの実施形態において、付加、置換又は欠失により、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が増加し得る。幾つかの実施形態において、Ｅ．コリ組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性の増加をもたらす非天然アミノ酸取り込みのための別の部位に加えて、天然コードアミノ酸又は非天然アミノ酸での置換のために部位を選択する。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチド受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（増加又は減少が含まれるが、これらに限定されない。）、ｈＩＦＮ受容体結合後の下流シグナル伝達現象を調節する、受容体二量体を安定化する、循環半減期を調節する、放出もしくは生物利用可能性を調節する、精製を促進するか、又は特定の投与経路を改善するかもしくは変更する、別の付加、置換又は欠失を含む。本発明のｈＩＦＮポリペプチドは現行のＩＦＮ治療薬に見出される副作用を含むＩＦＮの生物活性の１つ又はそれ以上を調節し得る。本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、現行のＩＦＮ治療薬に見出される毒性を調節し得る。同様に、ｈＩＦＮポリペプチドは、化学的又は酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗原結合ドメイン（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓなど）又はその他の親和性ベースの配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなど）又は、検出（以下に限定されないが、ＧＦＰなど）、精製、組織もしくは膜を介した輸送、プロドラッグ放出もしくは活性化、ｈＩＦＮサイズの縮小又はポリペプチドのその他の特性を改善する連結された分子（以下に限定されないが、ビオチンなど。）を含むことが可能である。
幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の置換は、ｈＩＦＮアンタゴニストを生成する。１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸におけるように）が含まれる。天然にコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位の別のサブセットには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７（ｈＩＦＮ；配列番号２又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸）が含まれる。幾つかの実施形態は、ｈＩＦＮアンタゴニストは、ＩＦＮをアンタゴニストとして作用させる、領域１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（Ｄ及びＥへリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅへリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）中に少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部内の残基が含まれる。他の実施形態において、上掲の置換は、ｈＩＦＮポリペプチドを、ｈＩＦＮアンタゴニストにするさらなる置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮアンタゴニストは、ｈＩＦＮ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの事例において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、ｈＩＦＮポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸の、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の置換をさらに含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮの以下の領域中の１つ又はそれ以上の残基は、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸で置換される：１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（Ｄ及びＥへリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅへリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）。幾つかの事例において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていない残基は、１つ又はそれ以上のより低分子量の直鎖又は分岐ＰＥＧ（約５から２０ｋＤａ又はそれ以下の質量）に連結されることにより、より高分子量の単一のＰＥＧに付着された種に比べて、結合親和性及び同等の血清半減期を増大させる。
１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸のｈＩＦＮ中への取り込みのための部位には、以下の残基の組み合わせ（配列番号２又は他のＩＦＮ若しくはインターフェロン様サイトカイン中の対応するアミノ酸）：位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）又はこれらの何れかの組み合わせが含まれる。１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸のｈＩＦＮ中への取り込みのための部位には、以下の残基（配列番号２又は他のＩＦＮ若しくはインターフェロン様サイトカイン中の対応するアミノ酸におけるように）３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、１２、１３、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４の組み合わせが含まれる。
ＶＩＩ．非真核生物及び真核生物中での発現
クローニングしたｈＩＦＮポリヌクレオチドの高レベル発現を得るために、通例、転写、転写／翻訳ターミネーターを支配するための強力なプロモーターを含有し、タンパク質をコードする核酸のための場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中に、本発明のｈＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，に記載されている。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、バチルス種、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）及びサルモネラなどにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５（１９８３））。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現系は当業者に公知であり、これも市販されている。オルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して本発明のｈＩＦＮポリペプチドを発現させる場合、オルソゴナル成分を宿主細胞が使用する能力に基づいて発現用の宿主細胞を選択する。代表的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（以下に限定されないが、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）など）及びグラム陰性細菌（Ｅ．コリ、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）など）、ならびに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。本明細書中に記載されているとおりに、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞を使用することができる。
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成することができるようになる。ある態様において、前記組成物は、場合によっては、以下に限定されないが、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム若しくはそれ以上含むか、又はインビボタンパク質産生方法により達成され得る量を含む（組み換えタンパク質産生及び精製に対する詳細は本明細書中に記載されている。）。別の態様において、このタンパク質は、場合によっては、以下に限定されないが、細胞可溶化液、緩衝液、医薬緩衝液又はその他の懸濁液などの中で（以下に限定されないが、約１ｎＬから約１００Ｌ又はそれ以上などの何れかの体積で）、以下に限定されないが、１Ｌあたり少なくともタンパク質１０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質５０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質７５マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク１００マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質２００マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質２５０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質５００マイクログラム、１Ｌあたり少なくとも１ミリグラム又は１Ｌあたり少なくともタンパク質１０ミリグラム又はそれ以上の濃度で、組成物中に存在する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞中でのタンパク質の大量産生（以下に限定されないが、他の方法（以下に限定されないが、インビトロ翻訳など）で通常可能なものを超える量など）は、本発明の特徴である。
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含むタンパク質を生合成することができるようになる。例えば、細胞抽出液、細胞可溶化液、培養液、緩衝液などの中で、以下に限定されないが、少なくとも、タンパク質１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル又は少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル又はそれ以上などの濃度で、非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生させることができる。
Ｉ．発現系、培養及び単離
例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含む多くの適切な発現系においてｈＩＦＮを発現させ得る。代表的な発現系の説明を下記で行う。
酵母
本明細書中で使用する場合、「酵母」という用語は、ｈＩＦＮをコードする遺伝子を発現することができるあらゆる様々な酵母を含む。このような酵母としては、以下に限定されないが、有子嚢酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、エンドミケス）、担子胞子酵母及び、不完全菌類（分芽菌）に属する酵母が挙げられる。有子嚢酵母は、スペルモフトラセア（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）及びサッカロミセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の２種類の科に分けられる。後者は、４種類の亜科、シゾサッカロミコイダエ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄａｅ）（例えばシゾサッカロミセス属）、ナドソニオイデア（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポミコイデア（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）及びサッカロミコイデア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属）からなる。担子胞子酵母は、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）及びフィロバシディエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属を含む。不完全菌類（分芽菌）に属する酵母は、スポロボロミセタセア（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えば、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属及びブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属）及びクリプトコッカセア（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えばカンジダ属）の２種類の科に分けられる。
本発明との使用に特に興味深いのは、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（以下に限定されないが、Ｐ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．グイレリモンディ（Ｐ． ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．カルルスベルゲンシス（Ｓ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ディアスタチクス（Ｓ． ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ダグラシ（Ｓ． ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クリベリ（Ｓ． ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス（Ｓ， ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、Ｓ．オビフォルミス（Ｓ． ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．マルトーサ（Ｃ． ｍａｌｔｏｓａ）、及びＨ．ポリモルファ（Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）など）に属する種である。
ｈＩＦＮの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者の技術の範疇に属する。発現のための酵母宿主の選択において、適切な宿主は、例えば、優れた分泌能、低タンパク質分解活性、優れた分泌能、優れた可溶性タンパク質産生及び全体的な頑健性を有することを示すものを含み得る。酵母は通常、以下に限定されないが、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
「酵母宿主」「酵母宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた酵母を含む。この用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡを受容したオリジナルの酵母宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ｈＩＦＮをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
多くの酵母宿主への形質転換のために、染色体外レプリコン又は組み込みベクターを含む発現及び形質転換ベクターが開発されてきた。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＳＩＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ． ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣＳ（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギレリモンディ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＳＩＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号；同第４，９２９，５５５号；及び同第４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ（１９８５）５：３３７６）；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９８２）３００：７０６）；及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）；Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２１１；及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９）；Ｔ．レーシア（Ｔ．ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ０２４４２３４）；及び糸状菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（ＷＯ９１／００３５７）など（それぞれ参照により本明細書中に組み込む。）に対して発現ベクターが開発された。
酵母ベクターに対する制御配列は当業者にとって公知であり、以下に限定されないが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ０２８４０４４）；エノラーゼ；グルコキナーゼ；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）；ヘキソキナーゼ；ホスホフルクトキナーゼ；３−ホスホグリセリン酸ムターゼ；及びピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰ０３２９２０３）などの遺伝子からのプロモーター領域が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供し得る（Ｍｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主との使用に適切なその他のプロモーター配列は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８０）２５５：２０７３）；及びその他の解糖系酵素、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＡＤＶ．ＥＮＺＹＭＥ ＲＥＧ．（１９６８）７：１４９）が挙げられる。増殖条件により調節される転写のさらなる長所を有する誘導型酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２；イソチトクロムＣ；酸性ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；窒素代謝に関与する分解酵素；並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域が含まれ得る。酵母発現での使用に適切なベクター及びプロモーターはさらにＥＰ００７３６５７に記載されている。
酵母エンハンサーを酵母プロモーターと一緒に使用することもできる。さらに、合成プロモーターも酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモーターの転写活性領域と連結させることができ、これにより合成ハイブリッドプロモーターを作製できる。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結させられたＡＤＨ制御配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号及び同第４，８７６，１９７号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ハイブリッドプロモーターのその他の例としては、ＧＡＰ又はＰｙＫなどの解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わせた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０又はＰＨＯ５遺伝子の制御配列からなるプロモーターが挙げられる。ＥＰ０１６４５５６号を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始させる能力を有する非酵母由来の天然に存在するプロモーターを含み得る。
酵母発現ベクターの一部を含み得る他の制御エレメントには、ターミネーター、例えば、ＧＡＰＤＨ又はエノラーゼ遺伝子由来のものが含まれる（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８１）２５６：１３８５）。さらに、２μプラスミドオリジンからの複製起点は、酵母に適切である。酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９７９）７：１４１を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを与える。同様に、Ｌｅｕ−２欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
外来性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は当業者にとって公知であり、典型的には、以下に限定されないが、アルカリ陽イオンで処理された、スフェロプラスト又はインタクトな酵母宿主細胞の何れかの形質転換が含まれる。例えば、Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ．（１９７９）７６：３８２９及びＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴ．（１９７７）１３０：９４６に記載の方法に従い、酵母の形質転換を行うことができる。しかし、核注入、エレクトロポレーション又はプロトプラスト融合など、細胞にＤＮＡを導入するためのその他の方法も、一般にＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（２００１）に記載のように使用し得る。次いで、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、酵母宿主細胞を培養し得る。
酵母宿主細胞中で異種タンパク質を発現するための他の方法は、当業者に公知である。一般に、米国特許出願２００２００５５１６９号、米国特許出願第６，３６１，９６９号；第６，３１２，９２３号；第６，１８３，９８５号；第６，０８３，７２３号；第６，０１７，７３１号；第５，６７４，７０６号；第５，６２９，２０３号；第５，６０２，０３４号；及び第５，０８９，３９８号；米国再審査特許ＲＥ３７，３４３及びＲＥ３５，７４９；ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ ９９／０７８６２１；ＷＯ ９８／３７２０８；及びＷＯ ９８／２６０８０；欧州特許出願ＥＰ ０ ９４６ ７３６；ＥＰ ０ ７３２ ４０３；ＥＰ ０ ４８０ ４８０；ＷＯ ９０／１０２７７；ＥＰ ０ ３４０ ９８６；ＥＰ ０ ３２９ ２０３；ＥＰ ０ ３２４ ２７４；及びＥＰ ０ １６４ ５５６を参照されたい。Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＡＮＴＯＮＩＥ ＶＡＮ ＬＥＥＵＷＥＮＨＯＥＫ（１９９２）６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， ＹＥＡＳＴ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９０）１８５：３−７も参照されたい（それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。）。
当業者にとって公知である標準的なフィードバッチ発酵法を用いて、増幅段階の際、発酵装置中で酵母宿主株を増殖させ得る。この発酵法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路又は発現制御方式の違いを明らかにするために適合させ得る。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵には、単一のグルコース供給、複合窒素源（例えばカゼイン加水分解物）及び複数ビタミンの供給が必要であり得る。これに対して、メチロトローフ酵母、Ｐ．パストリスは、グリセロール、メタノール及び微量元素の供給を必要とし得るが、最適な増殖及び発現のために、単純なアンモニウム（窒素）塩のみが必要であり得る。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＨＥＭ（１９９０）９：９５及びＦｉｅｓｃｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨ ＢＩＯＥＮＧ．（１９８７）２９：１１１３（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
しかし、このような発酵法は、使用する酵母宿主と無関係なある一定の一般的な特徴を有し得る。例えば、最大限に増殖させるために、増幅期の際に、増殖制限栄養、通常は炭素、を発酵装置に添加し得る。さらに、発酵法は通常、炭素、窒素、基本的塩、リン及びその他の微量栄養素（ビタミン、微量元素及び塩など）の適正な量を含有するように設定された発酵培地を用いる。ピチアとともに使用するのに適切な発酵培地の例は、米国特許第５，３２４，６３９号及び同第５，２３１，１７８号（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。
バキュロウイルス感染昆虫細胞
「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた昆虫を指す。この用語は、形質移入されたオリジナルの昆虫宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な変異のために、単一の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ｈＩＦＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
ｈＩＦＮポリペプチドの発現に適切な昆虫細胞の選択は、当業者にとって公知である。アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びトリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など、いくつかの昆虫種が当技術分野で詳しく記載されており、市販されている。発現のための昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、優れた分泌能、低タンパク質分解活性及び全体的な頑強性を有することを示すものを含み得る。昆虫は通常、以下に限定されないが、Ｉｎｓｅｃｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分には、トランスファーベクター、通常は、バキュロウイルスゲノムの断片及び発現させる異種遺伝子の挿入のための従来の制限部位の両方を含有する細菌プラスミド；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的断片と相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これにより、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組み換えが可能となる。）；及び適切な昆虫宿主細胞ならびに増殖培地が含まれる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの回収、培養での細胞増殖などで使用される、材料、方法及び技術は、当技術分野で公知であり、これらの技術を記載するマニュアルが利用可能である。
トランスファーベクターに異種遺伝子を挿入した後、ベクター及び野生型ウイルスゲノムを、ベクター及びウイルスゲノムの組み換えを行う昆虫宿主細胞に形質移入する。パッケージングされた組み換えウイルスを発現させ、組み換えプラークを同定し、精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に対する材料及び方法は、キット形態で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。これらの技術は通常、当業者にとって公知であり、ＳＵＭＭＥＲＳ ＡＮＤ ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に詳しく記載されている（参照により本明細書中に組み込む。）。また、ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（１９９５）；ＡＵＳＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １６．９−１６．１１（１９９４）；ＫＩＮＧ及びＰＯＳＳＥＥ，ＴＨＥ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＳＹＳＴＥＭ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＧＵＩＤＥ（１９９２）；及びＯ’ＲＥＬＬＹ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）も参照のこと。
実際に、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた様々な異種タンパク質産生が当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号；同第６，３４２，２１６号；同第６，３３８，８４６号；同第６，２６１，８０５号；同第６，２４５，５２８号、同第６，２２５，０６０号；同第６，１８３，９８７号；同第６，１６８，９３２号；同第６，１２６，９４４号；同第６，０９６，３０４号；同第６，０１３，４３３号；同第５，９６５，３９３号；同第５，９３９，２８５号；同第５，８９１，６７６号；同第５，８７１，９８６号；同第５，８６１，２７９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，８４３，７３３号；同第５，７６２，９３９号；同第５，７５３，２２０号；同第５，６０５，８２７号；同第５，５８３，０２３号；同第５，５７１，７０９号；同第５，５１６，６５７号；同第５，２９０，６８６号；ＷＯ０２／０６３０５；ＷＯ０１／９０３９０；ＷＯ０１／２７３０１；ＷＯ０１／０５９５６；ＷＯ００／５５３４５；ＷＯ００／２００３２；ＷＯ９９／５１７２１；ＷＯ９９／４５１３０；ＷＯ９９／３１２５７；ＷＯ９９／１０５１５；ＷＯ９９／０９１９３；ＷＯ９７／２６３３２；ＷＯ９６／２９４００；ＷＯ９６／２５４９６；ＷＯ９６／０６１６１；ＷＯ９５／２０６７２；ＷＯ９３／０３１７３；ＷＯ９２／１６６１９；ＷＯ９２／０３６２８；ＷＯ９２／０１８０１；ＷＯ９０／１４４２８；ＷＯ９０／１００７８；ＷＯ９０／０２５６６；ＷＯ９０／０２１８６；ＷＯ９０／０１５５６；ＷＯ８９／０１０３８；ＷＯ８９／０１０３７；ＷＯ８８／０７０８２（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクターである、バキュロウイルス、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス核（ＡｃＮＰＶ）由来の、昆虫発現及びトランスファーベクターを含む。この系由来のウイルス発現ベクターは通常、強力なウイルスポリへドリン遺伝子プロモーターを使用して異種遺伝子の発現を駆動する。一般的に、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）を参照のこと。
バキュロウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する前に、プロモーター、リーダー（必要に応じて）、関心のあるコード配列及び転写終結配列を含む上述の成分は、典型的には、中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物（トランスファーベクター）中に集められる。中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物は、細菌などの宿主において安定した維持が可能な染色体外エレメント（例えばプラスミド）など、レプリコンにおいて維持されることが多い。レプリコンは複製系を有し、したがって、これにより、クローニング及び増幅に適切な宿主において維持されるようになる。より具体的には、プラスミドは、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８８）４２：１７７）及び原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子及びＥ．コリでの選択及び増殖のための複製起点を含有し得る。
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するための、よく使用されるあるトランスファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、ＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する。）をはじめ、当業者にとって公知である、多くのその他のベクターも設計されてきた。Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ １７０：３１（１９８９）を参照のこと。その他の市販ベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２；ｐＭｅｌＢａｃ；ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。
異種遺伝子の挿入後、トランスファーベクター及び野生型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞宿主中に共トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当技術分野で公知である。ＳＵＭＭＥＲＳ及びＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ ＮＯ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８９）１７：３１を参照のこと。例えば、相同二重交叉組み換えにより、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に挿入し得、所望のバキュロウイルス遺伝子に組み込まれた制限酵素部位にも挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１も参照のこと。
エレクトロポレーションによりトランスフェクションを遂行し得る。ＴＲＯＴＴＥＲ及びＷＯＯＤ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：（１９９５）；Ｍａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。あるいは、リポソームを使用して、昆虫細胞に組み換え発現ベクター及びバキュロウイルスを形質移入し得る。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１８：４５；ＴＩＬＫＩＮＳ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９９４）６８（２）：７６６；及びＰｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９３）１４．２：２７４を参照のこと。市販のリポソームとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。さらに、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用し得る。ＴＲＯＴＴＥＲ及びＷＯＯＤ、３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７；並びにＭａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。
バキュロウイルス発現ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して置かれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。バキュロウイルスプロモーターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子の遠位にある。さらに、発現は制御されるか又は構造的である。
感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ウイルス性ポリへドロンタンパク質をコードする遺伝子（ＦＲＩＥＳＥＮ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（１９８６）；ＥＰ０１２７８３９及び０１５５４７６）及びｐ１０タンパク質をコ―ドする遺伝子（Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８８）６９；７６５）由来の配列が挙げられる。
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターを、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージし、続いて、当業者に公知の技術によって、増殖されたプラークを精製し得る。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＥＳＳＥＹＳ（１９８９）４：９１；ＳＵＭＭＥＲＳ及びＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
いくつかの昆虫細胞への感染のために、組み換えバキュロウイルス発現ベクターが開発されてきた。例えば、とりわけ、アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｈｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びトリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に対して組み換えバキュロウイルスが開発されている。Ｗｒｉｇｈｔ、ＮＡＴＵＲＥ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６を参照のこと。一般的に、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＣＥＬＬ．ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．（１９８９）２５：２２５を参照のこと。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクター系に対して使用される細胞株としては、一般に、以下に限定されないが、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルタ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ・フルギペルタ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、カタログ番号１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（トリコプルシア・ニー）及びＨｉｇｈ−ＦｉｖｅＴＭＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（トリコプルシア・ニー）が挙げられる。
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接及び融合発現両方に対して、細胞及び培養用培地が市販されており、細胞培養技術は一般に当業者にとって公知である。
Ｅ．コリ、緑膿菌種ならびにその他の原核生物
細菌発現技術は、当業者に公知である。細菌宿主での使用に対して多岐にわたるベクターが利用可能である。ベクターは、シングルコピー又は低コピーもしくは高多コピーベクターであり得る。ベクターは、クローニング及び／又は発現に役立ち得る。ベクターに関する豊富な文献、多くのベクターが市販されていること、並びにベクター及びそれらの制限地図及び特性を記載するマニュアルを考慮すると、本明細書中で幅広い考察を行う必要はない。周知のとおり、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含み、このマーカーは、細胞毒性物質耐性、原栄養性又は免疫性を規定し得る。しばしば、複数のマーカーが存在し、これらが様々な特性を提供する。
細菌性プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインも有し得、これは、ＲＮＡ合成が開始される隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特異的遺伝子の転写が抑制されるので、オペレーターにより、負に制御された（誘導型）転写が可能となる。オペレーターなどの負の制御エレメントの非存在下で恒常的発現が起こり得る。さらに、遺伝子活性化タンパク質結合配列により、正の制御を行い得、これは、存在する場合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して近位（５’）にある。遺伝子活性化タンパク質の一例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ｌａｃオペロンの転写開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３）。したがって、制御された発現は、正又は負の何れかのものであり得、それにより、転写が促進されるか又は抑制させる。
代謝経路酵素をコードする配列は、特に、有用なプロモーター配列を与える。一例として、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９７７）１９８：１０５６）及びマルトースなどの糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＵＣ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開第０３６７７６号及び同第１２１７７５号（参照により本明細書中に組み込む。））などの生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）２９２：１２８］及びＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。］プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を与える。本発明の好ましい方法は、Ｔ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用して、高レベルでｈＩＦＮポリペプチドを誘導する。このようなベクターの例は当業者に公知であり、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２９シリーズ及びＷＯ９９／０５２９７（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載のｐＰＯＰベクターが含まれる。このような発現系は、宿主細胞生存能又は増殖パラメータを害することなく宿主においてｈＩＦＮポリペプチドの高いレベルを産生する。ｐＥＴ１９（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、本分野において公知の別のベクターである。
さらに、天然にはない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を別の細菌又はバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結させて、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る（米国特許第４，５５１，４３３号（参照により本明細書中に組み込む。））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサーにより制御されるｌａｃオペロン配列の両方からなる、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．（１９８３）８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させることができる非細菌由来の天然プロモーターを含み得る。原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルで発現させるために、非細菌由来の天然プロモーターを適合するＲＮＡポリメラーゼと組み合わせることもできる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、組み合わされたプロモーター系の一例である（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーター及びＥ．コリオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開第２６７８５１）。
機能するプロモーター配列に加え、原核細胞での外来遺伝子の発現に対しては効率的なリボソーム結合部位も有用である。Ｅ．コリにおいて、リボソーム結合部位は、Ｓｈｉｈｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）及び開始コドンの３から１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．コリ１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる（Ｓｔｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｅｌｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｓｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編、１７９７））。弱いリボソーム結合部位を有する真核遺伝子及び原核遺伝子を発現させるために（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．１９８９）。
「細菌宿主」又は「細菌宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた細菌を指す。この用語は、形質移入されたオリジナルの細菌宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な変異のために、単一の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ｈＩＦＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
ｈＩＦＮポリペプチドの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者にとって公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、優れた封入体形成能、低いタンパク質分解活性及び全体的な頑強性を有することを示すものを含み得る。細菌宿主は通常、以下に限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。工業的／製薬的発酵は通常、Ｋ株（例えばＷ３１１０）由来の細菌又はＢ株（例えばＢＬ２１）由来の細菌を使用する。これらの株は、その増殖パラメータが非常によく知られており頑強なので、特に有用である。さらに、これらの株は、非病原性であり、安全性及び環境面の理由で商業上重要である。適切なＥ．コリ宿主の他の例には、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ又はこれらの誘導体の株が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法の別の実施形態において、Ｅ．コリ宿主は、以下に限定されないがＯＭＰ−及びＬＯＮ−などの、プロテアーゼマイナス株である。宿主細胞株は、以下に限定されないが、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ）及び（シュードモナス・プチダ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナスの菌種である。シュードモナス・フルオレセンス次亜種１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｂｉｏｖａｒ １）（ＭＢ１０１株と呼ばれる。）は、組み換え産生に有用であることが知られており、治療用タンパク質産生過程で利用可能である。シュードモナス菌発現系の例としては、宿主株として、Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ、ｄｏｗ．ｃｏｍにおいてＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで利用可能。）から入手可能な系が挙げられる。米国特許第４，７５５，４６５号及び同第４，８５９，６００号（本明細書中に参照により組み込む。）は、ｈＩＦＮ産生のための宿主細胞としてのシュードモナス菌株の使用について述べている。
組み換え宿主細胞株を確立（即ち、発現構築物を宿主細胞に導入し、正しい発現構築物を有する宿主細胞を単離する。）した後、ｈＩＦＮポリペプチドの産生に適切な条件下でその組み換え宿主細胞株を培養する。当業者にとって当然のことながら、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用する発現構築物の性質及び宿主細胞の種類に依存する。当業者にとって公知である方法を用いて組み換え宿主株を普通に培養する。組み換え宿主細胞は、典型的には、炭素、窒素及び無機塩の同化可能なソースを含有し、場合によっては、当業者にとって公知である、ビタミン、アミノ酸、増殖因子及びその他のタンパク性の培地補助物質を含有する液体培地中で培養する。宿主細胞培養用の液体培地は、望ましくない微生物の増殖を防ぐために抗生物質又は抗真菌剤を場合によっては含有し得、及び／又は、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択するために、以下に限定されないが抗生物質などの化合物を含有し得る。
組み換え宿主細胞をバッチ又は連続様式の何れかで培養し、細胞を回収する（ｈＩＦＮポリペプチドが細胞内に蓄積する場合。）、又はバッチ又は連続様式で培養上清を回収し得る。原核生物宿主細胞で産生を行う場合、バッチ培養及び細胞回収が好ましい。原核生物宿主細胞で産生を行う場合、バッチ培養及び細胞回収が好ましい。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、通常、組換え系での発現後に精製される。Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（１９９４） ２９８：７１９−７２５；Ｒｏｓｃｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ（２００５） １６：２００−２０７；Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９９） １５：２３６−２４２；ａｎｄ Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００４） ３５：３５３−３５９（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、組換えインターフェロンの発現、精製、単離及び性質決定の方法を記載する。ｈＩＦＮポリペプチドは、本分野で公知の様々な方法によって、宿主細胞又は培地から精製され得る。細菌宿主細胞中で産生されたｈＩＦＮポリペプチドは、溶解性が低いか、又は不溶性であり得る（封入体形態において）。本発明の一実施形態において、本明細書中で開示されている、ならびに本分野で公知の方法を利用して、組み換え産生されたタンパク質の溶解性を高める目的で選択されたアミノ酸置換を、ｈＩＦＮポリペプチドにおいて容易に行い得る。不溶性タンパク質の場合、遠心分離により宿主細胞可溶化液からタンパク質を回収し得、さらに続いて、細胞のホモジェナイズを行い得る。溶解性の乏しいタンパク質の場合、化合物（以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。）を添加して、ある程度可溶性のタンパク質の沈殿を誘導し得る。次に、沈殿したタンパク質を従来どおり遠心分離により回収し得る。当業者にとって公知である様々な方法を用いて、組換え宿主細胞を破壊又はホモジェナイズして細胞内から封入体を放出させ得る。以下に限定されないが、酵素的細胞破壊、超音波破砕、ダウンス型ホモジェナイズ又は高圧放出破壊法などの周知の技術を用いて、宿主細胞破壊又はホモジェナイズを行い得る。本発明の方法の一実施形態において、高圧放出技術を使用して、Ｅ．コリ宿主細胞を破壊し、ｈＩＦＮポリペプチドの封入体を放出させ得る。ｈＩＦＮポリペプチドの封入体を扱う場合、可溶化、機械的せん断又はタンパク質分解などの要素による喪失なく封入体の回収率を最大にするために、繰り返しでのホモジェナイズ時間を最短にすることが有利であり得る。
次に、当技術分野で公知の多くの適切な可溶化剤の何れかを用いて、不溶性のｈＩＦＮポリペプチド又は沈殿したｈＩＦＮポリペプチドを可溶化し得る。ｈＩＦＮポリペプチドは、尿素又は塩酸グアニジンを用いて可溶化し得る。都合よく操作できるバッチサイズを用いて大きなバッチを産生できるように、可溶化されたｈＩＦＮポリペプチド−ＢＰの体積は最少に抑えるべきである。数千リットルもの体積であるバッチにおいて組み換え宿主を増殖させ得る大規模な工業的設定において、この要素は重要であり得る。さらに、大規模な工業的設定でｈＩＦＮポリペプチドを製造する場合、特にヒトの医薬品の用途の場合、機械類もしくは容器類又はタンパク質産物そのものに損傷を与え得る強い化学物質の回避は、可能であれば避けるべきである。本発明の方法においては、強い変性剤である塩酸グアニジンの代わりにより穏やかな変性剤である尿素を使用してｈＩＦＮポリペプチド封入体を可溶化できることが示されている。尿素を使用することにより、ｈＩＦＮポリペプチド封入体を効率的に可溶化しながら、ｈＩＦＮポリペプチドの製造及び精製過程で利用するステンレス鋼の設備に損傷を与えるリスクが顕著に低下する。
可溶性ｈＩＦＮタンパク質の場合には、ペリプラスム間隙又は培地中にｈＩＦＮを分泌させ得る。さらに、宿主細胞の細胞質に可溶性ｈＩＦＮが存在し得る。精製段階を行う前に、可溶性ｈＩＦＮを濃縮することが望ましいものであり得る。当業者に公知の標準的技術を用いて、例えば、細胞可溶化液又は培地から、可溶性ｈＩＦＮを濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質又はペリプラスム間隙から可溶性ｈＩＦＮを放出させ得る。
融合タンパク質としてｈＩＦＮが産生される場合には、融合配列は除去され得る。酵素的又は化学的切断によって、融合配列の除去を行い得る。当業者にとって公知の方法を用いて、融合配列の酵素的除去を行い得る。融合配列を除去するための酵素の選択は、融合物が何であるかによって決まり、当業者にとって当然のことながら、反応条件は選択した酵素によって特定される。化学的切断は、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ及びその他の試薬など（これらに限定されない。）、当業者に公知の試薬を用いて行い得る。切断されたｈＩＦＮポリペプチドは、切断された融合配列から、当業者に公知の方法により精製され得る。当業者にとって当然のことながら、融合配列及びｈＩＦＮポリペプチドが何であるか及びそれらの特性により、このような方法が決定される。精製方法には、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析又はそれらの何らかの組合せが含まれ得る。
タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、またｈＩＦＮポリペプチドが精製され得る。沈殿又はイオン交換クロマトグラフィーなど、何らかの適切な当技術分野で公知の方法により、ＤＮＡを除去し得るが、限定されないが硫酸プロタミンなどの、核酸沈殿剤を用いた沈殿により除去され得る。限定されないが遠心分離又はろ過などの、標準的な周知の方法を用いて、沈殿されたＤＮＡからｈＩＦＮポリペプチドを分離し得る。ヒトを治療するためにｈＩＦＮポリペプチドを使用すべき状況において、宿主核酸分子の除去は重要な要素であり、本発明の方法により、宿主細胞ＤＮＡが医薬として許容されるレベルに低下する。
小規模又は大規模発酵の方法はまた、限定されないが、発酵槽、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、中空ファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養系及び撹拌タンクバイオリアクター系など、タンパク質発現において使用することもできる。バッチ、半回分式又は連続様式過程において、これらの方法のそれぞれを行うことができる。
本発明のヒトｈＩＦＮポリペプチドは、一般に、当技術分野で標準的な方法を用いて回収し得る。例えば、培地又は細胞可溶化液を遠心分離又はろ過して、細胞残屑を除去することができる。上清を所望の体積に濃縮もしくは希釈するか、又はさらなる精製のための調製に馴化するために適切な緩衝液中に透析ろ過することができる。ｈＩＦＮポリペプチドのさらなる精製には、変形されていない形態からのｈＩＦＮポリペプチドバリアントの脱アミド化され、短縮され、アセチル化され、及び酸化された形態を分離することが含まれる。
次の代表的な操作の何れかを本発明のｈＩＦＮポリペプチドの精製に用いることができる：アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー以下に限定されないが、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを用いる。）；シリカにおけるクロマトグラフィー；高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５などを用いる。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動操作（限定されないが、分取等電点電気泳動を含む。）、異なる溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出。“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（１９９８） Ｊａｎｓｏｎ ｅｔ Ｒｙｄｅｎ ｅｄｓ．（Ａ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）は、クロマトグラフィー及び電気泳動の様々な方法並びに精製スキームを最適化するための各方法内で実施可能な修飾を記載している。
当業者にとって公知であり、当業者により使用されている標準的手段に従い、以下に限定されないが非天然アミノ酸を含むタンパク質、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する結合対などを含む、本発明のタンパク質を、部分的に又は実質的に均一になるように精製することができる。したがって、以下に限定されないが硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などを含む、当業者に公知の多くの方法の何れかにより、本発明のポリペプチドを回収及び精製することができる。正しく折り畳まれた成熟タンパク質の生成において、所望のとおりに、タンパク質再折り畳み段階を使用することができる。高純度が望まれる最終精製段階において、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又はその他の適切な方法を利用することができる。一実施形態において、以下に限定されないが、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質又の親和性を利用した精製のためなど、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含むタンパク質）に対して作製された抗体を精製試薬として使用する。望みどおり、ある程度又は均一になるまで精製した後、以下に限定されないがアッセイ成分、治療剤、予防剤、診断薬、研究試薬及び／又は抗体産生のための免疫原などとして、ポリペプチドを多岐にわたる用途に場合によっては使用する。
本明細書で示した他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折り畳み法が当業者に公知であり、これには、以下に限定されないが、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｎｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ、（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．第２版 Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ、（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 第３版 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ，（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９８８），ＣＤ−ＲＯＭのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及び上記文献で引用されている参考文献が含まれる。
真核宿主細胞又は非真核宿主細胞での、非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドの産生の長所の１つは、通常、天然の立体構造にてタンパク質又はポリペプチドが折り畳まれていることである。しかし、本発明のある一定の実施形態において、合成、発現及び／又は精製後、タンパク質が、適切なポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有し得ることを当業者は認識する。本発明の一態様において、発現されたタンパク質又はポリペプチドを場合によっては変性させ、次いで再生する。以下に限定されないが、関心のあるタンパク質又はポリペプチドへのシャペロニンの添加によるもの、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中でタンパク質を可溶化することによるもの、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することなど、当技術分野で公知の方法を利用してこれを行う。
一般に、発現されたポリペプチドを変性及び還元し、次いで好ましい立体構造にポリペプチドを再折り畳みすることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを関心のある翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び再生する方法は、当業者にとって公知である（上記の参考文献及び、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０を参照のこと。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジンＤＴＥ中での封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。以下に限定されないが、酸化されたグルタチオン及びＬ−アルギニンなどを含有するレドックス緩衝液中でタンパク質を再折り畳みすることができる。再折り畳み剤を流動させるか、あるいは１もしくはそれ以上のポリペプチド又はその他の発現産物と接触させるように移動させるか、又はその逆を行うことができる。
原核生物によるｈＩＦＮポリペプチドの産生の場合、このように産生されたｈＩＦＮポリペプチドを誤折り畳みさせて、生物活性を失わせるか又は低下させることができる。「再折り畳み」することにより、タンパク質の生物活性を復元し得る。一般に、例えば１又はそれ以上のカオトロピック剤（例えば尿素及び／又はグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化し（ｈＩＦＮポリペプチドも不溶性である場合）、折り畳みを解き、還元することにより、誤折り畳みされたｈＩＦＮポリペプチドを再折り畳みさせる。カオトロープの中程度の濃度において、次いで酸化剤（例えば、酸素、シスチン又はシスタミン）を添加し、これにより、ジスルフィド結合を再形成させる。米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号及び同第４，５１２，９２２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載の方法などの、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、ｈＩＦＮポリペプチドを再折り畳みさせ得る。ｈＩＦＮポリペプチドは、ヘテロ二量体又はヘテロ多量体を形成させるために、他のタンパク質と同時折り畳みさせることもできる。
再折り畳み後、ｈＩＦＮをさらに精製し得る。ｈＩＦＮの精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど又はこれらのあらゆる組み合わせを含む、当業者に公知の様々な技術を用いて達成され得る。さらなる精製は、精製されたタンパク質の乾燥又は沈殿の工程も含み得る。
精製後、ｈＩＦＮは、限外ろ過及び透析などの（これらに限定されない。）、本分野で公知の様々な方法の何れかによって異なる緩衝液中に交換し、及び／又は濃縮し得る。単一の精製されたタンパク質として与えられるｈＩＦＮは、凝集及び沈殿に供し得る。
精製されたｈＩＦＮは、逆相高性能液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された場合に）少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋、又は少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％又はこれより純粋であり得る。ｈＩＦＮの純度の正確な数値に関わらず、ｈＩＦＮは、医薬品として使用するために、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの結合など、さらなる加工のために十分に純粋である。
ある種のｈＩＦＮ分子は、他の活性成分若しくはタンパク質（賦形剤、担体及び安定化剤、血清アルブミンなど以外）の不存在下で、治療剤として使用することができ、又は他のタンパク質若しくはポリマーと複合体を形成させ得る。
一般的な精製方法
ｈＩＦＮポリペプチドを含む細胞可溶化液、抽出物、細胞培地、封入対、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質若しくは他の物質に対して、又は何らかの単離段階（以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張層吸着又はこれらの何らかの組合せ及び／又は繰り返し（あらゆる適切な順番で）など）の結果生じるあらゆるｈＩＦＮポリペプチド混合物に対して、様々な単離段階のうち何れかを行い得る。
本明細書中に記載の技術を行う際に使用する装置及びその他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー及びシステム全体は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。以下に限定されないが、交換マトリックス材料、溶液及び緩衝液を含むクロマトグラフィーの材料もまた、このような会社から入手可能である。
ポンプなどの特別に設計された装置を用いて、平衡化並びに洗浄及び溶出などの本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィー過程におけるその他の段階をより迅速に行うことができる。市販のポンプとしては、以下に限定されないが、ＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）ポンプＰ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ Ｐ−１、Ｐｕｍｐ Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃフラクションコレクター、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター及びＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（Ｒ）フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。ミキサーはまた、ｐＨ及び直線的な濃度勾配を形成するために利用できる。市販されているミキサーとしては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｉｘｅｒ ＧＭ−１及びＩｎ−Ｌｉｎｅ Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
何らかの市販のモニターを使用してクロマトグラフィー過程をモニタリングし得る。このようなモニターを使用して、ＵＶ、ｐＨ及び伝導度などの情報を収集し得る。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（Ｒ）Ｓ ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−Ｍ ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ ｐＨ／Ｃ９００及びＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。実際に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得られる様々なＡＫＴＡ（Ｒ）システムなど、全体的なシステムが市販されている。
本発明の一実施形態において、まず、例えば、得られた精製ｈＩＦＮポリペプチドを尿素中で変性させ、次いで、適切なｐＨにて還元剤（ＤＴＴなど）を含有するＴＲＩＳ緩衝液中に希釈することにより、ｈＩＦＮポリペプチドを還元及び変性させ得る。別の実施形態において、約２Ｍから約９Ｍの間の濃度範囲の尿素中でｈＩＦＮポリペプチドを変性させ、次いで、約５．０から約８．０の範囲のｐＨにてＴＲＩＳ緩衝液中で希釈する。次に、この実施形態の再折り畳み混合物を温置する。一実施形態において、室温にて４時間から２４時間、再折り畳み混合物を温置する。次いで、還元及び変性されたｈＩＦＮポリペプチド混合液をさらに単離するか又は精製することができる。
本明細書中で述べるように、何らかの以降の単離段階を行う前に、第一のｈＩＦＮポリペプチド混合液のｐＨを調整し得る。さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、第一のｈＩＦＮポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知である技術を用いて、第一のｈＩＦＮポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を含む溶出緩衝液を、次の単離段階に適切な緩衝液に交換し得る。
イオン交換クロマトグラフィー 一実施形態において、及び場合により実施されるさらなる段階として、第一のｈＩＦＮポリペプチド混合物に対してイオン交換クロマトグラフィーを行い得る。全般的に、ＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を参照のこと。市販されているイオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。このようなカラムは、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ及びＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ及びＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体；及びＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用する。精製過程の何れかの段階でｈＩＦＮポリペプチドに対して陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、実質的に精製されたｈＩＦＮポリペプチドを単離し得る。何らかの適切な陽イオン交換マトリクスを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー段階を行い得る。有用な陽イオン交換マトリクスとしては、以下に限定されないが、繊維状、多孔性、非多孔性、微小顆粒、ビーズ状又は架橋された陽イオン交換マトリクス材料が挙げられる。このような陽イオン交換マトリクス材料としては、以下に限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリラート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル又は前出のものの何れかの複合物が挙げられる。
陽イオン交換マトリクスへのｈＩＦＮポリペプチドの吸着後、十分に高いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝液とマトリクスとを接触させてマトリクスからｈＩＦＮポリペプチドを排除することにより、実質的に精製されたｈＩＦＮポリペプチドを溶出し得る。実質的に精製されたｈＩＦＮポリペプチドの高ｐＨ溶出での使用に適切な緩衝液としては、以下に限定されないが、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲の、クエン酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液が含まれ得る。
逆相クロマトグラフィー 当業者にとって公知である適切なプロトコールに従い、ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、タンパク質を精製し得る。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照のこと。ｈＩＦＮポリペプチドに対してＲＰ−ＨＰＬＣを行って、実質的に精製されたｈＩＦＮポリペプチドを単離し得る。この場合、以下に限定されないが、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８など、様々な長さのアルキル官能基によるシリカ誘導体化樹脂を使用し得る。あるいは、ポリマー性樹脂を使用し得る。例えば、ＴｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用し得る（これは、スチレンポリマー樹脂である。）。様々なアルキル鎖長を有するシアノ又はポリマー性樹脂も使用し得る。さらに、エタノールなどの溶媒を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを洗浄し得る。ＳｏｕｒｃｅＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの別の例である。
イオン対合剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル又はエタノールなどの有機変性剤を含有する適切な溶出緩衝液を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからｈＩＦＮポリペプチドを溶出し得る。最も一般的に使用されるイオン対合剤としては、以下に限定されないが、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられる。分離時間を短くし、ピーク幅を狭めるのに好ましい勾配条件を用い、１つ又はそれ以上の勾配もしくは定組成条件を用いて、溶出を行い得る。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２種類の勾配を使用することを含む。本明細書中での使用に適切な溶出緩衝液の例としては、以下に限定されないが、酢酸アンモニウム及びアセトニトリル溶液が挙げられ得る。
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
ｈＩＦＮポリペプチドに対して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行い得る。全般的に、ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を参照のこと（参照により本明細書中に組み込む。）。適切なＨＩＣマトリクスとしては、以下に限定されないが、アガロース、架橋されたアガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリラート）マトリクス及び混合された様式の樹脂（以下に限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂又はブチルもしくはフェニル置換されたポリ（メタクリラート）マトリクスなど）を含む、アルキル又はアリール置換されたマトリクス、例えばブチル、ヘキシル、オクチル又はフェニル置換されたマトリクスなどが含まれ得る。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販ソースとしては、以下に限定されないが、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＥＲ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。
簡単に述べると、酢酸／塩化ナトリウム溶液又は硫酸アンモニウムを含有するＨＥＰＥＳなどの、当業者にとって公知の標準的緩衝液を用いて、試料添加前にＨＩＣカラムを平衡化し得る。ＨＩＣカラムに搭載するための緩衝液として、硫酸アンモニウムを使用し得る。ｈＩＦＮポリペプチドを添加した後、次に、標準的緩衝液及び不必要な物質を除去するが、ｈＩＦＮポリペプチドはＨＩＣカラムに保持し続ける条件を用いてカラムを洗浄し得る。特に、ＥＤＴＡ及び平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液又は酢酸／塩化ナトリウム緩衝液などの標準的緩衝液の約３から約１０カラム体積でｈＩＦＮポリペプチドを溶出し得る。例えばリン酸カリウムの勾配を用いて、塩を直線的に低下させる勾配を使用して、ｈＩＦＮ分子を溶出することもできる。次に、例えば透析ろ過又は限外ろ過などのろ過により、溶出物を濃縮し得る。透析ろ過を利用して、ｈＩＦＮポリペプチドを溶出するために用いた塩を除去し得る。
その他の精製技術 例えば、ゲルろ過（ＧＥＬ ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（参照により本明細書中に組み込む。）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）などの、適切なマトリクス）、ＨＰＬＣ、膨張層吸着、限外ろ過、透析ろ過、凍結乾燥などを用いて、第一のｈＩＦＮポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物に対してさらに別の単離段階を行い、あらゆる過剰な塩を除去し、緩衝液を次の単離段階もしくは最終薬剤産物の処方にも適した緩衝液で置換することができる。
当業者にとって公知の技術を用いて、本明細書中に記載されている各段階で、実質的に精製されたｈＩＦＮポリペプチドを含むｈＩＦＮポリペプチドの収率をモニタリングし得る。最後の単離段階後に、このような技術を用いて、実質的に精製されたｈＩＦＮポリペプチドの収率を評価することもできる。例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ；ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣなどの、様々なアルキル鎖長を有する幾つかの逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムの何れかを用いて、ｈＩＦＮポリペプチドの収率をモニタリングし得る。
本発明の具体的な実施形態において、各精製段階後のｈＩＦＮの収率は、各精製段階の出発物質中のｈＩＦＮの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％又は少なくとも約９９．９９％であり得る。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準的技術を用いて、又はウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いてｈＩＦＮポリペプチドを測定することにより、純度を決定し得る。例えば、ネガティブ対照の酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離したタンパク質に対してポリクローナル抗体を生成させ得る。この抗体を使用して、混入宿主細胞タンパク質の存在を調べることもできる。
ＲＰ−ＨＰＬＣ物質、Ｖｙｄａｃ Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を有する表面からなる。タンパク質性不純物からのｈＩＦＮポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度の相違に基づく。希釈されたトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて溶出を行う。ステンレス鋼カラムを用いて分取ＨＰＬＣを行う（Ｖｙｄａｃ Ｃ４シリカゲル２．８から３．２Ｌで満たす。）。トリフルオロ酢酸を添加することにより、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出液を酸性化し、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムに添加する。洗浄及び溶出のために、希釈されたトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いる。画分を回収し、すぐにリン酸緩衝液で中和する。ＩＰＣ限界内のｈＩＦＮポリペプチド画分をプールする。
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）物質は、セファロースビーズの表面に共有結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基への選択したｈＩＦＮポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。保持されることなく、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸がカラムを通過する。これらの物質を洗い流した後、低ｐＨの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより、微量の不純物を除去する。次に、このカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄し、イオン強度が上昇していく緩衝液を用いてｈＩＦＮポリペプチドを溶出する。カラムにＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗを充填する。３から１０ｍｇのｈＩＦＮポリペプチド／ｍｌゲルの範囲でｈＩＦＮポリペプチドを添加することができるようにするために、カラム体積を調整する。水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）でカラムを洗浄する。ＨＰＬＣ溶出の画分をプールしたものを添加し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。次に、カラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄する。続いて、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムからｈＩＦＮポリペプチドを溶出し、主たる溶出プロファイルに従い、単一の画分中に回収する。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出液を指定の伝導度に調整する。得られた薬物物質をろ過滅菌してＴｅｆｌｏｎボトルに入れ、−７０℃で保管する。
使用し得るさらなる方法としては、エンドトキシンを除去する段階が挙げられる。エンドトキシンは、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に位置するリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低下させる方法は当業者にとって公知であり、これには、以下に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末又はヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相、アフィニティー、サイズ排除、陰イオンクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組合せなどが含まれる。一緒に移動したタンパク質などの夾雑物を目的のポリペプチドから除去するために、変法又はさらなる方法が必要であり得る。エンドトキシンのレベルを測定するための方法は当業者に公知であり、カブトガニアメーバ様細胞可溶化液（ＬＡＬ）アッセイが含まれるが、これに限定されない。ＥｎｄｏｓａｆｅＴＭ−ＰＴＳアッセイは、携帯型分光光度計とともに、ＬＡＬ試薬、発色基質及び対照標準エンドトキシンが予め充填されたカートリッジを使用する比色分析単一管系である。別の方法には、比濁法であり、９６ウェルフォーマットを使用するＫｉｎｅｔｉｃ ＬＡＬ法が含まれるが、これに限定されない。
以下に限定されないが、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、マススペクトロメトリー（以下に限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む。）及び当業者にとって公知の、タンパク質の特徴を調べるためのその他の方法など、多岐にわたる方法及び手段を使用して、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮタンパク質の収率及び純度を評価することができる。
さらなる方法には、タンパク質染色法と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析的陰イオン交換、クロマトフォーカシング及び円二色性が含まれるが、これらに限定されない。
ＶＩＩＩ．代替系での発現
非組み換え宿主細胞、変異誘発された宿主細胞又は細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、いくつかの戦略が利用されてきた。これらの系はまた、本発明のｈＩＦＮポリペプチドの作製での使用にも適切である。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒなどの反応性側鎖によるアミノ酸の誘導体化により、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変換された。化学合成によっても、非天然アミノ酸を取り込む直接的な方法が得られる。ペプチド断片の、酵素的ライゲーション及びネイティブ化学ライゲーションの最近の開発により、より大きなタンパク質を調製することが可能である。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ及びＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６９：９２３（２０００）。化学的ペプチド連結及び固有化学的連結は、米国特許第６，１８４，３４４号、米国特許公開第２００４／０１３８４１２号、米国特許公開第２００３／０２０８０４６号、ＷＯ ０２／０９８９０２号及びＷＯ ０３／０４２２３５号に記載されており、これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。１００を超える非天然アミノ酸を実質的にあらゆるサイズの様々なタンパク質へ部位特異的に取り込むために、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、タンパク質生合成を支持可能なインビトロ抽出物に添加するという一般的なインビトロ生合成法が使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５、３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，ＳＪ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ、ＣＧ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）を参照のこと。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素機構及びシグナル伝達の研究のために、幅広い官能基がタンパク質に導入されてきた。
野生型シンテターゼの乱交性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を利用するために、選択圧取り込みと呼ばれるインビボ法が開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ、Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３：４１（１９９９）を参照のこと。天然アミノ酸の限定濃度を含有する最小培地で、特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路のスイッチがオフになっている栄養要求性株を増殖させ、同時に標的遺伝子の転写を抑制する。定常増殖期の開始時に、天然アミノ酸を枯渇させ、非天然アミノ酸類似体で置き換える。組み換えタンパク質の発現の誘発により、非天然類似体を含有するタンパク質の蓄積が起こる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンをタンパク質に取り込み、容易に同定できる、ＵＶスペクトルの２つの特徴的な肩が示され（例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）を参照。）；トリフルオロメチオニンを使用して、バクテリオファージＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換し、１９Ｆ ＮＭＲによりチトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が調べられ（例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＪ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）；及びトリフルオロロイシンをロイシンの代わりに取り込み、その結果、ロイシンジッパ―タンパク質の温度及び化学安定性が高まった。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ、Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ、Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ、Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）を参照のこと。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニンを様々な組み換えタンパク質に取り込み、Ｘ線結晶解析での相の溶解を促進させる。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ及びＤ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ、Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ、Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ及びＭ．Ｈａｔａｄａ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ、Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ、Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ、Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ、Ａ．Ｈｕｍｍ、Ｌ．Ｐｒａｄｅ、Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：６１６（１９９７）を参照のこと。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニン類似体もまた効率的に取り込まれ、これにより、化学的手段によるタンパク質のさらなる修飾が可能となった。例えば、Ｊ．Ｃ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ、Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開２００２／００４２０９７（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。
この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、一般に、これにはタンパク質翻訳の忠実度を確実にする高い選択性が必要である。本方法の範囲を広げるある方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩めることであり、これが遂行されたのは限られたケースである。例えば、エシェリヒア．コリのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ２９４をＧｌｙで置換することにより、基質結合ポケットが大きくなり、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化が起こる。Ｍ．Ｉｂｂａ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：７１０７（１９９４）を参照のこと。この変異ＰｈｅＲＳを有するエシェリヒア・コリ株により、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの取り込みが可能となる。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照のこと。同様に、エシェリヒア．コリのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位付近の点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒにより、アザチロシンがチロシンよりも効率的に取り込まれることが分かった。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ、Ｔ．Ｉｗａｍａ、Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ、Ｋ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ、Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、Ｄ．Ｓｏｌｌ及びＳ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照のこと。
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで取り込むための別の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは識別することができず、したがって、同種の天然アミノ酸と構造的に類似のアミノ酸を活性化する。このエラーは別の部位で補正され、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡからのミスチャージアミノ酸が脱アシル化される。シンテターゼの校正活性が機能しない場合、間違って活性化された構造類似体が編集機能を逃れ、取り込まれる。バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）により、このアプローチが近年明らかにされた。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ、Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ、Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ、Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｖ．ｄｅ Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ及びＰ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：５０１（２００１）を参照のこと。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノブチラート（Ａｂｕ）で間違ってアミノアシル化し得；続いて、編集ドメインによりこれらの非同種アミノ酸を加水分解する。エシェリヒア・コリ染色体のランダム変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位に変異を有する変異エシェリヒア・コリ株を選択した。この編集機能欠損ＶａｌＲＳは、ＣｙｓによりｔＲＮＡＶａｌを不正確に処理する。Ａｂｕは立体的にＣｙｓに類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基はＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置き換えられている。）、この変異エシェリヒア・コリ株をＡｂｕ存在下で増殖させた場合、変異ＶａｌＲＳもまたタンパク質にＡｂｕを取り込む。質量分析から、ネイティブタンパク質中の各バリン位置においてバリンの約２４％がＡｂｕにより置換されることが示される。
固相合成及び半合成法によってもまた、新規アミノ酸を含有する多くのタンパク質の合成が可能となった。例えば、次のような、以下の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｈ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｒａｌ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ，２２：４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅａｎｓ？ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３（１９９４）。
インビトロでタンパク質に補因子、回転脱水標識及びオリゴヌクレオチドなどの様々な非天然側鎖を導入するために、化学修飾が使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．ｅｔ Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｄｅｒ Ａ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，８８：３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照のこと。
あるいは、いくつかの生物物理学的プローブをインビトロで合成されたタンパク質に取り込むために、化学的に修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成法が使用されてきた。例えば、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｓｃｅｎｔ ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
以前、所望のアンバーナンセンス変異を含有する遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＭＡを加えることにより、非天然アミノ酸がインビトロでタンパク質に部位特異的に取り込まれ得ることが示された。これらのアプローチを用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である株を使用し、多くの一般的な２０種類のアミノ酸を構造が近い相同体で、例えばフェニルアラニンに対してフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ、Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．２０２ ３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２４、４３５−６２（１９９５）を参照のこと。
例えば、停止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡを調製し、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化した。従来の部位特異的変異誘発を使用して、タンパク質遺伝子の関心のある部位に停止コドンＴＡＧを導入した。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ及び変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において組合せた場合、指定の位置にそのアミノ酸を含有するタンパク質を与えるＵＡＧコドンに反応して非天然アミノ酸が取り込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験から、所望するアミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定された位置に取り込まれること、及びこのアミノ酸がタンパク質中の他の何れの位置にも取り込まれないことが分かった。例えば、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（６）：４２５−４３２；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）を参照のこと。
ｔＲＮＡは、化学的又は酵素的なアミノアシル化を含む（これらに限定されない。）あらゆる方法又は技術によって、所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって、又はリボザイムを含む（これに限定されない。）他の酵素分子によって達成し得る。「リボザイム」という用語は、「触媒的ＲＮＡ」と互換的である。Ｃｅｃｈと共同研究者ら（Ｃｅｃｈ， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３６：１５３２−１５３９；ＭｃＣｏｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２２１−２２６）は、触媒として作用することが可能な天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在を実証した。しかしながら、これらの天然ＲＮＡ触媒は、リボ核酸基質に対して、切断及びスプライシングのために作用することが示されているに過ぎず、リボザイムの人工的な進化の最近の発展により、様々な化学反応に対する触媒のレパートリーが拡大している。研究によって、それら自身の（２’）３’末端に対してアミノアシルＲＮＡ結合を触媒することが可能なＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：６４３−６４７）及びあるＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子へとアミノ酸を転移させることが可能なＲＮＡ分子（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４４２−４４４）が同定されている。
米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、リボザイムを構築する方法並びに天然にコードされているアミノ酸及び天然にコードされていないアミノ酸を用いた、ｔＲＮＡのアミノアシル化におけるそれらの使用について記載している。ｔＲＮＡをアミノアシル化させることが可能な酵素的分子（リボザイムを含むが、これに限定されない。）の基質に固定された形態は、アミノアシル化された産物の効率的なアフィニティー精製を可能とし得る。適切な基質の例には、アガロース、セファロース及び磁気ビーズが含まれる。アミノアシル化用リボザイムの基質固定化された形態の作製及び使用は、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３， １０：１０７７−１０８４」及び米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
化学的なアミノアシル化の方法には、アミノアシル化におけるシンテターゼの使用を回避するために、Ｈｅｃｈｔと共同研究者ら（Ｈｅｃｈｔ， Ｓ． Ｍ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． １９９２， ２５， ５４５；Ｈｅｃｋｌｅｒ， Ｔ． Ｇ．；Ｒｏｅｓｓｅｒ， Ｊ． Ｒ．；Ｘｕ， Ｃ；Ｃｈａｎｇ， Ｐ．；Ｈｅｃｈｔ， Ｓ． Ｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８， ２７， ７２５４；Ｈｅｃｈｔ， Ｓ． Ｍ．；Ａｌｆｏｒｄ， Ｂ． Ｌ．；Ｋｕｒｏｄａ， Ｙ．；Ｋｉｔａｎｏ， Ｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９７８， ２５３， ４５１７）並びにＳｃｈｕｌｔｚ、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びその他（Ｃｏｒｎｉｓｈ， Ｖ． Ｗ．；Ｍｅｎｄｅｌ， Ｄ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９５， ３４， ６２１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｓ． Ａ．；Ｅｌｌｍａｎ， Ｊ． Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１， １１３， ２７２２；Ｎｏｒｅｎ， Ｃ． Ｊ．；Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ， Ｓ． Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ， Ｍ． Ｃ；Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９， ２４４， １８２；Ｂａｉｎ， Ｊ． Ｄ．；Ｇｌａｂｅ， Ｃ． Ｇ．；Ｄｉｘ， Ｔ． Ａ．；Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ， Ａ． Ｒ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８９， １１１， ８０１３；Ｂａｉｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９２， ３５６， ５３７；Ｇａｌｌｉｖａｎ， Ｊ． Ｐ．；Ｌｅｓｔｅｒ， Ｈ． Ａ．；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ， Ｄ． Ａ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １９９７， ４， ７４０；Ｔｕｒｃａｔｔｉ， ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ２７１， １９９９１；Ｎｏｗａｋ， Ｍ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ２６８， ４３９；Ｓａｋｓ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９９６， ２７１， ２３１６９；Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， ３４）（これらは、参照により、本明細書宙に組み込まれる。）によって導入された方法が含まれるが、これらに限定されない。このような方法又は他の化学的アミノアシル化の方法は、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するために使用し得る。
触媒的ＲＮＡを生成するための方法は、ランダム化されたリボザイム配列の個別のプール生成すること、プールに対して誘導された進化を実施すること、所望のアミノアシル化活性についてプールをスクリーニングすること、及び所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列を選択すること、を含み得る。
リボザイムは、ＧＧＵモチーフ及びＵが豊富な領域などの、アシル化活性を促進させるモチーフ及び／又は領域を含むことが可能である。例えば、Ｕが豊富な領域はアミノ酸基質の認識を促進させ得ること、及びＧＧＵモチーフはｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成し得ることが報告されている。共同して、ＧＧＵ及びモチーフ及びＵが豊富な領域は、アミノ酸とｔＲＮＡの両方の同時認識を同時に促進し、これにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を促進する。
リボザイムは、ｔＲＮＡＡｓｎ ＣＣＣＧが結合された、部分的にランダム化されたｒ２４ｍｉｎｉを使用し、続いて、活性なクローン中に見出されるコンセンサス配列の体系的エンジニアリングを行うインビトロ選択によって生成することが可能である。本方法によって得られた典型的なリボザイムは、「Ｆｘ３リボザイム」と名付けられ、米国出願公開２００３／０２２８５９３号（その内容は、参照により本明細書宙に組み込まれる。）に記載されており、同族非天然アミノ酸が搭載された様々なアミノアシル−ｔＲＮＡの合成のための多目的触媒として作用する。
基質上への固定は、アミノアシル化されたｔＲＮＡの効率的なアフィニティー精製を可能とするために使用し得る。適切な基質の例には、アガロース、セファロース及び磁気ビーズが含まれるが、これらに限定されない。対応するジアルデヒドを生じさせて樹脂上のＲＮＡの固定化を促進するために、ＲＮＡのリボース上の３’−シス−ジオールを過ヨウ素酸塩で酸化することが可能であるなど、ＲＮＡの化学的構造を活用することによって、樹脂の上にリボザイムを固定することが可能である。安価なヒドラジド樹脂など、樹脂の様々な種類を使用することが可能であり、還元的アミノ化が樹脂とリボザイム間の相互作用を不可逆的連結とする。アミノアシル−ｔＲＮＡの合成は、このオンカラムアミノアシル化技術によって著しく促進することが可能である。「Ｋｏｕｒｏｕｋｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５；３６：２３９−４」は、カラムを基礎としたアミノアシル化システムを記載している。
アミノアシル化されたｔＲＮＡの単離は、様々な様式で達成することが可能である。１つの適切な方法は、１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えた酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンーＮ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する緩衝液又は単純にＥＤＴＡ緩衝化された水（ｐＨ７．０）などの緩衝液で、アミノアシル化されたｔＲＮＡをカラムから溶出することである。
翻訳反応によって作製されるポリペプチド中の選択された位置に、ｔＲＮＡのアミノアシル化に用いたアミノ酸を取り込ませるために、翻訳反応にアミノアシル化されたｔＲＮＡを添加することが可能である。本発明のアミノアシル化されたｔＲＮＡが使用され得る翻訳系の例には、細胞可溶化液が含まれるが、これに限定されない。細胞可溶化液は、入力ｍＲＮＡからポリペプチドをインビトロ翻訳するために必要な反応成分を提供する。このような反応成分の例には、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始及び伸長因子及び翻訳と関連するさらなる因子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、翻訳系は、バッチ翻訳又は区画化された翻訳であり得る。バッチ翻訳系は単一コンパートメント中の反応成分を組み合わせるのに対して、区画化された翻訳系は翻訳効率を阻害することが可能な反応産物から翻訳反応成分を分離する。このような翻訳系は市販されている。
さらに、連結された転写／翻訳系を使用し得る。連結された転写／翻訳系は、対応するｍＲＮＡへの入力ＤＮＡの両転写を可能とし、次いで、対応するｍＲＮＡは反応成分によって翻訳される。市販の連結された転写／翻訳の例は、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ， Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）である。系は、リボソーム及び翻訳因子などの翻訳成分を提供するために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）可溶化液を含有する混合物を含む。さらに、翻訳において使用するためのｍＲＮＡテンプレートへと、入力ＤＮＡを転写するために、ＲＮＡポリメラーゼが含められる。ＲＴＳは、供給／廃棄コンパートメント及び転写／翻訳コンパートメントを含む反応コンパートメントの間に介在される膜によって反応成分のコンパートメント化を使用することが可能である。
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒的抗体、多機能タンパク質などを含む（これらに限定されない。）他の因子によって実行し得る。
「Ｌｕ ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ．２００１ Ｏｃｔ；８（４）：７５９−６９」は、非天然アミノ酸を含有する合成ペプチドに、タンパク質を化学的に連結させる方法（発現されたタンパク質の連結）を記載している。
非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、マイクロインジェクション技術も使用されてきた。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）を参照のこと。インビトロで作製された２種類のＲＮＡ種（関心のあるアミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）をアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注入した。次に、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により、膜内在性タンパク質のインビボ構造−機能研究が可能となった（これは、通常、インビトロ発現系に適さない。）。例としては、蛍光共鳴エネルギー転移により距離を測定するための蛍光アミノ酸のタキキニンニューロキニン−２受容体への取り込み（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌ及びＡ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）を参照。）；イオンチャネルにおいて表面に曝露された残基を同定するためのビオチン化アミノ酸の取り込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）を参照。）；イオンチャネルにおける立体構造変化をリアルタイムでモニタリングするためのケージ化されたチロシン類似体の使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ、２０：６１９（１９９８）を参照；及びそれらのゲーティング機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変化させるためのαヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ、９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ及びＪ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）を参照のこと。
インビボでタンパク質に非天然アミノ酸を直接取り込むことができることから、変異タンパク質の収率が高くなること、技術が容易であること、細胞もしくは可能であれば生きている生物での変異タンパク質の研究の可能性、ならびに、治療処置でのこれらの変異タンパク質の使用などの（これらに限定されない。）様々な長所が得られる。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性及びその他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含有させることができれば、タンパク質機能を調べ、かつ新規の特性を有する新しいタンパク質又は生物を作製するための、タンパク質構造に対する合理的かつ体系的な操作能が飛躍的に拡大し得る。
部位特異的にパラ−Ｆ−Ｐｈｅを取り込むある試みにおいて、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ栄養要求性エシェリヒア．コリ株で、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡ ＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼペアが使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）を参照のこと。
無細胞（インビトロ）翻訳系を用いて本発明のｈＩＦＮポリヌクレオチドの発現を得ることも可能であり得る。翻訳系は、細胞又は無細胞であり得、及び原核生物又は真核生物であり得る。細胞翻訳系には、所望の核酸配列をｍＲＮＡへ転写し、ｍＲＮＡを翻訳することができる透過化された細胞又は細胞培養物などの完全な細胞調製物が含まれるが、これらに限定されるものではない。無細胞翻訳系は市販されており、多くの異なる種類及び系が周知である。無細胞系の例には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）可溶化液などの原核生物可溶化液並びに麦芽抽出物などの真核生物可溶化液、昆虫細胞可溶化液、ウサギ赤血球可溶化液、ウサギ卵母細胞及びヒト細胞可溶化液が含まれるが、これらに限定されない。得られるタンパク質が、グリコシル化され、リン酸化され、又はその他の修飾を受けている場合には、このような多くの修飾は真核生物系でのみ可能なので、真核生物抽出物又は可溶化液が好ましいことがあり得る。これらの抽出物及び可溶化液の幾つかは市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， １１１．；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎ．Ｙ．）。分泌タンパク質を翻訳するのに有用である、ミクロソーム膜を含有するイヌ膵臓抽出物などの膜抽出物も使用できる。これらの系では（テンプレートとしてのｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）又はテンプレートとしてのＤＮＡ（組み合わされたインビトロ転写と翻訳）の何れかを含むことができる。）、インビトロ合成は、リボソームによって誘導される。無細胞タンパク質発現系の開発に対して多大な努力が行われてきた。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１５３７−１５４２（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６６，１８０−１８８（１９９９）；及びＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４，８６２−８６８（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開２００２／００８１６６０；ＷＯ００／５５３５３；ＷＯ９０／０５７８５（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドの発現に対して適用し得る別のアプローチとしては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が含まれる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：１０４３−１０５０（２００３）を参照のこと。このアプローチにおいて、ピューロマイシンに連結されているｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。１つ又はそれ以上のｔＲＮＡ分子が改変されている場合、非天然アミノ酸もそのペプチドに取り込ませることができる。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後、ピューロマイシンがペプチドのＣ末端を捕獲する。生じたｍＲＮＡ−ペプチド結合体が関心のある特性を有することがインビトロアッセイにおいて分かった場合、ｍＲＮＡ配列からそれが何であるかを容易に明らかにすることができる。このようにして、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドのライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定し得る。さらに最近、精製された成分を用いたインビトロリボソーム翻訳により、天然にコードされていないアミノ酸で置換されたペプチドの合成が可能となることが報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）を参照のこと。
再構成された翻訳系も使用し得る。ｍＲＮＡをタンパク質へと首尾よく翻訳するために精製された翻訳因子の混合物がまた使用され、及び可溶化液の組み合わせ又は開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（α又はβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）又は終結因子などの精製された翻訳因子が補充された可溶化液がまた使用されてきた。無細胞系は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３）」に記載されているように（参照により、特に本明細書に具体的に組み込まれる。）、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡへと転写され、ｍＲＮＡが翻訳される連結された転写／翻訳系でもあり得る。真核生物転写系中で転写されたＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）又は５’末端ｃａｐｓ（７−メチルグアノシン）及び３’末端ポリＡ尾部化された成熟ｍＲＮＡの形態であり得、これは、ある種の翻訳系において有利であり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、赤血球可溶化液系中で、高い効率で翻訳される。
ＩＸ．ｈＩＦＮポリペプチドに連結された巨大分子ポリマー
本明細書に記載されている組成物、方法、技術及び戦略を用いて、本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾を為すことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の取り込み（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、回転脱水ラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質が含まれる。）を含む。本明細書に記載されている、組成物、方法、技術及び戦略の例示的な非限定例として、本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略がまた、他の官能基（以下に限定されないが上記で挙げたものなど）を添加するのに適用可能（必要に応じて適切な改変を行い、これは当業者が本明細書中開示を用いて行い得る。）であるという了解のもと、以下の記述は、非天然アミノ酸ポリペプチドに巨大分子ポリマーを添加することに焦点を当てる。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドに多岐にわたる巨大分子ポリマー及びその他の分子を連結してｈＩＦＮポリペプチドの生物学的特性を調節する、及び／又はｈＩＦＮ分子に新しい生物学的特性を与えることができる。天然コードアミノ酸を介して、天然にコードされていないアミノ酸を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸の何らかの官能置換基又は、天然もしくは非天然アミノ酸に付加されている何らかの置換基もしくは官能基を介して、これらの巨大分子ポリマーをｈＩＦＮポリペプチドに連結することができる。このポリマーの分子量は、広範囲にわたり、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上などである。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は３０，０００Ｄａである。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は４０，０００Ｄａである。
本発明は、ポリマー：タンパク質結合体の実質的に均一な調製物を与える。「実質的に均一な」とは、本明細書中で使用する場合、ポリマー：タンパク質結合体分子がタンパク質全体の半分よりも多いことが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質結合体は、生物活性を有し、本明細書中で提供される本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチド調製物は、均一な調製物の長所（例えば、ロットの異なるものの薬物動態の予測可能性において臨床適用が容易であるなど）を示すよう十分均一であるものである。
ポリマー：タンパク質結合体分子の混合物を調製することを選択することもでき、それにより与えられる長所とは、混合物に含めるためのモノポリマー：タンパク質結合体の比を選択し得るということである。したがって、所望であれば、様々な数の結合されたポリマー部分を有する（即ち、ジ−、トリ−、テラ−など）様々なタンパク質の混合物を調製し、本発明の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質結合体と前記結合体を組み合わせ、モノ−ポリマー：タンパク質結合体の前もって決定された比率を有する混合物を有することができる。
選択されたポリマーは、これに結合させるタンパク質が水性環境（生理的環境など）で沈殿しないように水溶性であり得る。このポリマーは、分枝又は非分枝であり得る。最終産物調製物の治療用途の場合、このポリマーは医薬として許容される。
ポリマーの例には、ポリアルキルエーテル及びそのアルコキシキャップ化類縁体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、及びメトキシ又はエトキシキャップ化されたその類縁体、特にポリオキシエチレングリコール、後者は、ポリエチレングリコール又はＰＥＧとしても知られる。）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン及びポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド及びポリヒドロキシアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド及びその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリラート；ポリシアル酸及びその類縁体；親水性ペプチド配列；デキストラン及びデキストラン誘導体、例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストランサルファート、アミノデキストランを含む多糖及びそれらの誘導体；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチン及びその誘導体、例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸及びその誘導体；デンプン；アルギナート；コンドロイチンサルファート；アルブミン；プルラン及びカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸及びその誘導体、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルタミド；スチレンマレイン酸無水物共重合体、ジビニルエチルエーテルマレイン酸無水物共重合体などのマレイン酸無水物共重合体；ポリビニルアルコール；その共重合体；そのターポリマー；その混合物及び先述されているものの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は、反応混合物中におけるこれらの濃度のように、変化する。一般に、最適な比率（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが最小限となる反応効率の観点で）は、選択したポリエチレングリコールの分子量により、及び利用可能な反応性基の数において決定され得る。分子量に関連して、通常、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合させ得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメータを最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率が高くなる。
本明細書中で使用する場合、及びＰＥＧ：ｈＩＦＮポリペプチド結合体を想定する場合、「治療的有効量」という用語は、患者に対して利点を与えるウイルスレベルの減少を与える量を指す。この量は、個々の患者により変化し、患者の全体的な身体的状態及び症状の根本的な原因を含む、多くの要因に依存する。治療に使用されるｈＩＦＮポリペプチドの量は、ウイルスレベルの許容可能な減少を与える。本発明の組成物の治療的有効量は、公に入手可能な物質及び手段を用いて当業者により容易に確定され得る。
水溶性ポリマーは、以下に限定されないが、直鎖状、フォーク状又は分枝状を含む、あらゆる構造形態であり得る。典型的には、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などであるが、その他の水溶性ポリマーも利用できる。一例として、ＰＥＧを使用して、本発明のある一定の実施形態を説明する。
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当業者に公知の方法に従い、エチレングリコールの開環ポリマー化により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，１３８−１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、大きさ又はＰＥＧの末端の修飾に関わらずあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、ｈＩＦＮポリペプチドに連結される場合、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
により表すことができる。
（式中、ｎは、２から１０，０００であり、及びＸはＨであり、又は、以下に限定されないがＣ１−４アルキル、保護基又は末端修飾基などの末端修飾である。）。
ある場合において、本発明で使用されるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。あるいは、ＰＥＧは反応性基で終結することができ、これにより、二官能性ポリマーが形成される。典型的な反応性基には、２０種類の一般的アミノ酸で見られる官能基（以下に限定されないが、マレイミド基、活性化されたカーボナート（以下に限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）、活性化されたエステル（以下に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）及びアルデヒドなど）ならびに、２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが天然にコードされていないアミノ酸（アジド基、アルキン基が含まれるが、これらに限定されない。）中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基と反応させるために一般に使用される反応性基が含まれ得る。ＰＥＧの他方の末端（上記式中では、Ｙによって示される。）は、天然又は天然にコードされていないアミノ酸を介して、ｈＩＦＮポリペプチドに直接又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、アミド、カルバマート又はポリペプチドのアミン基（以下に限定されないが、リジンのεアミン又はＮ末端など。）への尿素結合であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（以下に限定されないが、システインのチオール基など。）へのマレイミド結合であり得る。あるいは、Ｙは、２０種類の一般的アミノ酸を介して通常は接近可能ではない残基への結合であり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をｈＩＦＮポリペプチド上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成させることができる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基を天然にコードされていないアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、同様の産物を形成させることができる。幾つかの実施形態において、強い求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドなど）を天然にコードされていないアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応させて、適宜、ヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾンを形成させることができ、ある場合においては、適切な還元剤を用いた処理によりそれをさらに還元することができる。あるいは、天然にコードされていないアミノ酸を介して強い求核試薬をｈＩＦＮポリペプチドに取り込み、これを使用して水溶性ポリマーに存在するケトン又はアルデヒド基と優先的に反応させることができる。
実際に所望される場合、以下に限定されないが、要望どおり、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ又はそれ以上（以下に限定されないが、時には、０．１から５０ｋＤａ又は１０から４０ｋＤａなど）など、ＰＥＧに対するあらゆる分子量を使用することができる。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたり、それは、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上が含まれる。ＰＥＧは、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は３０，０００Ｄａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は４０，０００Ｄａである。以下に限定されないが、各鎖が１から１００ｋＤａの範囲のＭＷを有する（以下に限定されないが、１から５０ｋＤａ又は５から２０ｋＤａなど）ＰＥＧ分子を含む分枝鎖ＰＥＧもまた使用することができる。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、以下に限定されないが、約１，０００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上であり得る。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、及び１，０００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１，０００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧのの各鎖分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａと２０，０００Ｄａの間である。以下に限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ（参照により本明細書中に組み込む。）などに、多岐にわたるＰＥＧ分子が記載されている。
一般に、天然にコードされていないアミノ酸との反応に、少なくとも１つのＰＥＧ分子の末端を利用できる。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、本明細書に記載のとおり、天然にコードされていないアミノ酸にＰＥＧを連結させることができる。天然にコードされていないアミノ酸がアジドを含有する場合、ＰＥＧは通常、［３＋２］付加環化産物の形成を実現するためのアルキン部分又は、アミド結合の形成を実現するためのホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（即ち、エステル、カーボネート）の何れかを含有する。あるいは、天然にコードされていないアミノ酸がアルキンを含有する場合、ＰＥＧは通常、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化産物の形成を実現するためのアジド部分を含有する。天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含有する場合、ＰＥＧは通常、対応するヒドラゾン、オキシム及びオキシム及びセミカルバゾン結合の形成をそれぞれ実現するために、強力な求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド官能基など。）を含有する。あるいは、上述の反応基の方向が逆であるものを使用することができ、即ち、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と天然にコードされていないアミノ酸中のアジド部分を反応させることができる。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するｈＩＦＮポリペプチドバリアントは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性がある化学官能基を含有する。
本発明は、ある実施形態において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格を含有する、アジド−及びアセチレン−含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、以下に限定されないが、ポリ（エチレン）グリコール及びその他の関連ポリマーを含む（ポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）など）多岐にわたる水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適切であり、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、このような分子全てを包含し、含むものとすることを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、以下に限定されないが、そのあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）（二官能性ＰＥＧ、複数アーム化されたＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（即ち、ポリマー骨格に垂れ下がった、１つ又はそれ以上の官能基を有する、ＰＥＧ又は関連ポリマー）又はその中に分解性の結合を有するＰＥＧなど）を含む。
ＰＥＧは、典型的に、透明で無色、無臭、水溶性、熱安定性、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は分解せず、通常は無毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であるとみなされ、つまり、ＰＥＧは、害を与えることなく生体組織又は生物と共存可能である。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、身体において免疫反応を生じさせる傾向がない。生物活性物質など、身体においていくつかの望ましい機能を有する分子に付着させる場合、ＰＥＧは、その物質をマスクする傾向があり、生物がその物質の存在を耐容できるように、あらゆる免疫反応を低下させるか、又は取り除くことができる。ＰＥＧ結合体は実質的な免疫反応を引き起こさない、又は凝固もしくはその他の不必要な影響を生じさせない傾向がある。式：−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−を有するＰＥＧ（式中、ｎは約３から約４０００、典型的には約２０から２０００である。）は、本発明での使用に適切である。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたり、これは、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上であり得る。ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は３０，０００Ｄａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は４０，０００Ｄａである。
ポリマー骨格は、直鎖又は分岐であり得る。分枝ポリマー骨格は、一般に、当技術分野において公知である。通常、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分を有し、直鎖状ポリマー鎖の複数が中央分枝コアに連結されている。ＰＥＧは、一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加により調製することができる分枝形態で使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸由来であり得る。Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトールなどのコア部分由来であり、ｍは腕部分の数を表す。）のような一般式で分枝ポリ（エチレングリコール）を表すことができる。米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；同第５，２２９，４９０号；同第４，２８９，８７２号；米国特許公開２００３／０１４３５９６；ＷＯ９６／２１４６９；及びＷＯ９３／２１２５９（それぞれ本明細書中にその全体を参照により組み込む。）に記載のものなどの、マルチアーム化されたＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として使用できる。
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは、連結基であり、Ｚは指定された長さの原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である。）によって表されるフォーク状ＰＥＧの形態であり得る。
さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応基を有する。
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中の弱い又は分解性結合を用いて、ポリマーを調製することもできる。例えば、加水分解に供されるポリマー骨格中のエステル結合を用いてＰＥＧを調製できる。下記で示すように、この加水分解の結果、ポリマーがより低分子量の断片に切断される。
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧという用語は、以下に限定されないが、本明細書中に開示されているものなど、当技術分野で公知の形態全てを表すか又は含むことが、当業者により理解される。
多くの他のポリマーもまた本発明での使用に適切である。幾つかの実施形態において、水溶性であり、２から約３００の末端を有するポリマー骨格は本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、以下に限定されないが、その他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など、そのコポリマー（以下に限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど）、そのターポリマー、これらの混合物などが挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は様々であり得るが、典型的には、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、多くの場合、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
実質的に水溶性の骨格に対する前述の一覧は、網羅的なものではなく、単なる例示に過ぎず、上述の質を有する全てのポリマー性物質が本発明での使用に適切なものとして想定されることを、当業者は認識する。
本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、これは、つまり、ポリマー骨格が少なくとも２つの末端を有し、官能基により官能化又は活性化された、約３００末端にのぼる末端を有する可能性があることを意味する。多官能性ポリマー誘導体としては、以下に限定されないが、２つの末端（各末端は同じもしくは異なり得る官能基に結合されている。）を有する直鎖状ポリマーが挙げられる。
ある実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり；
Ｂは連結部分（存在してもよく、存在しなくてもよい。）であり；
ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じであるか、又は異なっていてもよい。）であり；
Ｘは、第二の官能基である。）
を有する。
Ａ及びＢに関する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられ、１個から１０個の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝され得る。Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１０個以下の炭素原子を含有する多官能性アリール基が挙げられ、５個から６個の炭素原子を含有し得る。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全ての連結部分が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカーボネート及び１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン及びアジドが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないよう、アジド基と適合可能であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアジド部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
「保護された」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる、保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護する化学的に反応性のある反応基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（例えば、メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど。）であり得る。当技術分野で公知のその他の保護基もまた、本発明において使用し得る。
文献中の末端官能基の具体例としては、以下に限定されないが、Ｎ−スクシニミジルカーボナート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号を参照。）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（２）を参照。）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照。）、スクシニミジルプロピオナート及びスクシニミジルブタノアート（例えば、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１７０−１８１、Ｈａｒｒｉｓ及びＺａｐｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９７を参照。；米国特許第５，６７２，６６２号も参照のこと。）、スクシニミジルスクシナート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照。）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号参照。）、ベンゾトリアゾールカーボナート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号参照。）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照。）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １：２５１（１９８５）を参照。）、ｐ−ニトロフェニルカーボナート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）；及びＳａｒｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照。）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照。）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ２：２９（１９８４）及びＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照。）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照。）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照。）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照。）が挙げられる。上記の参考文献及び特許の全てを本明細書中に参照により組み込む。
本発明のある一定の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、ｎは約２０から約４０００である。）
を有するポリマー骨格を含有する。
別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｗは、１個から１０個の炭素原子を含有する、脂肪族又は芳香族リンカー部分であり；ｎは約２０から約４０００であり；
Ｘは上述のような官能基であり、ｍはｍは１から１０である。）
を有するポリマー骨格を含有する。
当技術分野で公知及び／又は本明細書中で開示されている様々な方法により、本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。下記で示すある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な脱離基に第二の末端が結合するポリマー骨格）をアジド陰イオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどの適切な対イオンの何れかの数と対合し得る。）と反応させる。脱離基は求核置換され、アジド部分により置換され、これにより、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示されているように、本発明での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。）を有する。適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン及びビニルピリジンならびにケトンが挙げられる。適切な脱離基の例としては、以下に限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート及びトシラートが挙げられる。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、アジド官能基を含有する連結剤を平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（ここで、この連結剤は、連結基によりアジドがポリマー骨格から離されているアジド含有ポリマー誘導体産物を形成するために、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応する化学官能基を有する。）に接触させる。
例となる反応スキームを以下に示す。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ → ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；Ｍは、アジド官能基と反応性がないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。）
を有する。
適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、Ｎがアミンである場合、Ｍは、カルボン酸、カーボネート又は活性エステルである；Ｎがヒドラジド又はアミノオキシ部分である場合、Ｍはケトンである；Ｎが求核試薬である場合、Ｍは脱離基であるものが挙げられる。
以下に限定されないが、生成物の沈殿とその後のクロマトグラフィー（必要に応じて）など、公知の方法により、粗製生成物の精製を行い得る。
ＰＥＧジアミンの場合のより具体的な例を下記に示すが、この場合、アミンのうち１個がｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分により保護され、アジド官能基を有する連結部分と、生じたモノ保護化ＰＥＧジアミンとを反応させる。
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この例において、塩化チオニル又はカルボジイミド剤及びＮ−ヒドロキシスクンイミド又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの様々な活性化剤を用いて、アミン基をカルボン酸基とカップリングさせ、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー部分との間にアミド結合を形成させることができる。アミド結合をうまく形成させた後、生じたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護化アジド含有誘導体を直接用いて、生物活性分子を修飾するか、又はこれをさらに変化させて、その他の有用な官能基を取り込むことができる。例えば、強酸での処理によりＮ−ｔ−Ｂｏｃ基を加水分解して、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成させることができる。生じたアミンを合成ハンドルとして使用して、有用なヘテロ二官能性物質を生成させるための、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどのその他の有用な官能基を取り込むことができる。
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたい場合、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧにより、ＰＥＧの一方の末端への、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カーボネートなどの活性化された求電子基を有する分子の結合及びＰＥＧの他方の末端へのアセチレン基を有する分子の結合が可能となる。
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（Ｒは、Ｈ、又はアルキル、アルケン、アルキオキシ又はアリール又は置換されたアリール基の何れかであり得；
Ｂは連結部分（存在してもよく、存在しなくてもよい。）であり；
ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じであるか、又は異なっていてもよい。）であり；
Ｘは、第二の官能基である。）
を有する。
Ａ及びＢに関する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられ、１個から１０個の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝され得る。Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１０個以下の炭素原子を含有する多官能性アリール基が挙げられ、５個から６個の炭素原子を含有し得る。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４４６２号及び同第５，６４３，５７５号及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する多様な連結部分が本発明での使用に有用なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カーボナート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカーボナート及び１−ベンゾトリアゾリルカーボナートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン及びアセチレンが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が起こらないよう、アセチレン基と適合可能であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアセチレン部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ＝ＣＨ：
（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、ｎは約２０から約４０００であり、及びｍは１から１０である。）
を有するポリマー骨格を含有する。
ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーのそれぞれの具体例を下記に示す。
当業者にとって公知の方法及び／又は本明細書中で開示する方法を用いて、本発明のアセチレン−含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。ある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な求核基に第二の末端が結合するポリマー骨格）を、アセチレン官能基と、ＰＥＧ上の求核基との反応に適切な脱離基と、の両方を有する化合物と反応させる。求核部分を有するＰＥＧポリマー及び脱離基を有する分子を組み合わせた場合、脱離基において求核置換が起こり、求核部分により置換され、これにより、所望のアセチレン含有ＰＥＧポリマーが生じる。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示されているように、本反応での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、Ｘは、Ｎｕ、Ｌ又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。）を有する。
Ｎｕの例としては、以下に限定されないが、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、アアミンオキシ基（主にＳＮ２型の機構を介して反応する。）が挙げられる。Ｎｕ基のさらなる例としては、求核付加反応を介して主に反応する官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート及びトシレート及び、求核置換が行われると予想されるその他の基ならびに、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α−β−不飽和カルボニル基、カーボネート及び、求核試薬により付加が起こると予想されるその他の求電子基が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、Ａは、１個から１０個の間の炭素原子の脂肪族リンカー又は６個から１４個の間の炭素原子の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適切な脱離基である。
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり、一方の末端に保護化官能基又はキャッピング剤の何れかを有しており、他方の末端に適切な脱離基を有するＰＥＧポリマーをアセチレ陰イオンと接触させる。
例となる反応スキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
（ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、及びＸは、アルコキシ又は上記官能基などのキャップ基であり、及び
Ｒは、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリール又はアリールオキシ基又は置換されたアルキル、アルコキシル、アリール又はアリールオキシ基の何れかであり得る。）
を有する。
上記の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレン陰イオンと接触させた場合に、ＳＮ２型の置換を起こすよう十分に反応性があるべきである。アセチレン陰イオンによる脱離基のＳＮ２型の置換を遂行するのに必要な反応条件は、当技術分野で周知である。未精製産物の精製は、通常、産物の沈殿後、必要に応じて行われるクロマトグラフィーなど（これらに限定されない。）本分野で公知の方法によって達成することが可能である。
水溶性ポリマーは、本発明のｈＩＦＮポリペプチドに連結することが可能である。水溶性ポリマーは、ｈＩＦＮポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸又は何れかの官能基又は天然にコードされていない若しくは天然にコードされているアミノ酸の置換基、又は天然にコードされていない若しくは天然にコードされているアミノ酸に付加された何らかの官能基若しくは置換基を介して連結され得る。あるいは、水溶性ポリマーは、天然に存在するアミノ酸（システイン、リジン又はＮ末端残基のアミン基を負含むが、これらに限定されない。）を介して、天然にコードされていないアミノ酸を取り込むｈＩＦＮポリペプチドに連結される。幾つかの事例では、本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマー（ＰＥＧ及び／又はオリゴ糖を含むが、これらに限定されない。）に連結されている１、２、３、４、５、６、７、８．９、１０個の非天然アミノ酸を含む。幾つかの事例では、本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、さらに、水溶性ポリマーに連結されている１、２、３、４、５、６、７、８．９、１０個又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの事例において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸及び水溶性ポリマーに連結された天然に存在しない１つ又はそれ以上のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明において使用される水溶性ポリマーは、結合されていない形態に比べて、ｈＩＦＮポリペプチドの血清半減期を増大させる。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）は、インビボ半減期などの変化された（増加又は減少を含むが、これらに限定されない。）薬理学的、薬物動態的又は薬力学的特性を提供するように調整することが可能である。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮの半減期は、修飾されていないポリペプチドに対して、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７−倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍増加される。
強い求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明のある実施形態において、カルボニル含有天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドをＰＥＧ骨格と直接連結される、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾する。
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
ある実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、及び、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）
を有する。
ある実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している、末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
ある実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、及び、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）
を有する。
ある実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有し、分枝ＰＥＧで修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０から４０ｋＤａの範囲のＭＷを有し、５−２０ｋＤａの範囲のＭＷであり得る。
本発明の別の実施形態において、非天然のコードアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
例えば、ある実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、及び、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）
を有する。
ある実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
水溶性ポリマーがｈＩＦＮポリペプチドに連結している程度及び部位により、ｈＩＦＮポリペプチド受容体又は結合対への、部位１におけるｈＩＦＮポリペプチドの結合を調節することができる。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮについて「Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６３：７８６２−７８６７（１９８８）」に記載されているように、平衡結合アッセイによって測定された場合に、ｈＩＦＮポリペプチドが、約４００ｎＭ以下のＫｄで、約４００ｎＭ以下のＫｄで、幾つかの事例では、約１００ｎＭ以下のＫｄで、部位１においてｈＩＦＮポリペプチド受容体が結合するように、結合が用意される。
ポリマーの活性化のための、ならびに、ペプチドの結合のための方法及び化学反応は、文献中に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のために一般的に使用されている方法には、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどでの官能基の活性化が含まれるが、これらに限定されない。（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１）， ＰＲＯＴＥＩＮ ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２）， ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）， ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＬＩＧＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ， Ｒ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。）。
ＰＥＧの官能化及び結合のいくつかの概説及び論文が利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）を参照のこと。
ポリマーの活性化のための方法はまた、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号及びＷＯ９３／１５１８９においても、及び、活性化されたポリマーと、以下に限定されないが、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９）、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジムスターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５（１９８５））を含む酵素との間の結合に対するものも見出すことができる。引用する参考文献及び特許を全て、本明細書中に参照により組み込む。
何らかの従来法により、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＩＦＮポリペプチドのＰＥＧ化（即ち、何らかの水溶性ポリマーの付加）を行う。例えば、アルキン末端ＰＥＧ誘導体によりｈＩＦＮポリペプチドをＰＥＧ化する。簡潔に述べると、室温にて、撹拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ｈＩＦＮポリペプチドの水溶液に固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨの過剰量を添加する。通常、反応を行うｐＨ付近（通常約ｐＨ４から１０）のｐＫａを有する緩衝液で水溶液を緩衝化する。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化のための適切な緩衝液の例としては、例えば、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ及びＴＥＳが挙げられる。ｐＨを連続してモニタリングし、必要に応じて調整する。反応は通常、約１時間から４８時間連続して行う。
続いて反応産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、遊離のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及び、ブロックされていないＰＥＧが分子の両末端で活性化されている場合に形成され得、それによりｈＩＦＮポリペプチドバリアント分子を架橋する、ＰＥＧ化ｈＩＦＮポリペプチドの全ての高分子量複合体から、ＰＥＧ化ｈＩＦＮポリペプチドを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの際の条件は、遊離のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムから流出し、一方であらゆる架橋ＰＥＧ化ｈＩＦＮポリペプチドバリアント複合体が、１又はそれ以上のＰＥＧ基と結合させられている１個のｈＩＦＮポリペプチドバリアント分子を含有する所望の形態の後に溶出するようなものである。適切な条件は、架橋複合体対所望の結合体の相対サイズにより異なり、当業者は容易にこれを決定する。所望の結合体を含有する溶出物を限外ろ過により濃縮し、透析ろ過により脱塩する。
必要に応じて、以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを使用する。）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５などを使用する。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動手法（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動など）、異なる溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿など）又は抽出などの、当業者に公知の１つ又はそれ以上の手段により、疎水性クロマトグラフィーから得たＰＥＧ化ｈＩＦＮポリペプチドをさらに精製することが可能である。球状タンパク質標準（Ｐｒｅｎｅｔａ，ＡＺ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ編）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９，２９３−３０６）と比較することによるＧＰＣによって、見かけの分子量を推定し得る。タンパク質分解（以下に限定されないが、トリプシン切断など。）を行い、次いでマススペクトロメトリー分析を行うことにより、ｈＧＨ−ＰＥＧ結合体の純度を評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
限定なしに、本発明のｈＩＦＮポリペプチドのアミノ酸に連結している水溶性ポリマーをさらに誘導体化するか、又は置換することができる。
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、ｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量を有し、ある実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
別の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、末端アジド部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａの範囲のＭＷ、及び５から２０ｋＤａであり得る範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アルキン含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。例えば、幾つかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、及びＸは、それぞれの場合において、存在しても存在しなくてもよい、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）
を有する。
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、ｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。
幾つかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している末端アジド又は末端アルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、アルキン含有天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。
幾つかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
本発明の別の実施形態において、末端アルキン部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、及び５から２０ｋＤａであり得る範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アジド含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。例えば、幾つかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、及び、Ｘは、場合によっては、Ｏ、Ｎ、Ｓ若しくはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）又は不存在である。）を有する。
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化された官能基（以下に限定されないが、エステル、カーボナートなど。）を含有するＰＥＧ誘導体により、ｈＩＦＮポリペプチドを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量を有し、幾つかの実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2008541769
 （式中、ｎは１から１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、及びＷは、水溶性ポリマーである。）
を有する。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2008541769
 （式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリール基であり得る。）
を有する。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、それらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３が含まれるが、これらに限定されない。）など、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれるものとする。
他のＰＥＧ誘導体及び一般的なＰＥＧ化技術
ｈＩＦＮポリペプチドへ連結され得るその他の典型的なＰＥＧ分子及びＰＥＧ化方法には、米国特許公開２００４／０００１８３８；２００２／００５２００９；２００３／０１６２９４９；２００４／００１３６３７；２００３／０２２８２７４；２００３／０２２０４４７；２００３／０１５８３３３；２００３／０１４３５９６；２００３／０１１４６４７；２００３／０１０５２７５；２００３／０１０５２２４；２００３／００２３０２３；２００２／０１５６０４７；２００２／００９９１３３；２００２／００８６９３９；２００２／００８２３４５；２００２／００７２５７３；２００２／００５２４３０；２００２／００４００７６；２００２／００３７９４９；２００２／０００２２５０；２００１／００５６１７１；２００１／００４４５２６；２００１／００２１７６３；米国特許第６，６４６，１１０号；同第５，８２４，７７８号；同第５，４７６，６５３号；同第５，２１９，５６４号；同第５，６２９，３８４号；同第５，７３６，６２５号；同第４，９０２，５０２号；同第５，２８１，６９８号；同第５，１２２，６１４号；同第５，４７３，０３４号；同第５，５１６，６７３号；同第５，３８２，６５７号；同第６，５５２，１６７号；同第６，６１０，２８１号；同第６，５１５，１００号；同第６，４６１，６０３号；同第６，４３６，３８６号；同第６，２１４，９６６号；同第５，９９０，２３７号；同第５，９００，４６１号；同第５，７３９，２０８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，４４６，０９０号；同第５，８０８，０９６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，２５２，７１４号；同第６，４２０，３３９号；同第６，２０１，０７２号；同第６，４５１，３４６号；同第６，３０６，８２１号；同第５，５５９，２１３号；同第５，７４７，６４６号；同第５，８３４，５９４号；同第５，８４９，８６０号；同第５，９８０，９４８号；同第６，００４，５７３号；同第６，１２９，９１２号；ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６（これらを参照により本明細書中に組み込む。）に記載されているものが含まれる。本明細書に記載されているＰＥＧ分子の何れも、一本鎖、分枝鎖、マルチアーム鎖、単一官能性、二官能性、多官能性又はこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）あらゆる形態で使用され得る。
血清アルブミンに対する親和性の強化
様々な分子を本発明のｈＩＦＮポリペプチドに融合させて、血清中のｈＩＦＮポリペプチドの半減期を調節することもできる。幾つかの実施形態において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドに分子を連結又は融合させて、動物中の内在性血清アルブミンに対する親和性を増大させる。
例えば、ある場合において、ｈＩＦＮポリペプチドの組み換え融合物及びアルブミン結合配列を作製する。代表的なアルブミン結合配列には、以下に限定されないが、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｉｔｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）及びＳｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：１１５−１２３（１９９７）参照。）又は例えばＤｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものなどのアルブミン結合ペプチドが含まれる。
他の実施形態において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを脂肪酸でアシル化する。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照のこと。
他の実施形態において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを血清アルブミン（以下に限定されないが、ヒト血清アルブミンなど）と直接融合させる。本発明において、多岐にわたるその他の分子をｈＩＦＮに連結させて、血清アルブミン又はその他の血清成分への結合を調節することもできることを、当業者は認識する。
Ｘ．ｈＩＦＮポリペプチドのグリコシル化
本発明は、糖残基を有する１又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を取り込んでいるｈＩＦＮポリペプチドを含む。糖残基は、天然（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンなど）又は非天然（以下に限定されないが、３−フルオロガラクトースなど）の何れかであり得る。糖はＮ−又はＯ−結合型グリコシド結合（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンなど）又は非天然結合（以下に限定されないが、オキシム又は対応するＣ−もしくはＳ−結合型グリコシドなど）の何れかにより、天然にコードされていないアミノ酸に連結し得る。
糖（以下に限定されないが、グリコシルなど）部分をインビボ又はインビトロの何れかでｈＩＦＮポリペプチドに付加し得る。本発明の幾つかの実施形態において、アミノオキシ基により誘導体化された糖を用いてカルボニル含有天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを修飾し、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化されたポリペプチドを生成させる。天然にコードされていないアミノ酸に付着させた後、グリコシルトランスフェラーゼ及びその他の酵素を用いた処理を行ってｈＩＦＮポリペプチドに結合したオリゴ糖を生成させることにより、糖をさらに加工し得る。例えば、Ｈ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照のこと。
本発明のある実施形態において、アミノオキシ誘導体として調製された規定の構造を有するグリカンを用いて、カルボニル含有天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを直接修飾する。アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジドなどの他の官能基を使用して、天然にコードされていないアミノ酸に糖を連結させることができることを、当業者は認識するであろう。
本発明のある実施形態において、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（以下に限定されないが、それぞれ、アルキニル又はアジド誘導体などを用いて。）などにより、アジド又はアルキニル含有天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを修飾することができる。この方法により、タンパク質を非常に高い選択性で修飾することができるようになる。
ＸＩ．ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーの二量体及び多量体
本発明はまた、以下に限定されないが、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体（即ち、三量体、四量体など）などの、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーの組み合わせ（ｈＩＦＮ及びｈＩＦＮ類縁体を含むが、これらに限定されない。）を提供し、この場合、１又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＩＦＮなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドは、ポリペプチド骨格に直接又はリンカーを介しての何れかで、別のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーもしくはそれらのバリアント又は非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー若しくはそれらのバリアントである何らかの他のポリペプチドに結合されている。単量体と比較してその分子量が増加していることから、ｈＩＦＮなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーの二量体又は多量体結合体は、以下に限定されないが、単量体ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーと比べて、異なる薬理学的、薬物速度論的、薬物動態的特性、調節された治療半減期又は調節された血漿半減期など、新しい、又は所望する特性を示し得る。幾つかの実施形態において、本発明の二量体、ｈＩＦＮなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー受容体の二量体化を調節する。別の実施形態において、本発明のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー二量体又は多量体は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー受容体のアンタゴニスト、アゴニスト又は調節物質として作用する。
幾つかの実施形態において、二量体又は多量体を含有するｈＩＦＮ中に存在するｈＩＦＮ分子の１又はそれ以上は、部位ＩＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。このため、二量体又は多量体のｈＩＦＮ分子の各々は、部位Ｉインターフェースを介して、ｈＩＦＮポリペプチド受容体への結合のために接近可能であるが、部位ＩＩインターフェースを介した、第二のｈＩＦＮポリペプチド受容体への結合のためには利用できない。従って、ｈＩＦＮポリペプチド二量体又は多量体は、２つの異なるｈＩＦＮポリペプチド受容体の各々の部位Ｉ結合部位に接合することが可能でありｈＩＦＮ分子は、部位ＩＩ領域中に存在する遺伝的にコードされていないアミノ酸に付着された水溶性ポリマーを有するので、ｈＩＦＮポリペプチド受容体は、ｈＩＦＮポリペプチドリガンドの部位ＩＩ領域に接合することができず、二量体又は多量体は、ｈＩＦＮポリペプチドアンタゴニストとして作用する。幾つかの実施形態において、二量体又は多量体を含有するｈＩＦＮポリペプチド中に存在するｈＩＦＮ分子の１又はそれ以上は、部位Ｉ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含み、部位ＩＩ領域への結合を可能とする。あるいは、幾つかの実施形態において、二量体又は多量体を含有するｈＩＦＮポリペプチド中に存在するｈＩＦＮ分子の１又はそれ以上は、両部位が結合に利用可能なように、部位Ｉ又は部位ＩＩ結合領域内ではない部位に存在する水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、部位Ｉ、部位ＩＩを有し、又は両者を結合に使用できるｈＩＦＮ分子の組み合わせが使用される。少なくとも１つが結合に利用可能な部位Ｉを有し、及び少なくとも１つが結合に利用可能な部位ＩＩを有するｈＩＦＮ分子の組み合わせは、所望の活性又は特性を有する分子を提供し得る。さらに、結合に利用可能な部位Ｉ及び部位ＩＩを両方有するｈＩＦＮ分子の組み合わせは、スーパーアゴニストｈＩＦＮ分子を産生し得る。
幾つかの実施形態において、以下に限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合などを介して、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーは直接連結される。ある実施形態において、連結されたＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドは、結合、融合、二量体化又は多量体化を促進するために、異なる天然にコードされていないアミノ酸を含有し、以下に限定されないが、第一のＩＦＮ、例えばｈＩＦＮポリペプチドの１つの天然にコードされていないアミノ酸中のアルキン及び第二の連結されたＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドの第二の天然にコードされていないアミノ酸中のアジドなどは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化により結合される。あるいは、ヒドロキシルアミン含有天然にコードされていないアミノ酸を含む第二のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドに、第一のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー及び／又は、ケトン含有の天然にコードされていないアミノ酸を含む連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドを結合させ、対応するオキシムの形成を介してそのポリペプチドを反応させる。
あるいは、２個のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーが、リンカーを介して連結される。何らかのヘテロ又はホモ二官能性リンカーを使用して、２個のスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチド（同じ又は異なる一次配列を有し得る。）を連結させることができる。ある場合において、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーポリペプチドを一緒に連結するために使用するリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬であり得る。リンカーは、幅広い分子量又は分子長を有し得る。ＧＨスーパーファミリーメンバーと連結された部分との間の所望される空間的関係又は高次構造を提供するために、より大きな又はより小さな分子量のリンカーを使用し得る。ＧＨスーパーファミリーのメンバーと連結された部分との間に所望される空間的関係又は高次構造を提供するために、より長い又はより短い分子長を有するリンカーを使用し得る。同様に、特定の形又は立体構造を有するリンカーを利用して、ＧＨスーパーファミリーメンバーがその標的に到達する前又は後の何れかに、ＧＨスーパーファミリーメンバー又は連結された物体に特定の形又は立体構造を与え得る。ＧＨスーパーファミリーのメンバーと連結された物体との間の空間的関係をこのように最適化することにより、新しい、調節された、又は所望の特性を分子に対して与え得る。
ある実施形態において、本発明は、亜鈴構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供するが、この構造は以下のものを含む：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第一の末端における、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有部分；及びｂ）ポリマー骨格の第二の末端における少なくとも第二の官能基。第二の官能基は、第一の官能基と同一であるか又は異なり得る。第二の官能基は、ある実施形態において、第一の官能基と反応性がない。本発明は、幾つかの実施形態において、分枝状分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状分子構造は、樹状であり得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
（式中、ｎは約５から３，０００であり、ｍは２から１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有部分であり得、Ｒは、Ｘと同じもしくは異なリ得る、キャップ基、官能基又は脱離基である。）
を有する水溶性活性化ポリマーとの反応により形成された、１又はそれ以上のＧＨスーパー遺伝子ファミリーの要素（ＩＦＮなど）を含む多量体を提供する。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカーボナート、１−ベンゾトリアゾリルカーボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護化されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート及びトレシラート、アルケン及びにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
ＸＩＩ．ｈＩＦＮポリペプチドの活性及びｈＩＦＮポリペプチド受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性の測定
ｈＩＦＮ受容体は、米国特許第６，５６６，１３２号；同第５，８８９，１５１号；同第５，８６１，２５８号；同第５，７３１，１６９号；同第５，５７８，７０７号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおりに調製することが可能である。ｈＩＦＮポリペプチド活性は、標準的な又は公知のインビトロ又はインビボアッセイを用いて測定することが可能である。例えば、ｈＩＦＮに応答して、成長若しくはＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ抗原の産生を調節し、又はｈＩＦＮを結合する細胞又は細胞株（ヒトリンパ芽球様ダウディ細胞などの活性なＩＦＮ受容体を含有する細胞又は組換えＩＦＮ受容体産生細胞を含むが、これらに限定されない。）を使用して、ｈＩＦＮ受容体結合をモニターすることが可能である。非天然アミノ酸を含む非ＰＥＧ化又はＰＥＧ化ｈＩＦＮポリペプチドの場合、その受容体に対するホルモンの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの本分野で公知の技術を用いることによって測定することが可能である。ｈＩＦＮ活性を検査するためのインビボ動物モデル及びヒト臨床検査は、例えば、Ｋｏｎｔｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．４３：６３（１９９９）；Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｄｅｓｉｇｎ ８：２１３９（２００２）；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＤｒｕｇｓ １５：４１９（２００１）；米国特許第６，１８０，０９６号；米国特許第６，１７７，０７４号；米国特許第６，０４２，８２２号；米国特許５，９８１，７０９号；米国特許第５，９５１，９７４号；米国特許第５，９０８，６２１号；米国特許第５，７１１，９４４号；米国特許第５，７３８，８４６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものである。
本ｈＩＦＮ類縁体を作製するために何れの方法が使用されるかに関わらず、類縁体は、生物学的活性のためのアッセイに供される。細胞分裂の程度を確認するために、トリチウム化されたチミジンアッセイを実施し得る。しかしながら、所望の活性を確認するために、他の生物学的アッセイを使用し得る。ウイルス複製を阻害する能力をアッセイするなどの生物学的アッセイも、ＩＦＮ活性の指標となる。Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：１９５（２００１）；Ｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１９：５３３（１９８６）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１３：１４３（１９９８）；ＤｉＭａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２０２：１４４５（１９９４）；Ｆｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ３：３１２−３１９（２００３）；米国特許第４，６７５，２８２号；同第４，２４１，１７４号；同第４，５１４，５０７号；４，６２２，２９２号；５，７６６，８６４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本発明のｈＩＦＮポリペプチドの生物活性及び潜在的な副作用を評価するために、「Ｏｒｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０００ ６（６）：６５９−６６６；Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００４ ３２：７９７−８０５；ａｎｄ Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３ Ｓｅｐ；７７（１７）：９６２２−３１」によって記載されているアッセイなどのアッセイも使用し得る。
Ｐｌａｔａｎｉａｓらは、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９９；２７：１５８３−１５９２」（参照により、本明細書に組み込まれる。）において、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路、インシュリン受容体基質（ＩＲＳ）／ＰＩ−３’キナーゼ経路及びＣＢＬの活性化及びＣｒｋシグナル伝達経路など、インターフェロンによって活性化されるシグナル伝達経路を論述している。Ｖａｖ癌原遺伝子の重要性及びＩＦＮ依存性増殖阻害におけるその役割及びＩ型ＩＦＮシグナル伝達におけるチロシンホスファターゼの役割並びにＩＩ型インターフェロン受容体を用いたシグナル伝達カスケードに不可欠な分子が論述された。「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９９ ２７：１３１５−１３２１」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に、Ｐｌａｔａｎｉａｓらが記載したＣｒｋファミリータンパク質の２つのメンバーＣｒｋＬ及びＣｒｋＩＩを調べる研究など、インターフェロン受容体結合の下流のシグナル伝達及び経路を評価するアッセイを、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを評価するために使用し得る。
正常な骨髄細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）及び赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）に対するｈＩＦＮポリペプチドの効果を評価するために、「Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００４ ３２：７９７−８０５」又は「Ｇｉｒｏｎ−Ｍｉｃｈｅｌ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２ １６：１１３５−１１４２」（参照により、本明細書に組み込まれる。）によって記載されているアッセイなどのコロニー形成アッセイを使用し得る。巨核芽球のクローン増殖も、実施し得る。コロニー形成アッセイと骨髄毒性との間には相関が存在する。正常な造血に対するインビボ効果は、例えば、ｈＩＦＮポリペプチドの注射後における、マウスの末梢血もしくは骨髄中で測定することができ、又はマウスの体温に対する効果は、Ｋａｗａｍｏｔｏらによって記載されているように測定し得る。オリゴアデニラート合成酵素ｍＲＮＡも、抗ウイルス活性に対するバイオマーカーとして使用し得る（分岐ＤＮＡアッセイ）。
抗ウイルス活性をスクリーニングするために、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを用いて、ウイルス複製アッセイ又はインビボ研究を実施し得る。ウイルス複製アッセイは、当業者に公知であり、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）又はＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）が含まれ得る。ＷＩＳＨ又はＨｕｈ−７細胞を用いるＨＣＶレプリコンアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ法など（これらに限定されない。）、様々な方法によって測定されたＲＮＡ発現を用いて実施し得る。ＨＣＶ遺伝子型Ｉａ及びＩｂなど（但し、これらに限定されない。）、異なるＨＣＶ遺伝子型を使用し得る。ＶＳＶに感染した新生仔ハムスター腎臓ＢＨＫ２１細胞などの細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）の低下も、ｈＩＦＮポリペプチドを用いて測定し得る。ＣＰＥアッセイにおける効力を測定するために、様々な細胞株及び演算アルゴリズムを使用し得る。公知の参照標準との比較を行い、国債単位を計算し得る。他のアッセイには、ＥＭＣＶに感染した特異的細胞株及びヒト包皮繊維芽細胞中のＨＣＶ複製を用いるアッセイ（Ｔｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０００）；３４：１２３１−１２４６）（参照により、本明細書に組み込まれる。）が含まれるが、これらに限定されない。
生物学的活性を確認するために、他のインビトロアッセイを使用し得る。一般的に、生物学的活性に対する検査は、生物学的活性の増加若しくは減少（変化しないＩＦＮに比べて）、異なる生物学的活性（変化しないＩＦＮに比べて）、受容体親和性分析又は血清半減期分析などの所望される結果に対する分析を提供すべきである。
Ｄａｕｄｉ細胞が１２５Ｉ標識されたマウスＩＦＮに結合すること、この結合は、非標識ＩＦＮの添加によって競合され得ることが以前に報告された（例えば、米国特許第５，５１６，５１５号；同第５，６３２，９８８号参照）。天然のＩＦＮ及びｈＩＦＮが、ヒト及びマウス白血球への１２５Ｉ−ＩＦＮの結合について競合し得る能力が検査される。高度に精製された天然ＩＦＮ（９５％超純粋；１μｇ）がヨウ化され［Ｔｅｊｅｄｏｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２７， １４３（１９８２）］、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーによって反応物から分離される。１２５Ｉ−ＩＦＮの非活性は、約１００μＣｉ／μｇタンパク質であり得る。
「Ｔｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０００；３４：１２３１−１２４６」（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、免疫調節、抗増殖、抗ウイルス及び抗微生物活性など、ＩＦＮαの多数の生物活性について論述している。アミノ酸配列相同性の高い程度に関わらず、異なるヒトＩＦＮα種が生物活性の変化した相対レベルを示す。本発明のｈＩＦＮポリペプチドを評価するために、１つ又はそれ以上のＩＦＮα種の免疫調節、抗増殖、抗ウイルス及び抗微生物活性を測定するための当業者に公知のアッセイを使用し得る。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドを評価するために、プロスタグランジン、例えばＰＧＥ２の分泌を測定するインビトロアッセイを行い得る。プロスタグランジンは、発熱及び痛みの知覚など多数の中枢神経系機能を調節し、現行のＩＦＮ治療薬の副作用の１つが発熱である。
オリゴヌクレオチドアレイ転写物分析を用いて、モノＰＥＧ化されたインターフェロン−α−２ａ異性体の転写活性が、「Ｆｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００３；３：３１２−３１９」」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。本発明のｈＩＦＮポリペプチドを用いて、類似のアッセイを行い得る。遺伝子発現研究において使用され得る細胞株には、ＭＥ１５などの黒色腫細胞株が含まれるが、これに限定されない。ＭＥ１５又は類似の細胞株は、本発明のｈＩＦＮポリペプチドの機能的特性を調べるためにも使用し得る。ｍＲＮＡプロファイリングデータ、遺伝子発現差の情報又は変化した遺伝子発現のデータ（転写又は翻訳産物のレベルの変化）を与えるために、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを用いてＤＮＡマイクロアレイに対する代替アッセイを行い得る。細胞アレイも行い得る。ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップ研究は、高密度フォーマット又はアレイ中の固体表面上に、ゲノム内の遺伝子の群又は全ての遺伝子のＰＣＲ産物を構築することを含む。アレイ構築及び使用のための一般的な方法が利用可能である（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ， Ｓｈａｌｏｎ Ｄ， Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｗ， Ｂｒｏｗｎ Ｐ Ｏ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｏｃｔ．２０， １９９５；２７０（５２３５）：４６７−７０を参照。）。ＤＮＡマイクロアレイは、これらの遺伝子又はこれらの遺伝子のＰＣＲ産物を含むＤＮＡマイクロアレイを、分析すべき試料から調製されたｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることによって、多くの遺伝子の遺伝子発現パターン又はプロファイルの分析を同時に実行できるようにする。ＤＮＡマイクロアレイ又は「チップ」技術は、ゲノム規模での遺伝子発現の検査を可能とし、多くの遺伝子の転写レベルを同時に測定できるようにする。様々なアレイ及び類似の分析のための方法及び材料は、当業者に公知である。
アッセイ方法に関する参考文献の編集は網羅的なものではなく、当業者であれば、所望される最終結果を検査するために有用な他のアッセイが自明である。このようなアッセイに対する改変は、当業者に公知である。
ＸＩＩＩ．効力、機能的インビボ半減期、毒性及び薬物動態学的パラメーターの測定
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのポリペプチドの結合あり又は無しで、ｈＩＦＮポリペプチドの構築により得られる生物学的半減期の延長である。ｈＩＦＮポリペプチド血清濃度が急激に低下することにより、結合及び非結合ｈＩＦＮポリペプチド及びそれらのバリアントを用いた治療に対する生物学的反応を評価することが重要となる。本発明の、皮下又は静脈内投与後に、結合及び非結合ｈＩＦＮポリペプチドならびにそれらのバリアントは延長された血清半減期を有し得、これにより、例えばＥＬＩＳＡ法により、又は一次スクリーニングアッセイにより測定することが可能となる。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ， ＴＸ）から得られるＥＬＩＳＡ又はＲＩＡキットを使用し得る。ＩＦＮ又はそのバリアントのインビボ半減期の測定用アッセイの別の例は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＤｒｕｇｓ １５：４１９（２００１）；Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：１９５（２００１）；Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ ８：２１３９（２００２）；米国特許第６，５２４，５７０号；同第６，２５０，４６９号；同第６，１８０，０９６号；同第６，１７７，０７４号；同第６，０４２，８２２号；同第５，９８１，７０９号；同第５，５９１，９７４号；同第５，９０８，６２１号；同第５，７３８，８４６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。インビボ生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているとおりに実施される。
天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドの効力及び機能的インビボ半減期は、米国特許第５，７１１，９４４号、同第５，３８２，６５７号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているプロトコールに従って測定することが可能である。
天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドに対する薬物動態学的パラメータは、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（Ｎ＝５動物／処置群）において評価することが可能である。動物は、２５μｇ／ラット静脈内又は５０μｇ／ラット皮下の単回投与の何れかを受け、予め確定された時間（一般に、水溶性ポリマーに結合されていない、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドの場合には、約６時間、天然にコードされていないアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに結合されているｈＩＦＮポリペプチドの場合には、約４日に及ぶ。）に従って、約５から７個の血液試料を採取する。ｈＩＦＮポリペプチドに対する薬物動態データは、幾つかの種において詳しく研究されており、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドに対して得られたデータに対して直接比較することが可能である。ｈＧＨに関する研究については、「Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（ｌｌ）：１３５１−５９（１９９１）」を参照されたい。
薬物動態学的パラメータは、霊長類、例えば、カニクイザルにおいて評価することも可能である。典型的には、単一の注射は、皮下又は静脈内の何れかで投与することができ、経時的に、血清ＩＦＮレベルがモニターされる。
Ｕｎｏらは、「Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１９９８ Ｄｅｃ；１８（１２）：１０１１−８」において（参照により、本明細書に組み込まれる。）ＩＦＮに応答した、ＴＨＰ−Ｉ細胞中での２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素の誘導を記載する。特に、記載されているアッセイは、ＩＦＮαに対して感受性があり、血清インターフェロンに対するバイオアッセイとして有用であり得る。
ｈＩＦＮポリペプチドの抗ウイルス活性を研究するために使用される動物モデルには、チンパンジーＨＣＶ（Ｐｕｒｃｅｌｌ ＲＨ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９４ Ｊｕｌ；１４（３）：１８１−９１）、ＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａマウス（Ｉｌａｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００２ Ｊａｎ １５；１８５（２）：１５３−６１）、Ａｌｂ−ｕＰＡトランスジェニックマウスモデル（Ｍｅｒｃｅｒ ＤＦ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１ Ａｕｇ；７（８）：９２７−３３；Ｋｎｅｔｅｍａｎ， Ｎ ｅｔ ａｌ（２００３） １０ｔｈ ＨＣＶ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｋｙｏｔｏ Ｊａｐａｎ， Ｐ−１８７）（これらの全ては、参照により、本明細書に組み込まれる。）が含まれるが、これらに限定されるものではない。発熱、うつ病及び疼痛の閾値などの副作用を評価するために、他の動物モデルを使用し得る。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、ヒト骨髄ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構築モデルを用いて評価し得る。本プロトコールに対する改変は、当業者に公知である。本モデルにおいて、移植プロトコールは、以下のとおりである。小隔離ケージ中、無菌条件下でＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを飼育する。全身照射の直前及び全身照射後２ヶ月、酸性化されたＨ２Ｏ（ｐＨ＝３）をマウスに与える。１３７Ｃｓγ線照射装置を用いて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、３２０〜３５０ｃＧｙ致死量以下を照射する（約１ｃＧｙ／分）。照射当日に、静脈内注射によって、ヒトＭＮＣ（骨髄又は臍帯血由来の単核細胞）とともに細胞を移植する。再構成分析の場合、注射後６から８週の時点で、マウスの尾静脈から又は眼窩の後ろから採決し、ヘパリン処理されたバクチューブ（ｖａｃｕｔｕｂｅ）中に集める。再構成を評価するために、抗ヒトＣＤ４５及び抗マウスＣＤ４５を用いて、ＦＡＣＳにより、末梢血細胞を分析する。末梢血中に０．１％を上回るヒト細胞を有するマウスを陽性と考える。
投薬計画を用いて、ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）又はｈＩＦＮポリペプチドでマウスを処理する。様々な投薬療法を使用し得る。毎週投薬し、薬物ｖｓ．緩衝液をマウスに皮下注射する。４週目に、動物を屠殺し、分析のために末梢血、脾臓、肝臓及び骨髄を採集する。試料を以下のように処理する。ヘパリン処理されたｖａｃｕｔｕｂｅ中に末梢血を集める。脾臓及び肝臓を摘出し、単一細胞懸濁液を作製する。脛骨及び大腿骨の骨髄を採集する。ＥＬＩＳＡなど（但し、これに限定されない。）の方法によって、血液及び組織中のＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）又はｈＩＦＮポリペプチドのレベルを測定する。「Ｐｅｌｅｄ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９） ２８３：８４５−８４８）及び「Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（１９９９） １７：２８６−２９４）は、ＳＣＩＤマウスの再配置細胞について論述している。
ｈＩＦＮポリペプチドのインビボ活性及び骨髄毒性を評価するためにカニクイザルを使用する。２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素（２’５’−ＯＳＡ）の誘導は、サルにおいて測定され、ｈＩＦＮポリペプチドの活性を反映する。好中球、赤血球及び血小板など（これらに限定されない）、循環している血液細胞を測定し、並びに、場合によって、骨髄を収集及び評価することによって、骨髄毒性を評価する。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドを評価するためのさらなる動物モデルには、うつ病を研究する動物モデルが含まれる。「Ｃａｐｕｒｏｎ， Ｌ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００３；１６０：１３４２−１３４４」は、ＩＦＮ−α、ＨＰＡ軸及びうつ病間の相関を示唆する臨床データを提示する。ＩＦＮ−α療法の最初の１２週の間、投与直前並びに投与から１時間、２時間及び３時間後に、副腎皮質射刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチゾール及びインターロイキンー６（ＩＬ−６）の血漿濃度を患者において測定した。患者は、研究中、大うつ病の症候についても評価された。その後、大うつ病の症候基準を満たす患者は、症候基準を満たさなかった患者に比べて、ＩＦＮ−αの初期投与に対してより高いＡＣＴＨ及びコルチゾール応答を示す（但し、ＩＬ−６応答は示さない。）ことが見出された。
「Ｙａｍａｎｏ， Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＪＰＥＴ ２０００；２９２：１８１−１８７」（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、ヒトＩＦＮ−αのリンパ芽球調製物であるＳｕｍｉｆｅｒｏｎ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＹＭ６４３（ＩＦＮ−α−１；Ａｍｇｅｎ）並びにマウスに対するそれらの効果を論述している。静脈内投与すると、両化合物は、尾懸垂試験（ＴＳＴ；Ｔａｉｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｔｅｓｔ）によって測定したところによれば、用量依存的様式で、マウスに、不動（うつ病様行動）を誘導した。投薬レベル及び一般的な投薬計画は異なるが、皮下及び脳室内注射によって類似の結果が達成された。イミプラミン（抗うつ剤及びＨＰＡ軸の下方制御物質）は、ＩＦＮによって誘導される不動を有意に低減させることが明らかとなったのに対して、インドメタシン（シクロオキシゲナーゼ阻害剤）及びナロキソン（オピオイド受容体アンタゴニスト）は、観察されたＩＦＮ誘導性不動を低減させなかった。Ｙａｍａｎｏらは、ＣＲＦアンタゴニストＣＰ−１５４，５２６がＩＦＮによって誘導される不動を遮断し、これは用量依存的様式であり、ＩＦＮ−αによって誘導されるうつ病にＨＰＡ軸が関与していることを示唆する。
尾懸垂試験は、「行動的落胆」又は逃走させずに、動物に特定の領域を泳がせる水泳試験の代わりとなる。尾懸垂試験では、動物は、所定の時間（例えば、６分）、その尾から懸垂され、逃走できない。試験中、各動物が逃走行動（イベントと呼ばれる。）（例えば、奮闘行動の出現）に入る回数、イベントの期間及び各イベントの平均強度など（但し、これらに限定されない。）、様々な指標が得られる。尾懸垂試験は、例えば、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， Ｉｎｄｉａｎａ）から入手可能である。
他の研究は、好中球減少症などの現行のＩＦＮ治療薬に見出される他の副作用の動物モデルを用いる。実施される動物研究は、Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ又は別の化合物と組み合わせて実施され得る。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドの比活性は、本分野において公知の様々なアッセイによって測定することが可能である。本発明に従って取得及び精製されたｈＩＦＮポリペプチドミュテイン又はその断片の生物学的活性は、本明細書に記載され、若しくは参照された方法によって、当業者に公知の方法によって検査することが可能である。
ＸＩＶ．投与及び医薬組成物
以下に限定されないが、適切な医薬担体と組み合わせるなどして、治療用途のために、本発明の、ポリペプチド又はタンパク質（以下に限定されないが、ｈＩＦＮ、シンテターゼ、１又はそれ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質など）を場合によって使用することができる。このような組成物は、例えば、化合物の治療的有効量と医薬として許容される担体又は賦形剤とを含む。このような担体又は賦形剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はそれらの組合せが挙げられる。投与様式に適切となるように製剤を作製する。一般に、タンパク質の投与方法は、当業者に公知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
当業者に公知の方法に従い、本発明の１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む治療用組成物を、場合によっては１つ又はそれ以上の適切なインビトロ及び／又はインビボ疾患動物モデルにおいて試験し、有効性、組織代謝を確認し、投与量を推定する。特に、投薬量は最初、天然アミノ酸相同体に対する本明細書中の非天然物（以下に限定されないが、天然アミノ酸ｈＩＦＮポリペプチドに対する、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたｈＩＦＮポリペプチドの比較など）の、活性、安定性又はその他の適切な指標により、即ち、適切なアッセイにおいて、決定することができる。
投与は、血液又は組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用されるあらゆる経路による。何らかの適切な様式で、場合により、医薬として許容される１又はそれ以上の担体とともに、本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する。本発明の関連におけるこのようなポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能であるが、２以上の経路を用いて特定の組成物を投与することができ、特定経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な作用又は反応を得られることが多い。
一部、投与される特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、医薬として許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物の多岐にわたる適切な製剤が存在する。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、タンパク質又はペプチドに適したあらゆる慣用経路（皮下若しくは静脈内又は注射若しくは注入の他のあらゆる形態を含む（これらに限定されない。）非経口、例えば注射を含むが、これに限定されない。））によって投与し得る。ポリペプチド組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段を含む（これらに限定されない。）多数の経路によって投与することが可能である。リポソームを介して修飾又は非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物を投与することもできる。このような投与経路及び適切な製剤は通常、当業者にとって公知である。天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、単独で、又は医薬担体などの他の適切な成分と組み合わせて使用し得る。
単独又はその他の適切な成分と組み合わせて非天然アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドは、エアロゾル製剤に調製して（即ち、これらは「霧状」にすることができる。）、吸入により投与することもできる。加圧された許容可能なプロペラント（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）にエアロゾル製剤を入れることができる。
例えば、関節内投与（関節中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路などの非経口投与に適切な製剤としては、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。）並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器において、ｈＩＦＮの製剤を提供することができる。
非経口投与及び静脈内投与は好ましい投与方法である。特に、現在使用されている製剤とともに、天然アミノ酸相同体治療薬に対して既に使用されている投与経路（以下に限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は医薬として送達される何らかの他のタンパク質に対して典型的に使用されるものなど）は、本発明のポリペプチドに対する好ましい投与経路及び処方を与える。
本発明において、患者に投与される用量は、時間とともに患者において有効な治療応答（病原体による感染を阻害することなど（但し、これに限定されない。））を有するのに十分なものであるか、又は、適用に応じて、その他の適切な活性を有するのに十分なものである。特定のベクターもしくは処方の効率及び使用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性もしくは血清半減期及び患者の状態、ならびに処置される患者の、体重もしくは表面積により、用量を決定する。特定の患者における、特定のベクター、処方などの投与に付随する何らかの不都合な副作用の、存在、性質及び程度によっても、用量サイズが決定される。
疾患（以下に限定されないが、癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど）の治療又は予防において投与されるべきベクター又は製剤の有効量を決定する場合、医師は、循環血漿レベル、製剤の毒性、疾患の進行及び／又は適切な場合は、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
例えば、７０ｋｇの患者に投与する用量は、典型的には、現在使用されている治療用タンパク質の投薬量と等しい範囲であり、関連組成物の変化した活性又は血清半減期に対して調節される。本発明のベクター又は医薬製剤は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物反応調節物質などの投与など、何らかの公知の従来の治療による治療状態を補完することができる。
投与に対して、以下に限定されないが大部分及び全体的な患者の健康に対して適用する場合を含め、適切な製剤のＬＤ−５０又はＥＤ−５０及び／又は様々な濃度での非天然アミノ酸の何らかの副作用の観察により決定される速度で本発明の製剤を投与する。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。
製剤の注入を行っている患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を発症した場合、その患者にアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又はその他の疼痛／発熱制御薬の適量を与える。発熱、筋肉痛及び悪寒など、注入に対する反応が出たことがある患者には、それ以降の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミドフェン又は以下に限定されないがジフェンヒドラミンなどの何れかを前もって与える。解熱剤及び抗ヒスタミン剤に対して迅速に応答しないより重度の悪寒及び筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重症度によって、細胞注入の速度を遅くするか、又は中断する。
哺乳動物対象に、本発明のヒトｈＩＦＮポリペプチドを直接投与することができる。投与は、ｈＩＦＮポリペプチドを対象に導入するために通常使用される何れかの経路による。本発明の実施形態によるｈＩＦＮポリペプチド組成物には、経口、直腸、局所、吸入（以下に限定されないが、エアロゾルを介したものなど）、口腔内（以下に限定されないが、舌下など）、膣内、非経口（以下に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内など）、局所（即ち、皮膚及び粘膜表面の両方、気道表面を含む。）及び経皮投与に適切なものが含まれるが、いかなる場合も、最適な経路は、治療されている状態の性質及び重症度に依存する。投与は局所又は全身投与の何れかであり得る。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器中に、化合物の製剤を提供することができる。単位用量の注射用形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液又はエマルジョンなど）での医薬として許容される担体との混合物において本発明のｈＩＦＮポリペプチドを調製することができる。持続注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプなどのミニポンプなどを用いる。）、単一ボーラス又は徐放デポー製剤により、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを投与することもできる。
投与に適切な製剤としては、水性及び非水性の溶液、等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を等張にする溶質を含有し得る。）並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。
既に述べられた種類の、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、溶液及び懸濁液を調製し得る。
フリーズドライは、タンパク質を提示するために一般的に使用されている技術であり、これは、目的のタンパク質調製物から水を除去する役割を果たす。フリーズドライ又は凍結乾燥は、乾燥されるべき材料をまず凍結した後、真空環境中で、昇華により、氷又は凍結した溶媒を除去するプロセスである。フリーズドライプロセス中に安定性を増強させるために、及び／又は、凍結乾燥された産物の保存時における安定性を向上させるために、予め凍結乾燥された製剤中に賦形剤を含めることができる。Ｐｉｋａｌ， Ｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．３（９）２６−３０（１９９０）及びＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（３）：２８５−２９１（１９９１）。
医薬の噴霧乾燥も、当業者に公知である。例えば、「Ｂｒｏａｄｈｅａｄ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ， １８（１１ ＆ １２）， １１６９−１２０６（１９９２）」を参照されたい。小分子医薬に加えて、様々な生物学的材料が噴霧乾燥されており、これらには、酵素、血清、血漿、微生物及び酵母が含まれる。噴霧乾燥は、一段階の工程で、液体の医薬調製物を、微細な、無粉塵の粉末又は凝集した粉末に変換することができるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの工程：ａ）スプレー中への、フィード溶液の微粒化；ｂ）スプレー−空気接触；ｃ）スプレーの乾燥；ｄ）及び乾燥空気からの、乾燥された産物の分離を含む。米国特許第６，２３５，７１０号及び第６，００１，８００号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、スプレー乾燥による、組換えエリスロポエチンの調製について記載している。
本発明の医薬組成物及び製剤は、医薬として許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含み得る。一部、投与する特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、医薬として許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物（場合により、医薬として許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含む。）の多岐にわたる適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．１９８５参照。）。
適切な担体には、スクシナート、ホスファート、ボラート、ＨＥＰＥＳ、シトラート、ヒスチジン又はヒスチジン誘導体、イミダゾール、アセタート、バイカーボナート及びその他の有機酸を含有する緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基未満のものを含むが、これに限定されない。）；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどの（これらに限定されない。）タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの（これらに限定されない。）親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、ヒスチジン又はヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸又はリジンなどの（これらに限定されない。）のアミノ酸；トレハローズ、スクロース、グルコース、マンノース又はデキストリンなどの（これらに限定されない。）、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡ及びエデト酸二ナトリウム（ｅｄｅｎｔａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ）などのキレート剤；亜鉛、コバルト又は銅などの（これらに限定されない。）二価金属イオン；マンニトール又はソルビトールなどの（これらに限定されない。）糖アルコール；ナトリウム及び塩化ナトリウムなどの（これに限定されない。）塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎＴＭ（Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルバート８０）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリソルバート２０；ＰＳ２０））、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ及び他のプルロニック酸（プロロニック酸Ｆ６８（ポロキサマー１８８）を含むが、これに限定されない。）などの（これらに限定されない。）非イオン性界面活性剤又はＰＥＧが含まれる。適切な界面活性剤には、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）、すなわち（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）又はポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレノキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、すなわち、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）又はこれらの組み合わせを基礎としたポリエーテル（これらに限定されない。）が含まれる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ及びＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、Ｒ−ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ及びＲ−ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．， Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ， Ｍｉｃｈ．）の商品名で市販されており、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第４，８２０，３５２号にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーは、適切な界面活性剤であり得る。撹拌から生じるストレスを含む（これに限定されない。）１つ又はそれ以上のストレスに対して、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮを安定化するために界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせを使用し得る。上記の幾つかは、「充填剤」と表記され得る。幾つかは、「張度調整剤」とも称され得る。生成物の安定性のために抗微生物防腐剤及び抗微生物有効性を付与してもよく、適切な防腐剤には、ベンジルアルコール、塩化ベンズアルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン、クレゾール及びフェノール又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
インターフェロンα及びインターフェロンαのＰＥＧ化された形態を含む（これらに限定されない。）インターフェロン分子の製剤は、米国特許第５，７６２，９２３号；同第５，７６６，５８２号及び同第５，９３５，５６６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。インターフェロン分子の製造方法及びインターフェロン分子の安定性を調べる方法も記載されている。「Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｅｕｔｉｃｓ（１９９９） １８７：２５９−２７２）は、ハイブリッドインターフェロン−α分子の製剤及び高ｐＨ及び低ｐＨなどの様々な条件下で見出される分解産物についても論述している。
徐放システムにより、又は徐放システムの一部として、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されているものを含む、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを投与することもできる。徐放組成物としては、以下に限定されないがフィルム又はマイクロカプセルなどの（これらに限定されない。）、造形品の形態の半透性ポリマーマトリクスなど（これに点芸されない。）が挙げられる。徐放マトリクスには、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）、エチレンビニルアセタート（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーンなどの生体適合性の物質由来のものが含まれる。徐放組成物にはまた、リポソームに封入された化合物が含まれる。それ自身公知の方法により、化合物を含有するリポソームを調製する：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許公開８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
例えばＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；米国特許第４，４８５，０４５号；ＥＰ１４３，９４９；米国特許第５，０２１，２３４号；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４に記載の方法により、リポソーム中に封入されたｈＩＦＮポリペプチドを調製することができる。組成物及びリポソームサイズは周知であるか、又は当業者により経験的に容易に決定可能である。リポソームのいくつかの例が、例えばＰａｒｋ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ Ｄ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ（編）：ＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＬＹＰＯＳＯＭＥＳ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＤＣ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｅｉｃｈｅｒ Ｂ（編）：ＣＡＮＣＥＲ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）；Ｐａｒｋ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ ＵＢ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載されている。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
本発明に関連して、患者へ投与される用量は、時間とともに対象において有効な応答を生じさせるのに十分な用量とすべきである。一般に、非経口的に投与される本発明のｈＩＦＮポリペプチドの、投与あたりの総医薬的有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であるが、これは治療での判断に委ねられる。投与頻度もまた、治療での判断に委ねられ、ヒトでの使用が認可されている市販のｈＩＦＮポリペプチド製品よりも多い又は少ない頻度であり得る。一般に、上述の何れかの投与経路により、本発明のＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドを投与することができる。
ＸＶ．本発明のｈＩＦＮポリペプチドの治療的使用
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、多岐にわたる疾患を治療するのに有用である。
アゴニストｈＩＦＮバリアントは、増加が抗体の媒介によるものであれ、又は細胞の媒介によるものであれ、及び免疫系がｈＩＦＮポリペプチドで処理される宿主にとって内在性のものであれ、又はｈＩＦＮポリペプチドが与えられる宿主レシピエントにドナーから移植されるものであれ（骨髄移植におけるように）、哺乳動物の免疫機能を増加させることによって、哺乳動物の免疫系を刺激するように作用し得る。「免疫疾患」には、個体の免疫系が、抗原に対して正常より低下した抗体又は細胞応答を有するあらゆる症状が含まれ、薬物（例えば、化学療法）治療のために低下した免疫を有する小さな脾臓を有する個体が含まれる。免疫疾患を有する個体の例には、例えば、高齢の患者、化学療法又は放射線療法を行っている個体、大病から回復した個体又は手術を行う予定の個体、ＡＩＤＳを有する個体、低ガンマグロブリン血症、一般的な多様な無ガンマグロブリン血症及び選択的な免疫グロブリン欠乏（例えば、ＩｇＡ欠乏）などの先天性及び後天的Ｂ細胞欠乏を有する患者、患者の免疫応答より短い温置時間で狂犬病などのウイルスに感染した患者、及びディジョージ症候群などの遺伝性疾患を有する個体が含まれる。ＩＦＮαは、多くの免疫調節活性を示す。Ｚｏｏｎ ｅｔａｌ，（１９８６）、Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｔｅｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｎｋｅｎｓ， Ｅｄｓ．， Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｙｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を参照。
本発明のｈＩＦＮ産物の投与は、市販のＩＦＮ調製物によって示される活性の何れをも、ヒトにおいてもたらす。ｈＩＦＮを含有する医薬組成物は、抗増殖剤、抗炎症剤又は抗ウイルス剤など（但し、これらに限定されない。）のＩＦＮアゴニスト又はアンタゴニストによって影響され得る疾患を経験するヒト患者へ、様々な手段によって投与するのに有効な強度で調合され得、単独で、又は症状若しくは疾病の一部として使用される。
従って、本発明のｈＩＦＮは、ウイルス複製サイクルを破壊若しくは調節し、炎症を調節するために、又は抗増殖剤として使用され得る。本発明によって治療可能な症状には、ＨＣＶ、ＨＢＶ及びその他のウイルス感染症、腫瘍細胞増殖又は生存性並びに多発性硬化症が含まれる。本発明は、抗癌化学療法剤剤などの別の活性剤の治療的有効量の投与も提供する。与えられるべき量は、ｈＩＦＮを用いた治療に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
ＩＦＮは、最初、ウイルス学者によって発見されたが、（１９７９における）それらの最初の臨床用途は、骨髄腫に対する治療剤としてであった（Ｊｏｓｈｕａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１１（４）：１９１−２００）。それ以来、ＩＦＮαは、ウイルス、悪性腫瘍、血管新生、アレルギー、炎症及び繊維性起源の多数の疾病に対して有効であることが示されているＴｉｌｇ，（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１２（３）：１０１７−１０２１）。転移性腎臓癌及び慢性骨髄性白血病の治療においても有効であることが証明されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｃｈ，（１９９７） Ｂｒ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．５７（９）：４３６−４３９）。
ＩＦＮの臨床用途は、Ｇｒｅｓｓｅｒ（Ｉｙｙ７） Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１（５）：５６７−５７４ ａｎｄ Ｐｆｅｆｆｅｒ（１９９７） Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（３ Ｓｕｐｐｌ．９）：Ｓ９−Ｓ６３Ｓ９６９（参照により、本明細書に組み込まれる。）に概説されている。
ｈＩＦＮの平均量は変動することができ、特に、資格を有する医師の推奨及び処方に基づくべきである。ｈＩＦＮの正確な量は、治療されている症状の正確な種類、治療されている患者の状態及び組成物中の他の成分などの因子に従う好みの問題である。本発明は、別の活性剤の治療的有効量の投与も提供する。与えられるべき量は、ｈＩＦＮを用いた量に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
本発明の医薬組成物は、慣用の様式で製造し得る。
以下の実施例は例示のために記載されているものであり、特許請求に記載の本発明に限定を加えるものではない。
（実施例１）
本実施例は、ｈＩＦＮへの天然にコードされていないアミノ酸の組み込みの好ましい部位の選択のための基準に関する多くの可能性のあるセットのうちの１つを記述する。
本実施例は、ｈＩＦＮポリペプチド内の好ましい部位が天然にコードされていないアミノ酸の導入のためにどのように選択されたかを示す。ＰＤＢ ＩＤ １ＲＨ２を有する結晶構造及びＮＭＲ構造ＨＴＦ（２４個の異なるＮＭＲ構造）を使用して、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸が導入できる好ましい位置を決定した。これらの構造の配位は、ｒｃｓｂ．ｏｒｇ．でワールドワイドウェブ上で利用可能なｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から又はＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＰＤＢを介して利用可能である。
本実施例において使用される配列付番は、配列番号２に示される成熟型ｈＩＦＮのアミノ酸配列に従っている。次の基準を使用して、天然にコードされていないアミノ酸の導入のためのｈＩＦＮの各位置を評価した。残基は、（ａ）ｈＩＦＮ受容体と結合したｈＩＦＮの結晶学的構造の構造分析に基づいたｈＩＦＮの結合に干渉すべきではなく、ｂ）アラニン走査変異原性によって影響されるべきではなく、（ｃ）表面露出され、取り囲んでいる残基とのファンデルワールス相互作用又は水素結合相互作用を呈するべきであり、（ｄ）ｈＩＦＮ変異体において欠失されるか又は可変性であるべきであり、（e）天然にコードされていないアミノ酸との置換に基づいた保存性のある変化を結果として生じ、（ｆ）（ＣＤループを含むがそれに限定されるわけではない。）非常に可動性のある領域、又は（Ｂ螺旋を含むがそれに限定されるわけではない。）構造上強固な領域のいずれかにおいて見出され得る。部位評価に使用される刊行物には、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１（１２）１９５−２０２；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ２００２（８）２１３９−２１５７；Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００１（１２），８５７−８５９；ＢＢＲＣ １９９４（２０２）１４４５−１４５１；Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＋Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １９９８（Ｖｏｌ１３）１４３−１５３；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９６（１４）１４５３−１４６３；ＪＭＢ １９９７（２７４）６６１−６７５が含まれる。なお、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１８，ｐｐ ９８０）を利用して、ｈＩＦＮ分子に関してさらなる計算を実施し、各タンパク質原子に関する突出の程度を評価した。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２又は配列番号１，３の対応するアミノ酸又はその他のＩＦＮポリペプチドにあるような）ｈＩＦＮの次の位置すなわち、位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８，６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９，８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６，８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわちカルボキシル末端）の１つ又はそれ以上で置換されるが、これらに限定されるわけではない。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチドにあるような）ｈＩＦＮの次の位置すなわち、位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８，６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６，８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、又は１６６（すなわちカルボキシル末端）の１つ又はそれ以上で置換されるが、これらに限定されるわけではない。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＦＮの次の位置すなわち、６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に組み込まれる。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、次の位置の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。すなわち、４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）である。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、次の位置の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。すなわち、６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１６０、１６１、１６２（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）である。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８，６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、次の位置の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。すなわち、３４、７８、１０７（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）である。幾つかの実施形態において、これら又は他の位置の１つ又はそれ以上にある天然にコードされていないアミノ酸は、次の位置すなわち、位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６，８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、又は１６６（すなわちカルボキシル末端）（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）を含むがこれらには限定されない位置で、水溶性ポリマーと連結される。幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ又はそれ以上にある天然にコードされていないアミノ酸は、次の位置すなわち、位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８，６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、1１２、１１３、1１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわちカルボキシル末端）（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）を含むがこれには限定されない位置で、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、次の位置すなわち、６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、1１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上で水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、次の位置すなわち、１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、次の位置すなわち、４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、次の位置すなわち、６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、次の位置すなわち、６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、次の位置すなわち、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、次の位置すなわち、３４、７８、１０７（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、次のアミノ酸の位置すなわち、６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２、又は配列番号1，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある天然にコードされていないアミノ酸に対するＩＦＮポリペプチドへ連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、次のアミノ酸の位置すなわち、６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、1１１、１１３、1１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２、又は配列番号1，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にあるＩＦＮポリペプチドへ連結される。幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ又はそれ以上にある天然にコードされていないアミノ酸は、３４、７８、１０７（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）で１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、アゴニストを提供する次の位置すなわち、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８，６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、企図される部位により選択され望まれる活性に依存して、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして作用する可能性があり得る。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、又はその全ての組み合わせ（ｈＩＦＮ、配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）で、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸置換を有するｈＩＦＮポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチドにあるような）ｈＩＦＮの次の位置すなわち、３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４の１つ又はそれ以上で置換されるが、これらに限定されるわけではない。ある実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチドにあるような）ｈＩＦＮの位置３８で置換される。幾つかの実施形態で、これら又は他の位置の１つ又はそれ以上にある天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチドにあるような）位置３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４を含むがこれらには限定されない位置で、水溶性ポリマーへ連結される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＩＦＮ(配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸)の次の位置すなわち、位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、1１０、１１１、1１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、1１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、又は１６６（すなわちカルボキシル末端）及び１つ又はそれ以上の天然アミノ酸置換の１つ又はそれ以上で置換されるが、これらに限定されるわけではない。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーへ連結される。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧへ連結される。ある実施形態において、天然アミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｙである。幾つかの実施形態において、天然アミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｅである。幾つかの実施形態において、天然アミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｓである。ある実施形態において、非天然アミノ酸置換は、位置１０７においてであり、天然アミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｙである。ある実施形態において、非天然アミノ酸置換は、位置１０６においてであり、天然アミノ酸置換は、Ｒ１４９Ｙである。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコード化されているアミノ酸置換は、ｈＩＦＮ（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の次の位置すなわち１０、１６、１３、７９、８３、８５、８６、８７、９０、９１、９３、９４、９６、１２０、１２１、１２４、１２５、１２８、１４９を含むが、これらに限定されるわけではない位置の１つ又はそれ以上にある。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコード化されているアミノ酸置換は、次の置換すなわちＧ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓ（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）を含むが、これらに限定されるわけではない置換の１つ又はそれ以上である。幾つかの実施形態において、天然アミノ酸置換は位置１（Ｎ末端）においてである。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、（配列番号２、又は他のＩＦＮの対応するアミノ酸にあるような）ｈＩＦＮの次の位置すなわち１０７、７８、３４の１つ又はそれ以上で置換される。幾つかの実施形態において、これらの位置の１つ又はそれ以上にある天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーへ連結される。すなわち１０７、７８、３４においてである。
リミチン配列で見られる１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ｈＩＦＮポリペプチドへと置換され得る（ハイブリッドリミチン／ｈＩＦＮポリペプチド）。例には、先行の段落に記載の天然アミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、インターフェロンポリペプチドで見られる１セットのアミノ酸は、リミチン配列で見られる１セットのアミノ酸によって置換され得る。１セットのアミノ酸は、連続したアミノ酸又は分子の異なる部分に存在するアミノ酸を含み得るが、ポリペプチドの構造特性又は生物活性に関与する。マウスリミチン分子は、他のＩＦＮαタンパク質と比較して、ＣＦＵ−ＧＭ毒性特性が改善されている。ヒトＩＦＮα−２ａのリミチンタンパク質配列との整列によって、３０％アミノ酸相同性が示された。５０％配列保存も観察された。特に、（Ｃ螺旋とＤ螺旋との間のループにおける）Ｃ螺旋とＤ螺旋との間のリミチン配列における顕著な欠失が観察された。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）における次の置換とともに「ＨＶ」変異体が生成された。すなわち、Ｄ７７−Ｄ９４は、マウスリミチン配列ＨＥＲＡＬＤＱＬＬＳＳＬＷＲＥＬＱＶと置換される。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）における次の置換とともに「ＣＤ」変異体が生成された。すなわち、Ｖ１０５−Ｄ１１４はＧＱＳＡＰＬＰと置換される。リミチンからヒトＩＦＮα−２ａタンパク質へと置換されたループ領域を有するこのハイブリッド分子（「ＣＤ」変異体）は、ＷＨＯ ＩＦＮ標準物質と等価の抗ウィルス活性を有することがわかった。１つ又はそれ以上のリミチンアミノ酸に加えて、ｈＩＦＮポリペプチドは、ｈＩＦＮポリペプチドのいずれかの１つ又はそれ以上の位置で１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーへ連結され得るか、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーへ直接結合され得る。ＨＶ変異体又はＣＤ変異体における天然アミノ酸置換に加えて、１つ又はそれ以上の付加的な天然アミノ酸置換がｈＩＦＮポリペプチドにおいて見られ得る。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８．１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される次の位置すなわち、６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、１１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される次の位置すなわち、６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、１１１、１１４、1１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、１つ又はそれ以上の天然にコード化されているアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーへ連結される次の位置すなわち、６、１６、３４、３９、４５、４６、６４、６５、６８、７８、８５、８７、１０１、１０７、１０８、1１１、１１４、1１８、１２４、１２５、１４５、１４６、１５３、１５６、９６、１４９（配列番号２、又は対応するアミノ酸又は配列番号１，３の対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換すなわち、Ｇ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓの１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結された次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結された次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８（配列番号２、又は配列番号１，３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸及び次の天然にコード化されているアミノ酸置換すなわちＴ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上である。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結される次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、１０８の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換、すなわちＴ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、及び１０８（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結された次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、及び１０８（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ結合した次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、及び１０８（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、及び１０８の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換、すなわちＴ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅ（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結される次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、及び１０８の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換すなわちＴ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅの１つ又はそれ以上を含む（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ結合される次の位置すなわち、６、１６、３７、４５、４６、７８、８７、８９、１０７、及び１０８の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換すなわちＴ７９Ｒ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９１Ｅの１つ又はそれ以上を含む（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、３７、４５、４６、８９、及び１０７の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結される次の位置すなわち、３７、４５、４６、８９、及び１０７（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ結合される次の位置すなわち、３７、４５、４６、８９、及び１０７（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、３７、４５、４６、８９、及び１０７の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換、すなわちＴ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓの１つ又はそれ以上を含む（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結された次の位置すなわち、３７、４５、４６、８９、及び１０７の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換、すなわちＴ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓの１つ又はそれ以上を含む（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ結合した次の位置すなわち、３７、４５、４６、８９、及び１０７の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、次の天然にコード化されているアミノ酸置換、すなわちＴ７９Ｒ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ｌ、Ｙ８５Ｓ、Ｅ８７Ｓの１つ又はそれ以上を含む（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。
幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３５、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ結合した次の位置すなわち、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、２３、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４、１５８（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結されるか又は結合した次の位置すなわち、２３、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４、１５８（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置すなわち、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮポリペプチドは、水溶性ポリマーへ連結されるか又は結合した次の位置すなわち、２４、２７、３１、１２８、１３１、１３４（配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上にある１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。
（実施例２）
本実施例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における改変されたｈＩＦＮポリペプチドのクローニング及び発現を詳述する。
本実施例は、Ｅ．コリにおいて発現できる天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを示す。参照により組み込まれるＮａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ．２８４， ３１６−３２０（１９８０）及び米国特許第４，３６４，８６３号を参照してほしい。全長のｈＩＦＮ及びＮ末端シグナル配列を欠失するｈＩＦＮの成熟型をコードするｃＤＮＡが配列番号２１及び配列番号２２にそれぞれ示される。アミノ酸配列を変化させずにクローニング及び発現させるための配列の最適化後に、全長及び成熟型ｈＩＦＮをコードするｃＤＮＡを、ｐＢＡＤ ＨＩＳｃ、ｐＥＴ２０ｂ、及びｐＥＴ１９ｂ発現ベクターへと挿入する。
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む、導入される翻訳システムを使用して、天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＩＦＮを発現させる。前記Ｏ−ＲＳは天然にコードされていないアミノ酸を使用して前記Ｏ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。順に、前記翻訳システムは、天然にコードされていないアミノ酸をｈＩＦＮへと、コード化されるセレクタコドンに応じて挿入する。
Figure 2008541769
改変されたｈＩＦＮ遺伝子及び（望ましい天然にコードされていないアミノ酸に特異的な）オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含有するプラスミドによるＥ．コリの形質変換により、ｈＩＦＮポリペプチドへの天然にコードされていないアミノ酸の部位特異的組み込みが可能になる。特定の天然にコードされていないアミノ酸の０．０１ないし１００ｍＭの間を含有する培地において３７℃で増殖される形質変換されたＥ．コリは、改変されたｈＧＨを高い忠実度及び効率性で発現する。天然にコードされていないアミノ酸を含有するＨｉｓタグつきのｈＩＦＮを、封入体又は凝集体としてＥ．コリ宿主細胞により生成する。前記凝集体を可溶化し、６ＭグアニジンＨＣｌにおける変性条件下でアフィニティ精製する。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ ＣｕＳＯ４及び２％（ｗ／ｖ）サルコシル中で、４℃で一晩透析することによって、再折りたたみを実施する。次に、前記材料を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２に対して透析した後、Ｈｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）２６８：１５９８３−９３を参照してほしい。ｈＩＦＮの精製のための方法は本分野で周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、又はエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析等により確認される。
Ｎ末端に６Ｈｉｓタグを有するｈＩＦＮポリペプチドを生成するために、ｈＩＦＮヌクレオチド配列をタグの下流でクローニングした。ｈＩＦＮポリヌクレオチド配列及び（望ましい天然にコードされていないアミノ酸に特異的な）オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含有する構築物によるＥ．コリ（ＢＬ２１（ＤＥ３））の形質変換により、天然にコードされていないアミノ酸（ｐ−アセチル−フェニルアラニン）のｈＩＦＮポリペプチドへの部位特異的組み込みが可能になった。
（実施例３）
本実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入及びアミノオキシ含有ペグとのその後の反応を詳述する。
本実施例は、後に分子量約５，０００のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する、ケトン含有の非天然にコード化されているアミノ酸を組み込むｈＩＦＮポリペプチドの生成のための方法を示す。１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（ｈＩＦＮ）を含むがこれらに限定されるわけではない、実施例１の基準に従って同定される各残基を、次の構造を有する天然にコードされていないアミノ酸と個別に置換する。
Figure 2008541769
ｐ−アセチル−フェニルアラニンのｈＩＦＮへの部位特異的組み込みに利用される配列は、上述の実施例２に記載の配列番号２（ｈＩＦＮ）、及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ）、及び１６、１７又は１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５、又は６）である。
一度改変されると、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド変異体は、
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
の形態のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応する（式中、Ｒは、メチル、Ｎは、約５，０００の分子量である。）。２５ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０、又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解したｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製されたｈＩＦＮを、アミノオキシ含有ＰＥＧの１０ないし１００倍過剰量と反応させた後、室温で１０ないし１６時間撹拌する（Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９，８１，ｐｐ４７５）。次に、即時精製及び分析のため、ＰＥＧ−ｈＩＦＮを適切な緩衝液中へ希釈する。
（実施例４）
アミド結合を介してPEGへ連結されるヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧとの結合
実施例３に記載の手法を使用して、ケトンを含有する天然にコードされていないアミノ酸へ、次の構造を有するＰＥＧ試薬を連結させる。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４及びＮは約２０，０００の分子量である。）反応条件、精製条件、及び分析条件は、実施例３に記載のとおりである。
（実施例５）
本実施例は、２つの異なる天然にコードされていないアミノ酸の、ｈＩＦＮポリペプチドへの導入を詳述する。
本実施例は、Ｘ＊が天然にコードされていないアミノ酸を表す実施例１に従って同定される残基のうち、２つの位置でケトン機能性を含む天然にコードされていないアミノ酸を組み込むｈＩＦＮポリペプチドの生成のための方法を示す。ｈＩＦＮポリペプチドを実施例１及び２に記載のとおり調製するが、例外は、セレクタコドンを核酸内の２つの異なる部位で導入することである。
（実施例６）
本実施例は、ヒドラジド含有ＰＥＧへのｈＩＦＮポリペプチドの結合及びその後の原位置での還元を詳述する。
カルボニル含有アミノ酸を組み込むｈＩＦＮポリペプチドを、実施例２及び３に記載の手法に従って調製する。一度改変されると、次の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧを、ｈＩＦＮポリペプチドへ結合させる。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２及びＮ＝１０，０００の分子量及びＸはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。）ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製されたｈＩＦＮを、２５ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０、又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４．５中に０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬの間で溶解し、ヒドラジド含有ＰＥＧの１ないし１００倍過剰量と反応させ、Ｈ２Ｏ中に１０ないし５０ｍＭの終濃度で溶解させた１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ストックの添加によって、対応するヒドラゾンを原位置で還元する。反応を暗所で４℃ないし室温で１８ないし２４時間実施する。ｐＨ約７．６の１Ｍトリス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の５０ｍＭの終トリス濃度への添加によって、反応を停止させるか、適切な緩衝液中へ希釈して、即時精製する。
（実施例７）
本実施例は、アルキン含有アミノ酸のｈＩＦＮポリペプチドへの導入、及びアジ化ｍＰＥＧによる誘導体化を詳述する。
１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４を含むがこれらに限定されるわけではない、実施例１に従って同定されるｈＩＦＮの残基のいずれかを、次の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2008541769
ｐ−プロパルギル−チロシンのｈＩＦＮへの部位特異的組み込みに利用される配列は、上述の実施例２に記載の配列番号２（ｈＩＦＮ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、及び９、１０又は１１である。プロパルギルチロシンを含有するｈＩＦＮポリペプチドを、Ｅ．コリ中で発現させ、実施例３に記載の条件を使用して精製する。
ＰＢ緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）中に０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬの間で溶解したプロパルギル−チロシンを含有する精製されたｈＩＦＮ、及びアジ化物含有ＰＥＧの１０ないし１０００倍過剰量を反応混合物へ添加する。次に、ＣｕＳＯ４の触媒量及びＣｕワイヤを前記反応混合物へ添加する。その後、前記混合物を温置する（室温又は３７℃で約４時間、又は４℃で一晩、を含むがそれには限定されない）。Ｈ２Ｏを添加し、前記混合物を透析膜でろ過する。添加のために試料を分析できる。
本実施例において、ＰＥＧは次の構造を有する。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
式中、Ｒはメチル、ｎは４及びＮは１０，０００の分子量である。
（実施例８）
本実施例は、ｈＩＦＮポリペプチド中の大きな疎水性アミノ酸のプロパルギルチロシンとの置換を詳述する。
ｈＩＦＮの次の領域すなわち（配列番号２、又は他のＩＦＮポリペプチドの対応するアミノ酸にあるような）１ないし９（Ｎ末端）、１０ないし２１（Ａ螺旋）、２２ないし３９（Ａ螺旋とＢ螺旋との間の領域）、４０ないし７５（Ｂ螺旋）、７６ないし７７（Ｂ螺旋とＣ螺旋との間の領域）、７８ないし１００（Ｃ螺旋）、１０１ないし１１０（Ｃ螺旋とＤ螺旋との間の領域）、１１１ないし１３２（Ｄ螺旋）、１３３ないし１３６（Ｄ螺旋とＥ螺旋との間の領域）、１３７ないし１５５（Ｅ螺旋）、１５６ないし１６５（Ｃ末端）のうちの１つの中に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒを、実施例７に記載の次に天然にコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2008541769
一度改変されたら、アルキン含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド変異体へＰＥＧを結合させる。ＰＥＧは、次の構造
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
を有し、結合手法は、実施例７のものに従う。これが、天然に生じる大きな疎水性アミノ酸のうちの１つとほぼ等立体的な（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）で、ｈＩＦＮポリペプチド変異体内の異なる部位でＰＥＧ誘導体により改変される、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド変異体を生成させる。
（実施例９）
本実施例は、１つ又はそれ以上のＰＥＧリンカーによって分離されているｈＩＦＮポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、又はヘテロ多量体の生成を詳述する。
実施例７において生成されたアルキン含有ｈＩＦＮポリペプチド変異体を、形態
Ｎ３-（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
の二機能性ＰＥＧ誘導体と反応させ（式中、ｎは４であり、ＰＥＧは、約５，０００の平均分子量を有する。）２つのｈＩＦＮ分子がＰＥＧによって物理的に分離されている、対応するｈＩＦＮポリペプチドホモ二量体を生成させる。類似の様式で、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の他のポリペプチドへ結合され、ヘテロ二量体、ホモ多量体、又はヘテロ多量体を形成し得る。結合、精製、及び分析は、実施例７及び３にあるとおり実施される。
（実施例１０）
本実施例は、糖類部分のｈＩＦＮポリペプチドへの結合を詳述する。
次すなわち、（配列番号２、又は他のＩＦＮポリペプチドの対応するアミノ酸にあるような）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５のうちの１つの残基を、以下の非天然にコードされていないアミノ酸と置換させる。
Figure 2008541769
一度改変されたら、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド変異体を、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ連結したアミノオキシアナログと反応させる。ｈＩＦＮポリペプチド変異体（１０ｍｇ／ｍＬ）及びアミノオキシ糖類（２１ｍＭ）を水性の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で混合し、３７℃で７ないし２６時間温置する。１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、糖類結合ｈＩＦＮポリペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）をＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）及びβ−１，４−ガラシトシルトランスフェラーゼ（０．４単位/ｍＬ）を大気温で４８時間温置することによって、第二糖類を第一糖類と酵素的に結合させる（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，５０５７−５０６１）。
（実施例１１）
本実施例は、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドアンタゴニストの生成を詳述する。
次の残基すなわち２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（ｈＩＦＮ、配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）のうちの１つを、実施例３に記載の次の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択される部位及び望ましい活性に依存して、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして作用する可能性があり得る。次の残基すなわち２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７（ｈＩＦＮ；配列番号２、又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）を、実施例３に記載の次の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2008541769
一度改変されると、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド変異体を、形態
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒはメチル、ｎは４、Ｎは２０，０００の分子量である。）のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応させ、前記ポリペプチド内の単一部位でＰＥＧ誘導体により改変される天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドアンタゴニストを生成する。結合、精製、及び分析を実施例３にあるとおり実施する。
（実施例１２）
ｈＩＦＮ分子が直接連結されるｈＩＦＮポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、又はヘテロ多量体の生成
アルキン含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド変異体は、実施例１０に限定されるわけではないが、実施例１０に記載の部位で各々が天然にコードされていないアミノ酸置換を含む、アジド含有アミノ酸を含む別のｈＩＦＮポリペプチド変異体へ直接結合され得る。類似の様式で、ｈＩＦＮポリペプチドは、１つ又はそれ以上の他のポリペプチドへ結合され、ヘテロ二量体、ホモ多量体、又はヘテロ多量体を形成し得る。結合、精製、及び分析を実施例３、６、及び７にあるとおり実施する。
（実施例１３）
Figure 2008541769
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をハロゲン化アルキル（Ａ）と反応させ、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物において、ｎは１から９までの整数であり、Ｒ’は、直鎖又は分岐鎖の飽和又は不飽和Ｃ１ないしＣ２０アルキル基又はヘテロアルキル基出あり得る。Ｒ’は、Ｃ３ないしＣ７の飽和又は不飽和環状アルキル又は環状へテロアルキル、置換型又は未置換型アリール基又はヘテロアリール基、又は置換型若しくは未置換型アルカリル基（アルキルは、Ｃ１ないしＣ２０の飽和又は不飽和アルキルである。）又はヘテロアルカリル基でもあり得る。典型的に、ＰＥＧ−ＯＨは、８００ないし４０，０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
（実施例１４）
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ＝ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ＝ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、その溶液へ、キシレン中の８０重量％溶液として溶解した臭化プロパルギルの溶液（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫＩの触媒量を添加し、得られた混合物を２時間還流加熱した。次に、水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴下して添加した。得られた沈殿を回収し、冷ジエチルエーテルの幾つもの部分で洗浄し、乾燥させると、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを生じた。
（実施例１５）
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、５−ブロモ−１−ペンチンの５０当量（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫＩの触媒量を前記混合物へ添加した。得られた混合物を１６時間還流加熱した。次に、水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴下して添加した。得られた沈殿を回収し、冷ジエチルエーテルの幾つもの部分で洗浄し、乾燥させると、対応するアルキンを生じた。５−クロロ−１−ペンチンは、同様の反応において使用され得る。
（実施例１６）
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ+ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ-Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）及び水（２．５ｍＬ）中の３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液へ、まず粉末状の水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を添加した後、キシレン中に８０重量％溶液として溶解した臭化プロパルギルの溶液（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６時間還流加熱した。前記混合物へ１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮させると、３−プロパルギルオキシベンジルアルコールを付与した。
塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃のＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、反応物を冷蔵庫の中に１６時間配置した。通常の作業は、メシル酸塩を淡黄色の油として生じた。この油（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間還流加熱した後、室温へ冷却した。前記混合物へ水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮させると、望ましい臭化物を付与した。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、溶液を氷槽中で冷却した。数分間にわたって激しく撹拌しながらＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した後、上述から得られた臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）及びＫＩの触媒量を添加した。冷却槽を除去し、得られた混合物を１２時間還流加熱した。水（１．０ｍＬ）を前記混合物へ添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴下による添加によって、白色沈殿を生じ、それを回収して、ＰＥＧ誘導体を生じた。
（実施例１７）
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
末端のアルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーは、末端の機能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーを、上述に示されるようなアルキン機能性を含有する反応性分子と結合させることによっても入手できる。
（実施例１８）
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。得られた粗ＮＨＳエステル７をさらに精製せずに、次の反応において使用した。
分子量５，０００ＤａのｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、混合物を４℃へ冷却した。激しく撹拌しながら、ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加した。前記混合物を３時間撹拌し、その間、室温へ加温した。次に、水（２ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴下して添加した。得られた沈殿を回収し、真空乾燥した。
（実施例１９）
本実施例は、ポリ（エチレングリコールの）メタンスルホン酸塩又はメシル酸塩とも呼ぶことのできるポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステルの調製を表す。対応するトシル化物及びハロゲン化物は、同様の手法によって調製できる。
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
トルエン１５０ｍＬ中のｍＰＥＧ−ＯＨ（分子量＝３，４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間共沸蒸留し、溶液を室温へ冷却した。無水ＣＨ２Ｃｌ２４０ｍＬ及び無水トリエチルアミン２．１ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）を前記溶液へ添加した。前記溶液を氷槽中で冷却し、蒸留した塩化メタンスルホニル（１５ｍｍｏｌ）１．２ｍＬを滴下して添加した。前記溶液を室温で窒素下で一晩撹拌し、無水エタノール２ｍＬを添加することによって、反応を停止させた。前記混合物を真空下で蒸発させ、トルエン以外のものが主である溶媒を除去し、真空下で再度濃縮した後、ジエチルエーテル１００ｍＬ中へ沈殿させた。ろ液を冷ジエチルエーテルの幾つもの部分で洗浄し、真空下で乾燥させると、メシル酸塩を生じた。
メシル酸塩（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ７５ｍＬ中に溶解し、溶液を４℃へ冷却した。冷却した溶液へ、アジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を窒素下で２時間還流加熱した。次に、溶媒を蒸発させ、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。容積を２０ｍＬまで減少させ、冷無水エーテル１５０ｍＬへ添加することによって、生成物を沈殿させた。
（実施例２０）
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
４−アジドベンジルアルコールは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９９８，５９５号に記載の方法を私用して生成できる。塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、０℃のＣＨ２Ｃｌ２中の化合物４（１．７５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、反応物を冷蔵庫の中に１６時間配置した。通常の作業は、メシル酸塩を淡黄色の油として生じた。この油（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間還流加熱した後、室温へ冷却した。前記混合物へ水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮させると、望ましい臭化物を付与した。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、ＫＩの触媒量とともに臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を前記混合物へ添加した。得られた混合物を１２時間還流加熱した。水（１．０ｍＬ）を前記混合物へ添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、乾Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、容積を約２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴下による添加によって、白色沈殿を生じ、それを回収して、ＰＥＧ誘導体を生じた。
（実施例２１）
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２-ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（分子量３，４００Ｄａ、２．０ｇ）をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１０ｍＬ）中に溶解し、溶液を０℃へ冷却した。激しく撹拌しながら、プロピオン酸３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５当量）を添加した。３時間後、Ｈ２Ｏ２０ｍＬを添加し、混合物を室温でさらに４５分間撹拌した。０．５ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨを３へ調整し、ＮａＣｌを約１５重量％の濃度まで添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルによる沈殿の後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させると、アジ化オメガ−カルボキシＰＥＧ誘導体を生じた。
（実施例２２）
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
本分野で公知のように調製され、ＴＨＦ中で−７８℃まで冷却されたリチウムアセチリドの溶液（４当量）へ、激しく撹拌しながら、ＴＨＦ中に溶解したｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を滴下して添加する。３時間後、反応物を室温へ加温させ、ブタノール１ｍＬの添加により急冷する。次に、Ｈ２Ｏ２０ｍＬを添加し、混合物を室温でさらに４５分間撹拌する。０．５ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨを３へ調整し、ＮａＣｌを約１５重量％の濃度まで添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルによる沈殿の後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させると、１−（ブト−３−イニロキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を生じた。
（実施例２３）
Ｌ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１；９６４−７（２００３）、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４；９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ １１， １１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２），ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４、及びＬ．Ｗａｎｇ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１−１０に記載の方法を使用して、アジ化物含有及びアセチレン含有アミノ酸をタンパク質へ部位選択的に組み込んだ。一度アミノ酸を組み込むと、２ｍＭ ＰＥＧ誘導体、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、及び〜１ｍｇのＣｕワイヤの存在下で、リン酸緩衝液（ＰＢ）中の０．０１ｍＭタンパク質によって付加環化を３７℃で４時間実施した。
ｐ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）及びｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成を以下に示すとおり実施する。Ｚｈａｎｇ，Ｚ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｂ．Ａ．Ｃ．， Ｗａｎｇ，Ｌ．， Ｂｒｏｃｋ，Ａ．， Ｃｈｏ，Ｃ． &Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３）４２，６７３５−６７４６においてすでに記載の手法を使用して、ラセミｐＡＦを合成する。ｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体を合成するため、次の手法を完遂する。室温（ＲＴ）で１時間撹拌したジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）中の（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及び１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ、メトキシ−ポリエチレングリコールアミン（Ｉｎ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｍｔ．３０Ｋ、ＢｉｏＶｅｃｔｒａ製）及びジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加する。反応物をＲＴで４８時間撹拌した後、約１００ｍＬに濃縮する。前記混合物を冷エーテル（８００ｍＬ）へ滴下して添加する。ｔ−Ｂｏｃ保護した生成物を沈殿し、ろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬにより洗浄する。ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に再溶解することによってさらに精製し、エーテル（８００ｍＬ）中で２回沈殿させる。生成物を真空下で乾燥させ、ＮＭＲ及びニンヒドリン検査により確認する。
上述で得られた保護された生成物（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃを０℃で１時間の後ＲＴで１．５時間、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）中で実施する。真空下でＴＦＡのほとんどを除去した後、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（１ｍＬ）を残渣へ添加することによって、ヒドロキシルアミン誘導体のＴＦＡ塩をＨＣｌ塩へ変換する。沈殿物をＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解し、エーテル（８００ｍＬ）中に再度沈殿させる。最終生成物をろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬで洗浄し、真空下で乾燥させ、窒素下で保存する。他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）ヒドロキシルアミン誘導体が、同一の手法を使用して合成できる。
（実施例２４）
次のプロトコールに従って、ｈＩＦＮポリペプチドを単離した。可溶化したＩＦＮを受容する緩衝液の組成を改変することによって、再折りたたみ方法に対する改変も、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを単離するために実施されてきた。手法中又は手法後のＣｕ＋＋又は他の温和な酸化剤の添加などの付加的な改変、変性剤又は還元剤を変化させること、多様なｐＨで再折りたたみ効率を評価するためにｐＨを変化させることが実施され得る。ＨＩＣ、染色剤ベース、サイズ排除、又はイオン交換樹脂を使用するカラムベースの再折りたたみ方法が、再折りたたみのために使用され得る。このような方法に対する他の改変は、当業者に公知である。
Ｎ末端に６Ｈｉｓタグを有するｈＩＦＮポリペプチドを生成するために、ｈＩＦＮヌクレオチド配列をタグの下流でクローニングした。ｈＩＦＮポリヌクレオチド配列及び（望ましい天然にコードされていないアミノ酸に特異的な）オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含有する構築物によるＥ．コリ（ＢＬ２１（ＤＥ３））の形質変換により、天然にコードされていないアミノ酸（ｐ−アセチル−フェニルアラニン）のｈＩＦＮポリペプチドへの部位特異的組み込みが可能になった。
封入体調製及び再折りたたみ
新鮮な又は凍結したＥ．コリ宿主細胞ペレットを、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡの約１０ｍＬ／ｇ中に再懸濁した。前記ペレットを３０秒間の６回超音波処理し、各超音波処理の間に氷上で１分間温置した。１ｍｇ／ｍＬリゾチーム及びＤＮａｓｅＩを、超音波処理した各試料へ添加し、前記試料を室温で３０分間温置した。
前記試料を１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、各試料に関する上清を分析のために転移させた。チューブの側面から脱離させ、ペレットを３０秒間の超音波処理によって再懸濁することによって、冷却しておいたＩＢ洗浄緩衝液１（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトン）４０ｍＬでペレットを３回洗浄した。各洗浄の間に、試料を１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次に、冷却しておいたＩＢ洗浄緩衝液２（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）４０ｍＬでペレットを２回再懸濁／洗浄した。各洗浄の間に、試料を１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。
洗浄の２セットの後、可溶化緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、８ＭＧｄｎ−ＨＣｌ）５ないし２０ｍＬ中で破砕することによって、ペレットを可溶化した。各ペレットを完全に歌謡化するのに必要な緩衝液の最小量を使用した次に、試料を１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して全ての不溶性粒子を除去し、上清を新たなチューブへ転移させた。
各試料から一定分量を採取し、前記一定分量を可溶化緩衝液中で２０倍希釈し、各試料に関するＯＤ２８０を測定して、タンパク質濃度を測定した。２８０ｎｍでの消衰係数は、２２，５００Ｍ−１又は１．１７ｍｇ／ｍＬ−１である。
封入体を３ないし５ｍＬの一定分量へ分け、−８０℃で保存した。０．１５ｍｇ／ｍＬのＩＦＮ最終物（６ないし８ＭのＧｎｄＨＣｌ、ｐＨ８中の５ｍｇ／ｍＬ溶液）を３つの一定分量で、４℃の迅速撹拌緩衝液（２０ないし５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．２、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、１０％グリセロール又はショ糖）（プラス可溶化したＩＦＮ由来の２００ないし２５０ｍＭ Ｇｎｄ）中へ注入した。起泡を回避するため、注入を前記溶液の表面下で実施した。注入後、４℃で約１６ないし２４時間ゆっくり撹拌した。再折りたたみ反応の完了後、試料をさらに処理した。
前記試料をＡｍｉｃｏｎ撹拌セル（ＹＭ−１０メンブレン）で約１ないし１．５ｍｇ／ｍＬ（１５ないし３０ｍＬ）に濃縮した。次に、試料を３０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールに対して、４℃で一晩透析した。試料をＱ ＨＰ緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）で５０ｍＬに希釈し、１５カラム容積にわたって０ないし３０％Ｂ（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ）の勾配を使用して、５ｍＬのＱ ＨＰ ＡＫＴＡカラムで精製を実施した。カラムを２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ／１Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をカラム画分に関して実施し、単量体に再折りたたみされたｈＩＦＮポリペプチドを含有する画分をプールした。１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５の１／２０容積を添加することによって各プールのｐＨを調整し、各プールを２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールに対して一晩透析した。ＰＥＧ化のために、ｈＩＦＮポリペプチドを１ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。
ＰＥＧ化
オキシアミノ誘導体化した３０Ｋ ＰＥＧを、１：１２のモル比（３０ｍｇ／ｍｇＩＦＮ／ｍＬ）でｈＩＦＮポリペプチドへ添加し、混合物を２８℃で１６ないし４８時間温置する。図１９は、結合に使用される３０Ｋ ＰＥＧを示す。
ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの単離
Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ３０カラムを使用して、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドを単離した。このカラムで使用した緩衝液は、緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）、緩衝液Ｂ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ）及び衛生化緩衝液（１Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ）であった。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮの画分をプールし、次の保存緩衝液２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ６、０．００５％トゥイーン、１２５ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。次に、試料を８μＭ超に濃縮し、４℃で保存した。
緩衝液回線をつなぎ、適切な緩衝液で洗浄し、カラム及び試料回線３０ないし４０ｍＬの衛生化緩衝液で衛生化する。試料回線を緩衝液Ａですすぎ、衛生化緩衝液の全ての痕跡を除去し、前記回線を試料添加のためにつないだ。ＵＶ及び伝導率などのパラメータが安定するまで、カラムを緩衝液Ａの５ないし１０カラム容積で平衡化した。
ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの試料をカラムへ注入し、カラムを緩衝液Ａの４カラム容積で洗浄した。使用した勾配は、次のとおりであった。すなわち０ないし２０％の緩衝液Ｂで２０カラム容積、１００％緩衝液Ｂで４カラム容積であった。１ないし１．５ｍＬの画分を前記カラムから回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、プールのための画分を決定した。ＰＥＧ単量体画分をプールした。３０ないし４０ｍＬの衛生化緩衝液によるカラム及び試料回線の衛生化によって、前記カラムを次の試料のために準備した。
（実施例２５）
本実施例は、ｈＩＦＮ活性及びｈＩＦＮ受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性の測定を詳述する。
バイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）研究（受容体結合親和性）
（配列ＬＬＰＰＧＱで終了する２０６個のアミノ酸からなる）ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメインに関する配列を、クローンＭＨＳ１０１１−６１０６４（ＯｐｎｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から増幅した。このインサートをＴ７プロモーターの下流のｐＥＴ２０発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローニングした。タンパク質発現をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより導入した。
発現したタンパク質が不溶性であったため、溶解した細胞から封入体を精製し、６Ｍ ＧｎｄＣｌ中で可溶化した。５ｍＬの一定分量（５０ｍｇ量）を１０ｍＭのＤＴＴで、３７℃で４５分間還元した。次に、４℃の５０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン、１０％グリセロールからなる再折りたたみ緩衝液２００ｍＬ中へ前記混合物を注入し、やさしく撹拌しながら一晩温置した。
次に、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セルを使用して再折りたたみ反応物を２５ｍＬに濃縮し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して一晩透析した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、単量体に再折りたたみしたＩＦＮＡＲ ＥＣＤをＨＰ Ｑセファロースで精製した。製造者によって推奨されるリジン特異的結合手法を使用して、精製されたＩＦＮＡＲ２ ＥＣＤをＣＭ５ビアコアチップ上に固定した。機能的タンパク質約２００ＲＵを固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中のＩＦＮ変異体の多様な濃度を、固定したＩＦＮＡＲ２を含有するフローセル及び固定したウシ血清アルブミンを含有する対照フローセルを通じて５０ｍｃｌ／分の流速で注入した。生成されたセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を１：１の相互作用モデルへ適合させ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄの値を算出した。天然にコードされていないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）を含むＮ末端の６−ＨｉｓのｈＩＦＮポリペプチドを、実施例２５に記載の方法を介して単離した後のｐＡＦを含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドと同様に検査した。これらの研究において利用した対照は、Ｓｉｇｍａから入手したＩＦＮａＡ、Ｎ−６Ｈｉｓタグつき野生型ＩＦＮ、及びＰＥＧＡＳ ＹＳ（登録商標）を包含した。ｈＩＦＮポリペプチドに関して回収されたデータを表３に示す。配列番号２の位置１４９でパラ−アセチルフェニルアラニン置換を有するＰＥＧ化されていないＷＦＮポリペプチドは、本アッセイにおいて変化した結合動態（より迅速なｋｏｆｆ）を示した。
Figure 2008541769
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リン酸化したＳＴＡＴ１の測定
改変されたｈＩＦＮα２ａポリペプチドの生物活性を評価するため、ヒト単球白血病ＴＨＰ−Ｉ細胞を使用して、シグナル伝達因子及び転写ファミリーメンバーの活性化因子であるＳＴＡＴ１のリン酸化を測定するアッセイを実施した。ＳＴＡＴ１の活性化は、ＩＦＮの抗ウィルス活性に関して必須であることが示されている（Ｄｕｒｂｉｎ ＪＥ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９６ ８４：４３−４５０）。ヒト単球系ＴＨＰ−１をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、ＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、熱失活された１０％ウシ胎仔血清及び５０μＭ２−メルカプトエタノール中でルーチンに経代培養した。前記細胞を５％ＣＯ２の高湿大気下で３７℃で維持した。
熱失活された、チャコールデキストラン処理した１％ウシ胎仔血清を含有するアッセイ培地中で、ＴＨＰ−１細胞を一晩飢餓状態にした後、ｈＩＦＮポリペプチドの濃度を３７℃で３０分間上昇させることによって刺激した。刺激した細胞を全て透過のために固定し、製造者（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって示唆されるように、適切なリン酸−抗体で染色した。試料の獲得をＦＡＣＳ Ａｒｒａｙで実施し、獲得したデータをＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）で分析した。ＥＣ５０値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔを利用するタンパク質濃度に対する平均蛍光強度でプロットした投与量反応曲線から生じた（図２）。
ＳＴＡＴ１のＩＦＮ誘発性リン酸化が、ＩＦＮα受容体２（ＩＦＮＡＲ２）に選択的であることを確認するため、追加の対照に関して実験した。血清飢餓状態にしたＴＨＰ−１を、ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤＲ２）の濃度上昇とともに３７℃で１５分間あらかじめ温置した後、ＩＦＮをＥＣ８０投与量で添加した。ＩＦＮα受容体２の細胞外ドメインは、ＳＴＡＴ１のＩＦＮαＡ誘発性リン酸化がＩＦＮＡＲ２に対して選択的であることを示すＩＦＮαＡにより刺激されるＳＴＡＴ１リン酸化に対して効果的に競合することがわかった。図３は、ＥＣＤＲ２が、ＩＦＡαＡ誘発性ｐＳＴＡＴ活性と競合することを示す。
ｈＩＦＮポリペプチドの精製後の可能性のある夾雑物質は、エンドトキシンである。エンドトキシンが、ＳＴＡＴ１のリン酸化に影響するか否かを決定するため、ある範囲のエンドトキシンレベルを本細胞アッセイにおいて検査した。図４は、エンドトキシンが、検査したレベルで本アッセイに実質的な効果を有さなかったことを示す。（示されるように）検査したエンドトキシン濃度範囲は、エンドトキシンを含有しない対照試料に匹敵するＭＦＩ（ＰＥ）を提供した。
あるいは、ＳＴＡＴ１のリン酸化は、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）ＥＬＩＳＡキット（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）により測定され得る。本キットを使用して、本アッセイは、９６穴プレートにおいて実施され、分光光度的なプレートリーダーによって測定可能な比色分析的読み出しをする。
抗増殖活性の測定
ｈＩＦＮポリペプチドを、抗増殖活性に関してもアッセイした。ＩＦＮαの顕著な効果は、細胞増殖を阻害するＩＦＮαの能力であり、抗腫瘍作用を決定する上で主たる重要性がある。ヒトリンパ芽球様ダウディ細胞系は、ＩＦＮαに対して特に感受性があることを証明しており、多くのＩＦＮα及び派生したハイブリッドポリペプチドにおいて抗増殖活性を測定するのに使用されてきた（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）Ａｕｇ；６７（Ｐｔ ８）：１６３３−４３）。本細胞系の使用は、懸濁培養において増殖する能力によって促進されてきた（Ｅｖｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ，（１９８１）Ｍｅｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７９：３６２−３６８）。
ヒトダウディＢ細胞系をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から購入し、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）及び熱失活された１０％化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖した。前記細胞培養を５％ＣＯ２の高湿大気下で３７℃で維持した。
ダウディ細胞を平底９６穴プレート中で１×１０４個の細胞／穴の密度で播種した。前記細胞を投与量濃度あたりの三つ組中のＩＦＮα２Ａの濃度上昇により活性化した。３７℃、５％ＣＯ２での４日間の温置期間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）４０μＬを各穴へ添加し、培養物をさらに３時間温置させた。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘを使用して、吸光度を４９０ｎｍで読み出した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔによるタンパク質濃度に対するＯＤ４９０ｎｍでプロットした投与量反応曲線（三つ組の平均）から、ＥＣ５０を得た。図５を参照されたい。
ｈＩＦＮポリペプチドの精製後の可能性のある夾雑物質がエンドトキシンであるため、ある範囲のエンドトキシンレベルを抗増殖アッセイにおいて検査した。図６は、エンドトキシンが、検査したレベルで本アッセイに実質的な効果を有さなかったことを示す。
リン酸化Ｔｙｋ２の測定
参照により本明細書に組み入れられるＫａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００４ ３２：７９７−８０５及びＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００５ ３３：４９５−５０３は、Ｔｙｋ２、ＣｒｋＬ、ＣｒｋＩＩ、及びＤａｘｘ及びＩＦＮの副作用を包含するリミチンとＩＦＮ−αとの間のシグナル伝達差異を論議している。ＣｒｋＬ、ＣｒｋＩＩ及びＴｙｋ２のリン酸化を測定するアッセイを使用して、本発明のｈＩＦＮポリペプチドを評価し得る。Ｕ−２６６におけるＣｒｋＩＩのリン酸化を評価することは、参照により本明細書に組み入れられるＰｌａｔａｎｉａｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９９；２７：１３１５−１３２１によって記載されるとおり実施され得る。Ｔｙｋ２のリン酸化を測定するため、ヒトＵ２６６Ｂ１細胞（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）を、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）及び熱失活された１５％化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。前記細胞培養を５％ＣＯ２の高湿大気下で３７℃で維持した。Ｔｙｋ２を測定するとき、血清飢餓状態にしたＵ２６６細胞を３７℃でＩＦＮα２Ａによって活性化した。刺激した細胞を全て固定し、透過性にし、製造者（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって示唆されているように、適切なリン酸−抗体で染色した。試料の獲得をＦＡＣＳ Ａｒｒａｙで実施し、獲得したデータをＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）で分析した。ＥＣ５０値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔを利用するタンパク質濃度に対する平均蛍光強度でプロットした投与量反応曲線から生じた。ＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインとの競合アッセイは。特異性を決定するのに有用である。Ｔｙｋ２に関して、図８を参照されたい。
表４及び５は、ＩＦＮα２ａ変異体であるｈＩＦＮポリペプチドによって得られたデータを要約する。ｐＳＴＡＴ１データ、抗増殖データ、ＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインによる親和性研究から得られたＫｄ値を示す。これらの研究において利用される対照は、ＷＨＯ ＩＦＮα２Ａ、Ｓｉｇｍａから得られたＩＦＮαＡ、及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を包含した。
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コロニー形成アッセイ
Ｇｉｒｏｎ−Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２ １６：１１３５−１１４２に記載のものなどのコロニー形成アッセイを使用して、本発明のｈＩＦＮによる前駆細胞の増殖を評価し得る。臍帯血は、コロニー形成アッセイにおいて使用され得る。
ヒト骨髄性及び赤血球系前駆細胞に及ぼすｈＩＦＮポリペプチドの毒性の評価
メチルセルロースベースのインビトロコロニー形成アッセイを使用して、１０個の化合物（９個のｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））の造血性毒性を検査した。
細胞：正常ヒト骨髄低密度細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｍａｒｙｌａｎｄ）をアッセイに必要なときまで−１５２℃で保存した。実験当日、細胞を３７℃で急速に解凍し、２％ウシ胎仔血清を含有するイスコブ培地１０ｍＬ中にバイアルの内容物を希釈し、遠心分離によって洗浄した。上清を除去し、２％ＦＢＳを含有するイスコブ培地の公知の容積中に細胞ペレットを再懸濁した。トリパンブルー排除による細胞計数（３％氷酢酸）及び生存率の評価を実施した。
検査試料：化合物は、２０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ６．０の緩衝液中にある４０倍ストックであった。各化合物の希釈物を同一緩衝液で調製し、１４４、７２、３６、１８、及び９μｇ／ｍＬのストック濃度を作製した。メチルセルロースへ添加するとき、前記緩衝液は、２．５％の終濃度であり、化合物濃度は、３．６ないし０．２２５μｇ／ｍＬの範囲であった。２０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ６．０の緩衝液中に５０ＥＵ／ｍＬエンドトキシンを含有する対照を同一緩衝液により１：４０でメチルセルロース中に希釈し、エンドトキシンの同様のレベルの効果を検討した。
方法：サイトカインＳＣＦ（幹細胞因子；５０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（インターロイキン３；１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＥＰＯ（エリスロポエチン；３Ｕ／ｍＬ）の飽和濃度を含有するメチルセルロースベースの培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）４４３４）中で、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ及びＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球−単球（ＣＦＵ−ＧＭ）及び多分化能（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の系譜のクローン原性前駆細胞を評価した。ＣＦＵ−Ｅは、最も成熟した赤血球コロニー形成細胞由来の小さな赤血球コロニーである。ＣＦＵ−Ｅは、総数８ないし２００個の赤芽球を有する１ないし２個のクラスターを含有する。ＢＦＵ−Ｅは、より未発達のな細胞由来の大きな赤血球コロニーである。ＢＦＵ−Ｅは、２００超の赤芽球を含有する。ＣＦＵ−ＧＭは、４０個以上の顆粒球−単球及び／又はマクロファージ細胞を有するコロニーを精製できるコロニー形成細胞由来のコロニーである。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、２つ以上の系譜由来の細胞を含有するコロニーである。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、最も未発達のなコロニー形成細胞由来であり、赤血球細胞を、２０個以上の顆粒球、マクロファージ、及び巨核球と同様に含有する。対照として、培養物は、媒体（２０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ６．０）を含有するセットアップであり、媒体は、エンドトキシン、及び５−フルオロウラシル（公知の骨髄抑制性化合物）の多様な濃度を含有した。緩衝液も化合物も含有しない標準的な培養物も確立した。
赤血球（ＣＦＵ−Ｅ及びＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球−単球／骨髄性（ＣＦＵ−ＧＭ）及び多分化能（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の系譜のクローン原性前駆細胞を、記載のメチルセルロースベースの培地中にセットアップした。化合物をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）へ添加して、３．６、１．８、０．９、０．４５、及び０．２２５μｇ／ｍＬの終濃度を付与した。化合物を含有しないが、媒体緩衝液の等価の濃度を含有する媒体対照培養物、化合物を含有しないが、エンドトキシンの等価の濃度を含有するエンドトキシン対照培養物、及び化合物も媒体緩衝液も含有しない標準対照も開始した。さらに、５、１、０．５、及び０．１μｇ／ｍＬの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とともに培養を開始し、毒性に関するポジティブ対照として供した。全ての培養物を１個の培養物あたり１×１０４個の細胞で三つ組にセットアップした。培養の１４日後、コロニーを評価し、スコア化した。大きさ及び形態に基づいて、コロニーを次のカテゴリーすなわち、ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、及びＣＦＵ−ＧＥＭＭへ分割した。
結果及び分析：ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、及びＣＦＵ−ＧＥＭＭに関する三つ組の培養物を列挙した。さらに、コロニーの種類の分布並びに一般的なコロニー及び細胞の形態を分析した。複製培養物中で検出されるコロニー数の分散は、コロニー列挙に関する変動係数の代表的なものである。結果を表６に示す。統計分析に関し、全ての化合物を媒体対照と比較した。標準的なｔ検定を実施し、対照培養物と処理した培養物との間に、発生したコロニー数の差異があるかどうかを評価した。コロニー列挙に関する可能性のある主観性のため、０．０１より小さなｐ値を有意とみなす。
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媒体対照及びエンドトキシン対照中で検出されるコロニーの数及び分布は、（化合物及び媒体緩衝液を含有しない）標準対照と異ならなかった。投与量依存的毒性効果（赤血球性及び骨髄性前駆細胞増殖に及ぼす阻害効果）は、５−フルオロウラシルとともに温置した培養物中で見られた。増殖の完全な阻害は、５μｇ／ｍＬの最高濃度で見られた。対照数からの有意な低下は、赤血球性及び骨髄性増殖に関しては１μｇ／ｍＬで、骨髄性増殖のみに関しては０．５μｇ／ｍＬでも見られ、５−ＦＵが、骨髄性細胞系譜に対してより毒性があることを示した。コロニー数は、０．１μｇ／ｍＬでほぼ対照レベルまで回復した。
各ｈＩＦＮポリペプチド又はＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の存在下において、得られた赤血球性コロニー及び骨髄性コロニーの形態は変化しなかった。しかしながら、コロニー数が影響を受けた場合、両種類のコロニーの大きさが影響を受けた。全てのｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）が、検査した全濃度でコロニー形成細胞（骨髄性及び赤血球性前駆細胞）の総数に対して毒性があることがわかり、わずかな投与量依存的効果を示した。ｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）は、前駆体化合物に及ぼすわずかな段階的な投与量依存的効果を生じた。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）は、０．２２５μｇ／ｍＬで有意に毒性があることがわかり、６ＨｉｓＭ１６ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＧ及び６ＨｉｓＮ６５ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧは、０．４５μｇ／ｍＬ（６ＨｉｓＭ１６ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧのみ）及び０．２２５μｇ／ｍＬで赤血球性前駆細胞に対する有意な毒性はないことがわかった。しかしながら、全ての化合物に関し、ＣＦＣの総数は、検査した全濃度で有意に阻害された。コロニーの大きさは、全ての化合物の存在下でより小さいこともわかり、大きさは、観察された毒性を反映した。例えば、３．６μｇ／ｍＬのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の存在下でのコロニーは、０．２２５μｇ／ｍＬで観察されるものよりも小さかった。
ＣＦＵ−ＧＭコロニー計数のさらなる分析（Ｙ軸）を図１０として示し、抗ウィルス活性の内部単位をＸ軸とした。抗ウィルスアッセイにおけるＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の特異的活性は、１ｎｇ／単位である。ＶＳＶ複製アッセイにおいて測定された抗ウィルスＩＣ５０値を使用して、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの質能濃度を内部単位へ変換した。対照標準に関するＣＦＵ−ＧＭコロニー計数をグラフの右端にプロットする。本アッセイにおいて検査したＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の５つの濃度に関するＣＦＵ−ＧＭコロニー計数をプロットする。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）濃度が、約３６００単位／ｍＬから２２５単位／ｍＬまで低下するにつれ、コロニー計数は増大する。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドに関するコロニー計数も示す。
全てのｈＩＦＮポリペプチドは、ＣＦＵ−ＧＭに及ぼす濃度依存的な効果を示した。単位あたりのベースで、ｈＩＦＮポリペプチド６Ｈｉｓ１２４ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧ及び６ＨｉｓＮ６５ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧは、本アッセイにおいてＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）よりも毒性があるように見えた。６ＨｉｓＮ６５ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧは、抗ウィルスアッセイにおいてＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）よりも少なくとも５倍低い強さであったが、ＩＦＮＲ２受容体に対して密接に結合することがわかった。対照的に、６ＨｉｓＥ７８ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧは、２倍高い単位濃度でＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）と等しいコロニー計数を有する約２倍低い毒性であるようであった。例えば、１６００単位／ｍＬの濃度の２２の６ＨｉｓＥ７８ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＧコロニー計数を、９００単位／ｍＬの２１のＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）コロニー計数と比較する。毒性に関するさらなる研究には、１２地点濃度曲線が、各ｈＩＦＮポリペプチドに関して１５０００から１単位／ｍＬまで及び、ＣＦＵ−ＧＭ毒性に関するＩＣ５０を決定する、ＣＦＵ−ＧＭ毒性研究が含まれるが、それに限定されるわけではない。
表７は、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）及びリバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）で得られた造血性毒性データを示す。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）は、２０ｍＭ酢酸Ｎａ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０の緩衝液中にあり、出発濃度は１８０μｇ／ｍＬであった。ＰＢＳ中のリバビリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号５５５５８０）は、７．６３ｍｇ／ｍＬの出発濃度にあった。表７に示すように、各希釈物を検査した。
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各化合物に関するプロットＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、又は総ＣＦＣ対濃度（μｇ／ｍＬ）を図１２ないし１７のように示すグラフが生じた。
抗ウィルスアッセイ
ｈＩＦＮポリペプチドの抗ウィルス活性は、多様なアッセイによって測定され得る。あるこのようなアッセイは、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）に感染した細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）の低下を研究することを包含する。ＶＳＶ（ＡＴＣＣ）は、ベビーハムスター腎臓細胞系ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ）を感染させることによって生じる。簡潔には、細胞を多様な量のウィルスで感染させ、感染２４時間後、ウィルスを含有する上清を回収する。１，２００ｒｐｍで５分間、上清を遠心分離することによって、細胞細片を除去する。ウィルスのストックを−８０℃で１ｍＬの一定分量で保存する。プラークアッセイを使用することによって、ウィルスの力価を算出する。力価をＰＦＵ／ｍＬ（プラーク形成単位）によって表す。本発明のｈＩＦＮポリペプチドの抗ウィルス活性を検査するためのさらなるアッセイには、ＨＣＶレプリコンに基づいたアッセイ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＢｒｅｎｔ Ｋｏｒｂａ博士）が含まれるが、それに限定されるわけではない。多様なｈＩＦＮポリペプチドを、安定したＨＣＶ ＲＮＡ複製細胞系ＡＶＡ５においてアッセイし、本細胞系は、ヒト肝芽腫Ｈｕｈ７に由来する。ｈＩＦＮポリペプチドの最後の投与量が添加された２４時間後に、細胞内ＨＣＶ ＲＮＡレベルを測定する。標準的なブロットハイブリダイゼーション技術を使用して、ＲＮＡレベルを測定する。ＨＣＶレプリコンの２つの系である１ａ系及び１ｂ系を検査する。別のＨＣＶアッセイは、ＨＣＶ複製を支持する特異的ヒト細胞におけるＨＣＶ複製の測定に基づいている（Ｅ．Ｋｏｒｂａ博士又はＴｈｏｍａｓ Ｉ．Ｍｉｃｈａｌａｋ博士，Ｍ．Ｄ．，Ｐｈ．Ｄ．（Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ， Ｃａｎａｄａ））。ｈＩＦＮポリペプチドの生物活性を評価する別のアッセイは、マーモット肝細胞を利用する。ヒトＩＦＮ−αは、この種類の細胞において、クラスＩ ＭＨＣ抗原発現及び２’−５−ＯＡＳのｍＲＮＡを上方制御する（Ｔｈｏｍａｓ Ｉ．Ｍｉｃｈａｌａｋ博士，Ｍ．Ｄ．，Ｐｈ．Ｄ）。クラスＩ ＭＨＣ発現及び／又は２’−５’−ＯＡＳレベルに及ぼす本発明のｈＩＦＮポリペプチドの効果を肝細胞において測定する。
ｈＩＦＮポリペプチド活性を評価するため、３×１０４個のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）を９６穴／プレート中に播種し、その後、１穴あたりＶＳＶの１０，０００ＰＦＵで感染させた。感染時に、ｈＩＦＮポリペプチドの異なる量を添加した。感染４８時間後、ＣＰＥを評価し、４２ないし４８時間が、１００％ＣＰＥを得るのに必要な最短時間であった。前記細胞を１ｍｇ／ｍＬの臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）０．１ｍＬで染色した後、基準波長としての６９０ｎｍとともに５７０ｎｍで分光光度的に読み取ることによって、ＣＰＥを同定した。ＭＴＴは、ミトコンドリア中の代謝低下を測定する。
表８は、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）及び、示される部位に置換を有し、３３個のＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドで得られたＩＣ５０値を要約する。パラ−アセチルフェニルアラニン置換を有するＰＥＧ化されていないｈＩＦＮポリペプチドも、本アッセイにより検査した。図９は、９個のＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）で得られた投与量反応曲線を示す。
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部位特異的ＰＥＧ化は、ＩＦＮの活性を変化させることがわかり、タンパク質の多様な生化学的特性を分離し得る。この部位特異的ＰＥＧ化効果は、図１１に示されるように、高親和性ＩＦＮ受容体ＩＦＮＲ２に関する各ｈＩＦＮポリペプチドのＫＤを有する抗ウィルスＩＣ５０データの分析の結果としてわかった。泡の大きさは、ＩＦＮＲ２に関する各ｈＩＦＮポリペプチドの測定されたＫＤを表す。２つのｈＩＦＮポリペプチド６ＨｉｓＩ２４ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧ及び６ＨｉｓＥ１０７ｐＡＦ−３０Ｋ ＰＥＧは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）と比較して、抗ウィルスアッセイに基づいて、前記細胞中で約５倍高く強力であった。また、ＩＦＮＲ２受容体ＫＤと抗ウィルス活性との間の相関は欠如していた。従って、部位特異的ＰＥＧ化がＩＦＮの生化学的活性を異なって改変できるという証拠が存在する。従って、多様な他の測定された生化学的特性が異なる改善された抗ウィルス能を有するｈＩＦＮポリペプチドが生成された。
（実施例２６）
他のアッセイ
ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ発現の測定
ＴＨＰ−１細胞における細胞表面ＭＨＣクラスＩ発現の亢進を測定するアッセイを使用しても、ｈＩＦＮポリペプチドの活性を検査し得る。ヒト単球系ＴＨＰ−１を上述のとおり培養した。５×１０５個／ｍＬの細胞濃度のＴＨＰ−１細胞をまず、５ｎＭ酢酸ミリスチン酸ホルボール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で分化させた。次に、分化したＴＨＰ−１細胞を、３７で２４時間のＩＦＮα２Ａの濃度上昇で刺激した。次に、ＩＦＮα２Ａにより活性化された細胞を回収し、洗浄し、表面ＨＬＡ発現に関して染色した。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で、ＡＰＣ結合型抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体による免疫蛍光染色によって、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙでの試料分析が可能となり、獲得したデータをＦｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。ＥＣ５０値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔを利用するタンパク質濃度に対する平均蛍光強度でプロットした投与量反応曲線から概算した。図７を参照されたい。
ＰＧＥ２及びｃＡＭＰアッセイ
ｈＩＦＮポリペプチドを評価するのに使用されるインビトロアッセイの例には、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４ １５６：１０７−１１２及びＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ ３６：１９３−１９６に記載の、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の上昇又はｃＡＭＰの低下を検出するアッセイが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ＰＧＥ２分泌アッセイを記載するさらなる引用には、参照により本明細書に組み入れられるＮａｚｚｕｃｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ １９９６：６０（２）：２７１−７；Ｈｏｏｚｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２００１ Ｍａｒ；３６（３）：５５９−７０；Ｆｉｅｂｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０００ Ｎｏｖ；７５（５）：２０２０−８；Ｓｃｈｗｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ １９９６；５９（４）：５５５−６１；及びＨｏｏｚｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ．）２００１ Ｊａｎ；１０１（１）：２−８が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの方法に対する改変は、当業者に公知である。
例えば、本発明のｈＩＦＮポリペプチドをＰＧＥ２レベル又はｃＡＭＰレベルを改変する対照又は最新のＩＦＮ治療と比較することで、細胞ベースのアッセイを実施する。ＰＧＥ２分泌を測定するこのようなアッセイは、ヒトＴＨＰ−１白血病細胞及びヒト神経芽腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）などの細胞系を包含する。リポ多糖（ＬＰＳ）を負荷した分化済みＴＨＰ−１細胞は、ＰＧＥ２の分泌亢進を示した。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、ＩＬ−１βは、ＰＧＥ２分泌を亢進した。このようなアッセイを使用して、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベル又はｃＡＭＰレベルの分泌の改変された最新ＩＦＮ治療で見られる発熱誘導及び／又は鎮痛効果の相関を研究し得る。
ｃＡＭＰレベルを次のとおり検出する。５×１０４個のＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽腫細胞（ＡＴＣＣ）を、９６穴アッセイプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）へと一晩接着させる。次に、（ａ）１０μＭフォルスコリン単独、（ｂ）１０μＭフォルスコリン＋ｈＩＦＮポリペプチド（非ＰＥＧ版に関して６０ｐＭ、ＰＥＧ形態に関して６００ｐＭ）及び（ｃ）１０μＭフォルスコリン＋ｈＩＦＮポリペプチド＋２０μＭナロキソン（オピオイド受容体アンタゴニスト）によって、細胞を３７℃で１５分間刺激した。次に、細胞を溶解し、溶解液をｃＡＭＰ−アルカリホスファターゼ結合体及び抗ｃＡＭＰ抗体とともに室温で１時間温置する。次に、化学発光基質を添加し、光放射レベルをＴｏｐｃｏｕｎｔ発光リーダーで測定する。前期溶解液中に存在するｃＡＭＰの量をｃＡＭＰ標準曲線から定量する。
遺伝子発現鑑定
オリゴヌクレオチドアレイ転写産物分析を使用するモノＰＥＧ化されたインターフェロン−α−２ａ異性体の転写活性は、Ｆｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｏｎｍｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００３；３：３１２−３１９に記載されている。発現研究において使用され得る細胞系には、ＭＥ１５などの黒色腫細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
さらなるアッセイ
予備的な製剤研究を支持するアッセイには、タンパク質の脱アミド、凝集、酸化、アセチル化に関するアッセイ、及び安定性を示す他のアッセイが含まれる。他のアッセイには、ジスルフィド転位及びタンパク質分解産物を含むがこれらに限定されるわけではない他の可能性のある分解産物を研究するアッセイが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
（実施例２７）
本実施例は、本発明のｈＩＦＮポリペプチドのクローニング、発現及び精製に関する代替的なシステムを記載する。本代替的システムの可能性のある利点には、ｈＩＦＮポリペプチドの再折りたたみを包含する１つ又はそれ以上の段階の削除が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ＮｕｓＡ融合タンパク質及びＴＥＶは、参照により本明細書に全てが組み入れられるＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ（１９９９）；６５：３８２−３８８；Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５；１４：９３６−９４１；及び米国特許第５，１６２，６０１号、第５，５３２，１４２号；第５，７６６，８８５号；及び第５，９８９，８６８号において論議される。
Ｎｕｓ−ｈＩＦＮポリペプチド融合のためのクローニング及び構築物
ＮｕｓＡ−ｈＩＦＮ融合物を生成するために、（ＧＳＧリンカー及びＴＥＶのための認識配列が含まれる）配列ＧＳＧＥＮＬＹＦＱによって分離されたＳｐｅＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間のＮｕｓＡの下流で、ｈＩＦＮヌクレオチド配列をクローニングした。ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ４４ベクターを使用して全ての開始クローニング段階を完遂した後、Ｔ７ｌａｃプロモーターによって調節されるｈＩＦＮの発現及び１ｍＭ ＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘導を可能にする別のベクター中へ、Ｎｕｓ−ＩＦＮ融合物カセット全体を転移させた。改変されたｈＩＦＮポリヌクレオチド配列及び（望ましい天然にコードされていないアミノ酸に特異的な）オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含有する構築物によるＥ．コリ（Ｏｒｉｇａｍｉ ２）の形質変換により、ｈＩＦＮポリペプチドへの天然にコードされていないアミノ酸の部位特異的組み込みが可能になる。
Ｎｕｓ−ｈＩＦＮ融合物の精製及び開裂
ＮｕｓＡ−ｈＩＦＮ融合物をコードする構築物で形質転換したＥ．コリの単一コロニーから、５ｍＬのＬＢ培養物を増殖させた。アンピシリン含有ＬＢ０．５Ｌを播種し、天然にコードされていないアミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを培養物へ添加した。培養物を２８℃ないし３２℃で一晩増殖させた。培養物のＯＤが０．８ないし１を超えるとき、培養物を３０℃へ転移させ、１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導を実施した。培養物を３０℃で４時間増殖させ続け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために試料を回収した。遠心分離により細胞を回収し、−８０℃で凍結した。
５０ｍＭトリス、ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールの２５ないし３０ｍＬ中に細胞を溶解した。ガラスビーカー中で試料を２５秒間を５ないし６回で超音波処理し、その間、氷上で試料を維持した。細胞を１０μＬのＤＮＡｓｅとともに室温で３０分間温置した。次に、試料を遠心で沈降させ、上清を回収した。５ｍＭのイミダゾールを上清へ添加した。
次に、上清を５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐカラムへ３ｍＬ／分にて負荷した。上清を負荷する前に、ＨｉｓＴｒａｐカラムを２０ｍＭトリス ｐＨ８、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％トゥイーン８０、１０ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）で平衡化した。カラムを緩衝液Ａで洗浄した後、溶出を次の段階勾配、すなわち８％緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス ｐＨ８．３００Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％トゥイーン８０、０．５ｍＭイミダゾール）の４カラム容積、３０％緩衝液Ｂの５カラム容積、及び１００％緩衝液Ｂ洗浄で実施した。５回の試行の後、カラムを１Ｍ ＮａＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、分解し、再負荷した（又は置換した）。
段階勾配からの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、融合物を有する画分（約７５ｋＤａ）をプールし、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールに対して４℃で一晩透析した。透析緩衝液で試料を３０μＭタンパク質に希釈した。次のもの、すなわち０．２ｍＭに至るシステアミン、１ｍＭに至るＥＤＴＡ、及び０．８μＭに至るＴＥＶを試料を添加した。次に、試料を４℃で２４ないし４８時間、又は室温で一晩温置した。
温置後、試料を二重蒸留Ｈ２Ｏで１：３に希釈し、５ｍＬのＱ ＨＰカラムへ負荷した。１８カラム容積にわたって１０ｍＭトリス、ｐＨ８（緩衝液Ａ’）の緩衝液Ｂ’（１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ）への０ないし４０％の勾配により、溶出を実施した。ｈＩＦＮポリペプチドは、約１００ｍＭ ＮａＣｌで、ＴＥＶは、２５０ｍＭ ＮａＣｌで、及びＮｕｓＡは、４００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。カラムを２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ／１Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。
溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｈＩＦＮポリペプチド画分をプールし、１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５の１／２０容積を添加することによってプールのｐＨを調整した後、ｈＩＦＮプールを２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールに対して一晩透析した。次に、試料を１ｍｇ／ｍＬ超に濃縮し、容積を３００ｍｃｌ超に維持した。２８０ｎｍでの消衰係数は、２２，５００Ｍ−１又は１．１７ｍｇ／ｍＬ−１である。
ＰＥＧ化
オキシアミノ誘導体化した３０Ｋ ＰＥＧを、１：１２モル比（３０ｍｇ／ｍｇＩＦＮ／ｍＬ）でｈＩＦＮポリペプチドへ添加し、混合物を２８℃で１６ないし４８時間温置した。図１９は、結合に使用された３０Ｋ ＰＥＧを示す。試料をＳＰ緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５）で１０倍希釈した。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドを精製するため、０ないし５０％ＳＰ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％エチレングリコール）の勾配で、５ｍＬのＳＰ ＨＰ ＡＫＴＡカラムを１０カラム容積にわたって使用した。約１００ｍＭの塩で、ＰＥＧ化されたＩＦＮを溶出した後、ＰＥＧ化されていない単量体を溶出した（ベースライン分離）。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮの画分をプールし、次の保存緩衝液、すなわち２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ６、０．００５％トゥイーン、１２５ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。次に、試料を８μＭ超に濃縮し、４℃で保存した。
ＴＥＶの精製
ＴＥＶを次のプロトコールで精製した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の０．５ないし２Ｌの培養物をｐＲＫ７９３−ＴＥＶ（Ｓ２１９Ｖ）プラスミド（ＮＣＩ製）で３０℃で形質転換した。ＯＤ６００が０．８ないし１．２のとき、誘導を実施し、増殖を３０℃で４ないし５時間続行した。細胞をＮＴＡ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７、３００ｍＭ ＮａＣｌ）２０ないし３０ｍＬ中に再懸濁した。次に、試料を氷上で３０秒間で５回超音波処理し、室温で３０分間温置し、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を回収し、イミダゾールを１５ｍＭまで添加した。
１５ｍＭイミダゾールを補充したＮＴＡ緩衝液中で平衡化した５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐカラムへ、上清を負荷した。１８カラム容積にわたって０ないし１００％Ｂ（０．５Ｍイミダゾール含有ＮＴＡ緩衝液）の勾配で、溶出を実施した。ＴＥＶは、２００ｍＭイミダゾールを出発する広範なピークとして溶出した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、清浄なＴＥＶを含有する画分をプールした。プールした画分を次の緩衝液（３０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）に対して一晩透析した。透析した試料を遠心分離して、全ての沈殿物を除去した。
次に、回転脱水された材料を二重蒸留Ｈ２Ｏで４倍透析し、緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス ｐＨ７、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化した５ｍＬ ＳＰ ＦＦ ＡＫＴＡカラムへ負荷した。１８カラム容積にわたって直線勾配０ないし１００％Ｂ（１０ｍＭトリス ｐＨ７、５０ｍＭ ＮａＣｌ）によりカラムを溶出した。溶出したＴＥＶ画分をプールし、次のもの、すなわち１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロールを前記プールへ添加した。試料を２０μＭ超に濃縮し（消衰係数３２，５００、ｐＩは９．６である。）、５００ｍｃｌ／チューブで一定分量に分注し、−２０℃で保存した。
抗ウィルス活性
本実施例に記載の方法を介して生成されたｈＩＦＮポリペプチド活性を評価するため、３×１０４個のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）を９６穴／プレート中に播種し、その後、１穴あたりＶＳＶの１０，０００ＰＦＵで感染させた。感染時に、ｈＩＦＮポリペプチドの異なる量を添加した。感染４８時間後、ＣＰＥを評価し、４２ないし４８時間が、１００％ＣＰＥを得るのに必要な最短時間であった。前記細胞を１ｍｇ／ｍＬの臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）０．１ｍＬで染色した後、基準波長としての６９０ｎｍとともに５７０ｎｍで分光光度的に読み取ることによって、ＣＰＥを同定した。ＭＴＴは、ミトコンドリア中の代謝低下を測定する。５個のＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の抗ウィルス活性を図１８に示す。第一アミノ酸も、ＮｕｓＡを包含する方法を使用して生成するため、天然にコードされていないアミノ酸を含むメチオニルｈＩＦＮポリペプチドを、「Ｍ−」ｈＩＦＮポリペプチドと表す。
（実施例２８）
本実施例は、本発明のｈＩＦＮポリペプチドのインビトロ及びインビボでの活性を測定するための方法を記載する。
細胞結合アッセイ
標識していないＩＦＮ、ｈＩＦＮ又はＧＭ−ＣＳＦの多様な濃度（容積：１０μＬ）の不在下又は存在下で、及び１２５Ｉ−ＩＦＮ（約１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）の存在下で、０℃で９０分間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μＬ）中で細胞（３×１０６個）を二重に温置する（総容積：１２０μＬ）。次に、細胞を再懸濁し、３５０μＬプラスチック遠心チューブ中の２００μＬ氷冷ＦＣＳ上で層形成させ、遠心分離した（１０００ｇ；１分間）。前記チューブの末端を切断することによってペレットを回収し、ペレット及び上清を個別にガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数する。
競合剤の不在下での結合全体から、標識していないＩＦＮの１００倍過剰量の存在下での結合（ｃｐｍ）として、特異的結合（ｃｐｍ）を測定する（非特異的結合）。使用される細胞の各種類に関して、非特異的結合を測定する。１２５Ｉ−ＩＦＮの同一調製物を使用して、別個の日に実験を実施し、内部一貫性を表示すべきである。１２５Ｉ−ＩＦＮは、ダウディ細胞への結合を示す。結合は、標識されていない天然ＩＦＮ又はｈＩＦＮによって投与量依存的様式で阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦ又は他のネガティブ対照によっては阻害されない。天然のＩＦＮと同様、天然の１２５Ｉ−ＩＦＮの結合と競合するｈＩＦＮの能力は、受容体が両形態を等しく十分に認識することを示唆する。
ＰＥＧ化されたＩＦＮからのインビボ研究
ＰＥＧ−ｈＩＦＮ、改変されていないｈＩＦＮ及び緩衝液をマウス又はラットに投与する。結果は、マウス又はラットあたり同一投与量を使用してウィルス複製の阻害を有意に増大させることによって示される改変されていないｈＩＦＮと比較して、本発明のＰＥＧ化されたｈＩＦＮの優れた活性及び長時間の半減期を示す。
結合型及び非結合型ｈＩＦＮ及びそれらの変異体のインビボでの半減期の測定
オスのスプラーグドーリーラット（約７週齢）を使用する。投与の当日、各動物の体重を測定する。体重１ｋｇあたり非結合型及び結合型ｈＩＦＮ試料１００μｇを各々、３匹のラットの尾静脈へ注入した。注入１分後、３０分後、１、２、４、６、及び２４時間後、ＣＯ２麻酔下で血液５００μＬを各ラットから採血する。遠心分離（４℃、１８０００×ｇ、５分間）によって血液から血清を単離する。分析当日まで、血清試料を−８０℃で保存する。氷上での試料解凍後、ＩＦＮインビトロ活性アッセイによって、血清試料中の活性型ＩＦＮの量を定量した。
抗ウィルス活性
ウィルスに対する細胞の耐性の程度を測定する、当業者に公知の多くのアッセイがある（ＭｃＮｅｉｌｌ ＴＡ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９８１）４６（２）：１２１−７）。これらのアッセイは一般的に、３つの種類へと分類でき、すなわち、細胞変性効果の阻害、ウィルスプラーク形成、及びウィルス生成量の低下である。ウィルス細胞変性効果アッセイは、ＩＦＮで前処理され、その後ウィルスで感染した細胞培養物中で誘導される保護の程度を測定する。例えば、水疱性口内炎ウィルスは、このようなアッセイにおいて使用するための適切なウィルスである。アッセイのこの種類は、９６穴プレートで実施できるため、幾多の異なるＩＦＮをスクリーニングするのに簡便である。細胞変性効果低下アッセイの例は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ（２００１）１２（４）：８５７−８５９に詳述される。プラーク低下アッセイは、プラーク形成ウィルス（例えば、麻疹ウィルス）に対するＩＦＮ処理した細胞培養物の耐性を測定する。本アッセイの１つの利点は、プラーク形成における５０％低下の精確な測定が可能であることである。最終的に、ウィルス生成量アッセイは、例えば単一増殖周期中の細胞から放出されるウィルスの量を測定する。このようなアッセイは、細胞変性効果を生じないウィルス、又は標的細胞培養物中にプラークを構築しないウィルスに対するＩＦＮの抗ウィルス活性を検査するのに有用である。感染の多重度（ｍｏｉ）は、プラーク低下又はウィルス生成量アッセイのいずれかを使用するときを考慮するための重要な因子である。
他の臨床的に重要なインターフェロンの特徴も、研究室設定において簡単にアッセイされる。１つのこのような特徴は、特異的細胞表面受容体に結合するインターフェロンポリペプチドの能力である。例えば、幾つかのＩＦＮα−２ａｓは、臨床知見においてもっとも広範に使用されるＩＦＮであるＩＦＮα−２ｂと比較して、異なる細胞表面特性を呈する。ＩＦＮα−２ｂが効果的な抗ウィルス剤である一方、ＩＦＮα−２ｂは、有意な有害なる副作用を生じる。ＩＦＮα−２ｂとは異なる結合特性を呈するインターフェロンは、同一の有害な効果を生じ得ない。それゆえ、細胞上での結合部位に関してＩＦＮα−２ｂとほとんど競合しないインターフェロンが、臨床的な関心対象である。競合的インターフェロン結合アッセイは、本分野で周知である（参照により本明細書に組み入れられるＨｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９３）Ｊｕｎ １５；２６８（１７）：１２５９１−５；Ｄｉ Ｍａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０２：１４４５−１４５１）。一般的に、このようなアッセイは、１２５Ｉ標識したＩＦＮα−２ｂと関心対象の標識していないインターフェロンとの混合物との細胞培養細胞の温置を包含する。次に、結合していないインターフェロンを除去し、結合した標識の量（及び拡張により、結合したＩ標識済みＩＦＮα−２ｂ）を測定する。競合するインターフェロンの存在下又は不在下で細胞に結合する標識の量を比較することによって、相対的な結合親和性を算出できる。
ＩＦＮαの別の顕著な効果は、細胞増殖を阻害するＩＦＮαの能力であり、抗腫瘍作用を決定する上で主たる重要性がある。増殖阻害アッセイは、十分に確立されており、通常、細胞計数又は、トリチウム標識したチミジン（［３Ｈ］チミジン）又は別の放射性標識の取り込みに依存する。ヒトリンパ芽球様ダウディ細胞系は、ＩＦＮαに対して特に感受性があることを証明しており、多くのＩＦＮα及び派生したハイブリッドポリペプチドにおいて抗増殖活性を測定するのに使用されてきた（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）Ａｕｇ；６７（Ｐｔ ８）：１６３３−４３）。本細胞系の使用は、懸濁培養において増殖する能力によって促進されてきた（Ｅｖｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ，（１９８１）Ｍｅｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７９：３６２−３６８）。ＩＦＮαは、多くの免疫調節活性も呈する（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｔｅｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｎｋｅｎｓ，Ｅｄｓ．，Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｙｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍの中のＺｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６））。
ＩＦＮは、ウィルス学者によって最初に発見されたが、（１９７９年の）ＩＦＮの最初の臨床使用は、黒色腫に対する治療剤としてであった（Ｊｏｓｈｕａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１１（４）：１９１−２００）。ＩＦＮαはそれ以来、ウィルス源、悪性腫瘍源、血管新生源、アレルギー源、炎症源及び線維源に関する無数の疾病に対して効果的であることが示されてきた（Ｔｉｌｇ，（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１２（３）：１０１７−１０２１）。ＩＦＮαは、転移性腎癌及び慢性骨髄性白血病の治療において効果的であることも証明してきた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｃｈ，（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．５７（９）：４３６−４３９）。ＩＦＮの臨床使用は、Ｇｒｅｓｓｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１（５）：５６７−５７４及びＰｆｅｆｆｅｒ（１９９７）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（３ Ｓｕｐｐｌ．９）：Ｓ９−Ｓ６３Ｓ９６９において概説されている。
鎮痛アッセイ
疼痛閾値研究は、ｈＩＦＮポリペプチドの鎮痛効果を研究するため、これらの化合物で実施され得る。１つのこのような沈痛アッセイは、参照により本明細書に組み入れられるＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ（２００１）１２（４）：８５７−８５９に記載される。
（実施例２９）
本実施例は、本発明のｈＩＦＮポリペプチドのインビボでの活性及び毒性を測定するための方法を記載する。
ｈＩＦＮポリペプチドの抗ウィルス活性を研究するのに使用される動物モデルには、全てが参照により本明細書に組み入れられる、チンパンジーＨＣＶモデル（Ｉｌａｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００２ Ｊａｎ １５；１８５（２）：１５３−６１）及びＡｌｂ−ｕＰＡトランスジェニックマウスモデル（Ｍｅｒｃｅｒ ＤＦ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１ Ａｕｇ；７（８）：９２７−３３；Ｋｎｅｔｅｍａｎ，Ｎ ｅｔ ａｌ（２００３）１０ｔｈ ＨＣＶ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｋｙｏｔｏ Ｊａｐａｎ，Ｐ−１８７）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。マーモットにおけるウッドチャック肝炎ウィルス（ＷＨＶ）感染は、ＨＢＶ感染の病変形成、予防、及び治療を研究するための有用なモデルである（Ｂｅｒｒａｏｎｄｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００２；６８，４２４−４３２）。ＷＨＶへ出生前に暴露されるマーモットの状態は、ＨＢＶ感染と同様である。抗ウィルス性有効性評価に関してマーモットに対する種交差反応性を十分に増大させるために、幾つかの方法において改変された、ＰＥＧ化されたヒトインターフェロンペプチド、ＰＥＧ化されたマーモットインターフェロン化合物アナログ、又はＰＥＧ化されたヒトインターフェロンポリペプチドのいずれかの化合物を、ウッドチャック肝炎モデルで評価する。
カニクイザルも、インビボでの活性及び骨髄毒性を研究するのに使用される。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）などの最新のＩＦＮ治療薬と比較して、本発明のｈＩＦＮポリペプチドによる２’，５’−ＯＡＳを含むがそれに限定されない下流マーカーの誘導を測定することによって、活性をアッセイする。好中球、赤血球、及び血小板を含むがそれらに限定されるわけではない循環している血液細胞を、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）などの最新のＩＦＮ治療薬と比較したｈＩＦＮポリペプチドの投与後の骨髄毒性研究において評価する。２’，５’−ＯＡＳは、インターフェロンによって誘導される酵素であり、インターフェロンの抗ウィルス活性と直接関連している。この酵素は、細胞中に存在する不活性型ＲＮＡｓｅを活性化させ、ｍＲＮＡの分解を通じて細胞又はウィルスのタンパク質合成を妨害すると考えられるオリゴヌクレオチド（２−５Ａ）の混合物を生じる。２’，５’−ＯＡＳ活性の検出は、２−５Ａのレベルを測定する放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ＥＩＫＥＮ）を含むがそれに限定されるわけではない、当業者に公知の多様なアッセイによって実施され得る。カニクイザル血清は、例えば２’，５’−ＯＡＳ活性レベルを測定するのに使用され得る。ネオプテリンは、インターフェロンに対する暴露に際し、マクロファージによって生成される種非特異的免疫マーカーである。ネオプテリンの検出は、ＥＩＡ（ＩＢＬ）を含むがそれに限定されるわけではない、当業者に公知の多様なアッセイによって実施され得る。他の分子のレベルは、コルチゾルレベルを含むがそれに限定されるわけではないこのような研究において測定され得る。視床下部−下垂体−副腎皮質系の要素であるコルチゾルは、鬱、ストレス及び体重増加に関与してきた。コルチゾルの検出は、ＥＩＡ（ＲｎＤ）を含むがそれに限定されるわけではない、当業者に公知の多様なアッセイによって実施され得る。本発明のｈＩＦＮポリペプチドの投与後の研究を通じてサイトカインパネルを実施し、多様なサイトカインレベルを基礎レベルと比較して、ｈＩＦＮポリペプチドの毒性を評価し得る。ＥＬＩＳＡ、ビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び他のアッセイフォーマット（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を含むがそれらに限定されるわけではない当業者に公知の多様なアッセイが使用され得、蛍光読み出しを含むがそれに限定されるわけではない読み出しの異なる種類を包含し得る。血清又は血漿中の化合物レベルの測定は、ＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）を含むがそれに限定されるわけではない、当業者に公知の多様なアッセイを使用して検出され得る。ＥＬＩＳＡ又は他の方法による検出に使用される抗体は、抗ＩＦＮアルファ抗体又はＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドに関する抗ＰＥＧ抗体であり得る。当業者に公知の多様なアッセイフォーマットは、蛍光を包含するものを含む検出に使用され得る。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドの評価は、次の臨床前計画によって実施される。研究１において、投与量範囲を見出す薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）及び安全性研究が、メスカニクイザルにおいて開始され、偽薬及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の４つの投与量（０、１．５、１５、５０、及び１５０μｇ／ｋｇ）を包含する。前記サルを２週間順化させる。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の１５、５０及び１５０μｇ／ｋｇを第１日及び第５日に投与する。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の１．５μｇ／ｋｇを第１日にのみ投与する。５群の各々には３匹のメスザルがいる。生存期間は１４日間であり、少なくともさらに１週間進行させるのをデータが正当化する事象において、そのような選択肢を有する。エンドポイントは、第８日及び第１５日を通じてＡＵＣを統合させることによって測定される血漿中の化合物レベル及び第１５日を通じての２’，５’−ＯＡＳレベル及びネオプテリンレベルである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＴＮＦ、及びＩＦＮ−γを含むがそれらに限定されるわけではない多様なサイトカインのレベルを測定することによって、第１５日を通じてサイトカインパネルも実施される。前記サルの直腸温も測定され、その理由は、発熱が最新のＩＦＮ治療の公知の副作用でもあるからである。
１回又は２回の投与量が最初の研究から選択された後、研究２は、１回又は２回の投与量で本発明のｈＩＦＮポリペプチドをＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）と比較することを包含する。単回投与量がＰＫ、有効性、及び毒性の比較に適している場合、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の特定の投与量をカニクイザルで検査し、同一投与量での１つ又はそれ以上のｈＩＦＮポリペプチド及び偽薬と比較する。３匹のメスザルが各群におり、順化期間は、２週間である。研究１のように、２’，５’−ＯＡＳレベル、血液学、体温、コルチゾル、及びサイトカインパネルを研究する。２回の投与量が必要な場合、すなわち、低用量がＰＫ及び有効性に必要な場合、別の投与量が毒素比較に必要とされ、次に、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を、両投与量での１つ又はそれ以上のｈＩＦＮポリペプチド及び偽薬と比較する。研究１のように、２’，５’−ＯＡＳレベル、血液学、体温、コルチゾル、及びサイトカインパネルを研究する。生存中の研究終了時は第１５日であり、少なくともさらに１週間進行させるのをデータが正当化する事象において、そのような選択肢を有する。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドへ暴露した動物から骨髄を回収し評価する。例えば、処理された動物由来（例、霊長類由来）の骨髄吸引物及び／又は中心生検を組織学的に検討し、骨髄性細胞と有核赤血球との比（Ｍ：Ｅ比）を概算する。好中球減少に伴う低いＭ：Ｅ比は、好中球産生の低下による顆粒球形成不全を示し得る。処理された動物から単離された骨髄細胞を、造血前駆細胞に関してアッセイする。すなわち、細胞単離物をＣＦＵ−ＧＭ又はＢＦＵ−Ｅコロニーアッセイに供する。結果（すなわち、造血前駆細胞数）は、もしあれば、骨髄性細胞及び／又は赤血球前駆細胞における治療の効果を示す。
このような骨髄毒性研究は、皮下的及び静脈内を含むがそれらに限定されるわけではない異なる経路を介して投与されるｈＩＦＮポリペプチドを包含し得る。静脈内投与は、皮下投与よりも骨髄毒性のより長期の投与計画及びより良好な評価を可能とし得る。このような改善は、投与される化合物に対する免疫原性又は抗体反応の調節に起因し得る。毒性研究には、血漿又は血清ｍＬあたりの好中球数及び血小板数の評価が含まれる。
他の動物モデルには、鬱モデルが含まれるが、それに限定されるわけではない。１つのマウスモデルは、尾部懸垂検査を包含する。ｈＩＦＮポリペプチドの投与後のマウスにおけるコルチゾル及びＡＣＴＨのレベルを測定するアッセイも実施される。コルチゾル及びＡＣＴＨの両者は、視床下部−下垂体−副腎皮質系の要素であり、患者におけるインターフェロン治療誘発性鬱において役割を担うことに関与している。
（実施例３０）
本実施例は、ｈＩＦＮポリペプチドの単離及びｈＩＦＮ活性及びｈＩＦＮ受容体に対するこれらのｈＩＦＮポリペプチドの親和性の測定を詳述する。
銅カラムによる精製
５００ｍＬ ＬＢ振盪フラスコ発現：
各ｈＩＦＮポリペプチドに関して、オルソゴナルｔＲＮＡ（米国特許公報第２００３０１０８８８５号に記載のＪ１７）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（「アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の組成物及びその使用」という表題の米国特許出願第１１／２９２，９０３号に記載のＥ９）をコード化し、変異したｈＩＦＮポリヌクレオチドを有する構築物により形質転換されたＥ．コリをプレート上で画線し、コロニーを得た。抗生物質を含有する２ｍＬのＬＢに、新鮮に形質転換したプレートからの単一コロニーを接種した。培養物が、約０．０５ないし０．３のＯＤ６００（約５ないし６時間）に到達するまで、３７℃で定常撹拌（２５０ｒｐｍ）下で培養物を温置した。接種物を標準化して培養物を同期化し、（抗生物質及び４ｍＭのｐＡＦを含有する）５００ｍＬのＬＢに、２ｍＬ培養物の全て又は部分を接種した。培養物が、約１．０のＯＤ６００（約4ないし５時間）に到達するまで、３７℃で定常撹拌（２５０ｒｐｍ）下で培養物を温置した。次に、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、培養物を３７℃で一晩温置した。４℃、８０００ｒｐｍ／１２０００ｇで１５分間遠心分離することによって、細胞を回収した。細胞ペーストを掻き出し、４０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅチューブ中に保存した。次に、封入体調製を開始するまで、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
５００ｍＬ振盪フラスコからの封入体調製：
緩衝液１は、５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１．０％トリトンＸ−１００であった。緩衝液２は、５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡであった。表９は、封入体調製に使用した手法を示す。
Figure 2008541769
溶解工程のために、４℃で１時間振盪させることによって、２３ｍＬの冷緩衝液１中で細胞を再懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ３を洗浄し、１００ｍＬの水ですすいだ後、３０ｍＬの緩衝液１ですすいだ。次に、以下の様式で、４℃で冷却しながら１５，０００ないし２０，０００ｐｓｉでＡｖｅｓｔｉｎ中を２回通過させることによって、細胞を均質化した。１）試料を添加した。２）Ａｖｅｓｔｉｎ貯蔵器がほぼ空になるまで試料を一度処理し、試料を元のチューブ中に回収した（その後の工程に関して実施もした）。３）回収した試料をＡｖｅｓｔｉｎ貯蔵器へ添加し戻し、再度均質化した。４）１２ｍＬの緩衝液１を均質化することによって、試料を洗浄した。５）試料を４０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅ遠心チューブへ転移させた。６）試料を保存し、１００ｍＬの水をＡｖｅｓｔｉｎに通し、作動させながらゆっくり添加して、システムを洗い流した。７）次に、３０ｍＬの緩衝液１を貯蔵器へ添加し、均質化して、次の試料のために準備した。８）次に、前記工程を反復して、次の試料を処理した。
洗浄及びすすぎの工程に関し、最後の洗浄由来の上清を除去し、新鮮な緩衝液を注いだ後、スパチュラを使用して、ペレットをチューブから浮かせた。マイクロチップではなく通常のチップを使用して、７５％出力で超音波処理を実施した。試料間で、チップを水ですすぎ、キムワイプで拭いた。
最初の４工程の間、細胞ペレットを保存するのに使用した４０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅチューブ中で試料を回転脱水した。各試料を２個の１５ｍＬコニカルチュープへ分注することによって、すすぎ２を回転脱水した。
可溶化及び再折りたたみ：
５０ｍＭのＮａＡｃ又はトリスを使用して、ｐＨ５．５ないし８．５の間の８Ｍ ＧｎｄＨＣｌを用いて可溶化した。封入体を５ないし１０ｍｇ／ｍＬの間の終濃度に可溶化した。長期保存のため、材料を−８０℃で再折りたたみ又は保存した。
４℃の再折りたたみ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ６．０又は５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０；０．１％トゥイーン２０）中で０．５ｍｇ／ｍＬの最終的な総タンパク質濃度に、可溶化した材料を希釈することによって、再折りたたみを実施した。再折りたたみ混合物を４℃で２４ないし７２時間保存した。
Ｃｕ精製：
再折りたたみした試料を室温に加温させた。５０μＭ ＣｕＣｌの終濃度を再折りたたみした試料へ添加し、試料を室温で１０ないし３０分間温置した。試料を０．２２μｍＰＥＳフィルターでろ過し、Ｃｕを負荷し、Ｃｕ緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％トゥイーン２０）で平衡化したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ負荷した。直線的な勾配を１８カラム容積にわたって１００％Ｃｕ緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％トゥイーン２０）まで実施し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するチューブ中に試料を回収した。
ＣｕプールのＳＰ ＨＰ精製：
ｈＩＦＮポリペプチドピークをＣｕカラムから回収し、ＳＰ緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で平衡化したＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ直接負荷した。直線的な勾配を１５カラム容積にわたって５０％ＳＰ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０；０．５Ｍ ＮａＣｌ；１０％エチレングリコール；１ｍＭ ＥＤＴＡ）まで実施した。
ＰＥＧ化及び精製：
ｈＩＦＮポリペプチド試料をＳＰ ＨＰカラムからプールし、１．０ないし２．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１０％酢酸を試料へ添加し、ｐＨを４．０にまで低下させた。オキシアミノ誘導体化した３０Ｋ ＰＥＧを、１：１２モル比（３０ｍｇ／ｍｇＩＦＮ／ｍＬ）でｈＩＦＮポリペプチドへ添加し、混合物を２８℃で４８ないし７２時間温置した。図１９は、結合に使用された３０Ｋ ＰＥＧを示す。位置１０７で非天然アミノ酸パラ−アセチルフェニルアラニンを含む１つのｈＩＦＮポリペプチドを分岐鎖４０Ｋ ＰＥＧへ結合させた。このＰＥＧを化合物ＩＶ（ｍＰＥＧ（４０Ｋ）塩化アミノエトキシアミン）として図２０に示し、前記図は、ｍＰＥＧ（４０Ｋ）ｐ−炭酸ニトロフェノールからの合成スキームを示す。４０ＫＰＥＧ化された生成物に使用されるモル比及び結合条件及び精製方法は、３０ＫＰＥＧ化された生成物と同一であった。試料をＳＰ緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５；１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮを精製するため、０ないし５０％ＳＰ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％エチレングリコール；１ｍＭ ＥＤＴＡ）の勾配で、ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１５カラム容積にわたって使用した。約１００ｍＭの塩で、ＰＥＧ化されたＩＦＮを溶出した後、ＰＥＧ化されていない単量体を溶出した（ベースライン分離）。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮの画分をプールし、次の保存緩衝液、すなわち２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ６、０．００５％トゥイーン、１２５ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。試料を１．０ないし２．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
示されたグリセロールベースの分岐鎖４０Ｋ ＰＥＧを機能化するのに使用された方法は、次のとおりであった（図２０）。塩化Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−メチレン（１：２、１５０ｍＬ）中のｍＰＥＧ（４０Ｋ）ｐ−炭酸ニトロフェノールＩ（２０ｇ、０．５ｍｍｏｌ）と塩酸Ｎ−アミノエトキシフタルイミドＩＩ（０．６ｇ、２．５ｍｍｏｌ）との混合物へ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．２７ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、カタログ）を添加した。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した。酢酸エチル−ヘキサン（１：１、１Ｌ）を添加した。沈殿物をろ過し、酢酸エチル−ヘキサン（１Ｌ）で洗浄し、真空乾燥させると、生成物ＩＩＩを白色粉末として生じた。
先行工程からのｍＰＥＧ（４０Ｋ）Ｎ−アミノエトキシフタルイミドＩＩＩを、塩化メチレン−メタノール（１：１、１００ｍＬ）中のヒドラジンの０．５Ｍ溶液中に溶解した。得られた混合物を室温で１．０時間撹拌した後、ＨＣｌ水溶液（０．５Ｎ、３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中に溶解した。酢酸エチル−ヘキサン（１：１、１Ｌ）を添加し、ｍＰＥＧ（４０Ｋ）塩酸アミノエトキシアミン生成物ＩＶ（１７．６ｇ、Ｉから８８％）を白色粉末として沈殿させた。
ビアコア研究（受容体結合親和性）
（配列ＬＬＰＰＧＱで終了する２０６個のアミノ酸からなる）ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメインに関する配列を、クローンＭＨＳ１０１１−６１０６４（ＯｐｎｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から増幅した。このインサートをＴ７プロモーターの下流のｐＥＴ２０発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローニングした。タンパク質発現をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより導入した。
発現されたタンパク質が不溶性であったため、溶解した細胞から封入体を精製し、６Ｍ ＧｎｄＣｌ中で可溶化した。５ｍＬの一定分量（５０ｍｇ量）を１０ｍＭのＤＴＴで、３７℃で４５分間還元した。次に、４℃の５０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン、１０％グリセロールからなる再折りたたみ緩衝液２００ｍＬ中へ前記混合物を注入し、やさしく撹拌しながら一晩温置した。
次に、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セルを使用して再折りたたみ反応物を２５ｍＬに濃縮し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して一晩透析した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、単量体に再折りたたみしたＩＦＮＡＲ ＥＣＤをＨＰ Ｑセファロースで精製した。製造者によって推奨されるリジン特異的結合手法を使用して、精製されたＩＦＮＡＲ２ ＥＣＤをＣＭ５ビアコアチップ上に固定した。機能的タンパク質約２００ＲＵを固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中のＩＦＮ変異体の多様な濃度を、固定したＩＦＮＡＲ２を含有するフローセル及び固定したウシ血清アルブミンを含有する対照フローセルを通じて５０ｍｃｌ／分の流速で注入した。生成されたセンソグラムを１：１の相互作用モデルへ適合させ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄの値を算出した。天然にコードされていないアミノ酸（パラ−アセチルフェニルアラニン；ｐＡＦ）においてＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの受容体結合親和性を観察した。ｐＡＦにおいてＰＥＧ化されたさらなる変異体を検査し、前記変異体は、位置１４９で天然にコード化されているアミノ酸置換を有した。メチオニル野生型インターフェロン（Ｍ−ＷＴ）は、対照試料として包含された。表１０は、得られたｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを示す。示されたｈＩＦＮポリペプチドは、６−Ｈｉｓタグを有さず、本実施例に記載のとおり再折りたたみされた。
Figure 2008541769
抗ウィルスアッセイ
ｈＩＦＮポリペプチド抗ウィルス活性を評価するため、３×１０４個のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）を９６穴／プレート中に播種し、その後、１穴あたりＶＳＶの１０，０００ＰＦＵで感染させた。感染時に、ｈＩＦＮポリペプチドの異なる量を添加した。感染４８時間後、ＣＰＥを評価し、４２ないし４８時間が、１００％ＣＰＥを得るのに必要な最短時間であった。前記細胞を１ｍｇ／ｍＬの臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）０．１ｍＬで染色した後、基準波長としての６９０ｎｍとともに５７０ｎｍで分光光度的に読み取ることによって、ＣＰＥを同定した。ＭＴＴは、ミトコンドリア中の代謝低下を測定する。
表１１及び１２は、示された部位に非天然アミノ酸置換（パラ−アセチルフェニルアラニン、ｐAF）を有し、その部位でＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドによって得られたＩＣ５０値に基づいた％相対的抗ウィルス活性を示す。数個のｈＩＦＮポリペプチドは、位置１４９で同様に天然アミノ酸置換を有した。１対の変異体は、実施例２７に記載のＮｕｓＡシステムを使用して生成され、（「Ｍ−」と表される）Ｎ末端にメチオニンを含有する。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を対照として使用した。
Figure 2008541769
Figure 2008541769
（実施例３１）
本実施例は、ｈＩＦＮ活性及びｈＩＦＮ受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性の測定を詳述する。実施例２７のＮｕｓＡシステムを使用して、本実施例に記載のｈＩＦＮポリペプチドを生成した。リミチンとＩＦＮα２ａとの間の配列比較に基づいたＩＦＮα２ａポリペプチド配列（配列番号２）への天然アミノ酸置換を実施した。「Ｍ−」は、メチオニンが前記ポリペプチドにおける最初のアミノ酸であったことを示す。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）における次の置換とともにＭ−ＩＦＮ「ＨＶ」又は「ＨＶ」変異体が発生した。すなわち、Ｄ７７−Ｄ９４は、マウスリミチン配列ＨＥＲＡＬＤＱＬＬＳＳＬＷＲＥＬＱＶと置換される。ｈＩＦＮα−２ａ（配列番号２）における次の置換とともにＭ−ＩＦＮ「ＣＤ」又は「ＣＤ」変異体が発生した。すなわち、Ｖ１０５−Ｄ１１４はＧＱＳＡＰＬＰと置換された。
ビアコア研究（受容体結合親和性）
（配列ＬＬＰＰＧＱで終了する２０６個のアミノ酸からなる）ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメインに関する配列を、クローンＭＨＳ１０１１−６１０６４（ＯｐｎｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から増幅した。このインサートをＴ７プロモーターの下流のｐＥＴ２０発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローニングした。タンパク質発現をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより導入した。
発現したタンパク質が不溶性であったため、溶解した細胞から封入体を精製し、６Ｍ ＧｎｄＣｌ中で可溶化した。５ｍＬの一定分量（５０ｍｇ量）を１０ｍＭのＤＴＴで、３７℃で４５分間還元した。次に、４℃の５０ｍＭトリス ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン、１０％グリセロールからなる再折りたたみ緩衝液２００ｍＬ中へ前記混合物を注入し、やさしく撹拌しながら一晩温置した。
次に、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セルを使用して再折りたたみ反応物を２５ｍＬに濃縮し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して一晩透析した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、単量体に再折りたたみしたＩＦＮＡＲ ＥＣＤをＨＰ Ｑセファロースで精製した。製造者によって推奨されるリジン特異的結合手法を使用して、精製されたＩＦＮＡＲ２ ＥＣＤをＣＭ５ビアコアチップ上に固定した。機能的タンパク質約２００ＲＵを固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中のＩＦＮ変異体の多様な濃度を、固定したＩＦＮＡＲ２を含有するフローセル及び固定したウシ血清アルブミンを含有する対照フローセルを通じて５０ｍｃｌ／分の流速で注入した。生成されたセンソグラムを１：１の相互作用モデルへ適合させ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄの値を算出した。メチオニル野生型インターフェロン（Ｍ−ＷＴ）は、対照試料として包含された。
表１３は、１つ又はそれ以上の天然アミノ酸置換を含むｈＩＦＮポリペプチドによって得られたｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを示す。これらの変異体は、実施例２７に記載のＮｕｓＡシステムを使用して生成され、（「Ｍ−」と表される）Ｎ末端にメチオニンを含有する。前記変異体に関する配列は、ＩＦＮα２ａとリミチンとの間に見られるアミノ酸差異に基づいて発生した。
表１４は、図１９に示される直鎖３０Ｋ ＰＥＧによってＰＥＧ化された非天然アミノ酸置換（パラ−アセチルフェニルアラニン）を含むｈＩＦＮポリペプチドによって得られたｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを示す。これらの変異体は、上述のＮｕｓＡシステムを使用して生成され、（「Ｍ−」で表される）Ｎ末端にメチオニンを含有する。
Figure 2008541769
Figure 2008541769
抗ウィルスアッセイ
ｈＩＦＮポリペプチド抗ウィルス活性を評価するため、３×１０４個のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）を９６穴／プレート中に播種し、その後、１穴あたりＶＳＶの１０，０００ＰＦＵで感染させた。感染時に、ｈＩＦＮポリペプチドの異なる量を添加した。感染４８時間後、ＣＰＥを評価し、４２ないし４８時間が、１００％ＣＰＥを得るのに必要な最短時間であった。前記細胞を１ｍｇ／ｍＬの臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）０．１ｍＬで染色した後、基準波長としての６９０ｎｍとともに５７０ｎｍで分光光度的に読み取ることによって、ＣＰＥを同定した。ＭＴＴは、ミトコンドリア中の代謝低下を測定する。
表１５は、１つ又はそれ以上の天然アミノ酸置換を含むｈＩＦＮポリペプチドによって得られるＩＣ５０値に基づいた％相対的抗ウィルス活性を示す。
Figure 2008541769
（実施例３２）
本実施例は、ｈＩＦＮ活性及びｈＩＦＮ受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性の測定を詳述する。本実施例に記載のｈＩＦＮポリペプチドは、次の方法を使用して生成した。
ＨＩＣカラムによる精製
５００ｍＬのＬＢ振盪フラスコ発現：
各ｈＩＦＮポリペプチドに関して、オルソゴナルｔＲＮＡ（米国特許公報第２００３０１０８８８５号に記載のＪ１７）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（「アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の組成物及びその使用」という表題の米国特許出願第１１／２９２，９０３号に記載のＥ９）をコード化し、変異されたｈＩＦＮポリヌクレオチドを有する構築物により形質転換されたＥ．コリをプレート上で画線し、コロニーを得た。抗生物質を含有する２ｍＬのＬＢに、新鮮に形質転換したプレートからの単一コロニーを接種した。培養物が、約０．０５ないし０．３のＯＤ６００（約５ないし６時間）に到達するまで、３７℃で定常撹拌（２５０ｒｐｍ）下で培養物を温置した。接種物を標準化して培養物を同期化し、（抗生物質及び４ｍＭのｐＡＦを含有する）５００ｍＬのＬＢに、２ｍＬ培養物の全て又は部分を接種した。培養物が、約１．０のＯＤ６００（約4ないし５時間）に到達するまで、３７℃で定常撹拌（２５０ｒｐｍ）下で培養物を温置した。次に、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、培養物を３７℃で一晩温置した。４℃、８０００ｒｐｍ／１２０００ｇで１５分間遠心分離することによって、細胞を回収した。細胞ペーストを掻き出し、４０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅチューブ中に保存した。次に、封入体調製を開始するまで、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
５００ｍＬ振盪フラスコからの封入体調製：
緩衝液１は、５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１．０％トリトンＸ−１００であった。緩衝液２は、５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡであった。表１６は、封入体調製に使用した手法を示す。
Figure 2008541769
溶解工程に関し、４℃で１時間振盪させることによって、２３ｍＬの冷緩衝液１中で細胞を再懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ３を洗浄し、１００ｍＬの水ですすいだ後、３０ｍＬの緩衝液１ですすいだ。次に、以下の様式で、４℃で冷却しながら１５，０００ないし２０，０００ｐｓｉでＡｖｅｓｔｉｎ中を２回通過させることによって、細胞を均質化した。１）試料を添加した。２）Ａｖｅｓｔｉｎ貯蔵器がほぼ空になるまで試料を一度処理し、試料を元のチューブ中に回収した（その後の工程に関して実施もした）。３）回収した試料をＡｖｅｓｔｉｎ貯蔵器へ添加し戻し、再度均質化した。４）１２ｍＬの緩衝液１を均質化することによって、試料を洗浄した。５）試料を４０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅ遠心チューブへ転移させた。６）試料を保存し、１００ｍＬの水をＡｖｅｓｔｉｎに通し、作動させながらゆっくり添加して、システムを洗い流した。７）次に、３０ｍＬの緩衝液１を貯蔵器へ添加し、均質化して、次の試料のために準備した。８）次に、前記工程を反復して、次の試料を処理した。
洗浄及びすすぎの工程に関し、最後の洗浄由来の上清を除去し、新鮮な緩衝液を注いだ後、スパチュラを使用して、ペレットをチューブから浮かせた。マイクロチップではなく通常のチップを使用して、７５％出力で超音波処理を実施した。試料間で、チップを水ですすぎ、キムワイプで拭いた。
最初の４工程の間、細胞ペレットを保存するのに使用した４０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅチューブ中で試料を回転脱水した。各試料を２個の１５ｍＬコニカルチュープへ分注することによって、すすぎ２を回転脱水した。
可溶化及び再折りたたみ：
５０ｍＭのＮａＡｃ又はトリスを使用して、ｐＨ５．５ないし８．５の間の８Ｍ ＧｎｄＨＣｌで可溶化を実施した。封入体を５ないし１０ｍｇ／ｍＬの間の終濃度に可溶化した。１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールの終濃度を添加し、試料を室温で３０ないし６０分間温置した。長期保存のため、材料を−８０℃で再折りたたみ又は保存した。
４℃再折りたたみ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３；０．５Ｍアルギニン）中の０．５ｍｇ／ｍＬの最終的な総タンパク質濃度に、可溶化した材料を希釈することによって、再折りたたみを実施した。再折りたたみ混合物を４℃で２ないし４日間保存した。
ＨＩＣ精製：
ｈＩＦＮポリペプチド再折りたたみ試料を室温に加温した。１．５Ｍ ＮａＣｌの終濃度を前記試料へ添加し、前記試料を室温で３０ないし６０分間温置した。試料を２２μＭ ＰＥＳフィルターでろ過し、ＨＩＣ緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；１．５Ｍ ＮａＣｌ；２Ｍ尿素）中で平衡化したブチル６５０Ｍカラム（Ｔｏｓｏｈ）へ負荷した。１００％ＨＩＣ緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；２Ｍ尿素）に至る直線的な勾配を２０カラム容積にわたって実施した。
ＨＩＣプールのＳＰ ＨＰ精製：
ＩＦＮポリペプチドピークを前記ブチルカラムから回収し、水で３０ｍ／Ｓ未満に希釈した。試料のｐＨをＨＣｌで３．０に調整し、ＳＰ緩衝液Ａ１（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で平衡化したＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ負荷した。試料を負荷した後、カラムをＳＰ緩衝液Ａの２カラム容積で洗浄した後、ＳＰ緩衝液Ａ２（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）の４カラム容積で洗浄した。直線的な勾配を１５カラム容積にわたって１００％ＳＰ緩衝液Ａ２から５０％ＳＰ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０；０．５Ｍ ＮａＣｌ；１０％エチレングリコール；１ｍＭ ＥＤＴＡ）まで実施した。
ＰＥＧ化及び精製：
ｈＩＦＮポリペプチド試料をＳＰ ＨＰカラムからプールし、１．０ないし２．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１０％酢酸を試料へ添加し、ｐＨを４．０にまで低下させた。オキシアミノ誘導体化した３０Ｋ ＰＥＧを、１：１２モル比（３０ｍｇ／ｍｇＩＦＮ／ｍＬ）でｈＩＦＮポリペプチドへ添加し、混合物を２８℃で４８ないし７２時間温置した。図１９は、結合に使用された３０Ｋ ＰＥＧを示す。前記試料をＳＰ緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５；１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮを精製するため、０ないし５０％ＳＰ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％エチレングリコール；１ｍＭ ＥＤＴＡ）の勾配で、ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１５カラム容積にわたって使用した。約１００ｍＭの塩で、ＰＥＧ化されたＩＦＮを溶出した後、ＰＥＧ化されていない単量体を溶出した（ベースライン分離）。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮの画分をプールし、次の保存緩衝液、すなわち２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ６、０．００５％トゥイーン、１２５ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。試料を１．０ないし２．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
ビアコア研究（受容体結合親和性）
（配列ＬＬＰＰＧＱで終了する２０６個のアミノ酸からなる）ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメインに関する配列を、クローンＭＨＳ１０１１−６１０６４（ＯｐｎｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から増幅した。このインサートをＴ７プロモーターの下流のｐＥＴ２０発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローニングした。タンパク質発現をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより導入した。
発現したタンパク質が不溶性であったため、溶解した細胞から封入体を精製し、６Ｍ ＧｎｄＣｌ中で可溶化した。５ｍＬの一定分量（５０ｍｇ量）を１０ｍＭのＤＴＴで、３７℃で４５分間還元した。次に、４℃の５０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン、１０％グリセロールからなる再折りたたみ緩衝液２００ｍＬ中へ前記混合物を注入し、やさしく撹拌しながら一晩温置した。
次に、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セルを使用して再折りたたみ反応物を２５ｍＬに濃縮し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して一晩透析した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、単量体に再折りたたみしたＩＦＮＡＲ ＥＣＤをＨＰ Ｑセファロースで精製した。製造者によって推奨されたリジン特異的結合手法を使用して、精製されたＩＦＮＡＲ２ ＥＣＤをＣＭ５ビアコアチップ上に固定した。機能的タンパク質約２００ＲＵを固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中のＩＦＮ変異体の多様な濃度を、固定したＩＦＮＡＲ２を含有するフローセル及び固定したウシ血清アルブミンを含有する対照フローセルを通じて５０ｍｃｌ／分の流速で注入した。生成されたセンソグラムを１：１の相互作用モデルへ適合させ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄの値を算出した。メチオニル野生型インターフェロン（Ｍ−ＷＴ）及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）は、対照試料として包含された。
表１７は、天然にコードされていないアミノ酸ｐＡＦを含み、図１９に示されるように天然にコードされていないアミノ酸において直鎖３０Ｋ ＰＥＧによってＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドによって得られたｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを示す。さらに、検査されたｈＩＦＮポリペプチドの幾つかは、天然アミノ酸置換を有する。例えば、Ｔ７９Ｒ／Ｎ４５ｐＡｃＦ−３０Ｋ ＰＥＧは、配列番号２の位置４５の非天然アミノ酸ｐＡＦを置換することによって生じ、位置７９にあるトレオニンアミノ酸は、天然にコード化されているアミノ酸アルギニンと置換された。
Figure 2008541769
抗ウィルスアッセイ
ｈＩＦＮポリペプチド抗ウィルス活性を評価するため、３×１０４個のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）を９６穴／プレート中に播種し、その後、１穴あたりＶＳＶの１０，０００ＰＦＵで感染させた。感染時に、ｈＩＦＮポリペプチドの異なる量を添加した。感染４８時間後、ＣＰＥを評価し、４２ないし４８時間が、１００％ＣＰＥを得るのに必要な最短時間であった。前記細胞を１ｍｇ／ｍＬの臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）０．１ｍＬで染色した後、基準波長としての６９０ｎｍとともに５７０ｎｍで分光光度的に読み取ることによって、ＣＰＥを同定した。ＭＴＴは、ミトコンドリア中の代謝低下を測定する。
表１８は、示された部位において非天然アミノ酸置換を有し、その部位でＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドによって得られたＩＣ５０値に基づいた％相対的抗ウィルス活性を示す。より低いＩＣ５０値を有するｈＩＦＮポリペプチドは、より高い％相対的活性を示す。さらに、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの幾つかは、天然にコード化されているアミノ酸置換（Ｔ７９Ｒ；Ｙ８５Ｌ；Ｅ８７Ｓ；Ｙ８５Ｓ）を有した。
Figure 2008541769
（実施例３３）
抗増殖活性の測定
先行の実施例（実施例３０ないし３２）に記載のｈＩＦＮポリペプチドも抗増殖活性に関してアッセイした。ＩＦＮαの顕著な効果は、細胞増殖を阻害するＩＦＮαの能力であり、抗腫瘍作用を決定する上で主たる重要性がある。ヒトリンパ芽球様ダウディ細胞系は、ＩＦＮαに対して特に感受性があることが証明されており、多くのＩＦＮα及び派生したハイブリッドポリペプチドにおいて抗増殖活性を測定するのに使用されてきた（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）Ａｕｇ；６７（Ｐｔ ８）：１６３３−４３）。本細胞系の使用は、懸濁培養において増殖する能力によって促進されてきた（Ｅｖｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ，（１９８１）Ｍｅｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７９：３６２−３６８）。
ヒトダウディＢ細胞系をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から購入し、熱失活された１０％化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖した。前記細胞培養を５％ＣＯ２の高湿大気下で３７℃で維持した。
ダウディ細胞を平底９６穴プレート中で１×１０４個の細胞／穴の密度で播種した。２００μＬの最終容積中の投与量濃度あたり、三つ組でＩＦＮα２Ａの濃度上昇によって細胞を処理した。３７℃、５％ＣＯ２での４日間の温置期間後、ＷＳＴ−１溶液試薬（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１６４４８０７）２０μＬを各穴へ添加し、培養物をさらに６時間温置させた。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘを使用して、吸光度を４４０ｎｍで読み出した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔによるタンパク質濃度に対するＯＤ４４０ｎｍでプロットした投与量反応曲線（三つ組の平均）から、ＩＣ５０を得た。
表１９は、ＰＥＧ化されていない及びＰＥＧ化された異なるｈＩＦＮ分子によって得られた結果を示す。「Ｃｕ」は、実施例３０に記載の銅カラムを使用して生成されるポリペプチドを示す。「ＨＩＣ」は、実施例３２に記載のＨＩＣ方法を使用して生成されるポリペプチドを示す。
Figure 2008541769
（実施例３４）
コロニー形成アッセイ
Ｇｉｒｏｎ−Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２ １６：１１３５−１１４２に記載のものなどのコロニー形成アッセイを使用して、本発明のｈＩＦＮによる前駆細胞の増殖を評価し得る。臍帯血が、コロニー形成アッセイにおいて使用され得る。
ヒト骨髄性及び赤血球系前駆細胞に及ぼすｈＩＦＮポリペプチドの毒性の評価
メチルセルロースベースのインビトロコロニー形成アッセイを使用して、２１個のＰＥＧ化されていない化合物（２０個のｈＩＦＮポリペプチド及び対照としてのＲｏｆｅｒｏｎ（登録商標））及び１８個のＰＥＧ化された化合物（３０Ｋ ＰＥＧでＰＥＧ化された１７個のポリペプチド及び対照としてのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））の造血性毒性を検査した。実施例２７に示されるＮｕｓＡ方法によって、ＰＥＧ化されていないｈＩＦＮポリペプチドを生成し、実施例３１に示されるように特徴付けした。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドを生成し、実施例３０及び３１に示されるように特徴づけした。
細胞：正常ヒト骨髄低密度細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｍａｒｙｌａｎｄ）をアッセイに必要なときまで−１５２℃で保存した。実験当日、細胞を３７℃で急速に解凍し、２％ウシ胎仔血清を含有するイスコブ培地１０ｍＬ中にバイアルの内容物を希釈し、遠心分離によって洗浄した。上清を除去し、２％ＦＢＳを含有するイスコブ培地の公知の容積中に細胞ペレットを再懸濁した。トリパンブルー排除による細胞計数（３％氷酢酸）及び生存率の評価を実施した。
検査試料：化合物は、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１２５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ｐＨ６．０の緩衝液中にあった。一連の５倍希釈の１０個の検査濃度で各化合物を検査した。三重測定を各投与量濃度で実施した。各化合物の希釈を同一緩衝液で調製し、必要な希釈を生じた。メチルセルロースへ添加するとき、緩衝液は６．７％の終濃度にあり、化合物濃度は、ＰＥＧ化されていないｈＩＦＮ検査ポリペプチドに関して５ないし０．０００００２５６μｇ／ｍＬ、３０ＫＰＥＧ化されたｈＩＦＮ検査ポリペプチドに関して２６ないし０．００００１３３μｇ／ｍＬの範囲であった。初期の３０ＫＰＥＧ化されたｈＩＦＮ検査ポリペプチド濃度が低い場合、１４ないし０．０００００７１６８μｇ／ｍＬの濃度範囲を代替的に採用した。
方法：サイトカインＳＣＦ（幹細胞因子；５０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（インターロイキン３；１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＥＰＯ（エリスロポエチン；３Ｕ／ｍＬ）の飽和濃度を含有するメチルセルロースベースの培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）４４３４）中で、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ及びＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球−単球（ＣＦＵ−ＧＭ）及び多分化能（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の系譜のクローン原性前駆細胞を評価した。ＣＦＵ−Ｅは、最も成熟した赤血球コロニー形成細胞由来の小さな赤血球コロニーである。ＣＦＵ−Ｅは、総数８ないし２００個の赤芽球を有する１ないし２個のクラスターを含有する。ＢＦＵ−Ｅは、より原始的な細胞由来の大きな赤血球コロニーである。ＢＦＵ−Ｅは、２００超の赤芽球を含有する。ＣＦＵ−ＧＭは、４０個以上の顆粒球−単球及び／又はマクロファージ細胞を有するコロニーを精製できるコロニー形成細胞由来のコロニーである。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、２つ以上の系譜由来の細胞を含有するコロニーである。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、最も原始的なコロニー形成細胞由来であり、赤血球細胞を、２０個以上の顆粒球、マクロファージ、及び巨核球と同様に含有する。各アッセイセットアップにおいて、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）４４３４、細胞及び培地を含有する標準的な対照、及びＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）４４３４、細胞、緩衝液の等価の量を含有するが、化合物を含有しない緩衝液対照は、毒性が観察されるべきではない条件を確立するために包含された。
赤血球（ＣＦＵ−Ｅ及びＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球−単球／骨髄性（ＣＦＵ−ＧＭ）及び多分化能（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の系譜のクローン原性前駆細胞を、記載のメチルセルロースベースの培地中に調整した。前記化合物をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）へ添加し、上述の終濃度を付与した。化合物を含有しないが、媒体緩衝液の等価の濃度を含有する媒体対照培養物、及び化合物又は媒体緩衝液を含有しないが培地単独を含有する標準対照も開始した。全ての培養物を１個の培養物あたり１×１０４個の細胞で三つ組で調整した。培養の１４日後、コロニーを評価し、スコア化した。大きさ及び形態に基づいて、コロニーを次のカテゴリーすなわち、ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、及びＣＦＵ−ＧＥＭＭへ分割した。
結果及び分析：ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、及びＣＦＵ−ＧＥＭＭに関する三つ組の培養物を列挙した。さらに、コロニーの種類の分布並びに一般的なコロニー及び細胞の形態を分析した。全ての検査セットにおいて、緩衝液対照と比較して標準培養物において生じたコロニーの数の間の差異は観察されなかった。しかしながら、ＰＥＧ化されていない又はＰＥＧ化された各ｈＩＦＮポリペプチドの存在下で、骨髄性及び赤血球の両系譜のコロニー数及びコロニーの大きさは、標準アッセイ対照及び緩衝液アッセイ対照と比較したとき変化した。しかしながら、得られた赤血球コロニー及び骨髄性コロニーの形態は影響なかった。骨髄性及び赤血球の両前駆細胞に及ぼす投与量依存的毒性効果は、化合物対照Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）及びＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を含む、検査された全てのＰＥＧ化されていない及びＰＥＧ化されたｈＩＦＮに関して観察された。
検査化合物のさらにある分析を実施して、化合物間で観察される抗ウィルス活性の差異に関して標準化した。ＶＳＶ複製アッセイにおいて測定される抗ウィルスＩＣ５０値によって、コロニー形成アッセイにおいて使用されるｈＩＦＮポリペプチドの集団濃度を分割した。次に、対数のｘ軸上の標準化されたタンパク質濃度に対して、骨髄性コロニー及び赤血球コロニーの計数をＹ軸上にプロットした。２つの曲線間で因子ｒｈｏがｘ軸においてシフトを表すｒｈｏによって、適切な化合物対照と比較した各検査ポリペプチドの相対的毒性を測定した。ｒｈｏが１を超えるとき、検査化合物はより有力であり、それゆえ対照よりも毒性がある。ｒｈｏが１を超えるとき、倍の好転は、ｒｈｏの値を有する負の数（−ｒｈｏ）として表された（表２２及び２３参照）。ｒｈｏが１未満のとき、検査化合物は、化合物対照よりも毒性が低い。ｒｈｏが１未満のとき、倍の好転は、１／ｒｈｏの値を有する正の数（１／ｒｈｏ）として表された（表２０及び２１参照）。ＰＥＧ化されていないｈＩＦＮポリペプチドに関し、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）を、化合物対照として使用した。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドに関し、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を、化合物対照として使用した。
Figure 2008541769
Figure 2008541769
（実施例３４）
ｈＩＦＮポリペプチドの比較
ＶＳＶアッセイに関して、より活性のある分子は、ＩＣ５０値がより低い。検査化合物のＶＳＶ ＩＣ５０が、Ｍ−ＷＴ（Ｎ末端にメチオニンを有する野生型インターフェロン）のＶＳＶ ＩＣ５０よりも低い場合、倍の好転は、ＶＳＶ ＩＣ５０ Ｍ−ＷＴ／ＶＳＶ ＩＣ５０検査化合物として表された。検査化合物のＶＳＶ ＩＣ５０が、Ｍ−ＷＴのＶＳＶ ＩＣ５０よりも大きな場合、倍の好転は、−（ＶＳＶ ＩＣ５０検査化合物／ＶＳＶ ＩＣ５０ Ｍ−ＷＴ）として表された。表２２は、実施例３３にも記載のｈＩＦＮポリペプチドの１セットに関する倍の好転のデータを示す。
Figure 2008541769
ＶＳＶアッセイに関して、より活性のある分子は、ＩＣ５０値がより低い。検査化合物のＶＳＶ ＩＣ５０が、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）のＶＳＶ ＩＣ５０よりも小さな場合、倍の好転は、ＶＳＶ ＩＣ５０ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）／ＶＳＶ ＩＣ５０検査化合物として表された。検査化合物のＶＳＶ ＩＣ５０が、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）のＶＳＶ ＩＣ５０よりも大きな場合、倍の好転は、−（ＶＳＶ ＩＣ５０検査化合物／ＶＳＶ ＩＣ５０ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））として表された。表２３は、実施例３３にも記載のＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの１セットに関する倍の好転のデータを示す。
Figure 2008541769
表２４は、好転した毒性を有する候補のリスト及び抗ウィルス活性におけるそれらの関連した倍の好転を示す。
Figure 2008541769
（実施例３５）
天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮの安全性及び／又は有効性に関するヒト臨床試験
第０相の研究を実施し、本発明のｈＩＦＮポリペプチドの微量投与を研究する。本研究は、少数の対象者を包含する。これらの研究は、治療投与量の画分の投与による分子マーカーの変化を測定することを包含する。薬物が罹患した個体へ投与されるとき、これらの同一マーカーは治療反応と相関する。得られた薬物−反応情報は、第Ｉ相及び第ＩＩ相の試験計画に有用である。
目的
天然にコードされていないアミノ酸を含む皮下的に投与されたＰＥＧ化された組換えヒトｈＩＦＮの安全性及び薬物動態を、市販のｈＩＦＮ製剤ＲｏｆｅｒｏｎＡ（登録商標）又はＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標）と比較すること。
患者
年齢２０ないし４０歳、体重６０ないし９０ｋｇの範囲の１８名の健常なボランティアを本研究に登録する。対象者は、血液学又は血清化学に関する臨床的に有意な異常な研究値、及び負の尿中毒素学スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、及びＢ型肝炎表面抗原を有さない。対象者は、次の全ての証拠を有すべきではない。すなわち、全ての原発性血液学的疾患歴；有意な肝臓、腎臓、心臓血管系、胃腸系、生殖器系、代謝系、神経学的疾患歴；細菌又は哺乳類由来の生成物、ＰＥＧ、又はヒト血清アルブミンに対する公知の感受性；カフェイン含有飲料に対する習慣的及び大量消費者；研究エントリーの３０日以内にその他の治験に参加又は輸血若しくは献血；研究エントリーの３ヶ月以内にｈＩＦＮへ暴露；研究エントリーの７日間以内に罹患；研究前身体検査での有意な異常又は研究エントリーの１４日以内に臨床的研究評価であった。全ての対象者は、安全性に関して評価でき、薬物動態分析のための全ての血液回収は、計画されたとおり回収される。全ての研究は、機関倫理委員会の承認及び患者の同意をもって実施される。
研究計画
これは、健常な男性ボランティアにおける第１相、単一中心、非盲検、無作為化、２期クロスオーバー研究である。１８名の対象者を２つの治療シーケンス群のうちの１つへ無作為に割り当てる（９名の対象者／群）。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈIFN及び選択された市販の製剤の等価の投与量を使用して、大腿上部に迅速皮下投与として２つの別個の投与期間にわたってＩＦＮを投与する。市販の製剤の投与の量及び頻度は、包装ラベルに指示されているとおりである。対象者の付加的な群を包含することによって、市販の製剤を使用してのさらなる投与、投与頻度、又は望まれる他のパラメータを本研究に付加し得る。１４日間の休薬期間によって、各投与期間を分離する。２つの各投与期間の投与の少なくとも１２時間前ないし７２時間後、対象者を研究センターに拘束するが、投与期間と投与期間との間は拘束しない。ＰＥＧ化されたｈＩＦＮに関して同様に検査されるべき付加的な投与、頻度、又は他のパラメータがあるべきである場合、対象者の付加的な群を付加し得る。ヒトの使用に認可されるＩＦＮの複数の製剤を本研究で使用し得る。ＲｏｆｅｒｏｎＡ（登録商標）及び／又はＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標）は、ヒトの使用に認可された市販のＩＦＮ製剤である。ｈＩＦＮの実験的製剤は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮである。
血液サンプリング
ｈＩＦＮの投与前後に直接的な静脈穿刺によって連続血を採血する。投与約３０分前、２０分前、及び１０分前（３ベースライン試料）及び投与約３０分後及び１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後に、血清ＩＦＮ濃度の測定のための静脈血試料（５ｍＬ）を得る。各血清試料を２つの一定分量に分割する。全ての血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で輸送する。第１日の初期投与直前、第４日の午前、第１６日の投与直前、及び第１９日の午前に、空腹時臨床実験検査（血液学、血清化学、及び検尿）を実施する。
生体分析方法
血清ＩＦＮ濃度の測定のために、ＥＬＩＳＡキット手法（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））を使用する。
安全性測定
各投与の直前（第１日及び第１６日）、及び各投与の６、２４、４８、及び７２時間後に、バイタルサインを記録する。安全性の測定は、有害事象の発生率及び種類並びにベースラインからの臨床的実験検査の変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定における研究前からの変化、及び身体検査結果を評価する。
データ分析
投与３０、２０、及び１０分前に回収される３つの試料からＩＦＮレベルを平均することから決定される平均ベースラインＩＦＮ濃度を、各投与後値から減算することによって、投与前のベースラインＩＦＮ濃度に関して、投与後の血清濃度値を補正する。本アッセイの定量レベルを下回る場合、平均値の算出に投与前血清ＩＦＮ濃度は含まれない。ベースラインＩＦＮ濃度に関して補正された血清濃度データから、薬物動態パラメータを測定する。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を使用するＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステムのモデル独立型方法によって、薬物動態パラメータを算出する。次の薬物動態パラメータ、すなわちピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度に至る時間（ｔｍａｘ）；直線的台形則の使用により算出される、時刻０から最後の採血時刻までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積（ＡＵＣ０−７２）；及び一定の排出速度から算出される最終排出半減期（ｔ１／２）を測定する。対数−直線濃度−時間プロットの最終直線領域における継続したデータ地点の線形回帰によって、一定の排出速度を概算する。薬物動態パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）を、各処理に関して算出する。パラメータ平均の比（保存された製剤／保存されていない製剤）を算出する。
安全性の結果
有害事象の発生率を処理群間で等価に分配する。ベースラインからの又は研究前臨床実験検査又は血圧の有意な変化、並びに身体検査結果及びバイタルサイン測定における研究前からの顕著な変化はない。２つの処理群に関する安全性特性は、同様に現れるべきである。
薬物動態結果
測定された各時点において、市販のｈＩＦＮ（例、ＲｏｆｅｒｏｎＡ（登録商標）又はＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標））の単回投与を受容した後の１８名全ての対象者における（ベースラインＩＦＮレベルに関して補正されていない）平均血清ＩＦＮ濃度−時間特性を、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮと比較する。全ての対象者は、生理学的範囲内の投与前ベースラインＩＦＮ濃度を有するべきである。投与前平均ベースラインＩＦＮ濃度に関して補正された血清データから薬物動態パラメータを決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。ｈＩＦＮ（例、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標））に関する平均ｔｍａｘは、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮに関するｔｍａｘよりも有意に短い。ｈＩＦＮ（例、ＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標））に関する最終半減期値は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮに関する最終半減期と比較して有意に短い。
本研究は、健常な男性対象者において実施されるが、同様の吸収特性及び安全性特性は、癌又は慢性腎不全を有する男性又は女性の患者、小児腎不全患者、自己血術前貯血式プログラムにある患者、又は待機的手術を計画された患者などの他の受診者集団において期待される。あるいは、第Ｉ相研究をＨＣＶ対象者において実施し、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドを評価する。
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮの皮下的に投与される単回投与は、安全であり、健常な男性対象者又はＨＣＶ対象者によって十分に許容される。有害事象の比較発生率、臨床的な実験値、バイタルサイン、及び身体検査結果に基づいて、ｈＩＦＮ（例、ＲｏｆｅｒｏｎＡ（登録商標））及び天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮの安全性特性は等価である。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮは、多大なる臨床的有用性を受診者及び医療提供者に可能性を秘めて提供する。
（実施例３６）
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを生成するのに使用される方法を詳述する。上述の方法に従って、精製済みの再折りたたみされたｈＩＦＮポリペプチドをポリ（エチレングリコール）へ結合させた。上述の方法に対する改変及びｈＩＦＮポリペプチドなどのポリペプチドを再折りたたみする代替的な方法は、当業者に公知である。記載される方法に対する改変には、後述の１つ又はそれ以上の工程の付加、置換、又は減法が含まれるが、これらに限定されない。使用され得る可能性のある方法又は記載の方法への１つ又はそれ以上の改変には、尿素及びデオキシコール酸を含むがこれらに限定されない試薬をｈＩＦＮポリペプチドと潜在的に相互作用させる夾雑タンパク質の量を低下させる試薬で封入体を洗浄すること、変性剤、グアニジンＨＣｌ、尿素、市ステイン、及び還元剤の触媒量を含むがこれらには限定されない試薬を再折りたたみ反応物へ添加することが含まれるが、これらに限定されない。記載のもの以外のカラムを使用して、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを単離又は精製し得る。このようなカラムには、ブチル、オクチル、又はフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムなどのＨＩＣカラムが含まれるが、これらに限定されない。硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、及び他の塩などの代替的な塩の使用；精製／単離において使用されるカラムに対する結合を容易にさせるための塩濃度の調整を含むがこれらに限定されるわけではない緩衝液成分の調整；１つ又はそれ以上の試薬の置換；及びアルギニンを含むがこれらに限定されない１つ又はそれ以上の試薬の包含、を含むがこれらに限定されない代替的な条件及び溶液をｈＩＦＮポリペプチドの単離又は精製に使用し得る。
代替的な方法には、グアニジンによる細胞ペレットの可溶化及び当業者に公知の他の方法が含まれるが、これらに限定されない。細菌の異なる系も、ｈＩＦＮポリペプチドの発現に使用し得る。
ＩＦＮ封入体の精製
各ｈＩＦＮポリペプチドに関して、オルソゴナルｔＲＮＡ（米国特許公報第２００３０１０８８８５号に記載のＪ１７）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（「アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の組成物及びその使用」という表題の米国特許出願第１１／２９２，９０３号に記載のＥ９）をコード化し、変異されたｈＩＦＮポリヌクレオチドを有する構築物によりＥ．コリ系ＢＬ２１（Ａ１）、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＷ３１１０（Ｂ２）を形質転換した。アンピシリンプレートを有するＬＢアガー上に前記細菌を播種し、３７℃で一晩温置した。コロニーを選択し、培養増殖し、グリセロールストックを作製した。
午前中、グリセロールストックの５μＬ一定分量を使用して、５ｍＬのスターター培養物を調製した。午前中、パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）を含有するＬＢ培地へスターター培養物を添加し（１×ＬＢ；４ｍＭ ｐＡＦ；１×ＡＭＰ）、夕方又は培養物が１．０を超えるＯＤを有したとき、前記細胞を誘導した。培養物を２５０ｒｐｍで一晩振盪しながら３７℃で増殖／誘導した。
翌朝、培養物のＯＤを測定し、細胞をペレットにした。培養物のＯＤ測定結果は、約３と約８との間であった。細胞ペレットを−８０℃で凍結させたか又は封入体をペレットから即時調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにクーマシー染色を使用することによって、一定分量を分析し、生成された生成物の発現及び長さをチェックした。ＩＢ１緩衝液（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ６．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１％トリトンＸ）３５ｍＬ中で、細菌ペレットを再懸濁した。次に、試料を６回超音波処理し、細胞を再懸濁及び溶解した。超音波処理３０秒突発の後、氷上で１分間温置した。細菌溶解物を５０ｍＬのＯａｋｒｉｄｇｅチューブ中で、４℃、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した。超音波を使用して再懸濁して、ペレットをＩＢ１緩衝液で４回洗浄した。封入体を遠心で沈降させ、上清を廃棄した。ペレットをＩＢ２緩衝液（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ６．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、上清を廃棄した。ペレットを８ＭグアニジンＨＣｌ（８Ｍ ＧｎＨＣｌ；５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０）５ないし１５ｍＬ中で再懸濁し、加圧型細胞破砕装置を使用して再懸濁した。１００倍希釈を使用して、試料の濃度を測定し、ＯＤを２８０ｎｍで測定した。ＩＦＮ消衰係数は、２２８００又は１．１７である。試料濃度を５．０ｍｇ／ｍＬタンパク質に標準化した。封入体の純度をクーマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにより測定した。パラ−アセチルフェニルアラニン置換を有する２７個のｈＩＦＮポリペプチドを抑制し、２７個の変異体に関する封入体を単離した。生成された２７個の各変異体は、パラ−アセチルフェニルアラニンがｈＩＦＮ（配列番号２）において天然にコード化されているアミノ酸を置換する１つの天然にコードされていないアミノ酸置換を有した。生成された２７個のｈＩＦＮポリペプチドは、次の位置、すなわち２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、及び１６５のうちの１つで置換を有した。
精製された封入体を使用するｈＩＦＮの再折りたたみ
５．０ｍｇ／ｍＬのｈＩＦＮ１００ｍｇを４００ｍＬの再折りたたみ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；０．１％トゥイーン２０）へ添加し、その間４℃でゆっくり回転脱水した。再折りたたみを２４ないし４８時間実施した。次に、再折りたたみ混合物を室温にした。次に、５０μＭのＣｕＣｌを添加し、試料を混合した。試料を室温で１５分間温置した。
タンパク質の精製及びＰＥＧ化
再折りたたみ中に形成される全ての沈殿物を回転脱水で落とすか又はろ過し、銅キレートカラムを使用して、正確に折りたたまれたｈＩＦＮポリペプチドを精製した。銅カラム緩衝液Ａは、５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０；０．１５Ｍ ＮａＣｌ；０．１％トゥイーン２０であった。銅カラム緩衝液Ｂは、１００ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．５；０．１５Ｍ ＮａＣｌ；０．１％トゥイーン２０であった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにクーマシー染色を使用することによって、この点での一定分量をチェックした。銅カラムからプールした画分を５ｍＬのＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムへ負荷した。５ｍＬのＳＰ ＨＰ緩衝液Ａは、５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；１ｍＭ ＥＤＴＡであった。５ｍＬのＳＰ ＨＰ緩衝液Ｂは、５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ６．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ；５００ｍＭ ＮａＣｌ；１０％エチレングリコールであった。２８０ｎｍでのＯＤを測定することによって、タンパク質全体の量をこの点で測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにクーマシー染色を使用することも実施した。
前記銅キレートカラムからの画分をプールし、１．０ｍｇ／ｍＬ超に濃縮し、１０％酢酸を各試料へ添加して、ｐＨを４．０にした。図１９に示される直鎖３０Ｋ ＰＥＧを１２：１のモル比で添加した。試料を２８℃で２４ないし４８時間温置した。次に、試料をＭｉｌｉ−Ｑ水で１０倍希釈し、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドを５ｍＬ ＳＰ ＨＰカラムで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをクーマシー染色とともに実施し、試料を分析し、より高い分子量の種及びＰＥＧ化されていない夾雑物質のレベルを測定した。ＳＰカラムからの画分を回収した後、プールを保存緩衝液（２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ６．０；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；０．００５％トゥイーン８０）に対して透析した。次に、最終生成物の一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。最終生成物を１８０μｇ／ｍＬに濃縮し、一定分量を−８０℃で保存した。
（実施例３７）
ＶＳＶ抗ウィルスアッセイ
ｈＩＦＮポリペプチドの抗ウィルス活性は、多様なアッセイによって測定され得る。
水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）を使用して、ＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチドの抗ウィルス活性を測定した。本アッセイのための培地は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５ｍＬ ＨＥＰＥＳであった。付加的な試薬は、ＦＢＳを含有しないＲＰＭＩ及びフェノールレッドを包含した。使用されるＭＴＴストックの濃度は、ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍＬであった。このストック溶液を４℃で２週間だけ保存した。
ヒトＷＩＳＨ細胞を培地５０μＬ中に３０，０００個／穴で播種した。翌日、培地中のｈＩＦＮポリペプチドの２倍の連続希釈を実施した。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）をこれらの実験における対照として使用した。三つ組において、１５０μＬの最終穴容積のために、希釈したｈＩＦＮポリペプチド１００μＬをＷＩＳＨ細胞へ添加した。ＣＯ２インキュベーター中で、前記細胞及びｈＩＦＮポリペプチドを３７℃で６時間温置した。この６時間の温置の後、ＶＳＶの１０，０００ＰＦＵを穴あたり培地５０μＬの容積で添加し、ＶＳＶ２０μＬを９６穴／プレートあたり培地５ｍＬで希釈した。感染４５時間後、培地を吸引により除去した。プレートをペーパータオル上でやさしくたたき、残留培地を除去した。
フェノールレッドを含有しないＲＰＭＩ中で調製された１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム）５０μＬを５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴストック溶液から添加した。１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを通常、アッセイごとに新たに調製した。次に、プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７℃で３時間温置した。ＭＴＴを吸引により注意深く除去した。イソプロパノール５０μＬを穴あたりで添加した。プレートをプレート振盪器上に３０ないし４０秒間配置し、ＭＴＴの形成を完了させた。基準波長としての６９０ｎｍとともに５６０ｎｍで前記プレートを読み取った。データをプロットし、Ｓｉｇｍａ−Ｐｌｏｔプログラムを使用して、ＩＣ５０を算出した。
表２５は、ポリペプチド中のパラ−アセチルフェイルアラニン置換を介して３０Ｋ ＰＥＧへ結合された２０個のｈＩＦＮポリペプチドの抗ウィルス活性を要約する。第２列は、複数の抗ウィルス活性実験にわたる各化合物に関して平均したＩＣ５０を列挙する。第３列は、第２列において見られる平均したＩＣ５０値に対する％有効性である。
第４列は、平均％有効性である。本データに関し、個々の実験におけるＩＣ５０をＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）のＩＣ５０と比較することによって、％有効性を確立した。次に、全実験からの％有効性を平均した。
Figure 2008541769
Figure 2008541769
（実施例３８）
本実施例は、ｈＩＦＮ活性及びｈＩＦＮ受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性の測定を詳述する。
ビアコア研究（受容体結合親和性）
（配列ＬＬＰＰＧＱで終了する２０６個のアミノ酸からなる）ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメインに関する配列を、クローンＭＨＳ１０１１−６１０６４（ＯｐｎｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から増幅した。このインサートをＴ７プロモーターの下流のｐＥＴ２０発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローニングした。タンパク質発現をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより導入した。
発現されたタンパク質が不溶性であったため、溶解した細胞から封入体を精製し、６Ｍ ＧｎｄＣｌ中で可溶化した。５ｍＬの一定分量（５０ｍｇ量）を１０ｍＭのＤＴＴで、３７℃で４５分間還元した。次に、４℃の５０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン、１０％グリセロールからなる再折りたたみ緩衝液２００ｍＬ中へ前記混合物を注入し、やさしく撹拌しながら一晩温置した。
次に、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セルを使用して再折りたたみ反応物を２５ｍＬに濃縮し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して一晩透析した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、単量体に再折りたたみしたＩＦＮＡＲ ＥＣＤをＨＰ Ｑセファロースで精製した。製造者によって推奨されるリジン特異的結合手法を使用して、精製されたＩＦＮＡＲ２ ＥＣＤをＣＭ５ビアコアチップ上に固定した。機能的タンパク質約２００ＲＵを固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中のＩＦＮ変異体の多様な濃度を、固定したＩＦＮＡＲ２を含有するフローセル及び固定したウシ血清アルブミンを含有する対照フローセルを通じて５０ｍｃｌ／分の流速で注入した。生成されたセンソグラムを１：１の相互作用モデルへ適合させ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄの値を算出した。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を対照試料として包含した。表２６は、実施例３７において特徴付けられたｈＩＦＮポリペプチドによって得られる平均ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを示す。
Figure 2008541769
（実施例３９）
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、多くの異なるアッセイによって評価され得る。可能性のあるアッセイには、ｍＲＮＡ遺伝子発現鑑定、ＣＦＵ−ＧＭアッセイ及びＣＦＵ−ＭＫアッセイを含むがこれらに限定されないＣＦＵアッセイ、ＣｒｋＬ／ＳＴＡＴリン酸化を測定するアッセイ、ＭＨＣクラスＩ発現アッセイ、及びｍＲＮＡ鑑定、並びにラットにおける薬物動態研究、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構成モデルを使用する研究、及びサルにおける薬物動態学／薬力学などの動物研究が含まれるが、これらに限定されるわけではない。Ｇｉｒｏｎ−Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２ １６：１１３５−１１４２に記載のもの又は本明細書に記載のものなどのコロニー形成アッセイを使用して、本発明のｈＩＦＮによる前駆細胞の増殖を評価し得る。骨髄又は臍帯血は、コロニー形成アッセイにおいて使用され得る。
本発明の改変されたｈＩＦＮポリペプチドの生物活性を評価するため、ヒト線癌ＨｅＬａ細胞系を使用して、シグナル伝達因子及び転写ファミリーメンバーの活性化因子であるＳＴＡＴ３のリン酸化を測定するアッセイを実施する。ヒト細胞系ＨｅＬａをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、ＤＭＥＭ+熱失活された１０％ウシ胎仔血清中でルーチンに経代培養する。前記細胞を５％ＣＯ２の高湿大気下で３７℃で維持する。ウシ胎仔血清を有さないアッセイ培地中でＨｅＬａ細胞を一晩飢餓状態にした後、ｈＩＦＮポリペプチドの濃度上昇により３７℃で１０分間刺激する。ＳＴＡＴ３のリン酸化をＰａｔｈＳｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により測定し得る。このキットを使用して、本アッセイは、９６穴プレートにおいて実施され、分光光度的なプレートリーダーによって測定可能な比色分析的読み出しをする。
本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構成モデルを使用して評価され得る。サルにおけるＰＫ／ＰＤ研究を上述のとおり実施し得る。カニクイザルも、インビボでの活性及び骨髄毒性を研究するのに使用される。本発明のｈＩＦＮポリペプチドによる２’，５’−ＯＡＳを含むがこれに限定されない下流マーカーの誘導を測定することによって、活性をアッセイする。好中球、赤血球、及び血小板を含むがこれらに限定されない循環している血液細胞を、ｈＩＦＮポリペプチドの投与後の骨髄毒性研究において評価する。本発明のｈＩＦＮポリペプチドへ暴露した動物から骨髄を回収し評価する。例えば、処理された動物由来（例、霊長類由来）の骨髄吸引物及び／又は中心生検を組織学的に検討し、骨髄性細胞と有核赤血球との比（Ｍ：Ｅ比）を概算する。好中球減少に伴う低いＭ：Ｅ比は、好中球産生の低下による顆粒球形成不全を示し得る。処理された動物から単離された骨髄細胞を、造血前駆体に関してアッセイする。すなわち、細胞単離物をＣＦＵ−ＧＭ又はＢＦＵ−Ｅコロニーアッセイに供する。結果（すなわち、造血前駆細胞数）は、もしあれば、骨髄性細胞及び／又は赤血球前駆細胞における治療の効果を示す。このような骨髄毒性研究は、皮下的及び静脈内を含むがこれらに限定されない異なる経路を介して投与されるｈＩＦＮポリペプチドを包含し得る。静脈内投与は、皮下投与よりも骨髄毒性のより長期の投与計画及びより良好な評価を可能とし得る。このような改善は、投与される化合物に対する免疫原性又は抗体反応の調節に起因し得る。毒性研究には、血漿又は血清ｍＬあたりの好中球数及び血小板数の評価が含まれる。
タンパク質脱アミド化、凝集、酸化、アセチル化、及び他の安定性表示アッセイを含むがそれらに限定されない予備的な製剤研究を支持するアッセイが実施され得る。ジスルフィド再編成及びタンパク質分解生成物を含むがそれらに限定されない他のアッセイが使用され得る。
本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示を目的とするものに過ぎず、その態様の多様な改変又は変化が当業者に示唆され、本出願の精神及び範囲及び上述の請求項の範囲内に包含されるべきであることが理解される。本明細書に引用された全ての公報、特許、及び特許出願は、本明細書により、全ての目的のため、これらの全体において参照により本明細書に組み入れられる。
Figure 2008541769
４ヘリックスバンドルタンパク質インターフェロンアルファ−２（ＩＦＮα−２）の一般的な構造の図が示されている。 ｐＳＴＡＴ１アッセイから得られた結果の図が示されている。 ｐＳＴＡＴ１アッセイの特異性を示す図が示されている。 ｐＳＴＡＴ１アッセイに対するエンドトキシンの効果の図が示されている。 抗増殖アッセイから得られた結果の図が示されている。 抗増殖アッセイに対するエンドトキシンの効果の図が示されている。 ＨＬＡ発現の誘導を測定するアッセイから得られた結果の図が示されている。 Ｕ２６６細胞中でのＴｙｋ２リン酸化の図が示されている。 ９つのＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）で得られたＣＰＥ結果の図が示されている。 ＣＦＵ−ＧＭコロニー数対国際単位のグラフが、ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）及び４つのｈＩＦＮポリペプチドについて示されている。 ＩＦＮＲ２に対する抗ウイルスＩＣ５０及びＫＤの分析が示されている。 造血毒性アッセイから得られた結果が示されている。 造血毒性アッセイから得られた結果が示されている。 造血毒性アッセイから得られた結果が示されている。 造血毒性アッセイから得られた結果が示されている。 造血毒性アッセイから得られた結果が示されている。 造血毒性アッセイから得られた結果が示されている。 ５つのＰＥＧ化されたｈＩＦＮポリペプチド及びＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒ）で得られたＣＰＥ結果の図が示されている。 直鎖直鎖３０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミノオキシエチルアミンカルバマート塩酸塩の構造の図が示されている。 ｍＰＥＧ（４０Ｋ）ｐ−ニトロフェノールカルボナートからのアミノエトキシアミン塩酸塩の合成の図が示されている。

Claims (103)

  1. 少なくとも１つの調節された生物活性を有する、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド。
  2. ｈＩＦＮポリペプチドが１つ又はそれ以上の翻訳後修飾を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  3. ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  4. ポリペプチドが水溶性ポリマーに連結されている、請求項３に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  5. ポリペプチドがリンカー、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも１つの追加のｈＩＦＮポリペプチドに連結されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  6. 二官能性リンカー又はポリマーが第二のポリペプチドに連結されている、請求項５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  7. 第二のポリペプチドがｈＩＦＮポリペプチドである、請求項６に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  8. 水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  9. 水溶性ポリマーが、前記ｈＩＦＮポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸に連結されている、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  10. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基１から９、１０から２１、２２から３９、４０から７５、７６から７７、７８から１００、１０１から１１０、１１１から１３２、１３３から１３６、１３７から１５５、１５６から１６５からなる群から選択される位置において置換されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  11. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシル末端）及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  12. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１４４及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  13. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基４１、４５、４６、４８、４９及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  14. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  15. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  16. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  17. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６（すなわち、カルボキシル末端）及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  18. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２並びにこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項１７に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  19. ｈＩＦＮポリペプチドが、ｈＩＦＮ受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性を調節する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  20. ｈＩＦＮポリペプチドが、ｈＩＦＮポリペプチドの安定性又は溶解度を増加させる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  21. ｈＩＦＮポリペプチドが、組換え宿主細胞中でのｈＩＦＮポリペプチドの発現を増加させる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  22. ｈＩＦＮポリペプチドが、ｈＩＦＮポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増加させる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  23. 天然にコードされていないアミノ酸が、該アミノ酸がなければポリペプチド中の２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性を示す、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  24. 天然にコードされていないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  25. 天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  26. 天然にコードされていないアミノ酸が、構造：
    Figure 2008541769
     （ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
    を有する、請求項２５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  27. 天然にコードされていないアミノ酸がアミノオキシ基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  28. 天然にコードされていないアミノ酸がヒドラジド基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  29. 天然にコードされていないアミノ酸がヒドラジン基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  30. 天然にコードされていないアミノ酸残基がセミカルバジド基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  31. 天然にコードされていないアミノ酸残基がアジド基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  32. 天然にコードされていないアミノ酸が、構造：
    Figure 2008541769
     （ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキルもしくは置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
    を有する、請求項３１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  33. 天然にコードされていないアミノ酸がアルキン基を含む、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  34. 天然にコードされていないアミノ酸が、構造：
    Figure 2008541769
     （ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及びＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
    を有する、請求項３３に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  35. 水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  36. 水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａと約５０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  37. カルボニル含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  38. アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基が、アミド結合を通じて、水溶性ポリマーに連結されている、請求項３７に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  39. カルボニル基を含む水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  40. アルキン含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、アジド部分を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  41. アジド含有アミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを、アルキン部分を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  42. アジド又はアルキン基が、アミド結合を通じて、水溶性ポリマーに連結されている、請求項２４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  43. 水溶性ポリマーが分岐したポリマー又はマルチアーム化されたポリマーである、請求項４に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  44. 分岐したポリマーの各分岐が約１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項４３に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  45. ポリペプチドがｈＩＦＮアンタゴニストである、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  46. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項４５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  47. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２から得られる残基２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７及びこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項４５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  48. ポリペプチドが、１つ又はそれ以上の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含む、請求項４５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  49. ポリマーが水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項４８に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  50. 天然にコードされていないアミノ酸がｈＩＦＮポリペプチドの受容体結合領域内に存在する、請求項４５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  51. ポリペプチドがｈＩＦＮ受容体の二量体化を妨げる、請求項４５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  52. 天然にコードされていないアミノ酸が糖部分を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  53. リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、糖部分を介してポリペプチドに連結されている、請求項３に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  54. 配列番号２１又は２２に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含む、単離された核酸。
  55. セレクターコドンが、アンバーコドン、オクレコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される、請求項５４に記載の単離された核酸。
  56. 天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたｈＩＦＮポリペプチドを、前記天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む、リンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む、請求項３に記載のｈＩＦＮポリペプチドを作製する方法。
  57. ポリマーが水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 天然にコードされていないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル部分を含み、及びリンカー、ポリマー又は生物活性分子がアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含む、請求項５６に記載の方法。
  60. アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基が、アミド結合を通じて、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項５９に記載の方法。
  61. 天然にコードされていないアミノ酸がアルキン部分を含み、及びリンカー、ポリマー又は生物活性分子がアジド部分を含む、請求項５６に記載の方法。
  62. 天然にコードされていないアミノ酸がアジド部分を含み、及びリンカー、ポリマー又は生物活性分子がアルキン部分を含む、請求項５６に記載の方法。
  63. アジド又はアルキン部分が、アミド結合を通じて、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項５８に記載の方法。
  64. ポリ（エチレングリコール）部分が約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する、請求項５７に記載の方法。
  65. ポリ（エチレングリコール）部分が分岐したポリマー又はマルチアーム化されたポリマーである、請求項５７に記載の方法。
  66. 請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチドと、及び医薬として許容される担体とを含む組成物。
  67. 天然にコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマーに連結されている、請求項６６に記載の組成物。
  68. 請求項６６に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、ｈＩＦＮによって調節される疾患を有する患者を治療する方法。
  69. 請求項５４に記載の核酸を含む細胞。
  70. 細胞がオルソゴナルｔＮＲＡ合成酵素又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む、請求項６９に記載の細胞。
  71. 天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドを作製する方法であり、ｈＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びセレクターコドン、オルソゴナルＲＮＡ合成酵素及びオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養すること、並びにｈＩＦＮポリペプチドを精製することを含む、前記方法。
  72. ｈＩＦＮポリペプチドの血清半減期又は循環時間を増加させる方法であり、ｈＩＦＮポリペプチド中の何れかの１つ又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸を、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸と置換することを含む、前記方法。
  73. 前記ポリペプチドが化学的に合成される、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  74. ポリペプチドがリボソーム的に合成される、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  75. 天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２の２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は配列番号１若しくは３中の対応するアミノ酸からなる群から選択される位置において置換されている、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチド。
  76. 天然にコードされていないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項７５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  77. 天然にコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマーに連結されている、請求項７５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  78. 水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有するポリ（エチレングリコール）部分である、請求項７５に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  79. ポリ（エチレングリコール）部分が分岐したポリマー又はマルチアーム化されたポリマーである、請求項７８に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  80. ポリ（エチレングリコール）部分が１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項７９に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  81. 請求項７５に記載のｈＩＦＮポリペプチドと、及び医薬として許容される担体とを含む組成物。
  82. 組換え宿主細胞中でのｈＩＦＮポリペプチドの発現を増加させる、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＩＦＮポリペプチド。
  83. 共有結合によって、ｈＩＦＮポリペプチドの単一のアミノ酸に連結された水溶性ポリマーを含むｈＩＦＮポリペプチド。
  84. 水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項８３に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  85. 水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸である、請求項８３に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  86. 天然にコードされていないアミノ酸がポリ（エチレングリコール）分子に連結されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  87. 少なくとも１つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた非天然コードアミノ酸の官能基を通じて前記ポリペプチドに付着されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  88. 前記ｈＩＦＮポリペプチドがモノＰＥＧ化されている、請求項８７に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  89. １つ又はそれ以上の非天然コードアミノ酸に付着された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記非天然コードアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボソームによって取り込まれる、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  90. ｈＩＦＮポリペプチドが１つの前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含む、請求項８９に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  91. 前記ｈＩＦＮポリペプチドが１つ又はそれ以上の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー、生物活性分子、水溶性ポリマー、二官能性ポリマー、二官能性リンカー、追加のｈＩＦＮポリペプチド、第二のポリペプチド又はポリ（エチレングリコール）部分を含み、並びに前記ｈＩＦＮポリペプチドがコンセンサスＩＦＮ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、ＩＦＮτ、ＩＦＮα−１ａ、ＩＦＮα−１ｂ、ＩＦＮα−２ａ、ＩＦＮα−２ｂ、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮβ−１ｂ及びＩＦＮγ−Ｉａから選択される、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  92. 前記ｈＩＦＮポリペプチドが、ｈＩＦＮ受容体に対するｈＩＦＮポリペプチドの親和性を増加させ、ｈＩＦＮポリペプチドの安定性若しくは溶解度を増加させ、組換え宿主細胞中でのｈＩＦＮポリペプチドの発現若しくはインビトロでの合成を増加させ、又はｈＩＦＮポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増加させる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含み、前記ｈＩＦＮポリペプチドが、コンセンサスＩＦＮ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、ＩＦＮτ、ＩＦＮα−１ａ、ＩＦＮα−１ｂ、ＩＦＮα−２ａ、ＩＦＮα−２ｂ、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮβ−１ｂ及びＩＦＮγ−Ｉａからなる群から選択される、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  93. ｈＩＦＮポリペプチドが、ｈＩＦＮポリペプチドの免疫原性を調節する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  94. ｈＩＦＮポリペプチドが、ｈＩＦＮポリペプチドの血清半減期又は循環時間を調節する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  95. ｈＩＦＮポリペプチドの免疫原性を調節する方法であり、ｈＩＦＮポリペプチド中の何れかの１つ又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸を、１つ又はそれ以上の天然にコードされていないアミノ酸と置換することを含む、前記方法。
  96. 天然にコードされていないアミノ酸が、残基３１、１３４、３４、３８、１２９、３６、１２２、３７、１２１、４１、１２５、１２４、１４９、１１７、３９、１１８、１２０、１０７、１０８、１０６、１００、１１１、１１３、１１４、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、１０１、１０３、１０２、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９、９６、６、９、１２、１３、１６、６８、７０、１０９、１５９、１６１、１５６、１６０、１６２、２４、２７、７８、８３、８５、８７、８９、１６４又はこれらの何れかの組み合わせ（配列番号２）からなる群から選択される位置において置換される、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  97. 天然にコードされていないアミノ酸が、位置１０７（配列番号２）において置換されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  98. ｈＩＦＮポリペプチドが、オピオイド受容体との相互作用を調節する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  99. 前記オピオイド受容体がμオピオイド受容体である、請求項９８に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  100. ｈＩＦＮポリペプチドが、５−ＨＴ脳神経伝達を調節する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  101. ｈＩＦＮポリペプチドが、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの誘導を調節する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  102. 前記ｈＩＦＮが抗ウイルス活性を有し、並びにｈＩＦＮと比較して、低下された非抗ウイルス活性及び副作用を有する、請求項１又は９６に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
  103. Ｇ１０Ｅ、Ｍ１６Ｒ、Ｒ１３Ｅ、Ｔ７９Ｒ、Ｋ８３Ｑ、Ｋ８３Ｓ、Ｙ８５Ｌ、Ｔ８６Ｓ、Ｅ８７Ｓ、Ｑ９０Ｒ、Ｑ９１Ｅ、Ｎ９３Ｑ、Ｄ９４Ｖ、Ｅ９６Ｋ、Ｒ１２０Ｋ、Ｋ１２１Ｔ、Ｑ１２４Ｒ、Ｒ１２５Ｇ、Ｌ１２８Ｒ、Ｒ１４９Ｙ、Ｒ１４９Ｅ、Ｒ１４９Ｓからなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸置換をさらに含み、配列番号２のＤ７７−Ｄ９４がＨＥＲＡＬＤＱＬＬＳＳＬＷＲＥＬＱＶで置換されており、及び配列番号２のＶ１０５−Ｄ１１４がＧＱＳＡＰＬＰで置換されている、請求項１に記載のｈＩＦＮポリペプチド。
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